HU197357B - Process for cleaning and reactivating precipitated heterologous proteins - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás kicsapott heterológ fehérjék tisztítására és reaktiválására,

A dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs technológia lehetővé teszi, hogy exo- 5 gén vagy idegen (heterológ) fehérjéket termeljünk baktériumokban vagy más .gazda -sejtekben. Bizonyos körülmények között és egyes fehérjék esetén ezek a heterológ fehérjék kicsapódnak a sejteken belül fénytő- 10 réssel rendelkező testek alakjában. A találmány olyan eljárásokra vonatkozik, amelyekkel kinyerhetjük ezeket a heterológ fehérjéket, és kívánt esetben helyreállíthatjuk aktív formájukat. 15

Nagy számú - emberi, emlősállatoktól származó vagy egyéb eredetű - fehérjét, például emberi növekedési hormont (hGH), szarvasmarha növekedési hormont (bGH) és különféle interferonokat állítottak elő gazda- 20 sejtekben oly módon, hogy a sejteket olyan dezoxiribonukleinsavval látták el, amelyek ezeket a fehérjéket kódolják, és a kapott sejteket az új heterológ fehérje termelésének kedvező körülmények között tenyésztik. A 25 gazdasejtekben DNS-rekombinációs technológiával termelt heterológ fehérjékre további példák a következők: virusbevonó fehérjék, igy a száj és körömfájás vírusának külső fehérjéi és a hepatitisz B vírus felületi anti- 30 gén fehérjéje. A heterológ fehérje gyakran a sejten belül csapódik ki, és jelentős részét képezi a teljes sejtfehérjének.

Nagy számú fontos esetben, például az emberi növekedési hormon, sertés növekedési 35 hormon (pGH), szarvasmarha növekedési hormon, száj és körömfájás vírus és a fibroblaszt interferon (FIF) esetén megfigyelték, hogy a termelt heterológ fehérjék nem csupán nagy mennyiségben vannak jelen, hanem 40 kicsapódnak a sejten belül fénytöréssel rendelkező testek alakjában. A .fénytöréssel rendelkező kifejezést azért használjuk, mivel ezek a testek fáziskontraszt mikroszkóp segítségével láthatók. Mór 1000-szeres nagyi- 45 tásban is ezek a kicsapódott fehérjék fényes foltokként jelennek meg, amelyek a sejten belül láthatók.

Az ilyenfajta, fénytöréssel rendelkező testek alakjában lévő fehérje kinyerése több 50 problémát is felvet. Először, nyilvánvalóan szükség van arra, hogy elválasszuk a sejten belül elhelyezkedő, fénytöréssel rendelkező fehérjét a sejt anyagától és azoktól a fehérjéktől, amelyek a kívánt fehérjét a sejthez 55 rögzítik.

Másodszor, jóllehet a fénytöréssel rendelkező test gyakran nagy százalékban tartalmazza a kívánt heterológ fehérjét, egyes esetekben jelentős mennyiségű szennyező 60 anyag is jelen van, amelyeket el kell távolítani ahhoz, hogy elkülöníthessük a kívánt polipeptid szekvenciát.

Harmadszor, és talán ez okozza a legnagyobb nehézséget, a fénytöréssel rendelkező 65 test alakjában lévő fehérje azonosítható ugyan a kívánt fehérjeként, azonban biológiailag nem aktiv. A szakemberek úgy vélik, hogy ez az inaktivitás annak a következménye, hogy a heterológ fehérje .csavarodottsóga vagy konformációja nem megfeleld akár a sejten belüli kicsapódás előtt vagy után, akár az elkülönítés folyamán.

Azt találtuk, hogy ezeket a nehézségeket leküzdhetjük olyan műveletek alkalmazásával, amelyek során eltávolítjuk a szennyező gazdasejtfehérjét, szolubilizáljuk a kicsapódott, fénytöréssel rendelkező fehérjét, és olyan alakban állítjuk helyre a heterológ fehérjét, amelyben aktiv a biológiai vizsgálatoknál.

A találmányt a kővetkezőkben foglalhatjuk össze:

Általános megoldást biztosítunk a fenti problémára, amely abból áll, hogy aktiv alakban különítünk el gazdasejtekben termelt, azokhoz heterológ, és legalább is részben a sejteken belüli fénytöréssel rendelkező testek alakjában kivált fehérjéket, azaz oldhatatlan fehérje rögöket. A találmány szerinti eljárást, amellyel hatékonyan nyerhetünk ki heterológ fehérjéket olyan sejttenyészetekből, amelyekben fénytöréssel rendelkező testek képződtek, az 1. folyamatábrán mutatjuk be vázlatosan, a különféle alternatívákkal együtt.

A leírás egy későbbi részében bemutatott 1. folyamatábra, röviden ismertetve, több szakaszból áll. Először felszabadítjuk a sejtekből a kicsapódott oldhatatlan fehérjét. Az ehhez alkalmazott módszer megbontja a külső sejtfalat/membránt megfelelő ionerősség és pH-érték alkalmazásával úgy, hogy a gazdasejt fehérjéi - feltéve, hogy a sejtek megbontása kielégítő mértékű - szolubilizálódnak, vagy legalább is nem különülnek el a felülúszó folyadéktól kissebességű centrifugálóskor. Ennek megfelelően a eentrifugóláskor a kívánt, fénytöréssel rendelkező fehérje a szemcsében halmozódik fel, a szennyező fehérjék pedig főtömegükben a felülúszó folyadékban maradnak.

A centrifugálással nyert szemcse azonban különböző okokból kifolyólag tartalmazhat még szennyező fehérjét. Először is lehetséges, hogy az eredeti, fénytöréssel rendelkező test nem csak a kivánt fehérjéből áll. Másodszor, előfordulhat, hogy sejtfal- vagy sejtmembrán-töredékek nem lettek eléggé elbontva, és ezért a szemcsével együtt különülnek el, és esetleg még a szemcse mikroszkóppal végzett tanulmányozásakor sem veszszük őket észre. Ennek ellenére a kapott szemcse túlnyomórészt a kívánt fehérjéből áll, és eltérően az enzimológiai vizsgálatoknál alkalmazott szokásos fehérjetisztitási eljárások esetén tapasztalt helyzettől, a feladat a szennyező anyagok eltávolítása egy alapvetően tiszta termékből, és nem egy kis mennyi-25 eégben jelenlevő komponens elkülönítése egy bonyolult elegyből.

(Egyes esetekben, nevezetesen az emberi növekedési hormonnál, a baktérium vagy más gazda organizmus által termelt heterológ 5 fehérje csak részben van jelen fénytöréssel rendelkező alakban, amikor a sejtek növekednek és termelik a fehérjére vonatkozó gént. Ilyen esetben azt tapasztaltuk, hogy a centrifugálással elkülönített szemcsében lévó 10 kivánt fehérje mennyiségét növelhetjük, ha a sejteket a megbontás előtt olyan kezelésnek vetjük alá, amelyek célja hagyományosan a sejtek elpusztítása volt, a DNS-rekombinócióval transzformált sejtekre vonatkozó bizton- 15 sági óvórendszabályoknak megfelelően. Például a savval, hővel vagy apoláros oldószerekkel végzett kezelés biztosítani látszik a részlegesen oldható fehérjék oldhatatlanná tételét.) 20

Miután olyan termékhez jutottunk, amely túlnyomórészt a kívánt fehérjéből áll, a feladat az, hogy a fehérjét egyes esetekben tovább tisztítsuk, és olyan alakban nyerjük ki, amelyben a biológiai aktivitása hasznosítható. £5

Tekintettel arra, hogy a fehérje in vivő csapódott ki a citoplazmában fennálló körülmények között, nyilvánvaló, hogy a hagyományos szolubilizáló módszerek nem vezetnek eredményre. Ennek megfelelően erőteljesebb 30 módszerre van szükség ahhoz, hogy oldatba vigyük ezt a fehérjét, és így az felhasználható legyen. Azt tapasztaltuk, hogy egy erős denaturáló oldattal hatékonyan elvégezhetjük ezt, ugyanakkor a képződött oldat esetleg 35 nem biztosít biológiailag aktív készítményt.

Amikor ezt az oldatot, amely erős denaturálószert és szolubilizólt, fénytöréssel rendelkező fehérjét tartalmaz, fel akarjuk használni a biológiai aktivátás kimutatásához - amint azt a megfelelő tesztek mutatják -, a legnyilvánvalóbb alternatívák nem adnak kedvező eredményeket:

Ha szükség van hígításra, természetesen ugyanennek az .oldószernek' a nagyobb ₄₅ mennyiségével, azaz további erős denaturáló oldattal való hígítás a biológiai vizsgálathoz megkívánt koncentráció eléréséig, nem kívánatos, mivel maga az erős denaturálószer zavar a biológiai aktivitás mérésénél. Hig puf- gQ feroldattal vagy vízzel szintén nem hígíthatjuk fel az oldatot, mivel a fénytöréssel rendelkező fehérje ekkor ismét kicsapódik, szinte elkerülhetetlenül. Ha a hígítás nem eredményez kicsapódást, akkor is többnyire nem 55 kapjuk meg a várt aktivitásértéket.

Létezik néhány eredményes alternatíva biológiailag aktiv termékek kinyerésére, és ezek az eljárások összhangba hozhatók a találmány szerinti tisztitó eljárással. Az egyik θθ ilyen megoldásnál az erős denaturálószert gyengébbel helyettesítjük, majd csökkentjük a gyenge denaturálószer koncentrációját. Úgy tűnik, hogy ezzel az eljárással megőrizzük a fénytöréssel rendelkező fehérje oldha- θ.

tőségét, és olyan közeget biztosítunk, amely nem befolyásolja a biológiai aktivitást. Jóllehet azt tapasztaltuk, hogy egyes esetekben ez az eljárás önmagában nem eredményez pozitív biológiai aktivitást, más esetekben azonban kedvező eredményt adott. Erre példa a száj és körömfájás vírusát bevonó fehérjét magába foglaló összekapcsolt fehérje. Úgy tűnik, hogy hasonló helyzet áll fenn az állati növekedési hormonoknál. Ilyen esetekben elegendő, ha a szemcsét erős denaturálószerben oldjuk, puffercserével gyenge denaturálószert biztosítunk vagy korlátozott mértékű hígítással gyengítjük a kaotropizmust, és kívánt esetben további tisztítást végzünk, ismert módszerek alkalmazásával, végül fokozatos puffercserével higabb oldatot hozunk létre.

A jelenleg ismert adatok szerint azonban úgy tűnik, hogy inkább kivételnek, mint szabálynak tekinthető ennek az eljárásnak az eredményessége a biológiailag aktiv fehérje kinyerésénél. Sok esetben nyilvánvalóan gondoskodnunk kell az oldatba vitt fehérje .újradenaturálásáról'. A bekövetkezett denaturálódóst okozhatja az, hogy már eredetileg a baktériumban és/vagy az elkülönítés körülményei között a fehérje nem megfelelő .csavarodottsága' alakul ki. Minden esetben ésszerűnek látszik, ha a kővetkező eljárások valamelyikével végezzük a kapott fehérje .kiegyenlítését' és .visszacsavarását*. Mindhárom eljárásnál puffercserével gyenge denaturólószert hozunk létre (és az egyes esetekben önmagában is elegendő) a diszulfidkőtések újbóli kialakítása előtt.

Az egyik eljárásnál a fehérjét egyszerűen tovább tisztítjuk redukáló körülmények között, amelyek garantálják, hogy az esetleges diszulfidkőtések szulfhidrilcsoportokká alakuljanak ót, és így lehetővé váljon a molekula megfelelő konformációjának kialakulása a tisztítás körülményei között, majd levegő vagy más oxidólószer segítségével újra kialakítjuk a diszulfidkötéseket, miután a fehérje megfelelő csavarodottsága (konformációja) létrejött.

Egy másik eljárás értelmében az esetleg hibásan kialakult diszulfidkötéseket felhasítjuk a fehérje szulfonálásával, ismét hagyjuk, hogy a fehérje kívánt csavarodottsága létrejöjjön kedvezőbb körülmények között, majd újból létrehozzuk a diszulfidkötéseket a szulfonát eltávolításéval, szulfhidril reagenst használva mind a redukált, mind pedig az oxidált (diszulfid) alakjában.

Egy harmadik alternatíva az, hogy hagyjuk, hogy a megfelelő konformáció alakuljon egy alkalmas oldatban, olyan körülmények között, amikor állandóan képződnek és átalakulnak szulfhidril- és diszulfidcsoportok.

Úgy tűnik, hogy minden esetben az a legkedvezőbb, ha ez az .újradenaturálódási folyamat' egyidejűleg megy végbe a fehérje tisztítására szolgáló további műveletekkel, azaz amikor megszabadulunk azoktól a kisebb mennyiségű szennyező anyagoktól, amelyet a fehérje a centrifugálással kapott szemcséből való egyszerű kioldás után tartalmaz.

A jelen bejelentésben ismertetett találmány Így eredményesen biztosítja a heterológ fehérjék előállítását.

Egyrészt a találmány tárgya eljárás a fénytöréssel rendelkező fehérje elkülönítésére a gazdasejt fehérjéjétől, amikor is a gazdasejtek szuszpenzióját elbontjuk és kis sebességű centrifugálással kinyerjük a fénytöréssel rendelkező testeket. Ennek a tisztitó műveletnek a lefolyását célszerűen úgy követhetjük, hogy mikroszkóp alatt vizsgáljuk a készítményt, és megállapítjuk a bakteriális eredetű sejtek, sejttöredékek vagy sejtfaltöredékek jelenlétét vagy távollétét.

Másrészt, a találmány tárgya eljárás a fénytöréssel rendelkező testek alakjában kicsapott heterológ fehérjék mennyiségének növelésére a fénytöréssel rendelkező testek elkülönítése előtt. Az eljárás során a gazdasejttenyészet szuszpenzióját elpusztító behatásnak tesszük ki, például nagy koncentrációjú savval, hővel vagy kis koncentrációban vett szerves apoláros oldószerrel kezeljük. Ez az .elpusztító' kezelés a heterológ fehérje további kicsapását eredményezi. Utána olyan műveleteket végzünk, amelyek szintén a találmány körébe tartoznak, és a megnövelt mennyiségű kicsapott fehérje kinyerését célozzák.

Harmadrészt, a találmány tárgya eljárás a fénytöréssel rendelkező fehérje felhasználható alakban történő kinyerésére, erősen denaturáló oldatban végzett szolubilizálással. Ennél az eljárásnál kívánt esetben a gazdasejtek szuszpenzióját a fénytöréssel rendelkező fehérje kinyerése előtt olyan pufferoldattal kezeljük, amelynek az ionerőssége megfelelő a gazdasejt fehérjéjének a szolubilizálására.

Negyedrészt, a találmány tárgya eljárás az előzetesen erősen denaturáló oldatban szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérje további tisztításra, előnyösen redukálószer jelenlétében. Ennek során eltávolítjuk a nagy molekulatőmegű szennyező anyagokat vagy molekulaszitával vagy pedig nagy sebességű centrif u gálással.

Szintén a találmány körébe tartoznak azok a műveletek, amelyekkel felhasználjuk vagy tovább tisztítjuk a már erősen denaturáló oldatban oldott heterológ fehérjét oly módon, hogy a denaturáló közeget vagy hígítással gyengítjük, vagy gyenge denaturálószerrel váltjuk fel, s az oldatnak ezt a módosítását adott esetben redukálószer jelenlétében végezzük. A gyenge denaturáló körülmények között a fehérje konformációja is átalakulhat, amit egyes esetekben a redukálószer is elősegít. A gyenge denaturálószer további előnye, hogy további tisztító és/vagy újranaturáló műveleteket tesz lehetővé; erősen denaturáló közegben ugyanis ezek nem vezetnének eredményre.

Az erősen denaturáló közeget úgy alakíthatjuk át gyengén denaturáló közegre, hogy puffercserét végzünk olyan, hasonló koncentrációjú denaturálószerrel, amelynek a kaotróp tulajdonságai gyengébbek (például a guanidint karbamiddal váltjuk fel), vagy pedig - ha a jelenlevő fehérje oldhatósági jellemzői lehetővé teszik - hígítással csökkentjük ugyanannak az erős denaturálószernek a koncentrációját.

Szintén a találmány tárgyát képezi egy specifikus reaktiváló eljárás, amelyet gyengén denaturáló közegben vitelezünk ki. Ennél az eljárásnál az erősen denaturáló oldatban szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjét enyhe oxidálószerrel kezeljük szulfition jelenlétében. A kezelés sorén a cisztein és a cisztintartalmú fehérjék fehérje-S-szulfonétokká alakulnak át. Az erősen denaturáló oldatot ezután gyengítjük, hogy lehetővé tegyük a konformáció átalakulását, majd ismét kialakítjuk a diszulfidkötéseket valamely szulfhidril vegyület, például béta-merkapto-etanol vagy redukált glutation alkalmazásával, a megfelelő diszulfid (oxidált) alak jelenlétében.

Szintén a találmány értelmében további kezelésnek vetjük alá az erős denaturálószerben szolubilizált fehérjét a konformáció átalakítása érdekében oly módon, hogy az erős denaturálószert gyenge denaturálószerrel cseréljük ki, és az oldatot egy olyan keverékkel kezeljük, amely túlnyomórészt valamely szulfidril vegyületből, kisebb mennyiségben pedig annak diszulfid formájából áll. így egy lépésben alakítjuk ót a konformációt .redox puffer'-ben.

A találmány tárgyát továbbá tisztító eljárások képezik, amelyek redukálószer, például béta-merkapto-etanol jelenlétében vitelezzük ki, majd dialízissel vagy más alkalmas módon eltávolítjuk a denaturólószert és a redukálószert. Ha nem törekszünk a levegő kizárására, akkor az újraoxidálja a fehérjét, és így ismét kialakulnak a diszulfid-kötések, amelyek képződését gátolta a redukálószer jelenléte.

A találmány továbbá egy többlépéses eljárásra vonatkozik, amelynek célja a gazdasejt tenyészetében kicsapott heterológ fehérjék tisztítása, és amelynek értelmében megfelelő sókoncentrációjú és pH-értékü oldattal eltávolítjuk az oldható gazdasejtfehérjéket, majd redukálószert tartalmazó denaturáló oldatban szolubilizáljuk a kicsapott heterológ fehérjét, végül a denatutáló oldatból kinyerjük a kívánt fehérjét újranaturált alakban. Adott esetben a kívánt fehérjét további tisztítási műveletnek vethetjük alá, amelyek önmagukban ismert módszerek lehetnek, kivitelezésük azonban redukálószer jelenlétében történik. Ilyen tisztító műveletek például a következők: méret szerinti szétválasztás gélpermeációs kromatográfiával, és a nem kívánt fehérjék eltávolítása ioncserélő gyantán történő differenciális adszorpcióval.

Ez a tisztitó eljárás általánosan alkalmazható a gazdasejttenyészetekben kicsapott heterológ fehérjékre, függetlenül azok biológiai típusától, és ez azzal az előnnyel jár, hogy bármilyen termék esetén azonos felszerelés használható. Ez a találmány szerinti eljárás általánosan alkalmazható, legfeljebb csekély mértékű módosításokra vagy beállításokra van szükség az egyes fehérjéknél.

A találmány tárgyát képező eljárásváltoz&tok alkalmas kombinációja és kiválasztása megoldást nyújt a fénytöréssel rendelkező testekből álló fehérjével kapcsolatos problémákra.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra urokinázt (UK) tartalmazó összekapcsolt fehérjét termelő Escherichia coli sejtek fáziskontraszt mikroszkóp alatti képét mutatja.

A 2. ábrán üledék-szuszpenzió látható, szintén fáziskontraszt mikroszkóp alatt. Az üledéket a fenti sejtek elbontáséval és kis sebességű centrifugáláséval kaptuk.

A 3. ábra sertés növekedési hormon, veszettség antigén és urokináz nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisének eredményeit mutatja be. Az ábrán összehasonlítjuk az ultrahanggal kezelt nyers sejtek szennyezőanyag-tartalmát a találmány szerinti eljárással előállított, elkülönített, fénytöréssel rendelkező testek szennyezéseivel.

A 4A. ábra Escherichia coli tenyészetből elkülönített emberi növekedési hormon részlegesen elkülönített, fénytöréssel rendelkező testjeinek fényképe.

A 4B. ábra nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamid-gélelektroforézis utáni gél fényképe, amelyen az elbontott sejtet és a fénytöréssel rendelkező testekből álló fehérjét hasonlítjuk össze mind élő, mind pedig elölt sejtek esetében.

Az 5A. ábra serés növekedési hormonokból álló, fénytöréssel rendelkező testeket tartalmazó Escherichia coli egész sejtek fényképe.

Az 5B. ábra az %A. ábrán bemutatott készítmény ultrahanggal végzett kezelése utáni fényképe.

Az 5C. ábra a centrifugálással kapott szemcse fényképe, amikor az 5B. ábrán látható, ultrahanggal kezelt szuszpenziót kis sebességgel centrifugáltuk.

A 6. ábrán elölt és nem-elölt sejtek centrifugálásával kapott felülúszó folyadék és szemcse nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamid-gélelektroforézisének eredményeit szemlélteti.

A következőkben részletesen ismertetjük a találmányt:

A. Definíciók

A .heterológ' fehérjék olyan fehérjék, amelyeket a gazdasejt normális körülmények között vagy egyáltalán nem termel, vagy csak korlátozott mennyiségben termel. A DNS-rekombinációs technológia és más génmanipulációs módszerek, például a pont rautagenézis, lehetővé tette a heterológ fehérjék nagyobb mennyiségekben történő termelését átfertőzött gazdasejtek tenyészeteiben. A gyakorlatban ezeket a heterológ fehérjéket gyakran genetikai úton termelik, és kicsapásuk olyan körülmények között történik, amikor fennmarad a gazdasejtfehérjék oldhatósága.

Egyes esetekben a termelt fehérje oldhatatlansága olyan mértékű, hogy ezek a fehérjék úgynevezett .fénytöréssel rendelkező testek* alakjában vannak jelen a gazdasejtben, azaz olyan testekként, amelyek megtörik a fényt és fényes foltokként jelennek meg, ha fáziskontraszt mikroszkópon keresztül nézzük őket. Ezért ezeket a fehérjéket gyakran .fénytöréssel rendelkező fehérjék* vagy .fénytöréssel rendelkező testekből álló fehérjék* elnevezéssel említik.

A találmány tárgyát olyan eljárások képezik, amelyek felhasználhatók a gazdasejtekben fénytöréssel rendelkező testek alakjában megjelenő fehérjék elkülönítésére, tisztítására és kivánt esetben újraaktiválására. A találmány részben olyan eljárásokra is irányul, amelyek elősegítik ezeknek a fénytöréssel rendelkező testeknek a képződését; a fehérje találmány szerinti kinyerése és aktiválása azonban kifejezetten ezekre a fénytöréssel rendelkező fehérjékre alkalmazható.

A jelen leírásban a .fénytöréssel rendelkező, .kívánt* és .heterológ* kifejezéseket egymással felcserélhető kifejezésekként használhatjuk olyan fehérje megjelölésére, amelyet valamely idegen gazdasejt termelt, és amely az előállítás vagy tisztítás valamelyik szakaszában csapadékként látható fáziskontraszt mikroszkóp alatt, függetlenül attól, hogy az említés időpontjában milyen a fehérje fizikai állapota. Egyes esetekben például azután is fénytöréssel rendelkező fehérjéről beszélünk, hogy az illető fehérjét oldhatóvá alakítottuk a találmány szerinti eljárással.

A bakteriális eredetű gazdasejtekben termelt különféle heterológ fehérjék, például a sertés növekedési hormon, az emberi növekedési hormon és a vírusbevonó fehérjék, így a száj- és körömfájás vírussal, fehérjével és HBsAg-vel összekapcsolt fehérje, fénytöréssel rendelkező testeket képeznek kisebb vagy nagyobb mértékben a tenyészetekben szokásosan alkalmazott körülmények között. Egyes niás fehérjék, például az immun interferon (IIF) és a leukocita interferon (LelF) jobban oldódnak a citoplazmában.

-511 [A fibroblaszt interferon (FIF) azonban fénytöréssel rendelkező testeket képez a gazdasejt tenyészetekben.]

A .gazdasejtek' kifejezés minden olyan formát átfog, amelyben a sejtek felhasználhatók kiindulási anyagként heterológ fehérje elkülönítésére. Gazdasejten értjük például - az összegyűjtött sejtpép mellett - az egész sejttenyészetet, a sejtpép egy fagyasztott mintáját vagy a sejtpép fagyasztott és felengedett mintáját. így a következő kifejezés: .a gazdasejteket pufferolt oldatban kezeljük, vonatkozhat például az egész tenyészet táptalajon történő kezelésére vagy centrifugált sejtek alkalmazására.

A leírásban használt .újraaktiválás' kifejezés majdnem szinonim a .visszaessvarás', a .csavarodottság helyreállítása* kifejezésekkel, azaz arra vonatkozik, hogy biztosítjuk valamely fehérje biológiai aktivitását az aktivitással rendelkező konformáció kialakításával. Az .újraaktiválás’ nem jelenti az aminosav-szekvencia megváltoztatását, és nem foglal magába olyan jellegű aktivitást, amikor peptid elövegyületeket hasítással alakítanak aktiv formává, például tripszinogént tripszinné vagy prorennint renninné alakítanak.

A .biológiai aktivitás kifejezés a fehérje in vivő aktivitására, a szokásos in vitro és in vivő biológiai vizsgálatoknál jelentkező aktivitására, immunreakciót kiváltó képességére vagy azon képességére vonatkozik, hogy reakcióba lépjen a natív fehérje antitestjeivel. Megjegyzendő, hogy. egyes esetekben például a fehérjék biológiailag aktívak, ha a megfelelő antitestekkel való reagálást vizsgáljuk, nem tapasztalunk azonban biológiai aktivitást a hatásvizsgálatokhoz használatos teszteknél. Tekintettel azonban arra, hogy az antitestekkel való reakcióképesség általában a legegyszerűbb és legkönnyebben kivitelezhető vizsgálati módszer, néha ezt használjuk fel az aktivitás mérésére.

Az .ioneröseég’ a vizes oldatban fennálló ionkoncentráció szokásos mértéke. Definíció szerint ezt úgy kapjuk meg, hogy az oldatban lévő valamennyi ionra vonatkozólag összegezzük az egyes ionok koncentrációjának és töltésük négyzetének szorzatát, és az összeget elosztjuk kettővel.

A .denaturáló oldat olyan oldat, amely denaturálószert tartalmaz. A .denaturálószer kifejezésen olyan kaotrop vegyületeket vagy anyagokat értünk, amelyek vizes oldatban és megfelelő koncentrációkban megváltoztatják a fehérjék térbeli konfigurációját vagy konformációját a fehérje felületének a megváltoztatásával, megváltoztatva például a hidratáltségot, a körülvevő oldószert vagy az oldószer és a felület közötti kölcsönhatást. Ilyen denaturálószer például a karbamid, guanidin-hidroklorid, nátriumtiocianát, továbbá mosószerek, mint a nátrium-dodecil-szulfát és a Triton.

A denaturáláshoz nem használhatunk olyan erőteljes és irreverzibilis denaturáló műveleteket, mint magas hőmérséklet és erős savasság alkalmazása.

Megjegyzendő, hogy a felsorolt reagensek közül némelyik erős denaturálószer, mások pedig gyengébbek, és természetesen a koncentrációjuk közvetlenül befolyásolja a detaturálószer erősségét és hatékonyságát. Nem húzhatunk pontos választóvonalat az erős denaturálószerek és a gyenge denaturálószerek között, azonban az erős denaturáló viszonyok tökéletesebben .kiegyenesítik a fehérjét, bármilyen volt is a konformációja, amelyet fiziológiás körülmények között a hidrofil és hidrofób részeket tartalmazó aminosav-szekvencia határoz meg.

A leggyakrabban használt erősen denaturáló oldat, amellyel a fénytöréssel rendelkező fehérje feloldható, az ionos denaturálószer, a guanidin-hidroklorid eléggé koncentrált (4-9 M) oldata. A karbamid a gyenge denaturálószer leggyakrabban használt példája, mivel még elég nagy (például 7 M) koncentrációja alkalmazásakor is visszamaradnak egyes másodlagos fehérjeszerkezetek, és lehetőséget ad a .natív konformáció kialakítására. Emellett nemionos jellegű, és ez fontos a találmány szerinti eljárás olyan foganatositási módjánál, amelynél ioncserélő módszereket alkalmazunk.

Ennek megfelelően az .erősen denaturáló oldat olyan oldat, amely hatékonyan .kiegyenesíti azt a fehérjét, amely szintén oldva van az oldatban. A .kiegyenesedés viszonylag kiterjedt lesz, azonban reverzibilis. Az ilyen mértékű kiegyenesítést biztosító oldott anyagokra példa a guanidin-hidroklorid és a nátriumtiocianát, rendszerint viszonylag koncentrált - 4-9 M körüli - oldatban, és megemlíthetők a mosószerek, rendszerint 0,01-2% töménységben.

A .gyengén denaturáló oldatok olyan oldatok, amelyek lehetővé teszik, hogy a fehérje legalább is részben felvegye azt a térbeli konformációt, amelyben aktív alakjában található endogén vagy homológ fiziológiás körülmények között. Emellett a gyengén denaturáló oldatok szolubilizálják a fehérjének azokat az esetleges átmeneti formáit, amelyek az erősen denaturáló oldatban megtalálható denaturált alak és a megfelelően csavarodott konformáció között lehetnek.

Példaként ezekre a gyengén denaturáló oldatokra megemlíthetjük a tömény - általában 4-9 M koncentrációjú - karbamid-oldatokat, és azoknak a fentebb felsorolt denaturáiószereknek a híg oldatait, amelyek nagyobb koncentrációban erősen denaturálnak. Ez utóbbi híg oldatok koncentrációja rendszerint 0,5-2 M. Egyes esetekben azonban a gyengén denaturáló oldat funkcionális állapota standard enzimvizsgálati körülmények között is megfigyelhető, például kis - 0,1 M

-613 vagy még kisebb - pufferkoncentrációknál és fiziológiás pH-értéknél.

A leírásban a .gyengén denaturáló oldat* kifejezést a funkcionális definíció szerint értelmezzük, azaz olyan oldatokra értjük, amelyek lehetővé teszik a visszacsavarodást a fehérje bármilyen deformált konformációjából - a feltevésünk szerint közbenső termékeken keresztül, amelyek ebben az oldatban oldódnak - egy olyan konformációba, amely biztosítja a fehérje biológiai aktivitását.

A leírásban szerepeltetünk olyan rövidítéseket és kifejezéseket, amelyeket bizonyos módszerekkel kapcsolatban szokásosan használnak. Ezeket az alábbiakban röviden ismertetjük:

A gélpermeációs kromatográfia vagy gélszűrés szokásosan használt tisztítási módszer, amely a méretük szerint tesz különbséget a molekulák között. Az ehhez használt anyagot gyakran molekulaszitának is nevezik. A gél alkalmas megválasztásával szinte bármilyen mérettartomány elérhető. Azok a molekulák, amelyek eléggé nagyok ahhoz, hogy a gél pórusain kívül maradjanak, akadálytalanul mennek át a gélt tartalmazó oszlopon. A kisebb molekulákat az oszlop frakcionálja.

Az SDS-PAGE nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében kivitelezett poliakrilamid-gélelektroforézis, amely szokásosan alkalmazott módszer, s lehetővé teszi a hozzávetőleges molekulatömeg és a tisztaság meghatározását. Ennél a módszernél a fehérjét elektroforézisnek vetjük alá redukáló körülmények között, detergens jelenlétébe. Egy adott molekula esetén a vándorlás mértéke csak a molekulatömegtől függ, amelyet diszulfidkötések távollétében határozunk meg, mivel a vizsgálatot redukáló körülmények között végezzük. Ezért a készítményben jelenlevő egy adott fehérje mennyiségét úgy határozhatjuk meg, hogy denzitometriásan mérjük a fehérje molekulatömegének megfelelő helyen megjelenő, megfestett sávot. Ezt a módszert részletesen ismerteti a következő szakirodalmi hely: Laemmli, U.K. és munkatársai, Natúré, 227, 680 (1970).

A .Western Biot' kifejezés egy, az antitestre specifikus megkötési módszerre vonatkozik, ahol a mérni kívánt fehérjét tartalmazó oldattal vagy szuszpenzióval nitrocellulóz szűrőt kezelünk, majd a szűrőt átitatjuk az illető fehérje izotóppal jelzett antiszérumával. A kívánt fehérje jelenlétét az bizonyítja, hogy az izotóp a szűrőn marad annak következtében, hogy az illető fehérjével lejátszódott reakció folytán az antitest oldhatatlanná vált. A módszert részletesen ismerteti a következő szakcikk: Towbin, H. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 76, 4350 (1979).

A .kromatográfiás ioncserés fehérjetiszt.itási módszerek* kifejezés olyan eljárásokra vonatkozik, amelyeknél az anyagot kromatográfiás elválasztásnak vetik alá ioncserélő oszlopon lejátszódó kölcsönhatás alapján. Gyakran alkalmazott oszlopok a kővetkezők: DEAE-cellulóz, amelynek a jelölése gyakran egyszerűen DEAE, például DE-52 vagy DEt53 kereskedelmi nevű termékek, vagy a karboxi-metil-cellulóz (CMC).

Megfelelő pH-értéknél a DEAE-tartalmú oszlop ioncserélőként viselkedik, és negatív töltésű részecskék kötődnek az oszlophoz. Az elúció ezekről az oszlopokról az eluéló oldószerek alkotórészeinek megváltoztatásával történhet, vagy az oldat pH-értékének, ionerősségének vagy dielektromos állandójának megváltoztatásával, sőt, akár a hőmérséklet szabályozásával.

A .puffercsere* olyan módszerekre vonatkozik, amelyeknél megváltoztatjuk a tényleges .oldószert, azaz a makromolekula cseppfolyós környezetét. Ebben az értelemben tehát az .oldószer ténylegesen magában foglalja annak a közegnek a kismolekulájú oldott anyagait is (például a sókat), amelyben a kívánt makromolekula található, mivel ez utóbbi oldhatósága valóban azoknak tulajdonítható. A találmány szerinti eljárásnál a kívánt fehérjét például úgy készíthetjük elő ioncserélő kromatogréfiához, hogy megfelelő pufferben 8 M karbamidot tartalmazó oldószert biztosítunk, és ezzel helyettesítjük például a 7 M koncentrációjú guanidin-hidrokloridot, amelyet a találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatositási módja értelmében denaturálószerként használunk.

E .puffercsere kivitelezéséhez az egyik alkalmas módszer a dialízis, amelynél a fehérjét tartalmazó 7 M guanidin-hidroklorid oldatot dializáljuk a karbamid-tartalmú pufferoldat lényegesen nagyobb mennyiségével szemben. A puffercserét azonban más módszerekkel is végezhetjük, például gélpermeációval és diaszűréssel.

B. A találmány általános ismertetése

Az 1. folyamatábrán mutatjuk be általánosságban a találmány szerinti eljárást, amikor a kívánt aktív fehérjét elkülönítjük azoktól a gazdasejtektől, amelyekben ez a fehérje képződött és fénytöréssel rendelkező testek alakjában kivált.

-715

1. folyamatábra

A fénytöréssel rendelkező testeket tartalmazó sejtek

1) Pufferoldatban szuszpendáijuk

2) Elbontjuk/homogenizáljuk 3, Centrifugáljuk

Üledék' (kidobjuk)

Üledék erős denaturálószer

FeTulúszó folyadék (elöntjük)

Nagy molekulatömegű (előntjük) úlúszó folyadék, a kívánt fehérjével

szűrjük vagy	oxidálószer	1) gyenge dena-
nagy sebes-	S03	turálószer
séggel cent-		2) kromatográfia
rifugáljuk

Felülúszó folyadék

FehérjeS-szulfonát

Tisztított fehérje

1) gyenge denaturálószer

2) kromatográfia

1) gyenge denaturálószer kromatográfia

GSH/GSSG visszacsavarás

Tisztított redukált forma levegő, dialízis

Tisztított

S-szulfonát

Kívánt, fehérje visszacsavaras

GSH/GSSG

-817

C. A fénytöréssel rendelkező testek kinyerése

Amint az 1. folyamatábrán látható, tekintettel arra, hogy a fénytöréssel rendelkező testek a sejteken belül helyezkednek el, kívánatos, hogy először megbontsuk a sejteket. Ezáltal kiszabadítjuk a fénytöréssel rendelkező testeket és hozzáférhetővé tesszük őket a kinyerés számára, amely például centrifugálással történhet. A találmány szerinti eljárás egyik változata szerint a fénytöréssel rendelkező fehérjéket egyszerűen oly módon tisztítjuk, hogy gondoskodunk a sejt olyan mértékű megbontásáról, hogy sejttörmelék ne legyen a kis sebességű centrifugálással elkülönített szemcsékben.

A találmány szerinti eljárás e változatánál a sejteket 5-9 közötti, előnyösen 6-8 közötti pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk, 0,01-2 M, előnyösen 0,1-0,2 M ionerősség alkalmazásával. Bármilyen alkalmas só, így a nátrium-klorid is felhasználható a megfelelő ionerősség fenntartására. Ez az ionerősség-tartomány ismereteink szerint megfelelő a találmány szerinti eljáráshoz, jóllehet nem ismerjük pontosan a megengedhető ionerősség pontos szélső értékeit. Nem kívánatos azonban, hogy lényegében zérus ionerősséget alkalmazunk.

A fenti pufferoldatban szuszpendált sejteket ezután a szokásos módszerekkel elbontjuk, például mechanikai módszerekkel, mint Manton-Gaulin-prés, francia prés vagy ultrahang oszcillátor használatával, vagy vegyi vagy enzimes módszerekkel, például lizozimmal végzett kezeléssel.

Amikor úgy ítéljük meg, hogy a sejtek megbontása kielégítő mértékű, és alig marad vissza vagy egyáltalán nem marad vissza centrifugálható méretű sejttöredék, a szuszpenziót kis sebességgel, a gravitáció 500-5000-szeresének, előnyösen körülbelül 1000-szeresének megfelelő érték mellett centrifugáljuk hagyományos centrifugában, a térfogattól függően megfelelő ideig, rendszerint 10-30 percig.

A centrifugálással kapott üledék a fénytöréssel rendelkező fehérjék gyakorlatilag teljes mennyiségét tartalmazza. Abban az esetben azonban, ha a sejtek megbontása nem volt teljes, az üledékben sejttöredékek is lehetnek. Azt, hogy a sejtek megbontása tökéletes-e, úgy ellenőrizhetjük, hogy az üledéket ugyanolyan pufferoldat kis mennyiségében szuszpendáljuk, és fáziskontraszt mikroszkóp segítségével megvizsgáljuk. Sejttörmelékek jelenlétéből az következik, hogy további ultrahangos kezelésre vagy más raegbontási módszer alkalmazására van szükség annak érdekében, hogy eltávolítsuk ezeket.

Miután az esetleges további megbontás megtörtént, a szuszpenziót ismét centrifugáljuk, az üledéket elkülönítjük, a pufferoldatban újból szuszpendáljuk és újból megvizsgáljuk. Ezt az eljárást addig folytatjuk, amíg a vizuális vizsgálat azt nem mutatja, hogy fénytöréssel néni rendelkező fehérjék már nincsenek jelen az üledékben. Az egyes fehérjék esetén jól meghatározhatjuk az alkalmazandó körülményeket, úgy, hogy a találmány szerinti eljárás kivitelezésénél mindössze egyetlen szuszpendálásra, megbontásra és centrifugálásra legyen szükség. Még ilyen esetben is előnyös, ha a találmány szerinti eljárást a fentiek szerint több lépés, különösen előnyösen összesen három lépés alkalmazásával vitelezzük ki, mivel ezáltal előnyösen csökkenthetjük a vizes pufferoldatból szükséges mennyiségeket (azaz a szemcse ismételt szuszpendalásához lényegesen kisebb menynyiség szükséges a pufferoldatból, mint az eredeti sejtszuszpenzióhoz). A termék minőségét vizuális ellenőrzéssel megfelelően biztosíthatjuk.

Az ilyen módon előállított üledékben jelenlevő fehérjéknek általában 40-90%-át képezi a kívánt heterológ fehérje, attól függően, hogy a gazdasejt milyen fehérjét termelt.

Például emberi növekedési hormon esetén - amikor azt az 1-8. példában részletezett műveletekkel állítottuk elő - a fénytöréssel rendelkező fehérjének több mint 90%-a valóban a kívánt fehérje volt (a példákban ismertetett módszerekkel végzett mérés szerint). Humán interferonok és a vírus antigén fehérjék esetén azonban csak körülbelül 50% volt a kívánt fehérje mennyisége. A fenti szélső értékek közötti mennyiségeket kaptuk plazminogén aktivátor és borjú kimozin esetén. Ezek a tisztaságok elegendők a kívánt fehérje néhány felhasználásához.

Az üledék feloldható a denaturálószer oldatában, és az így nyert oldat a fehérjét vagy aktív vagy pedig inaktív alakban tartalmazza. A fentebb említett 1-8. példákban ismertetjük azokat az eredményeket, amelyeket akkor kaptunk, amikor egyedül ezt a módszert alkalmaztuk a fénytöréssel rendelkező fehérjék elkülönítésére. Ez a módszer a legelőnyösebben baktériumtenyészetben, különösen előnyösen Escherichia coli tenyészetben termelt heterológ fehérjékre és a következő fehérjék elkülönítésére alkalmazható: emberi növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, sertés növekedési hormon, humán fibroblaszt interferon, humán immun interferon (IIF), az emberi szövetekben lévő plazminogén aktivátor (tPA), borjú prokimozin (prorennin) és a száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérjék.

A későbbiekben ismertetjük a találmány szerinti eljárásnak azt a változatát, amelytől a fenti esetekben kölcsönöztük az üledékké alakított fehérje denaturálószerben történő

-919 oldásának és az aktivitás visszanyerésének módszerét.

D. A fénytöréssel rendelkező testek képződésének növelése

A találmány értelmében növelhetjük a gazdasejtben termelt, fénytöréssel rendelkező alakban oldhatatlanná tett fehérje mennyiségét a tisztítása előtt. Számos fehérje esetében, amikor termelésük a példákban részletezett módon történik, szükségtelen a mennyiségük növelése, mivel a kívánt fehérjének gyakorlatilag a teljes mennyisége ezeknek a fénytöréssel rendelkező testeknek az alakjában jelenik meg. Példaként ezekre a fehérjékre megemlítjük az állati növekedési hormonokat és a fibroblaszt interferont. Az emberi növekedési hormon esetén azonban az Escherichia coli által termelt fehérjének mindössze körülbelül 50%-a jelenik meg fénytöréssel rendelkező testek formájában, és a termelés csökken, ha nem a találmány szerint járunk el. Hasonló módon, az immun interferon jelentős része képződik fénytöréssel nem rendelkező anyag alakjában, és ha a fénytöréssel rendelkező testek elkülönítésére kidolgozott találmány szerinti eljárást kívánjuk alkalmazni, növelnünk kell ezeknek a testeknek a mennyiségét.

Ennnél az eljárásnál azt használjuk fel, hogy kívánatos egy .elpusztító’ lépés beiktatása, amivel egyébként eleget tehetünk a rekombinált sejtek tenyésztésével és összegyűjtésével kapcsolatos törvényes biztonsági rendszabályoknak. Több elpusztító módszer is rendelkezésre áll, és ezeket egyszerűen biztonsági okokból alkalmazzák, a fenti esetekben azonban az alkalmazásukkal a fénytöréssel rendelkező fehérje mennyiségének a növelése is elérhető.

A találmány szerinti eljárás e változatánál a gazdasejteket vagy a tenyészetésükhőz használt táptalajon pusztíthatjuk el, vagy egy olyan szuszpenzióban, amelyet úgy kapunk, hogy a sejteket tartalmazó eredeti táptalajt centrifugáljuk vagy más módon koncentráljuk, a sejtpépet kinyerjük és vizes oldatban újból szuszpendáljuk. Az elpusztítás történhet hig savval vagy hőkezeléssel, különösen előnyösen pedig kis menynyiségben alkalmazott apoláros szerves oldószerekkel.

Különösen előnyösen úgy járunk el, hogy a táptalajhoz 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk, majd szobahőmérséklet és 45 °C közötti hőfokon, előnyösen 37 °C körüli hőmérsékleten inkubáljuk 15 perc és néhány óra közötti ideig, különösen előnyösen 0,5 óráig.

Ha rendelkezésre áll megfelelő felszerelés, úgy is eljárhatunk, hogy a sejteket zárt térben összegyűjtjük, majd például 0,01-2 M ionerősségű, előnyösen 0,1-0,2 M ionerősségű,

5-9 közötti, előnyösen 6-8 közötti pH-értékű pufferoldatban szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz ezután kis mennyiségű szerves oldószert, például 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk.

További lehetőség, hogy a sejteket tartalmazó táptalajt vagy a sejtszuezpenziót 15-45 percig 60-80 °C-on tartjuk a sejtek elpusztítása céljából, vagy 0,5-1,5 közötti pH-értéket állítunk be.

Ezeknél a műveleteknél a termelt heterológ fehérje jelentős mértékű további kiválása következik be, ha már addig nem volt kicsapva. A 9. példában egy olyan esetet ismertetünk, amikor ez az eljárás előnyös.

A találmány szerinti eljárásnak ezt a változatát további találmány szerinti módszerekkel kapcsolhatjuk össze aktiv heterológ fehérje kinyerése érdekében.

E. A heterológ fehérje oldása erősen denaturáló oldatban

Szintén a találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás, amelynek értelmében erős denaturáló oldat alkalmazásával oldjuk a fénytöréssel rendelkező fehérjéket az oldhatatlan vagy szemcsévé alakított formájukból. Jóllehet a fénytöréssel rendelkező testek formájában lévő fehérjék általában oldhatatlanok a citoplazmában fennálló körülmények között (és így a viszonylag kis ionerősségű pufferoldatokban is), oldhatóknak látszanak egyes denaturálószerek eléggé nagy koncentrációjú, általában 4-9 M koncentrációjú oldataiban.

Különösen előnyös denaturálószerek a guanidinsók, jóllehet eredményesen alkalmaztunk detergenseket, például Tritont és nátrium-dodecil-szulfátot, továbbá tiocianátsókat is.

4-9 M közötti koncentráció használható a guanidinsók vagy a nátrium-tiocianát esetén, s különösen előnyös a 6-8 M közötti tartomány. A mosószereket 0,1-2%-os oldatban htisználjuk.

Az oldat pH-jának összeférhetőnek kell lennie az illető fehérje jellemzőivel, úgy, hogy irreverzibilis denaturálás vagy fehérjehidrolízis ne lépjen fel.

A denaturálószer optimális koncentrációja függ a szolubilizálni kívánt fehérjétől és az alkalmazott pH-értéktől.

Amíg az oldhatóság - ha egyszer elértük - gyakran akkor is fennmarad, ha a szolubilizált heterológ fehérjét gyengébben denaturáló közegbe visszük át, nem célszerű a szolubilizálést ugyanezzel a gyengén denaturáló közeggel elkezdeni. Akár termodinamikai, akár kinetikai okokból a fehérje nem oldódik elfogadható időn belül ilyen kevésbé drasztikus körülmények között.

Az oldathoz további komponenseket is adhatunk, hogy fenntartsuk a kívánt pH-értóket, és egyes esetekben más segédanya11

-1021 gokra is szükség lehet, például kelátképzókre, mint amilyen az etilén-diamin-tetraecetsav.

Amint azt a fénytöréssel rendelkező testek alakjában jelenlevő fehérjék viselkedése mutatja az 1-8., 10. és 11. példában, azok az oldatok, amelyek nem erősen denaturálok, általában nem oldják ezeket a fénytöréssel rendelkező fehérjéket (ugyanakkor a gazdasejtek fehérjéi oldódnak bennük). Az erős denaturáló oldatok viszont oldják a fénytöréssel rendelkező fehérjéket. Ennek megfelelően a gyengén denaturáló pufferoldatok szintén felhasználhatók a gazdasejtek fehérjéinek szolubilizálására és eltávolítására.

A találmány szerinti eljárás e változata értelmében a gazdasejteket először olyan közegben szuszpendáljuk, amelynek az ioneróssége megfelelő ahhoz, hogy sok gazdasejtfehérjét szolubilizáljon, azaz az ionerőssége 0,01-2 M, előnyösen 0,4-0,6 M, 5-9 közötti, előnyösen 6-8 közötti pH-értéken. Pontos ionerősség- és pH-értékeket természetesen nem adhatunk meg, az alkalmazható értéktartományok a fentiek.

A fenti oldat jelenlétében bekövetkezik a sejtek megbontása, majd a szuszpenziót centrifugáljuk. Az igy képződő üledék elsősorban a fénytöréssel rendelkező alakban lévő, kívánt fehérjéket tartalmazza, amelyeket a fentebb leírt, erősen denaturáló közegben szolubilizáljuk. A szolubilizált fehérjét az újranaturáláeát lehetővé tevő módon nyerjük ki.

P. A nagy molekulatömegü szennyező anyagok eltávolítása

A találmány egy olyan eljárásra is kiterjed, amelynek értelmében a szolubilizált, kívánt, korábban fénytöréssel rendelkező fehérjét közvetlenül az erősen denaturáló oldatban megszabadítjuk a nagyobb molekulatömegű komponensektől, még akkor is, ha a denaturálószer ionos, molekulaszita vagy nagy sebességű centrifugálás alkalmazásával.

A szükséges műveleteket az 1. folyamatábrán a „felülűszó folyadék, a kivánt fehérjével megjelölésű anyag feldolgozására feltüntetett, legbaloldalibb nyilak mutatják. Az erős denaturálószerrel extrahált szemcse centrifugálásával nyert felülűszó folyadékot vagy méret szerint megkülönböztetetö gélpermeációs molekulaszitával töltött oszlopon vezetjük át (ilyen molekulaszita például a szefakril), vagy nagy segbességgel centrifugáljuk, hogy elkülönítsük a nagyobb molekulaeúlyü alkotórészeket. Egyik módszernél sincs szükség arra, hogy az ionokat eltávolitsuk az oldatból, ezért közvetlenül felhasználhatjuk a szemcse extraktumát, még akkor is, ha ez az extraktum ionos. (Lásd a 10. és

11. példát).

Amikor a nagy molekulatömegü szennyező anyagokat gélszűréssel távolítjuk el, a molekulaszitát, például Sephacryl S-300-at tartalmazó oszlopot egyensúlyba hozzuk egy alkalmas pufferrel, amely előnyösen redukálószert is tartalmaz, és átvezetjük az oszlopon a heterológ fehérjét tartalmazó oldatot. Az oszlopról távozó folyadékot, amely tartalmazza a nagyobb molekulatömegü anyagokat, elöntjük, a heterológ fehérjét pedig további pufferoldattal eluáljuk. Az eluált fehérjét például oly módon ellenőrizhetjük, hogy mérjük az optikai sűrűséget 280 nm-nél, a kívánt fehérje jelenlétét nemionos oldószerrel szemben kivitelezett dialízissel igazolhatjuk. Ezután nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében kivitelezett poliakrilamid-gélelektroforézissel határozhatjuk meg a megfelelő molekulatömegű fehérjét.

Az alternatív módszernél nagyegbességű centrifugálást végzünk a gravitációs-gyorsulás 25 000-40 000-szerese, előnyösen 35 000-szerese mellett, 10 perc és 3 óra közötti ideig, majd a felülúszó folyadékot további tisztítás céljából elkülönítjük.

Eléggé szokatlan, ha egy ipari fehérjetisztító eljárásnál első kromatográfiás lépésként gélpermeációs kromatográfiai alkalmazunk, azaz például ioncserélő kromatográfia előtt végezzük a gélperraeációt. A találmány szerinti eljárásnál azonban a fehérje eléggé tiszta (gyakorlatilag mindig legalább 50%-os tisztaságú) közvetlenül elbontás és/vagy denaturálás után. Ezért a fehérjék elkülönítésére szolgáló szokásos eljárásokkal összehasonlítva, a kivánt fehérje eléggé tiszta állapotban van már, amikor a gélszüréses lépés következik. Ennek következtében erre az esetre - nem vonatkozik a szokásos hátrány, azaz a gélszűrés kisebb kapacitása az ioncsere kapacitásához képest. Mivel a szennyező anyagok mennyisége csekély, nincs szükség olyan nagy kapacitásra, mint amikor kis mennyiségű értékes fehérjét különítünk el sokféle szennyező anyagtól.

Kivánt esetben ezután további tisztítást is végezhetünk. Ha a feloldáshoz használt denaturálószer ionos volt, ezükeég van az oldat sómentesitésére abban az esetben, ha a további tisztítás ioncserével történik. Ennél a sómentesítésnél az ionos denaturálószert nem ionos denaturálöszerre cseréljük ki. A gyakorlatban előnyös, ha erre a célra gyengén denaturáló oldatot, például karbamid-oldatot használunk. Jóllehet elvben a denaturálószert egyszerűen például dialízissel távolíthatjuk szokásos pufferek alkalmazásával, ez gyakran a fehérje újbóli kicsapódását eredményezi. A fehérje korai kicsapódását megakadályozzuk, ha olyan oldatban tartjuk, amely tartalmaz bizonyos mennyiségű denaturálószert.

Miután az ionokat eltavolitottuk és nem ionos anyaggal helyettesítettük, sokféle kromatográfiás módszert alkalmazhatunk a to12

-1123 vébbi tisztításhoz, igy ioncserét vagy semleges adszorbensekeh Előnyös választás ezek közül a DEAE cellulóz kromatográfia olyan pH-értéken, amelyen a kívánt fehérje nem tapad az oszlophoz, és megjelenik az oszlopról távozó folyadékban. Ilyen módon az oszlop visszatartja a fehérje anionos szennyező anyagait, és eltávolítja azokat a kívánt fehérjétől. A fordított eljáráshoz képest, amelynél a kívánt fehérje adszorbeálódik és utána eluáljuk, ennek a módszernek nyilvánvaló előnye, hogy egyszerű és kevesebb gyantát igényel. Tekintettel arra, hogy a kívánt fehérje van jelen túlnyomórészt, csak annyi gyantára van szükség, amennyi adszorbeálja a szennyező anyagokat.

A találmány szerinti eljárásnak ez a változata azonban nem korlátozódik bizonyos példákra, hanem lehetővé teszi, hogy sokféle elválasztási módszert alkalmazzunk a további tisztításhoz.

G. Az oldhatóság fenntartása erős denaturálószer nélkül

A találmány arra a megoldásra is kiterjed, amelynél a tisztítás folyamán fenntartjuk a fehérje oldhatóságát oly módon, hogy a fehérje erősen denaturáló oldatát gyengén denaturáló oldattal helyettesítjük a tisztítás vagy a biológiai vizsgálat előtt. Egyes esetekben, például az Escherichia coli által termelt emberi növekedési hormonnál ez önmagában elegendő lehet a visszacsavarás eléréséhez, azonban ez nincs mindig igy. Továbbá némelykor és bizonyos alkalmazásoknál (például ahol később nem alkalmazunk ioncserét), az erősen denaturáló oldat korlátozott mértékű hígítása elegendő a fehérje oldhatóságának fenntartásához. A puffercsere azonban, amelynél az erősen denaturáló oldatot gyengébbel váltjuk fel, hasznos az oldhatóság fenntartásához, miközben lehetőség van a további tisztításra és egyes esetekben a biológiai aktivitás helyreállítására. Ez főképpen az erős ionos denaturálószerek esetén kívánatos, mivel például gyakran szükség van ioncserélő módszerek használatára ahhoz, hogy tovább tisztítsuk a részlegesen tisztított, fénytöréssel rendelkező fehérjéket. A fénytöréssel rendelkező fehérjék szolubilizálásával nyert oldatot közvetlenül nem használhatjuk ehhez, mivel az ionos denaturálószer zavarja az ioncserét. A denaturálószer eltávolítása azonban gyakran a kívánt fehérje kicsapását eredményezi.

Ezek a problémák elkerülhetők puffercserével, araikor az erős ionos denaturálószert, például a guanidint, kevésbé erős nem ionos denaturálószerrel, például karbamiddal váltjuk fel. Úgy tűnik, hogy a karbamid észszerű koncentrációkban - azaz 1-9 M koncentrációban - lehetővé teszi a fehérjék konformációjának visszaállítását a természetes állapotukat megközelítő állapotba, akár extrahált, akár S-szulfonált alakban voltak, és emellett (talán ennek következtében) megmarad a fehérjék oldhatósága.

A puffercserét kivitelezhetjük béta-merkapto-etanol vagy más alkalmas redukálószer jelenlétében, úgy, hogy redukáljuk az esetleges nem megfelelő diszulfidkötést, amely kialakulhatott a puffercserével kiváltott újranaturálás előtt, vagy alternatív módon az

S-szulfonát alakjában levő fehérjét.

Ennek megfelelően, ennél a találmány szerinti eljárásnál a fehérjét vagy S-szulfonátját és például 4-9 M guanidin-hidrokloridot tartalmazó, erősen denaturáló oldatot puffercserének vetjük alá dialízis vagy diaszűrés alkalmazásával karbamid-oldattal vagy más gyenge denaturálószer oldatával szemben, amely adott esetben redukálószert is tartalmaz alkalmas koncentrációban. A puffercserét a későbbi tisztító műveletek előtt végezzük el. (Amint azt a leírás más helyén kifejtjük, az eredeti, erősen denaturáló oldatot először szulfittal és enyhe oxidálószerrel kezelhetjük, hogy szulfitolizis menjen végbe, mielőtt puffercserét végeznénk gyengén denaturáló közeggel szemben. Ez a szulfitolizis beilleszthető a találmány szerinti eljárás jelen változatába.)

Mindegyik esetben a gyengén denaturáló oldat olyan fehérjét tartalmaz, amelynek csavarodottsága közelebb áll a biológiailag aktív fehérjének megfelelő alakhoz (akár S-szulfonálva van, akár nem), és a kapott oldat alávethető a tisztító módszerek teljes skálájának, például anioncserélő oszlopon, igy DEAE-cellulóz oszlopon, vagy kationcserélő oszlopon, például karboxi-metil-cellulóz oszlopon végzett ioncserének.

A későbbi tisztitó műveleteket mindig önmagéban ismert módon végezzük, megfelelő pH-értéken és sókoncentrációnál, az elkülöníteni kívánt fehérjétől és az alkalmazott stratégiától függően. Ezek a tisztító műveletek a szakember számára ismertek, és alkalmazásuk nem jelent problémát.

H. A konformáció kialakítása (visszacsavarás)

A találmány szerinti eljárás további három változata három alternatív eljárás, amely a kívánt fehérje (feltehetően a helytelen konformációja miatt) inaktív alakjának újraaktiváláséra irányul.

Az első ilyen eljárásnál a fénytöréssel rendelkező fehérjéket, amelyeket erős denaturálószer, például guanidin-hidroklorid oldatával szolubilizáltunk, újranaturaljuk a kővetkezőképpen: először szulfitolizist végzünk az erősen denaturáló oldatban, majd visszacsavarás, a szulfonát eltávolítása és diszulfid-képzódés következik gyengén denaturáló közegben, valamely szulfhidril vegyület és az

-1225 ennek megfelelő, kis mennyiségű diszulfid vegyület jelenlétében. A diszulfid vegyületet vagy közvetlenül hozzáadjuk az oldathoz, vagy egyedül a szulfhidril vegyületet használjuk, azonban nem fordítunk gondot a levegő kizárására. Ekkor olyan oxidáló atmoszféra alakul ki, amelyben mér képződik bizonyos mennyiségű diszulfid.

A szulfitolizist általában úgy végezzük, hogy az erősen denaturáló közegben, például 4-9 M guanldin-hidroklorid-oldatban szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjéhez 5-200 mg/ml, előnyösen 15-30 mg/ml nátrium-szulfitot vagy megfelelő moláris mennyiségű egyéb szulfitsót adunk annyi enyhe oxidálószer jelenlétében, amely elegendő a reakció folytán képződő esetleges szulfhidrilcsoportokból a diszulfid regenerálására. Alkalmas oxidálószer például a molekuláris oxigén katalizátorként fémkationok jelenlétében, vagy a nátrium-tetrationát. Előnyős oxidálószer a nátrium-tetrationát.

A nátrium-tetrationátot 1-20 mg/ml, előnyösen 10 mg/ml mennyiségben alkalmazzuk. Megfelelő ekvimoláris mennyiségű egyéb oxidálószert is használhatunk. Az oldatot ezután 4-24 órán át, előnyösen egy éjszakán át állni hagyjuk, 15-35 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten. Jóllehet megadtunk alkalmas koncentráció- és hőmérséklettartományokat, a pontos reakciókörülmények, amelyek a legelőnyösebbek, természetesen függnek annak a fehérjének a tulajdonságaitól, amelynek a szulfitolizisét el akarjuk végezni.

Továbbá, néha hasznos, ha csak .részleges szulfitolizist végzünk. Ebben az esetben lényegesen kisebb mennyiségű szulfit és oxidálószer elegendő. Lásd például a 13, példát. A fentebb megadott mennyiségek csupán útmutatásul szolgálnak, és a szélső értékeket különböző paraméterek határozzék meg, igy az oldatban lévő fehérje mennyisége és az elérni kívánt szulfitolizis mértéke.

A fenti szulfitolizisnél felhasadnak a diszulfid-kötések, és egy szulfonátcsoport kapcsolódik a diszulfid-kőtésben részvevő egyik kénatomhoz. Úgy véljük, hogy ennél a reakciónál a szulfition nukleofil támadással felhasitja a diszulfid-kötést. A kialakuló kötés minden esetben fehérje-S-SCto, azaz fehér je-S-szulfonát.

A képződő fehérje-S-szulfonátot gyengén denaturáló oldatba visszük át, vagy hígítással vagy puffercserével, például dialízis segítségével karbamidot tartalmazó oldatba.

Megjegyzendő, hogy további tisztítást végezhetünk például ioncserélő kromatográfia vagy més szokásos fehérjetisztító módszer alkalmazásával, miközben a fehérje még az S-szulfonált alakban van jelen.

A gyengén denaturáló közeg lehetőséget ad a megfelelő konformáció kialakulására, mivel a fehérje már nem tartalmaz helytelen diszulfid-kötéseket. Ha gyengén denaturáló oldatként karbamid-oldatot használunk, a megfelelő koncentraciótartomány 1-9 M, előnyösen 6-8 M. A pH-értékét 5-9 között, előnyösen 6-8 között tartjuk alkalmas pufferrel, amelyhez adott esetben etilén-tetraecetsavat vagy más kelátképzőt adunk.

Ha hígítással biztosítjuk a gyengén denaturáló oldatot, akkor az eredeti erős denaturálószert 0,5-2 M koncentrációra hígítjuk.

A gyengén denaturáló közeghez a következő komponensekből álló rendszert adunk: szulfhidril vegyület (RSH) és a megfelelő diszulfidja (RSSR), például béta-merkapto-etanol, redukált glutation, ciszteamin vagy cisztein és a megfelelő oxidált vegyületek. Az alkalmazott rendszei· előnyösen a glutation redukált alakjából (GSH) és oxidált alakjából (GSSG) áll. A pH-t olyan értékre állítjuk be, hogy a szulfhidril vegyület (RSH) legalábbis részben ionizált alakban (RS') legyen, úgy, hogy növeljük a szulfonát nukleofil átalakításét, úgy is eljárhatunk, hogy egyedül a redukált vegyületformát használjuk a levegő jelenlétében, mivel ekkor elegendő mennyiségű diszulfid képződik. Az RSH/RSSR mólarány általában 20:1-5:1, előnyösen körülbelül 10:1, és az összes glutation vagy egyéb reagens koncentrációja 0,05-5 millimól. Az elegyet a fehérjétől függően 0-37 °C-on inkubáljuk 4-24 órán át, előnyösen egy éjszakán ét.

A szulfhidril vegyület maga elegendő lenne ahhoz, hogy a fehérje-S-szulfonát átalakuljon a megfelelő diszulfiddá, vagy legalább is diszulfid-kötéseket képezzen magával a szulfhidril vegyülettel, az oxidált formára azonban ahhoz van szüség, hogy a megfelelő diszulfid-kötések sértetlenek maradjanak. Abban az esetben, ha tiszta szulfhidril vegyületet használunk olyan körülmények között, amikor oxidációra nincs mód, a fehérje végül is a szulfhidríl-alakban lesz jelen, és nem diszulfidként. Ennek megakadályozására fenntartjuk a környező puffer oxidáló képességét kis mennyiségű diszulfid biztosításával, amelyet közvetlenül adunk az oldathoz, vagy a redukált szulfhidrilből a levegő hatására bekövetkező oxidációval alakítunk ki.

Az oldat most már a megfelelő ceavarodottságú fehérjét tartalmazza, s a kívánt konformációt feltehetően rögzítették a helyes diszulfid-kötések, ezért az oldatból adott esetben eltávolíthatjuk a denaturálószert egy olyan pufferoldattal szemben végzett dialízissel, amelynek a pH-értéke 5-9 és adott esetben kevés redukált glutationt vagy más szulfhidril' vegyületet tartalmaz 1 mM körüli koncentrációban. Erre a műveletre azonban nincs szükség akkor, ha a fehérje a denaturálószer jelenlétében is felhasználható.

A fentebb ismertetett eljárásnál a fehérje koncentrációját eléggé kis értéken, előnyösen 1 mg/ml alatt tartjuk, mivel némelykor - bár nem mindig - a nagyobb koncentrációk hátrányosak a reakció lefolyásához.

-1327

A szulfitolizist karbamid vagy más gyenge denaturálószer oldatában éppúgy kivitelezhetjük, mint erósen denaturáló oldatban, és előnyös is lehet, ha így teszünk, különösen olyankor, amikor különösen nagy az oldáshoz használt denaturálÓ6zer-koncentréció. Ilyen esetekben inkább a szulfitolizis elótt, semmint utána végezzük el a puffercserét a gyengébb denaturálószer oldatába, vagy a hígítást.

A találmány szerinti eljárásnak a heterológ fehérje megfelelő konformációjának kialakítását célzó másik változatánál a fehérje kiegyenesitését és visszacsavarását ugyanabban az oldatban vitelezzük ki oly módon, hogy a fehérjét vagy peptidet szulfhidril/diszulfid-tartalmú pufferbe helyezzük, amely puffer elegendő denaturáló képességgel rendelkezik ahhoz, hogy a közbenső konformációk mindegyike oldható maradjon a fehérje kiegyenesitése és visszaess varasa folyamán. Alkalmas közeg például a karbamidot 1-9 M koncentrációban, előnyösen 7 M körüli koncentrációban tartalmazó oldat, amely eléggé gyenge denaturálószer ahhoz, hogy jól megközelíthetővé váljon a helyes konformáció, ugyanakkor eléggé erós denaturálószer ahhoz, hogy megmaradjon a visszacsavarodó lánc mozgékonysága és a közbenső konformációk oldhatósága. Ez az eljárás .redox pufferben történó visszacsavarás' kifejezéssel jellemezhető. A megfelelő kicserélő közegben a szulfhidril vegyületeknek, például a béta-merkapto-etanolnak, glutationnak, ciszteaminnak vagy ciszteinnek, előnyösen a glutationnak mind a redukált (RSH), mind pedig az oxidált (RSSH) alakja jelen van.

Ennél a redox pufferben történó visszacsavarásnál az RSH/RSSR mólarány általában 20:1-5:1, előnyösen körülbelül 10:1, a teljes reagenskoncentráció pedig 0,05-5 mM. Eléggé nagy pH-értékre van szükség ahhoz, hogy biztosított legyen az RSH legalább is részleges ionizálása, jóllehet néni kell olyan nagy pH-érték, mint a fehérje denaturálásához.

Az elegyet 0-37 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 5 °C körüli hőmérsékleten inkubáljuk 4-24 órán át, előnyösen egy éjszakán át. Ugyanúgy, mint fentebb, a szulfhidril vegyület redukált és oxidált alakjának egyidejű jelenlétét vagy közvetlenül biztosítjuk, vagy a szulfhidril vegyület levegő segítségével lejátszódó oxidációjával. A szulfhidril vegyület mindkét formájára szükség van a megfelelő oxidáló képesség fenntartásához, hogy kiküszöböljük a fehérje teljes redukcióját.

Hasonló módon, mint a helyes konformáció kialakítását célzó többi találmány szerinti eljárásváltozatnál, a még oldatban lévő fehérjét. ismert fehérjetisztitö módszerekkel, például gélszűréssel vagy ioncserével kezelhetjük. Különösen előnyös ioncserélő módszer alkalmazása, például DEAE cullulóz segítségével.

A találmány szerinti eljárás egy további változata értelmében a konformáció kialakítását a tisztítás során úgy végezzük, hogy a fehérjét redukált alakban tartjuk, bármilyen tisztító műveleteket alkalmazunk is, majd a denaturálószer végleges eltávolításakor levegő jelenlétében végzett újraoxidálással alakítjuk ki a megfelelő diszulfid-kötéseket. Ennél az eljárásnál a fénytöréssel rendelkező fehérje erós denaturálószerrel készült kezdeti oldatához redukálószert adunk, s a redukálószer jelenlétét valamennyi későbbi tisztitó műveletnél is biztosítjuk. Alkalmas redukálószer például a béta-merkapto-etanol, ditiotreitol és a redukált glutation. Előnyös a béta-merkapto-etanol. Amikor az eljárás végén a denaturálószer legnagyobb részét vagy teljes mennyiségét eltávolítottuk, mar nem adunk további redukálószert a reakcióelegyhez, és elegendő mennyiségű levegő van jelen ahhoz, hogy a most már megfelelő konformációjú fehérjében a szulfhidrilcsoportokat diszulfid-kötésekké oxidálja vissza, és igy rögzítse a helyet natív formát. Ezt a találmány szerinti eljárást a 10. és 11. példában mutatjuk be.

H. Általános többlépéses eljárás

A 2. folyamatábrán mutatjuk be azokat a lépéseket, amelyekre szükség van a tisztítást célzó általános többlépéses eljáráshoz. A 2. folyamatábrán még két további fakultatív lépést is feltüntettünk. A vázolt többlépéses eljárás szintén a találmány tárgyát képezi.

-1429

2. folyamatábra

Sejtpép

1. lépés pufferben diszpergáljuk és homogenizáljuk

Üledék

Felülúszó folyadék (gazdasejtfehérje)

2. lépés denaturáló oldat

Üledék (gazdasejt törmeléke)

(újranaturált) puffercsere

-1531

Amint azt a 2. folyamatábra mutatja, ez a találmány szerinti eljárás alapvetően a kővetkezőkből áll.

A sejtpépet 0,05-2,0 M közötti, előnyösen 0,4-0,6 M közötti ionerösségű pufferoldatban diszpergáljuk annak érdekében, hogy tökéletessé tegyük vagy fenntartsuk a heterológ fehérje kicsapását és feloldjuk a gazdasejtfehérje főtömegét vagy fenntartsuk annak oldhatóságát. A gazdasejtfehérjétől történő elválasztás után a heterológ fehérjét redukálószert tartalmazó, erősen denaturáló oldatban oldjuk. Az eljárás akkor fejeződik be, amikor puffercsere útján a heterológ fehérjét biológiailag aktiv alakban nyerjük ki. A gélszűrésből és az ioncseréből álló 3. és 4. lépés fakultatív. Ezeket kívánt esetben alkalmazzuk, ha esetenként további tisztításra van szükség.

A kiindulási anyagul szolgáló sejtanyag lehet az egész tenyészet vagy annak koncentrált alakja, például sejtpép. Gazdasejtekként előnyösek a baktériumtenyészetek, különösen az Escherichia coli tenyészetei. Jelenleg előnyös, ha olyan sejtpépet használunk, amelynél a baktériumokat előzetesen elpusztítottuk, ilyen módon eleget téve a biztonsági rendszabályoknak. (A találmány szerinti eljárás mind elölt, mind pedig elöletlen gazdasejtekből történő fehérjekinyerésre alkalmas).

Előnyösen ügy járunk el, hogy a sejttenyészethez, miután a tenyésztést 30-50 közötti optikai sűrűség egység eléréséig végeztük 550 nm hullámhosszúságon, mintegy 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk, s mintegy 30 percig állni hagyjuk. Ezzel eredményesen pusztíthatjuk el a sejteket anélkül, hogy szükségtelenül denaturálnánk a sejtfehérjét. Hőközléssel és savak alkalmazásával a sejtek szintén hatékonyan elpusztíthatok, ezek a módszerek azonban kevésbé előnyösek, jóllehet a találmány szerinti eljárásnál az említett vagy más elpusztító módszerek felhasználhatók. Az elpusztított sejteket ezután vagy a teljes tenyészet alakjában vagy centrifugált sejtekként vetjük alá a találmány szerinti eljárás műveleteinek. Gyakorlati szempontból előnyös a cintrifugálással kapott sejtpép alkalmazása, mivel ekkor kisebbek a térfogatok. A sejttenyészetet vagy sejtpépet fagyasztásnak is alávethetjük a tisztítás előtt, pusztán az egyszerűség kedvéért.

A kezdeti extrakció során (a 2. folyamatábra 1. lépése) a sejteket egy olyan pufferoldatban diszpergáljuk alaposan, amelynek a pH-értéke 4-10, előnyösen 6-9, és ionokat tartalmaz úgy, hogy az ionerőssége 0,052,0 M, előnyösen 0,4-0,6 M. Bármilyen alkalmas pufferrendszert használhatunk. Az ionerősséget bármilyen sóval biztosíthatjuk, a pufferoláshoz használt sókat is beleértve, a gazdaságossági szempontból azonban előnyös a nátrium-klorid használata. Emellett kívánatos, hogy a pufferoldat kelátképző szert, például etilén-diamin-tetraecetsavat és redukálószert, például 2-merkapto-etanolt is tartalmazzon.

A fenti lépés kivitelezésekor igen kívánatos, hogy egységes szuszpenziót kapjunk. Sejtpép alkalmazása esetén előnyős a mechanikai diszpergálás. Erre a célra beszerezhetők a kereskedelmi forgalomból diszpergáló gépek; előnyösen a Dispax Model SD 45 (gyártó: Tekmar Inc.). Sejttenyészet alkalmazása esetén szükségtelen a mechanikai diszpergálás.

Tekintettel arra, hogy a kicsapott heterolog (fénytöréssel rendelkező) fehérje rendszerint a sejteken belül helyezkedik el, az 1. lépésben nyert sejtszuszpenzió homogenizáláséra is szükség van olyan típusú homogenizáló vagy prés alkalmazásával, amely valóban megbontja a sejtek egészét. Többféle berendezés vagy módszer alkalmazható erre a célra, például francia prés vagy golyós malom vagy ultrahanggal történő kezelés. Előnyös azonban a Manton-Gaulin 15 N típusú homogenizáló készülék.

Miután a sejteket a pufferoldatban diszpergáltuk és homogenizáltuk a leirt módon, az oldhatatlan anyagot előnyösen centrifugálással választjuk el az oldható fehérjéktől, és a felülúszó folyadékot eltávolítjuk. A felülúszö folyadékot, amely elsősorban a gazdasejt fehérjéit tartalmazza, elöntjük.

Előnyösen a kapott üledéket mossuk hasonló pufferoldatban történő diszpergálással, hogy még jobban eltávolitsuk a gazdasejt anyagát az üledékben lévő oldhatatlan fehérjétől. A mosást a szokásos módon végezzük, az üledéket friss pufferoldatban diszpergáljuk és újból centrifugáljuk.

Az üledéket ezután a 2. lépés értelmében extraháljuk a kivánt heterológ fehérjék kinyerése érdekében. Az üledéket erősen denaturáló oldatban diszpergáljuk az 1. lépésben alkalmazott hasonló módon. Az ehhez használt oldat előnyösen 1-9 mólos, különösen előnyösen 6-8 mólos az erősen denaturáló anyagra nézve, amely például egy guanidinsó. Emellett az oldat annyi foszfát puffért vagy más alkalmas pufferanyagot tartalmaz, hogy a pH-értéke 4-10, előnyösen 6-9, különösen előnyösen 7 körüli legyen. Továbbá előnyös, ha az oldatban kis mennyiségű kelátképző szer, például etilén-diamín-tetraecetsav is jelen van. Az oldatban redukálószerre, például béta-merkapto-etanolra is szükség van, annak biztosítására, hogy az esetleges diszulfid-kötések szabad szulfhidrilcsoportokká alakuljanak.

Természetesen más denaturálószereket is használhatunk. A diszpergálás folyamán a szemcséket legfeljebb 24 órán ét, előnyösen egy éjszakán át keverjük a denaturáló oldattal.

A szuszpenziót ezután centrifugáljuk, és kidobjuk a szemcsét, amely feloldatlan és ki17

-1633 csapott gazdasejtfehérjét, valamint sejttől— meléket tartalmaz.

Néha elegendő az eddig leírt tisztítás ahhoz, hogy a kapott fehérjét felhasználhassuk, mindössze gyengítenünk kell a denaturálószer hatásét hígítással vagy puffercserével. Ebben az esetben elhagyható a 3. és 4. lépés, és közvetlenül az 5. lépést vitelezzük ki az alábbiak szerint.

A 2. folyamatábrán feltüntetett 5. lépésben a kivánt fehérjét olyan módon nyerjük ki biológiailag aktív alakban, hogy a denaturálószert alkalmas oldószerkőzeggel cseréjük fel. Egyes fehérjéknél elegendő, ha az eredetileg jelenlevő denaturálószert kisebb koncentrációra hígítjuk. Más fehérjéknél viszont arra van szükség, hogy puffercserét hajtsunk végre, és egy olyan oldatba vigyük át a fehérjét, amely egy kevésbé kaotrop denaturélószert, például karbamidot tartalmaz. A végső lépést az elkülönítésnél redukálószer távollétében vitelezzük ki, hogy ismét kialakulhassanak a diszulfid-kötések, miután a fehérje kiegyenesedett a gyengébb denaturálószerben.

Ha viszont kívánatos további tisztítás, akkor elvégezhetjük a fakultatív lépéseket redukálószer jelenlétében, hogy fokozzuk a tisztaságot az újranaturálás előtt. A tisztítás több módszerrel is történhet. Néhány példaképpen! és előnyös módszert az alábbiakban ismertetünk.

A 3. lépés során a denaturálószert, redukálószert és a kívánt fehérjét tartalmazó oldatot méret szerinti elkülönítést célzó gélszűréssel kromatografáljuk. Az, hogy milyen pórusméretű gélt választunk ki, függ a tisztítani kivánt fehérje természetétől. A szájés körömfájás vírus fehérjéihez megfelelő például a Sephacryl -S-300 (gyártó: Pharmacia).

A gélszűrést végezhetjük egy olyan ionos denaturálószer nagy koncentrációja jelenlétében, amely felhasználható a kívánt fehérje szolubilizálására. Nyilvánvaló azonban, hogy egy ilyen oldattal nem végezhető el a

4. lépés szerinti ioncserélő kromatográfiás tisztítás. Ezért, ha ioncserén alapuló további tisztításra is szükség van még, a denaturáló oldatot, ha az tartalmaz ionokat, például guanidínt, vagy gélpermeéciós kromatográfiánál képződő eluátumot, ha az tartalmaz még ionokat, az ionokat eltávolító kezelésnek kell alávetnünk. Ez dialízissel történhet egy olyan, előnyösen lúgos pufferoldattal szemben, amely ismét tartalmaz redukálószert és nagy koncentrációban semleges denaturálószert, például mintegy 8 mól karbamidot, hogy biztosított legyen a heterológ fehérje szolubilizációja.

Amikor a sókat eltávolitottuk, a dialízis során visszamaradt anyagot kromatográfiának vetjük alá, megfelelő ioncserélő oszlop, például DEAE cellulóz alkalmazásával. A kromatográfiás kezelés körülményeit előnyösen úgy választjuk meg, hogy a kívánt fehérje átfolyhasson az oszlopon a hézagtérfogatban. Ez előnyös, mivel kevesebb ioncserélő gyantára van szükség, ha a nyomokban jelenlevő szennyező anyagokat kell a gyanta segítségével adszorpcióval eltávolitanunk, mint amikor a fehérjét kötjük meg a gyantán, amely fehérje a tisztítás e szakaszában a kivánt termék.

Az oszlopon átfolyó folyadékot, amely a tisztított fehérjét és a (semleges) denaturálószert tartalmazza, vagy ebben a formájában használja fel - erre egyes esetekben lehetőség van vagy megszabadítjuk a denaturélószertöl egy higabb oldattal szemben végzett dialízissel. Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy egyes esetekben, a fehérje kicsapódásának megakadályozására szükség van egy előzetes puffercserére, amelynél a fehérjét higabb karbamid-oldatba visszük át, majd ezt követően végezzük el a végsó puffercserét viz vagy pufferoldat alkalmazásával.

A 2. folyamatábrán vázolt valamennyi lépésnél, egészen az utolsóig, redukálószernek jelen kell lennie. Az alkalmas redukálószereket fentebb ismertettük, és kifejtettük azokat az okokat is, amelyekből kifolyólag a használatukra szükség van.

A kapott oldatban jelenlevő fehérje rendszerint 95-99%-os tisztaságú. A heterológ fehérje kinyerésénél a termelés általában legalább 50%, és akár 98% is lehet.

A fentebb ismertetett találmány szerinti eljárásváltozat különösen előnyösen alkalmazható a következő fehérjékre: emberi növekedési hormon, sertés növekedési hormon, szarvasmarha növekedési hormon, szarvasmarha interferon, a szövetekben jelenlevő plazminogén aktivátor és száj- és körömfájás vírus bevonata.

I. Példák

A találmányt az alábbi példákkal részletesen ismertetjük az oltalmi kör korlátozása nélkül.

Az 1-8. példa a gazdasejtfehérjék szolubilizálását és a fénytöréssel rendelkező testeknek például kissebességű centrifugálással történő kinyerését mutatja be.

A 9. példa azt szemlélteti, hogyan növelhetjük a fénytöréssel rendelkező testek mennyiségét a sejtek elölésével.

A 10. és 11. példa arra a találmány szerinti többlépéses eljárásra vonatkozik, amelynél az előzetes elbontást és a baktériunifehérjék eltávolítását összekapcsoljuk a fénytöréssel rendelkező fehérjék és - elkerülhetetlenül - bizonyos szennyező anyagok erős denaturálószerrel történő szolubilizálásával, majd kívánt esetben tisztítást végzünk, amely gélszűrésból vagy nagy sebes-1735 ségű centrifugálásböl áll első lépésként, végül kinyerjük az aktiv fehérjét.

A 10. és 11. példa azt is bemutatja, amikor a levegőt használjuk diszulfidképzó reagensként, miután hagytuk, hogy a fehérje megfelelő konformációja kialakuljon redukálószer jelenlétében; továbbá az erősen denaturáló oldatoknak azt a képességét, hogy feloldják a fénytöréssel rendelkező testeket; valamint az oldhatóság fenntartását az erős denaturálóezernek gyengébb denaturálószerrel való kicserélésével.

A 12., 13. és 15. példában azt mutatjuk be, amikor a legalább is részben inaktív fehérje megfelelő konformációját szulfitolizissel, majd redox pufferben végzett kezeléssel alakítjuk ki. A 14. példából a redox pufferrel történő konformáció kialakítás tűnik ki.

A 16. példa az erősen denaturáló oldattal történő oldás, majd gyengébb denaturálószerrel végzett puffercsere hatékonyságát szemlélteti.

Valamennyi példában olyan heterológ fehérjék szerepelnek, amelyek tisztítása a találmány szerinti eljárással történt. A tisztítással kapcsolatos részletek természetesen eltérnek az egyes fehérjéknél. Jóllehet a találmány szerinti eljárás mindegyik esetben hasonló, egyes részletek, például a kivánt fehérje szolubilizálásához használt denaturálószer, a megfelelő gélek vagy ioncserélő gyanták valamint az egyes lépéseknél alkalmazott ionerösség és pH, függnek az illető fehérje tulajdonságaitól. A fénytöréssel rendelkező fehérjéknek azonban elegendő közös jellemzőjük van ahhoz, hogy ezek a kisebb eltérések hozzáigazíthatók legyenek az eljáráshoz a szóban forgó fehérjénél.

1. példa

Heterológ fehérjék termelése és elkülönítése

A. Sejtek szaporítása

Escheriehia coli K-12 sejteket, amelyeket az Escheriehia coli trp promotor-operátor irányítása alatt levő heterológ géneket hordozó pBR 322 rekombinélt plazmiddal transzformáltunk, olyan táptalajon szaporítottunk amely 10 g/1 élesztőkivonatot és 5 g/1 triptont tartalmazott. A szaporítást 2-4x10« sejt/ml sejtsűrűségig végeztük. A kapott tenyészet térfogatának 3-5%-át bevittük M9 táptalajba (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, 431. oldal, Cold Spring Harbor Laboratov, 1972) vagy hasonló, ásványi sókat tartalmazó táptalajba, amelyben 40-120 mg/1 triptofán is jelen volt. A tenyésztést fermentorban folytattuk olyan mértékű mozgatás és levegőztetés mellett, hogy 60-90 perc/sejtosztódás növekedési sebességet érjünk el.

Glukózt adtunk a tenyészethez a növekedés fenntartására, ügyelve azonban arra, hogy a glukóz koncentrációja a fermentálás alatt ne lépje túl az 50 g/1 értéket. A tenyészet pH-ját 6,8-7,2 értékre állítottuk be nátrium-hidroxiddal vagy ammónium-hidroxiddal. 5-10 g száraz súly/liter sejtmennyiségnél indolil-akrilsavat (IAA) vagy indolil-propionsavat (IPA)) adtunk a tenyészethez 25-50 mg/1 koncentrációban. Az IAA vagy IPA hozzáadása után 2-5 órával az Escheriehia coli sejtek megnyúltakká váltak, és sejtenként egy vagy több, fénytöréssel rendelkező testet figyeltünk meg fáziskontraszt mikroszkóp alatt 1000-szeres nagyítás mellett.

B. A heterológ fehérje elkülönítése

Az egyes tenyészeteket folyamatos centrifugálással különítettük el, és a sejtpépet megfagyasztottuk -10 és -20 °C közötti hőmérsékleten. (Kívánt esetben az elkülönítés előtt elpusztíthatjuk a sejteket olyan módon, hogy 0,25% fenolt és 0,25% toluolt adunk a táptalajhoz, és 0,5 órán át inkubáljuk 37 °C-on - lásd a 9. példát.) A frissen elkülönített vagy megfagyasztott sejtpépet pufferoldatban szuszpendáltuk, amely 10 mM trisz(hidroxi-nietil)-amino-nietánt és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazott, és a pH-értéke 7,4 volt. 1 g sejtpép szuszpendálásához 10-40 ml pufferoldatot használtunk. A szuszpenzióban a sejteket ultrahanggal végzett kezeléssel vagy nagy nyomás alatti homogenizálással bontottuk meg.

Fáziskontraszt mikroszkóp alatt a fénytöréssel rendelkező részecskék láthatók voltak a sejttörmelék között. Az 1. ábrán olyan Echerichia coli K-12 3110 törzs (ATCC-száma 27 325) sejtjeinek fáziskontraszt mikroszkópon keresztül készült fényképe látható, amely a pUK 33 trp LE2 plazmiddal volt transzformálva, és amely a 33 000 molekulatömegű urokinázt tartalmazó összekapcsolt fehérjét termel. (A fenti plazmiddal transzformáit Escheriehia coli törzset a 368 773 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és a 92 182 számú európai szabadalom írta le, a bejelentés napja 1982 április

15.) A fényképen a fénytöréssel rendelkező testek fényes foltokként jelennek meg a sejten belül.

A szuszpenziót 3-10 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 1000-szersének megfelelő értéken (Sorlvall SS-34 centrifuga, 3000 fordulat/perc). A centrifugálás befejezése után a felülúszó folyadékot elöntöttük, a szemcsét pedig ugyanebben a pufferoldatban szuszpendáltuk, az eredeti térfogat 1/5 részének megfelelő mennyiséget használva belőle. A szuszpenziót fáziskontraszt mikroszkóp alatt vizsgáltuk. Ha sértetlen sejtek vagy látható sejttöredékek voltak megfigyelhetők, a fenti eljárást addig ismételtük meg,

-1837 amíg az ismételten szuszpendélt üledék vizuális vizsgálata csak fénytöréssel rendelkező részecskéket mutatott.

A 2. ábrán az 1. ábrán bemutatott sejtekből az 1, példában ismertetett módon nyert, újraszuszpendált üledék fáziskontraszt mikroszkóp alatti képe látható, A 2. ábrából kitűnik, hogy a szuszpenzió főleg fénytöréssel rendelkező testekből áll, kevés sejttel és sejttörmelékkel együtt.

Abban az esetben, ha a szuszpenzióban sejtek vagy sejttörmelékek is jelen voltak, azokat újból megbontottuk. A fénytöréssel rendelkező testeket általában 3-4 fentebb ismertetett ciklus után különítettük el. A fénytöréssel rendelkező testek ezután megfagyasztva tárolhatók, üledékként vagy szuszpenzióban, és a fehérjetartalmuk 95%.

A fénytöréssel rendelkező testekből álló készítmény azonosítását nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel, .Western biot módszerrel és/vagy radioaktív immunológiai vizsgálattal (RIA) végeztük. A 3. ábrán a sertés növekedési hormonnal (pGH), veszettség elleni antigénnel és urokinázzal (UK) végzett tisztítás eredményeit mutatjuk be. (Az ábrán a sertés növekedési hormont, veszettség elleni antigén illetve urokinázt termelő sejttenyészetek ultrahanggal kezelt egész sejtjeinek (2., 4. és 6. oszlop) valamint az 1. példa szerint előállított, ultrahanggal kezelt szemcséinek nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézise látható, A szemcsék vizsgálatára a 3., 5. illetve 7. oszlop vonatkozik. Az egész sejtek keverékként jelennek meg. A veszettség elleni antigént és a sertés növekedési hormont tartalmazó szemcsék egyetlen sávot eredményeznek. Az urokinázra kapott sávrendszer bonyolultabb a számos allotrop alakja miatt. A 3. ábra 1. oszlopa a pBR322 plazmiddal transzformált Escherichia coli K-12 W3110 törzs ultrahanggal kezelt sejtjeinek felel meg.

2. példa

Emberi növekedési hormon ~

Az emberi növekedési hormon génjént hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pl07 törzset (amelyet a 4 342 832 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet) fermentorban szaporítottuk, majd a sejteket elkülönítettük és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elválasztottuk az 1. példában ismertetett módon.

A részecskék 22 000 dalton molekulatömegnek megfelelő fehérjesávot mutattak 2-merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisnél. A gél denzitométeres vizsgálata azt az eredményt szolgáltatta, hogy ez a fe20 hérje több mint 90%-ét képezi a fénytöréssel rendelkező részecskék teljes fehérjetartalmának. A .Western biot' módszerrel azonosítottuk ezt a fehérjét emberi növekedési hormonként. 1 g nedves sejtpépböl mintegy 10-20 mg mennyiségben nyertük ki a fénytöréssel rendelkező részecskéket.

A 4A. ábrán az első centrifugálással kapott üledék szuszpenziójában lévő, fénytöréssel rendelkező, emberi növekedési hormont tartalmazó testek fáziskontraszt mikroszkóp alatti képe látható.

A 4B. ábra a fenti, savval elölt és elöletlen sejtek nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilaraidgél-elektroforézisének eredményeit mutatja be. Az 1. és 3. oszlop elölt illetve elöletlen sejteknek (egész sejteknek) felelnek meg. Ezek az oszlopok febérjekeverékeket és hozzávetőleg azonos mennyiségű emberi növekedési hormont jeleznek. A 2. és 4. oszlop elölt illetve elöletlen sejtekből elkülönített, fénytöréssel rendelkező sejtek extraktumainak felelnek meg. Az elölt sejtek esetén az emberi növekedési hormonra vonatkozó sáv nagyobb.

3. példa

Szarvasmarha növekedési hormon (bGH)

A szarvasmarha növekedési hormon génjét hordozó rekombinánlt DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pBGH-l törzset (amelyet a 303 687 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és az annak megfelelő 75 444 számú európai szabadalmi leirás és 2 106 119 számú angol szabadalmi leírás ir le, a bejelentés napja 1981. szeptember 18.) fermentorban tenyésztettünk, majd a sejteket összegyűjtöttük, amint azt az 1. példában ismertettük. (A fermentorban lévő sejteket az összegyűjtés előtt 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltük.) A fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük, és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében poliakrilamidgél-elektroforézissel vizsgáltuk. Egyetlen fehérjesávot kaptunk, amely a 22 000 dalton molekulatömegű standard anyagnak felelt meg, A gél denzitométeres vizsgálata azt mutatta, hogy ez a sáv a fénytöréssel rendelkező részecskék teljes fehérjetartalmának több mint 90%-át képezi.

Miután a részecskéket 7 M guanidin-oldatban oldottuk, és az oldattal dialízist végeztünk 7 M karbamid-oldatban, a szarvasmarha növekedési hormon jelenlétét radioaktív immunológiai vizsgálattal (RIA) igazoltuk. 1 g nedves sejtpépből körülbelül 20 mg mennyiségű, fénytöréssel rendelkező részecskéket nyertünk ki.

-1939

4, példa

Sertés növekedési hormon (pGH)

A sertés növekedési hormon génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pGH-exl törzset (amelyet a 439 977 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és az annak megfelelő 83 306 730 számú európai szabadalmi leirás ír le, a bejelentés napja 1982. november 8.) fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, amint azt az 1. példában ismertettük. (A fermentorban lévő sejteket az összegyűjtés előtt 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltük.) Az elkülönített, fénytöréssel rendelkező részecskék a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis során egyetlen fehér jesávot adtak, amely 22 000 dalton molekulasúlyú standard anyagnak felel meg. A gél denzitométeres vizsgálat azt mutatta, hogy a gélen lévő teljes fehérmennyiség több mint 90%-a ez a sáv. Miután a részecskéket 7 M guanidin-oldatban oldottuk és dialízissel 7 M karbamid-oldatba átvittük, a sertés növekedési . hormon jelenlétét radioaktív immunológiai vizsgálattal igazoltuk. 1 g nedves sejtpépből körülbelül 20 mg mennyiségben nyertük ki a fénytöréssel rendelkező részecskéket.

Az 5A. ábra a pufferoldatban szuszpendált sejtpépben lévő, sertés növekedési hormont tartalmazó, fénytöréssel rendelkező részecskéket mutatja. Az 5B. ábrán ugyanez a sejtpép látható ultrahanggal végzett kezelés után. Az 5C. ábra az ultrahanggal kezelt sejtpép kis sebességű centrifugálásával nyert szemcsét mutatja be.

5. ábra

Humán fibroblaszt interferon (FIF)

A humán fibroblaszt interferon génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Esherichia coli K-12 W3110/pFlF 347 törzset [amelyet Shepard, M. és munkatársai írtak le a DNA, 1, 125 (1982) szakcikkben] fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük az 1. példában leírtak szerint. A kapott fénytöréssel rendelkező részecskék 2-merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfét jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézise egyetlen fő sávot mutatott, amely 17 000 dalton molekulasúlynak felelt meg, és amely a fénytöréssel rendelkező részecskékben jelenlévő összes fehérjének 50%-át képviselte. A .Western biot' vizsgálat azt mutatta, hogy a fénytöréssel rendelkező fehérje specifikus módon reagált a tiszta humán fibrobalszt interferon antitestjeivel. 1 g nedves sejtpépből 10-20 mg mennyiségben nyertük ki a fénytöréssel rendelkező részecskéket.

6. példa

Humán immun interferon (IIF)

A humán immun interferon génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pIFN-gamma trp48 törzset (amelyet a 312 489 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a 77 670 sz. európai szabadalmi leírás és 2 107 718 sz. angol szabadalmi leírás Ír le, a bejelentés napja 1981. október 19.) fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük az 1. példában ismertetett módon. A kapott fénytöréssel rendelkező részecskék 2-merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézise 17 000 dalton molekulatömegnek megfelelő fő sávot mutatott, amely a fénytöréssel rendelkező részecskék teljes fehérjetartalmának 50%-át képviselte. A .nyugati folt vizsgálat azt mutatta, hogy a fénytöréssel rendelkező fehérje specifikus módon reagált a tiszta humán immun interferon antitestjeivel. 1 g nedves sejtpépböl 10-20 g mennyiségű fénytöréssel rendelkező részecskéket különítettünk el.

7. példa szövetekben lévő plazminogén aktivétől- (TPA)

Az emberi szövetekben lévő plazminogén aktivator génjét hordozó rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 3110 pEPAtrpl2 törzset (amelyet a 398 003 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és az annak megfelelő 93 619 sz. európai szabadalmi leírás és 2 119 804 sz. angol szabadalmi leírás ír le, a bejelentés napja 1982. július 14.) fermentorban tenyésztettük, majd a sejteket összegyűjtöttük, és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük a sejtpéptől az 1. példában ismertetett módon.

A fénytöréssel rendelkező részecskékben jelenlévő fehérje 80-90%-a az emberi szövetekben lévő plazminogén aktivátornak bizonyult a 2-merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis, denzitométeres vizsgálat és .Western biot’ vizsgálat alapján. 1 g nedvves sejtpépből 10-20 g mennyiségű, fénytöréssel rendelkező részecskéket különítettünk el.

-2041

8. példa

A száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérje

A száj- és körömfájás vírusantigén különböző törzseinek megfelelő rekombinált DNS-t tartalmazó Escherichia coli K-12 W3110/pFMG (01), W3110/pFMB (A24), W3110/FMD (03), W3110/FMC (A27) törzseket (amelyeket a 374 855 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a 68 693 sz. európai és a 2 103 622 sz. angol szabadalmi leírás ir le, a bejelentés napja 1982. május 4.) tenyésztettünk, a sejteket összegyűjtöttük, és a fénytöréssel rendelkező részecskéket elkülönítettük az 1. példában ismertetett módon.

A fénytöréssel rendelkező részecskékben jelenlevő fehérjének körülbelül 50%-a volt klónozott száj- és körömfájás virusbevonat-fehérje gén termék, amint azt a 2-merkapto-etanol és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis eredményeinek denzitométeres kiértékelése és a .Western biot' vizsgálat mutatta.

9. példa

A fénytöréssel rendelkező fehérje menynyiségének növelése a sejtek elpusztításával

Meghatároztuk az emberi növekedési hormon mennyiségét a citoplazmában és a fénytöréssel rendelkező testekben az elölt és elöletlen sejteken végzett összehasonlító vizsgálattal. Az emberi növekedési hormon termelésére képes Escherichia coli K-12 W3110/pl07 törzs setjeit (lásd a 2. példa) tenyésztettük, majd pedig centrifugálással őszszegyűjtöttük az 1. példa A. pontjában ismertetett módon. A centrifugálás előtt a táptalajt két részre osztottuk. Az egyik részt 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltük, és 37 °C-on 4 órán át ínkubáltuk. Az ilyen módon elpusztított sejtek jelölése .PT‘, míg az elöletlen sejteké .NPT*.

A. A teljes sejtfehérje extrakciöja nátrium-dodecil-szulfáttal

Az elölt és az elöletlen sejtek egyenlő mintáit azonos kezelésnek vetettük alá: mindegyik sejtmintát megbontottuk ultrahanggal végzett kezeléssel egy olyan oldatban, amely 5 ml 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 10 mM etilén-diamin-tetraecetsavat és 250 pl 20%-os nátrium-dodecil-szulfét-oldatot tartalmaz. A szuszpenziókat 0,5 percig kevertük, majd centrifugáltuk. A felülúszó folyadékokban meghatároztuk az emberi növekedési hormont radioaktív immunvizsgálattal (RIA) és nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében vég22 zett poliakrilamidgél-elektroforézissel. Mind az elölt, mind pedig az elöletlen sejtek aktivitása lényegében azonos volt a radioaktív immunvizsgálattal, mégpedig 8,3x10® illetve 8,7x10®. Feltehetően a nátrium-dodecil-szulfáttal végzett extrakcióval mind az eredetileg oldható, mind az eredetileg oldhatatlan emberi növekedési hormont kinyerjük.

A 6. ábrán mutatjuk be a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel kapott megfelelő eredményeket, valamint a kővetkező, B. pont szerint kezelt mintákkal kapott gélelektroforézis eredményeket.

B. Kísérleti extraktumok

Az elölt és elöletlen sejtek két további egyenlő mintáját azonos módon kezeltük: 5 ml 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldattal (amely 10 mM etilén-diamin-tetraecetsavat is tartalmazott) extraháltuk és 0,5 percig kevertük. A szuszpenziókat ezután 10 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 10 000-szerese mellett, azaz kis sebességgel, majd a felülúszó folyadékot és az üledéket külön-külön vizsgáltuk. Feltehetően az üledékben lévő fehérje oldhatatlan nátrium-dodecil-szulfát távollétében. Az elöletlen sejtek aktivitása a felülúszó folyadékban 4,6x10® egység/ml volt (körülbelül fele a nátriuro-dodecil-szulfátos extraktuménak), az üledékben azonban lényegesen kevesebb, 0,42x10* egység/ml. Másrészt az elölt sejteknél az emberi növekedési hormon aktivitása lényegesen kisebb volt a felülúszó folyadékban a nátrium-dodecil-szulfátos extraktuméhoz képest, a radioaktív immunvizsgálat alapján 0,26x10* egység/ml, és csekély volt a szemcsében is az aktivitás, mivel a szemcse szolubilizációja bekövetkezett.

Hasonló eredményeket kapunk akkor is, amikor a mintákat hasonló módon kezeltük és 30 percig nagyobb sebességgel centrifugáltuk, azaz a gravitációs gyorsulás 35 000-szerese mellett.

C. Az eredmények összehasonlítása

A 6. ábrán foglaljuk össze a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel kapott eredményeket. Az ábra 12. oszlopa tiszta emberi növekedési hormon mintára vonatkozik. A 9. illetve 10. oszlop elöletlen egész sejtek illetve elölt egész sejtek nátrium-dodecil-szulfátos extraktumának felelnek meg. Mintegyik esetben fehérjekeverék mutatható ki, az emberi növekedési hormonnak megfelelő erős sávval.

Az 1. és az 5. oszlop az elöletlen sejtek kis sebességű illetve nagy sebességű centrifugálásával nyert felülúszó folyadék sávjait mutatja. A 3. és a 7. oszlopban az elölt sejtek kis sebességű illetve nagy sebességű centrifugálásával előállított felülúszó folyadék

-2143 sávjai láthatók. Ebben a két oszlopban az emberi növekedési hormon sávjának intenzitása jelentős mértékben csökkent.

A 2. és 6. oszlop elöletlen sejtek kis sebességű illetve nagy sebességű centrifugáiésával kapott üledékek sávjait mutatja be. A 4. és 8. oszlop az elölt sejtek kis sebességű illetve nagy sebességű eentrif ugatásával nyert üledékek sávjait szemléltetik. Az elölt sejteknél nagyobb az emberi növekedési hormon sávjának intenzitása.

A 6. ábrán látható, hogy a nátrium-dodecil-szulfáttal extrahált sejteknél az emberi növekedési hormon sávja természetesen azonos intenzitású. Az elöletlen sejteknél igen jelentős volt az emberi növekedési hormonnak megfelelő sáv mind a felülüszó folyadékban, mind pedig az üledékekben, akár nagy, akár kis sebességű centrifugálással történt az elválasztás. Másrészt, az elölt sejteknél csökkent a felülúszó folyadékban lévő emberi növekedési hormon mennyisége mind a kis, mind a nagy sebességű centrifugálással végzett elválasztásnál, a szemcsében azonban növekedett a2 emberi növededési hormon mennyisége.

10. példa

A száj- és körömfájás vírus fehérjeburkolata

Többlépéses eljárás

Az A24 típusú száj- és körömfájás vírust kódoló gént tartalmazó Exherichia coli K-12 W3110/pFHB (A24) törzset (amelyet a 374 855 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, a 68 693 sz. európai és a 2 103 622 számú angol szabadalmi leírás Ír le, a bejelentés napja 1982. május 4.) addig tenyésztettük, amíg a sejtsürűség 30-50 optikai sűrűség egységnek nem felelt meg 550 nm-en; vagy amig a nedves sejtpép mennyisége 40 g nem lett 1 liter M9 táptalajban vagy hasonló, sókat tartalmazó közegben, amelyben a triptofán mennyisége 40120 mg/1, a glukózé pedig legfeljebb 5 tömegX volt. Lásd Experiments in Mölecular Genetics, J.H, Miller, Cold Spring Harbor Labcratory, N.Y. (1972)).

liter tenyészetet 0,25% fenollal és 0,25% toluollal kezeltünk 0,5 órán át, majd centrifugáltuk. A sejtpépet megfagyasztva tároltuk a fehérje tisztítása előtt. Az alkalmazott tisztítást a 3. folyamatábrán mutatjuk be.

-2245

3. folyamatábra

1. Lépés

Sejtpép

1. üledék

1*. lépés

2. üledék

2. lépés

Üledék (eldobjuk) megolvasztjuk, .A' pufferben diszpergáljuk homogenizáljuk

Felülúszó folyadék (elöntjük) a szemcsét friss .A’ pufferrel mossuk

Felülúszó folyadék (elöntjük)

7M guanidin-hidroklorid-oldatban (.B” puffer) oldjuk

Felülúszó folyadék

Felülúszó folyadék (a 2. lépésből)

3. lépés

Nem száj- és körömfájás vírusfehérjét tartalmazó frakciók (elöntjük) kromatografálás Sephacryl S-300 gyantán

Száj- és körömfájás vírusfehérjét tartalmazó frakciók, elegyítve

3’. lépés

Dializátum (elöntjük)

4. lépés dializáljuk .0 puffer alkalmazásával

Visszamaradt anyag kromatográfia DE-52 oszlopon

Oszlopon maradt anyag (eldobjuk)

Oszlopon áthaladt száj- és körömfájás vírusfehérje

5. lépés

DializátíS (elöntjük) dializáljuk

1) karbamid

2) puffer alkalmazásával

Visszamaradt száj- és körömfájás virusfehérje

-2347

Közvetlenül a felhasználás előtt hagytuk, hogy a sejtpáp hűtőszekrényben megolvadjon. 500 g megolvadt sejtpépet 5 liter .A pufferben diszpergáltunk (a pufferoldat 50 mM foszfátot, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat, 500 mM nátriumkloridot, 15 mM béta-merkapto-etanolt tartalmazott, a pH-értéke 7 volt). Az egyenletes szuszpenzió előállításához G-450 generátorral ellátott Tekmar Dixpax Model SD-45 diszpergáló berendezést használtunk. A diszpergálást 3 percig végeztük teljes sebességre kapcsolt berendezéssel.

A szuszpenziót ezután Manton-Gaulin 15M típusú homogenizáló berendezéssel homogenizáltuk, 41 370 kPa nyomás alkalmazásával. A berendezésen kétszer vezettük át a szuszpenziót, és a két átvezetés között lehűtöttük. A homogén terméket 30 percig centrifugáltuk 4 °C-on Beckman RC3 centrifugában 5000 fordulat/perc mellett. A nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis azt mutatta, hogy a felülúszó folyadék lényegében ugyanazt a fehérjekeveréket tartalmazza, mint a centrifugálás előtti homogén anyag, lényegesen kisebb azonban a száj- és körömfájás virusfehérjének megfelelő sáv.

Az üledék mintegy a felét tartalmazta az eredeti sejtpép mennyiségének, a felülúszó folyadékot dekantáltuk és elöntöttük. Az üledéket olyan módon mostuk, hogy friss .A’ pufferoldatban diszpergáltuk Dispax SD-45 diszpergáló berendezés alkalmazásával, 2 liter pufferoldatot véve 200 g szemcsére. A szuszpenziót ismét centrifugáltuk a Beckman RC3 centrifugában 4 °C-on 30 percig, 5000//perc fordulatszámon. A felülúszó folyadékot dekantáltuk és elöntöttük. A 137 g mennyiségű üledék a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézisnél megnövelt nagyságú, a száj- és körömfájás vírusfehérjének megfelelő sávot mutatott, amely az üledék fehérjetartalmának mintegy 50%-át képviselte.

Az üledékből ezután extraháltuk a szájés körömfájás vírust bevonó fehérjét oly módon, hogy 1 liter .B' pufferoldatban szuszpendáltuk Dixpax SD-45 berendezés alkalmazásával. A ,B‘ pufferoldat 50 mM foszfátot, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat, 15 mM béta-merkapto-etanolt és 7 M guanidin-hidrokloridot tartalmazott, s a pH-értéke 7 volt. A szuszpenziót egy éjszakán át kevertük, majd centrifugáltuk Sorvall SS-34 rotor alkalmazásával 19 000/perc fordulatszámon, 3 órán át 4 °C-on.

Az üledéket eldobtuk, a száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérjét tartalmazó oldatot pedig kromátografáltuk Sephacryl S300 gyanta (gyártó: Pharmacia) alkalmazásával. Először hagytuk, hogy egyensúly alakuljon ki a gél és a ,B‘ pufferoldat között, majd 5 cm átmérőjű és 50 cm magasságú oszlopba töltöttük a gyártó cég útmutatása szerint. A hézagtérfogatot kitöltő frakciók (270 ml-től kezdve) zavarosak voltak, jóllehet az oszlopra felvitt oldat nem volt zavaros. A száj- és körömfájás vírusfehérjét tartalmazó frakciók 450-650 ml térfogatnál voltak elkülöníthetők. Ezek a frakciók tiszta oldatok voltak.

A száj- és körömfájás vírusát bevonó fehérjét úgy azonosítottuk, hogy a frakciók alikvot részeit dializáltuk 8 M karbaraid-oldattal szemben, majd nátrium-dodecil-szulfát jelenlété be n poliak rilamid gél-elek troforézissel analizáltuk. (A guanidint a nátrium-dodecil-szulfát kicsapja, ezért előbb el kell távolítani).

A száj- és körömfájás vírusának fehérjebevonatát tartalmazó frakciókat elvegyítettük és dializáltuk 20-szoros feleslegben vett ,C pufferoldattal szemben (14 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán, 15 mM béta-merkapto-etanol, 8 M karbamid, pH=8,3) 4 °C-on. A dialízis során négyszer cseréltük ki a pufferoldatot. (A dialízissel a 8 M karbamid-oldat biztosította a guanidin-hidroklorid helyett a fehérje oldatban tartását).

A visszatartott folyadék vagy alikvot részét nátrium-hidroxiddal pH=10-ig lúgositottuk, és 1,0 cmxl9 cm méretű, DE-52 töltettel ellátott oszlopon vezettük át, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk nátrium-hidroxiddal pH=10 értékre beállított ,C' pufferoldattal. A fehérjét nem tartotta vissza a gyanta, ugyanakkor az Escherichia coli-tói származó szennyező anyagok túlnyomó részét megkötötte. A gyantáról távozó folyadék fehérjetartalmának 96%-a a száj- és körömfájás vírusának fehérjéje volt a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézis alapján. Ez azt jelenti, hogy 1 kg sejtpépből 30 g terméket nyertünk ki, azaz a termelés 90% körüli. A kapott, fehérjét tartalmazó oldat felhasználható végtermékként, ha a karbamid jelenléte megengedhető az aktív anyag beadásánál.

A fentiek szerint kapott készítményből a karbamidot úgy távolitottuk el a fehérje kicsapása nélkül, hogy először 4 mg/ml koncentrációjú fehérje-oldatot dializáltunk 250-szeres feleslegben vett 1 M karbamid-oldattal szemben, amely még 14 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt és 0,1% béta-merkapto-etanolt tartalmazott, s a pH-értéke 7 volt, 4 °C-on, majd a visszatartott oldatot vízzel szemben dializáltuk. Enyhe zavarosodás jött létre, ezt azonban centrifugálással megszüntettük.

A száj- és körömfájás virusfehérjének kicsapódását vízben vagy pufferoldatban nyilvánvalóan az akadályozta meg, hogy fokozatosan csökkentettük a karbamid koncentrációját. A kapott fehérje biológiailag aktiv volt, amit a száj- és körömfájás antiszérumaval adott reakció, a .Western biot vizsgálat, továbbá az az in vivő vizsgálat mutatott, hogy szarvasmarhán immunreakciót hozott létre.

-2449

11. példa

Sertés növekedési hormon tisztítása

Többlépéses eljárás

A 4. példában leirt Escherichia coli K-12 W3110/pPGH-exl törzset az 1. példában ismertetett módon tenyésztettük 30-50 optikai sűrűség egység eléréséig. A táptalaj literenként 40 g nedves sejtpépet tartalmazott. A tenyészet fenol- és toluolkoncentrációját 0,25%-ra állítottuk be, majd 30 perc múlva a táptalajt centrifugáltuk, és a sejtpépet tárolás céljából megfagyasztottuk.

Közvetlenül a felhasználás előtt hagytuk, hogy 384 g sejtpép megolvadjon hűtőszekrényben, és 3,9 liter hideg .A' pufferoldatban diszpergáltuk. A pufferoldat 50 mM foszfátot, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsavat és 500 mM nátrium-kloridot tartalmazott, és a pH-értéke 7 volt Tekmar Dispax Model SD-45 diszpergáló berendezést használtunk, amely G-450 generátorral volt ellátva, és 3 percig működtettük a berendezést a 60-as beállításon. A kapott egyenletes szuszpenziót Manton-Gaulin 15 M típusú homogenizáló berendezéssel homogenizáltuk, 44 820 kPa nyomás alkalmazásával. A szuszpenziót kétszer vezettük át a berendezésen, és a két átvezetés között hűtést alkalmaztunk.

A 4,3 liter homogenizált szuszpenziót Sorvall RC3 rotor alkalmazásával centrifugáltuk 4 °C-on 30 percig 5000/perc fordulatszámon. A felülúszó folyadékot dekantáltuk, majd nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel kimutattuk, hogy lényegében ugyanazt a fehérjekeveréket tartalmazza, mint a homogenizált szuszpenzió a centrifugálás előtt, csak jelentősen csökkent benne a sertés növekedési hormonnak megfelelő sáv.

A felülúszó folyadékot elöntöttük, az üledéket pedig friss .A pufferoldatban diszpergáltuk a Dispax SD-45 berendezés alkalmazásával. 150 g mennyiségű üledékhez

1,5 liter pufferoldatot használtunk. A szuszpenziót ismét centrifugáltuk az RC3 rotor alkalmazásával, 5000/perc fordulatszámon, 35 percig 4 °C-on. A felülúszó folyadékot dekantáltuk és elöntöttük.

A 106 g mennyiségű üledéket 750 ml ,B pufferoldatban oldottuk [amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat, 100 mM béta-merkapto-etanolt és 7 M guanidin-hidrokloridot tartalmaz, pH-értéke 8,8], Dispax SD-45 berendezés alkalmazásával, és egy éjszakán át kevertük az oldatot. A zavaros oldatot Sorvall SS-34 rotor alkalmazásával centrifugáltuk 19 000/perc fordulatszámon 6 órán át 4 °C-on, és a szemcsét kidobtuk.

A 740 ml összmennyiségű felülúszó folyadékból 690 ml-t szobahőmérsékleten kromatografáltunk 10 cm átmérőjű és 85 cm hosszúságú Sephacryl S-300 oszlopon (gyártó Pharmacia). Az oldatot kétszer két részletben (350 ml és 340 ml) kromatografáltuk. Az egyensúly kialakításához 7 M guanidin-hidroklorid-oldatot használtunk, amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat és 50 mM béta-merkapto-etanolt tartalmazott, pH-értéke 8,9 volt. Az oszlopról távozó frakciók alikvot részeit dialízisnek vetettük alá egy olyan oldattal szemben, amely 8 M karbamidot, 0,1% béta-merkapto-etanolt és 25 mM trisz(hidroxi-etil)-amino-metánt tartalmazott, és pH-értéke 7 volt, majd nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakrilamidgél-elektroforézissel analizáltuk, hogy meghatározzuk a sertés növekedési hormon jelenlétét.

A sertés növekedési hormont tartalmazó frakciókat elegyítettük és 4 °C-on dializáltuk. A dialízishez 20-szeres feleslegben vett oldatot használtunk, amely 15 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot, 50 mM béta-merkapto-etanolt, 7 M karbamidot tartalmazott, és a pH-értéke 9,0 volt. A dialízis során négyszer cseréltük ki a fenti oldatot. A 3900 ml mennyiségű visszatartott folyadékot sósavval pH=7,0 értékre állítottuk be, és 10 cmxll,5 cm méretű DE-52 oszlopon vezettük át, miután a gyantát szobahőmérsékleten egyensúlyba hoztuk egy olyan, 7,0 pH-értékű oldattal, amely 15 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, 50 mM béta-merkapto-etanolt és 7,5 M karbamidot tartalmazott. Az oszlopot a térfogatának megfelelő mennyiségű, az egyensúly kialakításához használt pufferoldattal azonos összetételű oldattal mostuk a sertés növekedési hormon eltávolítása érdekében.

A DE-52 oszlopról elvezetett 4000 ml folyadékot nátrium-hidroxiddal pH=10 értékig titraltuk, majd Spectrapor 1 készülékben dializáltuk háromszor 100 liter mennyiségű, 25 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt és 1% mannitot tartalmazó, pH=10 értékű oldatokkal szemben, 4 °C-on. A visszatartott folyadékot a dializátummal 10,4 literre hígítottuk, szűréssel sterileztük és liofilizáltuk. 10 g biológiailag aktív fehérjét kaptunk, amely a .Western biot vizsgálat alapján 98%-os tisztaságú sertés növekedési hormon volt.

12. példa

Prorennin konformációjának kialakítása szulfitolizissel

A prorennint kódoló gént hordozó Escherichia coli K-12 W3ll0/pRIAK törzs (amelyet a 83 307 841.3 és 83 307 842.1 sz. európai szabadalmi bejelentések ismertetnek) tenyésztésével kapott sejtpép 432 g mennyiségét 3 liter pufferoldatban szuszpendáltuk, amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot és 5 mM etilén-diamin-tet-2551 raecetsavat tartalmazott, és 7,5 pH-értékű volt. A szuszpendált sejteket megbontottuk Manton Gaulin prés segítségével, 41 370 kPa nyomáson. A szuszpenziót négyszer vezettük át a présen, majd 30 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 4000-szeresének megfelelő érték mellett. A felülúszó folyadékot elöntöttük, az üledéket 2 liter mennyiségű, ugyanilyen pufferoldatban szuszpendáltuk, és ismét 30 percig centrifugáltuk a gravitációs gyorsulás 4000-szeresénél. A felülúszó folyadékot ismét elöntöttük, az üledéket pedig 6 M guanidin-hidroklorid-oldatban oldottuk, amely oldat 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, és a pH-értéke 8 volt. A szolubilizált, fénytöréssel rendelkező fehérjét ezután szulfonáltuk oly módon, hogy egy frissen készített és derített, nátrium-szulfitot és nátrium-tetrationátot tartalmazó törzsoldat hozzáadásával 20 mg/ml nátrium-szulfit-koncentrációt és 10 mg/ml nátrium-tetrationát-koncentrációt állítottunk be. Hagytuk, hogy a szulfonálás 4 óra alatt végbemenjen szobahőmérsékleten.

Az oldatot ezután dializáltuk 5 órán át 5 M karbamid-oldattal szemben, amely 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, és a pH-értéke 7,5 volt. A dialízissel kapott oldatot 10 cmx35 cm méretű DE-52 oszlopra vittük fel, ahol az oszlopot előzetesen ugyanezzel a .megkötő pufferoldattal (5 M karbamid, 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-raetán-hidroklorid, pH=7,5) mostuk. Az oldatot 750 ml/óra sebességgel adtuk az oszlopra, és egy éjszakán át mostuk az oszlopot a fenti pufferoldattal.

A DE-52 oszlopot ezután eluáltuk 0-ról 0,15 M-ra növelt nátrium-klorid-grádiens mellett, 1 liter/óra áramlási sebességgel, 16 órán ét. A fehérje fő tömege 0,070 M natriura-klorid-koncentráció közelében oldódott le az oszlopról. A prorennint tartalmazó frakciókat ismert dializáló szűrésnek vetettük alá 5 M karbamidot és 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidrokloridot tartalmazó, pH=8,5 értékű oldattal szemben, és a kapott oldat redukált glutation-koncentrációját (GSH) 1 mM-ra, oxidált glutation-koncentrációját (GSSG) 0,1 mM-ra állítottuk be, és egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A karbamidot egy újabb dializáló szűréssel távolítottuk el 0,1 mM redukált glutationt tartalmazó, pH=8,0 értékű 50 mM triszíhidroxi-metil)-amino-metán-oldat alkalmazásával. A kapott oldat mentes volt a denaturálószertől, és 5,5 g fehérjét tartalmazott. Az össztermelés mintegy 1% volt.

A fehérje biológiai aktivitását a prorennin antiszérumraal adott reakciója mutatta, valamint az, hogy autokatalitikus aktiválás után aktív volt a standard tejalvadást kiváltó vizsgálatnál.

13. példa

Aktív urokináz előállítása részleges szulfitolizissel

A 368 773 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben és az annak megfelelő 92 182 sz. európai szabadalmi leírásban leírt (a bejelentés napja 1982. április 15.) Escherichia coli K-12 W3110/pUK

33trpLEi törzs tenyészetétől az 1. példában ismertetett módon elkülönítettük az urokinázt tartalmazó, fénytöréssel rendelkező testeket. Ez utóbbiakat 5 M guanidin-hidroklorid-oldat.ban oldottuk, amely 50 mM trisz (hidroxi-metil)-amino-roetánt is tartalmazott, s a pH-értéke 8,0 volt. 0,2 mg/ml nátrium-szulfit-koncentrációt és 0,1 mg/ml nátrium-tetrationát-koncentrációt állítottunk be az oldatban, és egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten.

Az oldatot ezután 50 mM trisz (hidroxi-metil)-amino-metán pufferoldattal (pH=9,0) addig hígítottuk, amíg a guanidin-hidroklorid koncentrációja 1,5 M nem lett, majd 10 raM redukált glutation-koncentrációt (GSH) és 1 mM oxidált glutation-koncentrációt (GSSG) állítottunk be. Az oldott fehérjét tartalmazó híg guanidin-oldatot ismét egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten, és vizes oldatba dializáltuk.

Amíg a fénytöréssel rendelkező testek aktivitása a standard urokináz biológiai vizsgálatnál 0,25 PU/mg volt, addig a fenti módon elkülönített urokináz aktivitása 150 PU//mg értéknek adódott.

14. példa

Az urokináz ujraaktiválása redox pufferrel

A 13. példában ismertetett, fénytöréssel rendelkező testeket olyan 5 M guanidin-hidroklorid-oldatban oldottuk, amely 50 mM trísz(hidroxi-metil)-amino-metánt is tartalmazott, s a pH-értéke 8,0 volt, majd a kapott oldatot dializáltuk 2 M karbamidot és 50 mM tr isz(hidroxi- metil )-amino-metán-hidrokloridot tartalmazó, pH=7 értékű oldattal szemben. Az oldatban ezután 10 mM redukált glutation-koncentrációt (GSH) és 1 mM oxidált glutation-koncentrációt (GSSG) állítottunk be, és az oldatot egy éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. A kívánt konformációjü fehérjét tartalmazó oldatot dializáltuk vizes közeg alkalmazásával. A kapott oldat urokinázt tartalmazott, amelynek az aktivitása 30 PU/mg volt.

-2653

15. példa

Szark fehérje konformációjának kialakítása

Eredetileg szarkoma daganatokból elkülönített, .szark' elnevezésű fehérjét termeltünk oly módon, hogy az 1. példában leírtak szerint jártunk el transzformált sejtekből kiindulva, amelyeket McGrath, J. P. és Levinson, A.D. eljárásával állítottuk elő [Natúré, 295, 423 (1982)]. A természetes puffer körülmények között oldhatatlan fehérje 3 mg mennyiségben 3 ml 7 M guanidin-oldatot, 300 μΐ 1 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldatot (pH=8), 20 μΐ 0,5 M etilén-diamin-tetraecetsav-oldatot, továbbá 400 μΐ olyan oldatot adtunk, amely 200 mg/ml nátrium-szulfitot és 100 mg/ml nátrium-tetrationátot tartalmazott. Az oldatot szobahőmérsékleten egy éjszakán át állni hagytuk. Ilyen módon zavaros szuszpenzió képződött.

A szuszpenziót 5 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt tartalmazó, pH=8 értékű 7 M karbamid-oldattal szemben dializáltuk. A kapott oldathoz hozzáadtunk 300 μΐ 0,1 M glicin-oldatot (pH=9,5) és 90 pl 10 mM béta-merkapto-etanol-oldatot, majd egy éjszakán át állni hagytuk, és 50 mM trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldattal (pH=8,5) szemben dializáltuk. A kapott fehérje oldható volt, és egérbe fecskendezve olyan antitesteket indukált, amelyek kicsaphatok voltak autentikus szark fehérjével.

16. példa

Oldás guanid in-oldatban és exrakció karbamid-oldattal

A 8. példában leírt Escherichia coli K-12 W3110/pFMB [A24] törzset az 1. példa A. pontjában leírtak szerint tenyésztettük, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük. A 281 g nedves súlyú sejtpépet tízszeres térfogatú foszfát pufferben szuszpendáltuk (összetétel: 50 mM nátrium-dihidrogénfoszfát, 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav, 0,5 M nátrium-klorid, 0,1% béta-merkapto-etanol, pH= =7,0). (Ezt a foszfát puffért a továbbiakban PEB oldatnak nevezzük.) A kapott szuszpenziót kétszer átvezettük előhűtött Manton Gaulin présen 4137 kPa nyomáson és 1 liter/perc sebességgel. A szuszpenziót fél órán ót centrifugáltuk 5000/perc fordulatszámon RC5B centrifugában, a szemcsét 10 percig szuszpendáltuk 10-szeres térfogatú PEB oldatban ultratorex alkalmazásával. A szuszpenziót 0,5 órán át centrifugáltuk 5000/perc fordulatszámon RC5B centrifugában, a kapott üledéket pedig felvettük 20-szoros térfogatú karbamid-trisz pufferoldatban (a továbbiakban UTB oldat), amelynek összetétele: 8 M koncentrációjú, frissen készített és ionmentesitett karbamid-oldat, amely 0,14 M trisz28 (hidroxi-metil)-amino-metánt, 0,1% béta-merkapto-etanolt tartalmaz, pH-értéke 8,3.

Az oldatot 0,5 órán át tartottuk forrásban lévő vízfürdőn. Szobahőmérsékletre történő hűtés után 4-szeres téfogatú acetont adtunk hozzá, és az oldatot 1,5 órán át kevertük 6 °C körüli hőmérsékleten. A szuszpenziót 5000/perc fordulatszómon centrifugáltuk az RC3B centrifugában, és az üledéket felvettük 10-szeres térfogatú PEB oldatban. A szuszpenziót 0,5 órán át tartottuk forrásban lévő vízfürdőn, majd az RC5B készülékkel centrifugáltuk 5000/perc fordulatszámon, és a szemcsét 48 órán át szuszpendáltuk 2,2 literes 7 M guanidin-hidriklorid-oldatban, amely 0,1% béta-merkapto-etanolt is tartalmazott.

A mintát ezután dializáltuk pH=8,0 értékű UTB oldat alkalmazásával, amelyet háromszor cseréltünk ki friss oldatra, majd kromatografálóst végeztünk 5 cmx8 cm méretű DE-52 cellulóz oszlopon, amelyet előzetesen egyensúlyba hoztunk pH=8,0 értékű UTB oldattal. Az oszlopról távozó mosófolyadékot két frakcióban fogtuk fel, amelyek közül az egyik tiszta, a másik pedig zavaros frakció volt. A tiszta frakciót (>90% VP 3) 1,3 mg/ml körüli koncentrációig töményítettük be, és megvizsgáltuk a biológiai aktivitását.

Összehasonlító kísérleteket is végeztünk, amelynél az antigént úgy állítottuk elő, hogy az Escherichia coli K-12 W3110/pFMB [A241 törzset ugyanúgy tenyésztettük, gyűjtöttük össze és kezeltük, mint fentebb, a szemcsét azonban a guanidin-hidriklorid-oldat helyett az UTB oldatban vettük fel.

A vizsgálatnál a mintákat tengerimalacokba fecskendeztük be, és 28 nap múlva antiszérumot kaptunk. Az antiszérum antitest titerét annak alapján vizsgáltuk, hogy milyen mértékben képes megvédeni a szopós egereket a száj- és körömfájás vírusfertőzéstől. Az eredményeket az egerek 50%-ának immunitást adó antiszérumhígitás negatív logaritmusaként fejeztük ki (-lóg PDso).

A fenti készítmény 100 pg fehérjéjének befecskendezésével termelt antiszérum -lóg PDso értéke 3,2-3,4 volt, mig a kontroll kísérlettel előállított 100 pg fehérje befecskendezésével kapott antiszérum -lóg PDso értéke kisebb volt, mint 0,3.

Claims (20)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás biológiailag aktív fehérje előállítására egy gazdasejt-kultúrában heterológ expresszió-termékként termelt fénytörő fehérjéből, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtben termelt oldhatatlan fénytörő fehérjét - adott esetben a gazdasejt-kultúra sejtjeinek megölése és ezzel a fénytörő fehérje mennyiségének növelése, majd a sejtek elroncsolása után - elválasztjuk a nem-fénytöró terméktől, a fénytörő terméket egy ennek

-2755 szolubilizálására eléggé erős denaturáló képességű denaturáló oldattal kezeljük, és a fehérjét szolubilizált alakjának megtartása mellett, adott esetben az említett erősen denaturáló oldat tisztítása után, az alábbi kezeléssel hozzuk biológiailag aktiv alakba:

a) az erősen denaturáló oldatot a benne oldott fehérje oldatban tartása mellett gyengén denaturáló oldattá alakítjuk, a szolubilizált fehérje diszulfid-döntéseit az erősen denaturáló oldat gyengén denaturáló oldattá alakítása előtt vagy ezt kővetően felhasitjuk, majd az említett diszulfid-kötéseket a fehérjét biológiailag aktiv konformációjúvá alakítva helyreállítjuk; vagy

b) az erősen denaturáló oldatot a fehérje oldatban tartása mellett egy másik, gyengén denaturáló oldatra cseréljük ki; vagy

c) Az erősen denaturáló oldatot az említett fehérje oldatban tartása közben gyengén denaturálóvá alakítjuk, és a fehérjét oldva tartalmazó denaturáló oldatot egy vagy több tisztítási műveletnek vetjük alá;

mimeliett kívánt esetben a fenti a), b) vagy c) eljárás során a gyengén denaturáló oldatot a fehérje oldatban tartása közben egy még gyengébben denaturáló oldattá, majd kívánt esetben az utóbbit nem denaturáló oldattá alakítjuk tovább, és a biológiailag aktiv heterológ fehérjét kinyerjük az oldatból.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a denaturáló oldatként redukálószert tartalmazó oldatot alkalmazunk.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a diszulfid-kötéseket felhasító kezelést az erősen denaturáló oldatban végezzük.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a diszulfid-kötéseket felhasító kezelést a gyengén denaturáló oldattá való alakítás után végezzük.

5. Az 1., 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a diszulfid-kötéseket valamely szulfittal, enyhe oxidálószer jelenlétében való kezeléssel hasítjuk fel, a megfelelő fehérje-S-szuífonáttá való átalakítás útján.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enyhe oxidálószerként nátrium-tetrationátot használunk.

7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a diszulfid-kötések helyreállítását valamely szulfhidril-vegyülettel, ennek a megfelelő diszulfid-származéka jelenlétében végezzük.

8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjének az 1. igénypont a) eljárása szerinti kezelését egy szulfhidril-vegyülettel végezzük, ennek a megfelelő diszulfid-származéka jelenlétében, annyi denaturáló oldatban, amennyi elegendő a fehérje oldhatóságának az egész denaturálási művelet alatti fenntartásához.

9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szulfhidril-vegyületként redukált glutationt alkalmazunk.

10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a megfelelő diszulfidot oly módon állítjuk elő, hogy a szulfhidril-vegyületet levegőn oxidálni hagyjuk.

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérje kezelését oly módon végezzük, hogy a fehérjét a szolubilizáció, a denaturáló oldat átalakítása és az esetleges tisztítási műveletek során redukált állapotban tartjuk, majd a denaturálószer túlnyomó részének vagy egészének eltávolítása közben újraoxidáljuk.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az újraoxidálást a redukálószer kizárása és a levegő oxidáló hatásának érvényesülni hagyása útján végezzük.

13. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy erősen denaturáló oldatként valamely ionos denaturálószer oldatát alkalmazzuk.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy erős denaturálószerként valamely guanidinsót használunk.

15 gazdasejt-kultúrát a sejteket megölő kezelésnek vetjük alá és ezzel növeljük a fénytőrő fehérje mennyiségi arányát, majd a fénytörő fehérjéket a sejtek elroncsotásával extraháljuk.

15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy erősen denaturáló oldatként valamely guanidinsó 4-9 mól/l-es oldatát használjuk.

16. Az előző idénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyengén denaturáló oldatként karbamid 1-9 mól/1-es oldatát vagy valamely guanidinsó 0,5-2 mól/l-es oldatát használjuk.

17. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyengén denaturáló oldatként valamely nem-ionos denaturálószer oldatát használjuk.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyenge denaturálószerként karbamidot használunk.

19. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gyengén denaturáló oldatot az eljárás során még gyengébben denaturáló oldattá alakítjuk.

20. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét egy gyengén denaturáló oldatból egy nem-denaturáló oldatba visszük át.

21. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett egyik fehérje-oldatnak egy másik fehérje-oldattá való átalakítását puffer-csere útján végezzük.

22. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérje erősen denaturáló oldatát tisztítási műveletnek vetjük alá, a gyengén denaturáló oldattá való átalakítás előtt.

23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tisztítási műveletként a fehérjét egy méret szerinti szelektáló raole29

-2857 kul&szitáv&l érintkeztetjük és/vag nagy fordulatszámú centrif ugatásnak vetjük alá és így a nagyobb molekulatömegü komponenseket eltávolítjuk az oldatból.

24. Az előző igénypontok bármelyike ezerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyengén denaturáló oldatként egy nem-ionos denaturálószer oldatát alkalmazzuk, és a fehérje gyengén denaturáló oldatát további tisztítás végett ioncserélő kromatográfiának vetjük alá.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyenge denaturálószerként karbamidot alkalmazunk.

26. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fénytörő fehérjét oly módon választjuk el a nem-fénytőrő anyagtól, hogy a sejteket egy ionos pufferoldatban elroncsoljuk és kis fordulatszámú centrifugálásnak vetjük alá, amikor is a fénytörő fehérje a csapadékba kerül, míg a sejt-törmelékek a pufferoldatban maradnak; és adott esetben a centrifugált csapadéknak az ionos pufferoldatban való szuszpendálását, az elroncsolást és a kis fordulatszámú centrifugálást egyszer vagy többször megismételjük és ezzel a fénytörő fehérjét kísérő sejt-anyag mennyiségét to5 vább csökkentjük.

27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 4 és 10 közötti pH-értékű és 0,01-2 mól/1 ion-erősségű puffért alkalmazunk.

10

28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 6-9 pH-értékű és 0,4-0,6 mol/1 ion-erősségű puffért alkalmazunk.

29. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a

20 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek megölését savas kezeléssel, hőkezeléssel, vagy valamely nem poláros szerves oldószerrel való kezeléssel végezzük.