JPS59161321A - 沈澱異種蛋白質の精製及び活性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換ＤＮＡ技術により、外因性もしくは外来（異種）蛋
白質を細菌及びその他の宿主細胞中で光用することが可
能になった。成る条件下において且つ成る蛋白質の場合
、これらの異種蛋白質は細胞内で「屈折体（ｒ（１！ｆ
ｒａｃｔｉｌｅ　ｂｏｄｙ　）　Ｊとして沈澱する。本
発明は、これら異種蛋白質を回収し且つ必要に応じこれ
らの活性型を回復する方法に関するものである。

例爽ば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ウシ成長ホルモ
ン（ｂＧｌ−１）及び多数のインターフェロンを含めて
多くのヒト、哺乳動物及びその他の蛋白質が、これら蛋
白質をコードしているＤＮＡで゛宿ニド１ｉ１１胞を１
ヘランスフエクトし且つ得られた細胞を新規な異種蛋白
質の発現に好適な条件下で増殖ざＵることにより、宿主
細胞内で産生されている。

同様に適当な組換ＤＮＡで処理された宿主内で産生され
た異種蛋白質の他の例としては、ウィルス外殻蛋白質例
えば口蹄疫（ＦＭＤ）ウィルスのカプシド蛋白質及びＢ
型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）蛋白質がある。

異種蛋白質はしばしば細胞内部で沈澱して全細胞蛋白質
の相当な部分を１７４成づる。

多くの手習なブースの場合、例えばｈＧ　’ｌ−１、ブ
タ成長ホルモン（−ｐＧｌ−１）、　　ｂＧＨ，Ｆ、Ｍ
Ｄ及びＩＪｉ　ｆ？Ｉｆ芽細胞インターフェロン（ＰＩ
Ｆ）等の場合、産生された異種蛋白質は多量に存在する
だ（プでなく、「屈折体」として細胞内で沈澱すること
が観察されている。「屈折」という用語を使用する理由
は、これらが位相差顕微鏡を用いると実際に目祝し得る
からである。１０００侶程度の倍率で、これらの沈？１
ＡＩＪ５白’ｆ４　（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ　ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）は細胞の囲いに包囲されて明るい斑点どし
て見える。

所望の蛋白質がこの種の屈折体の形態である場合、これ
らの回収には多くの問題が伴う。第１に、当然のことで
あるが、細胞内に包」」されている屈折蛋白質を、これ
を隠蔽している細胞物質及び細胞蛋白質から分離する必
要がある。第２に、多くの場合、屈折体はほとんどが所
望の異種蛋白質で極く少量の不要な蛋白質とを含んでい
るが、成る場合には、多量の夾雑蛋白質が存在し、この
ため所望のポリペプチド配列を単１するにはこれらを除
去しな【プればならないであろう。第３に、恐らく最も
面倒なことであるが、屈折体蛋白質はしばしば、所望の
蛋白質としては同定され得るが生物学的には不活性な形
態である。所望の蛋白質が不活性になるのは、細胞内）
Ｌ澱の前又は後、或いは単離工程の際に異種蛋白質が誤
って折り畳まれ（白ＩＣ０ｒｒｅｃｔ　ｆｏｌｄｉｎｇ
）または誤った立体配座（ＣＯｎｆＯｒｍａ［！Ｏｎ）
で僅成されるためと考えられる。

本発明者等は、これらの問題が、種々の面で、宿主細胞
夾雑蛋白質を除去し、沈澱した屈折蛋白質を可溶化し、
異種蛋白質の生物学的検定において活性な形態を回復し
得る方法を使用することにより、克服し１７ることを知
見した。

本発明は一般化してきた問題に対する７ｉ７（ホ的解決
の種々の面に係る。即ち、宿主細胞で産生され、宿主細
胞に対し異種であり、且つ、屈折体即ち不溶性蛋白質凝
集睨として細胞内部に少なくとも部分的に析出（ｄｅｐ
ｏｓｉｔｉｏｎ）　Ｌ／ている蛋白質を活性型で回収す
る方法に係る。本発明により、屈折体が形成されている
細胞培養物（ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ）から異種蛋白
質を回収するための有効な手段が提供される。この方法
を種々の可能な経路を含めて第１図に模式的に示す。

簡単に説明すれば、第１図の方法は幾つかの工程を有す
る。先づ゛、細胞が充分に破砕されれば宿主細胞蛋白質
が可溶化されるか或いは少なくどし低速遠心分離で沈降
しなくなるような充分な−（Ａン強度と適性なｐｌ−１
の条件下で、細胞外’Ｉ　／　Ｕｓ！を破砕する手段を
用いることにより、沈澱した不溶性蛋白質を細胞から遊
離さ′ｔ！ろ。これにより、遠心分離の際、所望の屈折
蛋白質がベレットとして蓄積され、夾雑蛋白質の大部分
は上清中に残存する。しかしながら、このベレン１〜は
幾つかの理由で゛夾雑蛋白質を含有する。第１に、元々
の屈折体が完全には所望の蛋白質のみで溝成されていな
い。

Ｍ′１２に、細胞壁又は膜の断片が充分に破砕されてい
ないと、それらはペレッ１〜と共に残留しペレッ１への
顕微鏡検査においても検出されない。とはいうものの、
生成するペレッ１へは主として所望の蛋白質であり、酵
素学的研究で使用される標準的な蛋白質精製法に於ける
状況とは異なり、問題は複合混合物の少量成分を単離す
ることではなく、基本的に純粋な生成物から夾雑物を除
去でる問題となる。

（成る場合には、特にヒ１〜成長ボルモンの場合、細菌
又はその他の宿主生物により産生される異種蛋白質は、
細胞が増殖し且つ蛋白質に対する遺伝子が発現される際
、部分的にのみ屈折型となる。

この」、うな場合には、破砕する前の細胞を、組換ＤＮ
Δで形質転換された細胞に関づる安全４ｔ、を直に応じ
て細胞を死滅さぜるにうに従来設計された方法で処理す
ることにより、ペレツ１〜中に含有される所望蛋白質の
量が増大することが見出された。

即ち、例えば酸、熱又は非極性溶剤処理のような技術に
Ｊ：す、一部可溶な蛋白質が完全に不溶化されるであろ
う。） 主として所望の蛋白質である調製物が得られた後に残存
する問題は、蛋白質を、場合によっては更に精製し、生
物学的活性が利用できるような形態で回収せねばならな
いことである。

蛋白質は生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）細胞質条件下におい
て沈澱したのであるから、従来の可溶化技（・Ｉ：ｊて
はうまくいかないことが明らかである。従って、この蛋
白質を溶解させてこれを使用し得るようにするには、よ
り苛酷な手段が必要である。このためには強力変性溶液
が有効であると判明した。しかしながら、得られる溶液
からは、生物学的に活性な調製物が得られることもある
が得られないこともある。

強力変性剤（ｓｔｒｏｎｇ　ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）と
可溶化した屈折蛋白質との両者を含有するこの溶液を使
用して、適当な検定法により示される生物学的活性を回
収づるという問題を扱う際、最もｒ明白」な方法は成功
を収めることができない。即ち、必要に応じて多Φの同
じ「溶剤」、つまり強力変性溶液−Ｃ再び希釈して生物
学的試験に対する適切な濃度を得ることは明らかに望ま
しくない。何故なら、強力変性剤自身が生物学的活性を
阻害するからである。又、希釈用緩衝液又は水による溶
液の希釈も、屈折蛋白質が殆／υど常に再沈澱してし７
まうので行なうことができない。更に、希釈によって沈
澱が生じない場合でも、予想される活性レベルが示され
ないｔどもしばしばである。

生物学的に活性な産物を回収づるために本明糧「ｒＩ中
に記載した一般的精製方法に合致覆る有効な方法の数（
よ限られている。これらの１つ１ユ強力な変性剤をより
弱い変性剤と交換し、次いでこの弱い変性剤の濃度を減
少させることである。この方法によ、れば、屈折蛋白質
の溶解瓜が保持されると共に、生物学的活性を阻害しな
いような媒イホが１ｑられるＣ′あろう。成る場合には
この方法の１）では正の生物学的活性が得られないこと
が見出されたが、他の場合には活性が１９られることｂ
ある。［）蹄疫（ＦＭＤ）ウィルス外殻蛋白質を包含し
て生成された融合蛋白質はこの例の１つＣある。これ１
　　　　は、動゛物成長ホルモンに関する場合もそうで
あると思われる。これらの状況が生ずる場合には、ペレ
ットを強力変性剤に溶解させ、緩衝族を弱い変性剤に、
交換するか又は限界希釈（１１ｍ１ｔｅｄｄｉｌｕ−ｔ
ｉｏｎ）によりカオトロビスム（Ｃ１１ａＯｔｒＯｐｉ
Ｓ…）を弱め、更に所望により慣用技術を用いてこれを
精製し、最後により稀Ｈな溶液に徐々に緩衝液を交７％
　（ｂｕｆｆｅｒ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）すれば充分であ
る。

然しながら、現在知られているデータによれば、この方
法で生物学的に活性な蛋白質を回収し１ｑるのはむしろ
例外であると想われる。多くの場合、溶解している蛋白
質を「再生づ−る＜　ｒｅｎａｔｕｒｅ）　Ｊには、明
らかに、より・積極的な工程が必要とされる。変性（ｄ
ｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）が生じた（７）　ハ、■菌内
で゛の元々の誤った折り畳み又は単離条件文（漏その両
者によるものである。いずれにせよ、ジスルフィド結合
の再形成の前に弱い変性剤まで緩衝液交換する（ある場
合にはこれだ（プで充分である）ことを必要とする下記
の３つの方法の１つを用いて、得られた蛋白質の折り畳
みを解き（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）月つ再び折り畳む（ｒ
ｅｆｏｌｄｉｎｇ）のが賢明であると思われる。第１の
方法に８５いては、単に、ジスルフィド結合からスルフ
ヒドリル基への変換を保証覆る還元条件下で蛋白質を更
に精製すると、蛋白質自身がこの精製条件下で再び折り
畳Ｊ：れ、次いで蛋白質が適切に折り畳まれた後、空気
又は他の酸化剤によりジスルフィド結合を再形成する。

第２の方法では、誤って形成されている可能性があるジ
スルフィド結合を蛋白質のスルボン化により切断し、こ
の蛋白質を再びより好適な条イ′１下て゛折り畳み、次
いで還元型及び酸化型（ジスルフィド）の両形態のスル
フヒドリル試某を用いてスルボネート基を除去してジス
ルフィド結合を再形成する。第３の方法では、単に適切
な溶液環境の存在下且つスルフヒドリル−ジスルフィド
の組合せの存在下で再び折り畳み、スルフヒドリル及び
ジスルフィドを一定に形成し且つ再形成する。

いずれの場合にも、この［再生法（ｒｅｎａｔｕｒａｔ
ｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ）　Ｊは、蛋白質を更にｒｉ′ｌ
製する工程、即ちペレットから単に溶解させた後に含有
する少量の夾雑物を除去する工程と共に行なうと最良で
ある。

本発明は、種々の面において、異種蛋白質の製造にス・
ｊづ−る好適な手段を提供する。

−面において、本発明は、宿主細胞の懸濁物を　　−溶
解し、次いで低速遠心分離により屈折体を回収すること
によって、背景宿主細胞夾９１Ｅ蛋白質から屈折蛋白質
を単離する方法にβ１づ−るものである。

このｉｌ′ｉ′ｉ製工程に続いて、細菌細胞壁断片、断
片細−胞又は全細胞が存在するか否かを決定するため調
製物を顕微鏡下で検査することができこうすると有利で
ある。

他の面において、本発明は、屈折体の単離前に、屈折型
で沈澱する異種蛋白質の量を増大させる方法に関するも
のである。この方法は、宿主■胞培養物の懸濁物を、例
えば高濃度の酸、熱又は低深度の非極性有機溶媒のよう
な殺菌手段で処理することを含む。この「殺菌（死滅）
」処理により異種蛋白質が更に沈澱し、次いで本発明の
詳細な説明する方法により増大した量の沈ｊｆＧ蛋白質
を回収する。

第３の面において、本発明は、強力変性溶液中に可溶化
させることによｈ屈折蛋白質を使用可能な形態で回収す
る方法に関するものである。この方法は、所望の屈折蛋
白質を回収する前（こ、宿主細胞の懸濁物を適当なイオ
ン強度の緩衝液中で処理して宿主細胞蛋白質を可溶化さ
せるというイ」加工程を含んでいる。

第４の面において、本発明は強力変性溶液中に予め可溶
化された屈折蛋白質を、好ましくは還元剤の存在下で□
、更に精製する方法に関し、この方法は、分子篩又は高
速遠心分離のいずれかを用（１て大分子母夾雑物を分離
除去することから成ってい゛る。

更に他の面において、本発明は、強力変性溶液に既に溶
解された異種蛋白質を利用し或いは更に精製Ｊ−る工程
に関し、この工程では、拓釈により或いは弱い変性剤と
の交換により、場合によってはｊ＝還元剤存在下で、変
性用媒体を弱めることににり溶）１りを改変する。弱い
変性条件の影響下で、成る場合には還元剤により促進さ
れて、再度折り畳みが行なわれ得る。弱い変性剤で置換
することは、強力変性環境では行なえないようなｌ″ｈ
製及び／又は再生工程が行なえるようになるという意味
でも右利である。

この種の置換は、カオトロピック特性が本質的により弱
い変性剤の対応する８力度に対して緩衝液を交換する（
例えばグアニジンを尿素で交換する）ことにより、或い
はく当該蛋白質の溶解度特性に応じて可能ならば）同じ
強力変性剤を減少濃度まで希釈覆ることにより、行なう
ことがでいる。

本発明の更に他の面は、弱い変性用媒体の存在下で行な
われる特定の再賦活法に関するものである。−この方法
に８５いては、強力変性溶液中に可溶化された屈折蛋白
質を亜硫酸イオンの存在下で緩和（温和）な酸化剤によ
り処理づる。これにＪ：す、システィン及びシスチンを
含有する蛋白７′１が蛋白１９　　Ｓ−スルホネ−１〜
に変換される。次いで強力変性溶液を弱めると再び折り
胃みか起こり、例えばβ−メルカプ１〜エタノール又は
３Ｗ元型ゲルタデΔンのようなスルフヒドリル化合物を
用い、対応するジスルフィド（酸化）型のイｒ在下でジ
スルフィド結合を再形成する。

他の面にＪ３いて、強力変性剤に溶解（可溶化）した蛋
白質は、更に、強力変性剤を弱い変性剤で交換し且つ主
としてスルフヒドリル化合物と少ωのジスルフィド型と
の混合物で処理することからなる再折り昏み、即ち、［
酸化還元緩訂液（’ｒｅｄｏｘｂｕｙｅｒ）　ｊ中での
一工程再折り畳み法により処理される。

更に他の面において本発明は、例えばβ−メルカプトエ
タノールのような）７元剤の存在下で処理し、次いでこ
の変性還元剤を透析又はその他の適当な手段により除去
する精製方法に係る。空気をＪＪＩ除するのに問題がな
（ブれば、空気を使用して蛋白質を再酸化しジスルフィ
ド結合を再形成づ−ることかできるが、この結合再形成
は還元剤が存在する場合には抑制されている。

更に、本発明は、宿主細胞培養物中に沈澱した異種蛋白
質の１標準的」多段階精製法にも関するものであり、こ
の方法は、可溶性の背景（夾雑）宿主蛋白質を適切なｍ
　濃度及び１１Ｈの溶液中で除去し、次いで還元剤を含
有する変性溶液中に異種ｔ　　　沈澱蛋白質を可溶化さ
せ、そして所望蛋白質を再生型（ｒｅｎａｔｕｒｅｃｌ
　ｆｏｒｍ）として変性溶液から回収づ゛るという多段
階の工程からなっている。所望蛋白質を更に精製するた
めの１寸加工程は任意であり、多数の慣用技術から）巽
択し得るが、還元剤の存在下で行なわれる。これらの工
程は、例えばゲルパーミェーションクロマトケラフィー
によるサイズ分画及びイオン交換樹脂示差吸希（ｄｉＨ
ｅｒｃｎｔｉａｌａｄｓＯｒｌ）ｔｉｏｎ　）による所
望でない蛋白質の除去からなっているのが！！７７　Ｊ
：　Ｌい。

本発明のこの面は、生物学的性質とは無関係に宿主細胞
培養物中の沈澱異種蛋白質に適用され、従って、所望生
産物に対する装置要件（ｅｑｕｉｐ−ｍｃｎｔ　ｒｅｑ
ｕ’ｉｒｅｍｅｎｔｓ　）の一様性（ｕ旧ｆｏｒｍｉｔ
ｙ）が得られるという利点を右する一般的方法を提供す
る。この方法は、−′般に、特定蛋白質に応じて要求さ
れる僅かの修正又は調整を行なうだけで適用することが
できる。

最後に、本発明の種々の局面を適当に組合せ且つ選択す
ることにより、屈折体蛋白質に関する問題が解決できる
。

Ａ、定義 し異種」蛋白質という用語は、宿主細胞では通常全く産
生されないか或いは通常極く少量しか産生されないよう
な蛋白質を指で、組換ＤＮＡ技術及びその他の例えば点
突然変異のような標準的遺伝子操作の出現により、トラ
ンスフエフ１〜した宿主細胞培養物から異種蛋白質を若
苗に産生することが可能になった。実際、これらの異種
蛋白質は、しばしば、宿主細胞蛋白質の溶ｒｉ！度を維
持する条件下で沈澱するような量、で産生される。

成る場合には、発現蛋白質の非溶解性により、これら蛋
白質は、宿主細胞中で所謂「屈折体」、即ち光を屈折し
、位相差顕微鏡で見た場合に明る−い斑点として見える
ような物体として存在覆る。

このため、これら（ｈ白質はしばしば「屈折体蛋白質」
又は「屈折体蛋白質」と呼ばれる。

本発明は、宿主刑０胞中に１屈折体」として田川した蛋
白質を単離し、精製し、月つ必要に応じ再賦活りるのに
有用な方法に係る。本発明の一部一１、この種の屈折体
生成に好適な方法に関づるが、水門１１１書に記載ザる
蛋白質の回収及び活ｊ生化プノー法は、この種の屈折蛋
白質に特定的に適用し賀るＪ、うに行なわれる。

水門ＭＯ出にｄ−３いて、「屈折」、「所望」及び「異
種」という用語は互換的に使用されており、外来宿主に
おい−Ｃ発現され、参照される時点におりる蛋白質の物
理的状態とは無関係に、発現又は精製の成る段階で位相
差顕微鏡により沈澱物として観察される蛋白質を急、味
する。例え（ま、Ｉ”ｆｉｉ！ｌバ］蛋白質という用語
は、成る場合には＼本発明の方法にＪ：り屈折型から可
溶型に変換された後のこの蛋白質を意味するためにも使
用される。

細菌宿主細胞で発現される各種の異種蛋白質、例えばρ
ＧＨ，ｈＧ＋−１並びにウィルス外殻蛋白質、例えばＦ
ＭＤウィルス蛋白質との融合蛋白質及び１−ｌＢ５Ａｇ
は、一般的な培養条件下で多かれ少なかれ屈折体を形成
する。例えば、免疫インターフ」、ロン（ＩｉＦ）及び
白血球インターフェロン（ｌｃＪＦ）のよう、な他の成
る種の蛋白質は、細胞質中てより可溶性である。（しか
しながら、繊維芽細胞インターフェロン（ＰＩＦ）は宿
主Ｊ菩養物中で屈折性である。） 「宿主細胞」は、異種蛋白質の単離に関する方７人の３
１明にＪ３いて出発物質の意味で使用づ−る場合、その
ような方法に細胞を使用し得る任意の形態を包含する。

例えば、収穫した細胞ペーストの他に、全細胞培た物、
ペース１への凍結試料又はペース１への凍結及び解凍試
わ１を朝会する。従って、［絽笥溶液中Ｃ′宿主細胞を
処１ｑ＋するｊという表現（ま、例えば全培養ブロスの
操作、或いは回転沈降（ｓｐｉｎｄｏｗｎ）　Ｌ／た細
胞を用いる調製を意味りる。

木明ａ＋　Ｆｊで使用づる［再賦活（ｒｃａｃｔｉｖａ
ｔｉｏｎ）　Ｊトイう用語ハ、［再折畳み（ｒｃｆｏｌ
ｄｉｎｇ）　Ｊと０う用語と（Ｊぼ同意語であり、即ち
、立イホ配座−Ｌ活性型にづ“ることにより蛋白質調製
物に対りる生物学的活性を確保することを意味りる。［
−再賦活」は、本明細書中に記載づるように、アミノ酸
配列は変化ぼず、即ち、例えばペプチド先駆１木がその
活性型まで開裂で−るような「活性化（ａ員ｉ　ｖａ−
１ｉｏｎ）　ｊ　、例えばトリプシノーゲンから１−リ
ゾシンへの変換又はプロレンニンからレンニンへの変換
は包含しない。

「生物学的活性」という用語は、生体内（ユＬ匹）にｊ
５りる蛋白質の活性、その機能を試験するよう設計した
↑員用の試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）及びｉｎ　ｖｉ
ｖｏの生物学的検定におりる活性、免疫反応を示すその
能力、又は天然蛋白質（ｎａｔｉｖｅ　ｐｒｏ−ｔｅｉ
ｎ）に対づ゛る抗体と反応する蛋白質の能力を意味する
。蛋ｐ賀は成る場合には、例え１ま゛適当な抗体どの反
応性につぎ試験した場合には「生物学的に活性」である
が、機能検定において【ユ活性でないことに注目すぺぎ
である。しかしながら、抗体反応は一般に最も簡潔且つ
容易に行なわれる検定法であるため、時に「活性」の便
利な尺度として使用される。

「イオン強度」という用語は、水溶液中のイオン濃度の
慣用の尺度を意味する。これは、各イオンの濃度どイオ
ン電荷故（イオン価）の平方との積の和く溶液中の全イ
オンにつき）の１／２と定義される。

「変佐溶ンｐｊ　（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ　５ｏｌｕｔ
ｉｏｎ）　Ｊという用語は、「変性剤（ｄｃｎａｔｕｒ
ａｎｔ）　ｊを含有覆る溶液を意、味ブーる。本発明で
使用する「変性剤Ａとはカフ１−１〜に」ピック性の化
合物又は物質を意味し、水溶液中適当な濃度で、蛋白質
表面での変化により、例えば水和状態、溶媒環境の変化
により、或いは溶媒−表面相互作用の変化（ごより、蛋
白質の空間配向即ぢ立体配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ）を変化させる槍 ことができるものである。この種の変性剤の例は尿水、
グアニジン塩酸塩、ヂＡシアン酸す１ヘリウム並びに例
えばＳＤＳ及びトリトン のような洗浄剤を包含づ−る。然しながら、高’Ｉ：ｕ
’＋及び強酸度のような苛酷月っ不可逆的な変性工程は
包含しない。

′」上記した試薬の幾つかは強力な変性剤であり他のも
のはより弱い変性剤であること、並びに、勿論こーれら
の濃度はその強度及び効果に直接影響を与えることが特
記される。Ｆ強力づと「弱いコとの間の特に正確な境界
線は存在しないが、強力変性条件では、連鎖に治って親
水性と疎水性との領域を有するアミノ酸配列が生Ｉ！Ｉ
Ｉｊ的条件下で自発的にとるいかなるＸ′Ｌ体配座から
でもより完全に蛋白質の［折り畳みが解かれる（ｕｎｆ
ｏｌｄ）、」。屈折蛋白［Ｉを溶解ざＵるのに有用な最
も一般的に使用される強力変性環境は、がなり高い濃度
（　４〜９Ｍ）のイＡ＞性変性剤、即ちグアニジン塩酸
塩である。

尿素は最もよく使用される弱い変性剤の例であっ−（、
かなり高ｅ度（例えば７Ｍ）でも成る種の蛋白質二次４
１′，Ｓ造を保持づることができ、［天然（ｎａｔｉｖ
ｃ）　Ｊ立体配座まで再折り尋みＪ−ることができる。

又、例えばイオン交換技術を同時に使用づる本発明のこ
れら局面での使用に有意銭な非イオン性のものもある。

したがって、「強力変性」溶液という用語は、同（、ｕ
に溶液中に溶解された蛋白質の「折り畳みを効果的に解
く」溶液を意味する。折り畳みの解除（　ｕｎｆｏｌｄ
ｉｎｇ）は化較的広範囲に亘るが、可逆的である。この
程度」：で折り畳み解除を行なうのに有効な溶質の例は
、通常的４〜９Ｍの範囲の比較的高濃度で使用されるグ
アニジン塩酸塩及びヂＡシアン酸プ１ーリウム並ひに０
．０１へ・２％程疫の）８２度で供給される洗浄剤であ
る。

「弱い変↑」溶液」という用Ｍ１は、（１１白質を、そ
の活性型で内生的ｂｂ＜は同種の生理的条イ′１下で゛
操作ザる際、又、強力変性溶液中で見られるＪ：うな「
変性（　ｄｅｎａｔｕｒｃｄ）　Ｊ型と適切に折り臂ま
れた立体配座との間の中間形態を可溶化させる際に、出
現づるような空間立体配座に少なく−とも部分的に折り
昼み得るような溶液を意味づる。この種の弱い変性溶液
の例は、通常４〜９Ｍの範囲の高濃度の尿素、並びに高
）農度では強力変性剤である上記した変性剤の低濃度溶
液である。後者の「低濃度」は一般に０．５〜約２Ｍの
範囲である。しかしながら、場合により、「弱い変′性
溶液ゴの機能状態は、例えば０，ＩＭもしくはそれ以下
の程度の低い緩衝液淵疫及び生理的ｐ１−１のようなか
なり標準的な酵累検定（ｅｎＺｙｍｅ　ａｓｓａｙ）条
件下でも観察することがでさる。本発明において使用す
る「弱い変性溶液」とは機能的定義であり、何らかの理
由にＪ、り蛋白７′１が有するいずれの歪／Ｖた立体配
座からも、恐らくこの溶液に可溶性の中間体を介して、
生物学的粘性を示しイ１する立体配座に再折り畳みし得
るようイｆ溶）１りを意味する。

本発明Ｃ使用覆る特定技術に関し通常使用される略号及
び記述があり、便宜上これらをここに簡ｔ１１に説明す
る。

グルパーミェーションクロマトグラフィー又はゲル針通
は、」ノイズによって分子を分別する一般的に使用さ・
れる精製技術である。これは、しばしば「分子篩（＋ｎ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｉｅｖｅ）　Ｊとも呼ばれる。

適当なゲルの選択により、殆んど全ての範囲のサイズを
選択することができる。ゲルの孔から１ノ１除されるの
に十分大きい分子はゲルを○有づるカラムを遅滞なく通
過し、それＪ：り小ざい分子はカラムによって分画され
る。

５ＤＳ−１）ＡＧＥ（ドデシル硫酸す１〜リウムーポリ
アクリルアミドグル電気泳動）は、ｄ３お」、その分子
量とｌ１ｌＴ！度とを測定し得る慣用的に使用される技
術である。この技術によると、蛋白質調製物は。、洗浄
剤の存在下還元条件下にＪ３いて電気泳動にかけられる
。特定分子の移動度は、ジスルフィド結合の不存在下（
還元条件による）で決定される分子量のみに依存する。

従っ−Ｃ，調製物中に存在り゛る特定蛋白質の吊は、蛋
白質の分子ｍに相当する位置に現れる染色バンドの密度
測定（ｄｅｎｓｉ−ｔｏｍｅｔｒｙ　ｍｅａｓｕｒｅｍ
ｅｎｔ　）によって評価することができる。この技術に
ついての詳細な説明は、Ｕ。

Ｋ、Ｌａｅｍｍｌｉ等、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２２７
巻、　　６８０　（１９７０）に見られ、これを参考の
ためにここに引用する。

「ウェスタン・プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　　１３１ｏ
ｔ　）　１という用語は、抗体特異的結合技術を意味し
、測定すべき蛋白質を含有する溶液または懸濁物をニト
ロセルロースフィルターに露呈し、このフィルターを次
いで所望蛋白質に対づる標識抗血清で浸）貞り−る。所
望蛋白質の存在は、特異蛋白質との反応による抗体の不
溶化に基づくフィルター上の標識の保持によって確認さ
れる。詳細な説明は、Ｈ、Ｔ　０Ｗｂｉｒ１等、　Ｐ　
ｒｏｃ、Ｎ　ａｔ、　Ａ　ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、　　（Ｕ
ＳＡ）、７Ｇ巻、　４３５０　（１９７９）に見られ、
これを参考のためここに引用する。

［クロマ１〜グラフ・イオン交換蛋白質精製技術」とい
う用語は、物質をイオン交換カラムとの相互作用に基づ
くクロマトグラフ分離にか（〕る一連の］］稈を意味す
る。しばしば使用されるカラムは、例えばしばしば単に
ＤＥＡＥと呼ばれ、或いは一般的商品名としてＤＥ−５
２又はＤＥ−５３と呼ばれるＤＥＡＥセルロース又はカ
ルボキシメヂルセルロース（ＣＭＣ）である。適当なｐ
　Ｈ値において、ＤＥＡＥを含有り−るカラムは陰イオ
ン交換体として作用し、負に帯電した粒子がカラムに結
合する。

カラムからの溶出は、溶出溶剤の成分を変化させること
により、例えばｐｌ−１、イオン弾痕又はｔＲ液の誘電
率を変化させて、或いは温度の調整にＪ、って達成づる
ことができる。

「緩衝液受Ｊ％　（ｂｕｙｅｒ　ｅｘｃｈａｎｇｅ）　
Ｊという用語は、効果的な「溶媒」、即ら巨人分子の液
体環境を変化させる技術を意味づる。即ｌう、この意味
において、「溶媒」は、所望の巨人分子が存在Ｊ−る媒
体におけるミクロ分子の溶質（例えば塩）を現実に包含
する。この溶質は、実際所望の巨大分子の溶解度に関係
する。例えば、本発明の方法にＪ３いて、所望の蛋白質
は、例えば７Ｍのグアニジン塩酸塩と交換する適当な緩
衝液中の８Ｍの尿素から成る溶媒を使用することにより
、イオン交換クロマトグラフィーに適ツるように調製す
ることかでき、この溶媒は一好適具体例において変性剤
として使用される。この「緩衝液交換」を行なうための
１つの適する技術は、蛋白質を含有する７〜１のグアニ
ジン塩酸塩溶液を相当多量の尿素緩衝液に対して透析す
ることである。しかしながら、例えばゲルパーミェーシ
ョン及び透析ｅ過（ｄｉａ−ｆ　ｉ　１ｔｒａｔｉｏｎ
）のＪ：うな他のＫＭ　Ｉ’ｊ液交換技術も使用覆るこ
とができる。

Ｂ、一般的説明 第１図は、活性所望蛋白質を宿主細胞から単離するとい
う問題を解決する一般的方法を示し、ここでこの蛋白質
は屈折体とし゛Ｃ産生され且つ析出したものである。

Ｃ１屈折体の回収 第１図に示したＪ、うに、屈折体は細胞内に包１」され
□ているので、先ずこれら細胞を破砕しＣ屈折体を遊間
させ且つこれらを例えば遠心分Ｈにより回収し冑るよう
にするのが望ましい。本発明の一面にｄ５いては、単に
、細胞残骸を十分破砕してこれが低速遠心分離でペレツ
１〜中に入って来ないように確保づ−るた（プで屈折蛋
白質か精製される。本発明のこの而にＪ３いては、ｌ’
ｌＪ胞を０８０１〜２〜１、好Ｊニジ＜は０．１〜０．
２回程度のイオン強度を用いて、ｐ＋−＋５〜９、好ま
しくは約６〜８の綴仲ｊ液に懸濁させる。Ｎａ　ＣＤを
○め、任意の適当な騙を使用Ｌ）で適正なイオン強度レ
ベルを随行−りることかてきる。本発明ではこのイオン
強度範囲か適することが判明しているが、許容し１！？
るイオン強度の正確な限界は明確には理解されておらず
、また知られてもいない。しかしながら、はぼゼロのイ
オン強度を使用するのは明らかに望Ｊ、しくない。前記
の緩衝液に懸濁させた細胞を、次いで一般的に使用され
る技術、例えばマントン−ガラリンプレス（Ｍａｎｔｏ
ｎ−Ｇａｕｌｉｎ　ｐｒｅｓｓ　）　、フレンチプレス
（’Ｆ　ｒｅｎｃｈ　ｐｒｅｓｓ　）もしくは超晋波発
信器を使用−リ′るような機械的方法或いは例えばりゾ
チームにＪ：る処理のにうな化学的もしくは酵素的方法
によって溶菌Ｊる。

回転沈降してしまう程のザイスの細胞断片が最少になる
か又は全熱存在しないように細胞を充分に破砕したら、
この懸濁物を中力（ｇ＞の約５００〜５０００１Ｈ’；
、好ましくは約１０００Ｑの低速度で標準的遠心分離（
幾により、容積に依って適当な旧聞、通常約１０分〜０
．５時間に亘って遠心分離する。得られるペレットはほ
ぼ全部の屈折蛋白質を含有するが、細胞破砕工程か完全
でないと破砕細胞断片も含有するであろう。破砕が完全
かどうか検査するには、ベレン１〜を受口の同じ緩衝溶
液に再懸濁し口つこの懸濁物を位相差顕微鏡で検査づる
。破砕細胞断片が存在覆るとさは、これらｌＷｉ　）’
＋に関連づ−る蛋白質を除去づるため更に超音波処理又
はその他の破砕手段が必要とされる。このように更に破
砕した後、必要に応じ懸濁物を再び遠心分ばＩし、ペレ
ッ１〜を回収し、再懸濁し■］っ再倹査刀る。この過程
を、ペレッ１へ化物質中に非屈折蛋白τ′１が存在しな
いことが肉眼検査でわかるように４ｆるまで反復する。

適切な調製物の場合、υ」定蛋白質に対リ−る条件は、
本発明の方法を実施覆る際僅か１回の前記懸渇、破砕及
び遠心分離を行イｆえば充分であると明らかに規定され
る。しかしなから、この場合にも数回以上の前記工程を
実１Ｍリ−るのが好ましく、特に全部で３回行なうのが
好ましい。何故なら、これにより必要容量の水性Ｋｍ液
が好適に減少しく即ち、ペレットを再懸濁させるのに使
用する吊が最初の調製物に使用する容量Ｊこりも実質的
に少なくなる）、且つ調製物の品質が肉眼検査によって
確認されるからである。

このように調製されたペレツ１〜中の蛋白質は、宿主細
胞により産生される特定蛋白質に応じて、調製物が含有
づる全蛋白質に対し約４０〜９０％以上の所望の異種蛋
白質を含有する。

例えは、後記実施例１〜８Ｃ用いる特定方法で調製した
場合、ヒト成長ホルモンについては実際に９０％以上の
屈折蛋白質が所望の蛋白質Ｃ゛あり（ここに示した方法
で測定）、一方ヒトインターフェロン及Ｏ・ウィルス抗
原蛋白質の場合には約５０％のみが所望の蛋白質であっ
た。組織プラスミノーゲン活性化因子及びウシレンニン
については、その中間ｍが得られた。この段階において
、これらの純度は所望蛋白質を幾つかの用途に使用覆る
のに充分である１、 ペレッ１〜は変性剤の溶液中に？８解Ｊることができ、
このｒＩられた溶液はそれ自（本活性型の蛋白質を３右
したりしイＴかったりりる。屈Ｉｆｆ蛋白Ｙ１を小出Ｉ
Ｉりるためにこの方法たりを使用した場合の結果を、後
記実施例１〜８に例示−りる。この方ｄ１は、細菌培養
物、特に好ましくはＩＥ、ｃｏｌｉて産生される異種蛋
白質、更に　ｈＧｌ−１，ｉ＋Ｇ１−１．　１）Ｇｆ−
１，じ１〜繊肩を芽細胞インターフ］−ロン（Ｆｉ「＞
、じ１〜免役インターフエロン（ｒ　Ｉ　Ｆ　）　、じ
１〜組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウシ
ブ［ｌレンニン及０”　Ｆ　Ｍ　Ｄ外殻蛋白質より成る
群／ン冒ら３？択される蛋白質の単η１１に適用−する
と最し右利−Ｃある。

ペレッ１〜化蛋白質を変性剤中に溶解ざぜ且つ活性を回
収する技術は、本発明の他の局面から措用するが、この
局面について（よ以下に説明する。

Ｄ、屈折体の生産向上 第２の局面にｄ３いて、本発明は、外来宿主細胞で発現
され目つ屈折型どして不溶化される蛋白質の串を、精ル
Ｈに先立って増大ざぜる方法に関するもので゛ある。後
記実施例に示づように増殖月つ発現する多くの蛋白質の
場合にはほぼ全ての所望蛋白質がこれらの屈折体の形態
でｉ″５られるので、このにうな処理は不必要である。

この種の蛋白質の例１Ｊ、、動物成長ホルモン及び繊紐
芽１１１１胞インターフ１０ンである。しかしながら、
ヒ１へ成ｆｆｌ　〕１＼ルモンの場合、見掛ＧＪ十Ｅ、
ｃｏｌｉで発現される蛋白質の約５０％のみが屈折体と
して得られ、これら向上］−程に従わない限り４’ＦＪ
当な収量損失が生じるであろう。同４．丘に、免疫イン
ターフ」−１」ンも主として非屈折型で産生され、屈折
体に対づる方法を用いてその単利を行なうには、本発明
のこの面に於いて示した方法により向上処理を行なわね
ばならない。

この方法に於いては、組換９Ｉ口胞の増殖及び収穫にお
（プる安全性に門ηる政府塁Ｑｊ−にこの種の細胞を合
致ざｉ！得るような所望の「殺菌」工程を利用づる。多
くの殺菌技術が使用でき、これらＧＪｉ安全性の１」的
でのみ行なわれていたものであるが、上記のような場合
には、これらは屈折蛋白質の量を増大さＵるというイ」
加的な望ましい効果をも有刃る。この局面の本発明の方
法において、宿主細胞は、ぞれらが培養され且つ成育し
ている培地中で、或いは最初の培地の初期遠心分離又Ｉ
Ｊ、その仙の方法による才■胞の濃縮、霧１１１胞ペー
ス１〜の回収及び水溶液中への再懸濁により調製された
懸濁物中で、死滅させることができる。適切へ一殺菌汰
は、低）；２度の酸の投与及びり；１処理で゛あり、特
に好５１ニジ＜は少割合の非極１」右橙溶剤による処理
である。

更に好適な方法に於いては、培地をフェノール０．２５
％且つ１〜ルエン０．２５％とし、’Ｅｘ　７Ｑ乃至４
５℃、好ましくは約３７℃に１５分間乃至数時間、特に
好ましくは０．５［Ｉｆｆ間インキュベーｊ〜する。或
い（Ｊ、封じ込めの設備が利用できれば、細胞を先ず１
りじ込めの下で収穫し、例えば０．０１〜２〜１、好ま
しくは０．１〜０．２Ｍのイオン強度、１）ｌ−１５〜
９、好ましくは６〜８の緩衝液中に再懸（蜀させる。次
いで、懸濁物を低温度の有機溶剤、例えはそれぞれ０．
２５％のフェノール及びトルエンで処理覆る。

仙の具体例においでは、上記のＪ、うな細胞培地又は１
び澗物を約６０〜８０　’Ｃまで約１５〜４５分間加熱
して殺菌を行なうか或いは例えば約０．５”−１，５の
ｐｉ−１にすることもできる。

これらの工程にＪ、す、Ｊ、だ充分に沈Ｊ２されていな
い光現異秤蛋白質が更に相当最沈法づる。後記の実施例
９は、この方法が有利である特定の場合を示している。

この局面の本発明の方法は、次いで、活性異種？Ｊｉ白
貿の回収について木明細店中に記載した他の技術と相合
わせることができる。

１′−０強力変性溶液中への異枦蛋白質の溶解第３の面
において、本発明は、強力変性溶液を用いて不溶性もし
くはベレッ［へ１ヒ形態から屈折蛋白質を溶解ざぼる方
法に関づるものである。１ｔ７１折体と１）での蛋白質
は、一般に細ｊ抱貿内と同様な条（！ｌ　Ｆ　（及び例
えば比較的弱いイオン強度のＮｇ　ｔ！ｆ’ｉ　２１９
中）では不溶性であるが、かなり高いＩＷ　ａ、！１１
］型的には４〜９Ｍの）１；３瓜の成る種の変性剤には
可溶性であると思われる。本発明の方法においては、明
らかに、強力なしばしばイオン性の変性剤が最も実用的
である。特に好適な変性剤Ｃ，１、グアニジン塩である
が、例えばＴ　ｒｉｔｏｎ及びＳＤＳ並びにヂオシアン
酸イ刺ンのような洗浄剤も右利に使用される。グアニジ
ンｊ＝又はヂオシアン酸すｌ〜ツリウムついては４〜９
Ｍの濃度範囲を使用覆ることができ、６〜８Ｍが特に好
適である。これら洗浄剤は０．０１−２％の箱間の溶液
で使用される。溶液のｐｌ−１は、不可逆な変性もしく
は蛋白質加水分解が生じないＪ、うに、特定蛋白質の特
性に合致せねばならない。又、変性剤のＤ適濃度は可溶
化さ口るべぎ蛋白質及び使用するＤ　ｌ−１に依存づる
。

しばしば、可溶化した異種蛋白質をより弱い変性媒体中
に交換しても一旦１１１られた溶解度が維持されるが、
この同じ弱い変性媒体中に初めから４溶解りるのは実用
的Ｃ゛ない。即ち、熱力学的理由又は動力学的理由のい
ずれかにより、蛋白質はこれらの比較的弱い条件下で゛
は合即的時間内に溶解しない。

伯の成分を溶液へ追加して所望１］１」レベルを維持す
ることがでさ′、特定の場合には他のイ」加的成分、例
えばＦＤＴＡのようなキレート化剤が望ましい。実施例
１〜Ｂ、ｉｏ及び１１にｄ３いて屈ＪＪｊ体としての蛋
白質の挙動にＪ、り示されるように、強力に変↑りしな
い溶液は典型的にはこれらの屈折蛋白質を溶解しないく
宿よ細胞蛋白質は溶解される）が、強力な変性溶液はこ
れらを溶Ｗ？づる。従って、これらの弱い変性緩衝液を
、宿主細胞蛋白質を可溶化除去゛りるために使用するこ
とができる１゜この面に於（プる本発明の方法に於い（
Ｌ、Ｊｌ、宿主細胞を、先ず、多くの宿主剋胞蛋白？″
１を可）Ｆｉ化づ−るのに丁度Ｊ：いイオン強度、即ち
０．０１−・２Ｍのイオン強度、好ましくは約０．４〜
０　、６　Ｍのイオン強度且つ約５〜９、好ましくは約
６〜８のｐｌ−１の媒体中に懸）蜀させる。勿論正６１
ｒな［〕１１及びイ側ン強度の範囲（，１示ツことがで
きイｆいが、使用し２１″−するｆｌｉ２囲をここに示
した。

上記の溶液の存在下で細胞を破砕し、そして懸濁物を遠
心分離してペレッ１〜を形成づ“る。このペレッ１へは
主どして屈折型の所望蛋白質を含有して６３す、上記の
強力変性媒体を使用してこれを可溶化刃る。１■溶化し
た蛋白質を次いでその再生を可能にする手段を用いて回
収づることができる。

「、高分子早夾２１１物の除去 第４の而において、本発明は、・可溶化した所望の屈折
蛋白質から高分子量成分を除去する方法に係り、この揚
台、変性剤がイオン性である場合にも、分子篩又は高速
遠心分離のいずれかを用いて強力変性溶液から直接に除
去刃る。この工程は、第１図にｄ３いて［所望蛋白質含
有上清」から最も左の矢印で表わされ、強力変性媒体で
ペレットから抽出した上清を例えばセファクリル（、５
ｅｐｈａｃｒｙｌ）のような］ノイズ分画用のゲルパー
ミニ−９３ン分子ｎｍ　（モレ主コラ−シーブ）の力”
ラムに通ずか、或いは１烏速達心分Ｎｆで高分子早成分
を沈降させる。

これら分ｍｆｌ工程のいずれも溶液からのイオンの除人
を必要とＵず、従って、この抽出物がイオン性である場
合にし、ペレットからの抽出物に対して直接この工程を
実旅づることができる（実施例１０及び１１参照）。

グル濾過ににっで高分子量不純物の除去を行なう際、例
えばＳ　ｃｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ−３００のような分子
篩を含有ザるカラムを）名実な緩衝液（好ましくは還元
剤を含有する）で平衡化し、その後眉種蛋白貿を含有ツ
る溶液をカラムに通ず。流過した高分子ｆｆｉの溶液を
捨て、次いで異種蛋白質を更に緩衝液を流して溶＋１ｊ
　ｆｆ’る。溶出した蛋白質は、例えば２８０　ｎ　ｍ
にＪ′３（プる光学６９度の測定にＪ、リモニターする
ことがでさ、非イオン性溶剤に対Ｊる透析により所望蛋
白質の存在を確認し続いて５Ｏ３−ＰＡＧＥによって正
確な分子量の蛋白質を確認することができる。

他の方法においては、蛋白質を２５，０００〜４０，０
００ｘｇ、好ましくは３５，０ＯＯＸ（Ｊにて１０分間
乃至“３同間に亘り高速遠心分離（Ｓρ１ｎｎｉｎｉｌ
ｌ）　Ｌ／、上清を回収して更にオ、ｉｌｌ製する。

蛋白質に対する一般的な精製法では、最初のクロマ１〜
グラフ■程としてゲルパーミェーションクロマトグラフ
ィーを使用すること、即ち、例えばイオン交摸クロマ１
〜グりフィーに先立ってゲルパーミェーションを行なう
ことは一般的でない。しかし４ｒがら、Δ（発明の方法
にＪ３いては、蛋白質は、溶菌及び／又は変性剤抽出工
程の直後に高レベルの純度（（Ｊぼ常に５０％双上）を
有する。従って、従来の蛋白質単離方法と比較して、所
望蛋白質はグル計過工程にか【プる前に既にがなりの高
純度を有する。従って、この場合通常の欠点、即ちイオ
ン交換に比較してグル濾過の効力が低いということは問
題とならない。不純分の量が少ないので、少量の特定蛋
白質を多回の不純分から単離する場合とＩＪ異なり、全
体としてＨ’、ｒい能力を必要としない。

必要に応じ史に精製を行なうことも本発明のこの而に含
まれる。溶解用変性剤がイオン（’！−である場合、こ
の種の追加工程がイオン交換を会むならば、非イオン性
変性剤への交換にＪζる溶液の脱塩（ｄｅｓａｌｔｉｎ
ｇ）が必要とされる。実際、例えば尿素のようｔｉ弱い
変性溶液を使用づ−るのが好ましい。

単に、例えば′標準望の緩衝液に対する透析によって変
性剤を除−去づることも原理的にはでさるが、これはし
ばしば蛋白質の再沈１ｉｉｄをもたらす。合理的な濃度
の変性剤を含有する溶液中に蛋白質をＩｆｆ持ずれば、
蛋白質の早期沈澱が防止される。これらイオンを除去し
月つ非イオン性彌貿で交換リーるど、イオン交換又は中
性吸盾担イ声を含む種々のクロア１〜グラフ技術を用い
て更に精製することができる。これらのうら有利に選択
されるものはＤ［ＡＥセルロースクロマトグラフィーで
あって、これは所望蛋白質がカラムに粘性しないで流過
液中に出現するにうなｐＨで行なわれる。即ち、カラム
は陰イオン性蛋白質不純物をＩｎｊ犯し、これらを所望
蛋白質から除去゛りる。所望蛋白質を吸着しその後溶出
させる逆の方法と比べ、この方法は筒車であり且つ樹脂
の必要笛が少ないという明らかな利点を右づる。主とし
て所望蛋白質が予示に存在ザるため、少量の夾雑物を吸
盾づ−るのに充分な樹脂のみが必要とされる。しかしな
がら、この面にお１）る本発明の方法は特定例のみに限
定されず、追加精ｔ′ノ法として各種の分離技術を使用
することも可能である。

Ｇ１強力変性剤不在下の溶解性の維持 本発明の更に他の面は、後の精製或いは生物学的試験に
先立つ精製の際に、所望蛋白質の強ツノ変性溶液を弱い
変性溶液で交換することによる溶解度の肩１持に係る。

成る場合には、例えばＥ、ｃｏｌｉで発現されるｈＧＨ
の場合には、再折り昏みを行なうのにこの処理だけで充
分であるが、これは必ずしも全ての場合にあてはまらな
い。更に成る場合、（例えば接にイオン交換処理をしな
いような）成る用途に′ついては、成る種の蛋白質につ
ぎ溶解度を維持づるには強力変性溶液の限定希釈だ（Ｊ
で充分であろう。しかしながら、強力変性溶液をより弱
い変性溶液で交換する緩衝液交換法は、溶解度を維持覆
ると共に更に精製し旧つ成る場合に（ユ生物学的活性を
回復（ｒｅｓｔＯｒａｔｉｏｌｌ）するのにイ１用であ
る。これは特にイオン性の強力変性剤の１易合に望まし
い。何故なら、例えば部分的に精製された屈折蛋白質を
更に精製するに（ユ、イオン交換技術を使用することが
しばしば必要であるからである。イオン性変性剤はイオ
ン交換を妨害するため、屈折蛋白質を可溶化して得られ
たままの溶液を直接利用することはできない。しかしな
がら、この変性剤を全部除去するとしばしば所望蛋白質
が沈澱してしまう。これらの問題は、例えばグアニジン
のようなイオン性の強力変性剤を、例えば尿素のような
より弱い非イΔン性の変性剤で緩衝液交換することによ
り回避づることができる。特に、抽出された形態或いは
本発明の他の局面で示ザようなＳ−スルボン化型で供給
された蛋白質をほぼその天然状態に再折り畳み且つ（恐
らくこれにより）溶解性を維持するには、尿素を適当な
濃度、即ち約１〜９Ｍで存在さぼる。

「緩衝液交換」は、緩衝液交換再生工程の前に生成され
ているかも知れない不適切なジスルフィド結合の５７元
を紐持するようにβ−メルカプトエタノール又は仙の適
当な還元剤の存在下で、或いはＳ−スルボネートの形態
の蛋白質を用いて行なうことができる。

従って１．この面に於（プる本発明の方法においては、
ｉ’Ｊ＋　’！蛋白質又はそのＳ−スル小ネート形と例
えば４〜９Ｍのグアニジン塩酸塩とを含有する強力変哲
溶液を、必要に応じ適当な濃度のｊ工元剤を含イ１′？
ｊる尿素もしくはその曲の弱い変性剤の溶液に対し透析
又は３４析濾過（ｄｉａｆｉ　１ｔｒａｔ　１ｏｎ）　
Ｌ　−’Ｃ綴衝液交換した後、引続ぎ任意のｆｌ′Ｉ製
を行なう。

（本発明の他の面で示ずように、最初の強力変性溶液を
先ず亜硫酸塩及び温和な酸化剤で処理して亜硫酸分解（
ｓｕ＋ｒｒｔｏ＋ｙｓｒｓ＞を行なった後に弱い変性媒
体に対し緩衝液交換することもできる。この亜硫酸分解
法は本発明のこの面の範囲内（こは入らない）。いずれ
にせよ、弱い変性溶液は生物学的活性蛋白質に対応でる
形態に一層近似Ｊ−るように折り畳まれた蛋白質（Ｓ−
スルホン化型であってもそうでなくてもよい）を含有し
、得られる溶液を、例えばＤＥＡＥセルロースのような
陰イオンカラム又は例えばＣＭＣのような陽イオンカラ
１１でのイオン交換のような充分な精製技術にかけるこ
とができる。いずれの場合も、その後の″Ｉｉｉ製法を
、常法に従って、単離すべぎ特定蛋白質及び使用ずべき
特定技術に応じて、適当なｐｌ−１及び塩）門疫に′Ｃ
行なう。この種の精製法は当身“４界で周知であり、そ
の使用は当業者に熟知されている。

旦−」項■ユし芹カニ 本発明の仙の３つの面は、く恐らく誤って折り畳まれて
いるために）非活性型になっている所望蛋白質を再１５
℃活Ｊ−るための代替法を示している。

第１のこの種の局面に第３いて、例えばグアニジン塩酸
塩のような強力変性剤に溶解されている屈折蛋白質を、
強力変性溶液中での予備亜硫酸分解と、それに続く、弱
い変性媒体中、少割合の対応ジスルフィド型を含有する
スルフヒドリル化合物の存在下での再折り畳み、スルボ
ネー１〜除去及びジスルフィド形成にＪ、って、再賦活
化づ−る。このジスルフィド型は直接に供給してもよく
、或いは空気を排除する注意をＵザにスルフヒドリル化
合物を単独で使用覆ることもできる。こうづるど幾分か
のジスルフィドの存在を確保Ｊるのに充分４「適当な酸
化雰囲気をもたらづ。

典型的には亜）がｉ酸分解を行なうには、例えｔま４へ
・９Ｍのグアニジン塩０）塩のような強力変性媒１４＼
申に可溶化した屈折蛋白質を、亜（φｒＮ２す１〜リウ
ムのｂ＝　ｃに関し、約５〜２００１１１ｇ、／　７、
好ましく（。１、約１５〜３０ｎＩｇ／ｍｆ！、又は対
応りるモル早の他の亜硫酸温潤・）哀とし、同１１Ｎに
、反応ににって伴するスルラじドリル基からジスルフィ
ドを再生づるのに充分な温和な酸化剤を存在さゼる。適
づ−る醸化剤１．ｊ例えば分子状酸素であっ−Ｃ１金屈
陽イΔン又（ニア１〜ラチオン煎り−１〜リウム（好ま
しくはテ１−ラチＡン煎り１〜リウｌ＼）による触媒反
応を伴う。テトラヂオン酸すトリウムは約１〜２０ｍｇ
／威、好ましくは約１０＋ｕｑ／戒の量で加えられ、或
いはス］応するモル吊の他の試桑を使用することもでき
る。次いで、この溶液を１５〜３５°Ｃ，好ましくはほ
ぼ空温にて４〜２４時間、好ましく、は１晩静ｎ′刀る
。適当な範囲の）門度及び温度などを記載したが、最も
右利である正確な条件は、勿論並値酸分Ｍ′？Ｉべき蛋
白質の性質に依存する。

更に、１部分的」のみの亜硫酸分解も＋＋ｙには有用で
パある。この場合、ずっと生母の亜硫酸塩及び酸化剤を
使用することがＣ゛きる（例えば、実施例１３参照）。

前記の苗は単に使用し賀る脂層であり、広範囲の限界は
溶液中の蛋白質の量及び所望の亜硫酸分解程Ｊ宴を含む
種々のパラメータにより規定される。

上記の亜ｔｉｉｆＩ　酸分解反応に於いて、ジスルフィ
ド結合は切断され、一方のスルフィドが１個のスルノト
ネー１へて直換される。この反応のメカニス゛ムはジス
ルフィド結合を切断ザる亜硫酸イン］ンにＪ、る親核性
攻撃を○むものど思われる。いずれにぜＪ２、生り゛る
結合は蛋白″ｉ’ｉ　−Ｓ　−Ｓ　Ｏ３、即ｌ）蛋白質
−８−スル小ネ−１・である。

次いて・、得られる蛋白質−８−スル小ネー１〜溶液を
希釈或いは緩衝液交換のいずれかにより、例えば尿素の
よう４．−弱い変性剤を含有刃る溶油に対し透析づるこ
とにより、弱い変性溶液中に移り１゜イオン交摸り［１
７１〜クラフイー又はその他のイ票Ｌ）（的蛋白質楯製
技術を用い、蛋白質がＪ、たＳ−スル小ン化型であるう
ちに使用して更に）′ｈ製しく７ることに注ＩＪ］−Ｊ
へさである。

弱い変性媒体により適切な再折り畳みのルー１−が得ら
れ、この場合蛋白質はもはＡ９不正確イ１ジスルフィド
結合により誤って折り皆よれることはない。尿素を弱い
変性溶液として使用する場合、適当な濃度範囲は１〜９
Ｍ、りＹましくけ６〜８〜１である。１）ｌ−１１；ｉ
適当な緩衝液により旧つ必要に応じＥＤＴＡ又は他のキ
レ−１へ止剤を追加して約５〜９、好ましくは約６〜８
に保たれる。希釈を行なう場合、ｊ凶づる）門度は最初
に用いた強力変性剤の約０．５〜２Ｍの温度にづるのが
適切である。このような弱い変１１−媒体に、スルフヒ
ドリル化合物（ＲＳ　１１）及びその対応−ノるジスル
フィド（Ｒ３Ｓ　Ｒ）を含有する系、例えばβ−メルカ
プ１〜エタノール、還元クルタチンＩン、システアミン
又はシスフィン及び（の対応覆る酸化型を含有する系、
好Ｓｌ　シ＜はｊ；元型グルタチオン（Ｇ　Ｓ　ｌ−１
＞及び酸化型グルタチオン（ＧＳ、ＳＧ）を含有づ−る
系を添加づる。ｐＨを、スルフヒドリル化合物（、ＲＳ
　Ｈ）か少なくとも部分的にイオン化型（Ｒ３）となつ
−Ｃスルホネ−１〜の親核性置換が促進されるような値
に調整する。或いは空気の存在下で還元型のみを使用り
ることちできる。何故なら、充分なりのジスルフィドが
この環境で生成覆るからＣ゛ある。

ジυ型的にｌｌＲ３＋−１対Ｒ３５Ｉ欠のモルｊＬｔユ
約２０：１・〜５：１、好ましくは約１０＝１であり、
全ゲルタデオン又は他の試檗の濃度（ユ０．０５〜！ｕ
ｎｌｖｌの６”ｆｉｌ）］である３、この混合物を所望
蛋白質に応じて、約Ｏ〜３７℃で４〜２４時間、好、ｊ
、シ＜（Ｊ、１晩イン１．ｌ−へ−１〜づ−る。

蛋白質−８−スルホネ−］〜を対応ザるジスルフィドま
で変換し、或いは少なくともスルフじドリル化合物自身
とのジスルフィド結合を〈１成づるにはスルフヒドリル
化合物だ（）で充分であるが、適当なジスルフィド結合
がそのまま完全に訂１持されるように覆るためには酸化
型の存在が必要Ｃある。

酸化が起こらない条（Ｉｌで純粋１．Ｉｆスルフじｌ’
リル化合物を加えると、蛋白質は最終的にジスルフィド
どしてではなく、スルフヒドリル型で」−成される。

これを防止づ−るには、四りの緩衝液の酸化電位を、少
量のジスルフィドを直接に供給するか或いは還元型スル
フヒドリルが空気酸化され得るように維持づ−る。

恐らく１確なジスルフィド結合ににり固定され適切に再
び折り畳にれた所望蛋白質を含有覆る得られた溶液は、
次いて必要に応じ、ｐｌ−ｌ　５〜９て必要に応じ少量
の還元型グルタチオン又は約１ｍＭ＋Ｃ＋疫の程度の他
のスルフじドリル化合物を会右覆る適当な緩１φｊ溶）
（りに対し透析して、変性剤を除去づることｈくできる
。この蛋白質をその後、変性剤の存在下でも使用し寄る
場合は、この工程を必要どじない。

上記方法に於いて、蛋白質濃度はかなり低いレヘル、り
ｒましくは１ｍ（］／彪未渦に保たれる。何故なら、成
る場合（全での場合ではない〉には高温度だと反応の進
行に対し悪影響があるからである。

更に、亜硫酸分解反応１ま、尿素もしくは仙の弱い変性
剤中、或い【よ強力変性溶液中で任意に行なうことがで
きるが、このことは溶解の際に使用づ−る変性剤濃度が
特に高い場合には右利Ｃ′さえある。

このＪ、うな場合、弱い変１」剤への緩衝液交換又は希
釈は！ｉ（ｉ硫酸分解反応の後よりはむしろそのＩｊう
に行なう。

５１７１種蛋白質を「再折り畳み」づるよう設Ｈ＋　シ
た本発明の他の局面に８３いては、所望蛋白ｖ゛１もし
くはベプヂドをスルフヒドリル／ジスルフィド含イ」緩
衝液中に入れて同じ溶液中で折り胃みの解１）シ及び再
折臂力を生ｕしめ、この緩衝液（ま中間に牛した＼″Ｌ
休配体の全てが析畳みｊ＋７敢及び再折畳みの過程て可
溶性に？ｆｆ持されるような充分な変性能）Ｊをイ）り
る。適りる媒体は、例え（Ｊ、１へ・９Ｍ、りｒましく
は約７Ｍの１７！素であり、これは正（イｒな立体配圧
に近い配座を与え１ｑるのに充分な弱い変性剤であると
思われＪ］つ再折畳み鎖の可動性及び中間体の溶解が可
能である程充分に強力である。この具体例は「酸化還元
緩衝液にＪ３りる再折畳み」を特徴とづる。、還元型（
ＲＳ　ｌ−１）及び酸化型（Ｒ３ＳＲ）の両者のスルフ
ヒドリル化合物、例えばβ−メルカプ１へ土りノール、
ゲルタデ調ン、シスデアミン又はシスディン、好ましく
はゲルタデオンを適当な交換媒体中に存在ざぜる。

この酸化還元緩衝液再折音みては、ＲＳ　ｌ−１対Ｒ８
５Ｒの［ル比は約２０：１〜５：１、好ましくは約１０
．１であり、全訳ｉ　ｌｂ、、度は０．０５〜５ｍｔｖ
ｊの範囲である。ここでもｐｌ−１を充分高くしてＲＳ
　ｌ−１の少なくとも一部は確実にイオン化ぜねばなら
ないが、蛋白質を変性さける程高いもの−Ｃあっ−Ｃは
ならない。この混合物を０〜３７℃、々ｒましくけ約５
°Ｃにて約／ｌ　ヘ２４　ｎ、ｙ間、好ましくは１晩培
養する。この場合も、上記したようにスルフヒドリル化
合物の酸化型及び還元型の両者を直接に尋人づ゛るか、
又はスルフヒドリルの空気酸化にＪ５つ゛Ｃ存在さぜる
ことかできる。所望蛋白質が完全には還元されないよう
、適切な酸化電位を維持するには両形態を存在さＵる必
要がある。

本発明の仙の再折畳み方法の場合と同拝に、蛋白質は溶
液のまま例えばクルを過又はイΔン交換のような蛋白質
精製用標準技術にかりることができる。例えばＤ　ＩＥ
　Ａ　Ｅセルロースのようなイオン交模技術を使用する
のがｑ７Ｉに！ＩＹ適である。

本発明の更に池の局面にｄ３い−Ｃ，精製工程のハ、味
で行なわれる天然型への再折畳み及び再生〈回復）は、
いづ゛れの精製工程でもその間づ゛つと蛋白質を還元型
に紺持し、口つ空気の存（ｉ下で？Ｉｊ酸化して変性剤
の最終的除去の際に適当なジスルフィド結合を形成づる
ことによつ−Ｃ行なわれる。この方法では、還元剤は、
強力変性剤中の屈折蛋白質の最初の溶液中に及びその後
の全精製工程を通じて供給される。適する還元剤は、例
えばβ−メルカプトエタノール、ジチオスレイ１ヘール
及び還元グルタチオン、好Ｊ、しくはβ−メルカプトエ
タノールである。工程の最後に、変性剤のほとんど又は
１〉部を除去覆るがこのとき反応混合物中には還元剤は
含まれづ”、充分な空気の存在下、今や適切に折畳まれ
ている蛋白質のスルフヒドリル基をジスルフィド結合に
再酸化することにより、適正な天然型を確保する。この
工程の使用を後記実施例１０及び１１に例示刀る。

■、標標準的多段私 法発明の他の局面を描成する一般的多段階精製法並びに
従来使用されているものから選択さ゛れた２つの任怠角
加ステップを第２図に略式に示づ。

第２図に示ずＪζうに、この方法は基本的面で、約０．
０．５〜２．０Ｍ　、　好マしくハ０．４〜０．６Ｍ（
７）イ、ｔン強度を右づ゛る緩衝液中に細胞ペース１〜
を分散させ、異種蛋白質の沈澱を完結もしくは維持し且
つ宿主蛋白質の大部分を溶解ざＵ又はその溶解を維持す
ることから成っている。宿主蛋白質から分離したｉ！２
、異種蛋白質をｊ還元剤を含有づ−る強力変性溶液中に
溶解させる。この方法は、緩衝液交換ににり生物学的活
性型で異種蛋白質を回収し゛Ｃ完結する。ゲル濾過及び
イオン交換ステップ（スラップ３及び／ｌ）は、必要に
応じて行４ｆゎれる追加Ｈｉ１製スデステップＹ適具体
例であって、個々の場合に応じて行なうことができる。

出発物質として使用する細胞物質は、全ｉ８養物、又は
例えば細胞ペーストのにうに変形処理した形態とするこ
ともできる。宿主細胞どじで特に［。

ｃｏｌｉを用いた細菌培養物が好適である。一般に、安
全基準として規定された現行の規制に従って使用される
殺菌ステップを経て作成された細胞ペーストを使用覆る
のが好適である。（本発明は、殺菌ステップを予め使用
するかしないかに拘らず宿主細胞から蛋白質を回収する
場合に適用される）。

好適な手順では、５５０ｎｍで約３０−５００　、　Ｄ
　、単位Ｊ、で増９ｆｊ　Ｌ／た培ｊ？ブロスをフェノ
ール及び１ヘル工ン澗度それぞれ約０．２５％とし、次
いで約０．５時間静置させる。これにより、細胞蛋白質
を不当に変１９リ−ること泡′く細胞を殺菌できる。熱
及び酸殺菌は有効であるが、あ；１ζり好ましくない。

しかしながら、これらいその他の殺菌法も本発明の以下
の−に稈どＪξに使用づ゛ることができる。次いで本発
明の方法にか（）る殺菌材料は、全培養物又は遠心分ｔ
ｅｌ　ｌｌ［ｌ胞のどちらでしよい。しかしながら、客
足を最少化するという実用的観点から、遠心分離された
細胞ベース１〜を使用づ−るのが好適である。この培養
物又はペース１へを箱−製工程に先立って凍結保存づ−
ることもできるが、これは単に便宜上である。

初期抽出（第２図のステップ１）を行なうに際し、ρ１
−１約４〜１０、好Ｊ、しくけ約６〜９に緩衝され１１
つ約０．０５〜２　、０１１．＝１のイオン強度、好ま
しくは約０．４〜０　、６　ｆｖｌのイオン強度のレベ
ルでイオン秤を含有する溶油中に、細胞を充分に分散さ
ける。

任意の適当な緩１１１系を使用りることができる。イオ
ン強度は、緩衝用に使用される物質（秤）を含め任意の
塩により与えられるが、好演的理由で好ましくは塩化ノ
ー１へり・クムである。更に、！ｆ；、豹！ＩＲはキレ
−１へ化剤、例えばＦＤＴＡ及び還元剤例えば２−メル
カプ１〜エタノール（１３Ｍ　ｌ二）を含有づることが
望ましい。

上記ステップを行なう際、均一な懸濁物を１１７ること
が極めて望ましい。細胞ペース１〜を使用りる場合、（
幾械的分散が好適である。この目的には分散器が市販さ
れてＪｌす、１）、１適なものは［）　１ｓｐａｘ（Ｔ
　ｅｋｍａｒＩｎｃ、　）　Ｍ　ｏｄｅｌ　　Ｓ　Ｄ　
４５である。しかしながら、ブ［１スＪＭ養物を使用す
る場合、機械的分散は不必要である。

沈澱した（屈折）異種蛋白質は一般に細胞内に含有され
るので、ステップ１で得られる細胞懸濁物を！ｔｔｌｌ
ｌ胞の一体性を事実上破壊づる種類のホモゲナイザー又
はプレスを用いてボモグナイズする必要もある。例えば
Ｆ　ｒａｎｃｈ　ｐｒ（！ＳＳ　、ビードミル（ｂｅａ
ｄ　ｍ１ｌｌ）又は超音波処理のような多数の装置−〇
シ＜は技術を使用し得るが、Ｍａｎｔｏｎ　Ｑａｕ−ｌ
ｉｎ　ｔｙｐｃ１５〜１ホモグナイリ゛−が好適である
。細胞を」−記したように４　ｔ！ｒ！ｊ液中に分散ざ
μｍ且つホモグプイズした後、不溶性物質を好Ｊ゛シ＜
はｊ仝心分離によって可溶性蛋白質から分離し、上清を
除去する。この上清は主として宿主蛋白質を含有してｄ
３り捨てる。

好適手順においては、ペレットを同じ緩衝液に再分散し
て洗浄し、更にペレット中に存在する宿主物質を不溶性
蛋白質から除去する。この洗ン争は、ペレッ１へを新島
Ｙな同じ緩衝液で処理し、再分散させ口つ洗浄ペレット
を遠心分離する標準的方法で行なわれる。

次いで、ベレン１〜をステップ２に示したＪ、うに抽出
して所望の異Ｉｉ！蛋白買を回収り−る。ペレツ１〜を
ステップ１に記載したのと同様な方法で処理して強力変
性溶液中に分散させる。好ましくはこのステップで使用
される溶液（Ｊｌ例えばグアニジン塩のにうな強）ｊ変
性剤１〜９Ｍ、特に好にシ＜は６〜８Ｍ、約４〜１０好
８Ｌシ＜は約６・−９、’ｌ−１’ｉに好Ｊニジ＜は約
　７のｐ　ｌ−ｌを与えるのに充分な燐ｎプ塩又はその
他の適当な緩衝剤、θＹましくは更に少量の例えばＦＤ
′Ｔ△のＪ、うなキレ−１へ化剤を含イー１りる。

全てのジスルフィド結合を遊離のスルフヒドリル基へ確
実に交換するには、例えばβ−メルカプ１〜エタノール
のような還元剤を存在さＵることが必要である。勿論、
他の変性剤を使用することもできる。分散させるには、
ベレン１へを変性溶液とノ尖に２４時間まで、好ましく
）ま　１晩撹拌する。

次いで、懸濁物をｊ虐心分離し、そして溶解凹ずに沈澱
した宿主蛋白質及び残骸を○有するペレツ］〜を捨てる
。

時には、この点までの精製で充分であり、得られた蛋白
質を昂釈又はＸΣ衝液液交換より変性剤の効果を単に弱
めた後に使用することができる。こＱ）場合、スフツブ
３及び４は省略づることができ、ステップ５を下記−す
るＪζうに直接に行なうことｈ〜でさる。

次い−Ｃ、ステップ５にＪｌいて、変性剤を適当な溶媒
で交換づることにより、所望蛋白質を」已１勿学的活性
型で回収する。成る種の蛋白質につ（Ｘで（ま、元の変
性剤を斉釈してその濃度を低くづ−れ【ま充分である。

他の蛋白質については、例えば尿素のような力Ａ１〜ロ
ピック性のより低い他の変性剤に緩衝液交換することが
必要である。回収の最終ステップは還元剤の不存在下で
行なわれ、より弱い変＝Ｉ＜ｌ剤中で蛋白質のＩＪｉ畳
みを解かせ−る際に、ジスルフィド結合を再生づること
がでさる。

しかしながら、更に精製が望まれる」契合、必要に応じ
、その後のステップを還元剤の存台下で行なっＣ１再生
前に純度を増大ざぜることが（゛さる。

このステップは（Φ々多故のこの種のステップがら選択
することができる。これらのうら！ＩＦ”ｒ囚な例は次
の通りである。

この（重の第１の好ｊ暮ステップ（ステップ３）（こお
いては、変性剤と還元剤と所望蛋白質とを○右す−る溶
液をグル濾過工程によるリーイズ分画り［１７１〜グラ
フにかりる。このリイズ依存性のため、適づ−るゲルの
孔径（ｐｏｒｅ　５ｉｚｅ）の選択は精製ずへぎ蛋白質
の性質に依存する。口蹄疫病（ＦＭＤ）蛋白ｒ′ｉにつ
いて、適当な物質は例えば３　ｅｐｈａｃｒｙ１３−３
０（１（Ｐ　ＩＴａｒｎｌａｃ！ａ社）テアル。

グル濾過ステップは、所望蛋白質を可溶化させるために
使用した高Ｃ度のイオン性変性剤の存在下で行なうこと
かできる。しかしながら、例えばステップ４に例示する
ようなイオン交（条クロア１〜グラフスデップは不可能
であることが明らかである１、従って、イオン交換に塁
づり′Ｉｌ′ｉ′ｌ製が更に望ましい場合、イオン例え
ばグアニジンを含有するならば変′［」溶液自身、或い
はゲルパーミエーションク［」７トグラフイーにか（〕
てもこれらを含有するなら（Ｊ溶出？１ｋを、先ずイΔ
ン除去にか〔ブねばならイヱい。これは、異種蛋白質の
溶解を維持するために、（シリえは約８Ｍの尿素のよう
な高濃度の中性変性剤を用いて、好ましくは還元剤を含
有するアルカリ性級画液に対して透析して行なうことが
できる。

脱塩を行なった後、透析液中に残留づ−る物質を例えば
１つＩＥ　Ａ　Ｆレルロースのような適当なイオン交換
ツノラムクロマ１〜グラフイーにかりる３、好ましくは
、これらの条件は所望蛋白質がカラム中のボイド（空間
）容積を流過し得るように選択される。

これは、樹脂上への吸容により除去されるのは、精製工
程のこの段階で所望生成物である多電の蛋白Ｖ（てなく
、微昂の不純物である場合、少量のイオン交換樹脂しか
必要どされないので右利である。

ｉ’１′ｌ製された蛋白質（及び中ｆ（１）変性剤を含
有りる流過液は、適当な場合にはイのまま使用づること
ができ、或いはより稀薄な溶液に対し透析して変性剤を
除去りることしできる。成る場合には、蛋白？゛［の沈
澱を防止ヅるため、最終的に水又（，１緩衝？１りまで
緩衝液交換する前に、低８；コ度の尿素Ｊ、−〇”予備
的に緩衝液交換づ−ることが必要であると判明した。全
ステップを最後まで行なう間、還元剤を存在させねばな
らない。適する還元剤は上記したしのであり、その使用
割合は本発明の上記局面に関連して上記した通りである
。

ｒｌられる溶液は、通常所望蛋白質に関し９５〜９９％
程度の純度である。！１１」型面には少なくとも５０％
・−９８％までの程度の眉種蛋白質が回収される。

上記方法は、特にｈＧｌ−（、ｐＧｌ−１，ｂＧｌ−ｌ
、ウシインターフェロン、　　ｔＰＡ及びＦＭＤウィル
ス外殻蛋白質に対して右利に使用づ−ることがＣ゛きる
。

、］　、　実　　１１色　　１５１１ 」ス下の実施例にＪ、り本発明をば１明するが、これら
のみに限定されない。

実施例１へ・８は、宿主細胞蛋白質の可溶化及び低速遠
心分出ＩＩによる屈折体の回収から成る本発明の局面に
関り−るものである。

実施例９は、「殺菌」工程を用いる屈折体回収の向上を
示すものである。

実ｈ１！！例１０及び１１は、予（Ｒ１１的溶菌及び細
菌蛋白？１の除去と得られる屈折蛋白質及び不可避の成
る種の夾り１１物の強力変性剤中へのｉｉＪ溶化とを相
合せた多段階ｖ１ど、−されに続くグル）１１１過又は
高速遠心方円１及び活性蛋白質の回収をＥＩＥ要工程と
して合む任意の精製工程とからなる本発明の局面に関り
−るものである。これらの実施例は更に、丙白質を還元
剤の存右下で再折畳みした後のジスルフイ１ぐ生成剤と
しての空気の使用、屈折体を’＋’ｆｆ解させるための
強力変竹渚（１りである溶剤の能力及び弱い変１’！、
　？ｔ’１への交換による溶解性の粁１１、ｒを示−り
本発明の局面にも関づるもの−ｃ　’ｂある。

実施例１２．１３及び１５は、亜１ｊＷｉ酸分解にわ“
、く酸化還元紡鍾ｊ））（での処ｊｑ；　ｔこＪ、る少
’、−Ｋ　くとも部分的ｔこ不活性な蛋白質の再折り畳
のを示し、実ｆＭ例１４は「酸化）ｉ元緩町液再１バ眉
み」工程を示している。

実施例１６は、特に強力変性溶液中への溶解に続く、弱
い変性剤へのｔ％液交換の効果を示している。

これら実施例に示した全ての文献゛を参考のためここに
引用し包含覆る。

全ての実施例は、本発明の方法により昂製された特定の
異種蛋白質に関づるものである。勿論、精製の詳η１［
１は使用づる特定蛋白質に応じて変化する。／＼発明の
方法（ま全ての揚台に同様であるが、１シリえば所望蛋
白質を可溶化ざ巳る変性剤の選択、適当な４プイスのケ
ル又（：Ｉ、イオン交換１ｉ、ｌ脂の選択並ひに各−１
−稈において適ザるイオン強麿及びｐｌ−１条１′１−
のような肩線ｌＬ、蛋白質の性？５に依存覆る。しかし
４ｊがら、これら屈折蛋白質は、僅かの改変でこの方法
を′１″丁定蛋白ｒｔｊ（に適合さけるのに充分な共通
の凹貿を右する１゜ 実施例１　異種蛋白質の産生及びｊｌｊ　ｐ、ｊｊ力汐
）「、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐプ【」モーター−オペレータ
ー制御下の異種項伝了を担ｆｊづる組換プラスミドｐ［
３ｆ１３２２によつ（形質転換ざＵたＥ　、　ｃｏｌｉ
ｌ（１２！ｉ’ｌｌｌ胞を、１０ｇ／ρの酵母抽出物と
５ｇ／〃のトリジ１ヘンとを含有づるブロス中で約２〜
４ｘ　１０−１１１胞／誦の細胞濃度まで増殖さけた。

この培ｊ１物の３〜５容量％をＭ９培地（Ｊ　、　ｌ−
１、Ｍ　ｉ　ｌ　ｆａｒ、　Ｅ　ｘｐｃｒｉｍｃｎｔｓ
Ｉｎ　　ｌｙｉ　ｏｌｅｃｕｌａｒ　　　Ｇ　ｅｎｅｔ
ｌｃｓ、　　ｐｐ、４３１．　Ｃｏ１（ＩＳ　Ｉ）ｒｉ
ｎｇ　Ｉ−１ａｒＬ＋ｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、
１９７２）又は４０〜１２０ｍｇ／ρの１−リブトファ
ンを○有刃る同（Ｊな無賎塩培地に１ａ種した。４；’
ｌ；　ｒｊ％物を１回の細胞分ン：ｌ当り６０〜９０分
の増殖速度をｊヱ成づるのに充分へ一反打及び通気にＪ
、つ−’Ｃ、ペンチ発酵装置（ｌ］０ＩＩＣＩＩ　ｆｃ
ｒ−ｍｅｎｔｃｒ　）て増殖させた。グルコースを」８
養物に供給して増殖を維持したが、発酵中５０ｇ／ρを
超えないようにした。培養物のｐｌ−１をＮａ０ｌ−１
又はＮ　Ｈ４０ｌ−１により６．８〜７．２に調節した
。乾燥重量で５〜１０ｇ／ρの細胞濃度にて、インドー
ルアクリルＭ　　＜ＩＡ△）又はインドールプロピオン
酸（ＩＰＡ）を培養物へ２５〜５０ｍＱ／　ｉ’　（７
）　ｉＢ２度で加えた。■ＡＡ又（まＩＰＡを加えてか
ら２〜５時間後、ＩＩ：、ｃｏｌｉ細胞はＷＪ長くなり
、細胞１個当り　１個もしくはそれ以上の屈折体を１ｏ
ｏｏに５の４８率の位相差顕微鏡で見ることができた。

Ｂ、異（’Ｆ蛋白質の単ドｉ１１ 連続達心分離によりＪ９：ｊ養物を収穫し、細胞ペース
１へを−１０〜−２０℃で凍結させた。（収穫前に、必
要に応じ、細胞を０．２５％の］」−ノールと０．２５
％の１〜ル丁ンとを培地へ加え且つ３７℃で　０．５時
間インキュベートすることにより殺菌することができる
（実施例９参照））。新たに収穫又は凍結した細胞ペー
ス１〜を１０ｍＭの王ｒｉｓと１＋ｎＭの！ＥＤＴＡと
を含有するｐＨ７，４の緩衝液中に細胞ペースト１ｇ当
り１０〜□ＡＯｍｅ緩衝液の比率で再懸濁さけ、そして
廁１抱を超？ｈ波処工ｌｌ又は高汀下でのホモグナイズ
によって破砕した。

位相差顕微鏡で細胞残骸にまじって屈折粒子が見られた
。第３図は、１９８２年！１月１５日（＝Ｊ出願の米田
特訂１ｊ願第３６８，１１３号明細書に記載されたつ［
Ｊキナーゼ（Ｕ　Ｋ　）を含有する融合蛋白質を発現り
−るプラスミドｐＵ　Ｋ　３３　ｔｒｐｌ　［２で゛形
質転換されたＥ、ｃｏｌｉＫ１２菌株３１１０（Ａ丁Ｃ
Ｃ２７３２５）に対する懸濁物を示している。屈折体は
、細胞外被内で明るい斑点として現われた。この意ン先
物を１０００ｘＯテ（１）　３心分Ｂａ１ｌ　（３ｏｒ
ｖａｌｌ　　３Ｓ−３４，３，００Ｏｒ、ｐ。

Ｉｌｌ、＞に３〜１０分間かりた。遠心分離後、土浦を
捨て、ペレットを最初の６最の　１１５の同じ緩衝液に
再懸濁さけた１、この懸濁物を位相差顕微鏡下で検査し
、完全な細胞又は目に見える細胞断片が残存する場合は
再懸濁ペレットの肉眼検査で屈折粒子のみが見えるよう
になるまで上記工程を反復した。第４図は、第３図のＵ
ＫＩ白質に対する再懸濁ペレットを示している。調製物
は殆んど屈折性であり、幾分かの細胞及び細胞断片が含
まれることが判る。細胞又は細胞断片が存在する場合は
、懸濁物を破砕工程に再びか（〕る。屈折粒子の単離は
、典型的には３〜４リ−イクル後に行なった。次いで、
屈折粒子調製物をペレットとして凍結保存するか、或い
はｉケ濁物として保存することができるが、これは９５
％程度の屈折蛋白質を含んでいた。

同定覆るため、屈折粒子調製物を５ＤＳ−ＰＡＧ　Ｅ　
、　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法及び／又は放射免疫検
査法（ＲＩＡ）にかけた。第５図はｐＧ）−１，狂犬病
及びウロキナーゼについて得られる精製結果を要約して
いる。狂犬病及びｐＧｆ−１はペレット中に単一の蛋白
質バンドを生ずると思われるが、ウロキナーぜはその幾
つかの同族型（ａｌｌｏｔｒｏｐ’ｉｃ　ｆｏｒｍｓ）
のためより複夕１１である。

実施例２　ヒト成長ホルモン 米国特許第４，３４２，８３２号公報に記載されたにう
なヒト成長ポル゛しンｊ貫伝子を担持りる組換ＤＮＡＦ
　、　ｃｏｌｉＫ　１２細胞（菌株Ｗ　３１１０／　Ｉ
）１０７　）を、実施例１に記載した方法によりファー
メンクーで増９ｆｊさゼ、収穫し、屈折粒子を単ば１し
た。

これら粒子は、２−メルカプ１へエタノール５Ｄｓ＝ｐ
ΔＧ［にｄ３いて２２，０００ダルトンの標ｉ％１分子
二に相当づ−る蛋白質バンドを示し／Ｊｏゲルの温度泪
走査（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ　５ｃａｎ）によるど
、この蛋白質の量が屈折粒子調製物中の全蛋白質の９０
％」メ上であり、ヒト成長ホルモンどじでのこの蛋白質
はＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔで同定した。屈折粒子の収
缶は、湿潤細胞ペースト１ｇ当り約１０〜２０ｍｇであ
った。

第６Ａ図は、最初の遠心分離で得られたペレット黙澗物
中のｈＧＨ含有屈折体を示している。

第６Ｂ図は、この調製物から得られた酸により殺菌され
た細胞及び殺菌されない細胞について５ＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果を示している。殺菌された細胞からのペレットに
おけるｈＧＩ−１に相当するバンドはｊｊｊ人されてい
る。

実施例３　ウシ成長ホルモン（１）ＧＨ）１９８１年９
月１８日付で出願された米田特許出願第３０３．６８７
号明カ１０書に記載されたようなウシ成長ホルモン）貢
伝了をＪ、１１持する組換ＤＮＡＥ、　ｃｏｌｉＫ１２
〈菌株Ｗ　３１１０／　１１Ｂ　Ｇ　＋−１−１）を、
実施例１に記載したと同様にファーメンタ−で増殖さぼ
て収穫した（に■１胞を収穫前にファーメンタ−で０．
２５％の）Ｊノールど０，２５％の１〜ルエンとＣ処理
した）。屈折粒子を単６ｆｌ　Ｌ／だが、これらは５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにＪ′３いて２２，０００ダルトンの分子
伝の標準に相当する単一の蛋白質バンドを示した。ゲル
の濃度計走査により、このバンドが粒子中の全蛋白質の
９０％以上であることが示された。この粒子を７Ｍのグ
アニジンに溶解さ−Ｕ且つ　７Ｍの尿素中に透析した後
、ｂＧ）−１の存在を放射免疫検定法（ＲＩＡ）にＪ、
すｉｄ：明した。屈折粒子の収缶（Ｊい１桁ｉ　１１′
ｌ’ｌ　ＩＩ胞ペース１〜１ｇ当り約２０ｍｇであった
。

実）爾」引Ａ−ブタ成長ホルモン（１）Ｇ　Ｈ）１９８
２年１１月　８日イ」で出願された米国Ｗム′１出Ｍ第
４３９．９７７号明細店に記載されたようなブタ成長ホ
ルモン遺伝子を担持する組換１っＮ　Ａ　Ｆ　、　ｃｏ
ｌｉＫ　１２（菌株Ｗ３１１０／　ＤＧＩ−ｌ”ｃｘｌ
）を、実施例１に記載したと同様にファーメンタ−で増
ηｒ１さゼ、取位した（細胞を収秩する前に発酵装置中
で０．２５％のフェノールと０．２５％のトルエンとで
処理した）。屈折粒子を単離したが、これらは２２，０
００タルトンの分子昂の標準に相当する５ＤＳ−ＰＡＧ
ＥにＪ３いて単一の蛋白質バンドを示した。ゲルの濃度
計走査により、このバンドがゲル上に負荷された全蛋白
質の９０％以上であることが示された。これら粒子を７
Ｍのグアニジンに溶解させ且つ７Ｍの尿素で透析した後
、ｐＧｌ−ｌの存在を放射免疫検定法（ＲＩＡ）で証明
した。屈折粒子の収爪は、湿潤細胞ペース１〜１ｑ当り
約２Ｏｎ＋ｇであった。第７Ａ図は緩衝液中に懸濁され
た■１胞ベース１〜中の１）ＧＨを含有する屈折体の純
度及びＣ度を示し、第７Ｂ図は超音波処理後のペース１
へを示し、第７Ｃ図は低速遠心弁部１の後のペース１へ
を示している。

割糺匠工　ヒト繊肩芽細胞インターフ］−ロン（ＰＩＦ
） Ｎ−１、Ｓ　ｈｃｐａｒｄ等、ＤＮＡ、第　１巻、第　
１２５頁（１９８２）に記載され−Ｉこにうなヒト繊維
芽細胞インターファ［１ン遺伝了を有り゛る外■換ＤＮ
ＡＥ、ｃｏｌｉＫ１２（菌株Ｗ３１１０／　ＤＦ　Ｉ　
Ｆ　３４７　）を、実施例１に記載した方法によりファ
ーメンタ−で増殖させ、収穫し、屈折粒子を単ηｌｆ　
した。１′７られた屈折粒子調製物の２−メルノＪブ１
〜エタノール５ＤＳ−ＰＡＧＦは４７，０００グル１〜
ンの分子口に相当する主バンドを示し、これは屈折粒子
調製物中の全蛋白質の５０％を示した。Ｗｅｓｔｅｒｎ
　ｂｌｏｔにより、屈折蛋白質が純粋なと１へ繊紐芽細
胞インターフ工ＩＩンに対づる抗（ホにＴｊ異的に反応
覆ることが示された。屈折粒子の収、７＋は、湿１１Ｙ
Ｊ細胞ペース１へ１ｇ当り約１０−２０　ｍ　ｇであっ
た、１ 実施例６　ヒト免疫インターフ１［］ン（ＩＩＦ）１９
８１年１０Ｊ］１９臼イ」で出願された米国４ｊＪ許出
願ｌ第３１２．４８９号明細書に記載されたようなヒト
免疫インターフ」］］ン）貫仏子を右Ｊる組換ＤＮＡ、
Ｅ。

ｃｏｌｉＫ１２（菌株Ｗ３１１０／　Ｉ］Ｉ　Ｆ　Ｎ　
　γ　Ｉｒｐ／１８）を、実施例１に記載した方法でフ
ァーメンタ−で増殖させ、収穫し、屈折粒子をｌｉ離し
た。胃られた屈折粒子調製物の２−メルカプトエタノー
ル５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、１７，０００ダル］−ンの
分子Ｍに相当する主バンドが示され、これは屈折粒子調
製物中の全蛋白質の５０％を示した。Ｗｅｓｔｅｒｎ　
ｂｌｏｔにより、屈折蛋白質が純粋なヒト免疫インター
フェロンに対する抗体に特異的に反応することが示され
た。屈折粒子の収出は、湿潤細胞ペースト１ｇ当り約１
０へ一２０１１１！Ｊであった。

づＵ色−Ｊ邑りニア−絹トブラスミノーノ゛ン゛丁−牛
イ′５−（ＴＰＡ） １９８２年７　Ｊ］１４　Ｅｌ　（＝ｊで出願された米
国特許出願第３９８．００３；３明！ｉ′ｌｌｌ　Ｌり
に記載されたＪ、うなヒ１〜組織プラスミノーゲン話性
化因子道伝子を有する１１１換ＤＮ　Ａ　Ｆ　、　ｃｏ
ｌｉＫ　１２　（菌株＼ｔ’Ｊ　３１１０７’　ｐＥ　
Ｐ　Ａ　ｔｒｐ　１２）を、実施例１に記載した方法に
従ってファーメンタ−’Ｃ’　ｌ！８ｉＰｆ＋さぜ、庁
用胞を収穫し、屈折粒子を細胞ペース１〜から」１１自
１１シた。

２−メルカプトエタノール 濃度測定及びＷｅＳｔｅｒｌｌ　ｂｌｏｔ　によって測
定すると、屈折粒子調製物中に存在覆る蛋白質の８０〜
９０％がＴ　Ｐ　Ａであった。ＴＰＡ屈折粒子の取立は
、湿潤細胞ペース１〜１ｇ当り約１０〜２０ｍｇであっ
た。

実施例８　　Ｆ　Ｍ　Ｏ’Ａ、殻蛋白質１９８２年５月
　４日イ」で出願された米国ＱＩ　Ｓ’ｌ出願第３７４
．８５５号明細書に記載されたようなロ踊疫ウィルス抗
原を有する組換ＤＮＡＥ、ｃｏｌｉＫ１２の種々の菌株
（Ｗ３１１０／　ＤＦＭＧ　［０１］　、　Ｗ３１１０
／　ｐＦＭＢ　［Ａ２４］　、　Ｗ３１１０／　ＦＭＤ
　［Ｃ３］　、　ｗ３１１０／ＦＭＣ［Ａ２７］）を、
実／Ｉ旬例１に記載した方法で増７ｊ′ｊ′Ｊさけ、収
穫し、屈折粒子を１１１回した。

それぞれのｊ場合、２−メルノノブ１〜エタノールＳＤ
　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅの８ｚ度測定及び＼ＩＶ（！　
Ｓ　Ｌ　ＯｒＩＩ旧ｏｔ　−１測定すると、屈折粒子調
製物中に存在する蛋白ｖｉの約５０％は、り［１−ン化
にＮ１ＩＤ外殻蛋白ｒ、′４道仏子産生物であった。

実施例９　頗１胞殺菌工稈にＪ：る屈折蛋白質の１１９
加細胞貿中のヒト成長ホルモン（ｈＧｌ−１）の迅対屈
折体中のＩＩＧ＋−１の吊の比を、殺菌された細胞と未
殺菌の細胞とにつぎ比較試験して決定した。ｈＧ　ｌ−
１を発現しイｑるＦ　、ｃｏｌｉ）（７２廁胞（菌株Ｗ
３１１０／１ＮＯ７，実施例２参照）を、実施例１Ａに
記載したように増殖さ已、迫心分雅により収穫した。３
Ｅ心分Ｈ（Ｊる前□に、培地を２つに分り、一方を０．
２５％のフェノールと０．２５％の１ヘルエンとで処理
し、３７℃にで　４時間インキコベー１〜した。殺菌処
理した細胞をＩｔ”ＴＪ！ｔｉｌＩｌ胞と名付（す、殺
菌しイ【いものをｒ　Ｎ　Ｐ　Ｔ　Ｊ左Ｉｌｌ　１１包
と呼ぶ。

△、ＳＤＳによる全Ｎ■１胞蛋白り１の抽出ＩＩ）　Ｔ
及びＮＰＴ細胞の等量の試料を１０　ｍ　ｆｙｌのＥＤ
ＴＡを含有りる５０ｍＭ　Ｔ　ｒｉｓ　　５ｎｄ！と２
０％５ＤＳ２５０ρとから成る溶液中での超音波処理に
より細胞試料のそれぞれを破砕するという同一の処理に
か（）だ。これら懸）蜀物を０．５分間小ルテックスに
かり、次いで遠心分離した。上積を放射免疫検定法（Ｒ
ＴＡ）及び５ＤＳ−ＰＡＧ「にＪ、リ　ＩＩＧ　Ｎにつ
き検定した。ＰＴ及びＮＰＴ細胞の両者はＲＩＡ法にお
いてほぼ同一の活性を示し、特にそれぞれ１威あたり８
．３Ｘ　１０　　及び８，７Ｘ　１０６単位であった。

恐らく、ＳＤＳ抽出法によれば、最初に可）ｈ性のに１
〜成長ボルモンも最初に不溶性であると１−成長ホルモ
ンも回収できると思われる３、冑られたＳＤＳ　　ＰＡ
Ｇ［の結果を第８図に示し、更に次の項に説明Ｊるよう
に処理した試ｊｊ＋１について行なったＳ　Ｄ　Ｓ−Ｐ
　Ａ　Ｇ　Ｆの結果をも第８図に示り。

Ｂ２実験的抽出物 １）　Ｔ及びＮ　ｌ）　Ｔ細胞の更に２つの等量の試料
を、１０口ＩＭのＥＤＴＡを含有する５０％１Ｍ　Ｔ　
ｌ・ｉｓ　　！ｉｍ中へ夫々抽出し、０．５分間ポルテ
ックス処理して同様に処理した。次いて、これら懸濁物
を約１０，０００×９にて１０分間、即ち低速回転で遠
心分ｉｆ、（ｌｏｗｓｐｅｅｄ　５ｐｉｎ、　ｌ　Ｓ　
Ｓ　）　Ｌ／、上清及びペレツ１〜を別々に分析した。

恐らく、ペレツ１〜蛋白質はＳＤＳの不存在下で不溶性
である。Ｎ　ｌ）　Ｔ細胞は上清中で１彪当り　４．６
ｘ　１０６Ｌｌｉ位のレベルの活性を示した（　Ｓ　Ｄ
　Ｓ抽出物のそれの約１／２）が、ペレット中で（ユ著
しく低下した活性を示した（　　Ｉｄ当り０．４２Ｘ　
１０４単位）。使方、ＰＴ細胞はＳＤＳ抽出物に比較し
て、上清中ではｈＧＨの活性が著しく減少しくＲＩＡで
測定して　１ｎ＆当り０．２６Ｘ　１０４単侍）、更に
ペレットの可溶化を行なった際ペレツ１〜中のれ！ｌ竹
が低かった。試料を同様に処理し且つ高速ｊ仝心分８１
Ｊ　（ｈｉｏｈｃｒ　５ｐｅｅｄ　ｃｃｎｔｒｉｆｕｐ
ａｔｉｏｎ、１−ＩＳＳ）即ち３５，０００ｘ　ｇにて
３０分間処理した場合にも同様な結果が冑られた。

Ｃ１れ１．果の比較 第３３図１３１　、　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅを
用いた結果を要約している。ＳＤＳ抽出した細胞は、勿
論、ｈＧｌｌに相当するバンドに（Ｃ３いて同等な強酸
を示した。

ＮＰ丁細胞は、高速遠心力＾ＩＩ及び低速遠心分離の両
者につδ上清どペレットとの両者においで　ｈＱｌ−１
に相当する相当昂のハントを示した。他方、Ｐ丁廁胞は
、上ｄＪにおけるｈＧＨの帛のイバ速及び高速処理の両
者にＣ５いて低下を示したが、ベレッ１へに、１３いＣ
はＪｊＱ加を示した。

ＦＭＤウィルスＡ２４型をコードする遺伝子を右づる［
、　ｃｏｌｉＫ　１２　（菌株Ｗ３１１０／　ｐＦ　Ｍ
　［３［Ａ　２４］。

１９８２年（）月　４日刊で出願された米田特清出願第
３７４．８５５Ｐ３明細舌に記載）を１．’ｌ　５０　
ｎ　ｍ−Ｃ約３０〜５００、Ｄ、単位にイロ当する■１
重密度まで増殖させ、／〃の１ヘリブ１−ファンと約５
％Ｗ／Ｖ以下のグルコースとの培地にＣ５Ｇプる全ブロ
ス１β当り湿潤細胞ペース１へ４０ｇどなるまで増殖さ
けた。［Ｅ×−１）（！ｒｉｎｌｌｔｓ　ｉｎ　　Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　Ｊ、　Ｈ。

Ｍ　１ｌｌｅｒ、Ｃｏ１ｄ　３　ｐｒｉｎｇ　ｌ−１ａ
ｒｂｏｒ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ　。

Ｙ　、　　＜　１９７２）参照］。培養物（１０ρ）を
少なくとｂ　Ｏ，５１１ｉ　間ツレｉ’　ｔ’Ｌ　Ｏ，
２５％　（７）　７　Ｊ／　　／Ｌ／及ヒドルエンて処
理し、次いて遠心分間した。細胞ペース１−をΦ白貿粕
製の前に保存に便利なように凍結した。この実施例で行
なった精製を第９図に示り。

使用直前に？１１１胞ペース１〜を冷凍閥中で解凍した
。

解凍したペースト５００（］をＣ５の緩衝液Ａ（燐酸塩
５（１＋ｎＭ　、　ｒＥ　Ｄ　ＴΔ　５ｍＭ　、　Ｎ　
ａ　Ｃρ５００１ｎＭ、β−メルカプ１〜エタノール（
ＢＭＥ）１５０ＩＭ、　　ρｌ−１７）に分散さぼた。

Ｇ−／１５０ジェネレータを備えたＴ　ｅｋｍａｒ　Ｄ
　ｉｓ＋＋ａｙ、　ｍｏｄｅｌ　Ｓ　Ｄ　−４５（全速
力で　３分間）を使用し−（均−ｌｊ’ｊＪ濁物を得た
。

次いで、この懸濁物を６，０００ρＳ１て操作づるＭ　
ａｎｔｏｎ　Ｇａ１ｌ　ｌ　：　ｎホモグノイザー（Ｔ
　Ｖｐ６１５Ｍ　）に２回通過さけ、その」ノイクルの
間冷用しなからノＩ＼モゲナイズし、小モゲナイズした
均−物を１３　ｅｃｋｍａｎＲＣ３で５．００Ｏｒ、ｐ
、ｍ、、　４℃で３０分間遠心分離した。Ｓ［）Ｓ−Ｐ
ＡＧＥにより、上清が未遠心分自１１のＭ　ａｎｔｏｎ
　Ｇａｕｌ　！１１ホモゲーＪ　イス物トホｌ；Ｊ同じ
蛋白質）捏合物を含有づることが示されたが、ＦＭＤ蛋
白ｖ′（に相当覆るハンド（ま−）Ｆ、　Ｌ　＜　（Ｉ
ｔ下してい　ｌこ　。

ベレン１〜は最初の細胞ペース１〜物の約１７２を含イ
１した。上清をデカン１〜して捨てた。ペレットを新鮮
な緩Ｉｊｎｌ液Ａ　（２４’　／２００ｇペレツ１〜）
中Ｄ　１ｓｐａＸ　３　ｌ）　−４５を用いて分散さＵ
ることにより洗浄し、懸濁物を再びＲＣ３により５．０
０Ｏｒ、ｌ）、１１１゜４℃で３０分間遠心分離した。

上清をデカントし捨てた。ペレツ１〜（，１３７０）は
、５ＤＳ−ＰＡＧＥにＣ３いてＦＭＤＩ白貿に相当づ−
るバンドの増大を示し、これ（よペレツ１〜中の蛋白質
の約５０％を示した。

次いでベレン１〜を、Ｄ　１ｓｐａｘ　３　［）　−４
５を用いて、１ρの緩衝液Ｂ　（燐１’ａＪＡＲ５０ｍ
Ｍ　、　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　１ｍＭ。

１３　Ｍ　６　１５ｍＭ　、クアニジン塩’ｍＪｇ　（
Ｇｕ　ＨＣ１）７Ｍ　、　　Ｉ）ｌ−（７，０）中に懸
濁させることによりＦＭＤ蛋白？ゴを抽出した。この懸
濁物を１晩（Ｃ２拌し、Ｓ　ｏｒｖａｌｌｓ　Ｓ−３４
０−クにおいて１９．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、にＣ４°Ｃ’
Ｃ３ｆｉ’、’目３１遠心分ば（することにより清澄さ
けた。

ペレッ１へを捨て、ＦＭＤ蛋白質溶ｉ？りを３ｃｐｈａ
ｃｒｙ！　　Ｓ−３００（５−３００（Ｐｈａｒクロア
ｙトゲラフにかけた。先づ゛グルを緩衝液Ｂで平衡化さ
ぼ、これを５Ｘ５０ＣＩ１１のカラムに充填した。ボイ
ド空隙画分（最初は２７０威）１ま、カラムに加えた溶
液が濁っていないにも拘らず濁っていた。ＦＭＤ蛋白質
を含有りる両分は４５０〜６５０ｍでてあり透明であっ
た。Ｆ　Ｍ　Ｄ蛋白質自足はノＪ　”、７　ｌｘ画分の
１部を８Ｍの尿素に対し透杉テしＳ　ＯＳ−Ｐ　Ａ　Ｇ
　Ｅにより分析して測定した（グアニジンはＳＤＳにＪ
、り沈澱し、除去ＵねＩＪならない）。

ＦＭＤ蛋白τ′ｉを含有′りる画分をプールし、２ｏ（
８過剰の緩衝液Ｃ（Ｔｒｉｓ　　１４ｍＭ、　ＢＭＥ　
　１５ｒｎＭ。

尿素８Ｍ、　　ｌＮ−１８，３）を４口取９３え−ｃ４
℃で透析した（Ｇｕｔ−ＩＣＩ２の代りに８〜・１の尿
素を使用してＦＭＤ蛋白蛋白溶液中に保った）。

１ｊ■留物の１部をＮａＯ＋−１にＴ　ＩＪｌ−１１０
どし、Ｎ　ａ　、０１−Ｉにより　ｐｌ−１１０に調整
されたｊハ衝液Ｃにより平衡化した１つＥ５２カラム（
１，Ｏｃｍｘ　１９ｃｍ＞に通した。ＦＭＤ蛋白質は樹
脂により保持されなが・）だが、Ｅ、ｃｏｌｉ夾雑物の
大部分は吸着されＩＣ。流過容量中の蛋白質は５ＤＳ−
ＰＡＧＥにより測定して９６％のＦＭＤ蛋白質であり、
これは使用したＭｌ胞ペース１〜　Ｉｋｇ当り３０ｇの
収景、即ち約９０％を示した。活性物質の投与の際尿素
が存在してもよい場合、この物７′Ｘを最終生成物とし
て使用することがてぎる。

この製造においては、ＦＭＤ蛋白で１の沈澱を行イ１わ
ずに、４ｍｇ／彪の蛋白質を用いて、２５０倍容Ｇ４の
過剰の尿Ｒ７１Ｍ、　Ｔｒｉｓ　　１４ｍＭ、　ＢＭＥ
　０１１％、　　ｐｌ−ｌ　７に対し４℃で透析し、次
いで？１１）個物を水に対し透析して、尿素を除去した
。僅かの濁りか生じ、これをｊ仝心分饋により除去した
。水又は桜仲ｉ液中のＦ　ｌｖｌ　Ｄ　１５白質の沈と
は、尿素濃度を徐々に減少することで実際上防止された
。得られたＦ　Ｍ　Ｄ蛋白質は、ＦＭＤ抗血清との反応
性、Ｗｅｓｔｃｒｎ　ｂｌｏｔ及び免疫反応に基づくウ
シのユし■副分析ににす、生物学的に活性であることが
示された。

実施例１１　　ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）の精製［、
ｃｏｌｉＫ　１２　（Ｗ３１１０／　ＤＰ　Ｇ　１ｔ−
ｅｘｌ、実施例’ｌ）＠実施例１と同様ニ５５０１１ｍ
ニテ３０〜５０Ｑ　、　Ｑ　。

単位まで増殖させ、即ち１ρ当り湿潤細胞ペース１〜４
０（ｌどした。この培養物をフェノールとトルエンとの
両者につき０．２５％にし０　、５　ＩＩＩ）間維持し
た。

次いで、このブロスを遠心分離し、細胞ペース１〜を凍
結保存した。

使用直前に細胞ペースト３８４ｇを冷蔵ｔｈｅ中Ｃ′解
１５１４し、３．９βの冷緩衝液△（燐Ｗ　ｇ　５０ｍ
Ｍ　、　Ｅ　Ｄ　ＴＡ　５ｍＭ　、　Ｎ　ａ　０１５０
０ｍ〜ｌ　　Ｉ）Ｈ７）中に分ｉｊＱさせた。Ｇ−４５
０ジエネレータを備えたｌ−ｃｋｍａｒ　Ｄ　１ｓ−ｐ
ａｘ　１１０（１（！ｌ　３　ｆ）　−４５（Ｋ２定値
６ｏにて　３分間）を用いて均一懸濁物を胃、この懸濁
物をＪ５００ｐｓｉにで走査づるＭａｎｔｏｎ　Ｑａｕ
ｌｉｎホモゲナイザー（Ｔ　ｙｐｅ　１５Ｍ　）を２回
通過させ、そのサイクルの間冷ｆｉｌ　Ｌながらボモゲ
ナイズした。

このホモゲナイズ物（４，３Ｎ　）を３ｏｒｖａｌｌ　
　ＲＣ３中で５，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、、　４℃で３５分
間遠心分前した。

上清をデカン１〜したところ、５ＤＳ−ＰΔＧ「による
と、遠心分離前のホモグナイズ物とほぼ同じ蛋白ｖ゛１
の混合物を含有することが示されたが、ｐＧ　＋−１に
相当づるバンドは苔しく減少していた。

上清を捨て、ペレットを新たな緩衝液Ａ　（１，５ｐ／
１５０ｇペレッ１〜）中にＧ　１ｓｐａｘ　Ｓ　Ｄ　５
−４５を用い−Ｃ分散ざμた。この然）間物を再ひＲＣ
３により５．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で４°Ｃにて３５分間
遠心分自１１シた。上清をｆノＪン１〜し捨てた。

ベレッ１へ（１０６ｇ）を、０．７５０ｆ！の緩衝）（
りＢ（Ｔｒｉｓ　　５０ｍＭ、　ＥＤ−１部１ｍＭ　、
　Ｂ　Ｍ　Ｅ　１００ｍＭ　。

グアニジン塩酸塩７Ｍ’、　　Ｉ）ｌ−１８，８）中に
、Ｄｉｓ−ＤａＸＳＤ−４５を用いて溶解させ、次いで
１晩ｆｆｉ拌した。この濁った溶液を５ｏｒｖａｌ　１
３３−３４０−タにＪ′３いて１９．００Ｏｒ、ｐ、口
１．で４℃にて６．０時間遠心分臼１１することにＪ、
り清澄させ、ペレットを捨てた。

ｆ３９０ｄの上清く全容量　７４０ｍ）を室温で１０ｘ
　８５ａｍのＳ　ｃｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−３００（Ｐ
　ｈａｒｍａｃｉａ　）ノコラムにおい−Ｃ２つの部分
（３５０ｍρ及び３４５ｍ＞につきクロマ１〜グラフに
か（プた。カラムをグアニジン塩酸塩７Ｍ、　Ｔｒｉｓ
　　５０ｍＭ、　ＥＤＴＡｌｍＭ、　ＢＭＥ　５０ｍＭ
　（ｐＩ−１８，９）で平衡化してから使用した。カラ
ム画分の一部を尿素８Ｍ、　ＢＩＶＩＥ　Ｏ，，１％２
丁１゛１ｓ２５ｎ１Ｍ　（１）ｔ−ｌ　　７）に対して
透析し、Ｓ　ｆ、）　Ｓ−Ｐ　ＡＧＥにより分析して　
１）Ｇｌ−１の存在を確認した。

ｐＧｌ−１含有画分をプールし、約２０倍週刊の１−ｒ
ｉｓ　　塩ｕＪ盆　１５ｍ１ｖｌ　、　　Ｂ　Ｍ　　Ｅ
　　　５０ｍ１ｖｌ　　、　　尿素　７Ｍ（１）Ｈ９，
０）を４回取替えて４℃で透析した。滞留物（３，９０
０誦）をＨＣρにてＩ）ｌ−１７，ｏとなし、これをＴ
　ｒｉｓ　　１５ｍＭ　、尿素７．５Ｍ　、　Ｂ　Ｍ　
Ｅ　５０ｍＭ（吐　７．、Ｏ”）　ｒ平衡化させたＤ’
Ｅ５２カラム（１０ｃｍＸ１１，５Ｃｎ＋）に室温で通
した。このカラムをカラム容量の平衡化緩衝液で洗浄し
てｐＧｉｌを洗い出した。

ＤＦ５２プール（４，０００ｄ）をＮ　ａ　Ｏ！−１で
吋−１１０まで滴定し、スペク１〜レーパ（Ｓｐｅｃｔ
ｒａｐｏｒ　）　　１中で”ｌ　ｒｉｓ　　２５ｍＭ　
、　マンニ１〜−ル１％（１）ｌ−１１０）を（れぞれ
１００ρずつ３回取替えて４℃で透析した。滞留物をプ
ールし、透析液により１０．４ρまで希釈し、無菌濾過
し、凍結軟泥した。１）Ｇｌ−１の純度９８％である生
物学的に活性な蛋白質（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔによる
）１０ｇが冑られた。

実−施例１２　　亜硫酸分解を用いるプロレンニンの再
折昏み Ｅ　、　ｃｏｌｉＫ　１２　（係属中の本出願人の米国
特ｉｉ’ｒ出願Ｄ　ｏｃｋｃｔ　ｎｕｍｂｅｒ　１００
／　１３０に記載されたプロレンニンをコードする遺伝
子を担持する菌株Ｗ３．１１０／ｐＲＩＡＸ）からの細
胞ペースト４３２ｇを、５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｌ　ＳＬ”
ｊ＋　Ｍ　ｊ蕩及び５ｍ〜１の［Ｄ丁△（ｐｌ−１７，
５）にり成る緩衝液３ρ中に懸濁させた。この懸濁物を
Ｍａｎｔｏｎ　Ｑａｕｌｉｎ　ｐｒｅｓｓにより６，０
００ｐｓｉで　４回通過させて細胞破砕にか【プた。破
砕されたｆ、９　ｊＱ物を次いで４０００Ｘ　Ｕにて３
０分間ｊ仝心分磨（シ、上清を除ムして捨−Ｃた。ペレ
ッ１゛・を最初の懸濁物に使用したと同じまガ衝液２ρ
中に再懸濁ざμ、再び４０００×Ｑにて３０分間ｊ仝心
分離した。上清を再び捨て、ベレン１〜をＴｒｉｓ　　
５０ｍＭを含有りるＩ）ｌ−１８のグアニジン塩酸塩６
Ｍに溶解さゼた。次い℃゛、司溶化した屈折蛋白質を、
グアニジン溶液を亜ＩＪ　ＩＭす１〜リウム２０ｍｇ／
ｄ且つデトラチオン酸す１〜リウム１゜ｍ！ＩＩ／　ｄ
どづることによりスルホン１ヒし、イの際これらの成分
は新たに調製した透明イＦ　ｎ’ｉ’　ｆｉ戊温溶液一
部を加えた。スルホン化を室温にて４１ＩＩ間進行さぜ
　Ｉこ　。

次いで、この溶液を７ｒ＊ｓ　　５０ｎ１Ｍ塩酸塩を含
有するｐｌ−１７，５の５Ｍ尿素中に５１１間透析濾過
した。

透析濾過された溶液を；次いで予め同じ「結合（旧ｎｄ
ｉｎｇ）　ｊ　ＮＨ９ｒ溶液（尿素５Ｍ、丁ｒｉｓ　　
５０ｍＭ塩酸塩、ｐｌ−１７，５）にて洗ｉ′Ｊ’＋　
した１０Ｘ３５ＣＩＩｌのＤ［５２カラｌ＼上に入れた
。この溶液を毎ＩＣ’ｌ’　７５０　ｍで′加え、結合
用緩衝液で１晩洗ン’ｆｒ　Ｌ／た。

次いで、Ｄ「５２カラムをＮａ　ｃｐ　　Ｏ−０，１５
Ｍ勾配を用いて毎日）１ρの流速で１６時間に亘って溶
出ざＵた。人ｉ３Ｂ分の蛋白質がＮａ　Ｃ（！　　０．
０７０Ｍテ溶出した。プロレンニンを含有する両分を再
び尿素！ＩＭ　、　ｌ−ｒ　！Ｓ　」Ａ　％　ＪＡ　５
０１ρＭ　（１山　８．５）に対し透！ｌ’ｉ　Ｕ”　
過Ｌ／、コ（７）　７８７Ｗ　’ａ’　Ｇ　Ｓ　Ｈ１ｍ
　Ｍ　ｆｌ　ッＧ　Ｓ　Ｓ　ＧＯ，１１ｎＭとイ「し、
η５温　１晩インキュベ−１〜した。尿素を除去丈るた
めのイ」加面な透析濾過を、Ｇ　Ｓ　ｌ−１を０．１ｍ
ＭＱ右する１−ｒｉｓ　　５０ｍＭ　（ｐＨ８，０＞に
対して行なった。得られた溶液は変性剤を含有ゼず、５
．５ｇの蛋白質を含有し、゛即ち全収率は約１％であつ
だ。この蛋白質は、プロレンニン抗血澗に対する反応及
０’　標ｉ４丁、　ｉｒｔ乳分析（ｓｔａｎｄａｒｄ　
ｍ１ｌｋ　ｃｌｏｔ−ｉ　：　ＩＩＱ　ａｓｓａｙ）に
（１３（〕る話・１ノ１（自触媒活性化後）により測定
するど生物学的活性を示した。

実施例１３　　部分亜′ｆｌｙｌｉ酸分解にＪ：る活ｔ
’ｌつ［−１キナーレ゛の製ｊ貫 ウロキナーＬ′含有の屈折体を、１９８２年４月１５０
（＝Ｉで出願された米国特ｉ′１出願第３Ｇ８，７７３
弓に１；α戟されｙ＝ようなＵ　、　ｃｏｌｉＫ　１２
　（菌株Ｗ３１１０／　Ｉ）ＵＫ３３　ｔｒｐｌ−ＩＦ
Ｌ）力口ら、実施例１に記載し／〔方法にまり単離した
。この屈折体を、５０　ｎｌ　Ｍ丁１゛１ｓを含有りる
ｐｉ−ｉ　ａ、ｏの５〜１グアニジンｊＸ１！　酸塩に
溶解さけた。この溶液を、亜硫酸ブー　１−リウへ〇、
２ｍ（］／ｄ月つテ１〜ラヂオン酸す１ヘリウムＯ，Ｉ
ｍｇ／　ｍｅとし、′ＪＪコ温で　１晩インキユへ−１
−シた。

次いて、この溶液を７　ｒ　ｒ　ｓ　Ｌ　ｈｒ＋液５０
ｍＭ　、　　ｐＨ９，０にてグアニジンＨＣｆｌ　１．
５Ｍのレベルまで希釈し且ツＧ　Ｓ　ｌ−１１０ｍＭ対
ＧＳＳＧ１ｍＭとした。溶解した蛋白質を含有Ｊ−る希
釈グアニジン溶液を再び室温にて１晩インギコベートし
、水溶液に対し透析した。屈折イホはウロキナーじに対
Ｊる標準生物検定にｄ″３いて０．２５　Ｐ　Ｕ　／　
ｎｌ（］の活性を示したのに対し、」ニ記で示した手順
で得られるウロキナーゼは　１５０Ｐ　Ｕ　／Ｌ口）９
の活性を示した。

実施例１３に示したＪ：うに調製した屈折体をＴ’ｒｉ
ｓ　　５０ｍＭ　（ｐｌ−１ａ、ｏ）中のグアニジン塩
酸塩５Ｎ・１中に溶解させ、次いでこの溶液を尿素２Ｍ
。

Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　Ｊ＝　ｆｌ’２塩５０ｍＭ　（ＤＩ−
１７）に対し透析した。

次い−Ｃ１溶液をＧ　Ｓ　Ｈ１０ｍＭ対ＧＳＳＧ１ｍＭ
とし、室δｍで１晩インキコーベートした。再折畳み蛋
白質を含有Ｊ−る得られた溶液を水性媒体に対し透析し
た。得られた溶液は、３０ＰＵ／ｍＵの活性を示づ一つ
ロキナーＵを含有した。

実施例１５　　肉腫蛋白７：１の再折！ＪｔみＪ　、　
　Ｆ）、　Ｍ　ｃ　Ｇｒａｔｈ及びＡ、　　Ｄ、　　ｌ
　ｅｂｉｎｓｏｎ。

Ｎ　ａｔｕｒｅ、　２９５巻、４２３頁（１９８２年）
に記載された方法に従って調製された形質転換細胞に実
施例１の手順を適用りることにより、肉腫、即ち元々肉
１１重腫瘍から単離した蛋白質をイｑだ。天然の緩衝条
イ１下で不活性であったこの蛋白質３ｍｇに対し、グツ
′ニシン　７Ｍ　３ｎ＆と、　ＩＩ　　８のＴｒｉｓ　
　ＩＭ　３００ｍと、［Ｄ　ＴＡ　０．５Ｍ２０１戻と
、２００ｍｇ／　ｍｅの亜！ｊＸ’ｆ　Ｖ）１ヘリウｌ
＼及び１００ｍｇ１ｔｔｒｌのデ１〜ラヂオン酸す１〜
リウムを含有り−る溶？段４００成とを加えた。この溶
液を室温で　１晩静直し）窮っだ懸濁物を胃だ。

この懸濁物をＴｒｉｓ　５ｍＭ　（ｐｉ−１８）を含有
する尿素７Ｍに対し透析した。この溶ｄりの半ＬＲへグ
リシン０．１Ｍ　（ｐｉ−１９，５）　　３００成とβ
−メルカプ１〜Ｉタノール１０ｍＭ　、　り０μｍどを
加え　１晩静置した。

７　ｒｉｓ　　５０ｍ１ｙｌ　（１）ｉｌ　　８．５）
に対し透析した後、この同じ蛋白質は可溶性となり、マ
ウスに注射した際、標準肉腫蛋白質に対して沈澱し寄る
抗体を誘発することがでさ・た。

実施例１６　　グアニジンへの溶解及び尿素への抽出実
施例１Ａに記載したように、Ｆ　、　Ｃ□１ｉ１（１２
（Ｗ３１１０／　１）Ｆｌｖｌ　［Ａ２４］　）　　（
実施例８）を増り１１：１さぜ、）仝心分離により収穫
した。細胞ベース１〜（湿潤重量２８１！ＩＩ）を１０
侶容早の燐酸塩抽出緩衝液（ＰＥＢ　：　Ｎａ　Ｈ２Ｐ
Ｏ４５０ｍＭ、ＥＤＴ△５ｍＭ　。

Ｎａ　Ｃ１０，５Ｍ、　ＢＭＥ　　０．１％、　　Ｉ）
ｌ−１７，０）中にウル１゛うＩ・レックス（ｕ　ｌ　
ｔｒａｔｏｒｃｘ　）を用いて１次濁させた。寄られた
懸濁物を予ｆｆｆ５冷却された１ｖｊａｎｔｏｎ　Ｇａ
ｕｌｉｎにＧＯＯｐｓ　ｉにて　１ρ７　ｍ　１ｎの速
度で２回通した。ＲＣ５Ｂ型遠心分離はにて５．００Ｏ
ｒ。

ｐ、ｍ、で０．５時間ｊ仝心分ｉ＋ｉｌｆ　シた後、ペ
レットをウル１〜う［・レックスにより１０倍容最の１
つＥＢ中に再懸）蜀させた（１０ｍｉｎ、）。この鷹）
局物をＲＣ５１３ｊｆ、’Ｊ　Ｍ心弁ｉ’ｉｌ　ｆＵｏ
にて５，０００！’、ｊ）川、で０，５時間逆心分子ｍ
ｉｌ　シ、４Ｈ７られｌコベレッ１〜を２０（８容Ｈ１
のｒｌＪ＜　；ｌ’；−丁ｒｌ　Ｓ　Ｍｌ＜　ＦｆＪ？
ｌシ［ＵＴＢ：尿素８Ｍ　（新たに調製し月っ説イオン
しＩＪＬ）の１、丁１”ｉｓ　Ｏ，１４Ｎ’ｌ　、　ｌ
’３　Ｍ「ｏ、１”（＋　。

ｐｉ−１８，３）中に入れ、沸社水浴中で０．５時間加
熱した、２累温まで冷却した後、４倍量のアレ１〜ンを
加え、溶液を約６℃にて　１　、５　Ｂｒ４間撹拌した
。）Ｍ）間物を次いでＲＣ３１３型３を心分子ｉ［機ニ
Ｔ　５，０００１”、ｐ、Ｉｎ。

て連心分）Ｎｆｌ　シ、寄られたペレットを１０　（＊
ｉ容ζ・のＰＦＢに移した。１ケ）間物を沸賎水浴上て
０　、５１１７間加熱した後、この月別をＲＣ５Ｂ型遠
心分朗橘にて５．０００ｒ、ｌ）、口１．て再度遠心分
出（１し、得られたベレッ１〜を２．２ρの７ＭＧｕ　
ＨＣｊ２　、　０．１％ｆ３１ｖｌ　Ｅ　’ｌ’に４８
時間再懸濁ざじた。

次い−（・この試料を、ＵＴＩ３を３回取替え−Ｕ　ｐ
ｌ−１８，０で透析し、次いでＵＴＢ　（ｆ）ｌ−１８
，０）で平衡１ヒされたＤＥ−５２レルロースノコラム
（５ｘ８ｃｍ　）η・・クロマ１〜グラフにか（）だ。

カラムの）先浄液を２つの両分、即ち、透明画分と濁っ
た両分として集めた。透明な画分（９８％以上のＶＰ３
）を約１．３＋ｎｇ／ｍま−Ｃ’　（１４４縮し、生物
学的活性につき試験した。

上記のように増殖させ、収穫し月つ処理したが、ベレン
１〜を処Ｊ■１する際にＧＵＩ−１（ｌの代りにＵＴＢ
を使用して、Ｅ、　ｃｏｌｉＫ１２（Ｗ３＋１０／　ｌ
）Ｆ〜１日［Ａ２４］）からコン１へロール抗原バッチ
を調製しｌこ　。

この試料をモルモッ１へに注射し口つ２８日後に抗血清
を１′７ることにより試験した。次いで、この抗１１７
１　？ｉ’ｉの１−ＭＤウィルスからマウス胎仔を保護
するｉ’ｊｅ力により抗体タイターを試験した。それら
の結果をネズミの５０％に対し免疫をイ」勾し得る抗血
清の希釈の負対数どじで示す（−ｌｏｇＰＤ５（１）。

上記調製物の蛋白質１００ＩＪ！Ｉを注射して得られる
抗血７′１′４は３．２”　３．４の−ｊｏｇ　１１）
　１つり。値を示したが、」ント【］−ルから１″ノら
れた抽出物の蛋白’；Ｉｉ　１００μ３を法則して１１
１られる抗血清は０．３未満の一１ｏｌｌ）Ｉ）■。値
を示した１３

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法の工程を模式的に承り略図でｄつ
り、 第２図は、本発明方法の他の面、ｆｉＩ］　ノ、）多段
階ｆ＋′ｌ製法の工程を模式的に承り略図であり、第３
図は、つ１」キナ−ｔ？（ＵＫ）含イＪ融合（ｆ）白Ｔ
ｉを発現づる細胞ペース１〜の位’Ｉ’１１７；顕微鏡
写真であり、「、　ｃｏｌｉＫ　１２　（Ｗ３１１０／
　ｐｌＪ　Ｋ　３３　ｔ、ｌ・吐「Ｌ）は良融合（ｌｏ
ｎｇ−ｆｕｓｉｏｎ）　３３にウロキナーゼを発現し、 第４図は、第３図の破砕細胞の低速ｊ仝心分部により臂
られたペレッ１−然澗物の位相Ｚ窮！１欣８°１写真で
あり、 第５図は、ｐＧＨ，狂犬病抗原及び・ウロキナーゼの調
製物に対−りる５ＤＳ−ＰＡＧＥクロマ１〜グラムの結
果を示し、細胞の粗製超音波処理物中の所望蛋白質に対
づる不純物の含Ｅｄを、本発明の方ｄ１により製造した
単離屈折イホのそれと対比して示し、レーン２，４．６
は全細菌の超音波処理後５ＤＳ＝ＰΔＧＦの結果を示し
、レーン３，５．７は、夫々、ｐＧ　ｌ−１、狂犬病抗
原及びウロキナーゼ（Ｕ　Ｋ　）の屈折体を産生づる■
菌培養物を実施例１に従って処理したベレン１〜の超音
波処理後５ＤＳ−ＰＡＧ［二の結果を示し、全細菌では
Ｈ？含物を示すのに対し各ペレッ１〜はほぼ所望蛋白質
のみを含有しており、レーン１は「ブランク」プラスミ
ド　ｐＢＲ３２２で形質転換したＥ　、　ｃｏｌｉＫ　
１２Ｗ３１１０から得た超音波処理物を示し、 第６Ａ図は、［、ｃｏｌｉからＬｌ離したヒ１−成長ホ
ルモンの部分単離屈折体の写真であり、実施例２に記載
しｌζように回収された、Ｅ　、　ｃｏｌｉＫ　１２　
（Ｗ３１１０／　ｐ１０７）から１ワた懸濁ペレッ１〜
化屈折体の位相差顕微鏡写真であり、 第６Ｂ図は、全細胞溶菌物を、生細胞及び殺菌細胞の両
者に対りる屈折体蛋白質含量と対比した、５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲルの写真であり、レーン１及び３は、夫々、殺菌
及び非殺菌細胞の全細胞溶解物であり、混合蛋白質及び
ほぼ等量のｆｉＧｆ−１を示してＪ５す、レーン２及び
４は、夫々、殺菌及び非殺菌細胞の屈折体（ベレン１−
）から冑た抽出物であり、殺菌細胞ではＩＩＧ　Ｈバン
ドが増大してＪ５す、第７Ａ図は、ｐＧＨの屈折体を含
有づるＬ工匹旦仝１１１胞の写真であり、Ｆ　、　ｃｏ
ｌｉＫ　１２　（Ｗ３１１０／　Ｉ）Ｇ　ｌ−１−ｅｘ
ｌ　）から１かた細胞ペースト懸濁物４示し、　第７Ｂ
図は、第７Δ図の調製物の超音波処理物の写ｖ、工であ
り、 第７Ｃ図は、第７Ｂ図の超音波処理懸濁物を低速遠心分
ば１した際の遠心分離ペレットの写真で・あり、 第８図は、ｈＧＩ−１を発現づる［、　ｃｏｌｉＫ　１
２　（Ｗ３１１０／　Ｄ　１０７　）の殺菌■１胞及び
未殺菌細胞の上清及びペレツ［−フラクションにお（〕
る５ＤＳ−ＰＡＧ「の結果を承り写真であり、レーン１
２はｈＧＩ−１の純粋な試わ１てあり、レーン９及び１
０（Ｊ、夫々、非殺区ｉ　（Ｎ　Ｐ　Ｔ　）及び殺菌（
ＰＴ）全細胞のＳＤＳ抽出物を示し、各々混合蛋白質を
示しており、ｈＧｌｌにイ［１当づる強いバンドが見ら
れ、レーン１及び５【よ、夫々、ＮＰＴ細胞のＬＳＳ及
びｌ−Ｉ　Ｓ　Ｓ上清を示し、レーン３及び７は、人々
、ＰＴ細胞のＬＳＳ及びＨＳ　Ｓ上清を示し、レーン３
及び７（１丁）の＋Ｔ　Ｇ、　ｌ−Ｉバンド強度（Ｊ茗
しく低下しており、レーン２及び６は、夫々、ＮＰＴ細
胞のＬＳＳ及びＩ−Ｉ　Ｓ　Ｓペレットを示し、レーン
４及び８は、Ｐ　Ｔ細胞のペレッ１へを示し、ＰＴＩ胞
のｈＧＨバンドｉ；Ｌ　ｉｔ’ｉ大してｉＢす、 第９）図【Ｊｌ、実施例１０に（こ記事：又しＩこオ″
青袈処理工（？を模式的ｉご示づｌｌ′９１Ｆ１である
。 Ｆｊｑ、２ −．−１８１− Ｆ’ｙ’、４．バジ１、 ／〜ンｔ’、’７．’／ン□′）、 ｆ”ｔ’、ｒＪ６１ダ。 ／　ンｔ７，７”ｔ１ 第１頁の続き 優先権主張　＠１９８２年１２月２２日■米国（ＵＳ）
■４５２３４４ ＠１９８２年１２月２２日［相］米国（ＵＳ）［有］４
５２３６３ ＠１９８２年１２月２２田沖米国（ＵＳ）［有］４５２
２５２ ＠１９８２年１２月２２田■米国（ＵＳ）＠４５２２５
３ ＠１９８２年１２月２２日＠米国（ＵＳ）＠４５２３５
７ ＠１９８２年１２月２２…■米国（ＵＳ）■４５２３５
６ に＄１９８２年１２月２年目２月２２日（ＵＳ）＠４５
２３５５ ・部発　明　者　ノーム・スイン・シヤツク・リン アメリカ合衆国カリフォルニア ９４４０４フオスター・シティ・フ レイン・アヴエニュー６９８ （７２）発　明　者　ジョン・ロバート・オーゲズアメ
リカ合衆国カリフォルニア ９４４０１サン・マテオ・ノース・ ハンボルト・ストリート８３３ア パートメント４０１ ＠発　明　者　ケニス・チャールズ・オルソンアメリカ
合衆国カリフォルニア ９４０１０バーリンゲイム・ヒルサ イド・ドライヴ３０３６ （老発　明　者　ロング−チャンク・パイアメリカ合衆
国カリフォルニア ９４４０４フオスター・シティ・プ ライス・ストリート１１３６ ＠発　明　者　ステイーブン・ヤコブ・シアアメリカ合
衆国カリフォルニア ９４４０３サン・マテオ・ベレスフ オード・ストリート４３４１アパー トメント１ ■発　明　者　ロナルド・バーネル・ウエツゼル アメリカ合衆国カリフォルニア ９４１２７サン・フランシスコ°ア ーバノ・ドライヴ４５５ 手続補正書 特許庁長官　　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示　　　昭和５８年特許願第２４１８２０
丹２、発明の名称　　　沈澱異種蛋白質の精製及び活性
化法３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名　称　　　ジエネンテツク・インコーホレイテッド４
、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号
　山ＤＪビル５、補正命令の日付　　　自　発 ８、補正の内容 （１）明細書中温８３頁第７行目「特許出願第３６８．
１１３号明細書」とあるを「特許出願第３６８，７７３
号（欧州特許出願公開第９２１８２号）明細書」と補正
する。 （２）同第８６頁第９行目ｒ　３０３，６８７号」とあ
るをｒ　３０３，６８７号（欧州特許出願公開第７５４
４４号及び英国特許出願公開第２１０６１１９号）」と
補正する。 （３）同第８７頁第９行目ｒ　４３９，９７７号」とあ
るをｒ　４３９．９７７号（欧州特許出願第８３３０６
７３０号）」と補正する。 （４）同第８９頁下から第６行目「３１２，４８９号」
とあるをｒ３１２，４８９号（欧州特許出願公開第７７
６７０号及び英国特許出願公開束２１０７７１８号刀と
補正する。 （５）同第９０頁下から第７行目ｒ３９８，００３号」
とあるを「３９８，００３号（欧州特許出願公開第９３
６１９号及び英国特許出願公開箱２１１９８０４号刀と
補正する。 （６）同第９１頁第７行目「３７４，８５５号」とある
を「３７４，８５５号（欧州特許出願公開第６８６９３
号及び英国特許出願公開第２１０３６２２号）」と補正
する。 （力　同第９５頁下から第２行目ｒ３７４，８５５号」
とあるをｒ３７４，８５５号（欧州特許出願公開第６８
６９３号及び英国特許出願公開第２１０３６２２号）」
と補正する。 （８）同第１０４頁下から第３竹目ｒ１００／１３０Ｊ
とあるをｒ１００／１３０　（欧州特許出願第８３３０
７８４１．３号及び第８３３０７８４２　、１号（特願
昭５８−２４１７９４号及び５８−２４１８２１号））
」と補正する。 （９）同第１０７頁第８行目ｒ３６８，７７３号」とあ
るをｒ　３６８，７７３号（欧州特許出願公開第９２１
８１す」と補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　宿主細胞培養で発現した異種産物を含有する屈
   折物質を変性溶液と接触させるステップを含む宿主細胞
   発現異種産物の処理方法。 （２）　屈折物質を強力変性剤に溶解することと、前記
   処理方法が、更に、非溶解物質から上清を分離するステ
   ップ及び溶液から前記産物を回収するステップを含むこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）　屈折物質を場合により還元剤の存在下で強力変
   性剤に溶解し、得られた強力変性溶液をサイズ分画分子
   篩と接触させるか又は高速遠心分Ｎ（にかけて高分子量
   成分を溶液から除去することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 （４）　屈折物質を強力変性剤に溶解することと、前記
   処理方法が、更に、前記産物を溶液中に維持しつつ変性
   溶液の強度を実質的に低下するステップを含むことを特
   徴とする特許請求の範囲第１項又は第３項に記載の方法
   。 （５）　強力変性剤を弱い変性剤の溶液で置換すること
   により変性溶液の強度を低下づることを特徴とする特許
   請求の範囲第４項に記載の方法。 （６）　変性溶液の強度低下に先立って、強力変性溶液
   を処理して前記産物中のジスルフィド結合を開裂するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第４項又は第５項に記載
   の方法。 （７）　弱い変性溶液を処理して前記産物中のジスルフ
   ィド結合を開裂することを特徴とする特許請求の範囲第
   ４項又は第５項（こ記載の方法。 （８）　前記処理が温和な酸化剤の存在下亜硫酸塩での
   亜硫酸分解から成ることを特徴とする特許請求の範囲第
   ６項又は第７項に記載の方法。 （９）　ジスルフィド結合の開裂後、弱い変性溶液を少
   量の対応で−るジスルフィドを含有覆るスルフヒドリル
   化合物で処理することを特徴とする特許請求の範囲第４
   項乃至第８項のいずれかに記載の方法。 （１０）　　スルフヒドリル化合物及びそれより少量の
   対応するジスルフィド型を含有する変性溶液で前記産物
   を処理するステップを含むことを特１５１とする特許請
   求の範囲第１項、第４項又は第５ＪＯに記載の方法。 （１１）　　産物を強ツノ変性溶液に溶解し、引続きｐ
   １ツ物中のジスルフィド結合を切断する還元剤の存在下
   で精製し、更に変性剤を殆んど又は完全に除去し、酸化
   により産物中のジスルフィド結合を再形成することを特
   徴とする特許請求の範囲第１項又は第３項に記載の方法
   。 （１２）　　前記産物を含む宿主細胞を緩衝溶液に分散
   し、宿主細胞蛋白質を含、有する可溶性画分と屈折型の
   前記産物を含有する不溶性画分とを得ることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項乃至第１１項のいずれかに記載
   の方法。 （１３）　　屈折物質が、非屈炉宿主細胞物質を実質的
   に含まないペレットとして生成することを特徴とする特
   許請求の範囲第１２項に記載の方法。 （１４）　　ベレン１〜が、 〈１）前記産物を含有する宿主細胞物質を破砕しＣ前記
   産物を屈折型で遊離し、 に；ｚ＋（速遠心分離により屈折物質のペレットを生成
   し、 揚台により、非屈折細胞破砕物がペレット中に存在しな
   くなるまで、必要に応じて賀られたペレット物質に対し
   てステップ（ｉ　）及び（１１）を繰り返すことによっ
   て生成されることを特徴とする特許請求の範囲第１３項
   に記載の方法。 （１５）　　宿主靜１胞培養物を細胞死滅処理にかけ、
   次いで細胞を破砕して前記産物を屈折型で抽出すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１２項乃至第１４項のい
   ずれかに記載の方法。 （１６）　　死滅処理が酸処理、熱処理又は非（重性右
   （幾溶媒処理によつ“Ｃ行なわれることを特徴とする特
   許請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１７）　　異種蛋白質含有屈折物質を宿主細胞物質か
   ら抽出覆る方法であって、 ■　宿主細胞物質を緩衝溶液に懸）蜀づ−るステップ、 ■　細胞物質を破砕して屈折物質を遊離するステップ・
   及び・ ■　低速遠心分離により屈折物質のペレットを形成する
   ステップ を含む屈折物質抽出方法。 （１８）　　必要に応じ、非屈折細胞破砕物がペレット
   中に存在しなくなるまでペレット物質に対してステップ
   ■之■を繰り返すことを特徴とする特許♂」求の範囲第
   １７項に記載の方法。 （１９）　　細胞を先ず細胞死滅処理にかけることを特
   徴とする特許請求の範囲第１７項又は第１８項に記載の
   方法。 （２０）　　死滅処理が熱、酸又は非極性有機溶媒処理
   から成ることを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記
   載の方法。 〈２４）　　宿主細胞中で異種産物として発現した蛋白
   質を含む弱い変性溶液を、少量の対応するジスルフィド
   の存在下でスルフヒドリル化合物と処理するステップを
   含む蛋白質の再賦活化方法。 （２２）　　蛋白質を処理してジスルフィド結合を開裂
   することを特徴とする特許請求の範囲第２１項（ご記載
   の方法。 り２３）　　前記処理が、亜硫酸塩と弱い酸化剤の混合
   物による蛋白質合有変性溶液の亜硫酸分解から成ること
   を特徴とする特許請求の範囲第２２項に記載の方法。 （２４）　　ジスルフィド結合の開裂が、弱い変性溶液
   中で行なわれることを特徴とする特許請求の範囲・第２
   ２項又は第２３項に記載の方法。 （２５）　　ジスルフィド結合の開裂か強力変性溶液中
   で行なわれ、次いで蛋白質を溶液中に紺Ｊ、’ｊ　Ｌ／
   っつ溶液を弱い変性溶液に変換することを特徴とする特
   許請求の範囲第２２項または第２３　、Ｔｉｉに記載の
   方法。 （２Ｇ）　　屈折型の蛋白質をスルフヒドリル化合物含
   有変性溶液と接触させることを特徴と覆る待Ｊ′１請求
   の範囲第２１項に記載の方法。 （２７）　　宿主細胞中で異種産物として発現された蛋
   白質を含む変性溶液を還元剤の存在下で精製処理し、変
   性剤の殆んど又は全部を除去し、蛋白質を酸化処理する
   ステップを含む蛋白質の再賦活化法。 （２８）　　強力変性溶液が、４〜９Ｍのグアニジン塩
   若しくはチオシアン酸塩溶液であるが又は０．０１〜２
   重ω％の洗浄剤であることを特徴とする特許Ｖｊ求の範
   囲第２項乃至第９項、第１１項及び第２５項のいずれか
   に記載の方法。 （２つ）　　グアニジン塩溶液が６〜８Ｍであることを
   特徴とする特ＶＦ請求の範囲第２８項に記載の方法。 （３０）　　弱い変性溶液が１〜９Ｍの尿素溶液又は０
   ．５〜２Ｍのグアニジン塩溶液であることを特徴とする
   特許請求の範囲第４項乃至第１０項及び第２１１ｎ乃至
   第２６項のいり゛れかに記載の方法。 （３１）　　亜硫酸分解が亜硫酸ナトリウムを用いて行
   なわれ、温和な酸化剤がデトラチオン酸ナトリウムであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第８項又は第２３項
   に記載の方法。 （３２）　　スルフヒドリル化合物が還元ゲルタデオン
   であることを特徴とする特許請求の範囲第９項。 第１０項及び第２１項乃至第２６項のいずれかに記載の
   方）人　。 （３３）　　緩衝溶液が５〜９のｐｌ−１を右づること
   を特徴とする特許請求の範囲第１２項乃至第２０項のい
   ずれかに記載の方法。 （３４）　　緩衝溶液が０．０１〜２Ｍのイ訓ン強度を
   右づ゛ることを特徴とする特許請求の範囲第１２項乃至
   第２０項及び第３３項のいずれかに記載の方２人。 （３５）特許請求の範囲第１項１り金弟３４項のいずれ
   かに記載の方法で製造された損白貿。