DE2715832A1

DE2715832A1 - Verfahren zur gewinnung von gereinigtem antihaemophilem globulin a (faktor viii)

Info

Publication number: DE2715832A1
Application number: DE19772715832
Authority: DE
Inventors: Yoshiro Iga; Masashi Shiga
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1976-04-09
Filing date: 1977-04-07
Publication date: 1977-10-13
Also published as: DE2715832C3; JPS5512890B2; DE2715832B2; US4093608A; JPS52125609A

Description

¹¹ Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem antihämophilem Globulin A (Paktor VIII) "

" Faktor VIII,auch als antihämophiles Globulin A bezeichnet, 1st einer der wichtigsten Gerinnungs-Faktoren, der im "intrinsic system" bei der Bildung von Thromboplastin mitwirkt. Bei der Behandlung der Blutung von Patienten mit Hämophilie A hat sich die Substitution von Faktor VIII am besten

^M bewährt. Der Faktor VIII ist

aufgrund seines geringen Gehalts im Plasma und seiner Instabi lität schwierig vom Plasma abzutrennen und zu reinigen. Es sind zur Zeit einige Faktor VIII Präparate erhältlich, die zur Behandlung von Hämophilie A Patienten eingesetzt werden. Diese

^ Präparate werden aus der Fraktion I₁ die durch

Fraktionierung mit Äthanol nach Cohn erhalten worden ist, oder

durch Kyropräzipitation hergestellt. Diese Präpa rate sind noch sehr unrein, und sie haben einen hohen

L _J

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- * - 2716832 Fibrlnogengehalt. Eine zu häufige oder zu hohe Dosierung kann den Patienten klinisch gefährden, da die Fibrinogenkonzentration auf unzulässig hohe Werte ansteigt, Ferner ist die genaue Dosierung schwierig, weil die Aktivität von Präparat zu Präparat schwankt. Aus den vorstehenden Gründen besteht ein Bedarf an einem stark gereinigten, konzentrierten Faktor VIII Präparat aus frischem,crenooltem Plasma. Die bisher bekannten hochaktiven Faktor VIII Konzentrate werden im allgemeinen aus rohen Fraktionen von Faktor VIII, wie der Cohn Fraktion I oder aus einem Kryopraezipitat und anschließende Reinigung durch Fraktionierung mit Polyäthylenglykol oder Fraktionierung der GIykokoll-Fällunghergestellt. Teilweise Verbesserungen dieser Verfahren sind in den US-PSen 3 631 018 und 3 652 530 beschrieben.

Kisker, Thromb. Diath. Haemorrhagica, Bd. 17 (1967), S. 38l, und Penick und Brinkhouse, Amer. J. fled. Sciences, Bd. 232 (1956), S, k~$k,haben bereits darauf hingewiesen, daß· bei der Herstellung von hochaktiven Faktor VIII Konzentraten, insbesondere bei der Abtrennung und Reinigung des Faktors VIII, der gleichzeitig vorhandene Prothrombinkomplex und aktive Formen dieser Faktoren, wie Ha und Xa, sich sehr ungünstig auf die Stabilität des Faktor VIII auswirken und bisweilen den Faktor VIII Irreversibel inaktivieren. Zur Verbesserung der Stabilität, der Ausbeute und der Löslichkeit des FaktorsVIII ist es daher von Bedeutung, diese störenden

Faktoren auf einer möglichst frühen Stufe des Abtrennungsund Reinigungsverfahrens zu inaktivieren oder zu eliminieren. Verfahren zur Inaktivierung der störenden Faktoren

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sind beispielsweise in der US-PS 3803 115 beschrieben. Es ist ferner bekannt, daß diese störenden Faktoren auch mit tels eines Adsorptionsmittels, wie Aluminiumhydroxid, Magne siumhydroxid, Bariumcarbonat, Bariumsulfat, 9,10-Diamlno-2- äthoxyacridin-lactat (Rivanol), einem Ionenaustauscher (Amber- lite IRC-50) oder Glycinäthylester, abgetrennt werden können; vgl. E. Bidwell u. Mitarb., Brit. J. Haemat., Bd. 13 (1967), S. 568, J. P. Soulier u. Mitarb., Presse med., Bd. 72 (1961), S. 1223, P. M. Surgenor u. Mitarb., J. Phys. Colloid Chem., Bd. 55 (1951), S. 94,und M. S. Hoag u. Mitarb., J. Clin. In vest., Bd. 39 (I960), S. 55^. Aluminiumhydroxid eignet sich be sonders gut als Adsorptionsmittel für die störenden Faktoren und wird deshalb sehr häufig verwendet. Aluminiumhy droxid hat jedoch folgende Nachteile:

^ (1) die Abtrennung der störenden Paktoren, insbeson dere des Prothrombin-Komplexes, ist unbefriedigend, und es kann einen unerwünschten Einfluß auf die Stabilität oder eini ge andere Eigenschaften des Paktors VIII ausüben;

(2) es reagiert mit Citronensäure oder deren Salzen unter BiI-

" dung eines Gels, so daß seine Verwendung die Möglichkeit der Verwendung von Citraten als Mittel zur Löslichmachung und Sta bilisierung des Paktors VIII während seiner Fraktionierung ausschließt;

(3) nach der Behandlung mit Aluminiumhydroxid verbleibt eine

" geringe Menge an Aluminiumionen, die mit später zugesetztem Citrat geringe Mengen an Gel bildet, was zu einer Verstopfung des Membranfilters führen kann, wodurch die Sterilfiltration sehr erschwert wird und große Verluste an Faktor VIII auftreten.

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Γ Π

Nach M. S. Hoag u. Mitarb., New Eng. J. Med. , Bd. 280 (1969), S. 581 ,eignet sich ein Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen als Adsorptionsmittel für den Prothrombin-Komplex. Nach S. E. Michael und G. W. Tunnah, British J. Haemat., Bd. 9 (1963), S. 236 bis 244, kann ein Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen als Adsorptionsmittel für den Faktor VIII dienen. Bei der Verwendung von Dextran mit Diäthylaminoäthylgruppen (DEAE-Dextran) als Adsorptionsmittel zur Reinigung des Paktors VIII, der durch den Prothrombin-Komplex verunreinigt ist, besteht somit die Gefahr, daß nicht nur der Prothrombin-Komplex sondern auch der Faktor VIII an diesem Austauscher adsorbiert wird, wodurch die Ausbeute an Faktor VIII stark abfällt. Dies ist der Grund, warum DEAE-Dextran bisher nicht zur Abtrennung des Faktors VIII vom Prothrombin-Komplex verwendet wurde.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Faktor VIII (antihämophi-Ies Globulin A) aus frischem humanem Plasma oder gepooltem Plasma zu schaffen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Abtrennung des Prothrombin-Komplexes, der für den Abbau oder die Inaktivierung des Faktors VIII verantwortlich ist, aus humanem gepooltem Plasma zu entwickeln. Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, den Faktor VIII aus humanem gepooltem Plasma in hoher Ausbeute zu gewinnen. Ferner

ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung der Stabilität und löslichkeit des Faktors VIII zu entwickeln. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

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Γ Π

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird Plasma oder eine Plasmafraktion, die sowohl den Prothrombin-Komplex als auch den Paktor VIII enthält, vorzugsweise mit 0,5 bis 3 mg (bezogen auf das Trockengewicht) DEAE-Dextran pro Einheit Prothrombin behandelt. Auf diese Weise wird der Prothrombin-Komplex am DEAE-Dextran adsorbiert und abgetrennt. 10

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann als DEAE-Dextran DEAE-Sephadex^-' A-50 oder A-25 verwendet werden, die sich durch den

Vernetzungsgrad und dementsprechend die Porosität unterschei-Firmenschrift

zur Ionenaustausch-Chromatographie, Pharmacia Fine Chemicals AB, Juni 1973fsowie Dextran Fractions, Dextran Sulphate, DEAE-Dextran, defined polymers for -biological research, Pharmacia Fine Chemicals AB, Dezember 197^.

im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Plasma oder eine Plasmafraktion eingesetzt, die den Faktor VIII und den Prothrombin-Komplex enthält. Die Behandlung mit DEAE-Dextran ist wirkungsvoller, wenn ein Ausgangsmaterial verwendet wird, in dem der Paktor VIII in weniger gereinigtem Zustand vorliegt. Obwohl die Adsorption des Prothrombin-Komplexes durch die Reinheit des Paktors VIII im Plasma oder der Plasmafraktion nicht beeinträchtigt wird und auf Jeder Stufe der Reinigung ein hohes Ausmaß an Abtrennung erreicht wird, nehmen die Verluste an

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Γ

Paktor VIII durch Adsorption mit zunehmender Reinheit des Faktors VIII im Plasma oder der Plasmafraktion zu. Deshalb ist die Behandlung mit DEAE-Dextran wirkungsvoller, wenn sie auf einer Frühstufe der Reinigung durchgeführt wird. Besonders wirksam ist das Verfahren, wenn ein Plasma unmittelbar mit DEAE-Dextran behandelt wird.

DEAE-Dextran wird im erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise in einer Menge von 0,5 bis 3 mg, insbesondere 1,0 bis 1,5 mg, bezogen auf das Trockengewicht, pro Einheit Prothrombin im Plasma oder der Faktor VIII-Fraktion verwendet. Bei Verwendung von DEAE-Dextran in Mengen außerhalb des angegebenen Bereichs erfolgt keine wirksame Adsorption des Prothrombin-Komplexes_/ oder es treten Verluste an Faktor VIII ein. Selbstverständlich muß das DEAE-Dextran vor der Verwendung gequollen, mit Puffer behandelt und 30 Minuten bei 121°C dampfsterilisiert werden. Das verfahrensgemä'ß eingesetzte Plasma bzw, die Faktor VIII-Fraktion hat vorzugsweise einen pH-Wert von 6,8 bis 7,9 sowie eine Temperatur von 0 bis 10⁰C. Außerhalb dieses pH-Bereichs werden d_er Faktor VIII und der Prothrombin-Komplex inaktiviert. Das Plasma oder die Faktor VIII-Fraktion hat vorzugsweise eine elektrische Leitfähigkeit von 7 000 bis 12 000 juU/cm, gemessen mit einem Digital-Leitfähigkeitsmesser, Modell CM-15A (Hersteller TOA Electronics Ltd.). Gewöhnlich ist eine Kontaktzeit von 10 bis 60 Minuten ausreichend. Die elektrische Leitfähigkeit des verfahrensgemäß eingesetzten Plasmas oder der Plasmafraktion ist von besonderer Bedeutung. Sie muß im Bereich von 7 000 bis 12 000 /uU/cm, insbesondere zwischen 8 500

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und 9 500/uU/cm liegen. Bei einem Wert oberhalb 12 000 wird der Prothrombin-Komplex unzureichend adsorbiert und abgetrennt. Bei einem Wert unterhalb 7 000 |üU/cm erfolgt bereits teilweise Adsorption des Faktors VIII, Nach Abtrennung des Prothrorabin-Komplexes kann der überstand, d, h. das den Faktor VIII enthaltende Plasma oder die Plasmafraktion noch in üblicher Weise durch Kryoäthanolpräzipitation nach der Cohn'schen Äthanolfraktionierung (vgl. Blombäck, Arkiv For Kemi, Bd. 12,Nr. 36 (1958), S. 337 bis 396) und anschließende Reini- gung des prazipitats mit Polyäthylenglykol (vgl. Poison, Vox Sang, Bd. 23 (1972), S. 107 bis 118) und/oder Glykokoll(vgl. Hurt, Thromb. Diath. Haemorr., Bd. 15 (1966), S. 327 bis 337) weiter gereinigt werden.
In der Praxis wird das erfindungsgemäße Verfahren so durchge- führt, daß zunächst gepooltes humanes Plasma auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,9 und eine elektrische Leitfähigkeit von 7 000 bis 12 000 ^U/cm eingestellt und sodann mit 0,3 bis 5 mg (be zogen auf das Trockengewicht) DEAE-Dextran, vorzugsweise DEAE- Sephadex^ A-50 oder A-25_; pro ml Plasma etwa 30 Minuten unter Rühren bei einer Flüssigkeitstemperatur von 0 bis 10⁰C behan delt wird, bis der Prothrombin-Komplex am DEAE-Dextran adsor biert ist. Sodann wird das DEAE-Dextran abgeschleudert. Es wird Prothrombin freies Plasma, als überstand erhalten. Dieses Plasma wird anschließend bei -1 bis -4⁰C mit 53 Volumenprozent Äthanol versetzt, bis die Endkonzentration von Äthanol einen Wert von 3 bis 8 Volumenprozent erreicht hat. Es bildet sich

präzipitat.
ein Kryoäthanol/ ner Faktor VIII wird in einer Ausbeute von

72,7 bis 88,3 % und einer spezifischen Aktivität (Faktor VIII L

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γ -ι

Einheit pro A 23θ) von l3,3 bis 29,6, je nach der Herkunft des Plasmas, erhalten. Diese Werte liegen erheblich über den Werten für die spezifische Aktivität der bekannten Faktor VIII Präparate. In der nächsten Stufe wird das erhaltene Kryopräzipitat in einem entsprechenden Medium, wie Tris-Citratpuffer (pH-Wert 7|0 bis 7>Ό gelöst und nach der Methode von Poison, a.a.O. mit ~t> bis 5 Gewichtsprozent pro Volumen Polyäthylenglykol vom Molekulargewicht λ 000 versetzt. Auf diese Weise wird Fibrinogen ausgefällt. Der Überstand wird mit Polyäthylenglykol vom Molekulargewicht k 000 und/oder Glykokoll konzentriert. Es wird

Präzipi_tajt^, ein gereinigtesFaktor VIII- V erhalten. Aus dem hochgerei-

Präzipitat

nigten Faktor VIII- γ wird ein stabiles getrocknetes Produkt des humanen Faktors VIII in konzentrierter Form hergestellt. Dieses Produkt wird als Conco-eight bezeichnet. In Tabelle I sind die Aktivitäten und Eigenschaften von Concoeight und drei anderen bekannten Faktor Vlll-Präparaten zusammengefaßt .

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Tabelle I

	Eigenschaften	Conco-eight	Produkt A	25,5	Produkt B	Produkt C	Ln OD La)
		(500 U/20 ml)	(290 U/10 ml)	I	(260 U/10 ml)	(250 U/10 ml)	ho
	Löslichkeit bei 3O-37°C (min)	<clO	15		20	< 10
	Farbe der Lösung	schwach weiß			hellgelb
-J	Faktor VIII Aktivität	25,0	^y, 9	26,1	25,1
σ	(U/ml)	f
co			0,853
OD	Proteingenalt nach Lowry-	1 % "^	3,70	21,1	39,5
■Γ-	Folin (mg/ml)	13,3	0,124
	Spezifische Aktivität	*1 OO ^"\		0,942	0,635
O	(U/mg Protein)	1,880		f	/
co	Fibrinogengehalt (mg/ml) (mg/mg Protein)	1,13	O 1,2	10,85	13,90
	Bestandteile bei der	0,085	3,3	0,392	0,352
	Elektrophorese (%)		57,2
	Albumin (X .-Globulin		ι 33,7
	O₂-GlObUlIn	O 2,3	4,6	O	30,1 2,0
	ß-Globulin	11,4	2,0	9,8
	Fibrinogen	¹¹Z¹	42,5	3,8
	^-Globulin	18,6	49,5	45,5
L	55,6	4,9	8,8

ro cn

ro

?abelle I - Fortsetzung

Polyäthylenglykol-Gehalt (mg/ULKj	0.32	< 0.01	0.54	< 0.01
Isoagglutinin, reziproker Titer
Anti-A	x32 - x64	x64	• x32 - x64	x64 - xl28
Anti-B	x32 - x64	x64	x'32 - x64	x64 - xl28
HBs-Antigen (HAI Titer)	negativ	negativ -	negativ	negativ
Anti-HBs (HiA Tit er)	ti	Il	ti	It
Koagulationsfaktoren
Faktor I	I.13 mg/mi	3.7O mg/mi	10.85 mg/mi	13.90 mg/mi
II	0.035 U/mi	0.09 U/mi	0.026 U/mi	0.024 u/mi
" Ha	>24 h	> 24 Ii	>24 ii	> 24 h
¹¹ V	O.O3I u/mi	0.06 u/mi	0.04 u/mi	O.152 u/mi
¹¹ VII	0.071 u/mi	0.02 U./mi	0.02 u/mi	0.114 u/mi
" VIII	25.O U/mi	25.5 U⁷IHi	26.0 u/mi	25.I U/mi
" IX	O.232 u/mi	0.95 U/mi	0.345 Vmi	0.45 U/mi
" X	0.016 U/mi	0.013 u/m£	0.010 U /mi	0.101 U/mi

Testmethode: Faktor I: Thrombin-GerinnunEszeit

raktor II, V, VII und X: Prothronbin-Zeit Faktor Ha: 1 7« Fibrinogen-Gerinnungsseit Faktor VIII und IX: Modifizierte partielle Thromboplastin-Zeit

cn CD CO

Das Produkt der Erfindung ist den Vergleichsprodukten in folgender Hinsicht wesentlich überlegen:

1. es erfolgt eine rasche Wiederauflösung;

2. das Präparat hat eine hohe spezifische Aktivität;

3· das Präparat hat einen sehr niedrigen Pibrinogengehalt und ¹J. der Gehalt an Prothrombin-Komplex ist niedrig.

In Fig. 1 und 2 sind die Ergebnisse von in vitro Versuchen der Wirkung des Präparats der Erfindung bei einem an Faktor VIII W armen Plasma erläutert.

Pig. 1 zeigt die Wirkung des Präparats der Erfindung (Concoeight) auf die Gerinnungsfähigkeit von Plasma eines Patienten

mit Hcimonhi 1 i e A_f be?- /
/stimmt durch Thrombelastographie. In Fig. 1 zeigt Test Nr. 1 ein normales Muster und Nr. 2 das Muster eines an schwerer Häinophilie A erkrankten Patienten mit Faktor VIII Mangel. Der Gehalt an Paktor VIII im Plasma beträgt weniger als 1 % des Normalwertes. Nach Gabe einer ausreichenden Dosis Concoeight zur Erzielung eines lOprozentigen Faktor VIIl-Anstiegs

Ό zeigt sich eine beträchtliche Verbesserung des

Thrombelastogramms, was aus Teyt Nr. 3 hervorgeht, während die Verabreichung von Conco-eight zur Erzielung eines lOOprozentigen

^VIII₁AnStIe-OS,

Faktor ~y aas 'rnrombelastogranun das in Nr. H angegebene einwandfreie Muster ergibt.

Fig. 2 zeigt die Wirkung von Conco-eight auf die Gerinnungsfähigkeit von Plasma eines Patienten mit Hämophilie A, bestimmt

VIII-durch die partielle Thromboplastin Zeit (PTT). Bei einem Faktor

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Anstieg des uamophilie A-Plasnias auf einen Wert von 5 % des Normalwertes liegen 3 von 8 Fällen innerhalb des Normalbereichs. Bei einer Erhöhung auf 10 % des Normalwertes liegen sämtliche Fälle im normalen Gerinnungszeitbereich.

Aus den Figuren 1st ersichtlich, daß das erfindungsgemäß hergestellte Faktor VIII Präparat die Gerinnungsfähigkeit von Hämophilie Α-Plasma und die partielle Thromboplastin-Zeit erheblich

verbessern. 10

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem Faktor VIII hat folgende Vorzüge:

(1) Durch die Verwendung von DEAE-Dextran läßt sich der Prothrombin-Komplex aus dem eingesetzten humanen Plasma oder Plasmafraktionen in einer Menge von mindestens 95 % abtrennen. Die Abtrennung ist wesentlich höher als bei der Behandlung mit Aluminiumhydroxid, bei der nur 30 % des Prothrombin-Komplexes abgetrennt werden;

(2) bei der Behandlung mit DEAE-Dextran beträgt der Verlust

an Faktor VIII nur 10 bis 15 %, wenn als Ausgangsmaterlal Plasma, die Cohn-Fraktion I oder ein Xryopräzipitat eingesetzt v/erden. Dieser Verlustwert ist vergleichbar oder geringer als der Verlust, der bei der Behandlung mit Aluminiumhydroxid eintritt. In diesem Falle beträgt der Verlust 8 bis 22 %\

(3) bei der Behandlung von Plasma mit DEAE-Dextran wird der Prothrombin-Komplex vor der Abtrennung des Faktors VIII entfernt. Hierdurch wird die Stabilität und die Ausbeute an Faktor VIII erheblich verbessert;

L _l

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im Gegensatz zu Aluminiumhydroxid bildet DEAE-Dextran kein Gel mit Citronensäure oder Citraten. Dies gestattet die Verwendung von Citratpuffer, der eine hohe ausbeute zuläßt, zur Isolierung des Paktors VIII aus der Cohn-Fraktion I oder dem Kryopräzipitat . Dies führt zu einer Ausbeuteverbesserung an Faktor VIII auf dieser Behandlungsstufe von etwa 10 bis 15 %,

(5) Aus den gleichen Gründen, wie vorstehend beschrieben, ist

Meiubrary

die Gefahr einer Verstopfung des (filters durch Gelbildung vermieden, wodurch sich die Sterilfiltration erheblich vereinfacht;

(6) die Filtration verursacht daher keinen nennenswerten Verlust an Faktor VIII,und die Ausbeute an Faktor VIII ist erheblich verbessert;

(7) nach der Adsorption des Prothrombin-Komplexes kann dieser aus dem DEAE-Dextran eluiert werden. Dies gestattet die Abtrennung und Fraktionierung der, Prothrombin-Komplexes.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird eine Prothrombin-Einheit definiert als die in 1 ml frischem gepooltem normalem Plasma vorhandene Aktivität, bestimmt nach der einstufigen Methode von Koller, Loeliger und Duckert, Acta Haemat., Bd. 6 (1951), S. 1. Eine Faktor VIII-Einheit ist definiert als Aktivität in 1 ml frischem gepooltem normalem Plasma, bestimmt nach der partiellen Thromboplastin-Zeit-Methode von Hardisty und MacPherson, Thromb. Diath. Haemorrh., Bd. 7 (1962), S. 215. Die spezifische Aktivität de3 Faktors VIII ist die berechnete Aktivität von Faktor VIII in 1 mg Protein.

^u 709841/1029 ^J

- l6 -

1 Beispiell

1 300 Liter frisches gefrorenes humanes Plasma (Gesamtprothrombin-Aktivität 1,3 x 10 Einheiten, Faktor VIII Gesamtaktivität 1,3 x 10 EinheitenX/arcen aufgetaut und gepoolt. Sodann wird seine Temperatur auf H⁰C, sein pH-Wert mit 0,1 η Natronlauge auf 7»^ und seine elektrische Leitfähigkeit mit 1 molarer wäßriger Kochsalzlösung auf 10 000 /uU/cm eingestellt. Hierauf wird das Plasma mit 23,B kg (Trockengewicht 2 kg; 1,53 mg/Einheit Prothrombin) DEAE-Sephadex'— A-50 bei ^⁰C versetzt. Der Austauscher wird vorher gequollen und mit 0,02 molarem Citratpuffer (pH 7,0) gepuffert und dampfsterilisiert. Das Plasma wird mit dem DEAE-Dextran etwa 60 Minuten unter Rühren behandelt. Hierauf wird das mit dem Prothrombin-Komplex beladene DEAE-Dexträn bei der gleichen Temperatur abgeschleudert. Die Abtrennung des Prothrombin-Komplexes beträgt 96,5 % und die Ausbeute an Faktor VIII 88,5 %> Sodann wird das erhaltene Plasma bei 0 bis -2 C mit 53 volu'fienprozentigen Äthanol versetzt, bis die Endkonzentration an Äthanol im Plasma einen Wert von 4,5 Volumenprozent erreicht. Hierauf wird das Plasma zentrifugiert. Es werden 8,3 kg einer Faktor VIII-Fraktion in Form eines Kryoäthanolpräzipitats erhalten. Aus diesem Präzipitat wird der Faktor VIII in 150 Liter 0,02 molarem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-0,01 molaren Natriu.ncitrat-Puffer(pH 7,4) extrahiert. Auf diese Weise wird eine rohe Lösung von Faktor VIII mit einer 25,4 mal höheren spezifischen Aktivität als das eingesetzte Plasma in einer Ausbeute von 75,3 %_t bezogen auf das eingesetzte Plasma, erhalten. Sodann wird die rohe Lösung mit Polyäthylenglykol vom Molekulargewicht 4 000 bis zu einer Kon-

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Γ Π

zentration von H Gewichtsprozent pro Volumen versetzt. Die entstandene Fällung des Pibrinogens wird abgetrennt. Der Paktor VIII enthaltende überstand wird mit einer weiteren Menge Polyäthylenglykol vom Molekulargewicht 4 000 versetzt, bis dessen Endkonzentration 14 Gewichtsprozent pro Volumen beträgt. Hier-

Präzipitats

bei wird gereinigter Faktor VIII in Form eines / erhalten.

Präzipitat
Da-» gereinigte / wird mit einer geringen Menge einer 1,8-

molaren Glykokoll-Lösung gewaschen, um restliches Polyäthylen-

Präzipitat glykol abzutrennen. Sodann wird uas / in 10 bis 15 ml pro

•° Ig feuchtes / in einem 0,01 molaren Tris-(hydroxyraethyl)-aminomethan-0,01 molaren Natriumcitrat-0,1 molaren Natriumchlorid-Puffer vom pH-Wert 7,4 gelöst, Es wird eine konzentrierte Faktor VIII Lösung mit etwa 30 Einheiten Faktor VIII pro ml erhalten. Die Lösung wird sterilfiltriert und in Dosierungseinheiten unterteilt, die gefriergetrocknet werden. Die getrockneten Faktor Vlll-Präparate werden in der gleichen Menge V/asser, wie sie vorher durch Gefriertrocknung entfernt wurde, wieder gelöst. Die erhaltene Lösung hat eine Aktivität von 25 bis 30 Einheiten pro ml und folgende Eigenschaften:

Spezifische Aktivität von Faktor VIII 3 Einheiten/mg Protein

Pibrinogengehalt 0,048 mg/mg Protein

Polyäthylenglykol-Gehalt 0,2 mg/ml

Isoagglutinin-Titer 1 _: 32

HB3-Antigen und Antl-HBs-Antikörper negativ nach dem

Hämagglutinations-Hemmtest und dem pas-

** siven Hämagglutina-

tions-Test

aktiver Gerinnungsfaktor mindestens 24 Std.,

bestiroir.t durch die 1 % Fibrinogen-Gerinnungszeit.

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1 Beispiel2

1 300 Liter frisches gefrorenes gepooltes humanes Plasma werden aufgetaut und bei 0 bis -2°C mit 5 Volumenprozent Äthanol versetzt· Es wird eine Fraktion von Paktor VIII in Form eines ^ Kryoäthanolpräzipitats isoliert. Dieses Präzipitat wird ir. 130 Liter eines 0,02 molaren Trj s-ChydroxymethyD-aminomethan-O₁Ol molaren Natriumcitrat-Puf fers vom pH-V/er t 7,0 eingetragen. Das Gemisch wird bei 25°C gerührt und sodann zentrifugiert. Als Überstand wird eine rohe Extraktlösung von Faktor VIII mit einer Prothrombin-Gesantaktivität von 40 000 Einheiten und einer Faktor VIII-Gesamtaktivität von 1,0-Ί χ 10 Einheiten erhalten. Die Temperatur der Lösung wird auf k°C_t ihr pH-Wert mit 0,1 η Salzsäure auf 7,0 und ihre elektrische Leitfähigkeit mit 1 molarer Kochsalzlösung auf 9 000 /uCVcm eingestellt. Sodann werden Ί50 g DEAE-Sephadex v™ A-25 Gel (HO g Trockengewicht, 1 mg/1 Einheit Prothrombin) eingetragen. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt. Danach wird das mit dem Prothrombin-Komplex beladene DEAE-Dextran abgeschleudert. Als überstand wird eine Rohlösung von Faktor VIII erhalten, die praktisch frei von Prothrombin-Komplex ist. Die Ausbeute an Faktor VIII beträgt 63,5 % und die spezifische Aktivität ist 19,5 mal höher als im eingesetzten Plasma. Danach wird aus der erhaltenen Rohlösung gemäß Beispiel 1 das Fibrinogen abgetrennt und der Faktor VIII konzentriert. Es wird ein hochgereinigte Faktor Vlll-Präzi* erhalten, das gemäß Beispiel 1 zu einem Konzentrat mit ähnlichen Eigenschaften verarbeitet wird.

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'5

Le e rs e i t e

Claims

¹¹ Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem antihämophilem Globulin A (Faktor VIII) "

Priorität: 9.4.1976, Japan, Nr. 39 89Ί/76

Patentansnrüche

'lrf Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem antihämophilern Globulln A (Faktor VIII) aus frischem humanem Plasma, d a durch gekennzeichnet, daß man das humane Plasma oder Plasmafraktionen, die sowohl den Prothrombin-Komplex als auch den Faktor VIII enthalten, mit einem schwach basischen Anionenaustauscher auf der Basis eines Dextrans mit Diäthylamlnoäthylgruppen (DEAE-Dextran) behandelt und den Über-

25 stand vom Austauscher abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 0,5 bis 3 mg (bezogen auf das Trockengev/icht) DEAE-Dextran

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ORIGINAL INSPECTED

pro Einheit Prothrombin verwendet. -C / I bo Oi.

3. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man humanes Plasma oder Plasmafraktionen mit einer elektrischen
Leitfähigkeit von 7 000 bis 12 000 jaü/cm verwendet.

¹J, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man humanes Plasma mit einem pH-Wert von 6,8 bis 7,9 und einer
Flüssigkeitstemperatur von 0 bis 10 C verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Behandlung mit dem DEAE-Dextran während eines Zeitraums von 10 bis 60 Minuten durchführt«

6, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

/η Λ

als DEAE-Dextran DKAE-Sephadex v-^A-50 oder A-25 verwendet.

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