RU2395582C2 - СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАРИАНТА ПРОТЕАЗЫ ОmpТ - Google Patents

СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАРИАНТА ПРОТЕАЗЫ ОmpТ Download PDF

Info

Publication number
RU2395582C2
RU2395582C2 RU2006114756/13A RU2006114756A RU2395582C2 RU 2395582 C2 RU2395582 C2 RU 2395582C2 RU 2006114756/13 A RU2006114756/13 A RU 2006114756/13A RU 2006114756 A RU2006114756 A RU 2006114756A RU 2395582 C2 RU2395582 C2 RU 2395582C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
amino acid
polypeptide
fusion protein
target peptide
site
Prior art date
Application number
RU2006114756/13A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2006114756A (ru
Inventor
Казуаки ОКУНО (JP)
Казуаки ОКУНО
Масаюки ЯБУТА (JP)
Масаюки ЯБУТА
Original Assignee
Асубио Фарма Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Асубио Фарма Ко., Лтд. filed Critical Асубио Фарма Ко., Лтд.
Publication of RU2006114756A publication Critical patent/RU2006114756A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2395582C2 publication Critical patent/RU2395582C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/585—Calcitonins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/63—Motilins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биомедицинской промышленности. Предложен способ получения целевого пептида путем расщепления полипептида или слитого белка вариантом протеазы OmpT с заменой аминокислоты в положении 97 аминокислотой, выбранной из группы, включающей аланин, лейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, глутаминовую кислоту и гистидин, по сайту, структура которого характеризуется общей формулой Pn…Р2-Р1-Р1'-Р2'…Pn', где P1 - аргинин или лизин, Р2 и Р2' - аминокислота, не являющаяся глутаминовой или аспарагиновой кислотой, а Р1' - аланин, валин, изолейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, тирозин или аспарагин. Применение изобретения может обеспечить эффективное и специфическое выделение терапевтических пептидов с любым типом N-концевой последовательности. 2 н. и 20 з.п.ф-лы, 3 табл., 20 ил.

Description

Текст описания приведен в факсимильном виде.
Figure 00000001
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Figure 00000005
Figure 00000006
Figure 00000007
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Figure 00000011
Figure 00000012
Figure 00000013
Figure 00000014
Figure 00000015
Figure 00000016
Figure 00000017
Figure 00000018
Figure 00000019
Figure 00000020
Figure 00000021
Figure 00000022
Figure 00000023
Figure 00000024
Figure 00000025
Figure 00000026
Figure 00000027
Figure 00000028
Figure 00000029
Figure 00000030
Figure 00000031
Figure 00000032
Figure 00000033
Figure 00000034
Figure 00000035
Figure 00000036
Figure 00000037
Figure 00000038
Figure 00000039
Figure 00000040
Figure 00000041
Figure 00000042
Figure 00000043
Figure 00000044
Figure 00000045
Figure 00000046
Figure 00000047
Figure 00000048
Figure 00000049
Figure 00000050
Figure 00000051
Figure 00000052
Figure 00000053
Figure 00000054
Figure 00000055
Figure 00000056
Figure 00000057

Claims (22)

1. Способ расщепления полипептида, характеризующийся тем, что расщепление осуществляют по сайту, имеющему структуру, определяемую общей формулой Pn…Р2-Р1-Р1'-Р2'…Pn', где P1 - аргинин или лизин, Р2 и Р2' - аминокислота, не являющаяся глутаминовой или аспарагиновой кислотой, а Р1' - аланин, валин, изолейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, тирозин или аспарагин, путем обработки указанного полипептида вариантом протеазы OmpT, в котором аминокилота в положении 97 заменена аминокислотой, выбранной из группы, включающей аланин, лейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, глутаминовую кислоту и гистидин.
2. Способ расщепления полипептида по п.1, в котором одна основная аминокислота или две или три последовательные основные аминокислоты расположены в любом сайте аминокислотной последовательности от положения Р10 до положения Р3 или от положения Р3' до положения Р5'.
3. Способ получения целевого пептида, характеризующийся тем, что трансформируют клетки-хозяева экспрессионной плазмидой, имеющей ген, кодирующий слитый белок, включающий целевой пептид, слитый с защитным пептидом через желаемый сайт расщепления, по которому может осуществляться расщепление вариантом протеазы OmpT по 97-й аминокслоте, как определено в пункте 1, экспрессируют названный ген в указанных клетках и получают целевой пептид из слитого белка путем расщепления названной протеазой в указанном сайте расщепления.
4. Способ получения целевого пептида по п.3, в котором С-конец защитного пептида является аргинином или лизином, а N-конец целевого пептида является аминокислотой иной, чем аргинин или лизин.
5. Способ получения целевого пептида по п.4, где одна основная аминокислота или две или три последовательные основные аминокислоты располагаются в любом сайте аминокислотной последовательности от положения Р10 до положения Р3 или от положения Р3' до положения Р5' желаемого сайта расщепления слитого белка.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором в случае наличия в полипептиде или слитом белке сайта, по которому нежелательно проводить расщепление вариантом протеазы OmpT по 97-й аминокислоте, расщепление в указанном сайте ингибируют, располагая кислую аминокислоту в положении Р3 указанного сайта.
7. Способ по любому из пп.2 и 5, который включает расположение двух или трех последовательных основных аминокислот между положениями Р10 и Р3 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке.
8. Способ по п.7, который включает расположение трех последовательных основных аминокислот между положениями Р5 и Р3 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке.
9. Способ по любому из пп.2 и 5, в котором основными аминокислотами являются аргинин и/или лизин.
10. Способ по п.9, где основной аминокислотой является аргинин.
11. Способ по п.6, где кислой аминокислотой является аспарагиновая кислота.
12. Способ по любому из пп.2 и 5, где аминокислотная последовательность от положения Р5 до положения Р1 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке является Arg-Arg-Arg-Ala-Arg.
13. Способ по любому из пп.2 и 5, где аминокислотная последовательность от положения Р7 до положения Р1 желаемого сайта расщепления в полипептиде или слитом белке является Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg.
14. Способ по любому из пп.1-5, где 97-й аминокислотой от N-конца протеазы OmpT являются лейцин, метионин или гистидин.
15. Способ по любому из пп.1-5, где положение Р1' желаемого сайта расщепления полипептида или слитого белка или N-конец целевого пептида представлены серином или аланином, и 97-я аминокислота применяемого варианта протеазы OmpT по 97-й аминокислоте является лейцином.
16. Способ по любому из пп.1-5, где положение Р1' желаемого сайта расщепления полипептида или слитого белка или N-конец целевого пептида представлены фенилаланином, аланином, серином, цистеином или тирозином, и 97-я аминокислота применяемого варианта протеазы OmpT по 97-й аминокислоте является метионином.
17. Способ по любому из пп.1-5, где положение Р1' желаемого сайта расщепления полипептида или слитого белка или N-конец целевого пептида представлены аланином, валином, изолейцином, метионином, серином, треонином, цистеином или аспарагином, и 97-я аминокислота применяемого варианта протеазы OmpT по 97-й аминокислоте является гистидином.
18. Способ по п.3, где целевой пептид является пептидом, состоящим из 22-45 аминокислотных остатков.
19. Способ по п.18, где целевой пептид является адренокортикотропным гормоном (1-24), мотилином или предшественником кальцитонина.
20. Способ по п.3, где клетки-хозяева являются клетками Е.coli.
21. Способ по п.3, который включает применение в качестве расщепляющей протеазы бактериальных клеток, экспрессирующих ген, кодирующий вариант протеазы OmpT по 97-й аминокислоте, где 97-й аминокислотой от N-конца протеазы OmpT является аланин, лейцин, фенилаланин, метионин, серин, треонин, цистеин, аспарагин, глутамин, глутаминовая кислота или гистидин.
22. Способ по п.20, отличающийся тем, что вариант протеазы OmpT является продуктом экспрессии соответствующего гена, включенного в состав второй экспрессионной плазмиды, а выделение целевого пептида достигается путем растворения образующихся в клетке телец включения.
RU2006114756/13A 2003-09-30 2004-09-29 СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАРИАНТА ПРОТЕАЗЫ ОmpТ RU2395582C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-342183 2003-09-30
JP2003342183 2003-09-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2006114756A RU2006114756A (ru) 2007-12-20
RU2395582C2 true RU2395582C2 (ru) 2010-07-27

Family

ID=34386241

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2006114756/13A RU2395582C2 (ru) 2003-09-30 2004-09-29 СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАРИАНТА ПРОТЕАЗЫ ОmpТ

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9657323B2 (ru)
EP (1) EP1674567B1 (ru)
JP (1) JP4663524B2 (ru)
KR (1) KR101099398B1 (ru)
CN (1) CN1860226B (ru)
AU (1) AU2004276687B2 (ru)
BR (1) BRPI0414611A (ru)
CA (1) CA2540446A1 (ru)
ES (1) ES2398463T3 (ru)
IL (1) IL174588A (ru)
RU (1) RU2395582C2 (ru)
WO (1) WO2005030956A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008038296A2 (en) * 2006-06-21 2008-04-03 Reliance Life Sciences Pvt Ltd Recombinant calcitonin fused to interleukin-2
WO2014058830A1 (en) * 2012-10-12 2014-04-17 Sutro Biopharma, Inc. Proteolytic inactivation of select proteins in bacterial extracts for improved expression
WO2020061244A2 (en) * 2018-09-19 2020-03-26 Georgia Tech Research Corporation Self-titrating bacterial protease-activated prodrug

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR79124B (ru) 1982-12-22 1984-10-02 Genentech Inc
US4784949A (en) 1984-04-19 1988-11-15 Cetus Corporation Universal dominant selectable marker cassette
US5801038A (en) * 1984-05-29 1998-09-01 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US5077204A (en) 1984-06-21 1991-12-31 Chiron Corporation Yeast endopeptidase for basic amino-acid site cleavage, preparation and use
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
JPH07108232B2 (ja) * 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
ATE253639T1 (de) 1991-08-19 2003-11-15 Daiichi Suntory Pharma Co Ltd Verfahren zur herstellung von peptiden
IL139338A0 (en) * 1999-03-04 2001-11-25 Suntory Ltd METHOD OF CONTROLLING CLEAVAGE BY OmpT PROTEASE

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRAMER R. ET AL., FEBS Lett, 2001, 505, no.3, 426-430. OKUNO К. ET AL., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2002, 66, no.1, 127-134. VANDEPUTTE-RUTTEN L. ET AL., EMBO J, 2001 20 (18), 5033-5039. DEKKER N. ET AL., Biochemistry, 2001, 40, no.6, 1694-1701. *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20060089724A (ko) 2006-08-09
BRPI0414611A (pt) 2006-11-07
AU2004276687B2 (en) 2011-07-14
IL174588A (en) 2011-07-31
KR101099398B1 (ko) 2011-12-27
RU2006114756A (ru) 2007-12-20
EP1674567B1 (en) 2013-01-16
CA2540446A1 (en) 2005-04-07
ES2398463T3 (es) 2013-03-19
IL174588A0 (en) 2006-08-20
US9657323B2 (en) 2017-05-23
US20070077617A1 (en) 2007-04-05
EP1674567A4 (en) 2008-01-09
EP1674567A1 (en) 2006-06-28
JPWO2005030956A1 (ja) 2006-12-07
AU2004276687A1 (en) 2005-04-07
JP4663524B2 (ja) 2011-04-06
WO2005030956A1 (ja) 2005-04-07
CN1860226A (zh) 2006-11-08
CN1860226B (zh) 2013-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mukhopadhyay Inclusion bodies and purification of proteins in biologically active forms
ES2534040T3 (es) Plasmina modificada de forma recombinante
US8119369B2 (en) Human SUMO-3 for enhancing protein expression
CA2443365A1 (en) Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides
JP2017536835A5 (ru)
SI2907521T1 (en) New proNGF mutants and their uses in the production of beta-NGF
RU2008137800A (ru) Получение биологически активных белков
Huhmann et al. Position-dependent impact of hexafluoroleucine and trifluoroisoleucine on protease digestion
JP2024038140A (ja) ブタトリプシンの変異体
JP2020529221A5 (ru)
RU2395582C2 (ru) СПОСОБ РАСЩЕПЛЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВАРИАНТА ПРОТЕАЗЫ ОmpТ
KR940019726A (ko) 종양괴사인자- 알파 뮤테인
WO2016161983A1 (zh) 一种融合载体蛋白及其在促进目的蛋白或多肽表达中的应用
Ribó et al. Purification of engineered human pancreatic ribonuclease
EP1618135B1 (en) Cleavage of fusion proteins using granzyme b protease
US11267863B2 (en) N-terminal fusion partner for producing recombinant polypeptide, and method for producing recombinant polypeptide using same
EP2839010B1 (en) Method of producing a recombinant peptide
RU2006114353A (ru) Новая растворимая и стабилизированная тримерная форма полипептидов gp41
Shimokata et al. Substrate recognition by mitochondrial processing peptidase toward the malate dehydrogenase precursor
CA2327524A1 (en) Method of controlling cleavage by ompt protease
RU2009107894A (ru) Рекомбинантный интерферон-бета с повышенной биологической активностью
Wong et al. Escherichia coli: A versatile platform for recombinant protein expression
JP6525171B2 (ja) 環状化サイトカイン及びその製法
ES2280211T3 (es) Metodo para eliminar residuos de alanina, situados en extremos terminales de n, a partir de polipeptidos, con una aminopeptidasa procedente de aeromonas.
WO2005049847A1 (en) Fusion proteins and methods of cleavage of such proteins

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20140930