DE68914316T2

DE68914316T2 - Polypeptide aus Vipergift und deren Genexpression.

Info

Publication number: DE68914316T2
Application number: DE68914316T
Authority: DE
Inventors: Gerard H Bencen; Paul A Friedman; Zhong-Ru Gan; Victor M Garsky; Robert J Gould; John W Jacobs; Mark A Polokoff
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1988-04-22
Filing date: 1989-04-17
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2009-04-18
Also published as: NO891662L; AU627724B2; FI891916A0; ES2063113T3; NZ228710A; PT90321B; DK192189D0; IL89938A0; EP0338634A2; DK192189A; JPH02138298A; EP0338634B1; EP0338634A3; KR900016261A; DE68914316D1; NO891662D0; PT90321A; CN1039441A; FI891916A; ATE103931T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Polypeptide zur Hemmung der Blutplättchenaggregation

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf eine Modulierung der Zelladhäsion und eine Hemmung der Bindung von Fibrinogen und anderen Proteinen an Blutplättchen und eine Hemmung der Aggretation von Blutplättchen. Fibrinogen ist ein Glykoprotein, das im Blutplasma vorhanden ist und das an der Blutplättchenaggregation und der Fibrinbildung beteiligt ist. Blutplättchen sind zellartige kernlose Fragmente, die sich im Blut aller Säugetiere finden und die an der Blutgerinnung beteiligt sind. Die Wechselwirkung von Fibrinogen mit einem Rezeptor, dem Blutplättchenmembran-Glykoprotein-KompleX IIb/IIIa, ist bekanntlich wesentlich für eine normale Blutplättchenfunktion.
Wenn ein Blutgefäß zerstört wird, haften Blutplättchen an der zerrissenen subendothelialen Fläche. Die anhaftenden Plättchen setzen anschließend biologisch aktive Bestandteile frei und aggregieren. Die Aggregation wird eingeleitet durch die Bindung von Agonisten, wie Thrombin, Epinephrin oder ADP, an spezifische Rezeptoren der Plättchenmembran. Die Stimulierung durch Agonisten führt zu einer Freisetzung von latenten Fibrinogenrezeptoren an der Oberfläche der Blutplättchen und Bindung von Fibrinogen an den Glykoprotein-IIb/IIIa-Komplex.
Es wurden Versuche unternommen, natürliche Produkte und synthetische Peptide zu verwenden, um den Mechanismus der Blutplättchenaggregation und Haftung zu untersuchen. Die Blutplättchenaggregation hemmende Proteine wurden aus einer Vielfalt von Vipergiften gewonnen. Untersuchungen des Mechanismus der Hemmung der Blutplättchenaggregation durch diese Proteine wurden fedoch behindert durch die mangelnde Strukturinformation.
Vor einiger Zeit wurde ein Vipernpeptid, das als Trigramin bezeichnet wird, etwas im Detail charakterisiert (Huang et al., J. of Biol. Chem., 1987, 262, S. 16157-16163 und USSN 121 972, eingereicht am 18. November 1987). Es wurde berichtet, daß das Peptid durch Konkurrenz die Fibrinogenbindung an den Glykoprotein-IIb/IIIa-Komplex der Blutplättchenmembran hemmt. Das Peptid enthält eine Arg-Gly-Asp-Sequenz, von der angenommen wird, daß sie sich nahe dem COOH-terminalen Rest befindet.
Trigramin ist in der EP-A-0 317 053 angegeben, die nur Stand der Technik nach den Artikeln 54(3) und (4) EPC darstellt.
Rouslahti und Pierschbacher, Science, 1987, 238, S. 491- 497 beschreiben Haftungsproteine, wie Fibronectin, Vitronectin, Osteopontin, Collagene, Thrombospondin, Fibrinogen und von Willebrand-Faktor, die in extrazellulären Matrices und im Blut vorhanden sind. Die Proteine enthalten das Tripeptid Arginin-Glycin-Aspartinsäure als Zellerkennungsstelle. Die Tripeptide werden von mindestens einem Mitglied der Familie von strukturell verwandten Rezeptoren, Integrinen, die heterodimere Proteine mit zwei membranüberspannenden Subeinheiten sind, erkannt. Die Autoren stellen fest, daß die Konformation der Tripeptidseguenz in den einzelnen Proteinen kritisch sein kann für die Erkennungsspezifität.
Cheresh, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1987, 84, S. 6471- 6475, beschreibt einen Arg-Gly-Asp-dirigierten Adhäsionsrezeptor, der exprimiert wird durch endothele Human-Zellen, der strukturell ähnlich ist dem IIb/IIIa-Komplex von Blutplättchen, aber antigen und funktionell verschieden. Der Rezeptor ist direkt beteiligt an der Endothelzellhaftung an Fibrinogen, von Willebrand-Faktor und Vitronectin.
Pierschbacher und Rouslahti, J. of Biol. Chem., 1987, 262, 36, S. 17294-17298 beschreiben den Einfluß der Stereochemie der Sequenz Arg-Gly-Asp-Xaa auf die Bindungsspezifität von Peptiden, enthaltend die Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp. In Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1984, 81, S. 5985-5988 beschreiben die gleichen Autoren Varianten der Zellerkennungsstellen von Fibronectin, die die haftungfördernde Aktivität beibehalten Das Tetrapeptid Arg-Gly-Asp-Ser wird als minimale Struktur beschrieben, die von Zellen in dem großen Haftungsglykoprotein Fibronectin erkannt wird. Peptide mit dem Anteil -Arg-Gly-Asp- Ser- sind in den US-PS 4 589 881 und 4 614 517 beschrieben. Peptide mit Anteilen -Arg-Gly-Asp-R, wobei R ausgewählt ist aus Thr oder Cys oder anderen Aminosäuren mit der gleichen Zellhaftungsaktivität wie Fibronectin, sind in der US-PS 4 578 079 beschrieben.
Ruggeri et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 1986, 83, S. 5708-5712 beschreiben eine Reihe von synthetischen Peptiden, die in der Länge 16 Reste enthalten, die die Sequenz Arg-Gly- Asp-Val enthalten, die die Fibrinogenbindung an Blutplättchen hemmt.
Gold et al., Circulation, 77, 3. März 1988, S. 670-677 beschreiben die Wirkung von Bolusinjektionen von Rekombinations- Einzelketten-Plasminogenaktivator vom Gewebetyp und von F(ab')&sub2;- Fragmenten eines monoklonalen Mäuseantikörpers (7E3) gegen den Humanblutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptor auf die Coronararterienthrombolyse und den Wiederverschluß. Gold et al. haben gefunden, daß die Injektion von F(ab')&sub2;-Fragmenten des monoklonalen Antikörpers 7E3, der gegen den Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptor gerichtet ist, die Thrombolyse mit Rekombination-Einzelketten- Plasminogenaktivator vom Gewebetyp beschleunigt und einen Wiederverschluß verhindert.
Während es bekannt ist, daß die Tripeptidsequenz Arg- Gyl-Asp in bestimmten Polypeptiden vorhanden ist, die die zellhaftungsfördernden Wirkungen von Fibronectin und Vitronectin verdoppeln oder hemmen können, ist nur wenig bekannt über den Einfluß auf die Bindungsspezifität der anderen Aminosäuren in dem Polypeptid. Die Anmelder haben Polypeptide, die die Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp enthalten, und die Inhibitoren für die Blutplättchenaggregation darstellen und die Cysteinreste in spezieller Stellung, bezogen auf die Stellung des Tripeptids besitzen, identifiziert und gereinigt. Die spezielle Stellung der Cysteinaminosäuren scheint die Fähigkeit dieser Polypeptide, die Blutplättchenaggregation zu hemmen, deutlich zu beeinflussen.
Die Entwicklung zuverlässiger Verfahren und Ausrüstungen zur chemischen Synthese von langen Oligodesoxynucleotiden hat die Gensynthese als durchführbare Alternative zur Isolierung und Expression von natürlichen Genen gemacht (Caruthers, Science, 230 (1985) S. 281-285; Ferretti et al., Proc. Nat'l. Acad- Sci. USA, 83 (1986) , S. 599-603; Wosnick et al., Gene, 60 (1987) S. 115-127; Nassal, Gene, 66 (1988) S. 279-294; Bell et al., Gene, 63 (1988) S. 155-161. Das Verfahren ist besonders geeignet zum Exprimieren und Manipulieren von kleinen natürliche Proteinen. Viele eukaryotische Proteine, die in einem bakteriellen Wirt exprimiert sind, sind jedoch nicht stabil (Taniguchi et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 77 (1980) S. 5230-5233; Davis et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 78 (1981) S. 5376-5380; Shen, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 81 (1984) S. 4627-4631 und Lennick et al., Gene, 61 (1987) S. 103-112). Eine häufig angewandte Strategie, um die Instabilität zu umgehen, besteht darin, das interessierende Gen mit einer Nucleotidsequenz zu verschmelzen, die ein bakterielles Protein kodiert, um ein Fusionsprotein zu bilden, wodurch das eukaryotische Protein geschützt wird. Es wird von vielen chemischen Reagentien und Proteasen berichtet, daß sie eine Vielfalt von Aminosäurestellen von Fusionsproteinen spalten. Cyanogenbromid spaltet wirksam und selektiv an Methionin (Savige et al., Methods in Enzymology, Hirs und Timashelff, Hrsg. Academic Press, New York, 47 (1977) S. 459-469; Nagai et al., Nature, 309 (1984) S. 810-812; Szoka et al., DNA, 5 (1986) S. 11-20 und Haffey et al., DNA, 6 (1987) S. 565-571).

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung umfaßt Fibrinogenrezeptorantagonisten-Polypeptide, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Fibrinogen/Blutplättchen-Bindung hemmen und die allgemeine Formel I besitzen:
X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y (1)
wobei X H oder mindestens eine Aminosäure ist; Y OH oder mindestens eine Aminosäure ist und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, irgend eine Aminosäure ist.
Polypeptide, die unter die Formel I fallen, umfassen solche der Formel Ia:
H&sub2;N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H (Ia) wobei Ch mindestens eine Aminosäure bedeutet; Cx mindestens eine Aminosäure bedeutet und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sein können, eine Aminosäure bedeutet.
Polypeptide nach der Erfindung sind gereinigt worden aus dem Gift von verschiedenen Vipern, zum Beispiel Echis carinatus, Agkistrodon piscivorus, Bitis arietans und Eristocophis masmahonii. Diese Polypeptide sind geeignet zur Hemmung der Fibrinogenbindung an Humanblutplättchen und hemmen die durch Fibrinogen induzierte Aggregation von Humanblutplättchen.
Diese Polypeptide werden gereinigt aus Viperngift gemäß dem Reinigungsverfahren, wie es unten beschrieben ist. Sie sind reich an Cystein und enthalten die gemeinsame Sequenz -Cys-R-R- R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-, wobei jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, irgend eine Aminosäure bedeutet.
Obwohl die Anmelder nicht an irgend eine spezielle Theorie bezüglich des Bindungsmechanismus gebunden sein wollen, wird angenommen, daß die Stellung der Cysteinaminosäuren eine wichtige Rolle spielt bei der Bestimmung der dreidimensionalen Konformation, dem Grad der Steifheit und der Bindungsspezifität der Polypeptide.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Gen oder degeneriertes Äquivalent, das einen Inhibitnr für die Blutplättchenaggregation kodiert, der allgemeinen Formel:
X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y
wobei X H oder mindestens eine Aminosäure ist; Y OH oder mindestens eine Aminosäure ist; und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, irgend eine Aminosäure ist.
Ein bevorzugtes Gen nach der Erfindung kodiert modifiziertes Echistatin. Echistatin ist definiert als:
Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys- Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg- Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr- Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala- Thr
Das Methionin in Stellung 28 des nativen Proteins ist ersetzt durch Leucin bei Rekombinationsechistatin. Das synthetische Gen ist exprimiert in E. coli (MB-5385, ATCC Nr. 67873, hinterlegt bei American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA) unter Verwendung eines Expressionsvektors pJC264, der gebildet worden ist durch Einfügung von Teilen des E. coli cheB-und cheY-Genkomplexes in das Plasmid pUC13 (USSN 145 800, eingereicht am 5. November 1988). Mikroorganismen des Stammes sind hinterlegt worden entsprechend dem Budapester Vertrag und etwaige Beschränkungen bezüglich der Zugänglichkeit für die Öffentlichkeit bezüglich des hinterlegten Organismus werden unwiderruflich zurückgenommen nach Erteilung des Patents. Eine hohe Expression des r-Leu-28-Echistatin-Gens wurde erreicht durch Verschmelzen mit dem E. coli cheY-Gen in dem Expressionsvektor. Rekombinations-Leu-28-Echistatin wurde von dem Fusionsprotein freigesetzt durch Cyanogenbromid-Spaltung an dem Methionin, das genetisch zwischen dem cheY-Protein und Echistatin eingefügt war, und gereinigt zur Homogenität durch Phasenumkehr-HPLC und zurückgefaltet. Das zurückgefaltete-r-Leu 28-Echistatin ist nicht unterscheidbar von nativem Echistatin bezüglich der Hemmung der Blutplättchenaggregation, was nahelegt, daß das Methionin in 28-Stellung für die biologische Aktivität dieses Inhibitors für die Blutplättchenaggregation nicht wesentlich ist.
Die Er-indung betrifft auch Mittel zur Hemmung der Blutplättchenaggregation unter Verwendung von erfindungsgemäßen Proteinen und Expressionsvektoren, die geeignet sind zur Bildung von Rekombinatinnsproteinen nach der Erfindung.
Die Erindung betrifft auch synthetische Polypeptide der Formel I und Verfahren zur Synthese.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 - Nucleotid und Aminosäuresequenzen von Rekombinations-Leu-28-Echistatin

Einzelne synthetische Oligodesoxynucleotide sind durch durchgezogene Linien markiert und durch Klammerausdrücke numeriert. Die erste Aminosäure, Methionin, in der N-terminalen Proteinsequenz wurde zur Cyanogenbromid-Spaltung vorgesehen. Der Stop-Codon an dem C-terminalen Ende des Proteins ist durch ein Sternchen markiert. EcoRI-Stellen befinden sich an beiden 5 und 3'-Enden zum Einbau in den Expressionsvektor.

Fig. 2 - Struktur des pJC264-Expressionsvektors

Der Aufbau des pHC264-Expressionsvektors und die Insertion des r-Leu-28-Echistatin-Gens in den Vektor werden in der detaillierten Beschreibung der Erfindung diskutiert. A. Die Struktur von pHC264. Die von pUC13 abgeleitete Sequenz ist durch Pfeile angegeben. Der E. coli lac-Promotor-Operator in pUC13 geht dem cheB-Gen voraus und die Richtung der Transkription ist durch einen Pfeil angegeben. Das cheB-Gen (450 bp) und cheY-Gen (263 bp) sind als doppelte Linien bzw. schattierter Kasten angegeben. Die EcoRI-Stelle, in die das r-Leu-28-Echistatin-Gen eingebaut wurde, ist gezeigt. B. Die DNA-Sequenz zwischen der cheY PstI-Stelle und der EcoRI-Klonierungsstelle zeigt die kodierten Aminosäuren.

Fig. 3 - SDS PAGE-Analyse der bakteriellen Produktion von Rekombinations-Leu-28-Echistatin-Fusionsproteinen

E. coli JM109, enthaltend den pJC264-Echistatin-Expressionsvektor, wurde in LB-Medium mit 100 ug/ml Ampicillin gezüchtet. Wenn die Zelldichte eine OD&sub6;&sub0;&sub0;-Ablesung von 0,2 erreichte, wurde die Induktion der Expression gestartet durch Zugabe von IPTG zu dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 mMol. Anteile der Kulturen wurden zu unterschiedlichen Zeiten nach der Induktion entnommen und in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Die Pellets wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer, enthaltend 50 mMol Tris HCl, pH 6,8, 0,2 % SDS, 75 mMol Dithiothreitol, 10 % Glycerin und 0,05 Bromphenolblau, suspendiert. Die Proben wurden 15 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, bevor sie auf ein 14 % SDS- Polyacrylamidgradientengel aufgebracht wurden. Lysate entsprechend 100 ul gesättigter Kultur (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,8) wurden auf dem Gel analysiert. Die Proteine wurden nachgewiesen durch Coomassie- Blaufärbung. Streifen F-J: Lysate von Kulturen, die 0, 2, 4, 6 bzw. 16 Stunden induziert worden waren; Streifen E: Beschallte Perle von etwa 150 ul Kultur nach 16-stündiger Induktion; Streifen D: Lysat von 100 ul gesättigter Kultur von Zellen, die mit Kontroll-pJC264-Expressionsvektor, der kein r-Leu-Echistatinen enthielt, transformiert waren; Streifen B: 8 ug natives Echistatin; Streifen C: 8 ug gereinigtes Rekombinations-Leu-28-Echistatin; Streifen A: niedermolekulare Marker von Pharmacia (die Molekulargewichte sind in der Figur angegeben) ; Streifen K: niedermolekulare Standards von Bio-Rad mit Molekulargewichten von oben nach unten entsprechend 92,5, 66,2, 45,0, 31,0, 21,0 bzw. 14,4 kDa.

Fig. 4 - HPLC-Profile bei der Reinigung von Rekombinations-Leu- 28-Echistatin und Vergleich mit nativem Echistatin

Die Reinigungs- und HPLC-Bedingungen sind in der detaillierten Beschreibung der Erfindung angegeben. A: Reduziertes Gemisch der Cyanogenbromidspaltung; B: Natives Echistatin, das unter den gleichen Bedingungen reduziert worden war, wie sie für das Gemisch der Cyancgenbromidspaltung angewandt wurden; C: Renaturiertes Gemisch von gereinigtem Rekombinations-Leu- 28-Echistatin aus A; D: Natives Echistatin. Die Pfeile in den Tafeln A und B zeigen reduziertes Rekombinations-Leu-28- bzw. natives Echistatin an. Die Stellung des zurückgefalteten Rekombinations-Leu-28-Echistatin und des nativen Echistatin sind durch die Pfeile in den Tafeln C bzw. D angegeben.

Fig. 5 - Hemmung der Blutplättchenaggregation durch Rekombinations (r-Leu-28-Echistatin) und natives (n-Echistatin)- Echistatin

Die Bestimmungsbedingungen für die Blutplättchenaggregation sind in der detaillierten Beschreibung der Erfindung angegeben. A: Die Aggregation wurde in Abwesenheit und Gegenwart von 1,5 um Reknmbinations-Leu-28- oder nativem Echistatin überwacht. Es ist zu bemerken, daß die anfängliche Abnahme der Lichtdurchlässigkeit, die ein Zeichen für die Formänderung der Blutplättchen ist, nicht beeinflußt wurde. B: Die Anfangsgeschwindigkeit der Aggregation wurde nach Zugabe von ADP in Gegenwart von gereinigtem Rekombinations-(Leu 28) (Quadrate) Echistatin und nativem (Kreise) Echistatin gemessen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Native Proteine, wie der Ausdruck hier verwendet wird, beziehen sich auf Proteine voller Länge, die durch die entsprechenden Gene gebildet worden sind. Rekombinationsproteine beziehen sich auf die Isolierung eines Gens oder cDNA für ein erwünschtes Protein und die Verwendung dieses gereinigten Gens oder cDNA zum Aufbau einer Zelle, die das gewünschte Protein überproduziert. Mikroheterogene Formen, wie der Ausdruck hier verwendet wird, beziehen sich auf ein einzelnes Genprodukt, das ein Protein ist, das gebildet worden ist von einer einzelnen Geneinheit von DNA, die nach der Translation strukturell modifiziert worden ist. Diese strukturellen Modifizierungen führen jedoch nicht zu deutlichen Veränderungen der Aktivität des Proteins. Die Modifizierungen können entweder in vivo oder während des Isolierungs- und Reinigungsverfahrens stattfinden. In vivo-Modifizierungen können ergeben, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Acetylierung am N-Terminus, Proteolyse, Glykosylierung oder Phosphorylierung. Proteolyse kann eine Exoproteolyse umfassen, wobei eine oder mehrere terminale Aminosäuren nacheinander enzymatisch abgespalten werden, um mikroheterogene Formen mit weniger Aminosäuren als das ursprüngliche Genprodukt zu bilden. Die Proteolyse kann auch eine endoproteolytische Modifizierung umfassen, die bei der Einwirkung einer Endoprotease auftritt, die das Peptid an speziellen Stellen innerhalb der Aminosäuresequenz spaltet. Ähnliche Modifizierungen können während des Reinigungsverfahrens auftreten, was zur Bildung von mikroheterogenen Formen führen kann. Die häufigste Modifizierung, die während der Reinigung auftritt, ist die Proteolyse.
DNA-Rekombinationstechnologie ist hier definiert als Technologie, die es erlaubt, Segmente von genetischer Information, DNA von verschiedenen Zellen, üblicherweise von verschiedenen Organismen außerhalb des Organismus, aus dem die DNA erhalten wurde, Ende an Ende zu verbinden und diese Hybrid-DNA in eine Zelle einzubauen, die die Bildung des Proteins ermöglicht, das die ursprüngliche DNA kodiert. Genetische Information, DNA oder mRNA wird isoliert und in einen geeigneten Klonierungsvektor eingebaut und in eine entsprechende Wirtszelle transduziert.
Klonierungsvektor, wie der Ausdruck hier verwendet wird, ist definiert als eine DNA-Sequenz, die den Einbau spezieller experimenteller Fremd-DNA ermöglicht, wobei die kombinierte DNA in eine Wirtszelle eingeführt wird, die in stabiler Form existieren und das von der experimentellen DNA bestimmte Protein exprimieren kann. Die fremde mit dem DNA-Vektor kombinierte DNA stellt ein Rekombinations-DNA-Molekül dar, das durch Rekoinbinationstechnologie erhalten worden ist. Klonierungsvektoren können Plasmide, Bakteriophagen, Viren und Cosmide umfassen. Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, die zur Transkription von geklonten Kopien von Genen und die Translation ihrer mRNAs in einen entsprechenden Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können angewandt werden, um prokaryotische oder eukaryotische Gene in einer Vielfalt von Zellen, wie Bakterien-, Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen, zu exprimieren. Die Proteine können auch in einer Anzahl von Virussystemen exprimiert werden. Ein geeignet aufgebauter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsstartpunkt zur autonomen Replikation in Wirtszellen, selektive Marker, eine begrenzte Anzahl von wirksamen Restriktionsenzymstellen, eine hohe Kopienzahl und starke Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, die RNA-Polymerase dazu führt, an DNA zu binden und die RNA-Synthese einzuleiten. Ein starker Promotor ist einer, der dazu führt, daß mRNAs sehr häufig initiiert werden. Expressionsvektnren können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt darauf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell ausgebildete Plasmide oder Viren.
Die Proteine nach der Erfindung können vorliegen als, sind jedoch nicht beschränkt auf, vollständige Proteine, die durch die definierten Gene des nativen Proteins spezifiziert sind oder irgend ein Fragment oder eine Untereinheit davon oder als Hybride des vollständigen Proteins oder seiner Fragmente oder Untereinheiten, solange sie die die Blutplättchenaggregation hemmende Aktivität behalten. Die vollständigen Proteine, wie der Ausdruck hier verwendet wird, bezeichnen das Polypeptid mit voller Länge, das durch die entsprechenden Gene gebildet worden ist. Die vollständigen Proteine können erhalten werden durch Reinigung des entsprechenden Vipergifts oder durch Expression in einem geeigneten Expressionsvektor des entsprechenden durch Rekombination abgeleiteten Genprodukts. Proteinfragmente oder Untereinheiten beziehen sich auf irgend einen Teil des Proteins, der weniger Aminosäuren enthält als das vollständige Protein und noch die Fähigkeit besitzt, die Blutplättchenaggre gation unter den gleichen Bedingungen wie das native Protein zu hemmen. Hybridproteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fusionsproteine oder Proteine, die erhalten worden sind durch die Expression mehrerer Gene in dem Expressionsvektor. Ein Fusionsprotein ist definiert als ein solches, bei dem eine begrenzte Anzahl von Aminosäuren, die dem Expressionsvektor kodieren, exprimiert sind und die Expression zu ihrer Bindung an das spezifische, die Blutplättchenaggregatinn hemmende Polypeptid führt. Proteine, die aus mehreren Genen entstanden sind, können das spezifische Polypeptid umfassen, das an ein zweites Polypeptid oder Peptide gebunden ist über Peptidbindungen, die die Hemmung der Blutplättchenaggregation verstärken.
Polypeptide im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden isoliert aus Vipergift von Echis carinatus und Agkistrodon piscivorus, Bitis arietans und Eristocophis macmahonii. Alle diese Polypeptide sind wirksame lnhibitoren für die Blutplättchenaggregation.
Die Sequenz für einen aus Echis carinatus-Gift isolierten Inhibitor ist:
Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys- Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg- Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr- Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala- Thr
Dieser Inhibitor wird im folgenden als Echistatin bezeichnet.
Eine Sequenz für einen aus Bitis arietans-Gift isolierten Inhibitor ist:
Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu- Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys- Gln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu- Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys- Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys- Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys- Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His
Der Inhibitor wird im folgenden als Bitistatin 1 bezeichnet.
Eine andere Sequenz für einen aus Bitis arietans-Gift isolierten Inhibitor ist:
Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln- Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys- Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu- Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys- Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys- Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys- Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.
Der Inhibitor wird im folgenden als Bitistatin 2 bezeichnet.
Eine andere Sequenz für einen aus Bitis arietans-Gift isolierten Inhibitor ist:
Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu- Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn- Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys- Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys- Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val- Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr- Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His.
Der Inhibitor wird im folgenden als Bitistatin 3 bezeichnet.
Die Sequenz für einen aus Eristocophis masmahonii-Gift isolierten Inhibitor ist:
Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg- Arg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-Arg- Val-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr- Gly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-Asn- His.
Der Inhibitor wird im folgenden als Eristostatin bezeichnet.
Eine andere Sequenz für einen aus Bitis arietans-Gift isolierten Inhibitor ist:
Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Ile-Leu-Glu-Gln- Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-...
Die Identität der der 20. Aminosäure folgenden Sequenz wurde nicht bestimmt. Aufgrund der Strukturähnlichkeit zwischen dieser Sequenz, die im folgenden als Bitistatin 4 bezeichnet wird, und den anderen von Bitis arietans-Gift isolierten Polypeptiden wird angenommen, daß Bitistatin 4 in den Rahmen der Formel I fällt.
Die oben identifizierten Sequenzen sind spezielle Beispiele für Polypeptide, die unter die in Formel I definierte Sequenz fallen, und sollten nicht als den Rahmen der Erfindung beschränkend angesehen werden. Sie wurden definiert durch Aminosäuresequenzbestimmung. Es ist verständlich, daß natürliche allele Variationen existieren. Diese Variationen können gezeigt werden durch (einen) Aminosäureunterschied(e) in der Gesamtsequenz oder durch Weglassungen, Substitutionen, Einfügungen, Inversionen oder Additionen von (einer) Aminosäure(n) in der Sequenz.

Beispiel 1

Methoden

Materialien:

- Das Gift von Echis carinatus wurde von Miami Serpentarium Laboratories, SeIt Lake City, UT, gekauft.
Niedermolekulare Peptidstandards, Sephadex 0-50, und Mono S FPL0-Säulen waren von Pharmacia Inc. Servalyt Precote7 isoelektrische Fokusierungsgele wurden von Serva Fine Biochemicals Inc. gekauft und isoelektrische Fokusierungsmarkerproteine waren von BDH ChemicaIs Ltd. C18 HPLC-Säulen waren Produkte von Vydac.

Gewinnung von Blutplättchen

Kaninchenvollblut wurde von weißen Neuseelandkaninchen gesammelt. Das Blut wurde rnit 200 x g 10 Minuten zentrifugiert. Das überstehende blutplättchenreiche Plasma wurde 15 Minuten mit 800 x g in Gegenwart von Apyrase (20 ug/ml) und PGE&sub1; (5 ng/ml) zentrifugiert. Die Perle wurde wieder in 10 ml Waschpuffer (138 mMol NaCl, 2,9 mMol KCl, 0,31 mMol Na&sub2;HPO&sub4;, 1 mMol MgCl&sub2;, 5 mMol HEPES, pH 6,5, 5 mMol Glucose, 0,1 NaHCO&sub3;, 1 mMol EGTA und 0,35 % Rinderserumalbumin) suspendiert. Apyrase wurde zu einer Endkonzentration von 20 ug/ml zugegeben. Die resuspendierte Perle wurde 15 Minuten niit 800 x g zentrifugiert, dann ein zweites Mal im gleichen Puffer gewaschen. Die gewaschenen Perlen wurden dann in Waschpuffer, pH 7,4, suspendiert, wobei EGTA bei einer Konzentration von 2-5 x 10&sup8; Zellen/ml weggelassen wurde.

Untersuchung der Blutplättchenaggregation

Die Blutplättchenaggregation wurde in einem Aggregometer bei 37ºC gemessen. Das Reaktionsgemisch enthielt gewaschene Blutplättchen (2-5 x 10&sup8; Zellen/ml), Fibrinogen (100 ug/ml), Ca²&spplus; (1 mMol), ADP (10 uM), Epinephrin (2 ug/ml) und die zu untersuchende Inhibitorfraktion für die Blutplättchenaggregation. Die Aggregation wurde eingeleitet durch Zugabe von ADP und Epinephrin eine Minute nachdem die anderen Komponenten zugegeben worden waren. Die Reaktion konnte mindestens 2 Minuten ablaufen. Das Ausmaß der Aggregationshemmung wurde ausgedrückt als Prozentsatz dem in Abwesenheit des Inhibitors beobachteten Aggregation

Reinigung von Echistatin

Assays zur Bestimmung der Blutplättchenaggregation von Kaninchen wurden angewandt, um die Aktivität während der Reinigung zu überwachen. Lyophilisiertes Echis carinatus-Gift (1 g) wurde in 12 ml 10 mM Ammoniumbicarbonat, pH 7,7, enthaltend 20 mM DTT, gelöst. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Lösung 45 Minuten mit 45 000 x g zentrifugiert. Die Perle wurde verworfen und der Überstand auf eine 2,5 x 125 cm Säule aus Sephadex G-5, äquilibriert und eluiert bei 4ºC mit 10 mM MES, pH 5,3, aufgebracht. Fraktionen, die die Blutplättchenaggregation hemmende Aktivität besaßen, wurden zusammengegeben und unter Vakuum eingeengt. Nach dem Entsalzen auf einer Säule von Sephadex G-15 wurden 10 bis 13 mg Protein auf eine Mono S FPLC-Säule aufgebracht, die mit 10 mM MES, pH 5,3, äquilibriert war. Das gebundene Protein wurde bei 4ºC mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl zu 10 mM MES, pH 5,3, fraktioniert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,6 ml/Min. Die Hemmaktivität wurde als einzelner Peak bei ungefähr 0,17 M NaCl eluiert. Die zusammengegebene Aktivität wurde direkt auf eine C18-Phasenumkehr-HPLC-Säule aufgebracht, die mit 0,1 Vol.% Trifluoressigsäure in Wasser äquilibriert war. Die Säule wurde bei Raumtemperatur mit einem Mehrphasenacetonitrilgradienten in 0,1 % wäßrigem TFA mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,7 ml/Min. entwickelt. Die Inhibitoraktivität wurde als einzelner Peak bei einer Acetonitrilkonzentration von 17 % eluiert. Flüchtige Anteile wurden durch Zentrifugieren im Vakuum und anschließendes Lyophilisieren entfernt. Das erhaltene Protein war homogen, wie durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, isoelektrisches Fokussieren, Rechromatographieren über Phasenumkehr-HPLC und N-terminale Sequenzbestimmung beurteilt wurde. Die Ausbeute an gereinigtem Protein, das Echistatin genannt wurde, betrug 2,2 mg aus 1 g Ausgangsmaterial.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Es wurde eine Modifizierung des Laemmli-Systems (Nature, 1970, 227, S. 680-685, worauf verwiesen wird) angewandt. Befestigungs- und Trenngele (1,5 mm) enthielten 8 % bzw. 20 % Polyacrylamid. Harnstoff (8 M) wurde zu dem Trenngel zugegeben. Die Gele wurden 1,5 Stunden bei 85 Volt und dann 17 Stunden bei 90 Volt behandelt. Protein wurde nachgewiesen durch Anfärben mit Coomassie Brilliantblau R-250.

Isoelektrisches Fokussieren

Es wurde ein Servalyt Precote isoelektrisches Fokussiergel verwendet. Die Proben wurden mit konstanter Leistung von 1 Watt in einer LKB-Ultraphore-Vorrichtung behandelt. Die Gele wurden mit Serva-Blau W eingefärbt.

Reduziertes und carboxymethyliertes Echistatin

Echistatin (0,75 mg Protein) wurde eine Stunde bei Raumtemperatur mit 20 mMol DTT in Gegenwart von 0,28 Mol Tris und 6,7 Mol Guanidinhydrochlorid in einem Volumen von 0,6 ml reduziert. Dann wurde Jodessigsäure (0,06 ml) zu einer Endkonzentration von 0,136 Mol zugegeben und die Alkylierung konnte 20 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Das reduzierte carboxymethylierte Echistatin wurde von den Reagentien durch C18-Phasenumkehr-HPLC abgetrennt.

Chymotryptinspaltung von Echistatin

Echistatin wurde mit Chymotrypsin in einem Verhältnis von Substrat zu Protease von 40:1 (Gew/Gew) abgebaut. Die proteolytische Reaktion wurde 4 Stunden bei 37ºC in 0,2 M Ammoniumbicarbonat, pH 7,8, durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde dann lyophilisiert und Chymotrypsinpeptide durch Phasenumkehr-HPLC isoliert.

Bestimmung der Aminosäuresequenz

Gereinigtes Echistatin und ausgewählte Chymotrypsinfragmente wurden der automatischen Proteinsequenzanalyse in einem Applied Biosystems 470A Sequencer unter Anwendung eines Sequenzprogramms und vom Hersteller gelieferter Reagentien unterworfen. Freigesetzte Aminosäurederivate wurden mit Hilfe eines on-line- HPLC-Systems identifiziert.

Proteinbestimmung

Protein wurde bestimmt nach dem Verfahren von Lowry et al. (J. of Biol. Chem., 1951, 193, S. 265-275, auf das hier verwiesen wird) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard.

Ergebnisse

Reinigung

Echistatin wurde zur Homogenität aus dem löslichen Anteil des lyophilisierten Giftes von Echis carinatus in drei chromatographischen Stufen gereinigt. Aufgrund des Vorhandenseins von die Blutplättchenaggregation stimulierender Aktivität in dem rohen Gift, konnte der Inhibitor in dieser Fraktion nicht zuverlässig nachgewiesen werden. Nach Gelfiltration über Sephadex G-50 wurde jedoch ein einzelner Peak an Hemmaktivität beobachtet. Diese Aktivität wurde weiter gereinigt durch Kationenaustausch FPLC auf Mono S und schließlich durch C18-Phasenumkehr-HPLC.
Ein Gramm lyophilisiertes Gift ergab 2,2 mg gereinigtes Echistatin. Dieses Material zeigte ein einziges Band bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von 8 M Harnstoff und beim isoelektrischen Fokussieren. Erneute Chromatographie über Phasenumkehr-HPLC ergab einen einzigen symmetrischen Absorptionspeak, der genau mit der Blutplättchenaggregationsinhibitoraktivität korrespondierte. Eine weitere Bestätigung der Homogenität der Echistatinzubereitung wurde erreicht bei der Aminosäurebestimmung des nativen oder des reduzierten und carboxymethylierten Proteins. Der einzige, in dem ersten Sequenzer zyklus beobachtete Aminosäurerest war Glutaminsäure.

Molekulargewicht und isoelektrischer Punkt

Das scheinbare Molekulargewicht von reduziertem Echistatin während der Elektrcphnrese auf 20 % SDS Polyacrylamidgelen in Gegenwart von 8 M Harnstoff betrug 5800 Dalton. Dies ist ähnlich dem Wert, der aus der Aminosäuresequenz (s. unten) berechnet wurde. Unter nicht-reduzierenden Bedingungen wanderte das Protein etwas langsamer entsprechend einem scheinbaren Molekulargewicht von 7000 Dalton. Uberraschenderweise betrug das scheinbare Molekulargewicht, wenn natives Echistatin mit Hydroxyethyldisulfid behandelt wurde, nur etwa 4000 Dalton. Ein kleineres Band, vermutlich durch inkomplette DerivatbiIdung entstanden, wurde in dem mit Hydroxyethyldisuldid behandelten Echistatin beobachtet.
Sowohl natives als auch mit Disulfid behandeltes Echistatin besaß einen pI von 8,3. Nach Behandlung mit Dithiothreithol wurde ein kleineres Band mit einem pI von 7,5 neben dem überwiegenden Band mit pI 8,3 beobachtet.

Aminosäurezusammensetzung

Die Aminosäurezusammensetzung von Echistatin, das nach 20-stündiger Hydrolyse des reduzierten carboxymethylierten Proteins erhalten wurde, ist in Tabelle I angegeben. Die bei dieser Analyse erhaltene Zusammensetzung wurde verglichen mit der aus der Sequenz (siehe unten) vorausgesagten. Die meisten nach diesen zwei Methoden erhaltenen Werte stimmten nahe überein. Der Gehalt an Cysteinylresten, der sich in der Aminosäurezusammensetzung fand (6,7), war niedriger als der durch die Sequenz vorausgesagte (8). Dies kann auf einer unvollständigen Carboxynethylierung von Echistatin beruhen.

TABELLE I

Vergleich der Aminosäurezusammensetzung von Echistatin zwischen den nach Hydrolyse bestimmten und den aus der Sequenz berechneten Werten: Tabelle I Reste pro Molekül Aminosäure saure Hydrolyse Sequenz Cystein Aspartinsäure 1 Threonin Serin Glutaminsäure 2 Prolin Glycin Alanin Methionin Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Histidin Lysin Arginin Gesamt ¹Der Wert umfaßt Asparagin. ²Der Wert umfaßt Glutamin.

Wirkung von Echistatin auf die Blutplättchenaggregation in vitro

Untersuchungen der Blutplättchenaggregation zeigen, daß Echistatin wirksamer ist als Trigramin bei der Hemmung der durch ADP induzierten Aggregation von menschlichen gelfiltrierten Blutplättchen in Gegenwart von 0,1 M mg/ml Fibrinogen (IC&sub5;&sub0; = 30 nM gg. 150 nM).
Echistatin hemmt die Aggregation von menschlichen Blutplättchen, induziert durch ADP-Collagen, Blutplättchenaktivierungsfaktor oder Epinephrin in Dosen von 30-300 nMol.

Menschliches blutplättchenreiches Plasma

Blut wurde in 0,1 Vol. 3,8 %iges Natriumcitrat aus der Vene von normalen Freiwilligen abgezogen. Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde hergestellt durch Zentrifugieren mit 400 x g während 12 Minuten. Die Aggregation wurde durchgeführt durch Zugebe von ADP-Collagen, Blutplättchenaktivierungsfaktor oder Epinephrin zu PRP und in einem Sienco-Aggregometer gemessen.

Menschliche gelfiltrierte Blutplättchen

Blut wurde in 0,1 Vol. Säure-Citrat-Dextrose (85 mMol Natriumcitrat, 64 mMol Citronensäure, 110 mMol Dextrose) aus der Vene von normalen Freiwilligen abgezogen. Blutplättchenreiches Plasma wurde hergestellt durch 12 Minuten langes Zentrifugieren mit 400 x g. PGE&sub1; (5 ug/ml) wurde zugegeben und die Plättchen wurden durch Zentrifugieren mit 800 x g während 12 Minuten gesammeln. Die Blutplättchenperle wurde erneut in Human-Blutplättchen-Puffer (140 mMol NaCl, 7,9 mMol KCl, 3,2 mMol Na&sub2;HPO&sub4;, 6 mMol HEPES, 2 % Rinderserumalbumin, 0,1 % Dextrose, pH 7,2) suspendiert und über Sepharose 2B, die vorher in Human-Blutplättchen-Puffer äquilibriertt worden war, filtriert. Die Blutplättchen wurden gezählt und mi Human-Blutplättchen-Puffer auf 2 x 10&sup8;/ml eingestellt.

Aminosäuresequenz

Die Aminosäuresequenz von Echistatin wurde erhalten durch automatischen Edman-Abbau des reduzierten carboxymethylierten Proteins. Das Protein besaß 49 Aminosäuren mit einem N-terminalen Glutaminsäurerest und einem C-terminalen Threonin und ist oben angegeben. Cystein macht 8 Reste oder mehr als 16 % der gesamten Aminosäuren in Echistatin aus. Die Sequenz(bestimmung) wurde zweimal mit dem gleichen Ergebnis wiederholt. Wenn die Sequenz von nativem Echistatin bestimmt wurde, wurden keine PTH- Aminosäurepeaks während der Zyklen des Sequenzers beobachtet, wo Cysteinylreste erwartet wurden, was weiter die Zuordnung dieser Reste bestätigt. Der Disulfidstatus dieser Cysteinylreste ist nicht bekannt.
Eine weitere Bestätigung der Sequenz wurde erhalten durch Analyse von Chymotrypsin- Peptiden, die aus dem reduzierten carboxymethylierten Protein isoliert waren (Tabelle II).

TABELLE II

Aminosäurezusammensetzung von Chymotrypsinpeptiden von Echistatin

Die Werte in Klammern sind die Anzahl von Aminosäureresten, die durch die Sequenz bestimmt wurden. Tabelle II
Echistatin enthält die Sequenz Arg-Gly-Asp, die bestimmten Proteinen gemeinsam ist, die an den Glykoprotein IIb/IIIa-Komplex auf der Blutplättchenoberfläche bei den Resten 24- 26 gebunden werden. Diese Sequenz ist Teil einer vermuteten Blutplättchenbindungsstelle auf dem Fibrinogenmolekül.
Echistatin zeigte unübliches Verhalten während der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von 8M Harnstoff. Das native Protein wanderte mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 7000 Dalton, verglichen mit dem Wert von 5400 Dalton, der durch Sequenzanalyse erhalten wurde. Unter nicht reduzierenden Bedingungen werden Proteine mit Disulfidbindungen in den Ketten im allgemeinen an weniger als die erwartete Menge SDS gebunden, während eine vorherige Reduktion die SDS-Bindung auf Werde erhöht, die bei Proteinen auftreten, die keine 0isulfidbindungen in den Ketten besitzen (Pitt-Rivers et al., Biochem. J., 1968, 109, S. 825-830). So legt die Zunahme der Mobilität von reduziertem Echistatin bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nahe, daß dieses Protein in seiner nativen Konformation eine oder mehrere Disulfidbindungen in den Ketten aufweist.
Die Behandlung von Echistatin mit 80 mMol Dithiothreitol bei Raumtemperatur während 20 Minuten zerstörtidie Hemmwirkung gegenüber der Blutplättchenaggregation vollständig. Unter ähnlichen Bedingungen führte eine Behandlung mit 80 mMol Hydroxyethyldisulfid zu dem Verlust von 50 % der Hemmaktivität. Diese Ergebnisse zeigen, ähnlich wie die der SDS-Gelelektrophoreseuntersuchungen, daß eine oder mehrere Disulfidbindungen in den Ketten eine wichtige Rolle spielt bei der Aufrechterhaltung der Konformation von Echistatin, die für die Hemmaktivität notwendig ist.

Beispiel 2

Es wurden Verfahren der Proteinreinigung und Bestimmung wie in Beispiel 1 angewandt, um einen Blutplättchenaggregationsinhibitor zu isolieren, der in Agkistrodon piscivorus-Gift vorhanden ist. Das Protein, dessen Aminosäuresequenz oben identifiziert ist, zeigte Eigenschaften eines BlutpIättchenaggregationshemmers.

Beispiel 3

Es wurden Verfahren der Proteinreinigung und Bestimmung wie in Beispiel 1 angewandt, um einen Blutplättchenaggregationsinhibitor zu isolieren und zu identifizieren, der in Bitis arietans-Gift vorhanden ist. Das Protein, dessen Aminosäuresequenz oben angegeben ist, zeigte Charakteristika eines Blutplättchenaggregationshemmers.

Beispiel 4

Verfahren zur Proteinreinigung und Bestimmung wie in Beispiel 1 wurden angewandt, um einen zweiten Blutplättchenaggregationshemmer zu isolieren und zu identifizieren, der in Bitis arietans-Gift vorhanden ist. Das Protein, dessen Aminosäuresequenz oben angegeben ist, zeigte Charakteristika eines Blutplättchenaggregationshemmers.

Beispiel 5

Verfahren zur Proteinreinigung und Bestimmung wie in Beispiel 1 wurden angewandt, um einen dritten Blutplättchenaggregationshemmer zu isolieren und zu identifizieren, der in Bitis arietans-Gift vorhanden ist. Das Protein, dessen Aminosäuresequenz oben angegeben ist, zeigte Charakteristika eines Blutplättchenaggregationshemmers.

Beispiel 6

Verfahren zur Proteinreinigung und Bestimmung wie in Beispiel 1 wurden angewandt, um einen Blutplättchenaggregationshemmer zu isolieren und zu identifizieren, der in Eristocophis masmahonii-Gift vorhanden ist. Das Protein, dessen Aminosäuresequenz oben angegeben ist, zeigte Charakteristika eines Blutplättchenaggregationshemmers.
Die Reinigung von verschiedenen Polypeptiden, die unter die Formel I fallen, bis zur chemischen Homogenität nach der Erfindung hat eine Aminosäuresequenzbestimmung der Moleküle ermöglicht. Aufgrund der in Formel I angegebenen Aminosäuresequenz kann man vorteilhafterweise ein synthetisches Gen herstellen, das einer angegebenen Aminosequenz entspricht, und dieses Gen in einen entsprechenden Wirt durch geeignete Klonierungsvektoren einführen. Wahlweise wird in Betracht gezogen, daß das reine Polypeptid hergestellt werden kann, indem man das natürliche Gen aus giftbildenden Zellen gewinnt, gefolgt von Rekombination und Klonung. Es ist daher verständlich, daß der Rahmen der Erfindung nicht nur auf Polypeptide beschränkt ist, die isoliert worden sind durch chromatographische Verfahren, wie sie hier angegeben sind, oder Polypeptide, die unter die Formel I fallen, sondern auch solche Polypeptide umfaßt, die durch gentechnische Verfahren hergestellt werden können.

Beispiel 7

DNA-und Plasmidaufbau und Proteinexpression für Rekombinations- Leu-28-Echistatin

Alle Enzyme und DNA-Molekulargewichtmarker stammten von New England Biolabs. Kits zur Sequenzbestimmung von Dideoxy- DNA wurden von United States Biochemical Corporation Inc. gekauft. Authentische-E. coli Jm109 wurde von Stratagene gekauft. Alle anderen Reagentien waren analytisch oder elektrophoretisch rein.
Alle Oligodesoxynucleotide wurden mit Hilfe einer Applied Biosystems 380B DNA-Synthesevorrichtung unter Verwendung von Methylphosphoramidit synthetisiert. Nach der Entfernung der Schutzgruppe mit konzentriertem Ammoniak wurden Oligodesoxynucleotide auf einer Pharmacia NAP-10 Gelfiltrationssäule entsalzt.
Alle Oligodesoxynucleotide wurden mit ATP und T4 Polynucleotidkinase phosphoryliert mit Ausnahme der beiden Oligodesoxynucleotide, die an 5'-Enden beider Stränge hingen. Die mit Kinase behandelten komplementären Oligodesoxynucleotide wurden auf 95ºC erwärmt und dann durch langsames Abkühlen auf Raumtemperatur gekühlt. Die Bindung der drei Doppelstränge wurde 15 Stunden bei 14ºC in einem Reaktionsgemisch, enthaltend 0,5 nMol jedes Doppelstrangs, 50 mMol Tris-HCl, pH 7,8, 10 mMol MgCl&sub2;, 20 mMol Dithiothreitol, 1 mMol ATP, 50 ug/ml Rinderserumalbumin und 4000 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 130 ul durchgeführt. Das Bindungsgemisch wurde durch 10 % native Polyacrylamidgelelektrophorese fraktioniert. Das zusammengesetzte Leu-28-Echistatin-Gen wurde aus dem Polyacrylamidgel herausgeschnitten und elektroeluiert. Das eluierte Leu-28-Echistatin-Genwurde mit Kinase behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, bevor es in den Expressionsvektor eingesetzt wurde.

Aufbau von pJC264 Expressionsvektor

Ein 714bp HindIII-PstI-Fragment von pLC1-28 (erhalten von B. Bachmann, E. coli Genetic Stock Center), enthaltend das 3'-436 bp von dem cheB-Gen und das 5'-263 bp von cheY-Gen (Matsumura et al., J. Bact., 160 (1984) S. 36-41) wurde in die pUC13 HindIII- und PstI-Stellen geklont. Um die einzigartige EcoRI-Stelle in der Mehrfachbindungssequenz von pUC13, das an das cheY-Gen anschließt, zu bewegen, wurden Mehrfachbindungssequenzen zwischen den PstI- und EcoRI-Stellen weggelassen. Der erhaltene Expressionsvektor pJC264 enthält eine einzigartige EcoRI-Stelle, die es erlaubt, interessierende Gene mit dem cheY- Gen zu verschmelzen (Fig. 2). Zu anderen Zwecken wurde die HindIII-Stelle, die pUC13 und das cheB-Gen verbindet, zu einer BamHI-Stelle umgewandelt durch Füllen mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I und Verbinden mit einer synthetischen BamHI-Verbindungssubstanz.
Das synthetische Rekombinations-Leu-28-Echistatin-Gen wurde (Fig. 1) in die EcoRI-Stelle von pJC264 eingefügt durch Binden eines Drittels des synthetischen Leu-28-Echistatin-Gens das oben hergestellt worden war, mit 0,1 ug EcoRI, das aus pJC264 ausgeschnitten war, unter den folgenden Bedingungen: 50 mM Tris- HCl, pH 7,8, 10 mMol MgCl&sub2;, 20 mMol Dithiothreitol, 1 mMol ATP, 50 ug/ml Rinderserumalbumin und 800 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 20 ul. Die Bindung wurde 15 Stunden bei 40ºC durchgeführt.

Transformation der bakteriellen Rezipientenzellen und Identifizierung der positiven Klone

Ein Drittel des pJC264 Expressionsvektors, enthaltend das insertierte r-Leu-28-Echistatin-Gen(7 ul), wurde angewandt, um 50 ml authentische JM119 Zellen unter Standardbedingungen zu transformieren. Die Klone, enthaltend das r-Leu-28-Echistatin- Gen, wurden ausgewählt durch Restriktionskartierung. Das Vorhandensein der Kodierungssequenz von Echistatin wurde durch Dideoxysequenzanalyse verifiziert.

Zellwachstum und Erzeugung von Fusionsproteinperlen

Die Kulturen wurden mit einer Über-Nacht-Saatkultur (1 Vol.%) inokuliert und in LB-Medium, enthaltend 100 ug Amipicillin/ml gezüchtet. Wenn die Zelldichte eine OD&sub6;&sub0;&sub0;-Ablesung von 0,2 bis 0,3 erreichte, wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mMol zugegeben. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren nach weiterem 10-stündigem Wachstum geerntet. Die Zellperle aus einer 3000 ml-Kultur wurde in Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml suspendiert und 10 Minuten bei 4ºC beschallt unter Verwendung eines Fisher Sonic Dismembrators, Modell 300, mit der großen Spitze bei maximaler Kraft. Das beschallte Gemisch wurde 15 Minuten bei 20 000 g zentrifugiert. Die Perle wurde erneut in 8 ml Wasser suspendiert und auf 50 % Saccharose in 15 mMol Tris-HCl, pH 7,4, und 0,15 M NaCl, aufgeschichtet. Nach dem Zentrifugieren bei 113 000 Upm während 30 Minuten in einem SW28 Beckman-Rotor bei 6ºC wurde die das unlösliche cheY-Leu-28-Echistatinfusionsprotein enthaltende Perle wieder in 6 ml Wasser suspendiert.

Spaltung des Fusionsproteins

Die das Fusionsprotein enthaltende Perle aus einer 1000 ml Kultur wurde mit 60 mMol Cyanogenbromid in 70 % Ameisensäure in einem Gesamtvolumen von 13 ml gespalten. Die Reaktion lief 15 Stunden bei Raumtemperatur ab. Die Reagentien wurden durch extensive Dialyse und Lyophilisieren entfernt.

Reinigung und Rückfaltung von Rekombinations-Leu-28-Echistatin

Das gespaltene Fusionsprotein wurde zunächst mit 8 M Guanidin-HCl 5 Minuten bei 60ºC denaturiert und dann mit 0,15 M Dithiothreitol bei Raumtemperatur 10 Minuten in Gegenwart von 0,35 Mol Tris-Base und 6 Mol Guanidin-HCl reduziert. Das reduzierte Leu-28-Echistatin wurde gereinigt durch C18 Phasenumkehr- HPLC mit einem 0 bis 65 % Acetonitrilgradienten in Gegenwart von 0,1 % Trifluoressigsäure. Das durch HPLC gereinigte r-Leu-28-Echistatin wurde oxidativ wieder in 0,1 M Ammoniumacetat bei einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml gefaltet. Die Faltungsreaktion lief 72 Stunden bei Raumtemperatur ab unter Vortex-Mischen etwa einmal alle 12 Stunden.

Bestimmung der Blutplättchenaggregation

Die Blutplättchenaggregation wurde durch Zunahme der Lichtdurchlässigkeit gemessen. Kurz gesagt, wurde r-Leu-28-Echistatin zu dem Reaktionsgemisch, enthaltend gel-filtrierte Humanblutplättchen (2 x 10&sup8; Zellen/ml), Fibrinogen (100 ug/ml) und Ca&spplus;&spplus; (1 mMol) zugegeben. Die Blutplättchenaggregation wurde eingeleitet durch Zugabe von ADP (Endkonzentration 10 uM) eine Minute nachdem die anderen Komponenten zugegeben worden waren. Die Geschwindigkeit oder das Ausmaß der Aggregation wurde ausgedrückt als Prozentsatz der maximalen Lichtdurchlässigkeit, die in Abwesenheit von Echistatin erzielt wurde.

Fließschema zur Erzeugung von Rekombinations-Leu-28-Echistatin E. coli (Ankerplasmid pJC264-Echistatin)

Induzieren von w/IPTG
Zellernte
Zell-Lyse
Zentrifugieren
Fusionsproteinperle
Cyanogenbromid
CnBr-gespaltene Fusionsproteinperle
Denaturieren (Guanidin-HCl)
Reduzieren (Dithiothreitol)
Vollständig reduzierte, gespaltene Fusionsproteinperle
C18 Phasenumkehr-HPLC
Vollständig reduziertes r-Leu-28-Echistatin
Reoxidation/Rückfaltung
C18 Phasenumkehr-HPLC
Gereinigtes, oxidiertes r-Leu-28-Echistatin

Gestalt und Aufbau von synthetischem Gen

Natives Echistatin ist ein Einzelkettenpolypeptid mit 49 Aminosäureresten mit einem pI von 8,3. Ein synthehtisches r-Leu-28-Echistatin-Genwurde ausgebildet und mit dem E. coli cheY-Gen verschmolzen. Die primären Strukturen der Blutplättchenaggregationshemmer, die von anderen Quellen des Giftes von Vipern isoliert worden waren, haben gezeigt, daß Methionin 28 eine nicht konservierte Aminosäure in dieser Gruppe von Inhibitoren ist (Huang et al., (1987) J Biol. Chem., 262, S. 16157- 16163). Daher wurde Nethionin 28 von Echistatin durch ein Leucin ersetzt und ein Methionin wurde zwischen das cheY-Protein und Rekombinations-Leu-28-Echistatin eingefügt, um eine Stelle für die Cyanogenbromidspaltung zu bilden (Fig. 1). Zwei klebrige EcoRI-Enden wurden an den flankierenden Enden ausgebildet, um eine Verbindung mit dem Expressionsvektor zu ermöglichen. Es wurde ein Stop-Codon unmittelbar vor der 3'-flankierenden EcoRI-Stelle eingefügt. Das synthetische r-Leu-28-Echistatin-Gen wurde aus drei Doppelstrangfragmenten zusammengestellt, die KpnI- und Aval-Restriktionsstellen an den Verbindungsstellen enthalten. Bevorzugte E. coli-Codons wurden in dem Struktur-Gen angewandt, außer wenn Restriktionsstellen absichtlich erzeugt wurden. Das aufgebaute Gen wurde verifiziert durch Restriktionskartierung und DNA-Sequenzanalyse.

Aufbau des Expressionsvektors

Um r-Leu-28-Echistatin in E. coli zu exprimieren, wurde der Expressionsvektor pJC264 verwendet. Der Vektor (Fig. 2) enthält das Gen, das die aminoterminalen 88 Aminosäuren von E. coli cheY-Protein kodiert, wie oben gezeigt, damit es ausgiebig und stabil in E. coli exprimiert wird (Matsumura et al., (1984), J. Bact., 160, S. 36-41). Die CheY-Genexpression in diesem Vektor wird kontrolliert durch E. coli lac-Promotor-Operator von pUC13 (Messing, Methods in Enzymology, Wu et al., Hrsg. Academic Press, New York, 101, S. 20-78 (1983)). Nach dem cheY-Gen in pJC264 erleichtern einzigartige PstI- und EcoRI-Stellen das Klonen von neuen offenen Leserastern und ihre induzierbare Expression als cheY-Fusionsproteine. Das synthetische r-Leu-28-Echistatin-Genwurde in die EcoRI-Stelle von pJC264 insertiert. Die Struktur des cheY-Echistatinexpressionsvektors ist in Fig. 2 angegeben.
Dieser Vektor besitzt verschiedene Vorteile gegenüber existierenden Expressionssystemen. CheY-Fusionen werden häufig mit sehr hohen Stärken exprimiert (siehe unten und Bailey et al., (1987) J. Indust. Micro., 2, S. 47-52). Der Vektor ist abgeleitet von dem Plasmid pUC13 mit hoher Kopienzahl (Messing, Methods in Enzymology, Wu et al., Hrsg. Academic Press, New York, 101 (1983) S. 20-78) und die wirksame Replikation kann zu der hohen beobachteten Expressionsstärke beitragen. CheY-Fusionsproteine erweisen sich häufig als unlösliche Einschlußkörper. Diese Unlöslichkeit kann bei der Reinigung des Fusionsproteins ausgenutzt werden. Die Unlöslichkeit des Proteins kann auch seinen Abbau durch intrazelluläre Protease verhindern. Aufgrund der geringen Größe der cheY-Einheit ist das Massenverhältnis des interessierenden Proteins höher als es erreicht würde durch Fusion mit der größeren, häufiger angewandten β-Galactosidase. Schließlich werden durch die Abwesenheit von Cysteinresten in dem CheY-Protein mögliche Probleme durch inkorrekte Bildung von Disulfidbindungen in dem Fusionsprotein umgangen.

Expression von Rekombinations-Leu-28-Echistatin

Die Expression von Rekombinations-Leu-28-Echistatin in E. coli JM109 wurde wie oben beschrieben durch IPTG induziert. Das Expressionsprodukt nach verschiedenen Zeiten nach der Induktion wurde analysiert durch 14 % SDS PolyacrylamidgeleIektrophorese. 2 Stunden nach der Induktion wurde ein Polypeptid mit dem erwarteten Molekulargewicht des cheY-Echistationfusions proteins (14,5 kDa) in dem gesamten zellularen Lysat nachgewiesen (Fig. 3). 6 Stunden nach der Induktion sammelte sich dieses Protein bis zu einem maximalen Gehalt an, der mindestens 20 % des gesamten Zellproteins ausmachte. Das exprimierte Protein war nach der Beschallung der Zellen unlöslich, was nahelegt, daß während der Expression Einschlußkörper gebildet worden waren. Die beschallte Perle wurde der Cyanogenbromidspaltung zur Isolierung von Rekombinations-Leu-28-Echistatin unterworfen.

Reinigung und Renaturierung von Rekombinations-Leu-28-Echistatin

Die mit Cyanogenbromid gespaltenen Proteine wurden reduziert mit einem Überschuß an Dithiothreitol in Gegenwart von 6 M Guanidin-HCl vor der Reinigung. Fraktionierung der reduzierten Proteine durch Phasenumkehr-HPLG zeigte einen Peak mit einer Retentionszeit ähnlich derjenigen von reduziertem nativem Echistatin (Fig. 4A und B). Die Aminosäuresequenzanalyse des Proteins aus diesem Peak zeigte, daß es Rekombinations-Leu-28-Echistatin mit einer Reinheit von mehr als 90 % enthielt. Da das reduzierte Echistatin in 0,1 % Trifluoressigsäure (etwa pH 2) während der HPLC vorlag, wurde angenommen, daß die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion innerhalb des Rekombinations-Leu-28-Echistatin sehr langsam wäre. Daher wurde das Iyophilisierte Echistatin direkt in Gegenwart von 0,1 M Ammoniumacetat gefaltet ohne weitere Denaturierung und Reduktion. Es wurde angegeben, daß die Renaturierung des inaktiven Proteins erleichtert wird durch Zugabe eines Thiol/Disulfid-Gemisches zu der Renaturierungslösung (Tam et al., Nature, 309 (1984) S. 376-378). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde Rekombinations-Leu-28-Echistatin mit 0,5 mM Dithiothreitol und 1 mM oxidiertem Dithiothreitol in Gegenwart von 6 M Guanidin-HCl renaturiert. Die Ausbeute an gefaltetem Echistatin wurde unter solchen Bedingungen jedoch nicht erhöht. Korrekt gefaltetes Echistatin wurde aus den nicht gefalteten Arten durch Phasenumkehr-HPLC isoliert. Das HPLC-Profil, das in Fig. 4C angegeben ist, zeigte, daß mehr als 30 % des reduzierten Echistatins unter den gegebenen Bedingungen korrekt gefaltet war. Die Menge des korrekt gefalteten reinen Echistatins, das durch das Reinigungsverfahren erhalten wurde, wurde zu etwa 1,5 mg/l Zellkultur angenommen. Rekombinations-Leu-28 Echistatin wurde aus einer C18-Säule mit einer etwas höheren Konzentration an Acetonitril als natives Echistatin eluiert (Fig. 4C und 4D). Das kann das Ergebnis des Ersatzes von Methionin 28 in nativem Echistatin durch Leucin in Rekombinations-Leu-28-Echistatin sein. Die N-terminale Aminosäuresequenz von Rekombinations-Leu-28-Echistatin wurde durch automatisierten Edman-Abbau bestimmt. Es zeigte sich, daß die Sequenz bis zu dem Rest 32 vom N-Terminus aus mit nativem identisch war mit Ausnahme des ustausches von Leucin gegen Methionin im Rest 28.

Biologische Aktivität von Rekombinations-Leu-28-Echistatin

Ein Vergleich der biologischen Aktivität von Rekombinations-Leu-28- und nativem Echistatin ist in Fig. 5 angegeben. Die Hemmung der Blutplättchenaggregation durch Echistatin wurde in Gegenwart von Humanfibrinogen und CaCl&sub2; nach Zugabe von ADP gemessen. Ebenso wie natives Echistatin beeinflußte das Rekombinationsprotein die anfängliche Abnahme der Lichtdurchlässigkeit nach Zugabe von ADP nicht (Fig. 5A), was nahelegt, daß die Inhibitoren die Blutplättchenaktivierung nicht beeinflussen. Rekombinations-Leu-28-Echistatin und natives Echistatin hemmten die Blutplättchenaggregation, gemessen zu einem beliebigen Ausmaß der Aggregation mit dem gleichen IC&sub5;&sub0;-Wert (Fig. 5B) . Daher scheint Rekombinations-Leu-28-Echistatin mit nativem Echistatin in seiner Fähigkeit, die Blutplättchenaggregation zu beeinflussen, identisch zu sein. Die Ergebnisse legen nahe, daß das Vorhandensein von Methionin in Stellung 28 in nativem Echistatin nicht wesentlich ist für die korrekte Faltung und biologische Aktivität dieses Blutplättchenaggregationshemmers.
Bei der Anwendung der Rekombinations-DNA-Technologie besteht die Möglichkeit zur Herstellung von abgeleiteten Polypeptiden, die verschieden modifiziert sind, durch resultierende einzelne oder mehrfache Aminosäuresubstitutionen, Weglassungen, Additionen oder Ersatz, zum Beispiel durch ortsspezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA. Alle derartigen alle-Ien Variationen und Modifikationen, die zu Polypeptidderivaten führen, fallen in den Rahmen der Erfindung, solange die wesentliche charakteristische blutplättchenaggregationshemmende Wirkung in der Art nicht angegriffen wird. Die Polypeptide werden hergestellt (1) mit Methionin als erste Aminosäure (die vorhanden ist aufgrund der ATG-Startsignal-Codoninsertion vor dem Strukturgen) oder (2) wenn das Methionin intra- oder extrazellulär abgespalten ist, mit ihrer üblicherweise ersten Aminosäure oder (3) zusammen mit entweder ihrem Signalpolypeptid oder einem anderen konjugierten Protein als das übliche Ausgangspolypeptid, wobei das Signalpolypeptid oder Konjugat in intra- oder extrazellulärer Umgebung abspaltbar ist (s. GB-A-2 007 676A) oder (4) durch direkte Expression in reifer Form, ohne daß es notwendig ist, irgend ein äußeres überflüssiges Polypeptid abzuspalten. Das letztere ist besonders wichtig, wenn ein gegebener Wirt ein Signalpeptid nicht oder nicht wirksam entfernen kann, wo das Expressionsvehikel so ausgebildet ist, daß es das Protein zusammen mit seinem Signalpeptid exprimiert. In jedem Falle wird der so erzeugte Blutplättchenaggregationshemmer in seinen verschiedenen Formen gewonnen und gereinigt bis zu einem Grad, der zur Anwendung bei der Behandlung von verschiedenen Gefäßzuständen oder Erkrankungen geeignet ist.

Synthetische Polypeptide der Formel I

Polypeptide nach der Erfindung können hergestellt werden unter Anwendung einer Festphasensynthese, wie sie beschrieben ist von Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1964), obwohl auch andere entsprechende chemische Synthesen, wie sie bekannt sind, angewandt werden können, wie die Synthese nach Houghten, Proc. Natl. Acal. Sci., 82, 5132 (1985). Die Festphasensynthese geht aus von dem C-Terminus des Peptids durch Kuppeln einer geschützten Aminosäure an ein geeignetes Harz, wie es allgemein angegeben ist in der US-PS 4 244 946, veröffentlicht am 21. Januar 1982 von Rivier et al., auf die hier verwiesen wird. Beispiele für die Synthese dieser allgemeinen Art sind angegeben in den US-PS 4 305 872 und 4 316 891. Die Diskussion der Festphasensynthese eines 41-Reste-Polypeptids ist angegeben in Sciene, 213, 1394-1397 (September 1981) in einem Artikel von Vale et al., der sich auf eine detailliertere Diskussion der Synthese bezieht, die in einem Artikel von Marke et al. in J. Am. Ghem. Soc., 103, 3178 (1981) angegeben ist.
Beim Synthetisieren der Polypeptide wird die carboxylterminale Aminosäure, deren α-Aminogruppe geeignet geschützt ist, an ein chlormethyliertes Polystyrolharz oder ähnliches gekuppelt. Nach Entfernung der α-Aminoschutzgruppe, zum Beispiel unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, kann die nächste Stufe der Synthese ablaufen. Andere geeignete Spaltungsreagentien und Bedingungen zur Entfernung von spezifischen Aminoschutzgruppen können angewandt werden, wie sie in der Literatur angegeben sind.
Die verbleibenden α-Amino- und Nebenketten-geschützten Aminosäuren werden dann schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekuppelt, um eine Zwischenverbindung zu erhalten, die an das Harz gebunden ist. Als Alternative zur getrennten Addition jeder Arninosäure bei der Synthese können einige von ihnen aneinandergekuppelt werden vor der Addition zu der wachsenden Festphasenkette. Die Selektion der entsprechenden Kupplungsreagentien liegt im fachmännischen Können.
Chemischen Synthesen von Polypeptiden gemeinsam ist der Schutz der labilen Nebenkettengruppen der verschiedenen Aminosäureeinheiten mit geeigneten Schutzgruppen an dieser Stelle, bis die Gruppe zum Schluß, nachdem die Kette vollständig zusammengesetzt ist, entfernt wird. Ebenfalls gemeinsam ist der Schutz der α-Aminogruppe an einer Aminosäure oder einem Fragment, während diese Einheit an der Carboxylgruppe reagiert, und anschließende selektive Entfernung der α- Aminoschutzgruppe, damit eine anschließende Reaktion an dieser Stelle stattfinden kann. Folglich ist es üblich, als eine Stufe der Synthesen eine Zwischenverbindung herzustellen, die jeden der Aminosäurereste an der gewünschten Stelle der Sequenz in der Peptidkette umfaßt, wobei verschiedene dieser Reste Nebenketten-Schutzgruppen enthalten. Diese Schutzgruppen werden dann gemeinsam im wesentlichen zum gleichen Zeitpunkt entfernt, um das gewünschte Produkt nach der Reinigung zu erhalten.
Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vollständig ist, wird das Zwischenprodukt-Peptid von dem Harzträger entfernt durch Behandlung mit einem Reagens, wie flüssiger HF, das nicht nur das Peptid von dem Harz abspaltet, sondern auch alle verbleibenden Nebenkettenschutzgruppen abspaltet. Das Polypeptid kann dann gereinigt werden durch Geldurchdringung und anschließende semipräparative HPLC, wie es beschrieben ist von Rivier et al., Peptides: Structure and Biological Function (1979) S. 135-128. Eine Reinheit von mindestens 93 % oder darüber (bezogen auf alle vorhandenen Peptide) ist vernünftig erzielbar und sie ist zur klinischen Untersuchung und/oder Anwendung bevorzugt. Eine Reinheit von 98 % ist erreichbar, für bestimmte in vitro-Anwendungen können jedoch geringere Reinheiten annehmbar sein. Folglich wird das Polypeptid als geeignet angesehen, wenn es in im wesentlichen reiner Form vorliegt, was für die erfindungsgemäßen Zwecke mindestens 50 Gew.% bedeutet, bezogen auf alle vorhandenen Peptide.
Beispiele für verschiedene Polypeptide nach der Erfindung und Syntheseverfahren sind unten angegeben.

Beispiel 8

Boc-O-Benzylthreonin-PAM-Harz, mit Boc geschützte Aminosäuren und alle anderen Reagentien, die zur Synthese mit der Applied Biosystems 430 A (ABI) Peptid Synthese-Vorrichtung erforderlich sind, wurden vom Hersteller erhalten. An der Nebenkette geschütztes Asp, Glu und His wurden von Bachem Inc. erhalten. Die Lösungsmittel Dimethylformamid (DMF) und Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) wurden von Burdick und Jackson erhalten. Dithiothreitol (DTT) wurde von Bethesda Res. Labs. erhalten. Dithioerythritol (DTT) wurde erhalten von Chemical Dynamics. p- Cresol und p-Thiocresol wurden erhalten von Aldrich Chemical Co.

Echistatin-Synthese

Ausgehend von 0,50 mMol (0,69 g) Boc-Thr(Bzl)O-Pam- Harz (Substitution von 0,72 mMol Thr/g Harz) wurde die Synthese stufenweise durchgeführt unter Anwendung der automatischen ABI- Peptidsynthetisiervorrichtung. Kent und Clark-Lewis (1985) Synthetic Peptides in Biology and Medicine, Proc. Labsystems Res. Symp., Hrsg., Alitalo et al., Elsevier, Niederlande, S. 29-57. Die Aminosäuren wurden eingeführt unter Verwendung von vorgepackten Patronen (je 2 mM) des Herstellers. Schutzsubstanzen für die Seitenketten waren Arg (Tos), Asp (OcHx), Cys (Meb), Glu (OcHx), His (Bom) Lys[Z(Cl)], Ser (Bzl), Thr (Bzl), Tyr[Z(Br)]. [Tos, Tosyl; cHx, Cyclo-hexyl; Meb, 4-Methylbenzyl; Z(Cl), 2- Chlorbenzyloxycarbonyl; Bom, Benzyloxymethyl; Bzl, Benzyl; z(Br), 2-Brombenzyloxycarbonyl]. Doppelkupplung mit symmetrischen Anhydriden (in CH&sub2;Cl&sub2; und anschließenden Lösungsmittelaustausch mit DMF) wurde für alle Boc-geschützten Aminosäuren angewandt, ausser für Arg (Tos), Asn und Bis (Bom), wo Hydroxybenzotriazolester in DMF bei einer Doppelkupplung verwendet wurden. Als Schutz gegen unerwünschte säurekatalysierte Oxidationen von Cys und Met (Draper et al. (1973) J. Med. Chem. Bd. 16, S. 1326-1329) während der Entblockierung mit Trifluoressigsäure (TFA) wurde 0,1 % (Gew/VoI) DTE als Abfangmittel zugegeben. Nach der Kupplung des N-terminalen Glu wurde die Boc-Gruppe entfernt unter Verwendung von TFA und das Peptid-Harz wurde getrocknet. Das Endgewicht des am N-Terminus entblockierten Peptid-Barzes betrug 4,15 g.

HF-Spaltung und Oxidation

Das aufgebaute Peptid-Harz (2,0 g) wurde in 3 ml eines 1:1 (Vol:Vol) -Gemisches von p-Thiocresol/p-Cresol in einer HF-Vorrichtung (Peninsula Labs. Inc., Type 1B) suspendiert. Das System wurde mit einer mechanischen Vakuumpumpe evakuiert und HF (30 ml) unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff kondensiert. Nach 1 1/2 Stunden langem Rühren bei 0 bis 5ºC wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum eingedampft unter Anwendung einer Falle mit flüssigem Stickstoff (20 bis 30 Minuten) . Der Rückstand wurde mit Ether verrieben, filtriert und dreimal mit weiterem Ether gewaschen. Der filtrierte Rückstand wurde sofort in 4 l einer gerührten Lösung von verdünnter Essigsäure (0,4 % /H&sub2;O) überführt. Nach einigen Minuten langem Rühren wurde der pH-Wert des Gemisches mit Ammoniumhydroxid auf 8,0 eingestellt. Nach Filtration zur Entfernung des Harzes wurde das rohe Oxidationsprodukt ohne Rühren bei 5ºC gehalten (18 Stunden) und anschließend bei Raumtemperatur (19 bis 20ºC) während 3 Tagen. Analytische HPLC wurde angewandt, um das Fortschreiten der Oxidation zu überwachen. Ein qualitativer Ellman-Test (Habeeb, Methods in Enzymology (1972), Hrsg. Hirs and Timasheff, Academic Press New York, S. 457-464) wurde angewandt, um das Verschwinden von freien Sulfhydrylgruppen zu überwachen, bevor die Reinigung durchgeführt wurde. Dieser Test wurde an einer 1 ml-Probe durchgeführt, die lyophilisiert worden war, um restliches p-Thiocresol zu entfernen.

Reinigung von rohem oxidiertem Echistatin

Die rohe oxidierte Lösung (4 l) wurde durch Zugabe von Essigsäure (10 ml) angesäuert und direkt auf eine C&sub1;&sub8;-Silica (5 x 30 cm, 15 m 300 A) -Kartusche (Waters Associates) gepumpt. Das Produkt wurde unter Anwendung von präparativer HPLC (Separations Technology, Inc.) gereinigt. Ein Stufengradient (100 ml Zunahme) wurde aus je 1 l mit nach und nach zunehmenden Konzentrationen an mobiler Phase gebildet. Es wurde eine Durchflußgeschwindigkeit von 70 ml/Min. angewandt, um das Produkt zu eluieren. Homogene (> 95 %) Fraktionen, bestimmt durch RP-HPLC (Vydac C&sub1;&sub8;, 218TP5415), wurden zusammengegeben und lyophilisiert und ergaben 72 mg Produkt. Das halbreine Produkt war verunreinigt mit einer weniger polaren Komponente als Schulter zu dem Produktpeak. Das Produkt wurde weiter gereinigt durch erneute Durchführung über HPLC auf die gleiche Weise wie oben beschrieben und ergab Echistatin (54 mg). Bezogen auf 0,25 mM Ausgangsharz stellte dieses Gewicht eine Gesamtausbeute von 4 % dar. Die Homogenität wurde durch analytische HPLC gezeigt. Gemeinsame Injektion des synthetischen Produktes mit nativem Material ergab einen einzigen Peak. Das Produkt wurde ferner charakterisiert durch Aminosäureanalyse nach Hydrolyse mit 6N HCl (Tabelle 3) und durch automatisierten Edman-Abbau (ABI 470A Protein Sequencer). TABELLE 3 AMINOSÄUREANALYSEa VON SYNTHETISCHEM ECHISTATIN (Theoreitsche Werte in Klammern) aNach Hydrolyse mit 6N HCl 70 Stunden bei 100ºC. bKorrigiert für den Abbau während der Hydrolyse. cUnkorrigiert. dBestimmt als Cysteinsäure nach Durchführung der Säureoxidation.
Maximal 1,9 % (Abweichung von der) Voraussage wurden beobachtet. Die hohe Ausbeute an PTH-Aminosäuren aus der ersten Stufe zeigt auch, daß keine Cyclisierung des C-terminalen Glu zu Pyro-Glu eingetreten war.

Reduktion und Faltung von synthetischem Echistatin

Synthetisches Echistatin (0,50 mg) wurde in 1 ml 0,07 M Ammoniumacetat, pH 8,0 (10 mMol DTT) gelöst und der Verlauf der Reduktion durch analytische HPLC verfolgt. Nach einer Stunde war das Ausgangsmaterial quantitativ zu einem einzigen reduzierten Produkt umgewandelt. Dialyse (24 Stunden) des reduzierten Produktes unter Anwendung eines Celluloseschlauches mit 12 mm Durchmesser, 1000 MW Schnitt (Spectrum Medical Ind.) gegen (4 l) eines 0,07 M Ammoniumacetatpuffers (pH 8,0) bildete nur Echistatin. Um zu zeigen, daß das Echistatin in seiner vollständig reduzierten Form vor der Reoxidation vorlag, wurde die DTT- Reduktion von synthetischem Echistatin wie beschrieben wiederholt, aber in Gegenwart von 6M Guanidinhydrochlorid. Analytische HPLC bestätigte, daß die reduzierten Produkte identische Zeiten besaßen. Die Isolierung von reduziertem Echistatin durch semipräparative HPLC und anschließende quantitative Ellman-Analyse (Habeeb, a.a.O.) zeigte, daß das Produkt in Octahydroform vorlag.

Blutplättchenaggregationsassay

Die Blutplättchenaggregation wurde bei 37ºC in einem Chronolog-Aggregometer gemessen. Das Reaktionsgemisch enthielt gewaschene Blutplättchen (2 x 10&sup8;/ml), Fibrinogen (100 mg/ml), Ca²&spplus; (1 mMol) und die zu untersuchende Blutplättchenhemmerfraktion. Die Aggregation wurde eingeleitet durch Zugabe von 10 mM ADP, 1 Minute nachdem die anderen Komponenten zugegeben worden waren. Die Reaktion konnte mindestens 2 Minuten ablaufen. Das Ausmaß der Aggregationshemmung wurde ausgedrückt als Prozentsatz der in Abwesenheit des Inhibitors gemessenen Aggregation. Synthetisches Echistatin besitzt chemische und biologische Eigenschaften, die nicht unterscheidbar sind von denjenigen von natürlichem Echistatin (Tabelle 4). TABELLE 4 WIRKUNG VON NATIVEM ECHISTATIN UND SYNTHETISCHEM ECHISTATIN AUF DIE HEMMUNG DER AGGREGATION VON MENSCHLICHEN BLUTPLÄTTCHEN Peptid IC&sub5;&sub0; (uMol) (95 % Vertrauensgrenze) Natives Echistatin Synthetisches Echistatin
Die Konzentration an Peptid, die erforderlich ist, um die Aggregation von menschlichen Blutplättchen um 50 % zu hemmen (IC&sub5;&sub0;), wurde bestimmt unter Verwendung von Plättchen von 2 bis 4 Spendern. Die Bestimmungen wurden für jeden Spender doppelt durchgeführt.

Beispiele 9 bis 20

Nach den allgemeinen Syntheseverfahren zur Herstellung von Echistatin, wie in Beispiel 8 beschrieben, wurden viele Polypeptide mit Sequenzen ähnlich derjenigen von Echistatin, die unter die allgemeine Formel I fallen, hergestellt. TABELLE 5 SYNTHETISCH HERGESTELLTE ECHISTATIN-ANALOGE UND IHRE WIRKUNG AUF DIE AGGREGATION VON MENSCHLCHEN BLUTPLÄTTCHEN Beispiel Nr. Sequenz IC&sub5;&sub0; (uMol) (95 % Vertrauensgrenze) Phe-27-Echistatin Phe-27, Leu 28-Echistatin Trp-27-Echistatin Pro-23, -Phe-27, -Leu-28-Echistatin Leu-28-Echistatin Phe-28-Echistatin Asn-22, -Phe-27, -Leu-28-Echistatin (1-41)-Echistatin-amid (1-43)-Echistatin-amid Met-SO-28-Echistatin (1-39)-Echistatin-amid (1-39)-Echistatin
Die obigen Abkürzungen definieren die verschiedenen synthetisierten Polypeptide. In den Beispielen 9 bis 15 und 18 ist (sind) die Stellung(en) in der Sequenz, die substituiert ist (sind), und der/die Rest(e), die (den) natürlich vorkommende(n) Rest(e) ersetzen, angegeben (zum Beispiel in Beispiel 9 ist Asp, der in 27-Stellung in natürlichem Echistatin vorkommende Rest, ersetzt durch Phe). Die Reste 1 bis 26 und 28 bis 49 sind mit natürlichem Echistatin identisch. Beispiele 16, 17, 19 und 20 sind Sequenzen, bei denen Reste nach dem Carboxylende hin weggelassen worden sind (zum Beispiel sind in Beispiel 20 die Reste 40 bis 49 weggelassen worden). Met-SO in Beispiel 18 bedeutet Methioninsulfoxid.

Therapeutische Eignung

Erfindungsgemäße Polypeptide können verabreicht werden in irgend einer Situation, wo die Hemmung der Blutplättchenaggregation oder Adhäsion bei Menschen oder Säugetieren erwünscht ist.
Erfindungsgemäße Polypeptide werden schnell aus dem Kreislauf entfernt und sind besonders geeignet zur Hemmung der Blutplättchenaggregation in Fällen, wo eine starke antithrombotische Wirkung von kurzer Dauer erforderlich ist. So können sie Anwendung finden in der Chirurgie von peripheren Arterien (Arterientransplantationen, Carotis-Endarteriektomie) und bei der Herzgefäßchirurgie, wo eine Manipulation von Arterien und Organen und/oder die Wechselwirkung von Blutplättchen mit künstlichen Oberflächen zu einer Blutplättchenaggregation und einem Verbrauch führt. Die aggregierten Blutplättchen können Thromben bilden und zur Thromboembolie führen. Erfindungsgemäße Polypeptide können an diese Operationspatienten verabreicht werden, um die Bildung von Thromben ünd Thromboembolie zu verhindern.
Bei der Herzgefäßchirurgie wird üblicherweise ein exkorporaler Kreislauf angewandt, um Blut zu oxidieren. Blutplättchen haften an der Oberfläche des extrakorporalen Kreislaufs. Eine Haftung hängt ab von der Wechselwirkung zwischen GPIIb/IIIa an den Blutplättchenmembranen und an der Oberfläche des Kreislaufs adsorbiertem Fibrinogen. (Gluszko et al., Amer. J Physiol., 1987, 252:H, S. 615-621). Blutplättchen, die von künstlichen Oberflächen abgelöst sind, zeigen eine schlechtere hämostatische Wirkung. Erfindungsgemäße Polypeptide können zur Verhinderung der Haftung verabreicht werden.
Andere Anwendungen für diese Polypeptide umfassen die Verhinderung der Blutplättchenthrombose, Thromboembolie und Wiederverschluß während und nach der thrombolytischen Therapie und Verhinderung von Blutplättchenthrombose, Thromboembolie und Wiederverschluß nach Gefäßplastik der Herzkranz- und anderer Arterien und nach Bypaß-Operationen der Herzkranzarterien. In vielen klinischen Zentren erhalten Patienten, die derartigen Verfahren unterworfen werden, Antiplättchen-Arzneimittel, die schwächere Inhibitoren für die Blutplättchenaggregation sind, verglichen mit erfindungsgemäßen Polypeptiden. Erfindungsgemäße Polypeptide können auch angewandt werden, um einen Myocardinfarkt zu verhindern.
Diese Polypeptide können auf irgend eine geeignete Weise verabreicht werden, die zu ihrer Freisetzung in dem Blutstrom in nennenswerter Menge führt. Sie können mit thrombolytischen Mitteln, wie Plasminogenaktivatoren oder Streptokinase, kombiniert werden, um die Blutplättchenaggregation zu hemmen. Sie können auch mit Antikoagulantien, wie Heparin, Aspirin oder Warfarin kombiniert werden. Die intravenöse Verabreichung wird zur Zeit als bevorzugte Verabreichungsroute angesehen. Sie sind in Wasser löslich und können daher wirksam in Lösung verabreicht werden.
Bei einer beispielhaften Anwendung wird eine geeignete Menge Echistatin intravenös an einen Patienten mit einer Herzattacke verabreicht, der eine Gefäßplastik erhält. Die Verabreichung findet während oder wenige Minuten vor der Angioplastik statt und zwar in einer Menge, die ausreicht, um die Blutplättchenaggregation zu verhindern, zum Beispiel in einer Menge, die eine Gleichgewichtsplasmakonzentration zwischen etwa 0,05 bis 2 uM ergibt. Sollte bei dem Patienten eine Bypassoperation erforderlich sein, kann die Echistatinverabreichung sofort gestoppt werden und führt zu keinen Komplikationen während der Operation wie bei anderen Substanzen, wie Aspirin oder monoklonalen Antikörpern (z.B. 7E3, siehe Gold et al.) , deren Wirkungen mindestens eine Stunde nach Beendigung der Verabreichung anhalten.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Mittel, enthaltend Einzelketten-Rekombinationsplasminogenaktivator vom Gewebetyp oder Streptokinase und ein Polypeptid mit einer Sequenz H&sub2;N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H, wobei jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, irgend eine Aminosäure bedeutet. Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Beschleunigung der Thrombolyse und Verhinderung des Wiederverschlusses bei einem Patienten, umfassend die Verabreichung einer Menge an Einzelketten-Rekombinationsplasminogenaktivator vom Gewebetyp und eine Menge eines Peptids mit der Sequenz H&sub2;N-(Ch)- Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H, wobei jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, irgend eine Aminosäure bedeutet.
Die Erfindung kann in anderen speziellen Formen durchgeführt werden, ohne vom Geist oder wesentlichen Bestandteilen abzuweichen. So sollten die speziellen oben beschriebenen Beispiele nicht als den Erfindungsrahmen begrenzend angesehen werden.

Claims

1. Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz

X-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-Y

wobei X H oder mindestens eine Aminosäure ist, Y OH oder mindestens eine Aminosäure ist und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, irgendeine Aminosäure ist, mit der Ausnahme von Trigramin.

2. Polypeptid nach Anspruch 1 mit der folgenden Aminosäuresequenz

H&sub2;N-(Ch)Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H

wobei Ch mindestens eine Aminosäure bedeutet, Cx mindestens eine Aminosäure bedeutet und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, eine Aminosäure bedeutet.

3. Im wesentlichen reines Polypeptid nach Anspruch 1, das "Echistatin" genannt wird und die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys- Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg- Gly-Asp-Asp-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr- Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala- Thr

4. Im wesentlichen reines Polypeptid nach Anspruch 1, das 'Bitistatin 1" genannt wird und die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Glu-Leu-Leu-Glu-Glu- Gly-Glu-Glu-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys- Gln-Asp-Arg-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu- Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys- Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Thr-Val-Cys- Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys- Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

5. Im wesentlichen reines Polypeptid nach Anspruch 1, das "Bitistatin 2" genannt wird und die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu-Gln- Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn-Cys- Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys-Leu- Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys-Cys- Asp-Gln-Asp-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val-Cys- Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys- Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

6. Im wesentlichen reines polypeptid nach Anspruch 1, das "Bitistatin 3" genannt wird und die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Val-Ser-Pro-Pro-Val-Cys-Gly-Asn-Lys-Ile-Leu-Glu- Gln-Gly-Glu-Asp-Cys-Asp-Cys-Gly-Ser-Pro-Ala-Asn- Cys-Gln-Asp-Gln-Cys-Cys-Asn-Ala-Ala-Thr-Cys-Lys- Leu-Thr-Pro-Gly-Ser-Gln-Cys-Asn-His-Gly-Glu-Cys- Cys-Asp-Gln-Cys-Lys-Phe-Lys-Lys-Ala-Arg-Thr-Val- Cys-Arg-Ile-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr- Cys-Thr-Gly-Lys-Ser-Ser-Asp-Cys-Pro-Trp-Asn-His

7. Im wesentlichen reines Polypeptid nach Anspruch 1, das "Eristostatin" genannt wird und die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Gln-Glu-Glu-Pro-Cys-Ala-Thr-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg- Arg-Cys-Lys-Phe-Lys-Arg-Ala-Gly-Lys-Val-Cys-Arg- Val-Ala-Arg-Gly-Asp-Trp-Asn-Asp-Asp-Tyr-Cys-Thr- Gly-Lys-Ser-Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-Trp-Asn- His

8. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys- Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg- Gly-Asp-Phe-Met-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr- Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala- Thr

9. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

Glu-Cys-Glu-Ser-Gly-Pro-Cys-Cys-Arg-Asn-Cys-Lys- Phe-Leu-Lys-Glu-Gly-Thr-Ile-Cys-Lys-Arg-Ala-Arg- Gly-Asp-Phe-Leu-Asp-Asp-Tyr-Cys-Asn-Gly-Lys-Thr- Cys-Asp-Cys-Pro-Arg-Asn-Pro-His-Lys-Gly-Pro-Ala- Thr

10. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

11. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

12. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

13. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

14. Polypeptid nach Anspruch 1, das die folgende Aminosäuresequenz besitzt

15. Verfahren zur Hemmung der Fibrinogen-Bindung an Blutplättchen von Säugetieren oder der Fibrinogen-induzierten Aggregation von Blutplättchen von Säugetieren, umfassend das Inkubieren von Blutplättchen von Säugetieren mit einem Polypeptid nach Anspruch 1.

16. Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist zur Hemmung der Aggregation von Blutplättchen bei einem Säugetier.

17. Verfahren zur Reinigung eines Polypeptids mit der folgenden Sequenz

umfassend

(a) Auflösen von lyophilisiertem Echis carinatus Gift in leicht basischer Lösung;

(b) Zentrifugieren der Lösung, um einen Überstand zu erhalten;

(c) Aufbringen der Lösung auf eine Säule und

(d) Bestimmung von Fraktionen, die die Blutplättchen-Aggregation hemmende Wirkung besitzen und Konzentrieren unter Vakuum.

18. DNA-Molekül, umfassend eine Rekombinations DNA, die ein Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz kodiert

H&sub2;N-(Ch)Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H

wobei Ch mindestens eine Aminosäure bedeutet, Cx mindestens eine Aminosäure bedeutet und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, eine Aminosäure bedeutet, wobei dieses Peptid die Blutplättchen-Aggregation hemmt.

19. DNA-Molekül nach Anspruch 13, wobei die Aminosäuresequenz wie folgt ist:

20. Reproduzierbarer mikrobiologischer Rxpressions-Vektor, umfassend eine Promotor/Operator-Seguenz, die in der Lage ist, heterologe Proteine in einem Mikroorganismus zu exprimieren, gefolgt von DNA- Kodierung eines Blutplättchen-Aggregations-Hemmers mit der Aminosäuresequenz

H&sub2;N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys(Cx)-H

wobei Ch mindestens eine Aminosäure bedeutet, Cx mindestens eine Aminosäure bedeutet und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, eine Aminosäure bedeutet, wobei die Transkription der DNA in einem Transformations-Nikroorganismus unter Kontrolle des Promotor/Operators erfolgt.

21. Expressionsvektor nach Anspruch 20, wobei die Aminosäuresequenz die folgende Aminosäuresequenz besitzt:

22. Lebensfähgige Zellkultur, umfassend mit dem Expressions-Vektor nach Anspruch 20 transformierte Zellen.

23. Verfahren zur Herstellung eines Cystein-reichen Polypeptids, enthaltend die folgende Sequenz:

H&sub2;N-(Ch)-Cys-R-R-R-Arg-Gly-Asp-R-R-R-R-R-Cys-(Cx)-H

wobei Ch mindestens eine Aminosäure bedeutet, Cx mindestens eine Aminosäure bedeutet und jedes R, die entweder gleich oder verschieden sind, eine Aminosäure bedeutet, wobei

(a) die C-terminal erste Aminosäure der Sequenz an ein festes vernetztes Polystyrolharz gebunden wird unter Bildung eines Amino-acyl-Polymers, die die C-terminal erste Aminosäure blockierende Gruppe von dem Amino-acyl-Polymer entfernt wird, die in der Sequenz nächste zweite Aminosäure an den C- terminalen Aminosäure-Rest gekoppelt wird, folgende Aminosäuren schrittweise angekoppelt werden unter Bildung der Polypeptid-Sequenz und die N-terminale Boc-Gruppe, die die N- terminale Aminosäure schützt, entfernt wird;

(b) die Polypeptid-Sequenz mit HF und einem oder mehreren Thiohaltigen Abfangmitteln behandelt wird;

(c) die behandelte Sequenz gewaschen und von der Säule in ein großes Volumen verdünnte Essigsäure überführt wird, um eine unerwünschte Vernetzung möglichst gering zu halten und

(d) die aus Stufe (c) stammende Lösung unter Rühren auf einen pH- Wert von etwa 8 eingestellt wird.