KR100486472B1

KR100486472B1 - 폰빌레브란트인자의치료성단편

Info

Publication number: KR100486472B1
Application number: KR1019970709209A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 엘 파브; 마이클 이 린다; 테드 씨 케이 리; 크리스토퍼 피 프라이어; 데이비드 웨버
Original assignee: 아벤티스 베어링 엘.엘.씨.
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2005-09-02
Also published as: AU6047196A; JP4233114B2; US5847086A; CA2223702C; ES2302336T3; MX9709893A; EP0833659A4; JP2001517197A; ATE388722T1; EP0833659B1; KR19990022634A; DE69637464D1; CA2223702A1; EP0833659A1; DE69637464T2; AU716449B2; WO1997018834A1

Abstract

응집물이 거의 존재하지 않고 혈전증 치료 용도로 사용될 수 있는 시스테인 변형된 폰 빌레브란트 인자 단편의 수용액의 제조방법이 제공된다. 이 방법은 vWF 단편, 변성제 및 소망하지 않는 불순물을 함유하는 산성 pH의 수용액을 제공하고; 상기 용액을 상기 vWF 단편이 접착되는 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시킴으로써 상기 불순물을 상기 용액으로 부터 분리하며; 변성제 존재하에서 상기 친화성 크로마토그래피 매질로 부터 상기 vWF 단편을 용출시키며; 또 단편의 수용액을 pH 약 2.5 내지 약 5.5로 유지시키면서 상기 변성제로 부터 용출된 단편을 분리하여 단량체화를 증가시키고 또 응집을 감소시킴으로써 응집물이 거의 존재하지 않는 vWF 단편의 수용액을 형성하는 것을 포함한다.

Description

폰 빌레브란트 인자의 치료성 단편

본 발명은 치료성 폴리펩티드에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 예컨대 혈전증과 같은 혈관 장애 치료에 사용될 수 있는 폰 빌레브란트(von Willebrand) 인자의 정제 단편에 관한 것이다.

"지혈"이라는 용어는 혈관 손상으로 유발된 순환 혈액의 손실로 부터 신체의 방어 메카니즘을 포함하는 과정들을 지칭한다. 본 발명은 지혈 메카니즘 단백질의 하나인 폰 빌레브란트 인자 ("vWF")를 기본으로 하는 치료적으로 유용한 형태의 폴리펩티드를 제공하는 것에 관한 것이다.

혈관 손상에 대한 정상적인 생리 반응 과정들은 아테롬성 동맥경화성 혈관질병 또는 만성 울혈성 심장마비를 앓는 환자에서 혈관 폐색과 함께 원하지 않는 혈병의 형성과 같은 병적인 상황을 초래한다. 이러한 상황하에서 기관으로의 혈액 순환이 손상되면 심근 경색을 비릇한 심각한 병리 상태를 초래하며 선진국에서는 제 1의 치사 원인이 되고 있다.

상처나 혈관 질병 상태의 결과로서 순환계내의 혈액 순환이 제한되거나 종료되는 것은 2개 과정, 즉 일차 및 이차 지혈작용으로 분류될 수 있는 복잡한 일련의 반응을 포함한다. 일차 지혈작용은 혈소판 플러그 또는 연질 혈병 형성 과정으로 지칭된다. 혈소판은 거핵구 세포로 부터 유도된 직경 약 2 내지 5 미크론의 무핵성원판 구조이다. 효과적인 일차 지혈작용은 혈소판과 노출된 하부 콜라겐 섬유 및/또는 혈소판이 결합된 프로테오글리칸 및 글리코사미노글리칸과 같은 기타 접착성 거대분자상의 손상된 혈관 내피의 표면과의 상호작용인 혈소판 응집에 의해 발휘된다.

이차 지혈작용은 연질 혈소판 혈병의 강화 또는 가교반응을 포함한다. 이 이차 과정은 상처나 혈관 질병 상태에 감응하여 일차 지혈작용중에 활성화되는 혈장중에서 순환하는 단백질에 의해 개시된다. 이들 인자의 활성화는 궁극적으로는 연질 혈병을 강화시키는 단백질 피브리노겐 (소위 "피브린"으로 칭함)의 중합성 매트릭스의 생산을 초래한다.

그러나 혈전증 또는 중풍의 예방과 치료에서 혈관내에서 혈소판의 침착을 방지하고 및 동맥 이식의 폐색을 방지하는 것이 필요한 경우가 있다. 외과 수술중에 혈소판 혈전의 형성은 기존의 혈관 장애를 완화하려는 시도를 방해할 수 있다.

항혈소판 약은 혈소판 또는 기타 순환계 성분과의 상호작용을 변형시킴으로써 일차 지혈작용을 억제하는 화합물을 포함한다. 항혈소판 약으로 사용되는 것으로 기재된 화합물은 vWF의 트립신 분해로 부터 유도되며 약 449 내지 728 잔기를 포함하는 분자량 약 52,000의 vWF의 알킬화 단편이다. 이 치료성 단편은 1987년 5월 22일 출원되어 1988년 2월 3일 제 25 5206호로 공개된 유럽 특허출원 번호 87304615호의 목적이다. 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.

배경기술로서, 상술한 단편을 기본으로 하는 vWF는 혈액내에서 순환하고 혈액의 응고에 관여하는 고분자량의 다량체 단백질로 알려져 있다. vWF는 혈소판과 혈관 사이의 가교를 형성함으로써 손상된 혈관에 혈소판이 결합되도록 하는 것으로 인식되고 있다. 또한 vWF의 혈소판 결합 부위는 상술한 잔기 449-728내에 함유되어 있다고 알려져 있다.

상술한 vWF 단편의 항혈소판 약으로서의 작용에 대해서는 이 단편이 혈소판의 당단백질 Ibα 리셉터에 결합함으로써 혈액내의 vWF의 혈소판에 대한 결합을 억제하는 것으로 보고 있다. 실제로, vWF 단편은 혈액의 vWF에 의해 보통 점유되었던 GPIb의 표면 리셉터를 점유하지만, 이들이 유도되는 대형 vWF 분자의 가교 활성이 결여되어 있기 때문에 혈소판 접착 또는 그로 인한 혈병 형성을 개시하지 않는다.

실제로, 혈액의 혈장으로 부터 치료 유효량의 vWF의 상술한 단편 또는 기타 단편을 유도하기가 곤란하다. 다른 곤란한 점은 기타 성분, 예컨대 트립신 분해물로 부터 잔기 449-728 단편의 효과적인 분리 및 간염 및 HIV와 같은 사람의 바이러스로 잠재적으로 감염된 혈액 유도 성분의 효과적인 멸균을 필요로 하는 점이다. 따라서, 예컨대 세균 숙주 세포를 비롯한 숙주 세포에서 재조합 DNA를 사용하여 vWF의 상기 단편을 생산하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다.

세균 발현계에 의해 생산된 vWF 단편은 숙주 세포내에 불용성 응집물 (봉입체)로서 다량 축적되는 것으로 밝혀졌다. 치료적으로 유용한 단편 (잔기 449-728)의 배합물을 유도하기 위해서는 숙주 세포내에 함유된 봉입체로 부터 가용 형태의 단편을 추출하는 것이 필요하다.

도 1은 알킬화된 폰 빌레브란트 인자 단편의 전체 농도에 의한 영향으로서 단량체/이합체 균형을 나타내는 그래프,

도 2는 알킬화된 폰 빌레브란트 인자 단편의 특정 농도에 의해 유발된 혈소판 응집 억제를 나타내는 그래프,

도 3은 비응집 및 응집된 알킬화된 폰 빌레브란트 인자 단편의 혈소판 응집을 억제하는 능력을 대조한 그래프,

도 4는 pH 3.5 및 pH 4.5에서 비응집 알킬화된 vWF 단편의 환형 이색성을 도시한 그래프.

본 발명은 숙주 세균 세포에서 재조합 DNA 분자로 부터 발현된 vWF의 치료적으로 유용한 단편을 회수하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 응집물이 거의 존재하지 않는 치료적 배합물을 비롯한 순수한 형태 또는 비응집 형태의 단편을 제공하는 것을 포함한다.

발명의 요약

본 발명에 따르면,

(A) 시스테인 변형된 vWF 단편 및 변성제의 수용액을 제공하고;

(B) 단편 및 변성제의 수용액을, 단편의 응집 형태가 이합체 및/또는 단량체 형태로 전환되는 것을 증진시키는 조건하에서 정제시켜 정제 단편을 제공하며;

(C) 단편의 수용액을 약 2.5 내지 5.5의 pH로 유지하면서 용해되고 정제된 단편을 변성제로 부터 분리하여 상기 단편의 단량체화를 증가시키고 응집을 감소시킴으로써 응집물이 거의 존재하지 않는 시스테인 변형된 vWF의 수용액을 형성하는 것을 포함하는 응집물이 거의 존재하지 않는 시스테인 변형된 폰 빌레브란트 인자(vWF) 단편의 수용액을 제조하는 방법이 제공된다.

바람직한 형태로서, 단계 (A)의 시스테인 변형된 vWF 단편은 알킬화된 단편으로 제공되고, 단계(A) 및 (B)에서 변성제는 우레아이며 또 pH는 약 3 내지 약 4로 유지된다.

혈소판에 대한 결합 부위로서 작용하는 이외에, 성숙 vWF 서브유닛의 잔기 445-733 단편은 생체내에서 대형 vWF 다량체를 형성하기 위한 vWF 서브유닛의 비공유결합 및 공유 결합에 관여하는 서브유닛의 도메인을 포함한다. 따라서, 이 폴리펩티드는 이합체화되거나 및/또는 응집물을 형성하는 경향이 있다. 이러한 경향은 이 단편의 가장 생물학적으로 활성인 형태가 단량체 형태인 것을 고려할 때 바람직하지 않다. 따라서 본 발명의 특징은 시스테인 변형된 vWF 단편의 배합물에서, 심근 장애 치료시 치료적 유용성이 적고 임상 결과에 나쁜 영향을 줄 가능성이 있는 응집물의 형성을 억제하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 특징은 단량체성 시스테인 변형된 폰 빌레브란트 인자 단편의 이합체화를 억제하는 방법을 제공하는 것에 관한 것으로, 상기 이합체는 생체내에서 2개 이상의 성숙 vWF 서브유닛의 결합을 용이하게하는 한 개 이상의 이온성, 소수성 또는 수소 결합을 포함하며, 상기 방법은 또한 약 2.5 내지 약 5.5 이하의 pH를 갖고 또 약 10 mg/ml 이하의 상기 단편을 포함하며 또 용액에서 부가적인 이온종(존재한다면)의 전체 농도가 약 75 mM 이하인 단량체성 시스테인 변형된 vWF 단편의 수용액을 형성하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 특징은 환자에게 투여하기 전에 상당 기간 동안 효과적으로 저장될 수 있는 비응집성 시스테인 변형된 vWF 단편을 함유하는 수성 배합물을 제공하는 것에 관한 것이다. 따라서, 동결건조된 다음 재수화되면 실질적으로 비응집 형태로 존재하는, 즉 응집물이 거의 존재하지 않는 비응집성 시스테인 변형된 vWF 단편을 포함하는 수성 배합물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 특징은 숙주 DNA 및/또는 단백질 또는 내독소와 같은 거대분자의 오염이 완전히 제거되도록 봉입체로 부터 순수한 알킬화된 vWF 단편을 유도할 수 있는 능력을 개발하는 것에 존재한다. 이를 달성하는데 특히 유용한 정제단계는 다음을 포함한다: (A) 알칼리성 pH를 갖는 용액을 불순물이 접착된 음이온 교환 물질과 접촉시킴으로써 알킬화된 vWF 단편 및 변성제의 수용액으로 부터 상술한 유형의 불순물을 분리하고; (B) 불순물이 제거된 수용액을 알킬화된 vWF 단편이 접착된 양이온 교환 수지와 접촉시키며; 또 (C) 상기 수지를 이온화된 시트르산 및 비이온성 변성제를 함유하는 수용액과 접촉시킴으로써 양이온 교환 수지로 부터 알킬화된 vWF 단편을 용출시키며, 이때 용출된 단편의 이동상 시트레이트 이온에 대한 친화도는 정상기로 부터 용해되는 것을 촉진시킨다.

본 발명의 또 다른 특징은 친화성 크로마토그래피를 사용한 선택적 정제 방법에 존재한다. 상기 방법에 특히 유용한 정제 단계는 다음을 포함한다: 용액을 vWF 단편이 접착된 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시킴으로써 산성 pH를 갖는 vWF 단편 및 변성제의 수용액으로 부터 상술한 불순물을 분리하고; 친화성 크로마토그래피 매질로 부터 vWF 단편을 용출시키며; 또 단편의 수용액을 pH 약 2.5 내지 약 5.5로 유지하면서 용출된 단편을 변성제로 부터 분리함으로써 단편의 단량체화를 증가시키고 또 단편의 응집을 감소시켜 응집물이 거의 존재하지 않는 단편의 수용액을 제공한다.

본 발명의 다른 특징은 본 발명의 치료성 배합물을 사용하여 환자에서 혈전증을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

정의

특별히 지시하지 않는 이상, 이하의 용어는 다음 의미를 갖는다.

cDNA - mRNA 주형에 존재하는 서열로 부터 효소적으로 합성된 DNA 분자 또는 서열.

발현 - 생성물을 제조하기 위해 구조 유전자가 거친 과정. 단백질 생성물의 경우, 전사 및 번역의 조합이다.

재조합 DNA 분자 - 말단 대 말단으로 결합되고 일부 숙주 세포를 감염시키는 능력을 갖도록 변형될 수 있고 그대로 유지될 수 있는 상이한 게놈으로 부터의 DNA 절편으로 구성된 분자.

클로닝 - 무성생식 또는 DNA 복제에 의해 생물 또는 서열로 부터 유도된 생물 집단 또는 DNA 서열 또는 기타 거대분자를 수득하기 위한 과정.

생물학적 활성 - 생물학적 관계 (즉, 생물내 또는 시험관내)에서 분자에 의해 실행되거나 유발된 활동의 하나 이상의 작용 및 효과. 성숙 폰 빌레브란트 인자 서브유닛의 잔기 445-733 단량체 단편의 특징적 생물학적 활성은 혈소판의 GPIbα 리셉터에 결합함으로써 혈소판 응집을 억제하는 능력이다.

성숙 폰 빌레브란트 인자 서브유닛의 잔기 445-733 단량체 단편의 특징적 생물학적 활성의 부가적 특징은 오직 한 개의 혈소판 GPIbα 리셉터에 결합함으로써 그 분자가 보트로세틴 유도된 다량체 vWF의 혈소판 결합을 억제하도록 하는 능력이다. 단량체 445-733 종의 다른 결과 또는 관련 효과는 혈소판 활성화 또는 표면 접착을 억제하는 것이다. 따라서, 이러한 단편은 항혈전제로서 치료 효과를 갖는다.

환원 조건 - 폰 빌레브란트 인자 또는 그로 부터 유도된 폴리펩티드를 함유하는 용액에서 vWF의 이황화 결합의 분해를 유발하는 환원제의 존재를 지칭한다.

폰 빌레브란트 인자 (vWF) - 본 명세서에서 말하는 모든 폰 빌레브란트 인자는 사람에 있는 vWF를 지칭한다. 용어 "폰 빌레브란트 인자"는 이하에서 정의한 용어 "성숙 vWF"의 범위내에 포함된다.

성숙 vWF - 혈장에서 발견되거나 또는 내피하층에 결합되어 있는 순환성 vWF. 서브유닛(단량체)의 길이가 2,050 잔기인 다수 종의 다량체에 전형적으로 결합된 폴리펩티드 단량체의 집단으로 구성된다. 부가적으로, 포유 세포에서 발현되면, 성숙 vWF는 보통 글리코실화된다. 폰 빌레브란트 인자는 내피하층 매트릭스의 성분, 활성화된 혈소판에 의해 분비되는 α-과립의 성분 및 순환성 혈액 혈장 단백질로 발견된다.

단량체성 - 시스테인 변형된 vWF 단편과 관련하여 사용되는 경우, 단량체성은 공유결합 또는 비공유결합적으로 다른 폴리펩티드에 결합되지 않은 단일 폴리펩티드를 지칭한다. "이합체"는 2개 단량체가 비공유적으로 결합된 것을 지칭한다. "응집된" 시스테인 변형된 vWF 단편은 이합체 보다 큰 구조를 지칭한다.

정제되거나 실질적으로 순수한 형태 - vWF-유도된 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 이 용어는 체내에서 보통 폴리펩티드와 함께 생기는 세포성 원형질, 비 vWF 단백질 또는 세포외 물질이 조성물에 실질적으로 존재하지 않는 것을 의미한다.

친화성 크로마토그래피는 단백질이 특정 분자에 긴밀하지만 공유결합이 아니게 결합되는 능력을 이용하는 크로마토그래피법을 지칭한다. 친화성 크로마토그래피를 실시하기 위하여, 리간드로 불리는 분자, 예컨대 헤파린을 크로마토그래피 물질, 보통 다공성 불활성 매트릭스에 공유 결합적으로 부착시킨다. 정제된 단백질, 상기 경우 vWF를 함유하는 용액 및 다양한 다른 바람직하지 않은 물질을 크로마토그래피 물질에 통과시킨다. 소망하는 단백질은 크로마토그래피 물질에 부착된 리간드에 선택적으로 결합되어 다른 물질이 용출되는 동안 유지된다. 단백질을 리간드와의 결합 작용으로 부터 분리하기 위하여 용출 조건을 변경함으로써 상기 vWF 단편을 고도로 정제된 형태로 회수할 수 있다.

헤파린은 D-글루쿠로네이트-2-술페이트 및 N-술포-D-글루코사민-6-술페이트가 교대로 α(1 →4)-결합된 잔기로 주로 구성된 다양하게 황산화된 글리코사미노글리칸을 지칭한다.

하기 표 I은 본 명세서에서 사용된 아미노산을 나타내는 표준 3자 표시를 나타낸다.

표 I

본 발명이 관계되는 항혈전성 폴리펩티드는 잔기 445 (세린)에서 부터 시작해서 잔기 733 (발린)으로 끝나고 겉보기 분자량이 약 33,000이며 시스테인 잔기(위치 459, 462, 464, 471, 474, 509 및 695)가, 다른 시스테인 잔기와의 상호작용이 억제되어 시스테인 기제 결합이 단일 단편 또는 단편내에 형성되지 않고 이러한 결합의 형성이 불용성 또는 생물학적으로 활성인 물질을 형성하는 경향이 있도록 변형된, 성숙 vWF 서브유닛의 아미노산 서열 도메인을 포함하는 시스테인 변형된 vWF 단편이다. 편의상, 이러한 단편을 이후 "시스테인 변형된 vWF단편"으로 칭한다. 이 용어는 단편의 정의내에서 445-733 잔기 서열을 포함하거나 중복되고 이들의 GPIbα 결합 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 것을 포함한다. 용어 "시스테인 변형된 vWF 단편"은 또한 항혈전 유용성을 갖는 잔기 445-733 도메인의 돌연변이 아미노산 서열을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 돌연변이 서열은 시스테인 잔기를 포함하거나 포함하지 않는다.

진핵 숙주 세포에서 적합한 cDNA 또는 기타 재조합 DNA 분자의 발현으로 생긴 폴리펩티드 형태는 본 발명의 실시에 따라 효과적으로 단량체화되거나 또는 배합될 수 있다.

시스테인 변형된 vWF 단편이 vWF 단편을 기본으로 하는 한, 이 단백질 및 지혈작용과 혈전작용에서 이들의 역할에 관한 정보는 이후에 나타낸다. 폰 빌레브란트 인자는 약 270,000 (270 kDa)의 분자량을 갖고 다량체당 30개 이하의 글리코실화된 동일한 서브유닛으로된 고분자량의 다량체로서 인체에 존재한다. 각 순환성 "성숙한" 사람의 서브유닛은 2,050 아미노산 잔기로 구성된다.

손상된 내피 표면을 감싸는 혈소판의 초기 단층의 형성은 표면 결합된 다량체성 vWF가 한편으로는 콜라겐 또는 프로테오글리칸과 같은 내피하층 성분에 또 다른 한편으로는 혈소판 막의 GPlb-IX 리셉터에 결합되는 가교 작용을 포함하는 것으로 이해된다. 다량체성 vWF와 당단백질 Ib-IX 착물(GPIb(α))의 상호작용은 혈소판 활성화를 유발하여 성장성 혈전을 형성하는 부가적인 혈소판의 보충을 촉진시킨다. 급속하게 축적되는혈소판은 피브리노겐의 결합에 의해 가교된다. 상기 방법에서 특히 중요한 것은 순환성 vWF의 다량체성 및 다가 특성으로서 거대분자가 결합 및 가교 작용을 효과적으로 발휘하도록한다.

본 발명에 의한 시스테인 변형된 vWF 단편은 GPIbα 리셉터에 대하여 vWF 인자와 경쟁하며 리셉터를 불활성화시켜 리셉터가 vWF와 상호작용을 하지 못하게하여 혈병의 형성이 억제된다. 단편의 성질에 관한 선행 연구 작업은 혈소판 막 당단백질 Ib-IX 리셉터 (GPIb(α))에 결합되는 2,050 잔기 성숙 폰 빌레브란트 인자 서브유닛의 도메인이 순환 서브유닛의 잔기 약 449 (발린)에서 부터 잔기 728 (리신)에 걸친 단편인 것을 밝혀내었다. 이 단편의 겉보기 분자량은 약 52,000이고 트립신 분해에 이어 vWF의 디술피드 환원에 의해 생성될 수 있다. vWF의 GPIb(α)) 결합 도메인은 단편내의 2개의 불연속 서열 Cys⁴⁷⁴-Pro⁴⁸⁸ 및 Leu⁶⁹⁴-Pro⁷⁰⁸ 에 함유된 잔기를 포함한다 (Mohri, H. et al., J. Biol. Chem., 263 (34), 17901-17904 (1988)). 전형적으로, 52,000 분자량 단편은 사람의 효소계가 단편을 글리코실화시켜 분자량에 기여한다는 사실을 감안하여 "52/48" 단편으로 칭한다. 글리코실화 양은 분자별로 다양하지만, 2개 분자량 52,000 및 48,000이 가장 일반적이다. 재조합 세균 숙주 세포로 부터 발현되므로, 상기 단편은 포유 세포에서 발현과 관련된 번역후 글리코실화가 결여된다. 글리코실화에 의한 부가적인 중량 없이 폴리펩티드는 약 33,000의 분자량을 갖는다. "52/48" 및 "33" 단편 모두는 폰 빌레브란트 인자가 혈소판에 결합되는 것을 경쟁적으로 억제한다.

상술한 바와 같이, 혈액 혈장으로 부터 치료에 유용한 양의 vWF 단편을 유도하기는 어렵다. 따라서, 숙주 세포에서 재조합 DNA를 사용하여 vWF 단편을 생산하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. 이 단편을 코딩하는 DNA 서열을 발현하기에 적합한 다양한 재조합 계가 알려져있다. 3개 계의 예를 이하에 나타낸다. 이들 계는 성공적으로 사용되어 왔고 또 세균 숙주를 이용하며 보다 큰 잔기 445-733 단편을 코딩한다. 부가적인 아미노 및 카르복시 말단 잔기 서열들은 항혈전성으로서 단편의 유용성에 대하여 아무런 영향을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.

(I) 박테리오파아지 람다로 부터 고 효율의 P_R 프로모터를 포함하는 pMMB3로 표시된 벡터. 대장균에서 vWF 단편 발현 유도는 세포를 30℃에서 중간 로그상으로 성장시킨 다음 온도를 42℃로 변화시키는 것에 의해 실시하였다.

(II) lac 리프레서에 의해 조절되는 하이브리드 trp-lac (tac) 프로모터 계를 포함하는 pMMB5로 표시된 벡터. 이 계에서의 유도는 세포를 37℃에서 중간 로그상으로 성장시킨 다음 락토로스 유사체 IPTG를 부가함으로써 실시하였다.

pMMB3 및 pMMB5로써 수득한 결과는 매우 유사하였다. 간단히 말해, 상술한 각 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포는 중간 로그상으로 성장하였고 1 내지 16시간 동안 유도되었고 수집된 다음 가용성 및 불용성 성분으로 분류되었다. vWF 단편은 세포 집단의 용해후 불용성을 나타내었다.

(III) vWF 단편의 발현에 사용되고 카나마이신(Km^R)에 대한 내성을 부여하며 박테리오파아지 T7으로 부터의 프로모터를 함유하는 제 3 벡터 (플라스미드). 이 벡터는 브룩헤이븐 내쇼날 라보라토리스의 F.월리엄 스투디에르 박사로 부터 구입하였고 다음과 같이 작성하였다. 이 플라스미드는 BspHI-EcoRI 단편(pBR322 bp3195-4361)의 절단을 통하여 pET-8c 로 부터 암피실린 내성 유전자를 제거하고 또 이것을 카나마이신 내성(Km^R)을 코딩하는 869 bp 단편으로 대체함으로써 작성하였고 Km^R 유전자는 벡터내에 시계방향으로 존재하였다. Km^R 유전자는 Tn903 (Oka, et al., J. Mol. Biol., 147: 217-226 (1981))으로 부터 유도되며 pUC4KISS (Barany, F., Gene, 37: 111-123 (1985))를 주형으로 하여 중합효소 연쇄반응(PCR)법으로 수득하였다. Km^R 유전자를 갖는 단편은 Km^R 개시 코돈 앞의 50개 뉴클레오티드에서 시작하여 종결 코돈에서 끝난다.

vWF 단편을 발현하고 카나마이신 내성을 부여하는 플라스미드는 pET-8c52K 및 pET-8c (Km^R)로 표시된 벡터로 부터 작성하였다. 간단히 말해서, vWF 단편을 코딩하는 XbaI/BamI 단편을 pET-8c52K로 부터 절단해내고 XbaI/BamHI 절단된 pET-8c(Km^R)에 결찰시켰다. 생성한 플라스미드 DNA (pET-8c52K9Km^R)를 사용하여 대장균 DH-1 세포를 형질전환시키고 XbaI/BamHI으로 분해된 적합한 크기의 단편을 방출하는 단일 단리물을 확인하였다. 이 단리물로 부터 얻은 DNA를 사용하여 대장균 BL21(DE3)pLysS를 형질전환시켰다. 이 형질전환으로 부터 얻은 단일 단리물을 vWF 단편의 발현에 사용하였다.

상기 계에서, vWF DNA를 박테리오파아지 T7의 TΦ 단백질에 대한 프로모터 및 번역 개시 시그널을 함유하는 벡터에 넣었다. 이어 유도 또는 감염에 의해 T7 RNA 중합효소를 숙주 세포에 전달할 수 있다. 특정 경우, lac UV5 프로모터 제어하의 T7 RNA 중합효소에 대한 유전자를 함유하는 프로파아지를 갖는 세포에 vWF 발현 벡터를 도입한다. 세포의 성장 배양물에 락토오스 유사체 IPTG를 부가하면 T7 RNA 중합효소를 유발하며 이것은 다시 플라스미드내의 표적 DNA를 전사시킨다. T7 RNA 중합효소에 의한 전사는 너무 활성이 강하여 표적 RNA가 리보솜 RNA에 필적할 만한 양으로 축적되며 표적 단백질은 세포성 단백질의 주 분획을 구성한다. vWF 단편의 합성의 초기 특징으로서, 세포가 유도되었고 도입한지 0.5 및 16시간 후의 시점에서 샘플을 채취하였다. 이들 데이터는 4일간의 도입후 vWF 단편이 전체 세포성 단백질의 약 25%를 구성함을 나타낸다. 이 수준은 tac 또는 R_R 벡터계에 의해 생성되는 수준보다 훨씬 높은 것이다.

재조합계로 부터 치료성 폴리펩티드를 제공하는데 있어 특히 중요한 점은 약리적으로 유용한 양의 치료성 폴리펩티드의 발현을 유발하는 능력이다. 상술한 세 개 계중, 단편의 수율이 높은 면에서 계(III)이 바람직하다.

세균 발현계, 예컨대 계(III)에 의해 생산된 vWF 단편은 숙주 세포내에 불용성 응집물(봉입체)로서 다량 축적되는 경향이 있고, 그로 부터 이들의 효과적인 분비를 촉진할 메카니즘이 숙주 세포에는 존재하지 않는다. 예컨대 포유류 시그널 펩티드는 세균계에서는 일반적으로 인식되지 않을 것이다. 이러한 발현된 폴리펩티드의 불용성 응집물(봉입체)은 재조합 세균계로 부터 유용 단백질을 다량 생산하려는 시도의 결과로 알려져 있고(Williams, D.C. et al., Scienece, 215, 687-689(1982)) 또 부적합하게 폴딩된 폴리펩티드를 초래할 수 있다.

봉입체의 형성은 시스테인 잔기의 고 효율적 농도 존재와 관련되어 있는 것으로 알려져있다. 부정확한 디술피드 결합의 형성은 봉입체내 또는 폴리펩티드를 용해시키려는 동안 증진되는 것으로 알려져있다. 단편(사슬내 결합)내에 형성되는 경우, 이러한 결합은 생물학적으로 불활성 구조의 분자를 초래할 수 있다. 단편 사이(사슬간 결합)에 형성되는 경우, 이러한 결합은 불용성 또는 생물학적으로 불활성인 이합체 또는 응집물을 초래할 수 있다. 잔기 445-733을 포함하는 vWF 단편은 위치 459, 462, 464, 471, 474, 509 및 695에서 7개의 시스테인 잔기를 함유한다. 따라서, 재조합 세균 계로 부터 발현된 포유 단백질의 성공적인 조작은 일반적으로 이들의 시스테인 잔기가 다른 시스테인 잔기와 반응할 수 없도록 변형되는 것을 필요로한다. 이 처리를 하지 않으면, 시스테인 잔기의 바람직하지 않은 반응이 전형적으로 일어나서 치료제로서 효과적으로 사용하기에 부적합한 불용성 또는 생물학적으로 불활성인 폴리펩티드 응집물의 형성을 초래한다.

시스테인 잔기를 성공적으로 변형시키기 위해 사용될 수 있는 수많은 유용 방법이 공지되어 있다. 이러한 수법중의 하나는 시스테인 잔기를 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 "DTT"로 처리한 다음 이 단편의 7개의 시스테인 잔기를 영구적으로 알킬화(예컨대 요오도아세트아미드로써)시키는 것을 포함한다. 수많은 다른 공유 라벨이 표적 시스테인 잔기에 부착될 수 있고, 이때 오직 하나의 요건은 표적 단백질을 비가역적으로 변성시키지 않는 pH 조건하에서 라벨이 적용되는 것이며, 상기 부착은 단편이 추가의 가공 또는 저장되는 동안 발현되는 조건하에서 다른 시스테인 잔기와의 화학적 반응을 허용하지 않는 종류의 부착이다. 이러한 공유 라벨링 과정은 이 기술 분야에서 공지되어 있고 또 (A) 요오도아세트산 또는 (B) 요오도플루오레세인과 같은 요오드화제와의 반응을 포함한다. 부가적으로, 시스테인 잔기는 술피톨릴화와 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 변형은 암호화 DNA의 위치 특이적 돌연변이에 의해, 시스테인 잔기를 글리신 또는 알라닌과 같은 불활성 잔기로써 대체하거나, 또는 시스테인에 상응하는 위치의 서열을 결실시키는 것에 의해 실시할 수 있다. 이들의 존재에 의해 유발되는 문제를 피하기 위하여 충분한 수의 시스테인 잔기를 변형시킨다.

이하의 실시예 1에 기재한 바와 같이, 부정확한 디술피드 결합에 의해 유발된 응집 효과는 화학적 환원 (디티오트레이톨로써, "DTT")에 이어 영구적인 알킬화반응(요오도아세트아미드로써)에 의해 본 발명의 치료적 배합물에 대하여 제거되는 것이 바람직하다. 이러한 처리에도 불구하고, 생성한 폴리펩티드 (이후, 본 발명의 "알킬화된 vWF 단편")는 응집물로 축적되는 것으로 밝혀졌고 따라서 치료적으로 무용한 형태이다. 다른 유형의 시스테인 변형된 단편은 치료적 배합물에 대한 용해에 대해 균등하게 내성일 수 있고, 따라서 응집 효과는 시스테인과는 무관하다.

따라서, 본 발명은 응집된 시스테인 변형된 단편을 용해화시키는데 효과적인 처리 단계를 제공하며 또 본 발명은 환자에게 주사하기에 적합한 단편의 수용액, 예컨대 비응집 형태 및 치료적으로 유용한 형태의 용해된 단편을 함유하는 용액을 제공한다.

따라서, 본 발명은 봉입체를 포함한 발현된 vWF 단편이 변성제를 함유하는 용액에서 안정화된 비응집 시스테인 변형된 단편으로 먼저 제공된 다음 두 번째는 사람용 주사액에 적합한 치료적으로 허용되는 물질만을 함유하는 용액에서 안정화된 비응집 단편으로 제공될 수 있는 조건하의 범위내에 든다.

단편이 제조된 재조합계로 부터 vWF 단편을 회수하기 위해 임의의 적합한 수단을 이용할 수 있다. 초기 단계로서는, 단편의 불용성 응집물, 즉 봉입체를 다른 세포성 성분으로 부터 분리시킨다. 이는 숙주 세포의 파쇄 및 불용성 단백질(봉입체)로 부터 파쇄된 세포 물질의 분리를 포함한다. 이를 실시하기 위한 유용한 방법의 예는 초음파처리 및 균질화를 포함한다. 대표적인 방법은 미국 특허 4,828,929호 및 동 4,673,641호에 기재되어 있는 방법을 포함한다.

봉입체를 숙주 세포로 부터 추출하기 위한 바람직한 방법은 이하의 실시예 1에 기재되어 있으며, 1개 이상의 세제 존재하에서 세포 파쇄를 실시하기 위한 기계적 균질화 및 원심분리에 의해 vWF 단편으로 부터 파쇄된 물질을 분리하는 주기를 반복하는 것을 포함한다. 다른 유용한 방법도 또한 사용될 수 있다.

재조합 계로 부터 회수된 응집된 vWF 단편은 단편의 가용성 삼합체에서 부터 수천개의 개별 폴리펩티드 단편이 결합된 거대 불용성 구조에 걸친 광범위한 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 전형적으로, 약 10 내지 20개, 또는 이하의 단편으로 구성되며 분자량 200,000 내지 400,000을 갖는 이들 응집물은 가용성이다. 이후 "가용성 응집물"로 지칭되는 이러한 단편은 시험관내 분석(실시예 3 및 도 3 참조)으로 측정된 바와 같이 비교적 낮은 치료적 유용성을 갖는다. 특정의 더 큰 착물도 가용성일 수 있지만 그의 치료적 유용성은 비교적 낮다.

상술한 과정으로 부터 생성된 "비응집성 단편" (또는 "응집물이 거의 존재하지 않는" 단편)은 단량체성 단편 및 비공유결합으로 연결된 이합체 단편으로 구성된 집단을 포함한다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 실험을 기초하여, 이러한 샘플에 존재하는 "가용성 응집물"의 양은 약 0.5% 미만이다. 사실, %불순물이 적은 대부분의 제제는 HPLC 계의 염 환경의 가공품이다. 하기 기술한 바와 같이, 이렇게 단리된 이합체는 단량체와 함께 평형(도 1)하게 존재하며 중량기준해서 평균 0.5배의 단량체의 항-혈소판 응집 활성을 갖는 것으로 측정되었다. 이로써 이합체내에 2개의 결합 부위중의 하나를 마스킹하게된다. 비응집 단편의 치료적으로 유용한 샘플의 생산과 관련하여, 다량의 단량체 및 소량의 이합체를 함유하는 샘플의 제조가 바람직하다.

본 발명을 실시함에 있어서, 용해된 비응집 단편을 제조하기 위한 방법은 불용성 응집물을 가용성 응집물로 전환시키는 단계로 개시된다. 이것은 시스테인 변형된 vWF 단편 및 변성제를 함유하는 수용액의 제조를 포함한다.

본 발명의 바람직한 형태는 변성제가 단편의 가용성 응집물의 형성을 용이하게하는 조건하에서 수용액중에서 단편을 영구적으로 알킬화하는 것을 포함한다. 응집 물질의 분리는 크기 배출을 기본한 겔 크로마토그래피 및 한외여과를 비롯한 다수 공지된 수법에 의해 조정될 수 있다.

단편의 알킬화는 봉입체 응집물중의 내부사슬 및 사슬사이의 디술피드 결합을 환원시킴으로써 실시한다. 이어 환원된 시스테인 잔기를 영구적으로 알킬화시킨다. 단편의 환원과 알킬화는 공지된 단백질 처리단계와 같은 적합한 수단에 의해 실시될 수 있다.

환원은 일반적으로 응집물의 수용액을 단백질성 응집물의 디술피드 결합을 티올로 전환시키는 조건하에서 적합한 환원제와 반응시키는 것을 포함한다. 사용될 수 있는 환원제의 예는 δ-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨이며, 후자가 바람직하다.

상기 환원의 생성물은 알킬화제가 단편의 유리 술프히드릴 기를 불활성으로 존재하도록 영구적이고 공유결합적으로 라벨링하는 작용을 하는 조건하에서 알킬화 처리할 수 있으며 단백질성 단편은 더욱 조작되거나 저장된다. 임의의 적합한 알킬화제가 사용될 수 있다. 이러한 알킬화제의 예는 요오도아세트산, 요오도아세트아미드이고, 후자가 바람직하다.

본 발명에 따르면, 알킬화된 형태를 비롯한 시스테인 변형된 vWF 단편 및 비응집성 단편의 생산은 단편을 변성제를 함유하는 수용액중에서 조작함으로써 실시할 수 있다. 여기서 사용된 용어 "변성제"라는 것은 전형적으로 이하에 대표적으로 나타낸 메카니즘중의 하나 이상에 의해 단편의 구조를 변경할 수 있는 적합한 농도의 물질을 지칭한다: 특정 용매 표면 상호작용을 제공하거나 또는 단편내 또는 단편 사이의 이온 또는 수소 결합 또는 기타 작용을 파쇄함으로써 용매 환경, 즉 단편의 특정 기의 수화 상태를 변경시킨다. 일반적으로, 변성제의 효과는 가역적이다. 예컨대, 변성제를 함유하지 않는 용액에 대하여 투석하는 경우, 변성제에 의해 유도된 효과는 가역적이다. 본 발명에 사용된 변성제의 성질 및 처리 조건은 변성제의 사용효과가 가역적이도록 선정한다. 따라서, 비가역적 효과를 초래하는 물질 또는 조건, 예컨대 고 친화성으로 실제적으로 제거하기가 불가능하게 단편에 결합되는 물질의 사용이나 고온의 이용은 피해야한다.

여기서 사용한 용어 "변성제" 및 "세제"는 상기 조건이 만족되는한 동등한 것으로 본다. 본 발명에서 변성제로서 사용하기에 적합한 물질의 예는 우레아 및 구아니딘-히드로클로라이드이며, 세제는 예컨대 폴리옥시에틸렌 (9) p-삼차옥틸페놀 (Nonidet^R P40), 폴리옥시에틸렌 (9-10) p-삼차옥틸페놀 (Triton-X-100) 및 나트륨 데옥시콜레이트이다.

본 발명에서 사용하기에 가장 바람직한 변성제는 우레아이다. 우레아는 수용액에서 고 용해성이며 투석에 의해 용액으로 부터 신속하게 제거될 수 있다. 우레아는 비이온성 물질이기 때문에, 이하에 설명한 바와 같이 DNA 및 내독소와 같은 세균 유래의 불순물을 제거하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있는 이온 교환 물질을 방해하지 않는다. 우레아의 권장 농도 범위는 약 4M 내지 약 8M이다.

본 발명의 실시는 세균성 DNA, 세균성 내독소(지방다당류) 및 세균성 단백질과 같은 세균 유래의 불순물을 시스테인 변형된 vWF 단편으로 부터 제거하기에 특히 유용한 것으로 밝혀진 단계들을 포함할 수 있다. 이러한 불순물의 제거로써 단편은 치료성 배합물에 사용될 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 순수하지 않은 알킬화된 vWF 단편 및 변성제의 수용액을 음이온 교환물질과 처리한 다음 양이온 교환 물질과 처리하는 것을 포함한다.

불순물 함유 용액을 음이온 교환 물질과 처리하는 것은 알칼리성 pH에서 실시하며 음이온 교환 물질에 접착되는 세균성 DNA 및 내독소를 용액으로 부터 제거하는데 효과적이다. 이를 위하여, 용액은 세균성 성분이 음이온 교환 물질에 접착되고 vWF 단편은 접착되지 않는 다량의 염을 함유해야한다.

상기 용액을 단편이 결합된 양이온 교환 물질과 산성 pH에서 접촉시켜 단편을 세균성 단백질로 부터 분리한다. 용액의 산성 pH는 양이온 교환 물질의 카르복시기의 일부가 이온화되고 또 단편상의 카르복시기의 일부가 양성자화되어 응집을 피하도록 해야한다. 양이온 교환 물질로 부터 단편을 용출시키는 것은 적합한 용출 완충액을 사용하여 실시하며, 바람직하게는 이온화된 시트르산 및 비이온성 변성제를 함유하는 수용액으로 실시한다.

이하의 실시예 1은 시스테인 변형된 vWF 단편 집단을 비응집 단편으로 전환하는 과정의 전체적 목표가 달성되는 조건하에서 세균성 불순물을 단편으로 부터 효과적으로 분리하는 방법의 대표적인 일련의 단계를 기술한다.

구아니딘 히드로클로라이드가 바람직한 변성제이긴 하지만, 이것은 이온 교환 물질을 방해하므로 상술한 유형의 불순물을 제거하는 임의의 이온 교환 단계 전에 실질적으로 제거되어야한다. 구아딘 히드로클로라이드의 권장 농도는 약 4 내지 약 8M이다.

하기 실시예 5는 친화성 크로마토그래피법에 의해 세균성 불순물로 부터 단편이 분리되는 본 발명의 특히 바람직한 구체예를 예시한다. 이 방법은 헤파린에 대한 vWF의 친화성을 기본으로 하여 신속하고 효과적으로 다량의 vWF를 정제하는 방법은 제시한다.

부분적으로, 이 구체예는 본 과정에서 정제된 vWF 단편이 헤파린을 결합하는 것으로 공지된 23개 아미노산 잔기 (Tyr5⁵⁶⁵ 내지 Ala⁵⁸⁷) 서열을 포함한다는 사실을 기본으로 한다. 단편의 헤파린에 대한 친화성은 이온 교환 크로마토그래피법에서 흔히 관측되는 유사하게 하전된 단백질이 함께 단리되는 것을 피하도록 친화성 크로마토그래피법의 사용을 용이하게한다.

본 구체예에 사용된 친화성 크로마토그래피 매질은 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 헤파린 분자를 포함한다. vWF 단편이 상기 매질을 함유하는 크로마토그래피 칼럼에 로딩되면, 단편은 가역적으로 헤파린 분자에 결합되어 소망하지 않는 불순물이 크로마토그래피 칼럼을 통과하는 동안 선택적으로 잔존한다. 이어 vWF 단편은 vWF와 헤파린 분자의 비공유 결합을 극복하기에 충분한 이온 강도를 갖는 염 용액으로 용출될 수 있다. 이 용출된 vWF는 부가적인 크로마토그래피 단계를 이용하여 더욱 정제될 수 있다.

본 구체예에서 사용된 친화성 크로마토그래피 매질은 이 기술 분야에서 공지된 수법을 이용하여 용이하게 제조될 수 있거나 또는 시중에서 구입할 수 있다. 필요에 따라서, 헤파린은 이 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 시아노겐 브로마이드를 사용하는 방법을 이용하여 세파로오스 또는 아가로오스와 같은 소망하는 크로마토그래피 매트릭스에 결합될 수 있다. 다르게는, 파마시아사가 시판하는 헤파린-세파로오스 CL-6B와 같은 시판되는 친화성 크로마토그래피 매질이 사용될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 시판중인 친화성 크로마토그래피 물질이 사용된다.

본 발명의 친화성 크로마토그래피법은 다양한 pH값 범위에서 실시될 수 있지만, 약 6 이하의 pH에서 실시될 때 가장 우수한 결과를 얻었다. 우레아와 같은 변성제를 병용하거나 낮은 pH 조건은 vWF가 고 선택적으로 친화성 크로마토그래피 매질에 결합되게하여 비특이적 작용이 최소화된다. 낮은 pH 조건의 이용은 단편의 선택적 결합 뿐만 아니라 vWF 단편을 비응집 상태로 보존하는데 기여하므로 단편의 재생을 용이하게한다. 따라서 상기 기술한 친화성 크로마토그래피법은 우레아와 같은 변성제 존재하에서 약 6 이하의 pH에서 실시하는 것이 바람직하다.

상술한 이온 교환 또는 친화성 크로마토그래피법에 이어, 단편은 변성제 존재하, pH 약 2.5 내지 약 5.5에서 더욱 용해되어 유지되는 것이 중요하다. 알킬화된 vWF 단편의 아미노산 측쇄를 산으로 적정하면 단편이 pH 3.5에서 완전히 양성자화되고, 폴리펩티드 단편은 네트 전하 (+) 41를 갖는다는 것을 알 수 있다. 네트 전하를 최대화하는 환경에서 단편을 유지하는 것은 단편의 용해성을 유지하고, 용해성 응집물이 소형 응집물 및 비응집 물질로 분해되는 것을 용이하게 하며 또 단편이 재결합되는 것을 억제하는데 중요하다. 약 3 내지 약 4의 pH값이 바람직하다. 변성제 존재하, pH 3.5에서 용해화하는 것이 가장바람직하다. 임의의 적합한 산이 pH를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 산의 예는 염산 또는 젖산이다. 그러나 약 3 내지 약 5의 pH 범위에서 완충능을 제공하는 산의 사용이 바람직하다. 시트르산의 사용이 가장 바람직하다.

변성제 존재하에서 응집된 봉입체 단백질을 용해시키기 위한 다수의 방법이 공지되어 있지만, 생성한 제품을 임상 용도로 사용하는 것은, 생성한 용액이 사람용 주사액에 대한 법정 규준에 부응하도록, 함유된 변성제가 비독성이고 해가되지 않는 임상적으로 허용되는 물질로 대체되는 것을 필요로한다. 시스테인 변형된 vWF 단편 및 봉입체로 부터 재구성된 알킬화된 형태의 단편을 생리적 pH 또는 혈액의 염수에 상응하는 이온 세기를 갖는 용액으로 배합하기 위한 시도는 불용성 응집 단백질을 함유하는 제품만을 생성하여왔다.

따라서, 시스테인 변형된 단편을 변성제로 단량체화하는 것은 실질적으로 분해된 조성물을 생성하지만, 변성제없이 임상 용도의 폴리펩티드를 성공적으로 배합하는 것은 불가능한 것으로 밝혀졌다. pH 3.5에서 vWF 단편상의 네트 하전은 +41이고 또 이러한 하전은 대표적이거나 또는 상응하는 크기의 많은 단백질상에서 생길 수 있는 네트 하전 보다 본질적일 수 있지만, 이렇게 제조된 단량체 분자는 변성제 부재하에서 재응집될 수 있다. 이후 시스테인 변형된 vWF 단편의 가용성 형태의 임상적 배합물의 제조 및 이것을 저장 및 분해하기 위한 방법 단계에 대해 기술한다.

본 발명의 중요한 특징은 용액이 비교적 저농도의 이온성 물질을 함유하면, 시스테인 변형된 vWF 단편의 산성 pH의 용액에서의 용해도가 향상될 수 있는 점이다. 이러한 물질은 유기 또는 무기 염, 완충액, 아미노산 또는 기타 하전 분자 형태일 수 있다. 이하에 자세히 기재한 바와 같이, 시스테인 변형된 단편을 수용액으로 유지하는 것은 생리적 pH값 및 이온 염 농도를 갖는 용액에 비교하여 수용액에 의한 단편의 반극성 또는 소수성 기의 용해를 용이하게한다. 따라서 이러한 용액은 임상적 배합물의 저장을 위해 상술한 변성제 함유 용액을 대체하여 사용될 수 있다.

본 발명을 실시함에 있어서, 단편에 의해 제공되는 하전된 기의 공헌 이외에 양성 및 음성 이온의 전체 세기로서 정의되는 이온 물질의 농도는 단편의 수용액에서 약 75 mM를 초과해서는 안된다. 이 농도를 초과하면, 변성제의 부재하에 시스테인 변형된 vWF 단편의 응집이 현저한 정도로 되어, 이 물질이 용액이든 또는 냉동 저장으로 부터 해동되거나 또는 냉동 건조된 형태로 부터 재구성될 때 임상적 용도를 위한 장기간 저장에 부적합하고 또 이하에 설명한 바와 같이 이후의 과정전에 일시적으로 저장하기에 부적합할 수 있다.

시스테인 변형된 vWF 단편이 응집물이 거의 없이 본 발명의 수성 배합물에 존재하는 농도는 다양한 범위일 수 있지만, 예컨대 약 1 내지 약 30 mg/ml이다. 따라서 시스테인 변형된 단편은 예컨대 바람직한 배합물에서 가용성 응집물의 형성없이 적어도 약 30 mg/ml 까지 가용성일 수 있다. "비응집성" 시스테인 변형된 단편의 단량체와 이합체 사이에 존재하는 평형 때문에, 또 단량체의 높은 특이적 억제 활성 때문에(실시예 2 및 도 1 참조), 단량체를 선호하는 농도 범위는 약 15 mg/ml가 바람직하고, 효과적인 투여에 특히 적합한 농도인 약 5 내지 약 10 mg/ml가 가장 바람직하다.

본 발명에서 특히 바람직한 것은 약 10 mM 이하의 무기 염, 약 15 mM 이하의 부가적 이온성 화합물, 예컨대 아미노산 히드로클로라이드 및 약 10 mM 이하의 완충액을 함유하는 치료성 배합물이다. 상술하거나 또는 유사한 화합물의 바람직한 농도 범위에 대한 기술에서 "mM"는 화합물의 농도를 지칭하는 것이고 전체 합이 약 75 mM를 초과하지 않아야하는 개별 이온의 농도가 아니다.

부가적으로, 당 또는 당 유도체, 예컨대 만니톨, 수크로오스 또는 말토오스와 같은 비이온성 긴장도 개질제는 액체 형태로 저장하기 전 또는 동결건조하기 전에 본 발명의 배합물에 부가될 수 있다. 이들의 양은 약 0 내지 약 15% (w/v)를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 냉동된 다음 치료 용도로 사용시 해동될 수 있다.

바람직한 수성 배합물은 약 0.5 내지 약 10 mM의 NaCl 또는 기타 무기 염, 약 0.5 내지 약 5 mM의 시트르산 또는 기타 적합한 완충액 및 약 0.5 내지 약 15 mM의 리신 모노히드로클로라이드 또는 기타 아미노산을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예는 pH 약 3.5이고 약 1.5 mM의 NaCl, 약 1 mM의 시트르산 및 약 1 mM의 리신 모노히드로클로라이드를 포함하는 용액이다. 약 5% (w/v)의 만니톨과 같은 비이온성 긴장도 개질제를 부가하는 것은 생리적 용액과 거의 등장성인 본 발명의 배합물 제조를 가능하게한다.

여기서 기재된 과정을 따라서, 응집물이 거의 존재하지 않는 시스테인 변형된 vWF 단편의 수용액을 제조할 수 있다. "응집물이 거의 존재하지 않는"이라는 용어는 다량의 가용성 응집물 및/또는 치료 투여량으로 사용될 때 환자에서 불리한 임상 결과를 초래하지 않는 불용성 응집물을 함유하는 시스테인 변형된 vWF 단편의 치료성 용액 또는 기타 약학 조성물을 포함한다.

본 발명은 단편의 농도가 약 1 내지 약 30 mg/ml, 바람직하게는 약 5 내지 약 15 mg/ml이고 가장 바람직하게는 약 10 mg/ml인 응집물이 거의 존재하지 않는 시스테인 변형된 단편의 수용액을 제조하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 단량체의 중량%가 약 40 내지 약 100%, 바람직하게는 약 65 내지 약 80중량% 및 가장 바람직하게는 약 75중량%인 응집물이 거의 존재하지 않는 시스테인 변형된 단편의 수용액을 제조하기 위해 이용될 수 있다.

시스테인 변형된 vWF 단편은 제제를 적정하는데 필요한 이외에는 부가적 완충액, 염 또는 이온성 화합물 없이 파이로겐 유리 탈이온수에 비응집 형태로 저정하기 위해 배합될 수 있으며, 그 pH는 약 3.5로 조정될 수 있다. 이 경우, 비이온성 긴장도 개질제의 부가가 바람직하다. 이러한 제제는 동결건조 또는 냉동된 다음 치료용도로 사용할 때 해동될 수 있다. 따라서 본 발명은 동결건조되거나 냉동된 다음 재구성되거나 해동되며 이러한 처리시 원래의 활성을 회복할 수 있는 안정성을 갖는 치료성 용액을 제공한다.

본 발명에 따라 제조된 조성물은 4℃에서 한달 이상 동안 저장될 수 있으며, 이 조성물은 거의 응집물을 함유하지 않는다.

용액을 저장하거나 또는 냉동건조 또는 냉동시키기 전의 용액에 바람직한 pH의 선택에 관해서는, 시스테인 변형된 단편의 아미노산 측쇄를 산으로 적정함으로써 전체 (+) 41 하전 단편을 생성하는 것이 약 pH 3.5에서 완전하다고 알려져 있다. 따라서, 약 3 내지 약 5의 pH 범위의 배합물이 바람직하다. 보다 큰 산도는 단백질을 변성시킬 수 있는 반면에 더 높은 pH값은 단백질의 등전 pH(5.5)에 근접하여서 응집이 생길 수 있다.

바람직한 범위 이외의 pH를 갖거나 또는 바람직한 범위 외의 이온 농도를 함유하는 배합물은 장기간 저장 전에 중간 정도 기간(부가적 가공 전) 동안 알킬화된 단편의 수용액을 저장하는데 적합할 수 있다.

순환 계 또는 재조합 포유 계로 부터 단리된 vWF로 제공되는 시스테인 변형된 vWF 단편은 향상된 용해도 및 안정성 특징을 갖도록 본 발명에 따라서 배합될 수 있다. 이렇게 제조된 배합물은 혈액과 등장일 수 있거나 또는 저장액 또는 고장액일 수 있다.

본 발명의 단량체화 및 배합 과정은 여기서 기재된 처리 조건이 특정 소수성 및 친수성 아미노산 잔기 및 시스테인 변형된 vWF 단편의 서열내의 도메인의 특성을 이용하게 하기 때문에 효과적이라 알려져 있다. 시스테인 변형된 단편을 pH 3.5로 유지하는 것은 친수성 및 용해도를 증가시키는 것으로 알려진 네트 하전 +41을 폴리펩티드에 부여한다고 이미 말한 바 있다. 약 pH 4.5 이하에서 글루타민산 및 아스파라긴산 측쇄를 적정(양성자화)하는 것은 pH 3.5에서 저장함으로써 vWF 단편상에 부여되는 응집으로 부터 안정화를 설명할 수 있는 단백질 구조의 중요한 조절제이다.

아미노산 동종중합체의 하전된 측쇄는 α-나선를 불안정하게할 수 있다고 공지되어 있다. 하전되지 않은 폴리-L-글루타민산 및 폴리-L-리신은 예컨대 안정한 α-나선 구조를 형성하는 반면에 그의 하전된 형태는 랜덤 코일 영역에서만 안정하다(Urnes, P. and Dozy, P., Adv. Proein Chem., 16, 401 (1961), Lehninger, A.L., Biochemistry, p.113, Worth Publishing Company (1970)). 적합하게 위치한 글루타민산 및 아스파라긴산 잔기는 음성으로 하전되면 시스테인 변형된 vWF 단편내의 α-나선 영역을 불안정화시킬 것이라고 본다. 그러나, 양성자화된 형태, 예컨대 pH 3.5에서는 이들은 일정 구조 영역내에 포함되거나 인접 형태로 되거나 증식될 수 있다.

이러한 일정 구조 영역이 확대되거나 또는 pH 3.5에서 아스파라긴산 또는 글루타민산 양성자화에 의해 형성되는 정도 까지 이러한 영역(약 pH 7.0에서 소수성 잔기를 함유하는 랜덤 코일로서 존재하는)이 결합될 수 있는 용이성을 제한할 것이라고 알려져 있다. 이러한 효과는 소수성 결합에 필요한 활성화 엔탈피를 증가시키는 것에 의해 측정될 수 있음을 예상할 수 있다.

이러한 결합은 생리 용액과 비교하여, 실질적으로 저농도의 용해된 이온 물질을 함유하는 수용액에서 최소화되는 것으로 예상된다.

pH 3.5를 유지하는 것이 특정 단백질의 단량체화를 촉진시키는 지의 여부와, 응집을 억제하는지의 여부는 폴리펩티드 구조중의 아스파라긴산과 글루타민산 잔기의 총 갯수 및 정해진 구조에 참여하는 퍼텐셜이 인접하는 아스파라긴산과 글루타민산의 양성자화에 부분적으로 현상에 의존하는 특정 아미노산 잔기의 서브도메인과의 간격에 따라 다르다. 따라서, 시스테인 변형된 재조합으로 생성된 폴리펩티드를 pH 3.5에서 유지하는 것이 단량체화를 촉진시키는지 또는 안정화시키는지의 여부는 폴리펩티드 종 기중으로 판단되어야 하는 문제임이 명백하다.

생리적 pH 7.0의 저장 조건하에서 명백한 응집을 피하기 위한 낮은 pH 배합물의 유용성 평가에 유용한 특정 우레아는 하기와 같이 시스테인 변형된 vWF 단편을 모델로 사용하여 나타낸다.

(A) 시스테인 변환 잔기 445-733 vWF 단편은 pH 7에서 정해진 2차 구조를 파괴하는 위치의 주요 번호는 특정 글루타민산 또는 아스파라긴산의 잔기의 양성자화를 규제할 수 있음을 총 289개의 염기 위치 중 21 글루타민산과 15 아스파라긴산 잔기를 함유한다.

(B) 많은 소수성 잔기는 α-나선 또는 β-병풍 쉬트 도메인을 선호하거나 또는 허용한다고 공지되어 있고, pH 3.5에서 정해진 구조적 서브도메인에서의 격리때문에 소수성 응집에 참가할 수 없다. 상기 잔기는 알라닌, 로이신, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민 및 발린을 포함한다. Asp 또는 Glu 잔기에 인접한 특정 영역이 아스파라긴산 또는 글루타민산의 양성자화에 의해 허용될 수 있는 정해진 2차 구조를 수여하기에 유익하도록 소수성인지의 여부는 Kyte, J.일행의 J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982)의 모델을 참고면 알 수 있을 것이다. Kyte 모델은 대형 폴리펩티드로 존재할 때, 특정 펩티드 서열이 나타내는 소수성(또는 친수성) 성질의 정도를 예견한다. 전반적인 소수성/친수성 지수는 각 잔기의 기여 및 목적 서열에서 서로 관련된 특정 아미노산의 위치에 근거하여 정해진다.

(C) 약 pH 7에서 얻은 구조와 비교하여, pH 3.5 내지 4.0에서 아스파라긴산 또는 글루타민산의 양성자화에 의해 정해진 구조가 강화되어질 수 있다고 예상되는 5개 또는 그 이상의 잔기의 많은 서열이 잔기 445-733 단편 내에 존재한다. α-나선 특성이 pH 3.5에서 강화될 수 있는 대표적인 도메인은 하기를 포함한다(공지된 염기 참고).

(1) Cys⁴⁶⁴-Leu⁴⁶⁹(465 위치에 Asp 함유);

(2) Cys⁴⁷¹-Glu⁴⁷⁶(472 위치에 Glu 함유);

(3) Leu⁴⁹⁴-Ile⁴⁹⁹(497, 498, 위치에 각각 Glu 및 Asp 함유);

(4) Leu⁵¹²-Asp⁵²⁰(514 위치에 Asp 함유);

(5) Glu⁵²⁷-Leu⁵³³(529 및 531 위치에 Glu 함유);

(6) Val⁵³⁷-Clu⁵⁴²(539 위치에 Asp 함유);

(7) Val⁵⁵³-Tyr⁵⁵⁸(557 위치에 Glu 함유);

(8) Val⁶⁸⁰-Gln⁶⁸⁶ (681 위치에 Asp 및 682, 684위치에 Glu 함유); 및

(10) Tyr⁶⁹³-Ala⁶⁹⁸(696 위치에 Asp 함유).

4.5 부터 3.5 까지의 pH 이동에 의해 미응집 시스테인 변형된 vWF 단편에서 생성되어질 수 있는 정해진 구조의 증가는 실시예 4 및 도 4에 기재되어 있다.

응집물이 거의 없는 시스테인 변형된 vWF 단편 배합물의 치료 용도를 고려하면, 혈전증을 예방 또는 억제하기 위한 투여량은 환자가 혈전증이 되기 쉬운 정도에 따라 다르지만, 어떤 환자에서도 쉽게 결정될 수 있다. 용액 또는 재현탁된 동결 건조 물질을 포함하는 본 발명의 배합물은 직접 환자에게 주입될 수 있거나, 주입 전에 비이온성 긴장도 조절제와 같은 기타 생리적으로 화합할 수 있는 성분과 혼합될 수 있다.

실시예 1-비응집 형태의 알킬화 폰 빌레브란트 인자 단편의 제조

하기 방법은 (1) 하기에 언급된 바와 같이 vWF 단편의 봉입체 펠릿으로부터 용해된 가용성 응집물(전형적으로 200 kDA 또는 그 이상)을 용액에 방치하고; (2) 치료성 배합물에 받아들일 수 없는 불순물(세균성 DNA 및 내독소와 같은)을 제거하며; (3) 소형 응집물을 초래하는 일련의 단계로 단편의 "단량체화"를 개시하고; 또 (4) 생성된 미응집 물질을 재응집되지 않게 단편을 안정화시킨 배합물 완충액으로 제공하는 것으로 고안되었다.

봉입체 펠릿 물질은 하기와 같이 적당한 E.coli BL21(DE3) pLysS의 배양물로부터 수득하였다. 50리터의 통기 배양액으로부터 세포를 얻고, 중공 섬유 미량 여과막 카트리지를 사용하여 농축시켰다. 2개의 Amicon H5MP01-43 여과 카트리지가 재순환 방식에 사용되었다. 세포를 Amicon 여과기에서 2 내지 4 리터의 용량으로 농축시키고, 그후, 세포를 Amicon 여과 기구에서 트리스 완충 식염수(0.025 M 트리스, 3.03 gm/리터 H₂O, 0.2M NaCl, 11.7 gm/리터 H₂O, 최종 pH 7.5±0.2, 25℃; 이하 A-1로서 지칭) 5 부피, 약 10 내지 20 리터로 투석여과에 의해 세정시켰다.

트리스 완충 식염수(A-1) 4리터로 여과에 의해 세포를 회수하였다. 세포 파쇄시 나트륨 데옥시콜레이트를 최종 농도가 0.5g/리터에 이르도록 세포 현탁액에 가했다. 세포를 수집하자마자 Microfluidizer^R(Microfluidics Corp., M-110 Microfluidizer^R)를 통과시켜 기계적으로 파쇄시켰다. 세포가 일단 Microfluidizer^R를 통과한 후, 두 번째 세제인 Tween80을 용균된 세포 현탁액에 가하여 1리터의 TBS에 용해된 2.5% Tween 80(v/v) 25ml를 사용하여 최종 농도가 0.025%에 이르게 했다. 이는 완충액 A-1을 따뜻하게 하고, Tween 80을 용액에 적가하고, 용액이 뚜렷하게 균질화될 때까지 혼합하여 실행되었다. 이 용액을 실온으로 냉각시키고, 파열 세포 현탁액에 부가하여 0.025%(v/v)의 최종 농도를 수득했다(이하, A-2). Tween이 처음 통과시 존재하면, Microfluldizer^R가 장애되므로 세포를 파쇄하기 전에 유통로를 세척해야 된다. 세포가 파쇄된 후, 현탁액을 원심분리(10,000×g; 35분, 4℃)시켜, 가용성 세포 파편으로부터 주로 생성된 봉입체를 분리시켰다. 이 단계에서 봉입체는 -20℃에서 철야로 저장될 수 있다.

봉입체는 봉입체 습윤 중량 그램당 35 ml의 트리스 완충액 A-3에 재현탁되며, 이는 원심분리관(A-3 - 0.05M 트리스, 6.0gm/리터 H₂O, 1.21 mM 나트륨 데옥시콜레이트, 0.5gm/리터 H₂O, 2mM 디티오트레이톨(DDT), 0.31gm/리터 H₂O, 2mM EDTA, 0.74gm/리터 H₂O, 5%(v/v) 글리세롤, 50ml/리터 H₂O, 0.025%(v/v) Tween 80, 10ml 2.5% Tween 80 (A-2)/리터 H₂O, 최종 pH 9.0±0.2, 25℃)의 중량차에 의해 결정된다. 봉입체 펠릿은 폴리트론 균질기(Polytron homogenizer: Brinkmann)를 사용하여 완충액에서 재현탁된다. 재현탁된 봉입체는 Microfluidizer^R를 통과하여 완충액과 확실히 혼합된다. Microfluidizer^R를 통과시킨 후, 원심분리에 의해 봉입체를 수집하여다. 세정 방법은 트리스 완충액 A-3으로 총 3회 실행하였다. 세 번째 세정 완료시, 세정제 데옥시콜레이트 또는 Tween (A-4 - 0.05M 트리스, 6.06gm/리터 H₂O, 2mM 디티오트레이톨(DDT), 0.31gm/리터 H₂O, 2mM EDTA, 0.74gm/리터 H₂O, 5%(v/v) 글리세롤, 50ml/리터 H₂O, 최종 pH 9.0±0.2, 25℃)을 함유하지 않은 완충액 A-4에 펠릿 봉입체를 재현탁시켰다. 네 번째 및 마지막 세정은 트리스 완충액 A-4로 실행하였다. 원심분리 후에 조 생성물을 수집하고, 배수 건조시키며 -70℃에서 저장될 수 있다.

봉입체 필릿의 각 그램을 6M의 우레아, 0.05M의 트리스·HCl 및 1M의 염화 나트륨을 포함하고 pH 8.8인 완충액 7.5ml에 용해시켰다. 형성된 "가용화" vWF 물질은 약 200 kDa 또는 그 이상의 분자량을 갖는 가용성 응집물의 이종 집단을 나타낸다.

혼합물을 질소 분위기하에 두고, 디티오트레이톨(DDT)을 최종 농도 0.01M이 되도록 부드럽게 교반하면서 가하여 단편의 디술피드 결합을 감소시켰다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 암실에서 계속 교반시켰다. 요오도아세트이미드(Sigma Chemical Co.,St.Louis, MO)를 최종 농도가 0.05M이 되도록 가했다. 37℃에서 1시간 동안 암실에서 계속 배양시켰다. 부가적인 DDT를 부가하여 DDT의 최종 농도를 0.03M로 상승시켰다. 알킬화 vWF 단편을 함유하는 용액을 0.2 미크론 여과기를 통과시키고, 4℃±2℃가 유지되는 냉실로 옮겼다. 이어서 4℃의 냉실에서 이 온도로 미리 평형이 된 시약을 사용하여 정제과정을 실시하였다.

알킬화된 물질은 pH 8.0에서 6M의 우레아, 0.05M의 트리스·HCl, 1mM의 이나트륨 EDTA를 포함하는 완충액 부가에 의해 5배 희석시켰다. 수득한 용액은 알킬화 용액으로부터 이후에 실행된 0.2M의 NaCl을 함유한다. 회석 vWF 제조는 pH 8.0에서 6M의 우레아, 5mM의 트리스·HCl, 0.02M 염화 칼륨, 1mM의 이나트륨 EDTA를 포함하는 완충액으로 미리 평형된 음이온 교환(Q-Sepharose^R, Pharmacia, Uppsala, Sweden)에 적합한 4차 암모늄 측쇄를 갖는 45-165 미크론 비이드 형성된 아가로오스 입자의 252mm×150mm 칼럼상에서 크로마토그래피했다. 이러한 조건하에서 폰 빌레브란트 인자 단편은 Q-Sepharose^R에 결합하지 않았다; 그러나, 음으로 하전된 DNA 및 세균성 내독소, 지질 다당류와 같은 불순물은 결합되었다.

가용성 응집물 내의 폴리펩티드의 각 단량체 단위에서의 네트 하전은 상기 조건하에서 약 (-2)였다. 고 염 농도의 사용된 샘플과의 조합물에서 낮은 네트 하전은 응집물이 고정상에 결합하는 것을 막았다. 주로 가용성 응집물 집단인 미반응 분획 함유 vWF 단편을 0.2 미크론 여과기를 통하여 여과시키고 그 용액을 pH 3.5에서 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 시트레이트를포함하는 완충액을 첨가하여 10배 희석시켰다. 생성된 제제를 4℃에서 약 1시간 동안 유지시켰다. 이 기간 동안 가용성 응집물의 분리가 시작되어 단편 집단이 소형 응집물 및 단량체성 및 이합체성 분자로 되었다.

완충되지 않은 충분한 부피의 1.0M 나트륨 시트레이트를 부가하여 상기 제제의 pH를 4.8로 조정한 다음 제제를, 양성자화되지 않은 형태의 수지 카르복시 기를 유지하기 위해 필요한 pH와 단편의 등전 pH(약 5.5)에 너무 가까이 근접함으로써 단편 집합이 응집 상태로 후퇴하는 것을 피하기 위한 pH간의 절충으로 선정된 pH 4.8에서 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 시트레이트를 포함하는 완충액으로 미리 평형된 양이온 교환(CM-Sepharose^R, Pharmacia, Uppsala, Sweden)할 수 있는 카르복시메틸 측쇄를 갖는 45-165 미크론 입자로 형성된 비이드-형성 아가로오스 겔상을 통과시켰다. 이와 달리 3.0의 pH는 단편 집단을 이합체와 단량체로 만드는데 바람직하다.

이런 방법으로 로딩시킬 때, vWF 단편 생성물의 약 80-100%가 CM-Sepharose^R와 결합했다. 용출물에서 UV 흡수 물질(280nm에서 측정)이 더 이상 나타나지 않을 때까지 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 시트레이트를 함유하는 pH 4.8의 완충액으로 칼럼을 세정시켰다. 용출 완충액을 pH 4.8의 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 시트레이트, 0.15M 염화 나트륨으로 변경다. 소량의 부가적 UV 흡수 물질이 상기 용액의 칼럼으로부터 용출되어 나타났다. 세균성 내독소의 실질적인 잔류 양은 이러한 방법으로 제거되었다. 용출은 UV 흡수 물질이 더 이상 나타나지 않을 때까지 계속 되었다. CM-Sepharose-결합 분획은 이전 완충액에 존재하는 염화 나트륨이 완전이 없어질 때까지, pH 4.8의 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 완충액을 포함하는 완충액으로 세정시켰다.

정제된 결합 vWF 분획을 pH 3.0의 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 시트레이트를 포함하는 완충액으로 최종적으로 세정시켜 부가적인 소량의 UV 흡수 물질을 용출시켰다. 상기 물질이 더 이상 나타나지 않을 때까지 계속세정하였다. pH 3.0은 점유되지 않은 칼럼 카르복시기의 pKa 이하에서 양호하지만, 양으로 하전된 vWF 단편과 음으로 하전된 수지 간에 형성된 복합체는 실제로 지시된 시간 동안 이 pH에서 손상되지 않은 상태로 유지되었다. vWF 단편을 이 낮은 pH로 유지하는 것은 단편집단의 단량체화를 더욱 촉진시키도록 계속하여 단량체 및 이합체가 우세하게되고 가용성 응집물은 실질적으로 감소되었다. 단량체, 이합체 및 응집물의 백분율은 실시예 2의 방법에 따라 결정될 수 있다.

재조합 vWF 인자 단편을 6M의 우레아, 0.01M 나트륨 시트레이트를 포함하는 pH 3.0의 완충액을 사용하여 CM-Sepharose^R 칼럼으로부터 최종적으로 용출시켰다. UV 흡수 분획의 푸울로서 용출 피이크를 수집하고 0.2 미크론 여과기를 통해 여과시켰다. 단편의 용출된 집단은 가용성 응집물이 거의 검출되지 않게 50%의 이합체 및 50%의 단량체로 표시된다. pH 3.0의 시트레이트 이온은 평균적으로 2.5 양성자화된 카르복시기(시트레이트의 pKa₁는 3.08)를 갖는, 평균적으로 -0.5 네트 음전하를 갖는 것으로 나타났다. 시트레이트 이온은 양으로 하전된 단편에 대해 경쟁하여 단편-수지 복합물의 분해를 촉진시켜 부가적인 "고정"상의 역할을 수행한다.

용출 생성물을 한외여과에 의해서 약 10mg/ml 단백질로 농축시켰다. 농축된 생성물을 다시 약 0.2 미크론 일회용 여과기를 통하여 재여과한 다음, 얻은 물질을 pH 3.5에서 1mM 리신 모노히드로클로리드, 1.5mM 염화 나트륨, 1mM 시트르산, 5%(w/v) 만니톨을 포함하는 "배합물 완충액" 50 부피에 대하여 투석시켰다. 투석 완충액은 단량체화가 완결된 2-3일 동안 3회 반복되었다. 생성된 생성물(약 70%의 단량체 및 30%의 이합체를 함유, 실시예 2 참조)은 적당한 크기 0.2 미크론의 여과기를 통해 여과시키고, 병에 채워질 때까지 4℃에서 저장되었다.

정제된 vWF 용액내의 잔류 DNA 및 내독소는 각각 약 0.94 Eu/mg 단백질 및 0.15 Eu/mg 단백질로 측정되었다. DNA 분석은 E.coli DNA 샘플에 대해 혼성에 의해 수행되었다. 내독소는 리물루스 아메바양세포 세포 분해산물 시험 방법에 의해 분석했다.

멸균 용액을 20ml 용량 바이알의 약 4ml 부피 수준의 유형 I 플린트 유리 바이알(Wheaton Scientific, Millville, NJ)에 로딩시킨 후 실리콘화된 부틸 그레이 고무 동결건조 스토퍼(웨스트 컴패니 제조)를 충전된 바이알에 적용하였다. 이 바이알을 진공 동결 건조기(Hull Corporation, Hatboro, PA)에 놓고, -42℃로 냉동시킨 후, 12시간 동안 60미크론의 진공에 노출시켰다. 12시간 후, 샘플의 온도를 점진적으로(24시간에 걸쳐) 약 30℃로 증가시켰다. 이 온도 및 진공은 부가적으로 16시간동안 유지되었다. 멸균 건조 질소를 사용하여 챔버내의 대기압을 회복시킨 후, 바이알의 뚜껑을 덮었다. 열이 없는 물 4ml 부피를 사용하여 바이알을 복원시킬 필요가 있을 때 까지 바이알을 4℃에서 저장시켰다.

실시예 2 - 미응집 알킬화 vWF 단편의 제제가 이합체와 단량체간의 평형에 영향을 준다는 증명

상이한 총 단편 농도를 함유하는 미응집 알킬화 vWF 단편 샘플을 실시예 1의 방법에 따라 제조하여, 표준 배합물 완충액(pH 3.5에서 1mM 리신 모노히드로클로리드, 1.5mM 염화 나트륨, 1mM 시트르산, 5%(w/v) 만니톨)에 두고, 4℃에서 철야로 배양시켰다. 샘플을 분자량(크기) 배출을 기본으로한 크로마토그래피용 가교된 덱스트란 겔(Sephadex^R G-100, Pharmacia, Uppsala, Sweden)을 함유하는 칼럼에 적용시켜서 미응집 생성물을 포함하는 단량체 및 이합체의 백분율을 결정하였다.

일반적으로, 단편 샘플중의 가용성 응집물의 양은 G-100 칼럼상에서 공극 부피로 검출하는 것으로써 측정될 수 있다. 소량의 응집물(즉, 삼합체, 사합체)의 양을 측정하는 경우에도 G-50 칼럼이 사용될 수 있다.

2 ml 샘플 (1-11 mg/ml)을 4℃, 1.5×88cm 칼럼상에 로딩시켰다. 3ml 용출분획을 수집하고, 280nm에서 단백질의 농도를 측정했다. 단량체 단편 피이크는 분획 24에 거의 집중되었고 이합체는 분획 31에 집중되었다.

도 1은 배합물 완충액에서 철야로 배양시킨 후에 샘플에서 검출된 %단량체를 샘플에서 단편의 총 mg/ml의 함수로서 나타낸다. 도 1에 나타낸 직선 범위로부터의 외삽에 의해 vWF 단편을 약 20mg/ml 농도로 저장하면 이합체 생성물을 초래한다. 단량체인 치료용 생성물은 2mg/ml의 저장 농도 단편을 갖는 샘플로부터 생성될 수 있다. 따라서 단량체/이합체 평형에서 이동은 환자에 투여하기 적합한 저장 용액에서 미응집 알킬화 단편의 농도를 감소시킴으로써 생성되었다. 동결 건조 형태로 저정하기 전에 적당한 부피의 열이 없는 물을 사용하여 시험 용액이 복원될 수 있는지의 여부에 대해서는 유사한 결과를 얻었다.

단량체 단편이 이합체 단편보다 중량당 혈소판 응집 저해 효과가 크기 때문에, 배합물 완충액으로 주입하기 위해 제조된 vWF 단편의 치료 유용성은 약 2mg/ml과 같은 단편의 희석 농도로 저장 또는 복원시키는 것이 의해 증가될 수 있다. 본 발명의 바람직한 저장 용액에서 단편의 배합물은 생산물이 실질적으로 동결건조 및 재수화에 의해 영향을 받지 않는 생성물을 제공한다.

실시예 3 - 알킬화 vWF 단편의 생물학적 활성에 대한 응집의 효과

보쓰롭프스 자라라카(Bathrops jararaca)의 독으로부터 추출한 단백질인 보트로세틴은 체외에서 다량체 폰 빌레브란트가 혈소판에 결합되는 것을 촉진시킨다(Read 일행, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4514-4518 (1978)). 성숙한 vWF 소단위에서 보트로세틴의 결합 부위는 아미노산 서열 위치 445-733으 함유하는 영역 및 GPIb 결합 도메인내에 존재해 왔다(Andrews, R.K.일행, Biochemistry, 28, 8317-8326 (1989)). 보트로세틴이 vWF에 결합하는 것은 혈관계의 손상과 관련된 신호에 의해 체내에서 유도될 수 있는 구조적 변화를 vWF 분자 내에서 유도했다. 따라서, 알킬화 단편의 응집이 다량체 vWF에 의해 매개되는 혈소판의 응집 저해능에 미치는 효과는 보트로세틴-유발 분석법으로 시험되었다.

미응집 알킬화 vWF 단편은 단량체 및 이합체의 결합 농도를 나타낸다. 실제로 이합체의 백분율은 계산되지 않았다. 도 1을 참고하면, 실시예 1의 방법에 따라 정제된 미응집 알킬화 폰 빌레브란트 인자 단편의 샘플이, 배합물 완충액에 2 내지 8mg/ml로 저장된다면, 약 70%의 단량체와 30%의 이합체 알킬화 폰 빌레브란트 인자 단편을 함유함을 나타낸다. 이 실시예의 분석에 이용된 조건하에서 이합체는 단량체만큼 완전히 용해되지만, 혈소판 응집 억제에 있어서 이합체 단편의 효과는 중량기준해서 단량체의 약 절반이다.

따라서 알킬화 단편에 의한 응집 억제를 단량체와 이합체 농도(응집된 물질을 함유하지 않는 제제로부터)의 함수로서 측정하고, 응집된 제제에 의한 억제와 비교하였다. 응집 방법은 브린크후스의 방법을 변경한 것이다(K.M. 및 Read, M,S., Blood, 55(3), 517-520 (1980) 및 Fugimura 일행, I.Biol. Chem., 261, 381-385 (1986)).

이 방법에서는 특정 양의 보트로세틴 및 다량체 vWF가 특정 양의 혈소판을 응집시키기 위하여 사용되었고 그로 인해 100% 응집의 참고치가 정의되었다. 특정양의 알킬화 vWF 단편을 사용하여 다수의 서브유닛 vWF, 보트로세틴 및 혈소판을 포함하는 반응 혼합물을 생성하여 IC₅₀(보트로세틴 유도 혈소판 응집의 50%를 억제하는 vWF 단편의 유효 농도)이 측정되도록 하였다.

이 방법에서의 혈소판은 Marguerie, 일행, J. Biol. Chem., 254, 5357-5363(1979)의 방법에 따른 겔 여과 수법을 이용하여 제조한 다음 Allain, 일행, J. Lab. Clin. Med., 85, 318-328 (1975)와 방법의 변형 방법에 따라 고정하였다. 상기 변형은 다음을 포함한다; (1) 고정액으로서 0.5% 파라포름알데히드를 적용하고; (2) 그 후 실온에서 30분 동안 고정한다. 부가적으로, 혈소판의 현탁액을 pH 8.5에서 5mM EDTA로 처리(37℃에서 30분 동안)함으로써 당단백질IIb/IIIa 수용체 부위를 효능이 없게 하도록 혈소판을 처리하여 손상되지 않은 IIb/IIIa 수용체 복합체를 분해시켰다. 혈소판 응집의 억제는 제조자 지시에 따라 작동되는 혈소판 응집 Profiler, Model PAP-4 (BioData Co,,Hatboro, PA)에서 일정하게 교반(1000rpm)하면서 37℃로 유지된 실리콘화 유리 크벳에서 기록되었다.

분석은 하기와 같이 실행되었다. 분석 성분을 분석 배양에서 37℃에서 사용하기 전에 얼음에 유지시켰다. 분석을 개시하기 위해, 고정된 사람 혈소판(2×10⁸ml) 0.4ml을 크벳에 부가시키고, 37℃에서 4분간 배양시켰다. 배합물 완충액(0.1%의 사람 혈청 알부민 함유)에 용해된 소량 μl의 vWF 단편 또는 동 부피의 배합물 완충액-HSA(대조용)을 크벳에 가하여 37℃에서 1분간 배양시켰다. 도 2에 나타난 응집 도표를 참고하여, 30μl 배합물 완충액-HSA 샘플을 대조용으로 사용하고, 정제된 알킬화 단편의 일련의 희석물 30μl 양 (단편의 최종 분석 농도가 17.0, 8.5 및 4.3㎍/ml으로 됨)을 사용하였다. Newman, 일행, Br. J. Hematol., 21, 1-20 (1971)의 방법에 따라 제조된 천연 다량체 vWF를 각 크벳에 부가하고, 37℃에서 1분간 배양시켰다. vWF의 적당한 분액을 최종 vWF 농도가 6.3 ㎍/ml이 되게 반응 혼합물에 가하였다. 최종적으로 적당히 농축된 보트로세틴 총액 (Read 일행, Proc. Natl. Acad. Sic. USA, 75, 4514-4518 (1978))의 방법에 따라 정제됨)12.5 ㎕를 반응 혼합물중의 보트로세틴의 최종 농도가 8.2㎍/ml이 되게 가하고, 37℃에서 최종 1분간 배양시켰다. 응집 반응을 2분에 걸쳐 기록했다. 도 2에 증명되었듯이, 정제되고 미응집 알킬화된 vWF 단편(약 70% 단량체/30% 이합체의 집단을 나타냄)은 혈소판 응집 억제제로서 용량 의존 경향으로 효과적이다.

도 3은 미응집 단편(약 70% 단량체/30% 이합체 포함)과 응집 단편 물질을 응집 억제 효능에 대해 비교한 유사 실험을 나타낸다. 이 시험은 잠재적인 응집-억제 물질의 최종 농도인 7.3㎍/ml르 제공하는 농도의 vWF 단편 30μl양을 사용하여 실행되었다. 미응집 물질은 혈소판 응집 억제에 실질적으로 효과적이지만, 응집된 vWF-유도 물질은 그렇지 않다. 도 3에서, 이 실시예의 분석 조건하에서 약 7.3μg/ml 의 미응집 물질의 단편 농도(IC₅₀) (이들의 0.22μM과 등량)에서 50% 응집 억제를 수득했지만, 응집 형태는 상기 조건하에서 5% 이하의 억제 효과를 나타냈다.

실시예 4 - 결합된 α-나선 또는 β-쉬트 함량의 미반응 알킬화 vWF 단편의 가용성에 대한 효과

도 4에 만니톨 없이 표준 배합물 완충액을 포함하는 용액에서 알킬화 vWF 단편(pH 3.5 대 4.5)의 환형 이색성 특성을 비교하였다. 약 350nm로부터 스캐닝하여 Jasco, Inc. (Easton, MD) 모델 500A 분광 광도기내, 25℃에서 동일하게 농축된 샘플에 대해 스펙트럼을 생성시켰다.

알킬화 단편의 스펙트럼은 단편의 침전 때문에 pH 7.5의 1mM 인산염 완충액에서 측정될 수 없었다. 222nm 근처에서 총 회전에 대한 α-나선, β-병풍 쉬트 및 무작위 코일 영역의 영향은 측정되지 않았다; 그러나, 알킬화 단편은 pH 4.5에서 보다 pH 3.5에서 보다 더 정렬된 구조를 가짐이 분명한다.

실시예 5 - 친화성 크로마토그래피를 이용하여 미응집 형태의 알킬화 폰 빌레브란트 인자 단편의 제조

이 방법은 vWF 단편을 정제하고 단백질 및 DNA 불순물로부터 이들을 단리하는 헤파린 친화성 크로마토그래피를 이용한다. 이 방법은 (1) 하기에 언급된 바와 같이 vWF 단편의 봉입체 펠릿으로부터 용해된 가용성 응집물(전형적으로 200 kDA 또는 그 이상)을 용액에 방치하고; (2) 치료성 배합물에 받아들일 수 없는 불순물(세균성 DNA 및 내독소와 같은)을 제거하며; (3) 소형 응집물을 초래하는 일련의 단계로 단편의 "단량체화"를 개시하고; 또 (4) 생성된 미응집 물질을 재응집되지 않게 단편을 안정화시킨 배합물 완충액으로 제공하는 것으로 고안되었다.

봉입체 필릿 물질은 하기와 같이 적당한 E.coli BL21(DE3) pLysS의 배양물로부터 수득하였다. 50리터의 통기 배양액으로부터 세포를 얻고, 중공 섬유 미량 여과막 카트리지를 사용하여 농축시켰다. 2개의 Amicon H5MP01-43 여과 카트리지가 재순환 방식에 사용되었다. 세포를 Amicon 여과기에서 2 내지 4 리터의 용량으로 농축시키고, 그후, 세포를 Amicon 여과 기구에서 트리스 완충 식염수(0.025 M 트리스, 3.03 gm/리터 H₂O, 0.2M NaCl, 11.7 gm/리터 H₂O, 최종 pH 7.5±0.2, 25℃; 이하 A-1로서 지칭) 5 용량, 약 10 내지 20 리터로 투석여과에 의해 세정시켰다.

트리스 완충 식염수(A-1) 4리터로 여과에 의해 세포를 회수하였다. 세포 파쇄시 나트륨 데옥시콜레이트를 최종 농도가 0.5g/리터에 이르도록 세포 현탁액에 가했다. 세포는 수집하자마자 Microfluidizer^R(Microfluidics Corp., M-110 Microfluidizer^R)를 통과시켜 기계적으로 파쇄시켰다. 세포가 일단 Microfluidizer^R를 통과한 후, 두 번째 세제인 Tween80을 용균된 세포 현탁액에 가하여 1리터의 TBS에 용해된 2.5% Tween 80(v/v) 25ml를 사용하여 최종 농도가 0.025%에 이르게 했다. 이는 완충액 A-1을 따뜻하게 하고, Tween 80을 용액에 적가하고, 용액이 뚜렷하게 균질화될 때까지 혼합하여 실행되었다. 이 용액을 실온으로 냉각시키고, 파열 세포 현탁액에 부가하여 0.025%(v/v)의 최종 농도를 수득했다(이하, A-2). Tween이 처음 통과시 존재하면, Microfluidizer^R가 장애되므로 세포를 파쇄하기 전에 유통로를 세척해야 된다. 세포가 파쇄된 후, 현탁액을 원심분리(10,000×g; 35분, 4℃)시켜, 가용성 세포 파편으로부터 주로 생성된 봉입체를 분리시켰다. 이 단계에서 봉입체는 -20℃에서 철야로 저장될 수 있다.

봉입체는 봉입체 습윤 중량 그램당 35 ml의 트리스 완충액 A-3에 재현탁되며, 이는 원심분리관(A-3 - 0.05M 트리스, 6.0gm/리터 H₂O, 1.21 mM 나트륨 데옥시콜레이트, 0.5gm/리터 H₂O, 2mM 디티오트레이톨(DDT), 0.31gm/리터 H₂O, 2mM EDTA, 0.74gm/리터 H₂O, 5%(v/v) 글리세롤, 50ml/리터 H₂O, 0.025%(v/v) Tween 80, 10ml 2.5% Tween 80 (A-2)/리터 H₂O, 최종 pH 9.0±0.2, 25℃)의 중량차에 의해 결정된다. 봉입체 펠릿은 폴리트론 균질기(Polytron homogenizer: Brinkmann)를 사용하여 완충액에서 재현탁된다. 재현탁된 봉입체는 Microfluidizer^R를 통과하여 완충액과 확실히 혼합된다. Microfluidizer^R를 통과시킨 후, 원심분리에 의해 봉입체를 수집하여다. 세정 방법은 트리스 완충액 A-3으로 총 3회 실행하였다. 세 번째 세정 완료시, 세정제 데옥시콜레이트 또는 Tween (A-4 - 0.05M 트리스, 6.06gm/리터 H₂O, 2mM 디티오트레이톨(DDT), 0.31gm/리터 H₂O, 2mM EDTA, 0.74gm/리터 H₂O, 5%(v/v) 글리세롤, 50ml/리터 H₂O, 최종 pH 9.0±0.2, 25℃)을 함유하지 않은 완충액 A-4에 필릿 봉입체를 재현탁시켰다. 네 번째 및 마지막 세정은 트리스 완충액 A-4로 실행하였다. 원심분리 후에 조 생성물을 수집하고, 배수 건조시키며 -70℃에서 저장될 수 있다.

봉입체 펠릿의 각 그램을 6M의 우레아, 0.05M의 트리스·HCl 및 1M의 염화 나트륨을 포함하고 pH 8.8인 완충액 7.5ml에 용해시켰다. 형성된 "가용화" vWF 물질은 약 200 kDa 또는 그 이상의 분자량을 갖는 가용성 응집물의 이종 집단을 나타낸다.

혼합물을 질소 분위기하에 두고, 디티오트레이톨(BDT)을 최종 농도 0.01M이 되도록 부드럽게 교반하면서 가하여 단편의 디술피드 결합을 감소시켰다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 암실에서 계속 교반시켰다. 요오도아세트이미드(Sigma Chemical Co.,St.Louis, MO)를 최종 농도가 0.05M이 되도록 가했다. 37℃에서 1시간 동안 암실에서 계속 배양시켰다. 부가적인 DDT를 부가하여 DDT의 최종 농도를 0.03M로 상승시켰다. 알킬화 vWF 단편을 함유하는 용액을 0.2 미크론 여과기를 통과시키고, 4℃±2℃가 유지되는 냉실로 옮겼다. 이어서 4℃의 냉실에서 이 온도로 미리 평형이 된 시약을 사용하여 정제과정을 실시하였다.

알킬화된 물질을 pH 5.5에서 6M의 우레아, 10mM의 나트륨 시트레이트를 포함하는 용액으로 5배 희석시켜 150mM의 NaCl과 등가인 전도율로 만들었다. 필요하다면, 1M의 나트륨 시트레이트로 pH를 5.5로 맞췄다. 물질을 pH 5.5를 갖는 6M의 우레아, 10mM의 나트륨 시트레이트, 100mM의 염화 나트륨으로 평형이 된 헤파린 Sepharose 칼럼(Pharmacia에 의해 생산된 헤파린 Sepharose CL-6B, 생산물 번호 17-0467-01호)에 로딩시켰다. pH 5.5를 갖는 6M의 우레아, 10mM의 나트륨 시트레이트, 250mM의 염화 나트륨을 포함하는 용액으로 칼럼을 세척하였다. 생성물을 pH 5.5를 갖는 6M의 우레아, 10mM의 나트륨 시트레이트, 700mM의 염화 나트륨을 포함하는 용액으로 용출시켰다.

pH 3.5의 6M의 우레아, 10mM의 나트륨 시트레이트를 포함하는 용액으로 용출물을 약 7배 희석시켰다. pH를 3.5로 맞추고, 이 용액을 4℃에서 1시간 동안 방치하였다. 1M의 시트르산으로 pH 4.8로 맞추고 pH 4.8의 6M의 우레아, 10mM의 나트륨 시트레이트, 150mM의 염화 나트륨으로 평형된 CM Sepharodex(IBF에 의해 생산된 CM Sepharodex M, 목록 번호 제 262010호) 칼럼에 생성물을 로딩시켰다. pH 3.0의 6M의 우레아, 500mM의 나트륨 시트레이트로 칼럼을 세척하였다. 생성물을 pH 3.0의 6M의 우레아, 700mM의 나트륨 시트레이트로 용출시켰다.

멸균 용액을 20ml 용량 바이알의 약 4ml 부피 수준의 유형 I 플린트 유리 바이알(Wheaton Scientific, Millville, NJ)에 로딩시킨 후 실리콘화된 부틸 그레이고무 동결건조 스토퍼(웨스트 컴패니 제조)를 충전된 바이알에 적용하였다. 이 바이알을 진공 동결 건조기(Hull Corporation, Hatboro, PA)에 놓고, -42℃로 냉동시킨 후, 12시간 동안 60미크론의 진공에 노출시켰다. 12시간 후, 샘플의 온도를 점진적으로(24시간에 걸쳐) 약 30℃로 증가시켰다. 이 온도 및 진공은 부가적으로 16시간동안 유지되었다. 멸균 건조 질소를 사용하여 챔버내의 대기압을 회복시킨 후, 바이알의 뚜껑을 덮었다. 열이 없는 물 4ml 부피를 사용하여 바이알을 복원시킬 필요가 있을 때 까지 바이알을 4℃에서 저장시켰다.

본 발명을 실시하는데 유용한 균주의 기탁

하기 균주의 생물학적으로 순수한 배양주의 기탁은 부다페스트 조약하에서 미국 매릴랜드 로크빌레 파크론 드라이브 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉숀(American Type Culture Collection)에 기탁되었다. 생존 시험 성공후 수탁 번호가 부여되었으며 필수요금도 지불되었다.

상기 배양주에 대한 접근은 본 특허 출원이 진행되는 동안 37 C.F.R. ∬1.14 및 35 U.S.C. ∬122 이하에서 미국 특허청 장관에 의해 결정된 사람에게 가능하거나 또는 그러한 접근이 부다페스트 조약에 의해 요청되는 경우에 가능할 것이다. 상기 배양주의 공중의 이용가능에 대한 모든 제한은 이 출원을 기초한 특허가 사정되면 결정적으로 제거될 수 있고, 상기 배양주는 가장 최근의 샘플 분양 요청이 있은지 5년 이상 동안 및 기탁일로 부터 30년 동안 영구적으로 분양가능하다. 배양주가 생육할 수 없게되거나 또는 돌연히 파괴된다면, 이들은 동일 분류 기재의 생육 가능한 배양주로 대체될 수 있다.

균주/플라스미드 ATCC 번호 기탁일

BL21(DE3)

pLysS/pET-8c52K(Km^R) 68306 1990. 4. 17

Claims

(A) 시스테인 변형된 vWF 단편, 변성제 및 소망하지 않는 불순물을 포함하는 산성 수용액을 제공하고;

(B) 상기 용액을 상기 vWF 단편이 접착되는 헤파린-함유 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시킴으로써 상기 용액으로부터 상기 불순물을 분리하며;

(C) 변성제 존재하에서 상기 친화성 크로마토그래피 매질로부터 상기 vWF 단편을 용출시키고; 또한

(D) 단편의 수용액을 2.5 내지 5.5의 pH로 유지하면서 상기 변성제로부터 용출된 단편을 분리하여 상기 단편의 단량체화를 증가시키고 또한 응집을 감소시킴으로써 응집물이 실질적으로 존재하지 않는 vWF의 수용액을 형성하는 것을 포함하는, 응집물이 실질적으로 존재하지 않으며, 아미노산 잔기 445에서 아미노 말단 잔기를 갖고 또한 아미노산 733에서 카르복시 말단 잔기를 갖는 vWF 단편의 수용액의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (B) 단계가 6.0 미만의 pH에서 수행되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 vWF 단편의 공급원이 숙주 세균 세포에서 발현된 재조합 DNA 분자인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 시스테인 변형된 vWF 단편이 재조합 vWF 단편 및 변성제의 수용액을 알킬화 조건에 처리하여 알킬화된 vWF 단편을 형성하는 것에 의해 제조되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 변성제가 우레아인 방법.
제 1항에 있어서, pH 2.5 내지 5.5인 상기 단편의 수용액이 75 mM 이하의 전체 이온 농도를 갖는 방법.
pH 6.0 미만에서 수행되는 헤파린 친화성 크로마토그래피에 의해 단리된 단량체성 시스테인-변형 vWF 단편의 이합체화를 억제하는 방법에 있어서,

상기 단편은 아미노산 잔기 445에서 아미노 말단 잔기를 갖고 또한 아미노산 잔기 733에서 카르복시 말단 잔기를 갖고,

상기 이합체화는 2개 이상의 성숙 vWF 서브유닛의 결합을 용이하게 하는 한개 이상의 이온성, 소수성 또는 수소 결합을 포함하며,

상기 방법은 pH가 2.5 내지 5.5이고, 10 mg/ml의 단편을 포함하며 또 이온의 부가 종(있다면)에서 전체 농도가 75 mM 이하인 단량체성 시스테인 변형된 vWF 단편의 수용액을 형성하는 것을 포함하는 방법.
(A) 재조합 수단에 의해 제조되고 또한 소망하지 않는 세균성 불순물을 함유하며 pH 6.0 미만인 우레아 및 vWF 단편의 수용액을 제공하고;

(B) 상기 용액을 vWF 단편이 접착되는 친화성 크로마토그래피 매질과 접촉시킴으로써 상기 용액으로부터 상기 불순물을 분리하며;

(C) 상기 vWF 단편을, 상기 vWF 단편이 상기 친화성 크로마토그래피 매질의 헤파린으로부터 분리되도록 수성 염 용액과 접촉시킴으로써 변성제 존재하에서 상기 친화성 크로마토그래피 매질로부터 상기 vWF 단편을 용출시키고; 또한

(D) 단편의 수용액을 2.5 내지 5.5의 pH로 유지하면서 상기 변성제로부터 용출된 단편을 분리하여 상기 단편의 단량체화를 증가시키고 또한 응집을 감소시킴으로써 응집물이 실질적으로 존재하지 않는 vWF의 수용액을 형성하는 것을 포함하는, 응집물이 실질적으로 존재하지 않으며, 아미노산 잔기 445에서 아미노 말단 잔기를 갖고 또한 아미노산 733에서 카르복시 말단 잔기를 갖는 vWF 단편의 수용액의 제조 방법.
제 1항에 기재된 방법을 이용하여 제조되며, 응집물이 실질적으로 존재하지 않고, 아미노산 잔기 445에서 아미노 말단 잔기를 갖고 또한 아미노산 733에서 카르복시 말단 잔기를 가지며, 그 농도가 1 내지 30 mg/ml인 시스테인-변형된 vWF 단편의 수용액.
제 9항에 있어서, 상기 vWF 단편의 시스테인 잔기가 블로킹되거나(blocked) 또는 제거되는 수용액.
제 9항에 있어서 상기 시스테인 잔기가 알킬화되는 수용액.
제 11항에 있어서, 상기 알킬화된 vWF 단편의 공급원이 숙주 세균 세포에서 발현된 재조합 DNA 분자인 수용액.
제 11항에 기재된 수용액을 재수화 및 동결건조시킴에 의해 형성되며, 응집물이 실질적으로 존재하지 않는 알킬화된 vWF 단편의 수용액.
제 11항에 기재된 수용액을 냉동 및 해동함에 의해 형성되며, 응집물이 실질적으로 존재하지 않는 알킬화된 vWF 단편의 수용액.
제 9항에 있어서, 상기 시스테인 잔기가 점 돌연변이된 (point mutated) 수용액.
제 9항에 있어서, 상기 단편의 40 내지 100 중량%가 단량체 형태인 수용액.
제 1항에 기재된 방법을 이용하여 제조되며, (A) 1 내지 30 mg/ml의 용해된 vWF 단편; (B) 10 mM 이하의 무기 염; (C) 15 mM 이하의 부가적 이온성 화합물; 및 (D) 10 mM 이하의 완충액을 실질적으로 포함하고, 2.5 내지 5.5의 pH를 가지고, 아미노산 잔기 445에서 아미노 말단 잔기를 갖고 또한 아미노산 733에서 카르복시 말단 잔기를 가지며, 사람에게 투여가능한 형태를 갖는 시스테인-변형된 vWF 단편의 치료성 수용액으로서, 상기 수용액내의 이온성 물질 (상기 단편을 제외한)의 총 농도가 75 mM 이하인 수용액.
제 1항에 기재된 방법을 이용하여 제조되며, 1 내지 30 mg/ml의 농도에서, 아미노산 잔기 445에서 아미노 말단 잔기를 갖고 또한 아미노산 733에서 카르복시말단 잔기를 갖는 시스테인-변형된 vWF 단편, 0.5 내지 10 mM의 시트르산, 0.5 내지 15 mM의 리신 히드로클로라이드, 0.5 내지 10 mM의 염화나트륨, 만니톨을 포함하고, 2.5 내지 5.5의 pH를 갖는, 혈전증을 치료하기 위한 약학 조성물.