DE69637464T2

DE69637464T2 - Therapeutische fragmente des "von willebrand" faktors

Info

Publication number: DE69637464T2
Application number: DE69637464T
Authority: DE
Inventors: David L. Chalfont FARB; Michael E. Gwynedd Valley HRINDA; Ted C.K. Lansdale LEE; Christopher P. Wayne PRIOR; David 301 Conestoga Way Norristown WEBER
Original assignee: Aventis Behring LLC
Current assignee: CSL Behring LLC
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2008-11-06
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: JP4233114B2; EP0833659A1; CA2223702C; EP0833659B1; JP2001517197A; AU716449B2; DE69637464D1; MX9709893A; AU6047196A; CA2223702A1; ES2302336T3; ATE388722T1; US5847086A; KR100486472B1; KR19990022634A; EP0833659A4; WO1997018834A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von therapeutischen Polypeptiden. Im Spezielleren betrifft die Erfindung gereinigte von Willebrand-Faktor-Fragmente, die z. B. bei der Behandlung von Gefäßerkrankungen wie z. B. einer Thrombose verwendet werden können.
Der Begriff „Hämostase" bezieht sich auf jene Vorgänge, die den Abwehrmechanismus des Körpers gegen einen durch eine Gefäßverletzung verursachten Verlust von zirkulierendem Blut umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung von therapeutisch nützlichen Formen von Polypeptiden auf der Basis des von Willebrand-Faktors („vWF"), eines der Proteine des hämostatischen Mechanismus.
Vorgänge, die als physiologische Reaktion auf eine Gefäßverletzung normal sind, können bei pathologischen Zuständen, z. B. bei einem Patienten, der an einer atherosklerotischen Gefäßerkrankung oder einer chronischen kongestiven Herzinsuffizienz leidet, zu der Bildung von unerwünschten Thromben (Gerinnseln) mit einem daraus resultierenden Gefäßverschluss führen. Eine Beeinträchtigung des Blutflusses zu den Organen unter solchen Umständen kann zu schweren pathologischen Zuständen, unter anderen zu einem Myokardinfarkt, einer der Haupttodesursachen in entwickelten Ländern, führen.
Die Einschränkung oder das Einstellen der Durchblutung im Kreislaufsystem als Reaktion auf eine Wunde oder als ein Ergebnis eines Gefäßerkrankungszustands schließt eine komplexe Reihe von Reaktionen ein, die in zwei Vorgänge unterteilt werden können, die primäre Hämostase und die sekundäre Hämostase. Die primäre Hämostase bezieht sich auf den Vorgang der Throm bozytenpfropfbildung oder Bildung eines weichen Gerinnsels. Thrombozyten sind nicht nukleierte, scheibenförmige Strukturen mit einem Durchmesser von ca. 2–5 Mikron, die sich von megakaryozytären Zellen herleiten. Die effektive primäre Hämostase wird durch eine Thrombozytenadhäsion, die Wechselwirkung zwischen Thrombozyten und der Oberfläche eines verletzten Gefäßendothels, auf der darunter liegende Kollagenfasern und/oder andere klebende Markomoleküle wie z. B. Proteoglykane und Glykosaminoglykane frei liegen, an die die Thrombozyten binden, bewerkstelligt.
Die sekundäre Hämostase beinhaltet die Verstärkung oder Vernetzung des weichen Thrombozytengerinnsels. Dieser sekundäre Vorgang wird durch im Plasma zirkulierende Proteine (Gerinnungsfaktoren) eingeleitet, die während der primären Hämostase entweder als Reaktion auf eine Wunde oder einen Gefäßerkrankungszustand aktiviert werden. Die Aktivierung dieser Faktoren führt schließlich zur Produktion einer Polymermatrix des Proteinfibrinogens (danach als „Fibrin" bezeichnet), die das weiche Gerinnsel verstärkt.
Es gibt jedoch Umstände, unter denen es erwünscht ist, die Ablagerungen von Thrombozyten in Blutgefäßen zu verhindern, z. B. in der Prävention und Behandlung einer Thrombose oder eines Schlaganfalls, und um einen Verschluss von Arterientransplantaten zu verhindern. Eine Thrombozyten-Thrombus-Bildung während chirurgischer Verfahren kann ebenfalls störend bei Versuchen sein, bereits bestehende Gefäßverstopfungen zu entfernen.
Antithrombozyten-Medikamente umfassen Verbindungen, die die primäre Hämostase unterdrücken, indem sie die Thrombozyten oder deren Wechselwirkung mit anderen Bestandteilen des Kreislaufsystems verändern. Eine Verbindung, die zur Verwendung als ein Antithrombozyten-Medikament offenbart wurde, ist ein alkyliertes Fragment von vWF mit einem Molekulargewicht von etwa 52 000, das durch einen tryptischen Aufschluss von vWF gewonnen wird und ca. 449–728 Reste davon umfasst. Dieses therapeutische Fragment ist der Gegenstand der europäischen Patentanmeldung Nr. 87 304 615 , eingereicht am 22. Mai 1987 und veröffentlicht unter der Nr. 25 5206 am 3. Februar 1988.
Prior et al. offenbaren ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung eines vWF-445-733-Fragments durch säulenchromatografische Reinigung (Bio/Technology, Band 11 (6), 1993, 709–713 und Bio/Technology, Band 10, 1992, 66–73).
Die US 5 238 919 offenbart ein Polypeptid, das in der Lage ist, die Bindung des von Willebrand-Faktors an Thrombozyten, Heparin und Kollagen zu verhindern, das im Wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz besteht, die einem von Willebrand-Faktor-Fragment mit einem endständigen Aminorest um die Aminosäure 449 Val und mit einem endständigen Carboxyrest um die Aminosäure 728 Arg (Säule 5, Linien 34 bis 40) entspricht.
Des Weiteren berichten Sugimoto et al. von einem rekombinanten Fragment, das die Reste 445–733 der reifen vWF-Untereinheit umfasste, in der die sieben Cysteinreste in der Sequenz reduziert und alkyliert waren (Biochemistry 1991, 30, 5202–5209).
Die WO 92/17 192 offenbart ein Polypepdid, das auf ein Fragment eines Wildtyps einer reifen von Willebrand-Faktor-Untereinheit gemustert ist, die eine modifizierte Aminosäuresequenz und eine erhöhte Bindungsaffinität für Liganden wie z. B. Kollagen, Glycosaminoglykane, Proteoglykane oder den Gerinnungsfaktor VIII aufweist.
Die WO 93/00 107 offenbart auch eine wässrige Lösung eines Cystein-veränderten von Willebrand-Faktor-Fragments, das im Wesentlichen frei von Aggregat und für therapeutische Zwecke zur Behandlung einer Thrombose geeignet ist.
Als Hintergrundinformation wird angemerkt, dass der vWF, auf dem das zuvor erwähnte Fragment basiert, ein multimeres Protein mit hohem Molekulargewicht ist, das im Blut zirkuliert und in die Gerinnung des Blutes involviert ist. Es ist anerkannt, dass der vWF bewirkt, dass die Thrombozyten sich an das geschädigte Blutgefäß binden, indem er eine Brücke zwischen den Thrombozyten und dem Gefäß bildet. Es ist auch anerkannt, dass Thrombozyten-Bindungsstellen von vWF in den zuvor erwähnten Resten 449–728 enthalten sind.
Was die Funktion des zuvor erwähnten vWF-Fragments als ein Antithrombozyten-Medikament betrifft, so wird angenommen, dass das Fragment wirkt, indem es sich an den Glykoprotein Ibα-Rezeptor der Thrombozyten bindet und dadurch die Bindung an die Thrombozyten des vWF im Blut verhindert. In der Tat besetzt das vWF-Fragment den Oberflächenrezeptor des GPIb, der normalerweise vom vWF des Blutes besetzt würde, da es jedoch nicht die Brückenbildungsaktivität des größeren vWF-Moleküls aufweist, von dem es abstammt, leitet es keine Thrombozytenadhäsion oder eine resultierende Gerinnselbildung ein.
In der Praxis ist es schwierig, therapeutisch nützliche Mengen dieses oder anderer Fragmente von vWF aus Blutplasma zu gewinnen. Die Schwierigkeiten beinhalten eine wirksame Abtrennung des Rest-449-728-Fragments von anderen Komponenten, z. B. tryptischen Aufschlüssen, und die Erfordernisse einer wirksamen Sterilisierung von Blutderivatbestandteilen, die potentiell mit Humanviren, wie Hepatitis und HIV, kontaminiert sind. Demgemäß hat es sich als wünschenswert erwiesen, dieses Fragment von vWF mithilfe einer rekombinanten DNA in Wirtszellen, die z. B. bakterielle Wirtszellen umfassen, herzustellen.
Unglücklicherweise wurde jedoch festgestellt, dass sich vWF-Fragmente, die durch bakterielle Expressionssysteme erzeugt werden, in großen Mengen als unlösliche Aggregate (Einschlusskörper) innerhalb der Wirtszellen akkumulieren. Zum Zweck des Gewinnens von therapeutisch nützliche Formulierungen des Fragments (der Reste 449–728) ist es notwendig, das Fragment in löslicher Form aus den in den Wirtszellen enthaltenen Einschlusskörpern zu extrahieren.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst die Gewinnung eines therapeutisch nützlichen Fragments von vWF, das von rekombinanten DNA-Molekülen in Wirtsbakterienzellen exprimiert wird. Die Erfindung schließt auch die Bereitstellung dieser Fragmente in reiner und nicht aggregierter Form ein und umfasst therapeutische Formulierungen, die im Wesentlichen frei von Aggregat sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung eines Cystein-veränderten von Willebrand-Faktor-(vWF)-Fragments mit einem endständigen Aminorest am Aminosäurerest 445 und einem endständigen Carboxyrest an der Aminosäure 733, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist, bereitgestellt, umfassend:

(A) Bereitstellen einer sauren, wässrigen Lösung, welche ein Cystein-verändertes vWF-Fragment, Denaturierungsmittel und unerwünschte Verunreinigungen enthält;
(B) Abtrennen der Verunreinigungen aus der Lösung durch Inkontaktbringen der Lösung mit einem Affinitätschromatografiemedium, enthaltend Heparin, an welche sich die vWF-Fragmente binden;
(C) Eluieren des vWF-Fragments aus dem Affinitätschroma-to-grafiemedium in Gegenwart des Denaturierungsmittels; und
(D) Abtrennen des eluierten Fragments aus dem Denaturierungsmittel, wahrend die wässrige Lösung des Fragments bei einem pH von etwa 2,5 bis weniger als etwa 5,5 gehalten wird, um die Monomerisierung des Fragments zu erhöhen und die Aggregation des Fragments zu verringern, wobei eine wässrige Lösung von vWF-Fragment ausgebildet wird, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist.

In einer bevorzugten Form wird das Cystein-veränderte vWF-Fragment von Schritt (A) als ein alkyliertes Fragment bereitgestellt, wobei das Denaturierungsmittel, auf das in den Schritten (A) und (B) Bezug genommen wird, Harnstoff ist, und der pH bei etwa 3 bis etwa 4 gehalten wird.
Zusätzlich zu seiner Rolle als eine Bindungsstelle für Thrombozyten umfasst das Reste-445-733-Fragment der reifen vWF-Untereinheit eine Domäne der Untereinheit, die in-vivo für eine nicht-kovalente und kovalente Bindung der vWF-Untereinheiten verantwortlich ist, um große vWF-Multimere auszubilden. Demgemäß besteht eine Tendenz, dieses Polypeptids zu dimerisieren und/oder Aggregate ausbilden. Dies ist unerwünscht, da die biologisch aktivste Form des Fragments die monomere Form ist. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet daher das Verhindern der Bildung von Aggregaten in Formulierungen eines Cystein-veränderten vWF-Fragments, da solche Aggregate einen geringen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Herz- und Gefäßerkrankungen besitzen und potentiell das Risiko nachteiliger klinischer Konsequenzen mit sich bringen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung eines Verfahrens zum Limitieren der Dimerisierung von monomerem Cystein-verändertem von Willebrand-Faktor-Fragment, isoliert durch Heparin-Affinitätschromatografie, wobei das Fragment einen endständigen Aminorest am Aminosäure rest 445 und einen endständigen Carboxyrest an der Aminosäure 733 aufweist, welche Dimerisierung eine oder mehrere ionische, hydrophobe oder Wasserstoffbindungen umfasst, welche in vivo die Assozierung von zwei oder mehreren reifen vWF-Untereinheiten erleichtern, welches Verfahren das Ausbilden einer wässrigen Lösung von monomerem Cystein-verändertem vWF-Fragment umfasst, welches einen pH von etwa 2,5 bis weniger als etwa 5,5 aufweist und welches darin bis zu etwa 10 mg/ml des Fragments enthält, und wobei die Gesamtkonzentration in der Lösung an zusätzlichen Ionenspezies, sofern vorhanden, weniger als etwa 75 mMol beträgt.
Die vorliegende Erfindung kann für die Bereitstellung einer wässrigen Formulierung verwendet werden, die ein nicht aggregiertes Cystein-verändertes vWF-Fragment enthält, das über beträchtliche Zeitspannen effektiv aufbewahrt werden kann, bevor es einem Patienten verabreicht wird. Demgemäß wird eine wässrige Formulierung bereitgestellt, die ein nicht aggregiertes Cystein-veränderte vWF-Fragment umfasst, das, wenn es lyophilisiert und dann rehydratisiert wird, danach im Wesentlichen in nicht aggregierter Form bleibt, das heißt, es ist im Wesentlichen frei von Aggregat.
Des Weiteren ist die vorliegende Erfindung nützlich für die Entwicklung der Fähigkeit, reines, alkyliertes vWF-Fragment aus Einschlusskörpern auf solch eine Weise zu gewinnen, dass verunreinigende Makromoleküle wie z. B. Wirts-DNA und/oder ein Protein oder Endotoxin vollständig beseitigt sind. Die Reinigungsschritte, die besonders nützlich sind, um dies zu bewerkstelligen, umfassen: (A) Abtrennen des zuvor erwähnten Typs von Verunreinigungen aus einer wässrigen Lösung von alkyliertem vWF-Fragment und Denaturierungsmittel durch Inkontaktbringen einer Lösung davon, die einen alkalischen pH besitzt, mit einem Anionenaustauschermaterial, an das diese Verunreinigungen gebunden sind; (B) Inkontaktbringen der wässrigen Lösung, aus der die Verunreinigungen entfernt wurden, mit einem Kationenaustauscherharz, an das sich das alkylierte vWF-Fragment bindet; und (C) Eluieren des alkylierten vWF-Fragments aus dem Kationenaustauscherharz durch Inkontaktbringen des Harzes mit einer wässrigen Lösung, die ionisierte Zitronensäure und ein nicht ionisches Denaturierungsmittel enthält, wobei die Affinität des eluierten Fragments für die Citrat-Ionen der mobilen Phase die Solubilisation von der stationären Phase erleichtert.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein alternatives Reinigungsverfahren eingesetzt, das die Affinitätschromatografie verwendet. Ein Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung eines Cystein-veränderten von Willebrand-Faktor-(vWF)-Fragments mit einem endständigen Aminorest am Aminosäurerest 445 und einem endständigen Carboxyrest an der Aminosäure 733, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist, umfassend:

(A) Bereitstellen einer wässrigen Lösung von Harnstoff und vWF-Fragment, welches durch rekombinante Mittel hergestellt wird und unerwünschte bakterielle Verunreinigungen enthält, welche Lösung einen pH von weniger als etwa 6,5 besitzt;
(B) Abtrennen der Verunreinigungen aus der Lösung durch Inkontaktbringen der Lösung mit einem Affinitätschromatografiemedium, welches Heparin enthält, an welches sich das vWF-Fragment bindet;
(C) Eluieren des vWF-Fragments aus dem Affinitätschromatografiemedium in Gegenwart des Denaturierungsmittels durch Inkontaktbringen des vWF-Fragments mit einer wässrigen Salzlösung mit einer ausreichenden Konzentration, um eine Disoziierung des vWF-Fragments vom Heparin des Affinitätschromatografiemediums hervorzurufen; und
(D) Abtrennen des eluierten Fragments aus dem Denaturierungsmittel während die wässrige Lösung des Fragments bei einem pH von etwa 2,5 bis weniger als etwa 5,5 gehalten wird, um die Monomerisierung des Fragments zu erhöhen und die Aggregation des Fragments zu verringern, wobei eine wässrige Lösung von vWF-Fragment ausgebildet wird, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist.

Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich zur Bereitstellung eines Verfahrens zum Behandeln von Thrombose bei einem Patienten unter Verwenden einer therapeutischen Formulierung der Erfindung.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Profil eines Monomer/Dimer-Gleichgewichts, das durch eine Gesamtkonzentration von alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment beeinflusst ist.
2 ist eine Aufzeichnung der Verhinderung der Thrombozyten-Agglutination (Aggregation), die durch festgelegte Konzentrationen an alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment verursacht wird.
3 ist eine Aufzeichnung der vergleichsweisen Fähigkeit von nicht-aggregiertem und aggregiertem alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment, um die Thrombozyten-Agglutination zu verhindern.
4 zeigt das Zirkulardichroismusprofil von nicht alkyliertem vWF-Fragment bei einem pH von 3,5 und einem pH von 4,5.
Definitionen
Wenn hierin nicht anders angegeben, besitzen die folgenden Begriffe die angegebene Bedeutung.
cDNA – Ein/e DNA-Molekül oder -Sequenz, das/die enzymatisch aus der/den in einem mRNA-Template vorhandenen Sequenz/en synthetisiert wurde.
Expression – Der Vorgang, dem ein strukturelles Gen unterworfen ist, um ein Produkt zu erzeugen. Im Fall eines Porteinprodukts ist es eine Kombination aus einer Transkription und einer Translation.
Rekombinantes DNA-Molekül – Ein Molekül, das aus Segmenten einer DNA aus verschiedenen Genomen besteht, die Ende-an-Ende verbunden wurden und die Fähigkeit besitzen, oder modifiziert werden können, um die Fähigkeit zu besitzen, bestimmte Wirtszellen zu infizieren und darin gehalten zu werden.
Klonieren – Der Vorgang, bei dem eine Population von Organismen oder DNA-Sequenzen oder anderen Markomolekülen erhalten wird, die von einem/r solchen Organismus oder Sequenz durch asexuelle Reproduktion oder DNA-Replikation gewonnen werden.
Biologische Aktivität – Eine oder mehrere Funktionen, Auswirkungen von Aktivitäten, die von einem Molekül in einem biologischen Zusammenhang ausgeführt oder bewirkt werden (das heißt, in einem Organismus oder in einer in-vitro-Nachbildung). Eine charakteristische biologische Aktivität des monomeren Rest-445-733-Fragments der reifen von Willebrand-Faktor-Untereinheit ist die potentielle Fähigkeit, an die GPIα-Rezeptoren der Thrombozyten zu binden und dadurch die Thrombozyten-Agglutination zu verhindern.
Ein zusätzlicher Aspekt der charakteristischen biologischen Aktivität des monomeren Rest-445-733-Fragments der reifen von Willebrand-Faktor-Untereinheit ist die Fähigkeit, nur an einen Thrombozyten-GPIbα-Rezeptor zu binden und dadurch zuzulassen, dass das Molekül eine durch Botrocetin induzierte Bindung von multimerem vWF an Thrombozyten verhindert. Weitere Effekte, die sich aus der monomeren Spezies 445–733 ergeben oder damit in Verbindung stehen, umfassen, dass eine Aktivierung der Thrombozyten oder deren Haftung an Oberflächen verhindert wird. Daher besitzt ein solches Fragment einen therapeutischen Nutzen als Antithrombosemittel.
Reduzierende Bedingungen – Beziehen sich auf das Vorhandensein eines „reduzierenden" Mittels in einer Lösung, die von Willebrand-Faktor oder daraus gewonnene Polypeptide enthält, welches Mittel das Aufbrechen von Disulfidbrücken des vWF verursacht.
von Willebrand-Faktor (vWF) – Es versteht sich, dass alle Verweise auf den von Willebrand-Faktor hierin sich auf vWF im Menschen beziehen. Der Begriff „von Willebrand-Faktor" soll in seinem Umfang den untenstehend definierten Begriff „reifer vWF" umfassen.
Reifer vWF – Zirkulierender vWF wie im Plasma vorliegend oder wie an das Subendothel gebunden. Er besteht aus einer Polpulation von Polypeptidmonomeren, die typischerweise zu zahlreichen Spezies aus Multimeren davon zusammengeschlossen sind, wobei jede Untereinheit (Monomer) davon eine Länge von 2 050 Resten besitzt. Zusätzlich ist der reife vWF üblicherweise glykosyliert, wenn er in Säugetierzellen exprimiert wird. Der von Willebrand-Faktor liegt als eine Komponente der Subendothel-Matrix, als eine Komponente der α-Granules, die durch die aktivierten Thrombozyten abgesondert werden, und als ein zirkulierendes Blutplasmaprotein vor.
Monomer – Wenn der Ausdruck in Bezug auf ein Cysteinverändertes vWF-Fragment verwendet wird, bezieht sich „monomer" auf ein einziges Polypeptid, das weder kovalent noch nicht-kovalent mit einem anderen Polypeptid verbunden ist. „Dimer" bezieht sich auf einen nicht-kovalenten Zusammenschluss von zwei Monomeren. „Aggregiertes" Cystein-verändertes vWF-Fragment bezieht sich auf Strukturen, die größer sind, als Dimere.
Gereinigt oder im Wesentlichen in reiner Form – Wenn der Ausdruck in Bezug auf aus vWF gewonnene Polypeptide verwendet wird, bedeuten dieser und ähnliche Begriffe, dass die Zusammensetzung im Wesentlichen frei vom Großteil des zellulären Protoplasmas, nicht-vWF-Proteins oder extrazellulären Materials ist, mit dem das Polypeptid normalerweise im Körper vorliegt.
Affinitätschromatografie – Bezieht sich auf chromatografische Verfahren, die die Fähigkeit der Proteine nutzen, an spezifische Moleküle fest, jedoch nicht-kovalent zu binden. Um eine Affinitätschromatografie durchzuführen, wird ein als Ligand bezeichnetes Molekül, z. B. Heparin, kovalent an ein chromatografisches Material, üblicherweise eine poröse, inerte Matrix befestigt. Eine Lösung, die das zu reinigende Protein, in diesem Fall vWF, und verschiedene weitere unerwünschte Substanzen enthält, wird durch das chromatografische Material geleitet. Das gewünschte Protein wird selektiv an den an dem chromatografischen Material angebrachten Liganden gebunden und wird festgehalten, während die anderen Substanzen eluiert werden. Die vWF-Fragmente können dann in hoch gereinigter Form gewonnen werden, indem die Elutionsbedingungen geändert wer den, um das Protein von seiner bindenden Wechselwirkung mit den Liganden zu lösen.
Heparin – Bezieht sich auf ein verschieden sulfatisiertes Glykosaminglykan, das hauptsächlich aus abwechselnden α(1→4)-gebundenen Resten aus D-Glukuronat-2-sulfat und N-Sulfo-D-glukosamin-6-sulfat besteht.

Tabelle 1 zeigt die in der Anmeldung verwendeten Standardbezeichnungen aus drei Buchstaben für die Aminosäuren. Tabelle I

Alanin	Ala
Cystein	Cys
Asparginsäure	Asp
Glutaminsäure	Glu
Phenylalanin	Phe
Glycin	Gly
Histidin	His
Isoleucin	Ile
Lysin	Lys
Leucin	Leu
Methionin	Met
Asparagin	Asn
Prolin	Pro
Glutamin	Gln
Arginin	Arg
Serin	Ser
Threonin	Thr
Valin	Val
Tryptophan	Trp
Tyrosin	Tyr

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Das antithrombotische Polypeptid, mit dem sich die vorliegende Erfindung befasst, ist ein Cystein-verändertes vWF-Fragment, das die Aminosäuresequenz-Domäne der reifen vWF-Untereinheit umfasst, welche mit dem Rest 445 (Serin) davon beginnt und mit dem Rest 733 (Valin) davon endet und ein scheinbares Molekulargewicht von ca. 33 000 aufweist, und in der die Cysteinreste davon (Positionen 459, 462, 464, 471, 474, 509 und 695) auf eine Weise verändert sind, dass ihre Tendenz, mit anderen Cysteinresten in Wechselwirkung zu treten, auf eine Weise verhindert ist, dass die auf Cystein basierenden Bindungen innerhalb eines einzelnen Fragments oder zwischen Fragmenten nicht gebildet werden können, wobei die Bildung solcher Bindungen dazu neigt, Materialien zu bilden, die die Tendenz zeigen, unlöslich oder biologisch aktiv zu sein. Der Einfachheit halber wird solche ein Fragment hierin als ein „Cystein-verändertes vWF-Fragment" bezeichnet. Dieser Begriff umfasst in seinem Umfang Fragmente, die die Sequenz der Reste 445–733 einschließen oder diese überlappen und die gesamten oder einen Teil der an GPIbα bindenden Domänen davon enthalten. Der Begriff „Cysteinverändertes vWF-Fragment" umfasst auch Polypeptide, die mutante Aminosäuresequenzen der Domäne der Reste 445–733 darstellen, welche einen antithrombotischen Nutzen besitzen. Solche mutanten Sequenzen können Cysteinreste enthalten oder nicht.
Es wird vorweggenommen, dass Formen des Polypeptids, die aus einer Expression einer geeigneten cDNA oder eines anderen rekombinanten DNA-Moleküls in einer eukaryotischen Wirtszelle resultieren, gemäß der Praxis der Erfindung auch effektiv monomerisiert und formuliert werden können.
Insofern als das Cystein-veränderte vWF-Fragment auf einem Fragment von vWF basiert, wird nachstehend die Information in Bezug auf dieses Protein und seine Rolle in der Hämostase und Thrombose fortgesetzt. Der von Willebrand-Faktor liegt im Menschen als eine Reihe von Multimeren mit hohem Molekulargewicht von bis zu 30 glykosilierten Untereinheiten pro Multimer vor, in denen die Untereinheiten als identisch angenommen werden, wobei jede ein ungefähres Molekulargewicht von 270 000 (270 kDa) aufweist. Jede zirkulierende „reife" humane Untereinheit besteht aus 2 050 Aminosäureresten.
Es wird angenommen, dass die Bildung einer ersten Monoschicht aus Thrombozyten, die die verletzten Endotheloberfläche bedecken, eine Brückenbildungsfunktion einschließt, in der oberflächengebundener, multimerer vWF auf der einen Seite an Komponenten des Subendothels wie z. B. Kollagen oder Proteoglykane bindet und auf der anderen Seite an den GPIb-IX-Rezeptor einer Thrombozytenmembran bindet. Angenommen wird, dass die Wechselwirkung von multimerem vWF mit dem Glykoprotein Ib-IX-Komplex (bei GPIb(α)) zu einer Thrombozytenaktivierung führt und die Rekrutierung zusätzlicher Thrombozyten erleichtert, die dazu dienen, einen wachsenden Thrombus zu bilden. Die sich schnell akkumulierenden Thrombozyten werden durch die Bindung von Fibrinogen auch vernetzt. Von besonderer Bedeutung bei diesem Vorgang ist der multimere und multivalente Charakter des zirkulierenden vWF, der es dem Makromolekül ermöglicht, seine Bindungs- und Brückenbildungsfunktionen effektiv auszuführen.
Das Cystein-veränderte vWF-Fragment, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, konkurriert in der Tat mit dem vWF-Faktor um die GPIbα-Rezeptoren und inaktiviert die Rezeptoren, so dass sie für die Wechselwirkung mit dem vWF nicht verfügbar sind, wobei das Ergebnis darin besteht, dass die Bildung von Gerinnseln verhindert wird. Was das Wesen des Fragments betrifft, so hat vorausgehende Forschungsarbeit ergeben, dass die Domäne des 2 050-Rests der reifen von Willebrand-Faktor-Untereinheit, die an den Thrombozytenmembran-Glykoprotein Ib- IX-Rezeptor (GPIb(α)) bindet, das Fragment davon ist, das sich von ungefähr dem Rest 449 (Valin) der zirkulierenden Untereinheit bis zu ungefähr dem Rest 728 (Lysin) davon erstreckt. Dieses Fragment weist ein scheinbares Molekulargewicht von ca. 52 000 auf und kann durch Trypsin-Aufschluss gefolgt von einer Disulfid-Reduktion des vWF erzeugt werden. Die an GPIb(α) bindende Domäne des vWF umfasst Reste, die in zwei unterbrochenen Sequenzen Cys⁴⁷⁴-Pro⁴⁸⁸ und Leu⁶⁹⁴-Pro⁷⁰⁸ innerhalb des Fragments enthalten sind; Mohri, H. et al., J. Biol. Chem., 263 (34), 17901–17904 (1988). Typischerweise wird das Fragment mit dem Molekulargewicht von 52 000 als ein „52/48"-Fragment bezeichnet, was die Tatsache zum Ausdruck bringt, dass humane Enzymsysteme das Fragment glykosilieren, was zu dessen Molekulargewicht beiträgt. Das Ausmaß der Glykosilierung variiert von Molekül zu Molekül, wobei zwei Gewichte, 52 000 und 48 000, am häufigsten sind. Wie von rekombinanten Wirtsbakterienzellen exprimiert, ist bei dem Fragment die Glykosilierung nach der Translation, die mit der Expression desselben in Säugetierzellen verbunden ist, nicht vorhanden. Ohne das durch Glykosilierung hinzugefügte zusätzliche Gewicht weist das Polypeptid ein Molekulargewicht von ca. 33 000 auf. Sowohl das „52/48"- als auch das „33"-Fragment verhindern kompetitiv die Bindung von von Willebrand-Faktor an die Thrombozyten.
Wie obenstehend erwähnt, ist es schwierig, therapeutisch nützliche Mengen des vWF-Fragments aus Blutplasma zu gewinnen. Demgemäß hat es sich als wünschenswert herausgestellt, dieses Fragment von vWF unter Verwendung einer rekombinanten DNA in Wirtszellen herzustellen. Es ist eine breite Vielfalt von rekombinanten Systemen zur Expression einer das Fragment codierenden DNA-Sequenz verfügbar. Beispiele für drei Systeme sind untenstehend beschrieben. Diese Systeme wurden erfolgreich verwendet und verwenden Wirtsbakterienzellen und codieren das etwas größere Rest 445-733-Fragment. Es wurde festgestellt, dass die Sequenzen mit einem zusätzlichen endständigen Amino- und Carboxyrest keinen wesentlichen Effekt auf die Nützlichkeit des Fragments als ein Antithrombotikum besitzen.

(I) ein als pMMB3 bezeichneter Vektor, der einen hochwirksamen P_R-Promotor aus bakteriophagem Lambda enthält. Die Induktion einer vWF-Fragment-Expression in E. coli wurde durch Aufwachsen der Zellen auf eine mid-log-Phase bei 30°C und dann Verschieben der Temperatur auf 42°C erreicht.
(II) ein als pMMB5 bezeichneter Vektor, der ein Hybrid-trp-lac (tac)-Promotorsystem umfasst, das durch den lac-Repressor reguliert wird. Die Induktion in diesem System wurde durch Aufwachsen der Zellen auf eine mid-log-Phase bei 37°C gefolgt von der Zugabe von Laktose-Analog-IPTG erreicht.

Die mit pMMB3 und pMMB5 erhaltenen Ergebnisse waren sehr ähnlich. Kurz gesagt wurden E. coli-Zellen, die mit jedem der obigen Plasmide transformiert wurden, auf die mid-log-Phase aufgewachsen, 1–16 Stunden lang induziert, abgeerntet und in lösliche und unlösliche Komponenten fraktioniert. Das vWF-Fragment zeigte eine extreme Unlöslichkeit nach der Lyse jeder Zellpopulation.

(III) ein dritter Vektor (Plasmid), der für die Expression des vWF-Fragments verwendet wird und Resistenz gegen Kanamycin (Km^R) verleiht, enthält einen Promotor von dem Bakteriophagen T7. Der Vektor wurde von Dr. F. William Studier von den Brookhaven National Laboratories erhalten und war, wie folgt, hergestellt. Das Plasmid wurde hergestellt, indem das Ampicillin-Resistenz-Gen von pET-8c durch einen Ausschluss eines BspHI-EcoRI-Fragments (pBR322 bp 3195– 4361) entfernt wurde und Ersetzen desselben durch ein 869-bp-Fragment, das eine Kanamycin-Resistenz (Km^R) codiert, wobei das Km^R-Gen in dem Vektor im Uhrzeigersinn orientiert ist. Das Km^R-Gen stammt von Tn903 (Oka et al., J. Mol. Biol., 147: 217–226 (1981)) und wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion mit pUC4KISS, Barany F., Gene, 37: 111–123 (1985)) als Matrize erhalten. Das Fragment, welches das Km^R-Gen trägt, beginnt 50 Nukleotide vor dem Km^R-Startcodon und endet genau bei dem Stopcodon.

Ein Plasmid, welches das vWF-Fragment exprimiert und Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht, wurde aus einem mit pET-8c52K bezeichneten Vektor und pET-8c (Km^R) hergestellt. Kurz gesagt wurde ein XBaI/BamI-Fragment, welches das vWF-Fragment codiert, aus pET-8c52K ausgeschlossen und in XbaI/BamHI-gespaltenes pET-8c (Km^R) ligiert. Die erhaltene Plasmid-DNA (pET-8c52K9 (Km^R)) wurde in E. coli-DH-1 Zellen transformiert und ein einzelnes Isolat wurde identifiziert, welches das Fragment mit geeigneter Größe durch Aufschluss mit Xba/BamHI freisetzte. Die DNA von diesem Isolat wurde dann verwendet, um E. coli BL21 (DE3) pLysS zu transformieren. Ein einzelnes Isolat aus dieser Transformation wurde dann zur Expression von vWF-Fragment verwendet.
In diesem System wird die vWF-DNA in einem Vektor angeordnet, der den Promotor und Translationsinitiationssignale für das TΦ-Protein des Bakteriophagen T7 enthält. Die T7-RNA-Polymerase kann dann entweder durch Induktion oder durch Infektion an die Wirtszelle geliefert werden. In diesem speziellen Fall wurde der vWF-Expressionsvektor unter der Kontrolle des lac-UV5-Promotors in einer Zelle angeordnet, die einen Prophagen trägt, der das Gen für die T7-RNA-Polymerase enthält. Die Zugabe des Laktose-Analogs-IPTG an eine wachsende Zellkultur induzierte eine T7-RNA-Polymerase, die wiederum die Target-DNA in dem Plasmid transkribierte. Die Transkription durch die T7-RNA-Polymerase war so aktiv, dass sich die Target-RNA in Mengen akkumuliert, die mit ribosomaler RNA vergleichbar sind, und das Target-Protein bildet eine Hauptfraktion des zellulären Proteins. Als eine erste Charakterisierung der Synthese von vWF-Fragment wurden die Zellen induziert und Proben zu Zeitpunkten zwischen 0,5 und 16 Stunden nach der Induktion genommen. Diese Daten wiesen darauf hin, dass 4 Stunden nach der Induktion vWF-Fragment ca. 25% des gesamten zellulären Proteins bildete. Dieser Wert ist viel größer als jener, der entweder durch das tac- oder das P_R-Vektorsystem erzeugt wird.
Von besonderer Bedeutung für die Bereitstellung von therapeutischen Polypeptiden aus rekombinanten Systemen ist die Möglichkeit, eine Expression von pharmakologisch nützlichen Mengen des Therapeutikums zu bewirken. Von den drei Systemen, auf die obenstehend Bezug genommen wurde, wird das System (III) bevorzugt, da es eine größere Ausbeute von Fragment liefert.
Unglücklicherweise neigen vWF-Fragmente, die durch ein bakterielles Expressionssystem wie z. B. das System (III) hergestellt werden, dazu, sich in großen Mengen als unlösliche Aggregate (Einschlusskörper) innerhalb der Wirtszellen zu akkumulieren, wobei in den Wirtszellen kein Mechanismus verfügbar ist, um ihre effektive Sekretion davon auszulösen. Zum Beispiel würde ein Säugetier-Signalpeptid im Allgemeinen in dem bakteriellen System nicht erkannt werden. Solche unlöslichen Aggregate von exprimiertem Polypeptid (Einschlusskörper) sind ein gut bekanntes Ergebnis des Versuchs, große Mengen von nützlichem Protein aus rekombinanten bakteriellen Systemen herzustellen, Williams, D. C. et. al., Science, 215, 687–689, (1982) und können falsch gefaltete Polypeptide widerspiegeln.
Eine Theorie besagt, dass die Bildung der Einschlusskörper mit dem Vorhandensein einer hochwirksamen Konzentration von Cysteinresten darin im Zusammenhang steht. Es wird angenommen, dass fehlerhafte Disulfidbrücken dazu angeregt werden, sich entweder innerhalb der Einschlusskörper oder bei Versuchen, die Polypeptide davon zu lösen, auszubilden und dies tun. Wenn solche Brücken innerhalb eines Fragments (eine Intrakettenbrücke) gebildet werden, können sie zu einer biologisch inaktiven Konformation des Moleküls führen. Wenn solche Brücken zwischen Fragmenten gebildet werden (eine Interkettenbrücke), können sie zu unlöslichen oder biologisch inaktiven Dimeren oder Aggregaten führen. Das vWF-Fragment, das die Reste 445–733 umfasst, enthält sieben Cysteinreste an den Positionen 459, 462, 464, 471, 474, 509 und 695. Daher hat eine erfolgreiche Verarbeitung von Säugetierproteinen, die aus rekombinanten bakteriellen Systemen exprimiert werden, im Allgemeinen erfordert, dass die Cysteinreste davon verändert werden, sodass sie nicht mit anderen Cysteinresten reagieren können. Ohne diese Behandlung erfolgt typischerweise eine unerwünschte Reaktion der Cysteinreste davon, die zu der Bildung von unlöslichen oder biologisch inaktiven Polypeptid-Aggregaten führt, welche für eine effektive Nutzung als Therapeutika ungeeignet sind.
Es sind zahlreiche gut bekannte Verfahren verfügbar, die verwendet werden können, um Cysteinreste erfolgreich zu verändern. Ein solches Verfahren beinhaltet die Behandlung von Cysteinresten mit einem Reduktionsmittel wie z. B. 6-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol „DTT" gefolgt von einer permanenten Alkylierung (z. B. mit Iodacetamid) der sieben Cysteinresten des Fragments. Zahlreiche weitere kovalente Markierungen können an den Target-Cysteinresten angebracht werden, wobei die einzige Voraussetzung jene ist, dass die Markierung unter pH-Bedingungen angebracht werden kann, die das Zielprotein nicht irreversibel denaturieren, wobei die Anbringung von einer Art ist, die unter den Bedingungen, denen das Fragment während der weiteren Verarbeitung oder Lagerung ausgesetzt ist, keine chemische Reaktion mit den anderen Cysteinresten zulassen wird. Solche kovalenten Markierungsverfahren sind in der Technik im Allgemeinen bekannt und umfassen auch z. B. eine Reaktion mit (A) Iodessigsäure oder (B) Iodierungsmittel, wie Iodfluorescein. Zudem können Cysteinreste chemisch verändert werden, wie durch eine Sulfitisierung. Die Veränderung kann auch über eine seitengerichtete Mutagenese einer codierenden DNA, Ersetzen der Cysteinreste durch „inerte" Reste wie z. B. Glycin oder Alanin oder durch Löschen von Sequenzpositionen, die Cystein entsprechen, bewerkstelligt werden. Es wird eine ausreichende Anzahl der Cysteinreste verändert, um die durch ihr Vorhandensein verursachten Probleme zu vermeiden.
Wie in dem untenstehenden Beispiel 1 beschrieben, wird bevorzugt, dass die durch eine fehlerhafte Disulfid-Brückenbildung verursachten Aggregationseffekte in Bezug auf die therapeutischen Formulierungen der Erfindung durch chemische Reduktion (mit Dithiothreitol „DTT") gefolgt von einer permanenten Alkylierung (mit Iodacetamid) eliminiert werden. Trotz dieser Behandlung wurde festgestellt, dass das resultierende Polypeptid (nachstehend als das „alkylierte" vWF-Fragment der Erfindung bezeichnet) in einer aggregierten und somit therapeutisch nutzlosen Form akkumuliert bleibt. Andere Typen von Cysteinveränderten Fragmenten können gleichermaßen gegenüber einer Solubilisierung für die therapeutische Formulierung resistent sein, wobei das dafür verantwortliche Aggregationsverhalten in keiner Beziehung zu den Cysteinen steht.
Demgemäß stellt die Erfindung Behandlungsschritte bereit, die beim Solubilisieren des aggregierten Cystein-veränderten Fragments effektiv sind, und sie stellt wässrige Lösungen des Fragments bereit, die annehmbar sind, um z. B. Patienten injiziert zu werden, wobei solche Lösungen das gelöste Fragment enthalten, das in nicht aggregierter und therapeutisch nützlicher Form vorliegt.
Somit gestattet die vorliegende Erfindung eine Identifikation von Bedingungen, unter denen das exprimierte vWF-Fragment, das Einschlusskörper umfasst, zuerst als ein nicht aggregiertes Cystein-verändertes Fragment, welches in einer ein Denaturie rungsmittel enthaltenden Lösung stabilisiert ist, und zweitens als ein nicht aggregiertes Fragment, welches in einer Lösung stabilisiert ist, die nur therapeutisch akzeptable Substanzen enthält, welche für Injektionen an Menschen verträglich sind, bereitgestellt werden kann.
Beliebige geeignete Mittel können verwendet werden, um das vWF-Fragment aus dem rekombinanten System, in dem das Fragment hergestellt wird, zu gewinnen. Als ein erster Schritt werden die unlöslichen Aggregate des Fragments, das heißt die Einschlusskörper, von den anderen zellulären Komponenten abgetrennt. Dies beinhaltet ein Aufschließen der Wirtszellen und eine Abtrennung des aufgeschlossenen Zellenmaterials von dem insolubilisierten Protein (als Einschlusskörper). Beispiele für verfügbare Mittel, um dies zu bewerkstelligen, sind Verfahren, die die Verwendung von Ultraschallbehandlung und Homogenisierung beinhalten. Repräsentative Verfahren umfassen jene, die in den US-Patenten Nr. 4 828 929 und 4 673 641 beschrieben sind.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Extrahieren der Einschlusskörper aus Wirtszellen ist in dem untenstehenden Beispiel 1 beschrieben und beinhaltet wiederholte Zyklen der Verwendung einer mechanischen Homogenisierung zum Bewirken eines Zellaufschlusses in Gegenwart eines oder mehrerer Detergenzien und die Abtrennung der aufgeschlossenen Zellenmaterialien von den vWF-Fragmenten durch Zentrifugation. Es versteht sich, dass auch andere verfügbare Verfahren verwendet werden können.
Das aus dem rekombinanten System gewonnene aggregierte vWF-Fragment umfasst ein breites Spektrum von Polypeptiden, das von löslichen Trimeren des Fragments zu makroskopischen unlöslichen Strukturen reicht, in denen tausende von derartigen einzelnen Polypeptidfragmente gebunden sind. Typischerweise sind diese Aggregate, die aus ca. 10 bis 20 oder weniger Frag menten bestehen und ein Molekulargewicht von 200 000 bis 400 000 aufweisen, jedoch löslich. Solche Fragmente, die hierin als „lösliches Aggregat" bezeichnet werden, besitzen einen relativ geringen therapeutischen Nutzen, wie in in-vitro-Assays gemessen wurde (siehe Beispiel 3 und 3). Bestimmte sogar noch größere Komplexe sind ebenfalls löslich, wenngleich ebenfalls von relativ geringem therapeutischem Nutzen.
Die „nicht aggregierten Fragmente" (oder Fragmente, die „im Wesentlichen frei von Aggregat" sind), die sich aus dem hierin beschriebenen Verfahren ergeben, umfassen eine Population, die aus monomerem Fragment und auch aus nicht-kovalent verbundenem dimerem Fragment zusammengesetzt ist. Auf der Grundlage von Versuchen unter Verwendung der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatografie (HPLC) ist die Menge an „löslichem Aggregat", die in solchen Proben vorliegt, kleiner als etwa 0,5%. Tatsächlich wird für die meisten Präparate erwartet, dass die prozentuelle Verunreinigung geringer ist und in großem Maß ein Artefakt der Salzumgebung des HPLC-Systems ist. Wie untenstehend erläutert wird, liegen die so isolierten Dimere im Gleichgewicht (1) mit dem Monomer vor, und es wurde festgestellt, dass sie im Durchschnitt die halbe Antithrombozyten-Agglutinationsaktivität von Monomeren bezogen auf das Gewicht besitzen. Dies legt nahe, eine der zwei Bindungsstellen innerhalb des Dimers zu maskieren. In Verbindung mit der Herstellung von therapeutisch nützlichen Proben von nicht aggregiertem Fragment wird die Zubereitung von Proben, die eine große Menge an Momomer und eine kleine Menge an Dimer enthalten, bevorzugt.
Bei der Ausführugn der Erfindung beginnt das Verfahren für die Herstellung von solubilisiertem und nicht aggregiertem Fragment mit einem Schritt, der unlösliches Aggregat in lösliches Aggregat umwandelt. Dies beinhaltet die Zubereitung einer wässrigen Lösung, die das Cystein-veränderte von vWF-Fragment und Denaturierungsmittel enthält.
Die bevorzugte Form der Erfindung beinhaltet die permanente Alkylierung des Fragments in einer wässrigen Lösung unter Bedingungen, unter denen ein Denaturierungsmittel die Bildung von löslichen Aggregaten von Fragment erleichtert. Die Dissoziation des aggregierten Materials kann mit einer beliebigen von verschiedenen gut bekannten Techniken, einschließlich Gelchromatografie auf Größenausschlussbasis und Ultrazentrifugation überwacht werden.
Der Alkylierung des Fragments geht die Reduktion der Intra- und Interketten-Disulfidbrücken in dem Einschlusskörperaggregat voraus. Darauf folgt die permanente Alkylierung der reduzierten Cysteinreste. Sowohl die Reduktion als auch die Alkylierung des Fragments können durch ein beliebiges geeignetes Mittel bewirkt werden, wobei solche Behandlungsschritte für Proteine bekannt sind.
Die Reduktion beinhaltet im Allgemeinen, dass eine wässrige Lösung des Aggregats mit einem geeigneten Reduktionsmittel unter Bedingungen, welche die Disulfidbrücken des Proteinaggregats zu Thiolgruppen umwandeln, umgesetzt wird. Beispiele für Reduktionsmittel, die verwendet werden können, sind 6-Mercaptoethanol und Dithiothreitol, wobei das zuletzt erwähnte bevorzugt wird.
Das Reduktionsprodukt kann dann einer Alkylierung unter Bedingungen unterworfen werden, sodass das Alkylierungsmittel dazu dient, die freien Sulfhydrylgruppen des Fragments auf eine Weise permanent und kovalent zu markieren, dass sie inaktiv sind und bleiben, wenn das Proteinfragment einer weiteren Verarbeitung oder Aufbewahrung unterworfen wird. Es kann jedes beliebige geeignete Alkylierungsmittel verwendet werden. Bei spiele für solche Mittel umfassen Iodacetsäure und Iodacetamid, wobei das zuletzt erwähnte bevorzugt wird.
Gemäß der Erfindung werden das Cystein-veränderte vWF-Fragment, das die alkylierte Form davon enthält, und die nachfolgende Herstellung von nicht aggregiertem Fragment bewirkt, indem das Fragment in einer wässrigen Lösung behandelt wird, die ein Denaturierungsmittel enthält. Der Begriff „Denaturierungsmittel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Substanzen, die in entsprechenden Konzentrationen in der Lage sind, die Konformation von Fragmenten typischerweise über einen oder mehrere der folgenden repräsentativen Mechanismen zu verändern: Verändern der Lösungsmittelumgebung, das heißt, des Hydratisierungszustands bestimmter Gruppen des Fragments, durch Bereitstellen bestimmter Lösungsmittel-Oberflächen-Wechselwirkungen oder durch Aufbrechen von ionischen oder Wasserstoffbrückenkontakten oder anderen Wechselwirkungen innerhalb von oder zwischen Fragmenten. Im Allgemeinen sind die Effekte eines Denaturierungsmittels reversibel. Zum Beispiel wird bei einer Dialyse gegen eine Lösung, die kein Denaturierungsmittel enthält, der durch das Denaturierungsmittel induzierte Effekt umgekehrt. Das Wesen des in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendeten Denaturierungsmittels und die Behandlungsbedingungen sind derart, dass die Effekte der Verwendung des Denaturierungsmittels reversibel sind. Demgemäß sollte die Verwendung von Materialien oder Bedingungen, die einen irreversiblen Effekt bewirken, vermieden werden, z. B. die Verwendung einer hohen Temperatur oder die Anwendung von Substanzen, die mit einer so hohen Affinität an das Fragment binden, dass es praktisch unmöglich ist, sie zu entfernen.
Die Begriffe „Denaturierungsmittel" und „Detergens", wie hierin verwendet, sind als gleichwertig zu betrachten, so lange die obenstehenden Kriterien erfüllt sind. Beispiele für geeignete Materialien zur Verwendung als Denaturierungsmittel in der vorliegenden Erfindung umfassen Harnstoff und Guanidin-Hydrochlorid und Detergenzien wie z. B. Polyoxyethylen (9) p-tert-Oktylphenol (Nonidet^® P40), Polyoxyethylen (9–10) p-tert-Oktylphenol (Triton-X-100) und Natriumdeoxicholat.
Das am meisten bevorzugte Denaturierungsmittel zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist Harnstoff. Er ist sehr gut löslich in wässrigen Lösungen und er kann durch Dialyse schnell aus der Lösung entfernt werden. Da Harnstoff eine nicht ionische Substanz ist, stört er, wie untenstehend beschrieben, Ionenaustauschermaterialien nicht, die in dem Verfahren verwendet werden können, um Verunreinigungen bakteriellen Ursprungs wie z. B. DNA und Endotoxin zu entfernen. Ein empfohlener Konzentrationsbereich von Harnstoff beträgt etwa 4 Mol bis etwa 8 Mol.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung kann auch Schritte umfassen, die sich als besonders nützlich erwiesen haben, um von dem Cystein-veränderten vWF-Fragment Verunreinigungen bakteriellen Ursprungs wie z. B. bakterielle DNA, bakterielles Endotoxin (Lipopolysaccharid) und bakterielle Proteine zu entfernen. Die Entfernung solcher Verunreinigungen gestattet es, das Fragment in therapeutischen Formulierungen zu verwenden. Allgemein gesagt, beinhaltet das Verfahren, dass eine wässrige Lösung aus dem unreinen alkylierten vWF-Fragment und Denaturierungsmittel einem Anionenaustauschermaterial und dann einem Kationenaustauschermaterial ausgesetzt wird.
Die Behandlung der die Verunreinigung enthaltenden Lösung mit dem Anionenaustauschermaterial wird bei einem alkalischen PH durchgeführt und ist effektiv bei der Entfernung von bakterieller DNA und Endotoxin, die an das Anionenaustauschermaterial gebunden sind, aus der Lösung. Zu diesem Zweck sollte die Lösung eine Menge von Salz in einer derartigen Größe enthalten, dass die bakteriellen Komponenten sich an das Anionenaustauschermaterial binden und die vWF-Fragmente nicht.
Die Lösung wird dann bei einem sauren pH mit einem Kationenaustauschermaterial in Kontakt gebracht, an das die Fragmente binden, wodurch das Fragment von dem bakteriellen Protein abgetrennt wird. Der saure pH der Lösung sollte derart sein, dass einige der Carboxylgruppen des Kationenaustauschermaterials ionisiert werden und einige der Carboxylgruppen an dem Fragment protonisiert werden, um eine Aggregation zu vermeiden. Die Elution des Fragments aus dem Kationenaustauschermaterial kann mit einem geeigneten Elutionspuffer, z. B. und vorzugsweise einer wässrigen Lösung, die ionische Zitronensäure und nicht ionisches Denaturierungsmittel enthält, durchgeführt werden.
Das untenstehende Beispiel 1 beschreibt eine Reihe von Schritten, die repräsentativ für Verfahren sind, welche bakterielle Verunreinigungen von dem Fragment unter Bedingungen wirksam abtrennen, unter denen das Gesamtziel des Verfahrens – die Umwandlung der Population von Cystein-veränderten vWF-Fragmenten in nicht aggregierte Fragmente – erreicht wird.
Wenngleich Guanidinhydrochlorid als ein bevorzugtes Denaturierungsmittel angesehen wird, stört es Ionenaustauschermaterialien und muss im Wesentlichen vor jeglichen Ionenaustausch-Schritten entfernt werden, die Verunreinigungen der zuvor erwähnten Art entfernen. Eine empfohlene Konzentration an Guanidinhydrochlorid beträgt etwa 4 bis etwa 8 Mol.
Das untenstehende Beispiel 5 ist illustrativ für eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der das Fragment von bakteriellen Verunreinigungen durch ein Affinitätschromatografie-Verfahren abgetrennt wird. Dieses Verfahren stellt eine schnelle, effiziente Reinigung von vWF in großem Maßstab auf der Basis der Affinität von vWF für Heparin bereit.
Diese Ausführungsform beruht zum Teil auf der Erkenntnis, dass die in den vorliegenden Verfahren gereinigten vWF-Fragmente eine Sequenz von 23 Aminosäureresten (Tyr⁵⁶⁵ bis Ala⁵⁸⁷) umfassen, von der bekannt ist, dass sie Heparin bindet. Die Affinität des Fragments für Heparin erleichtert die Verwendung eines Affinitätschromatografie-Verfahrens, das die Co-Isolierung von ähnlichen Proteinen vermeidet, die bei Ionenaustauschchromatografie-Verfahren oft beobachtet wird.
Die in dieser Ausführungsform verwendeten Affinitätschromatografiemedien umfassen an eine chromatografischen Matrix gebundene Heparinmoleküle. Wenn vWF-Fragmente auf eine Chromatografiesäule aufgebracht werden, die dieses Medium enthält, binden die Fragmente reversibel an die Heparinmoleküle und werden selektiv zurückgehalten, während unerwünschte Verunreinigungen durch die Chromatografiesäule laufen. Die vWF-Fragmente können dann mit einer Salzlösung eluiert werden, die eine ausreichende Ionenstärke aufweist, um die nicht-kovalente Assoziierung von vWF und den Heparinmolekülen zu überwinden. Der eluierte vWF kann dann unter Verwenden zusätzlicher Chromatografieschritte weiter gereinigt werden.
Das bei der Ausführung dieser Ausführungsform verwendete Affinitätschromatografiemedium kann leicht unter Verwenden von in der Technik bekannten Verfahren zubereitet werden oder ist im Handel erhältlich. Falls gewünscht, kann Heparin unter Verwenden von in der Technik bekannten Vorschriften an eine gewünschte Chromatografiematrix wie z. B. Sepharose oder Agarose gebunden werden, wobei diese Vorschriften Cyanogenbromid verwenden. Alternativ können handelsübliche Affinitätschromatografimedien verwendet werden wie z. B. Heparin-Sepharose CL-6B, vertrieben von Pharmacia. In bevorzugten Ausführungsformen wird ein handelsübliches Affinitätschromatografie-Material eingesetzt.
Wenngleich die Affinitätschromatografie-Verfahren der vorliegenden Erfindung über einen Bereich von pH-Werten ausgeführt werden können, werden überlegene Ergebnisse erzielt, wenn diese Verfahren bei einem pH unterhalb von etwa 6 ausgeführt werden. Es wurde festgestellt, dass die Kombination aus einem Denaturierungsmittel, wie Harnstoff, und niedrigen pH-Bedingungen zu einer hochselektiven Bindung von vWF an das Affinitätschromatografie-Medium führt und unspezifische Wechselwirkungen minimiert sind. Es scheint, dass die Anwendung niedriger pH-Bedingungen nicht nur zu der selektiven Bindung des Fragments beiträgt, sondern die vWF-Fragmente auch in einem nicht aggregierten Zustand bewahrt und dadurch eine nachfolgende Renaturierung der Fragmente ermöglicht. Demgemäß werden die vorliegend beanspruchten Affinitätschromatografie-Verfahren in bevorzugten Ausführungsformen bei einem niedrigen pH unterhalb von etwa 6 in Gegenwart eines Denaturierungsmittels, wie Harnstoff, ausgeführt.
Anschließend an die hierin obenstehend beschriebenen entweder Ionenaustausch- oder Affinitätschromatografie-Verfahren, ist es wichtig, dass das Fragment während der weiteren Solubilisierung in Gegenwart von Denaturierungsmittel bei einem pH von etwa 2,5 bis unterhalb von etwa 5,5 gehalten wird. Die Titration der Aminosäureseitenketten des alkylierten vWF-Fragments mit Säure zeigt, dass das Fragment bei pH 3,5 vollständig protoniert wird, wobei das Polypeptidfragment dann eine Nettoladung von (+)41 trägt. Es wird angenommen, dass es wichtig ist, das Fragment in einer Umgebung zu halten, welche die Nettoladung maximiert, um die Solubilität des Fragments aufrechtzuerhalten, die Dissoziation der löslichen Aggregate zu kleineren Aggregaten und zu nicht aggregiertem Material zu erleichtern und auch die Reassoziation von Fragmenten zu verhindern. Ein pH-Wert von etwa 3 bis etwa 4 wird bevorzugt. Die Solubilisierung in Gegenwart von Denaturierungsmittel bei pH 3,5 wird am stärksten bevorzugt. Es kann eine beliebige geeignete Säure verwendet werden, um den pH einzustellen. Beispiele für Säuren, die verwendet werden können, umfassen Salzsäure oder Milchsäure. Allerdings wird die Verwendung einer Säure bevorzugt, die eine Pufferkapazität im pH-Bereich von etwa 3 bis etwa 5 bereitstellt. Die Verwendung von Zitronensäure wird am stärksten bevorzugt.
Wenngleich viele Verfahren zum Solubilisieren von aggregierten Einschlusskörperproteinen in Gegenwart von Denaturierungsmittel bekannt sind, erfordert jedwede klinische Verwendung des erhaltenen Produkts, dass das darin enthaltene Denaturierungsmittel durch klinisch akzeptable Materialien ersetzt wird, die nicht toxisch und nicht reizend sind, sodass die erhaltene Lösung gesetzlichen Anforderungen, um Menschen injiziert zu werden, entspricht. Versuche, Cystein-verändertes vWF-Fragment und sogar Fragment in alkylierter Form, das aus Einschlusskörpern rekonstituiert wird, in einer Lösung zu formulieren, die einen physiologischen pH oder eine Konzentration an Ionen besitzt, die den Salzgehalt von Blut widerspiegelt, haben nur zu Produkten geführt, die unlösliches aggregiertes Protein enthalten.
Daher, wenngleich die Monomerisierung des Cystein-veränderten Fragments mit Denaturierungsmitteln eine Zusammensetzung erzeugt, in der die Fragmente im Wesentlichen dissoziiert werden, hat sich eine erfolgreiche Formulierung des Polypeptids für die klinische Verwendung ohne Denaturierungsmittel vordem als unmöglich erwiesen. Wenngleich eine Nettoladung von +41 an dem vWF-Fragment bei einem pH von 3,5 erzielt wird und wenngleich diese Ladung repräsentativ für, oder sogar wesentlicher als, die Nettoladung ist, die an vielen Proteinen mit vergleichbarer Größen erzeugt werden kann, bildeten monomere Mo leküle so Reaggregat bei Abwesenheit von Denaturierungsmittel. Es folgt nun eine Erläuterung von Verfahrensschritten, die es gestatten, eine klinische Formulierung einer löslichen Form des Cystein-veränderten vWF-Fragments herzustellen und es aufzubewahren und zu verabreichen.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Erkenntnis, dass die Löslichkeit von Cystein-verändertem vWF-Fragment in einer Lösung mit saurem pH verbessert ist, wenn die Lösung eine relativ niedrige Konzentration an ionischen Substanzen enthält. Solche Substanzen können die Form von organischen oder anorganischen Salzen, Puffern, Aminosäuren oder anderen geladenen Molekülen besitzen. Wie untenstehend erarbeitet, wird angenommen, dass das Halten des Cysteinveränderten Fragments in solch einer wässrigen Lösung die Solubilisierung von semipolaren oder hydrophoben Gruppen des Fragments durch die wässrige Lösung relativ zu Lösungen mit physiologischen Werten des pH und ionischer Salzkonzentration erleichtert. Demgemäß werden solche Lösungen als Ersatz für die oben beschriebenen, Denaturierungsmittel enthaltenden Lösungen für die Lagerung von klinischen Formulierungen verwendet.
Bei der Ausführung der Erfindung sollte die Konzentration der ionischen Substanzen, definiert als die Gesamtsumme der Konzentration der positiven und der negativen Ionen, die zusätzlich zu dem Beitrag der durch das Fragment bereitgestellten geladenen Gruppen vorhanden ist, etwa 75 mMol in einer wässrigen Lösung des Fragments nicht überschreiten. Wenn diese Konzentration überschritten wird, ist die Aggregation des Cystein-veränderten vWF-Fragments in Abwesenheit von Denaturierungsmittel von einer derart bedeutenden Größenordnung, dass das Material für eine längere Lagerung zur klinischen Verwendung ungeeignet ist, unabhängig davon, ob in Lösung oder wenn es aus der tiefgefrorenen Lagerung aufgetaut wird oder wenn es aus gefriergetrockneter Form rekonstituiert wird, und, wie untenstehend dargelegt, kann es ferner ungeeignet für eine vorübergehende Lagerung vor einer weiteren Verarbeitung sein.
Die Konzentration, bei der das Cystein-veränderte vWF-Fragment im Wesentlichen frei von Aggregat in den wässrigen Formulierungen der Erfindung vorliegt, kann über einen relativ weiten Bereich variieren, z. B. von etwa 1 bis etwa 30 mg/ml. Daher kann das Cystein-veränderte Fragment z. B. in den bevorzugten Formulierungen bei bis zu wenigstens etwa 30 mg/ml ohne die Ausbildung von löslichem Aggregat löslich gemacht werden. Auf Grund des zwischen Monomeren und Dimeren bestehenden Gleichgewichts des „nicht aggregierten" Cystein-veränderten Fragments und auf Grund der höheren spezifischen inhibitorischen Aktivität des Monomers (siehe Beispiel 2 und 1) werden Konzentrationsbereiche, die das Monomer begünstigen, wie bis zu etwa 15 mg/ml, bevorzugt, wobei etwa 5 bis etwa 10 mg/ml, eine Konzentration, die besonders für eine wirksame Dosierung geeignet ist, am stärksten bevorzugt wird.
Bei der Ausführung der Erfindung wird eine therapeutische Formulierung bevorzugt, die bis zu etwa 10 mMol anorganisches Salz, bis zu etwa 15 mMol einer zusätzlichen ionischen Verbindung, wie z. B. ein Aminosäurehydrochlorid, und bis zu etwa 10 mMol eines Puffers enthält. Mit Bezug auf die Erläuterung bevorzugter Konzentrationsbereiche der obenstehend angeführten oder ähnlicher Verbindungen versteht sich, dass sich „mMol" auf die Konzentration der Verbindung bezieht, nicht auf die einzelnen Ionen, deren Gesamtsumme 75 mMol nicht überschreiten sollte.
Zusätzlich kann den Formulierungen der vorliegenden Erfindung, entweder vor der Lagerung in flüssiger Form oder vor ihrer Gefriertrocknung, ein nicht-ionisches Tonizitäts-Modifizierungsmittel, wie Zucker oder ein Zuckerderivat, ein schließlich z. B. Mannitol, Saccharose oder Maltose, zugesetzt werden. Die Menge davon kann etwa 0 bis etwa 15% (Gew./Vol.) umfassen. Solche Präparate können eingefroren und dann zur therapeutischen Verwendung aufgetaut werden.
Eine bevorzugte wässrige Formulierung umfasst NaCl oder ein anders anorganische Salz zu etwa 0,5 bis etwa 10 mMol, Zitronensäure oder einen anderen geeigneten Puffer zu etwa 0,5 bis etwa 5 mMol und Lysinmonohydrochlorid oder eine andere Aminosäure zu etwa 0,5 bis etwa 15 mMol.
Stark bevorzugt ist in der vorliegenden Erfindung eine Lösung mit einem pH von etwa 3,5, die etwa 1,5 mNol NaCl, etwa 1 mMol Zitronensäure und etwa 1 mMol Lysinmonohydrochlorid umfasst. Die Zugabe eines nicht-ionischen Tonizitäts-Modifizierungsmittels wie z. B. Mannitol zu etwa 5% (Gew./Vol.) macht die Formulierungen der Erfindung isotonisch annähernd wie physiologische Lösungen.
Den hierin beschriebenen Verarbeitungsschritten folgend ist es möglich, eine wässrige Lösung aus Cystein-verändertem vWF-Fragment herzustellen, welche im Wesentlichen frei von Aggregat ist. Der Ausdruck „im Wesentlichen frei von Aggregat" umfasst eine therapeutische Lösung oder eine andere pharmazeutische Zusammensetzung aus Cystein-verändertem vWF-Fragment, die eine Menge an löslichem Aggregat und/oder unlöslichem Aggregat enthält, die nicht ausreicht, um nachteilige klinische Folgen bei Patienten auszulösen, wenn sie in therapeutischen Dosen verabreicht wird.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um wässrige Lösungen aus Cystein-veränderten Fragmenten herzustellen, die im Wesentlichen frei von Aggregat sind, wobei die Konzentration des Fragments darin zwischen etwa 1 und etwa 30 mg/ml, vorzugsweise zwischen etwa 5 und etwa 15 mg/l und am stärksten bevorzugt bei etwa 10 mg/ml liegt.
Die Ausführung der Erfindung kann auch verwendet werden, um wässrige Lösungen aus Cystein-veränderten Fragmenten herzustellen, die im Wesentlichen frei von Aggregat sind, wobei die Gewichtsprozent an Monomer wenigstens 40 bis etwa 100%, vorzugsweise wenigstens etwa 65 bis etwa 80 Gew.-% und am stärksten bevorzugt etwa 75 Gew.-% betragen.
Cystein-verändertes vWF-Fragment kann zur Lagerung in nicht aggregierter Form in pyrogenfreiem, deionisiertem Wasser formuliert werden, wobei der resultierend pH ohne zusätzliche Puffer, Salze oder ionische Verbindungen, außer wie es notwendig ist, um so das Präparat zu titrieren, auf etwa 3,5 eingestellt wird. In solch einem Fall ist die Zugabe eines nichtionischen Tonizitäts-Modifizierungsmittels bevorzugt. Solche Präparate können auch gefriergetrocknet oder eingefroren und dann zur therapeutischen Verwendung aufgetaut werden. Somit stellt die Erfindung therapeutische Lösungen bereit, die solch eine Stabilität besitzen, dass sie gefriergetrocknet oder eingefroren und dann rekonstituiert oder aufgetaut werden können, sodass bei solch einer Behandlung die ursprüngliche Aktivität zurückkehrt.
Zusammensetzungen, die gemäß der Ausführung der Erfindung hergestellt werden, können wenigstens einen Monat bei 4°C aufbewahrt werden, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von Aggregat bleibt.
In Bezug auf die Auswahl eines bevorzugten pH zum Aufbewahren einer Lösung oder für solch eine Lösung vor dem Gefriertrocknen oder Einfrieren derselben wird angemerkt, dass eine Titration mit Säure der Aminosäureseitenketten des Cystein veränderten Fragments, wobei das Fragment mit der vollen Ladung (+)41 erzeugt wird, bei einem pH von ca. 3,5 zu Ende ist. Demgemäß werden Formulierungen im pH-Bereich von etwa 3 bis etwa 5 bevorzugt. Eine höhere Acidität kann das Protein denaturieren, wohingegen höhere pH-Werte zu nahe an den isoelektrischen pH (5,5) des Proteins herankommen, bei dem eine Aggregation stattfinden würde.
Es wird angemerkt, dass Formulierungen, die einen pH außerhalb des bevorzugten Bereiches besitzen, oder die eine Konzentration an Ionen außerhalb des bevorzugten Bereiches enthalten nichtsdestoweniger zur Lagerung einer wässrigen Lösung aus alkyliertem Fragment über mittlere Zeitspannen (z. B. vor einer weiteren Verarbeitung) vor einer Lagerung über längere Zeit geeignet sein können.
Cystein-verändertes vWF-Fragment, bereitgestellt aus vWF, wie es aus dem Kreislaufsystem oder aus einem rekombinanten Säugetiersystem isoliert wird, kann gemäß der Ausführung der Erfindung auch mit verbesserten Lösungs- und Stabilitätseigenschaften formuliert werden. Die so hergestellte Formulierung kann isotonisch mit dem Blut oder kann hypertonisch oder hypotonisch gegenüber diesem sein.
Es wird angenommen, dass die Monomerisierungs- und Formulierungsverfahren dieser Erfindung zumindest zum Teil effektiv sind, da es die hierin offenbarten Behandlungsbedingungen gestatten, Nutzen aus den Eigenschaften bestimmter hydrophober und hydrophiler Aminosäurereste und resultierender Domänen innerhalb der Sequenz von Cystein-verändertem vWF-Fragment zu ziehen. Es wurde zuvor erwähnt, dass das Halten des Cysteinveränderten Fragments bei pH 3,5 dem Polypeptid eine Nettoladung von ⁺41 verleiht, von der angenommen wird, dass sie seinen hydrophilen Charakter und somit seine Löslichkeit erhöht. Eine Titration (Protonisierung) von Glutamin- und Asparginsäuresei tenketten bei oder unterhalb von einem pH von etwa 4,5 ist ein potentiell bedeutender Modulator der Proteinstruktur, was auch die dem vWF-Fragment verliehene Stabilisierung gegen eine Aggregation durch Lagerung bei pH 3,5 erklären kann.
Es ist gut bekannt, dass geladene Seitenketten von Aminosäure-Homopolymeren α-Helices destabilisieren können. Ungeladene/s Poly-L-glutaminsäure und Poly-L-lysin z. B. bilden stabile α-Helix-Strukturen, während ihre geladenen Formen davon nur als Random-Coil-Regionen stabil sind. Urnes, P. und Dozy, P., Adv. Protein Chem., 16, 401 (1961), Lehninger, A. L., Biochemistry, S. 113, Worth Publishing Company (1970). Es ist zu erwarten, dass auch entsprechend positionierte Glutamin- und Asparginsäurereste, wenn sie negativ geladen sind, α-Helix-Regionen innerhalb des vWF-Cystein-veränderten Fragments destabilisieren werden. In protonierter Form jedoch, z. B. bei pH 3,5, ist es wahrscheinlicher, dass sie sich anpassen und in geordneten strukturellen Regionen eingeschlossen werden oder eine benachbarte Ausbildung oder Ausbreitung dieser zulassen.
Es wird angenommen, dass in dem Ausmaß, in dem solche geordneten strukturellen Bereiche durch eine Aspartat- oder Glutamat-Protonisierung bei pH 3,5 vergrößert oder gebildet werden, sie die Fähigkeit einschränken werden, mit der jede dieser Regionen (die zuvor bei einem pH von ca. 7,0 als eine Random Coil vorlag, welche hydrophobe Reste enthält) binden kann. Es wird vorweggenommen, dass diese Effekte durch eine Erhöhung der Aktivierungsenthalpie gemessen werden können, die zur hydrophoben Assoziierung notwendig ist.
Es ist auch zu erwarten, dass solche Assoziierungen in wässrigen Lösungen minimiert sind, die im Vergleich zu physiologischen Lösungen eine wesentlich niedrigere Konzentration an gelösten ionischen Substanzen enthalten.
Es ist zu erwarten, dass ein Halten bei pH 3,5, unabhängig davon ob die Monomerisierung eines bestimmten Proteins erleichtert und die Aggregation desselben verhindert wird oder nicht, abhängig ist von der Gesamtanzahl der Aspartat- und Glutamatreste in der Polypeptidstruktur und von ihrem Abstand in Bezug auf Subdomänen bestimmter Aminosäurereste, deren Potential, an einer geordneten Struktur teilzunehmen, zum Teil von dem Protonisierungszustand des proximalen Glutamats und Aspartats abhängig ist. Es ist daher offensichtlich, dass, ob ein Anordnen von Cystein-veränderten rekombinant hergestellten Polypeptiden bei pH 3,5 die Monomerisierung derselben erleichtert oder stabilisiert, eine Frage ist, die auf der Grundlage der Spezies für eine Polypeptidspezies gestellt werden muss.
Bestimmte Faktoren, die bei der Bewertung des potentiellen Nutzens einer Formulierung bei niedrigem pH nützlich sind, um ein Aggregationsverhalten zu vermeiden, das andernfalls unter Lagerbedingungen bei einem physiologischen pH 7,0 zutage tritt, sind hierin nachstehend unter Verwendung eines Cysteinveränderten vWF-Fragments als ein Modell dargestellt.

(A) Das Cystein-veränderte Rest-445-733-vWF-Fragment enthält 21 Glutamat- und 15 Aspartatreste aus einer Gesamtheit von 289 Sequenzpositionen, was anzeigt, dass eine beträchtliche Zahl von Stellen, an denen eine geordnete Sekundärstruktur bei pH 7,0 gestört wird, bei einer Protonisierung bestimmter Glutaminsäure- oder Asparginsäurereste geordnet werden kann.
(B) Viele klassisch hydrophobe Reste sind bekannt dafür α-Helix oder β-Faltblatt-Domänen zu bevorzugen oder zuzulassen und infolge einer Sequestrierung in einer geordneten strukturellen Subdomäne bei pH 3,5 weniger in der Lage sein können, bei einer hydrophoben Aggregation mitzuwirken. Solche Reste umfassen Alanin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Methionin, Aspargin, Glutamin und Valin. Ob eine bestimmte Subregion benachbart zu einem Asp- oder Glu-Rest hydrophob ist, sodass sie von Nutzen wäre, um ihr eine geordnete Sekundärstruktur zu verleihen, wie es durch eine Glutamat- oder Aspartat-Protonisierung zugelassen würde, kann zum Teil durch Bezugnahme auf das Modell von Kyte, J. et al., J. Mol. Biol., 157, 105–132 (1982) beantwortet werden. Das Kyte-Modell sagt das Ausmaß des hydrophoben (oder hydrophilen) Charakters vorher, das eine bestimmte Peptidsequenz aufweisen wird, wenn sie in größeren Polypeptiden vorhanden ist. Ein Gesamt-Hydrophobizitäts/Hydrophilizitäts-Index wird auf der Basis der Beiträge einzelner Reste und der Position bestimmter Aminosäuren in Bezug zueinander in der Target-Sequenz zugeordnet.
(C) Innerhalb des Rest-445-733-Fragments gibt es zahlreiche Sequenzen aus 5 oder mehr Resten, wo erwartet wird, dass eine geordnete Struktur durch Protonisierung von Glutamin- oder Asparginsäure in dem pH-Bereich zwischen 3,5 und 4,0 in Bezug auf die bei einem pH nahe 7,0 erreichte Ordnung verbessert werden kann. Repräsentative Domänen, deren α-Helix-Charakter bei pH 3,5 verbessert werden kann, umfassen die folgenden (unter Verweis auf die veröffentlichte Sequenz): (1) Cys⁴⁶⁴ – Leu⁴⁶⁹ (enthält Asp bei 465); (2) Cys⁴⁷¹ – Glu⁴⁷⁶ (enthält auch Glu bei 472); (3) Leu⁴⁹⁴ – Ile⁴⁹⁹ (enthält Glu und Asp bei 497 bzw. 498); (4) Leu⁵¹² – Asp⁵²⁰ (enthält auch Asp bei 514); (5) Glu⁵²⁷ – Leu⁵³³ (enthält auch Glu bei 529, 531); (6) Val⁵³⁷ – Glu⁵⁴² (enthält auch Asp bei 539); (7) Val⁵⁵³ – Tyr⁵⁵⁸ (enthält Glu bei 557); (8) Val⁶⁸⁰ – Gln⁶⁸⁶ (enthält Asp bei 681 und Glu bei 682, 684); und (10) Tyr⁶⁹³ – Ala⁶⁹⁸ (enthält Asp bei 696).

Die Zunahme der geordneten Struktur, die in einem nicht aggregierten Cystein-veränderten vWF-Fragment durch eine pH-Verschiebung von 4,5 auf 3,5 erzeugt werden kann, ist in Beispiel 4 und 4 davon beschrieben.
Mit Bezug auf die therapeutische Verwendung von Formulierungen aus Cystein-verändertem vWF-Fragment, die im Wesentlichen frei von Aggregat sind, wird die Menge zur Verabreichung für die Prävention oder Verhinderung einer Thrombose von der Schwere, mit welcher der Patient an der Thrombose leidet abhängen, kann aber problemlos für jedweden bestimmten Patienten ermittelt werden. Die Formulierungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, welche Lösungen oder resuspendiertes gefriergetrocknetes Material umfassen, können Patienten direkt injiziert werden oder mit weiteren physiologisch verträglichen Substanzen, wie nicht-ionischen Tonizitäts-Modifizierungsmitteln, unmittelbar vor einer Injektion vermischt werden.
Beispiele
Referenz 1 – Herstellung von alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment in nicht aggregierter Form
Das folgende Verfahren ist gestattet, um (1) lösliche Aggregate (typischerweise 200 kDa oder mehr), die aus einem Einschlusskörper-Pellet aus vWF-Fragment aufgelöst wurden, in Lösung zu bringen, wie untenstehend beschrieben; (2) Verunreinigungen zu entfernen, die in therapeutischen Formulierungen inakzeptabel sind (wie z. B. bakterielle DNA oder Endotoxine); (3) eine „Monomerisierung" des Fragments in einer Reihe von Schritten einzuleiten, die zu immer kleineren Aggregaten führen; und (4) das erhaltene nicht aggregierte Material in einem Formulierungspuffer bereitzustellen, der das Fragement gegenüber einer Reaggregation stabilisiert.
Das Einschlusskörper-Pelletmaterial wurde aus einer entsprechenden Kultur von E. coli BL21 (DE3) pLysS, wie folgt, erhalten. Die Zellen wurden aus 50 Liter belüfteter Kultur geerntet und unter Verwenden von Hohlfaser-Mikrofiltermembran-Patronen aufkonzentriert. Zwei Amicon H5MPO1-43 Filterpatronen wurden in einem Rezirkulationsmodus verwendet. Die Zellen wurden auf den Amicon-Filtern auf ein Volumen von 2 bis 4 Liter aufkonzentriert, wonach die Zellen durch Diafiltration in der Amicon-Filtrierapparatur mit 5 Volumenteilen, ca. 10 bis 20 Liter, Tris-gepufferter Salzlösung (0,025 Mol Tris, 3,03 g/l H₂O, 0,2 Mol NaCl, 11,7 g/l H₂O, End-pH 7,5 ±0,2, 25°C; hierin nachfolgend als A-1 bezeichnet) gewaschen wurden.
Die Zellen wurden aus Filtration in 4 Liter Tris-gepufferter Salzlösung (A-1) gewonnen. Bei der Vorbereitung zum Aufschließen der Zellen wurde Natrium-Deoxycholat der Zellsuspension zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,5 g/l zu erreichen. Die Zellen wurden mechanisch aufgeschlossen, indem sie unmittelbar nach dem Sammeln durch einen Microfluidizer^® (Microfluidics Corp., M-110Y Microfluidizer^®) geleitet wurden. Nachdem die Zellen ein Mal durch den Microfluidizer^® gelaufen waren, wurde ein zweites Detergens, Tween 80, der Suspension lysierter Zellen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,025% zu erreichen, wobei 25 ml von 2,5% Tween 80 (Vol./Vol.), in einem Liter TBS gelöst, verwendet wurden. Dies geschieht indem der Puffer A-1 erwärmt und das Tween 80 tropfenweise der Lösung zugesetzt und gemischt wird, bis die Lösung sichtbar homogen ist. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann der Suspension aufgeschlossener Zellen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,025% (Vol./Vol.) zu erreichen; (hierin nachfolgend A-2). Wenn das Tween in dem ersten Durchlauf vorhanden ist, kann der Microfluidizer^® verstopft werden und dies wird es erfordern den Strömungsweg zu reinigen, bevor die Zellen aufgeschlossen werden können. Nachdem die Zellen aufgeschlossen wurden, wurde die Suspension zentrifugiert (10 000 × g; 35 min, 4°C), um die Einschlusskörper abzutrennen, die ein Primärprodukt aus den löslichen Zelttrümmern sind. In diesem Stadium können die Einschlusskörper über Nacht bei –20°C aufbewahrt werden.
Die Einschlusskörper wurden in 35 ml Tris-Puffer A-3 pro Gramm Einschlusskörper-Nassgewicht, bestimmt durch die Gewichtsdifferenz des Zentrifugenröhrchens (A-3 – 0,05 Mol Tris, 6,06 g/l H₂O, 1,21 mMol Natrium-Deoxycholat, 0,5 g/l H₂O, 2 mMol Dithiothreitol (DTT), 0,31 g/l H₂O, 2 mMol EDTA, 0,74 g/l H₂O, 5% (Vol./Vol.) Glycerin, 50 ml/l H₂O, 0,025% (Vol./Vol.) Tween 80, 10 ml 2,5% Tween 80 (A-2)/l H₂O, End-pH 9,0 ± 0,2, 25°C), resuspendiert. Die Einschlusskörper-Pellets wurden routinemäßig in einem Puffer unter Verwenden eines Polytron-Homogenisators (Brinkmann) resuspendiert. Die resuspendierten Einschlusskörper wurden durch den Microfluidizer^® geleitet, um ein sorgfältiges Mischen mit dem Puffer sicherzustellen. Nach dem Durchgang durch den Microfluidizer^® wurden die Einschlusskörper durch Zentrifugation gesammelt. Die Waschprozedur wurde insgesamt drei Mal mit Tris-Puffer A-3 durchgeführt. Am Ende des dritten Waschens werden die pelletierten Einschlusskörper in Tris-Puffer A-4 resuspendiert, der die Detergentien Deoxycholat oder Tween nicht enthält (A-4 – 0,05 Mol Tris, 6,06 g/l H₂O, 2 mMol Dithiothreitol (DTT), 0,31 g/l H₂O, 2 mMol EDTA, 0,74 g/l H₂O, 5% (Vol./Vol.) Glycerin, 50 ml/l H₂O, End-pH 9,0 ± 0,2, 25°C). Das vierte und letzte Waschen wurde mit Tris-Puffer A-4 durchgeführt. Das Rohprodukt wurde nach der Zentrifugation gesammelt, zum Trocknen entwässert und kann bei –70°C aufbewahrt werden.
Jedes Gramm Einschlusskörper-Pellet wurde in einem Volumen von 7,5 ml Puffer gelöst, der 6 Mol Harnstoff, 0,05 Mol Tris·HCl und 1 Mol Natriumchlorid, pH 8,8, umfasst. Das erhaltene „solubilisierte" vWF-Material stellt eine heterogene Population von löslichen Aggregaten mit einem Molekulargewicht von typischerweise ca. 200 kDa oder mehr dar.
Das Gemisch wurde unter eine Stickstoffatmosphäre gebracht und Dithiothreitol (DTT) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,01 Mol unter sanftem Rühren zugesetzt, um die Disulfid-Brücken des Fragments zu reduzieren. Das Rühren des Gemisches wurde im Dunkeln eine Stunde lang bei 37°C fortgesetzt. Jodacetimid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Mol zugesetzt. Die Inkubation im Dunkeln wurde eine Stunde lang bei 37°C fortgesetzt. Dann wurde weiteres DDT zugesetzt, um die Endkonzentration von DDT auf 0,03 Mol anzuheben. Die alkyliertes vWF-Fragment enthaltende Lösung wurde dann durch einen 0,2 Mikron-Filter geleitet und in einen kalten Raum überführt, der bei 4°C ± 2°C gehalten wurde. Anschließende Reinigungsverfahren wurden in einem kalten Raum bei 4°C unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt, die bei dieser Temperatur voräquilibriert wurden.
Das alkylierte Material wurde 5-fach durch Zugabe eines Puffers umfassend 6 Mol Harnstoff, 0,05 Mol Tris·HCl, 5 mMol Dinatrium-EDTA bei pH 8,0 verdünnt. Die erhaltene Lösung enthält auch 0,2 Mol NaCl, das von der Alkylierungslösung mitgebracht wurde. Das verdünnte vWF-Präparat wurde auf einer 252 mm × 150 mm-Säule aus 45–165 Mikron perlförmigen Agarose-Partikeln mit für einen Anionenaustausch geeigneten quarternären Ammoniumseitenketten (Q-Sepharose^®, Pharmacia, Uppsala, Schweden), welche mit einem Puffer mit 6 Mol Harnstoff, 25 mMol Tris·HCl, 0,02 Mol Kaliumchlorid, 0,1 mMol Dinatrium-EDTA, 0,1 mMol DTT, pH 8,0 voräquilibriert wurde, chromatografiert. Unter diesen Bedingungen erfolgte keine Bindung des von Willebrand-Faktor-Fragments an die Q-Sepharose^®; hingegen wurden Verunreinigun gen wie z. B. negativ geladene DNA und bakterielles Endotoxin einschließlich Lipopolysaccharid gebunden.
Die Nettoladung an jeder monomeren Einheit von Polypeptid innerhalb der löslichen Aggregate beträgt unter diesen Bedingungen ca. (–2). Es wird angenommen, dass diese geringe Nettoladung in Verbindung mit der hohen Salzkonzentration der aufgebrachten Probe verhindert, dass Aggregat an die stationäre Phase bindet. Die Fraktion, die das ungebundene vWF-Fragment, primär als eine Population von löslichen Aggregaten, enthielt, wurde dann durch ein 0,2 Mikron-Filter gefiltert, wonach das Filtrat durch Zusatz eines Puffers mit 6 Mol Harnstoff, 0,01 Mol Natriumcitrat, pH 3,5 10-fach verdünnt wurde. Das daraus erhaltene Präparat wurde dann ungefähr eine Stunde lang bei 4°C gehalten. Während dieser Zeit setzte die Dissoziation der löslichen Aggregate ein, wodurch die Fragmentpopulation zu kleineren Aggregaten und zu monomeren und dimeren Molekülen verschoben wurde.
Der pH des Präparats wurde dann durch die Zugabe eines ausreichenden Volumens von ungepuffertem 1,0-molarem Natriumcitrat auf 4,8 eingestellt, wonach das Präparat über ein perlförmiges, aus 45–165 Mikron Partikeln gebildetes Agarose-Gel, das Carboxymethyl-Seitenketten enthält, welche zu einem Kationenaustausch in der Lage sind, geleitet wurde (CM-Sepharose^®, Pharmacia, Uppsala, Schweden), das in einem Puffer mit 6 Mol Harnstoff, 0,01 Mol Natriumcitrat, pH 4,8 voräquilibriert wurde, wobei der pH als ein Kompromiss zwischen der Notwendigkeit, die Harz-Carboxylgruppen in nicht protonierter Form zu halten und zu verhindern, dass sich die Fragmentpopulation zurück zu dem aggregierten Zustand verschiebt, indem man zu nahe an den isoelektrischen pH (ca. 5,5) des Fragments herankommt, gewählt wird. Andererseits wäre ein pH von 3,0 zu bevorzugen, um die Fragmentpopulation zu Dimeren und Monomeren hin zu bringen.
Wenn es auf diese Weise beladen wurde, erfolgte eine Bindung von ca. 80–100% des Produkt-vWF-Fragments an die CM-Sepharose^®. Die Säule wurde dann mit einem Puffer mit pH 4,8 gewaschen, der 6 Mol Harnstoff und 0,01 Mol Natriumcitritat enthielt, bis kein weiteres UV-absorbierendes Material (gemessen bei 280 nm) im Ablauf detektiert wurde. Der Elutionspuffer wurde dann gewechselt auf 6 Mol Harnstoff, 0,01 Mol Natriumcitrat, 0,15 Mol Natriumchlorid, pH 4,8. Eine geringe Menge von zusätzlichem UV-absorbierendem Material wurde detektiert, das von der Säule in dieser Lösung eluierte. Auf diese Weise wurden beträchtliche Mengen von restlichem bakteriellem Endotoxin entfernt. Die Elution wurde fortgesetzt, bis kein weiteres derartiges UV-absorbierendes Material detektiert wurde. Die an die CM-Sepharose gebundene Fraktion wurde dann mit einem Puffer mit 6 Mol Harnstoff, 0,01 Mol Natriumcitritat, pH 4,8 gewaschen, bis das in dem vorhergehenden Puffer vorhandene Natriumchlorid vollständig verdrängt war.
Die gereinigte, gebundene vWF-Fraktion wurde schließlich mit einem Puffer mit 6 Mol Harnstoff, 0,01 Mol Natriumcitritat, pH 3,0 gewaschen, was bewirkte, dass eine zusätzliche geringe Menge von UV-absorbierendem Material eluiert wurde. Das Waschen wurde fortgesetzt, bis dieses Material nicht mehr detektiert werden konnte. Obwohl der pH 3,0 deutlich unter dem pKa der unbesetzten Säulencarboxylgruppen liegt, bleiben die vorgeformten Komplexe zwischen positiv geladenem vWF-Fragment und negativ geladenem Harz bei diesem niedrigen pH für die angegebene Zeit im Wesentlichen intakt. Das Halten der vWF-Fragmente bei diesem pH fördert weiterhin die Monomerisierung der Fragmentpopulation, wobei Monomere und Dimere nun vorherrschen und lösliches Aggregat deutlich reduziert ist. Der prozentuelle Anteil an Monomer, Dimer und Aggregat kann gemäß der Assay-Prozedur von Beispiel 2 bestimmt werden.
Schließlich wurde das rekombinante vWF-Faktor-Fragment von der CM-Sepharose^®-Säule mit einem Puffer mit pH 3,0 mit 6 Mol Harnstoff und 0,02 Mol Zitronensäure eluiert. Der Elutionspeak wurde als ein Pool von UV-absorbierenden Fraktionen gesammelt und durch ein 0,2 Mikron-Filter gefiltert. Die eluierte Population der Fragmente stellt 50% dimeres und 50% monomeres Material dar, wobei praktisch kein lösliches Aggregat detektiert wird. Es wird festgestellt, dass die Citrationen bei pH 3,0 im Durchschnitt eine negative Nettoladung von –0,5 tragen und im Durchschnitt 2,5 protonierte Carboxylgruppen besitzen (der pKa₁ von Citrat beträgt 3,08). Es wird angenommen, dass die Citrationen das Aufbrechen der Fragment-Harz-Komplexe erleichtern, indem sie um positiv geladene Fragmente konkurrieren und schließlich die Rolle einer zusätzlichen „stationären" Phase einnehmen.
Das eluierte Produkt wurde durch Ultrafiltration auf ca. 10 mg/ml Protein aufkonzentriert. Das konzentrierte Produkt wurde ein weiteres Mal durch ein entsprechend dimensioniertes 0,2 Mikron-Wegwerffilter gefiltert, wonach das Material gegen 50 Volumenanteile „Formulierungspuffer" dialysiert wurde, der 1 mMol Lysin-Monohydrochlorid, 1,5 mMol Natriumchlorid, 1 mMol Zitronensäure, 5% (Gew./Vol.) Mannitol, mit pH 3,5 umfasst. Der Dialysepuffer wurde über eine Dauer von 2–3 Tagen 3 Mal gewechselt, wobei dann die Monomerisierung auch vollständig ist. Das erhaltene Produkt (das ca. 70% Monomer und 30% Dimer enthält, siehe Beispiel 2) wurde durch ein geeignet dimensioniertes 0,2 Mikron-Filter filtriert und bei 4°C aufbewahrt, bis es in die Vials gefüllt wurde.
Rest-DNA und -Endotoxin in der gereinigten vWF-Lösung wurden mit etwa 0,94 Eu/mg Protein bzw. etwa 0,15 pg/mg Protein bestimmt. Die DNA-Analyse wurde durch Hybridisierung gegen E. coli-DNA-Proben durchgeführt. Endotoxin wurde mit dem Limulus Amebocyte Lysate-Assay analysiert.
Die sterile Bulk-Lösung wurde in ein Typ-I-Flintglas-Vial (Wheaton Scientific, Millville, NJ) auf ca. die 4 ml-Marke eines 20 ml-Vials gefüllt, wonach silikonisierte graue Butylkautschuk-Gefriertrocknungsstopfen (West Co.) an den gefüllten Vials angebracht wurden. Die Vials wurden dann in einen Vakuumgefriertrockner (Null Corporation, Hatboro, PA) plaziert und bei –42°C tiefgefroren, wonach sie 12 Stunden lang einem Vakuum von 60 Mikron ausgesetzt wurden. Nach 12 Stunden wurde die Temperatur der Probe schrittweise auf ca. 30°C erhöht (über 24 Stunden). Diese/s Temperatur und Vakuum wurden für weitere 16 Stunden aufrechterhalten. Der Atmosphärendruck in der Kammer wurde unter Verwenden von sterilem, trockenem Stickstoff wiederhergestellt, wonach die Vials verschlossen wurden. Die Vials wurden bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt, wobei sie dann unter Verwenden eines Volumens von 4 ml pyrogenfreiem Wasser rekonstituiert werden können.
Referenz 2 – Nachweis, dass Präparate von nicht aggregiertem alkyliertem vWF-Fragment ein Gleichgewicht zwischen Dimer und Monomer widerspiegeln
Proben von nicht aggregiertem, alkyliertem vWF-Fragment, die verschiedene Gesamtfragmentkonzentrationen enthalten, wurden gemäß der Prozedur von Beispiel 1 hergestellt und in einen Standardformulierungspuffer (1 mMol Lysinmonohydrochlorid, 1,5 mMol Natriumchlorid, 1 mMol Zitronensäure, 5% Mannitol (Gew./Vol.) bei pH 3,5) eingebracht und dann bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Proben wurden dann auf eine Säule, die ein vernetztes Dextran-Gel enthält (Sephadex^® G-100, Pharmacia, Uppsala, Schweden), zur Chromatografie auf der Basis des Molekulargewicht-(Größen)-Ausschlusses aufgebracht, sodass der prozentuelle Anteil von Monomer und von Dimer, die zusammen das nicht aggregierte Produkt umfassen, bestimmt werden könnte.
Im Allgemeinen können jegliche Mengen von löslichem Aggregat in Fragmentproben durch Detektion im Leervolumen einer G-100-Säule bestimmt werden. In Bezug auf die Mengen von kleinen Aggregaten (d. h. Trimere, Tetramere) kann eine G-50-Säule verwendet werden.
Proben von zwei ml (1–11 mg/ml) wurden auf die 1,5 × 88 cm G-100-Säule bei 4°C aufgebracht. Eluentenfraktionen von drei ml wurden gesammelt und bei 280 nm auf die Proteinkonzentration untersucht. Die Mitte des Peaks des monomeren Fragments lag ca. bei der Fraktion 24 und des Dimers bei der Fraktion 31.
1 zeigt eine grafische Darstellung von % Monomer, das in den Proben nach Inkubation über Nacht in Formulierungspuffer detektiert wurde als eine Funktion der Gesamt-mg/ml Fragment in den Proben. Durch Extrapolieren des in 1 dargestellten linearen Bereiches ergibt die Lagerung von vWF-Fragment bei einer Konzentration von ca. 20 mg/ml ein Produkt, das hauptsächlich ein Dimer ist. Ein therapeutisches Produkt, das hauptsächlich monomer ist, kann aus Proben mit einer Fragment-Aufbewahrungskonzentration von 2 mg/ml erzeugt werden. Eine Verschiebung des Monomer/Dimer-Gleichgewichts wird somit erzeugt, indem die Konzentration an nicht aggregiertem, alkyliertem Fragment in Aufbewahrungslösungen, die zur Verabreichung an Patienten geeignet sind, verringert wird. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, unabhängig davon, ob die getesteten Lösungen mit einem entsprechenden Volumen von pyrogenfreiem Wasser nach vorheriger Aufbewahrung in gefriergetrockneter Form rekonstituiert wurden oder nicht.
Da ein monomeres Fragment, auf Gewichtsbasis, eine größere Fähigkeit besitzt, eine Thrombozyten-Aggregation zu verhindern, als ein dimeres Fragment, kann der therapeutische Nutzen von vWF-Fragment, das zur Injektion in Formulierungspuffer herge stellt wird, durch Aufbewahren bei oder Rekonstitution zu einer verdünnten Konzentration an Fragment, wie 2 mg/ml, erhöht werden. Es wird angemerkt, dass die Formulierung des Fragments in den bevorzugten Aufbewahrungslösungen der Erfindung ein Produkt bereitstellt, in dem der prozentuelle Anteil von Monomer und von Dimer in dem Produkt durch Gefriertrocknung und Rehydratisierung im Wesentlichen unbeeinflusst ist.
Referenz 3 – Effekt der Aggregation auf die biologische Aktivität des alkylierten vWF-Fragments
Botrocetin, ein aus dem Gift der Bothrops jararaca (Jararace-Lanzenotter) extrahiertes Protein, ermöglicht die in-vitro-Bindung von multimerem von Willebrand-Faktor an Thrombozyten (Read, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514–4518 (1978). Die Bindungsstelle für Botrocetin in der reifen vWF-Untereinheit wurde in deren Region lokalisiert, die die Aminosäuresequenzpositionen 445–733 und somit die GPIb-bindende Domäne enthält. Andrews, R. K. et al., Biochemistry, 28, 8317–8326 (1989). Es wird angenommen, dass die Bindung von Botrocetin an vWF in dem vWF-Molekül eine Konformationsänderung induziert, die andernfalls in vivo durch ein Signal in Verbindung mit einer Beschädigung des Gefäßsystems induziert werden würde. Demgemäß wurde der Effekt der Aggregation des alkylierten Fragments auf seine Fähigkeit die Agglutinationen von Thrombozyten zu verhindern, die durch multimeren vWF vermittelt wird, in einem durch Botrocetin ausgelösten Assay getestet.
Nicht aggregiertes, alkyliertes vWF-Fragment stellt die kombinierte Konzentration des Monomers und Dimers dar. Der tatsächliche prozentuelle Dimer-Anteil wurde nicht berechnet. Die Bezugnahme auf 1 verdeutlicht, dass Proben von nicht aggregiertem, alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment, die gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 gereinigt wurden, wenn sie in Formulierungspuffer bei zwischen 2 und 8 mg/ml aufbewahrt wer den, ca. 70% an Monomer und 30% an dimerem, alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment enthalten. Das dimere Fragment ist auf Gewichtsbasis etwa halb so wirksam beim Verhindern der Thrombozyten-Agglutination wie das Monomer, obwohl das Dimer unter den in den Assays dieses Beispiels verwendeten Bedingungen ebenso vollständig löslich ist wie das Monomer.
Die Verhinderung der Agglutination durch alkyliertes Fragment wurde daher als eine Funktion der Monomer- und Dimer-Konzentration (aus Präparaten, die kein aggregiertes Material enthielten) gemessen und wurde mit dem durch aggregierte Präparate bereitgestellten Ansprechen verglichen. Das Agglutinationsprotokoll wurde von den Verfahren Brinkhous, K. M. und Read, M. S., Blood, 55(3), 517–520 (1980) und Fugimura, et al., J. Biol. Chem., 261, 381–385 (1986) angepasst.
In diesem Assay wurden festgelegte Mengen von Botrocetin und multimerem vWF verwendet, um eine festgelegte Menge von Thrombozyten zu agglutinieren (aggregieren), um dadurch einen Referenzwert von 100% Aggregation zu definieren. Festgelegte Mengen von alkyliertem vWF-Fragment wurden verwendet, um Reaktionsgemische zu erzeugen, die auch Multiuntereinheit-vWF, Botrocetin und Thrombozyten umfassen, sodass die IC₅₀ (Konzentration an vWF-Fragment, die wirksam ist, um 50% einer Botrocetin-induzierten Thrombozyten-Agglutination zu verhindern) bestimmt werden konnte.
Die Thrombozyten für den Assay wurden unter Verwenden eines Gelfiltrationsverfahrens gemäß dem Verfahren von Marguerie, et al., J. Biol. Chem., 254, 5357–5363 (1979) hergestellt und dann unter Befolgung einer modifizierten Form des Verfahrens von Allain, et al., J. Lab. Clin. Med., 85, 318–328 (1975) fixiert, wobei die Modifikationen umfassen: (1) Aufbringen von 0,5% Paraformaldehyd als Fixiermittel; (2) wonach die Fixierung nach 30 Minuten bei Raumtemperatur erfolgt war. Zusätz lich wurden die Thrombozyten behandelt, um die Glykoprotein-IIb/IIIa-Rezeptorstellen durch Behandeln (während 30 Minuten bei 37°C) einer Suspension der Thrombozyten mit 5 mMol EDTA bei pH 8,5, um eine Dissoziation der intakten IIb/IIIa-Rezeptor-Komplexe zu bewirken, unwirksam zu machen. Die Verhinderung der Thrombozyten-Agglutination(-Aggretation) wurde in silikonisierten Glasküvetten überwacht, die unter konstantem Rühren (1000 U/min) bei 37°C in einem Platelet Aggregation Profiler, Model PAP-4 (BioData Co., Hatboro, PA) gehalten wurden, der gemäß den Anleitungen des Herstellers betrieben wurde.
Die Assays wurden wie folgt durchgeführt. Die Assay-Komponenten wurden auf Eis gehalten, bevor sie bei 37°C in den Assay-Inkubationen verwendet wurden. Um den Assay zu beginnen, wurden 0,4 ml von fixierten menschlichen Thrombozyten (2 × 10⁸ ml) in die Küvette gefüllt und bei 37°C 4 Minuten lang inkubiert. Eine kleine μl-Menge von in Formulierungspuffer (der auch 0,1% Humanserumalbumin enthielt) oder einem äquivalenten Volumen von Formulierungspuffer-HSA (zur Kontrolle) gelöstem vWF-Fragment wurde dann für eine Inkubation bei 37°C für eine Minute in die Küvette gefüllt. In Bezug auf die in 2 dargestellten Agglutinationsprofile wurde eine 30 μl Formulierungspuffer-HSA-Probe als eine Kontrolle verwendet und 30 μl-Mengen von Serienverdünnungen von gereinigtem, alkyliertem Fragment (was 17,0, 8,5 und 4,3 μg/ml Assay-Endkonzentrationen an Fragment ergab) wurden verwendet. Multimerer nativer vWF, der gemäß dem Verfahren von Newman et al., Br. J. Hematol., 21, 1–20 (1971) hergestellt wurde, wurde dann in jede Küvette zugesetzt und bei 37°C eine Minute lang inkubiert. Ein entsprechendes Aliquot von vWF wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um eine vWF-Endkonzentration von 6,3 μg/ml bereitzustellen. Schließlich wurden 12,5 μl einer entsprechend konzentrierten Botrocetin-Lösung (gereinigt gemäß dem Verfahren von Read et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514–4518 (1978)) zugesetzt, um eine Endkonzentration an Botrocetin von 8,2 μg/ml in dem Reaktionsgemisch bereitzustellen, das dann zum Schluss eine Minute lang bei 37°C inkubiert wurde. Die Agglutinationsreaktion wurde dann über eine Dauer von zwei Minuten überwacht. Wie in 2 verdeutlicht, ist das gereinigte und nicht aggregierte, alkylierte vWF-Fragment (das eine Population von ca. 70% Monomer/30% Dimer darstellt) dosisabhängig als ein Inhibitor einer Thrombozyten-Aggregation wirksam.
3 zeigt einen ähnlichen Versuch, in dem das nicht aggregierte Fragment (das ca. 70% Monomer/30% Dimer umfasst) mit dem aggregierten Fragmentmaterial für die Wirksamkeit der Agglutinationsverhinderung verglichen wurde. Die Assays wurden wie obenstehend durchgeführt, wobei 30 μl-Mengen von vWF-Fragment mit einer Konzentration, die 7,3 μg/ml als die Endkonzentration an potentiell agglutinationsverhinderndem Material bereitstellt, verwendet wurden. Das nicht aggregierte Material war im Wesentlichen wirksam, um eine Thrombozyten-Agglutination zu verhindern, während dies bei dem aus aggregiertem vWF gewonnenen Material nicht der Fall war. Die Bezugnahme auf 3 zeigt, dass unter den Assay-Bedingungen dieses Beispiels 50% Verhinderung der Agglutination bei einer Fragmentkonzentration (IC₅₀) von ca. 7,3 μg/ml von nicht aggregiertem Material (entsprechend 0,22 μMol davon) erhalten wird, während die aggregierte Form unter diesen Bedingungen nicht mehr als 5% Verhinderungswirkung zeigt.
Referenz 4 – Effekt des kombinierten α-Helix- und β-Blatt-Gehalts auf die Solubilität von nicht aggregiertem, alkyliertem vWF-Fragment
4 zeigt einen Vergleich des Zirkulardichroismusprofils von alkyliertem vWF-Fragment (bei pH 3,5 vs. 4,5) in einer Lösung, die Standardformulierungspuffer ohne Mannitol umfasst. Spektren wurden für identisch konzentrierte Proben bei 25°C in einem Spektrometer Modell 500A von Jasco, Inc. (Easton, MD) durch Herunterscannen von ca. 350 nm hergestellt.
Das Spektrum des alkylierten Fragments konnte in einem 1 mMol Phosphatpuffer, pH 7,5, auf Grund des Ausfallens des Fragments nicht bestimmt werden. Die jeweiligen Beiträge der Komponente α-Helix, β-Faltblatt und Random Coil-Regionen zu der Gesamtdrehung nahe bei 222 nm wurden nicht bestimmt; es ist jedoch offensichtlich, dass das alkylierte Fragment bei pH 3,5 eine geordnetere Struktur besitzt als bei 4,5.
Beispiel 5 – Herstellung von alkyliertem von Willebrand-Faktor-Fragment in nicht aggregierter Form mithilfe der Affinitätschromatografie
Dieses Verfahren verwendet die Heparin-Affinitätschromatografie, um die vWF-Fragmente zu reinigen und sie von verunreinigenden/r Proteinen und DNA zu isolieren. Das Verfahren ist gestaltet, um: (1) lösliche Aggregate (typischerweise 200 kDa oder mehr), die aus einem Einschlusskörper-Pellet aus vWF-Fragment aufgelöst wurden, in Lösung zu bringen, wie untenstehend beschrieben; (2) Verunreinigungen zu entfernen, die in therapeutischen Formulierungen inakzeptabel sind (wie z. B. bakterielle DNA und Endotoxine); (3) eine „Monomerisierung" des Fragments in einer Reihe von Schritten einzuleiten, die zu immer kleineren Aggregaten führen; und (4) das resultierende nicht aggregierte Material in einem Formulierungspuffer bereitzustellen, der das Fragment gegenüber einer Reaggregation stabilisiert.
Das Einschlusskörper-Pelletmaterial wurde aus einer entsprechenden Kultur von E. coli BL21 (DE3) pLysS, wie folgt, erhalten. Die Zellen wurden aus 50 Liter belüfteter Kultur geerntet und unter Verwenden von Hohlfaser-Mikrofiltermembran-Patronen aufkonzentriert. Zwei Amicon H5MPO1-43 Filterpatronen wurden in einem Rezirkulationsmodus verwendet. Die Zellen wurden auf den Amicon-Filtern auf ein Volumen von 2 bis 4 Liter aufkonzentriert, wonach die Zellen durch Diafiltration in der Amicon-Filtrierapparatur mit 5 Volumenteilen, ca. 10 bis 20 Liter, Tris-gepufferter Salzlösung (0,025 Mol Tris, 3,03 g/l H₂O, 0,2 Mol NaCl, 11,7 g/l H₂O, End-pH 7,5 ± 0,2, 25°C; hierin nachfolgend als A-1 bezeichnet) gewaschen wurden.
Die Zellen wurden aus Filtration in 4 Liter Tris-gepufferter Salzlösung (A-1) gewonnen. Bei der Vorbereitung zum Aufschließen der Zellen wurde Natrium-Deoxycholat der Zellsuspension zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,5 g/l zu erreichen. Die Zellen wurden mechanisch aufgeschlossen, indem sie unmittelbar nach dem Sammeln durch einen Microfluidizer^® (Microfluidics Corp., M-110Y Microfluidizer^®) geleitet wurden. Nachdem die Zellen ein Mal durch den Microfluidizer^® gelaufen waren, wurde ein zweites Detergens (Tween 80) der Suspension lysierter Zellen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,025% zu erreichen, wobei 25 ml von 2,5% Tween 80 (Vol./Vol.), in 1 Liter TBS gelöst, verwendet wurden. Dies geschah indem der Puffer A-1 erwärmt und das Tween 80 tropfenweise der Lösung zugesetzt und gemischt wurde, bis die Lösung sichtbar homogen war. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und dann der Suspension aufgeschlossener Zellen zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,025% (Vol./Vol.) zu erreichen; (hierin nachfolgend A-2). Wenn das Tween oder ein ähnliches Detergens in dem ersten Durchlauf vorhanden ist, kann der Microfluidizer^® verstopft werden und dies wird es erfordern, den Strömungsweg zu reinigen, bevor die Zellen aufgeschlossen werden können.
Nachdem die Zellen aufgeschlossen waren, wurde die Suspension zentrifugiert (10 000 × g; 35 min, 4°C), um die Einschlusskörper abzutrennen, die ein Primärprodukt aus den löslichen Zelltrümmern sind. Falls erforderlich können die Einschlusskörper vor dem nächsten Schritt im Reinigungsverfahren über Nacht bei –20°C aufbewahrt werden.
Die Einschlusskörper wurden in 35 ml Tris-Puffer A-3 pro Gramm Einschlusskörper-Nassgewicht, bestimmt durch die Gewichtsdifferenz des Zentrifugenröhrchens (A-3 – 0,05 Mol Tris, 6,06 g/l H₂O, 1,21 mMol Natrium-Deoxycholat, 0,5 g/l H₂O, 2 mMol Dithiothreitol (DTT), 0,31 g/l H₂O, 2 mMol EDTA, 0,74 g/l H₂O, 5% (Vol./Vol.) Glycerin, 50 ml/l H₂O, 0,025% (Vol./Vol.) Tween 80, 10 ml 2,5% Tween 80 (A-2)/l H₂O, End-pH 9,0 ± 0,2, 25°C), resuspendiert. Die Einschlusskörper-Pellets wurden routinemäßig in einem Puffer unter Verwenden eines Polytron-Homogenisators (Brinkmann) resuspendiert. Die resuspendierten Einschlusskörper wurden durch den Microfluidizer^® geleitet, um ein sorgfältiges Mischen mit dem Puffer sicherzustellen. Nach dem Durchgang durch den Microfluidizer^® wurden die Einschlusskörper durch Zentrifugation gesammelt. Die Waschprozedur wurde insgesamt drei Mal mit Tris-Puffer A-3 durchgeführt. Am Ende des dritten Waschens werden die pelletierten Einschlusskörper in Tris-Puffer A-4 resuspendiert, der die Detergentien Deoxycholat oder Tween nicht enthält (A-4 – 0,05 Mol Tris, 6,06 g/l H₂O, 2 mMol Dithiothreitol (DTT), 0,31 g/l H₂O, 2 mMol EDTA, 0,74 g/l H₂O, 5% (Vol./Vol.) Glycerin, 50 ml/l H₂O, End-pH 9,0 ± 0,2, 25°C). Das vierte und letzte Waschen wurde mit Tris-Puffer A-4 durchgeführt. Das Rohprodukt wurde nach der Zentrifugation gesammelt, zum Trocknen entwässert und kann bei –70°C aufbewahrt werden.
Jedes Gramm Einschlusskörper-Pellet wurde in einem Volumen von 7,5 ml Puffer gelöst, der 6 Mol Harnstoff, 0,05 Mol Tris·HCl und 1 Mol Natriumchlorid, pH 8,8, umfasst. Das erhaltene „solubilisierte" vWF-Material stellt eine heterogene Population von löslichen Aggregaten mit einem typischen Molekulargewicht von ca. 200 kDa oder mehr dar.
Das Gemisch wurde unter eine Stickstoffatmosphäre gebracht und Dithiothreitol (DTT) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,01 Mol unter sanftem Rühren zugesetzt, um die Disulfid-Brücken des Fragments zu reduzieren. Das Rühren des Gemisches wurde im Dunkeln 1 Stunde lang bei 37°C fortgesetzt. Jodacetimid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Mol zugesetzt. Die Inkubation im Dunkeln wurde eine Stunde lang bei 37°C fortgesetzt. Dann wurde weiteres DDT zugesetzt, um die Endkonzentration an DDT auf 0,03 Mol anzuheben. Die alkyliertes vWF-Fragment enthaltende Lösung wurde dann durch einen 0,2 Mikron-Filter geleitet und in einen kalten Raum überführt, der bei 4°C ± 2°C gehalten wurde. Anschließende Reinigungsverfahren wurden in einem kalten Raum bei 4°C unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt, die bei dieser Temperatur voräquilibriert wurden.
Das alkylierte Material wurde 5-fach mit einer Lösung umfassend 6 Mol Harnstoff, 10 mMol Natriumcitrat, pH 5,5 auf eine Leitfähigkeit verdünnt, die der von 150 mMol NaCl entspricht. Falls erforderlich, wurde dann der pH mit Natriumcitrat auf 5,5 eingestellt. Das Material wurde dann auf eine Heparin-Sepharose-Säule (Heparin Sepharose CL-6B, vertrieben von Pharmacia, Produktnummer 17-0467-01) aufgebracht, welche in 6 Mol Harnstoff, 10 mMol Natriumcitrat, 100 mMol Natriumchlorid mit einem pH von 5,5 äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit einer Lösung umfassend 6 Mol Harnstoff, 10 mMol Natriumcitrat, 250 mMol Natriumchlorid mit einem pH von 5,5 gewaschen. Das Produkt wurde mit einer Lösung umfassend 6 Mol Harnstoff, 10 mMol Natriumcitrat, 700 mMol Natriumchlorid mit einem pH von 5,5 eluiert.
Das Eluat wurde dann ca. 7-mal mit einer Lösung umfassend 6 Mol Harnstoff, 10 mMol Zitronensäure, pH 3,5, verdünnt. Nach dem Einstellen des pH auf 3,5 wurde diese Lösung 1 Stunde lang bei 4°C gehalten. Dann wurde der pH mit 1 Mol Zitronensäure auf 4,8 eingestellt und das Produkt wurde auf eine CM-Spherodex-Säule (CM Spherodex M, vertrieben von IBF, Katalog Nr. 262010) aufgebracht, die in 6 Mol Harnstoff, 10 mMol Natriumcitrat, 150 mMol Natriumchlorid, pH 4,8, äquilibriert wurde. Die Säule wurde mit 6 Mol Harnstoff, 500 mMol Zitronensäure, pH 3,0, gewaschen. Das Produkt wurde dann mit 6 Mol Harnstoff, 700 mMol Zitronensäure, pH 3,0, eluiert.
Das eluierte Produkt wurde durch Ultrafiltration auf ca. 10 mg/ml Protein aufkonzentriert. Das konzentrierte Produkt wurde ein weiteres Mal durch ein entsprechend dimensioniertes 0,2 Mikron-Wegwerffilter gefiltert, wonach das Material gegen 50 Volumenanteile „Formulierungspuffer" dialysiert wurde, der 1 mMol Lysin-Monohydrochlorid, 1,5 mMol Natriumchlorid, 1 mMol Zitronensäure, 5% (Gew./Vol.) Mannitol, mit pH 3,5 umfasst. Der Dialysepuffer wurde über eine Dauer von 2–3 Tagen 3 Mal gewechselt, wobei dann die Monomerisierung auch vollständig ist. Das erhaltene Produkt (das ca. 70% Monomer und 30% Dimer enthält, siehe Beispiel 2) wurde durch einen geeignet dimensionierten 0,2-Mikron-Filter gefiltert und bei 4°C aufbewahrt, bis es in die Vials gefüllt wurde.
Rest-DNA und -Endotoxin in der gereinigten vWF-Lösung wurden mit etwa 0,94 Eu/mg Protein bzw. 0,15 pg/mg Protein bestimmt. Die DNA-Analyse wurde durch Hybridisierung gegen E. coli-DNA-Proben durchgeführt. Endotoxin wurde mit dem Limulus Amebocyte Lysate-Assay analysiert.
Die sterile Bulk-Lösung wurde in ein Typ-I-Flintglas-Vial (Wheaton Scientific, Millville, NJ) auf ca. die 4 ml-Marke eines 20 ml-Vials gefüllt, wonach silikonisierte graue Butylkautschuk-Gefriertrocknungsstopfen (West Co.) an den gefüllten Vials angebracht wurden. Die Vials wurden dann in einen Vakuumgefriertrockner (Null Corporation, Hatboro, PA) platziert und bei –42°C tiefgefroren, wonach sie 12 Stunden lang einem Vakuum von 60 Mikron ausgesetzt wurden. Nach 12 Stunden wurde die Temperatur der Probe schrittweise auf ca. 30°C erhöht (über 24 Stunden). Diese/s Temperatur und Vakuum wurden für weitere 16 Stunden aufrechterhalten. Der Atmosphärendruck in der Kammer wurde unter Verwenden von sterilem, trockenem Stickstoff wiederhergestellt, wonach die Vials verschlossen wurden. Die Vials wurden bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt, wobei sie dann unter Verwenden eines Volumens von 4 ml pyrogenfreiem Wasser rekonstituiert werden können.
Hinterlegung von Stämmen, die für die praktische Umsetzung der Erfindung nützlich sind
Hinterlegungen von biologisch reinen Kulturen der nachfolgenden Stämme erfolgten in Übereinstimmung mit dem Vertrag von Budapest bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland. Die angegebenen Hinterlegungsnummern wurden nach erfolgreichem Lebensfähigkeitstest zugeteilt und die zu entrichtenden Gebühren wurden bezahlt.
Zugang zu den Kulturen ist während der Anhängigkeit der Patentanmeldung einem durch den Bevollmächtigten des United States Patent and Trademark Office möglich, der hierzu unter 37 C.F.R §1.14 und 35 U.S.C. §122 ermächtigt ist, oder, falls und wenn solch ein Zugang entsprechend dem Vertrag von Budapest erforderlich ist. Sämtliche Einschränkungen in Bezug auf die Verfügbarkeit dieser Kulturen für die Öffentlichkeit werden unwiderruflich durch die Erteilung eines Patents auf der Basis der Anmeldung aufgehoben und die Kulturen werden für eine Dauer von wenigstens fünf Jahren nach der letzten Anfrage für die Bereitstellung von Proben und in jedem Fall für eine Dauer von wenigstens 30 Jahren nach dem Datum der Hinterlegungen dauerhaft verfügbar bleiben. Sollten die Kulturen nicht lebensfähig oder versehentlich aufgeschlossen werden, werden sie durch (eine) lebensfähige Kultur/en derselben taxonomischen Beschreibung ersetzt.

Stamm/Plasmid ATCC Nr. Hinterlegungsdatum

BL21(DE3)

pLysS/pET-8c52(Km^R) 68306 17. April 1990

Claims

Verfahren zur Herstellung einer wässrigen Lösung eines Cystein-veränderten von Willebrand-Faktor-(vWF)-Fragments mit einem endständigen Aminorest am Aminosäurerest 445 und einem endständigen Carboxyrest an der Aminosäure 733, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist, umfassend: (A) Bereitstellen einer sauren wässrigen Lösung, welche ein Cystein-verändertes vWF-Fragment, Denaturierungsmittel und unerwünschte Verunreinigungen enthält; (B) Abtrennen der Verunreinigungen aus der Lösung durch Inkontaktbringen dieser Lösung mit einem Affinitätschromatografiemedium, enthaltend Heparin, an welche sich die vWF-Fragmente binden; (C) Eluieren des vWF-Fragments aus dem Affinitätschromatografiemedium in Gegenwart des Denaturierungsmittels; und (D) Abtrennen des eluierten Fragments aus dem Denaturierungsmittel, während die wässrige Lösung des Fragments bei einem pH von 2,5 bis weniger als 5,5 gehalten wird, um die Monomerisierung des Fragments zu erhöhen und die Aggregation des Fragments zu verringern, wobei eine wässrige Lösung von vWF-Fragment ausgebildet wird, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Affinitätschromatografie (B) bei einem pH unter 6 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Quelle des vWF-Fragments ein rekombinantes DNA-Molekül ist, welches in einer Wirtsbakterienzelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cystein-veränderte vWF-Fragment durch Unterwerfen einer wässrigen Lösung eines rekombinanten vWF-Fragments und eines Denaturierungsmittels unter Alkylierungsbedingungen, wodurch ein alkyliertes vWF-Fragment ausgebildet wird, hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Denaturierungsmittel Harnstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung des Fragments mit einem pH von 2,5 und weniger als 5,5 eine Gesamtionenkonzentration von weniger als 75 mMol aufweist.
Verfahren zur Limitierung der Dimerisierung von monomerem Cystein-verändertem von Willebrand-Faktor-(vWF)-Fragment, isoliert durch Heparin-Affinitätschromatografie, wobei das Fragment einen endständigen Aminorest am Aminosäurerest 445 und einen endständigen Carboxyrest an der Aminosäure 733 aufweist, welche Dimerisierung eine oder mehrere ionische, hydrophobe oder Wasserstoffbindungen umfasst, welche die Assoziierung von zwei oder mehreren reifen vWF-Untereinheiten erleichtern, welches Verfahren das Ausbilden einer wässrigen Lösung von monomerem Cysteinverändertem vWF-Fragment umfasst, welches einen pH von 2,5 bis weniger als 5,5 aufweist und welches darin bis zu etwa 10 mg/ml des Fragments enthält, und wobei die Gesamtkonzentration in der Lösung an zusätzlichen Ionenspezies, sofern vorhanden, weniger als 75 mMol beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend (A) Bereitstellen einer wässrigen Lösung von Harnstoff und vWF-Fragment, welches durch rekombinante Mittel hergestellt wird und unerwünschte bakterielle Verun reinigungen enthält, welche Lösung eine pH von weniger als 6,5 besitzt; (B) Abtrennen der Verunreinigungen aus der Lösung durch Inkontaktbringen der Lösung mit einem Affinitätschromatografiemedium, welches Heparin enthält, an welches sich das vWF-Fragment bindet; (C) Eluieren des vWF-Fragments aus dem Affinitätschromatografiemedium in Gegenwart des Denaturierungsmittels durch Inkontaktbringen des vWF-Fragments mit einer wässrigen Salzlösung mit einer ausreichenden Konzentration, um eine Disoziierung des vWF-Fragments vom Heparin des Affinitätschromatografiemediums hervorzurufen; und (D) Abtrennen des eluierten Fragments aus dem Denaturierungsmittel während die wässrige Lösung des Fragments bei einem pH von 2,5 bis weniger als 5,5 gehalten wird, um die Monomerisierung des Fragments zu erhöhen und die Aggregation des Fragments zu verringern, wobei eine wässrige Lösung von vWF-Fragment erhalten wird, welche von Aggregat im Wesentlichen frei ist.