KR101099398B1 - ＯｍｐＴ 프로테아제 변이체를 이용한 폴리펩티드의 절단 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리펩티드내 원하는 절단 부위에 대한 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 P1' 위치가 아스파르트산, 글루탐산 및 프롤린 이외의 아미노산이며, P1O 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열 중 임의의 부위에 1개의 염기성 아미노산 및 2개 또는 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하고(단, 1개의 염기성 아미노산을 배치하는 경우, P6 및 P4 위치는 제외함), OmpT 프로테아제 또는 이의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 치환된 변이 효소를 사용하여, 원하는 절단 부위에서 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법에 관한 것이다.
Figure R1020067005984
OmpT 프로테아제, 융합 단백질

Description

ＯｍｐＴ 프로테아제 변이체를 이용한 폴리펩티드의 절단 방법{POLYPEPTIDE CLEAVAGE METHOD USING OmpT PROTEASE VARIANT}
본 발명은 대장균 0mpT 프로테아제 또는 그 변이체를 이용하여, 생리 활성 펩티드, 단백질 및 그것의 유도체를 융합 단백질로부터 직접 절단하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 대장균의 성숙형 0mpT 프로테아제를 이용한 융합 단백질의 절단에 있어서, 절단부위의 P3 위치, P4 위치 및 P5 위치에 염기성 아미노산을 배치함으로써 상기 절단 부위의 P1 위치와 P1' 위치 사이의 펩티드 결합에 대한 절단율을 상승시키는 방법과, 또한 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산을 치환하여 그 P1' 위치에 대한 기질 특이성이 변이된 변이체를 이용함으로써, P1' 위치의 아미노산이 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 경우에도 융합 단백질로부터 생리 활성 펩티드, 단백질 및 그것의 유도체를 효율적으로 유리 및 생산하는 방법에 관한 것이다.
대장균의 OmpT 프로테아제는 대장균의 외막 분획에 존재하며, 주로 염기성 아미노산 사이의 펩티드 결합을 선택적으로 절단하는 프로테아제이다. 대장균 OmpT 프로테아제의 아미노산 서열과 상동성을 가지며 프로테아제 활성을 가지거나 또는 가지는 것으로 추정되는 단백질들이, 살모넬라, 예르시니아(Yersinia), 쉬겔 라(Shigella) 등의 장내 세균에서도 발견되고 있으며, 이들 일군의 단백질들을 옴프틴 계열(omptin family)이라고 한다.
대장균의 0mpT 프로테아제 분자량은 약 33500이다. Sugimura 등은 0mpT 프로테아제에 대한 기질 특이성을 조사하여, 상기 효소가 아르기닌-아르기닌, 라이신-라이신, 아르기닌-라이신 및 라이신-아르기닌의 염기성 아미노산 사이의 펩티드 결합을 특이적으로 절단하는 효소인 것으로 보고하였다(Sugimura, K. and Nishihara, T. J. Bacterio1. 170: 5625-5632, 1988).
그러나, 상기 효소는 모든 염기성 아미노산 쌍을 절단하는 것은 아니며, 그 특이성이 높다. 예를 들면, 인간 γ-인터페론에는 염기성 아미노산 10쌍이 존재하지만, 이들중 2쌍만 절단한다(Sugimura, K. and Higashi, N. J. Bacter iol. 170: 3650-3654, 1988). 이는 기질인 인간 γ-인터페론의 입체 구조나, 염기성 아미노산 주변의 효소가 인식하는 것으로 생각되는 부위의 아미노산 서열의 영향인 것으로 생각된다.
본 명세서에서는, Schechter와 Berger의 표기 방법(Schechter, I. and Berger, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157-162, 1967)에 따라 기질의 아미노산 위치를 표기하였다. 즉, Pn…P2-P1-P1'-P2'…Pn'에서, P1 위치와 P1' 위치 사이의 펩티드 결합이 절단 부위이며, 아미노산은 1 문자 또는 3 문자로 표기하고, ↓으로 절단 부위를 표시한다.
예를 들면, 아미노산 서열 -루신-타이로신-라이신-아르기닌-히스티딘- 에서, 라이신과 아르기닌 사이를 절단하는 경우(-Leu-Tyr-Lys↓Arg-His-), 루신이 P3 위 치, 타이로신이 P2 위치, 라이신이 P1 위치, 아르기닌이 P1' 위치, 히스티딘이 P2' 위치의 아미노산이다.
또한, 절단 부위 및 그 주변 아미노산 서열에 아미노산 치환이 도입되어 절단되지 않게 된 경우이거나, 또는 새로운 절단 부위가 생기는 경우에 있어서도, 특별한 언급이 없는 한, 원래 서열에 대응하는 아미노산의 위치로서 표기한다.
지금까지 염기성 아미노산 쌍 이외의 아미노산 서열에서도 OmpT 프로테아제 절단 부위가 발견되고 있으며, Dekker 등은 Ala-Arg-Arg-Ala(P2-P1↓P1'-P2')의 아미노산 서열을 포함하는 이루어지는 0mpT 프로테아제 기질에 아미노산 치환이 도입된 기질을 사용함으로써, OmpT 프로테아제가 절단 부위 P1 위치의 아미노산이 염기성 아미노산인 아르기닌 및 라이신인 경우에 높은 특이성을 나타내지만, P1' 위치의 아미노산에 대해서는 덜 엄격한 것으로 보고하였다(Dekker, N. et al. Biochemistry 40: 1694-1701, 2001).
본 발명자들은, 요소 존재하 폴리펩티드 변성 조건에서, 상기 효소에 의해 절단될 수 있는, P1' 위치의 아미노산이 치환된 융합 단백질을 기질로 사용함으로써, P1' 위치의 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 및 프롤린 이외의 아미노산인 경우에도 절단되는 것을 확인하였다(0kuno, K. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66: 127-134, 2002, 일본 특허 출원번호 2000-602803). 단, 상기 경우의 절단 효율은 P1' 위치 아미노산 잔기가 아르기닌 또는 라이신인 경우에 비해서 낮다.
절단 부위의 주변 서열에 대한 특이성에 있어서, P2 위치 또는 P2' 위치에 산성 아미노산이 위치하는 경우에는 절단되지 않는 것으로 알려져 있다(Dekker, N. et al. Biochemistry 40: 1694-1701, 2001).
또한, 본 발명자들은 P4 위치 또는 P6 위치에 염기성 아미노산인 아르기닌 또는 라이신이 위치하는 경우에는 절단 효율이 증가하지만, 역으로 산성 아미노산인 아스파르트산 또는 글루탐산이 위치하는 경우에는 절단 효율이 감소하는 것으로 보고하였다(Okuno, K. et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 36: 77-84, 2002, 일본 특허 출원번호 2000-602803).
절단 부위의 그외 주변 서열에 대한 특이성은 명확하진 않지만, 0mpT 프로테아제가 염기성의 고항균 펩티드인 프로타민을 절단하며(Stumpe, S. et al. J. Bacteriol. 180: 4002-4006, 1998), 프로테아제 활성에 관여하는 0mpT 프로테아제 외부 도메인에 산성 아미노산이 많이 존재하고 있다(Vandeputte-Rutten, L. et al. EMB0 J. 20:5033-5039, 2001)는 사실로부터, 0mpT 프로테아제와 기질간의 상호작용시 전하에 의한 작용이 중요하다는 것을 추측할 수 있다.
0mpT 프로테아제는 절단 부위에 대해 고특이적이며 대장균 외막에 존재한다는 점에서, 본 프로테아제는 유전자 조작 기술로 제작한 융합 단백질에서 목적 폴리펩티드를 유리시킬 때에 프로세싱 효소로서 이용되고 있다.
Hanke 등은 대장균을 사용한 콜레스테롤 에스테라제의 분비, 생산에 있어, 그것을 대장균 헤모리신 A 단백질과 융합시켜 균체 외로 분비시킨 후 외막에 존재하고 있는 0mpT 프로테아제를 이용하여 융합 단백질로부터 활성형 콜레스테롤 에스테라제를 성공적으로 수득하였다. 그들은 아르기닌-라이신의 서열을 가지는 링커 를 배치하여, 이 서열을 OmpT 프로테아제로 절단시켰다(Hanke, C. et al. Mol Gen. Genet. 233: 42-48, 1992).
또한, 본 발명자들은 0mpT 프로테아제가 변성제(denaturing agent)에 대해 저항성이 있음을 인식하고, 이러한 특성을 이용함으로써 봉입체로 발현된 융합 단백질을 변성제 존재하에 절단할 수 있음을 확인하였다. 즉, 대장균 발현 시스템으로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) V8 프로테아제 유도체 융합 단백질을 봉입체로 발현시키고, 이를 요소로 가용화한 다음, 요소 존재하에 0mpT 프로테아제의 작용에 의해 융합 단백질로부터 V8 프로테아제 유도체 부분을 유리시키고, 리폴딩을 수행하여 효소 활성을 가지는 V8 프로테아제 유도체를 성공적으로 생산하였다(Yabuta, M. et al. Appl. Microbiol. Biotechno1. 44: 118-125, 1995).
통상적으로, 융합 단백질로부터 목적 폴리펩티드 또는 목적 단백질을 유리시키는 경우에, 아미노산 서열 특이성이 높은 효소가 프로세싱 효소로 이용되고 있다. 사용되는 프로테아제로는 Xa 인자, 트롬빈, 엔테로키나제 등이 알려져 있지만, 이들 효소는 포유류를 기원으로하는 효소로, 공급량이 적고 단가가 높기 때문에 융합 단백질 방법에 의한 펩티드 및 단백질의 공업적 대량 처리에는 적절하지 않다. 또한 목적 폴리펩티드, 단백질을 의약품으로 사용하는 경우, 효소로부터 유래되는 바이러스 오염 및 광우병의 원인 인자인 변성 프리온 단백질의 오염을 고려하여야 한다.
0mpT 프로테아제는 대장균에서 유래된 것으로서, 프로세싱 효소로 사용시 공급량, 비용 및 안전성 측면에서 전술한 효소 보다 우수한 것임은 명백하다. 또한, OmpT 프로테아제는, 봉입체내에도 존재하므로 융합 단백질이 봉입체로 발현되어 요소 등의 변성제로 융합 단백질을 용해시킬때 작용한다. 또한, 0mpT 프로테아제는 대장균 외막에 존재하기 때문에, 균체 자체를 반응 시스템에 첨가함으로써 0mpT 프로테아제 반응을 수행할 수 있다(Grodberg, J. and Dunn, J. J. J. Bacterio1. 170: 1245-1253).
의약품 제조 등의 공업적인 펩티드 생산에 있어서, 대장균에서 생산된 융합 단백질을 처리하여 목적 폴리펩티드를 수득할때 사용하는 프로테아제의 다수는 대장균으로부터 유래한 된이 아니므로, 정제하여 사용하여야 한다. 따라서, 정제를 요하지 않으며, 대장균 균체 그 자체, 외막 분획의 첨가 또는 봉입체 용해만으로도 0mpT 프로테아제를 프로세싱 프로테아제로 사용하므로, 폴리펩티드 생산 단가의 대폭적인 개선에 기여할 수 있다. 그러나, 종래 대장균 0mpT 프로테아제를 사용한 융합 단백질의 프로세싱에 있어서, 유리되는 폴리펩티드의 N 말단 아미노산은 일부 예외를 제외하고는 라이신 또는 아르기닌으로 한정되어 있다.
OmpT 프로테아제의 유용성은 크지만, 본 발명 이전에는 OmpT 프로테아제를 융합 단백질의 절단 효소로서 사용하는 경우, 절단 부위 및 그 주변의 아미노산 서열을 어떻게 디자인하면 의도하는 부위에서 특이적 또는 효율적인 절단이 가능한가에 대한 견해는 한정적이었다. 즉, 효율적으로 절단 가능한 목적 폴리펩티드의 N 말단 아미노산의 종류는 한정적이다. 따라서, 수득할 수 있는 목적 폴리펩티드의 종류가 제한되며, 또는 비록 절단가능하더라도 효율적인 절단이 이루어지지 않는다는 문제점이 있다.
특허 문헌 1 : 일본 특허 출원번호 2000-602803
비특허 문헌 1 : Sugimura, K. and Nishihara, T. J. Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988
비특허 문헌 2 : Sugimura, K. and Higashi, N. J. Bacteriol. 170: 3650-3654, 1988
비특허 문헌 3 : Schechter, I. and Berger, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27: 157-162, 1967
비특허 문헌 4 : Dekker, N. et al. Biochemistry 40: 1694-1701, 2001
비특허 문헌 5 : 0kuno, K. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66: 127-134, 2002
비특허 문헌 6 : 0kuno, K. et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 36: 77-84, 2002
비특허 문헌 7 : Stumpe, S. et al. J. Bacteriol. 180: 4002-4006, 1998
비특허 문헌 8 : Vandeputte-Rutten, L. et al. EMB0 J. 20: 5033-5039, 2001
비특허 문헌 9 : Hanke, C. et al. Mol. Gen. Genet. 233: 42-48, 1992
비특허 문헌 10 : Yabuta, M. et al. Appl. Microbio1. Biotechnol. 44: 118-125, 1995
비특허 문헌 11 : Grodberg, J. and Dunn, J. J. J. Bacteriol. 170: 1245-1253, 1988
발명의 개시
본 발명의 과제는, 상기 문제점을 극복하고, 프로세싱 효소로서 0mpT 프로테이아제 또는 이의 변이체를 이용하여 융합 단백질로부터 모든 종류의 목적 폴리펩티드를 효율적으로 또는 특이적으로 유리시키는 방법, 특히, 목적 폴리펩티드의 N 말단 아미노산이 P1' 위치의 아미노산 잔기인 융합 단백질의 P1-P1'의 하나의 결합만을 효율적으로 절단시키는 방법을 제공하는 것이다.
전술한 과제에 대해, 본 발명자들은 OmpT 프로테아제의 절단 부위와 주변 아미노산 서열을 조사하여 새로운 절단 방법 또는 인식/절단 서열을 확인함으로써 전술한 한계점을 해결할 수 있으며, 본 효소가 융합 단백질의 프로세싱 효소로 더욱 유용할 것으로 평가하였다. 또한, OmpT 프로테아제 자체에 부위 특이적 변이를 도입하여 기질 특이성이 야생형과 다른 0mpT 프로테아제 변이체를 제작하여, 이를 이용하는 것도 가능한 것으로 생각하게 되었다.
따라서, 본 발명자들은, 0mpT 프로테아제에 의한 기질 인식 및 절단에 절단 부위의 주변 아미노산 서열이 중요하다는 사실을 토대로, 기존의 절단 부위를 이용하여 절단 부위 및 그 주변 아미노산 서열을 검토함으로써 새로운 기질 특이성을 확인하였으며, 이를 융합 단백질의 절단에 응용하고자 예의 검토하였다.
본 발명에서, "OmpT 프로테아제"는 시그널 펩티드를 제거한 대장균 유래의 성숙형 0mpT 프로테아제 또는 상기 0mpT 프로테아제 이외의 0mpT 프로테아제 활성을 가지는 단백질(OmpT계 프로테아제)을 의미한다. OmpT계 프로테아제로는, (1) 예르시니아 페스티스 플라스미노겐 활성자(Yersinia pestis plaslminogen activator), (2) 살모넬라 티피무리움 E 단백질(Salmonella typhimurium E protein), (3) 대장균(Escherichia coli) 및 (4) 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) SopA 등을 들 수 있다.
본 발명에서, "OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체"는 상기 0mpT 프로테아제의 97번째 아스파르트산(Asp97)이 다른 아미노산으로 치환된 OmpT 프로테아제 변이체, 또는 상기 OmpT계 프로테아제의 아미노산 서열에서 상기 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산에 해당되는 아미노산이 치환된 변이체(0mpT계 프로테아제 97번 대응 아미노산 변이체)를 의미한다.
0mpT 프로테아제의 97번째 아스파르트산과 치환되는 다른 아미노산으로는, 예컨대, 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘을 들 수 있다. 또한, 0mpT계 프로테아제 97번 대응 아미노산 변이체로는, 상기 0mpT계 프로테아제들 중 (1) 예르시니아 페스티스 플라스미노겐 활성자의 117 위치(시그널 펩티드를 포함하는 전체 아미노산 서열의 N 말단으로부터 아미노산 잔기를 계수함. OmpT의 경우에도 동일하게 시그널 펩티드를 포함한 아미노산 잔기의 번호로 나타내는 경우 97번째 아미노산은 117 위치가 된다)의 아스파르트산이, (2) 살모넬라 티피무리움 E 단백질의 134 위치의 아스파르트산이, (3) 대장균 OmpP의 117 위치의 아스파르트산이, 또는 (4) 쉬겔라 플렉스너리 SopA의 117 위치의 아스파르트산이, 예컨대 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘으로 치환된 것 등을 들 수 있다.
본 발명에서, "목적 펩티드"는 최종적으로 수득되는 펩티드 뿐만 아니라, 0mpT 프로테아제 등에 의해 융합 단백질로부터 절단된 후 수식 반응이나 절단 반응이 이루어진 생산 중간산물(이른바, 전구체 펩티드)를 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에서, "보호 펩티드"는 목적 펩티드와 함께 링커 펩티드를 매개로 융합 단백질을 구성하는 펩티드로서, 링커 펩티드도 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명에서, "원하는 절단부위"는 폴리펩티드내 임의의 부위, 링터 펩티드를 매개로 보호된 펩티드와 융합된 목적 펩티드로 이루어진 융합 단백질에서, 링커 펩티드의 C 말단과 목적 펩티드의 N 말단 사이의 부위, 또는 상기 링커 펩티드내 임의의 부위를 의미한다.
본 발명의 주된 주제는 아래 (1) 내지 (4)에 관한 것이다:
(1) 폴리펩티드내 원하는 절단 부위의 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이며, P1' 위치가 아스파르트산, 글루탐산 및 프롤린 이외의 아미노산이며, P10 위치에서 P3 위치의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치의 아미노산 서열내 임의의 부위에, l개의 염기성 아미노산 또는 2, 3개의 염기성 아미노산이 연속하여 배치되며(단, 1개의 염기성 아미노산을 배치하는 경우, P6 또는 P4 위치는 제외하다), 0mpT 프로테아제를 사용하여 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법, 및 상기 절단 방법을 이용하여 융합 단백질로부터 목적 펩티드를 수득하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법,
(2) 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 이용하여 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법, 및 상기 절단 방법으로 융합 단백질로부터 목적 펩티드를 수득하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법,
(3) 폴리펩티드내 원하는 절단 부위의 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 P1' 위치가 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산이며, P10 위치에서 P3 위치의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치의 아미노산 서열내 임의의 부위에, 1개의 염기성 아미노산 또는 2개 또는 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하는 것을 포함하는 상기 (2)에 따른 방법,
(4) 0mpT 프로테아제 또는 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 이용하여 폴리펩티드내 원하는 절단 부위에서 절단하는 폴리펩티드의 절단 방법에 있어서, 상기 폴리펩티드내 상기 프로테아제에 의한 절단이 불필요한 부위가 존재하는 경우, 상기 부위의 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법, 및 상기 절단 방법을 사용하여 융합 단백질로부터 목적 펩티드를 수득하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
상기 (1)에서, 바람직하게는 0mpT 프로테아제의 절단 부위 P10 위치에서 P3 위치(단, P6 또는 P4 위치중 하나만을 염기성 아미노산으로 치환한 경우는 제외함), 특히 바람직하게는 P5 위치에서 P3 위치의 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환시 절단율이 증가한다는 새로운 사실에 근거하고 있다. 그러나, OmpT가 연속하는 염기성 아미노산 사이의 펩티드 결합을 절단하기 쉬운 성질을 가지므로, P5 위치에서 P3 위치에 연속하는 염기성 아미노산을 배치한 경우, 이들 부위의 펩티드 결합은 OmpT에 의해 절단된다.
또한, 3회 연속된 아르기닌에 대한 OmpT의 절단율이 2회 연속하는 경우에 비해 감소한다는 기존의 성질을 이용함으로써, P5 위치로부터 P3 위치에 3회 연속하는 아르기닌을 배치하여 P5 위치에서 P3 위치의 아르기닌들 사이의 절단을 억제할 수 있다. 즉, 이로써 원하는 부위에서의 절단(P1 위치와 P1' 위치의 아미노산의 사이 절단)을 촉진하고, 원하지 않는 부위에서의 절단(P5 위치에서 P3 위치의 아미노산의 사이 절단)을 억제할 수 있다.
이상으로, 절단을 원하는 부위의 P3 위치, P4 위치 및 P5 위치에 염기성 아미노산(바람직하게는, 아르기닌)을 배치한 아미노산 서열을 갖지도록 원하는 폴리펩티드를 제작함으로써, 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위의 P1' 위치가 종래의 아르기닌 또는 라이신인 경우 뿐만 아니라, 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린을 제외한 그 외의 아미노산의 경우에도 OmpT 프로테아제에 의해 매우 효율적으로 절단할 수 있음을 확인하였다.
또한 상기 방법은, 목적 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 대장균 숙주에서 제조하고, 대장균이 본래 가지고 있거나 또는 유전공학적으로 도입한 OmpT 프로테아제를 이용하여 융합 단백질로부터 원하는 절단 부위의 P1' 위치에서 C 말단 측에 배치된 N 말단 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린 이외의 아미노산인 목적 폴리펩티드를 자르는 경우에 특히 부합된다.
또한, 상기(2) 및 (3)에 있어서, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째의 아미노산을 특정한 아미노산으로 치환한 경우, 0mpT 프로테아제로는 절단할 수 없는 절단 부위도 실제로 절단할 수 있음을 발견한 것은, 목적 펩티드의 제조시 상기 펩티드의 N 말단 아미노산의 종류를 다양하게 선택할 수 있다는 점에서 매우 유용하다. 특히, 융합 단백질을 사용한 목적 펩티드의 제조 방법에 있어서, 융합 단백질의 링커 서열을 ―Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-목적 펩티드로 제작하고, 또한 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째의 아스파르트산이, 특히 바람직하게는 루신, 메티오닌 또는 히스티딘으로 치환된 프로테아제 변이체를 프로세싱 프로테아제로 이용함으로써, 유리되는 폴리펩티드의 N 말단 아미노산이 라이신 또는 아르기닌인 이외인 경우에도 효율적으로, 또는 특이적으로 유리시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 대장균 유래 0mpT 프로테아제의 변이체를 사용하여 융합 단백질을 절단하지만, OmpT 프로테아제 이외의 OmpT 프로테아제 활성을 가지거나 또는 아미노산 서열내 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째의 아미노산에 해당되는 아미노산이 치환된 변이체를 사용하여 융합 단백질을 절단하는 것도 충분히 가능하다.
또한, 상기 (4)에서, 폴리펩티드 또는 융합 단백질내에 0mpT 프로테아제 및 그 변이체에 의한 절단이 불필요한 부위가 있는 경우, 상기 부위의 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제할 수 있음을 발견하였다. 이러한 발견은, 특히 융합 단백질에서 목적 펩티드를 수득하는 경우의 융합 단백질을 제작하는데 유용하며, 목적 펩티드를 매우 효율적으로 제조할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 하기에 관한 것이다.:
(1) 폴리펩티드내 원하는 절단 부위의 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 P1' 위치가 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린 이외의 아미노산이며, P10 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열내 임의의 부위에 1개의 염기성 아미노산 또는 2, 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하여(단, 1개의 염기성 아미노산을 배치하는 경우, P6 또는 P4 위치는 제외함), 0mpT 프로테아제를 사용하여 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
(2) 원하는 절단 부위를 매개로, C 말단이 아르기닌 또는 라이신인 보호 펩티드와 융합한, N 말단이 아스파르트산, 글루탐산 또는 프롤린 이외의 아미노산인 목적 펩티드로 이루어지는 융합 단백질에서, 상기 절단 부위의 P10 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열내 임의의 부위에, 1개의 염기성 아미노산 또는 2개나 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하고(단, 1개의 염기성 아미노산을 배치하는 경우, P6 또는 P4 위치는 제외함), 상기 절단 부위가 OmpT 프로테아제에 의해 절단되는 절단 부위인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키고, 상기 세포에서 상기 유전자를 발현시켜, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단되어 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
(3) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내에 0mpT 프로테아제에 의해 절단되지 않기를 원하는 부위가 존재하는 경우, 상기 부위의 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제하는 것을 포함하는 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 방법.
(4) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P10 위치 및 P3 위치 사이에 2회 또는 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 것을 포함하는, 상기 (1) - (3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(5) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P5 위치 및 P3 위치 사이에 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 것을 포함하는, 상기 (4)에 기재된 방법.
(6) 염기성 아미노산이 아르기닌 및/또 라이신인, 상기 (1) - (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 염기성 아미노산이 아르기닌인, 상기 (6)에 기재된 방법.
(8) 0mpT 프로테아제를 사용하여 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 폴리펩티드의 절단 방법, 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위를 절단하는 단계를 포함하는 목적 펩티드의 제조 방법으로서, 상기 폴리펩티드내 또는 상기 융합 단백질내 OmpT 프로테아제에 의한 절단이 불필요한 부위가 존재하는 경우, 상기 부위에 대한 P3 위치에 산성 아미노산을 배치하여 상기 부위에 있어서의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
(9) 산성 아미노산이 아스파르트산인, 상기 (3) - (8) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(10) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P5 위치로부터 P1 위치까지의 아미노산 서열이 Arg-Arg-Arg-Ala-Arg인, 상기 (1)-(9) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(11) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P7 위치로부터 P1 위치까지의 아미노산 서열이 Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg인, 상기(1)-(9) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(12) 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
(13) 폴리펩티드내 원하는 절단 부위에 대한 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 P1' 위치가 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 경우에, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
(14) 폴리펩티드내 원하는 절단 부위에 대한 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 P1' 위치가 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산이며, P10 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열내 임의의 부위에 1개의 염기성 아미노산 또는 2, 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하고, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
(15) 원하는 절단 부위가, OmpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단될 수 있는 절단 부위를 매개로, 보호 펩티드와 융합한 목적 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 상기 세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단되어 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
(16) 원하는 절단 부위가, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단될 수 있는 절단 부위를 매개로, C 말단이 아르기닌 또는 라이신인 보호 펩티드와 융합한 N 말단이 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 목적 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환하는 단계, 상기 세포에서 상기 유전자를 발현시키는 단계, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단되어 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
(17) 원하는 절단 부위를 매개로 C 말단이 아르기닌 또는 라이신인 보호 펩티드와 융합한, N 말단이 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 목적 펩티드로 이루어지며, 상기 절단 부위의 P10 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열내 임의의 부위에, 1개의 염기성 아미노산 또는 2, 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하여, 상기 절단 부위가 OmpT 프로테아제의 N 말단부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단될 수 있는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환하는 단계, 상기 세포에서 상기 유전자를 발현시켜, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단되어 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
(18) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의한 절단이 불필요한 부위가 존재하는 경우, 상기 부위에 대한 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제하는 것을 포함하는, 상기 (12)-(17) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(19) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P10 위치 및 P3 위치 사이에 2회 또는 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 것을 포함하는, 상기 (12)-(18) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(20) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P5 위치 및 P3 위치 사이에 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 것을 포함하는, 상기 (19)에 기재된 방법.
(21) 염기성 아미노산이 아르기닌 및/또는 라이신인 상기 (14), (17)-(20) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(22) 염기성 아미노산이 아르기닌인, 상기 (21)에 기재된 방법.
(23) 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 절단 방법 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위를 절단하는 단계를 포함하는 목적 펩티드의 제조방법으로서, 상기 폴리펩티드내 또는 상기 융합 단백질내에 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단되길 원하지 않는 부위가 존재하는 경우, 상기 부위에 대한 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
(24) 산성 아미노산이 아스파르트산인, 상기 (18)-(23) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(25) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P5 위치로부터 P1 위치까지의 아미노산 서열이 Arg-Arg-Arg-Ala-Arg인, 상기 (12)-(24) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(26) 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P7 위치로부터 P1 위치까지의 아미노산 서열이 Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg인, 상기 (12)-(24) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(27) 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이, 루신, 메티오닌 또는 히스티딘인, 상기 (12)-(26) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(28) 폴리펩티드 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P1' 위치 또는 목적 펩티드의 N 말단이 세린 또는 알라닌이고, 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체의 97번째의 아미노산이 루신인, 상기 (12)-(26) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(29) 폴리펩티드 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P1' 위치 또는 목적 펩티드의 N 말단이 페닐알라닌, 알라닌, 세린, 시스테인 또는 티로신이고, 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체의 97번째 아미노산이 메티오닌인, 상기 (12)-(26) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(30) 폴리펩티드 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P1' 위치 또는 목적 펩티드의 N 말단이 알라닌, 발린, 이소루신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인 또는 아스파라긴이고, 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체의 97번째 아미노산이 히스티딘인, 상기 (12)-(26) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(31) 목적 펩티드가 22 내지 45개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드인, 상기 (2)-(11), (15)-(30) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(32) 목적 펩티드가 부신피질 자극 호르몬(1-24), 모틸린(motilin) 또는 칼시토닌(calcitonin) 전구체인, 상기 (31)에 기재된 방법.
(33) 숙주 세포가 대장균인, 상기 (2)-(11), (15)-(32) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(34) 0mpT 프로테아제 또는 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 코딩하는 유전자를 발현하는 균체 자체를, 절단용 프로테아제로 사용하는 상기(1)-(33) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(35) 0mpT 프로테아제, 또는 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 코딩하는 유전자와, 상기 프로테아제에 의해 절단되길 원하는 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 공동발현하는 것을 포함하는, 상기 (1)-(33) 중 어느 하나에 기재된 방법.
발명을 실시하기위한 최선의 형태
이하 본 발명을 상세히 설명 한다.
pG117S4HompPRR는 글루카곤계 펩티드-1(7-37)(GLP-1(7-37))를 포함하는 융합 단백질(PRR)을 발현하는 발현 플라스미드이다.
본 융합 단백질은, 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산을 포함하는 β-gal117S4H인 보호 단백질, 아르기닌-아르기닌 서열이 배치된 26개의 아미노산으로 이루어진 링커 서열, 및 GLP-1(7-37)로 구성된다. 대장균 0mpT 프로테아제는 PRR의 링커 서열내 아르기닌-아르기닌 서열 사이의 펩티드 결합을 절단하여, GLP-1(7-37)을 포함하는 44개의 아미노산으로 이루어진 목적 폴리펩티드를 유리시킨다는 것을, 본 발명자는 이미 인지하고 있었다(Okuno, K. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 66: 127-l34, 2002).
본 발명자는 융합 단백질(PRR)을 토대로 P1 위치와 P1' 위치가 아르기닌이고, 이들 부위 이외의 P10 위치로부터 P5' 위치의 아미노산을 모두 알라닌으로 치환한 융합 단백질인 PA를 제작하였다.
또한, 상기 융합 단백질 PA를 출발물질로서, 각 부위에 알라닌을 아르기닌으로 치환한 융합 단백질(PAn)을 제작하고, OmpT 프로테아제 절단부위 주변에 염기성 아미노산인 아르기닌 배치에 의한 OmpT 프로테아제 절단에 미치는 영향을 검토하였다. 그 결과, 절단부위 주변 아미노산 서열의 P10 위치에서 P3 위치 또는 P3' 위치에서 P5' 위치에 염기성 아미노산(예를 들면, 아르기닌, 라이신)이 존재하는 경우(단, P6 또는 P4 위치의 한 부분만을 염기성 아미노산으로 치환하는 경우는 제외함), 절단율이 상승하는 것을 새롭게 발견하였다.
한편, P2 위치 또는 P2' 위치가 아르기닌인 경우, 절단 부위로서 배치된 P1 위치와 P1' 위치에 단지 아르기닌 2개 대신에 3회 연속된 아르기닌을 포함하지만, 이 경우에는 역으로 절단율이 감소하였다. 즉, 절단 부위 주변에 아르기닌 존재하면 절단율은 상승하지만, 아르기닌이 3회 연속되는 경우에는 절단율이 감소됨을 의미하며, 따라서, 절단부위의 주변 아미노산 서열을 아르기닌으로 치환함으로써 절단율을 제어할 수 있는 것으로 확인되었다.
또한, P3' 위치에 아르기닌이 존재하는 융합 단백질 PA3'(절단부위의 주변 아미노산 서열이 -Ala-Ala-Arg[P1]-Arg[P1']-Ala-Arg[P3']-Ala[P4']-Ala-)인 경우, P3' 위치의 아르기닌과 P4' 위치의 알라닌 사이도 절단되는 것으로 확인되었고, 이로써 아르기닌-알라닌 사이를 효율적으로 절단할 수 있는 서열을 발견하였다. 염기성 아미노산이 연속하여 나란히 배치되는 서열 이외의 서열을 가지는 기질이 효율적으로 절단되는 것은, OmpT 프로테아제를 프로세싱 효소로서 사용하는 경우에 매우 중요하므로, 본 발명자들은 추가적인 검토를 실시하였다.
절단부위의 주변에 아르기닌을 배치함으로써 절단 효율이 증가되며, 또한 아르기닌이 3회 연속된 경우 아르기닌-아르기닌 사이를 절단하기 어렵다는 사실을 토대로 각종 아미노산 서열을 검토하였으며, 그 결과 아미노산 서열-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-에서 주된 절단은 -Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-로 발생되는 것을 확인하였다. 즉, 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 경우, 그 다음에 존재하는 염기성 아미노산 부위에서의 절단이 촉진되는 성질이 있다는 것이 명확해졌다.
그러나, 상기 아미노산 서열(-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-)에서 3회 연속하는 아르기닌 서열도 절단되었다. 이를 저해하고자, N 말단측 상류 아미노산 서열에 산성 아미노산인 아스파르트산을 배치한 아미노산 서열 -Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala- 를 제작하였다. 이 서열에서 아르기닌-알라닌의 사이의 절단율은 반으로 저하되었고, 3회 연속하는 아르기닌 서열내의 절단은 성공적으로 억제되었다. 즉, 이들 서열 -Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala- 또는 ―Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala- 은, 0mpT 프로테아제에 의한 아르기닌-알라닌의 절단이 발생되기 쉽도록 최적화된 것으로 생각할 수 있다. 이들 서열(-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala- 및 Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-), 특히 바람직하게는, Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-을 사용함으로써 P1' 위치의 아미노산이 알라닌을 제외한 아미노산인 경우에서도 효율적으로 절단할 수 있을 것으로 기대된다.
이상의 결과로부터, -Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-의 절단 부위의 C 말단측 아미노산 서열에 생리 활성 펩티드를 배치하여, 0mpT 프로테아제를 이용하여 융합 단백질에서 생리 활성 펩티드를 직접 절단하는 것이 가능한지를, 모틸린(N 말단 아미노산은 페닐알라닌)을 목적 폴리펩티드로 사용하여 검토하였다. 모틸린을 목적 폴리펩티드로 하는 융합 단백질 PMT를 제작하고, 0mpT 프로테아제를 작용시켜 모틸린 적출을 시도하였다.
그 결과, 융합 단백질 PMT에서 모틸린은 효율적으로 절단되지 않은 것으로 확인되었다. 이는, OmpT 프로테아제의 기질 특이성이 P1' 위치의 아미노산에 대해선 관대하지만, 효율적인 절단을 위해선 상기 프로테아제 자체에 변이를 도입하여 P1' 위치의 아미노산에 대한 특이성을 높일 필요가 있다고 생각되었다.
이미 0mpT의 결정 구조를 해석한 논문(Vandeputte-Rutten, L. et al. EMB0 J. 20: 5033-5039, 2001)이 발표되어 있으며, 이와 관련된 논문(Kramer, RA. et al. FEBS lett. 505: 426-430, 2001)에서는 기질의 P1' 위치의 아미노산과 OmpT 프로테아제의 Asp97 (N 말단으로부터 97번째의 아스파르트산)이 상호작용하고 있을 가능성이 고찰되어 있다. 이 97번째 아미노산을 치환하였을 때에 발생되는 기질 특이성 변화를 조사하기 위해, OmpT의 Asp97를 2O 종의 아미노산(아스파르트산과 같은 의미의 치환을 포함함)으로 치환한 변이체에 대한 플라스미드를 제작하고, 이들을 0mpT 결손 대장균 BL21주에 도입하여 0mpT 프로테아제 변이체 0mT D97X (X는 20종의 아미노산에 해당됨) 발현 대장균 20주를 제조하였다.
이들로부터 P1' 위치에 대한 0mpT 프로테아제의 기질 특이성을 조사하기 위해, 도 1의 구조를 가지는 융합 단백질 PRX(X는 20종의 아미노산에 해당됨, 일본 특허 출원번호 2000-602803 참조)를 기질로 사용하여, 각각의 융합 단백질의 절단을 조사하였다. 그 결과, OmpT 프로테아제 97번째 아스파르트산을, 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 및 히스티딘으로 치환하는 경우, 절단율의 차이는 있지만 융합 단백질 PRX 절단 활성을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 특히, 변이체 0mPT D97L은 세린 및 알라닌에, 0mpT D97M는 페닐알라닌, 알라닌, 세린, 시스테인 및 티로신에, 0mpT D97H는 알라닌, 발린, 이소루신, 메티오닌, 트레오닌, 시스테인 및 아스파라긴에 각각 높은 특이성을 나타내었다.
이러한 결과를 토대로 모틸린의 N 말단 아미노산이 페닐알라닌인 것을 고려하여, P1' 부위가 페닐알라닌일때 절단이 양호하게 이루어지는 0mpT D97M를 전술한 융합 단백질 PMT에 반응시켰으며, 이로써 효율적으로 모틸린을 절단할 수 있었다. 즉, 본 발명자들은 OmpT 프로테아제 절단 부위의 주변 서열을 최적화하고, 또한 0mpT 프로테아제 변이체를 이용함으로써, 지금까지 원하는 위치에서의 절단이 어려웠던 OmpT 프로테아제에 의한 절단이 가능하도록 하였다.
또한, 이러한 방법의 상업적 이용가능성을 검증하기 위하여, 융합 단백질 PMT 발현 대장균 및 0mpT D97M 프로테아제 변이체 발현 대장균을 고밀도 배양하고, 융합 단백질 PMT 발현 대장균으로부터 제조한 봉입체를 포함하는 반응액에 0mpT D97M 프로테아제 변이체 발현 대장균을 직접 첨가하여, 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 반응액에 20 mM 아세트산(pH 4.0)을 첨가하고, 침전 제거한 다음 상청액을 양이온 교환 및 역상 크로마토그래피로 정제하였다. 이러한 일련의 조작을 통해, 융합 단백질 PMT 발현 대장균 배양액 l L로부터 순도 99.0% 이상의 모틸린을 회수율 52%로 160 mg을 생산할 수 있었으며, 이는 충분히 상업화 가능한 수준이다.
또한, 이 폴리펩티드 생산 시스템의 범용성을 확인하기 위해, 목적 폴리펩티드로 사람 부신피질 자극 호르몬(1-24)(N 말단 아미노산이 세린임) 및 인간 칼시토닌 전구체(N 말단 아미노산이 시스테인임)를 위치시킨 융합 단백질을 제조하고, 이를 0mpT 프로테아제 변이체로 처리하였다. 그 결과, 둘다의 경우에서 원하는 목적 폴리펩티드를 수득할 수 있었으며, 상기 시스템의 범용성을 확인할 수 있었다.
또한, 융합 단백질 PMT와 0mpT D97M 프로테아제 변이체를 공동발현하는 대장균을 제조하고, 상기 대장균을 배양하여 수득한 봉입체를 요소롤 용해하는 것만으로도 융합 단백질 PMT에서 인간 모틸린을 유리시킬 수 있음을 확인하였다.
후술하는 실시예에서 기재되지 않은 구체적인 실험 조작은, 특별하게 언급되지 않는 한 이하의 방법으로 수행하였다.
(1) 발현 플라스미드의 구축
발현 플라스미드의 구축은 대장균 JMl09를 사용하여 통상적인 방법에 따라 수행하였다. 변이 도입시 수행한 PCR로 수득한 DNA 영역, 및 합성 DNA에 의한 치환으로 얻어진 DNA 영역의 염기 서열 결정을 통하여, 구축한 발현 플라스미드가 목적한 플라스미드임을 확인하였다. 그리고, 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 16, 18에서 제작한 플라스미드의 구조는 도 10A에, 실시예 11에서 제작한 플라스미드의 구조는 도 10B에 나타낸다. 실시예 17에서 제작한 플라스미드는 도 13에 나타낸다.
(2) OmpT 프로테아제 효소의 활성 측정
0mpT 프로테아제 활성은 다이노르핀 A(펩티드 연구소제) 기질에 대해 측정하였다.
0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 50 mM 인산 나트륨(pH 6.0) 40 μL에 1 mg/mL의 다이노르피A 5μL를 첨가하고, 여기에 0mpT 프로테아제 활성 측정용 샘플 5 μL를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응은 25 ℃에서 10분간 수행하고, 1 N HCl 5 μL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액을 10000xg에서 3분간 원심분리하여 상청액을 회수하고, 20 μL를 HPLC에 주입하여 분석하였다.
HPLC 분석은 YMC PROTEIN RP 컬럼에서, 컬럼 온도 40 ℃, 유속 1 mL /min으로 수행하였다. 3분간 O.1% 트리플루오르 아세트산을 포함하는 10% 아세트니트릴로 세척하고, l0분간 0.1% 트리플루오르 아세트산을 포함하는 10-15% 아세트니트릴의 선형 농도구배로 용출을 수행하였다. 220 nm에서의 흡광을 모니터닝하여, 분해 산물인 펩티드 Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg을 검출하였다. 상기 반응 조건하에서, 25 ℃에서 1분간 다이노르핀 A 1 μmo1을 절단할때의 OmpT 프로테아제 활성을 1 unit으로 하였다.
(3) SDS-폴리아크릴아미드 전기영동
융합 단백질의 절단을 검증하기 위해 사용한 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동시, 젤은 테후코사 제품의 16% Peptide-PAGEmini를, 전기영동용 완충액으로는 바이오라드사 제품의 트리신 영동 완충액을, 분자량 마커로는 테후코사 또는 바이오라드사의 단백질 분자량 마커를 사용하였다. 샘플에 4 M 요소를 포함하는 동량의 2x SDS-PAGE 샘플 완충액을 첨가하고, 10O ℃에서 5분간 가열하였다. 10 μL를 전기영동을 위해 로딩하고, 테후코사에서 지정한 조건으로 전기영동하였다. 전기영동 후, 코마시브릴리언트 블루-R-250을 포함한 염색액으로 염색하였다.
(4) 봉입체 제조
본 실시예에서, 융합 단백질은 대장균에서 봉입체로 발현되며, 대장균이 OmpT 프로테아제를 발현하고 있는 경우 봉입체를 요소로 용해한 것만으로도 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 수행할 수 있었다. 절단을 방지하기 위해, 융합 단백질 발현용 플라스미드를 OmpT 프로테아제 결손 대장균주인 W3110 M25에 형질전환하여, 융합 단백질을 봉입체로 발현시켰다. 각 융합 단백질을 발현하는 W311O M25 대장균을 2 L 삼각 플라스크에서 테트라사이클린 10 mg/L을 포함하는 LB 액체 배양배지(0.5% (w/v) 효모 엑기스, 1%(w/v) 트립톤, 0.5% 염화나트륨) 400 mL를 사용하여 37 ℃에서 하룻밤동안 150 rpm로 교반하면서 배양하였다.
다음날, 4 ℃에서 6000xg로 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고, 이를 초음파 처리하여 균체를 파쇄하였다. 균체 파쇄액에 탈이온수을 가하여 30 mL로 조절한 다음 4 ℃에서 25000xg로 15분간 원심분리하고, 상청액을 버리고 펠렛(봉입체)을 회수하였다. 또한, 30 mL의 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 5 mM EDTA, 1% 트리톤 X-100에 현탁하여, 4 ℃에서 25000xg로 15분간 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 펠렛을 30 mL의 탈이온 빙수에 현탁한 후, 4 ℃에서 25000xg으로 15분간 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 이에 탈이온수을 첨가하여 1.5 mL로 조절 및 현탁한 후, 4 ℃에서 10000xg로 30분간 원심분리함으로써 펠렛을 수득하고, 이러한 과정을 반복하여, OD660 = 10O로 되도록 탈이온수로 펠렛을 현탁하였으며, 상기 과정으로 제조된 봉입체를 OmpT 프로테아제의 반응 기질로 사용하였다.
(5) OmpT 프로테아제 반응
융합 단백질을 기질로 사용하여, OmpT 프로테아제 반응을 다음과 같이 수행하였다. 10 M 요소 20 μL에 1 M 인산 나트륨(pH 7.0) 2.5 μL 및 5O mM EDTA 2 μL를 각각 융합 단백질 봉입체(OD660 =l00) 10 μL에 첨가하여, 봉입체를 용해하였다. 여기에 빙수 10.5 μL을 가하고, 1.4 units/mL의 0mpT 프로테아제 5 μL를 첨가하여 반응액량 50 μL로 반응을 개시하였다. 반응 온도는 25 ℃이며 30분간 행하였다. OmpT 프로테아제와 반응하여 수득한 폴리펩티드는 특별히 거절되지 않는 한 이하의 조건의 HPLC로 정량하였다. OmpT 프로테아제 반응액에 6% 아세트산 150 μL과 2 M 요소를 첨가하여 반응을 정지시키고, 10000xg에서 3분간 원심분리하여 상청액 20 μL를 YMC PROTEIN RP 컬럼에 주입하였다. HPLC 컬럼 온도는 40 ℃이고, 유속은 1 mL/min으로 수행하였다. 20분간 0.1% 트리플루오르아세트산을 포함하는 30-50% 아세트니트릴의 선형 농도구배로 용출을 수행하였으며, 214 nm에서 흡광도를 측정하여 폴리펩티드를 정량하였다.
(6) 폴리펩티드의 질량 해석
절단 부위를 추정하기 위해, HPLC로 분리하고 폴리펩티드의 질량 분석을 Thermo Finnigan사 제품 SSQ710을 사용하여 수행하였다.
(7) 대장균 외막 분획 제조
숙주를 W311O M25로 하여 0mpT 프로테아제 또는 0mpT 프로테아제 변이체를 발현하는 대장균의 외막측 분획을 하기와 같이 제조하여, 실시예 10, 14, 16 및 18의 0mpT 프로테아제 또는 0mpT 프로테아제 변이체를 이용한 융합 단백질의 절단 반응에 사용하였다. 배양 방법은 (4)와 동일하게 수행하였으며, 배양 종료 후 4 ℃에서 6000xg에서 10분간 원심분리하여 균체를 수득하였다. 이 균체를 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA(TE)로 현탁하고, 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하였다. 균체 파쇄액을 4 ℃에서 100Oxg로 10분간 원심분리하여, 펠렛은 버리고 파쇄액을 회수하였다. 또한, 상기 파쇄액을 4 ℃에서 36000xg로 40분간 원심분리하여 펠렛을 회수하고, 이를 TE로 현탁한 다음 4 ℃에서, 36000xg로 40분간 재차 원심분리하였다. 수득한 펠렛은 0D660 = 10이 되도록 TE에 현탁하였다. 사용하기전까지 -2O ℃에서 동결 보존하였다.
도 1는 융합 단백질 PRR 및 PRX의 구조를 나타낸 도면이다. 융합 단백질 PRR의 아미노산 서열 상에 각 아미노산의 위치를 나타내며, 아래의 숫자는 PRR의 N 말단으로부터의 아미노산 서열 번호이다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째 아미노산까지로 이루어진 보호 단백질이며, GLP-1(7-37)은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7-37)이며, 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 153번째의 아르기닌까지이다. 융합 단백질 PRR의 0mpT 프로테아제 절단 부위는 ▼로 나타낸다. 융합 단백질 PRX는 PRR의 141번째 아르기닌을 19 종의 다른 아미노산으로 치환한 융합 단백질이다.
도 2는 융합 단백질 PAn의 구조를 나타낸 도면이다. 융합 단백질 PA 아미노산 서열의 각 아미노산의 위치를 나타내며, 아래 숫자는 PA의 N 말단으로부터의 아미노산 서열 번호이다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째 아미노산까지로 이루어진 보호 단백질이며, GLP-1(7-37)은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7-37)이며, 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 153번째의 아르기닌까지이다. 융합 단백질 PA의 0mpT 프로테아제 절단 부위는 ▼(흑삼각)으로 나타낸다. 융합 단백질 PAn에서 아미노산 치환된 아르기닌을 이탤릭체로 굵게 나타낸다. PAn의 OmpT 프로테아제 절단 부위는 ↓로 나타낸다. 도면의 우측에 융합 단백질 PA의 절단율을 100%으로 두었을때의 각 융합 단백질의 절단율을 나타낸다. a는 Arg139-Arg140의 절단율도 포함한다. b는 Arg141-Arg142의 절단율을 포함한다. c는 Arg143-Ala144의 절단율을 포함한다.
도 3은 융합 단백질 PA1A3', PA1'A3', PA23', PA323' 및 PA2'3'의 구조를 나타낸 도면이다. 융합 단백질 PA3'의 아미노산 서열에 각 아미노산 위치를 나타내며, 아래의 숫자는 PA3'의 N 말단으로부터의 아미노산 서열 번호이다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부 터 유래된 보호 단백질이며, GLP-1(7-37)은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7-37)이며, 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 153번째의 아르기닌까지이다. 아르기닌은 굵은 글씨로 나타낸다. 융합 단백질 PA3'의 0mpT 프로테아제 절단 부위를 ▽(절단율 73%), ▼(절단율 220%)으로 나타낸다. 융합 단백질 PA1A3', PA1'A3', PA23', PA323' 및 PA2'3'에서, PA3'에 아미노산 치환된 아미노산은 이탤릭으로 나타내며, OmpT 프로테아제 절단 부위는 ↓로 나타낸다. 도면의 우측에 융합 단백질 PA의 절단율을 100%로 두었을때 각 융합 단백질의 Arg140-Arg141 (●)과 Arg143-Ala144 (○)에서의 절단율을 나타낸다. ND는 검출되지 않았음을 의미한다. a는 Arg140-Ala141의 절단율을 나타낸다. b는 Arg139-Arg140의 절단율을 포함한다. c는 Arg142-Arg143의 절단율을 포함한다.
도 4는 융합 단백질 PA3D23', PA4D23' 및 PA5D23'의 구조를 나타낸 도면이다. 융합 단백질 PA23'의 아미노산 서열에 각 아미노산 위치를 나타내며, 아래의 숫자는 PA23'의 N 말단으로부터의 아미노산 서열 번호이다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 단백질이며, GLP-1(7-37)은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7-37)이며, 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 153번째의 아르기닌까지이다. 아르기닌 굵은 글씨로 나타낸다. 융합 단백질 PA23'의 주된 OmpT 프로테아제 절단 부위는 ▼으로 나타낸다. 융합 단백질 PA3D23', PA4D23', PA5D23' 및 PA23'에 치환된 아미노산은 이탤릭체로 표시하며, OmpT 프로테아제 절단 부위는 ↓로 나타낸다. 도면 우측에 융합 단백질 PA의 절단율을 10O%으로 두었을 때, 각 융합 단백질의 Arg140-Arg141(●)과 Arg143-Ala144(○)에서의 절단율을 나타낸다. ND는 검출되지 않았음을 의미한다.
도 5는 융합 단백질 PRMT 및 PMT의 구조를 나타낸 도면이다. 두개의 융합 단백질의 아미노산 서열상의 숫자는 N 말단으로부터의 아미노산 서열 번호이다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 단백질이며, PRMT의 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 140번째 아르기닌까지이고 PMT의 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 143번째 아르기닌까지이다. 융합 단백질 PRMT의 140번째 아르기닌까지의 아미노산 서열은 도 1의 구조를 가지는 융합 단백질 PRR(일본 특허 출원번호 2000-602803 참조)의 N 말단으로부터 140번째 아르기닌까지의 아미노산 서열과 동일한다. 또한, 융합 단백질 PMT의 143번째 아르기닌까지의 아미노산 서열은 융합 단백질 PA23'(도 4)의 N 말단으로부터 143번째 아르기닌까지의 아미노산 서열과 동일한다. 융합 단백질 PMT의 OmpT 프로테아제에 의한 절단 부위는 ●로 표시하고, 0mpT 프로테아제 변이체 D97M에 의한 절단 부위는 ○로 나타낸다. RAR-모틸린(motilin)은 PMT에서 Arg140-Arg141 절단으로 유리된 Arg-Ala-Arg-모틸린으로 이루어지는 폴리펩티드이고, RRAR-모틸린은 PMT에서 Arg139-Arg140 절단으로 유리된 Arg-Arg-Ala-Arg-모틸린으로 이루어지는 폴리펩티드이다.
도 6은 융합 단백질 PRMT 및 PMT와, 야생형 0mpT 프로테아제 및 0mpT 프로테아제 변이체 D97M의 반응(25 ℃, 120분)을 HPLC로 해석한 결과이다.
도 7은 W311O M25 PMT 및 W3110 M25 0mpT D97M 발현균의 2L 고밀도 배양시, 배양액 0D660의 경시 변화를 나타낸 도면이다. ○는 W3110 M25 PMT이고, ●는 W3110 M25 0mpT D97M이다. 두 종의 재조합 대장균 모두 글루코오스 농도 1.5%, 32℃로 배양하고, 배양 개시 후 약 12시간 경과시 글루코오스가 고갈되면 2%가 되도록 글리세롤을 첨가하고, 37℃로 배양 온도를 변경한 후, 글리세롤이 고갈할 때마다 동일하게 2%가 되도록 글리세롤을 첨가하였으며(W311O M25 PMT, ↑; W311O M25 0mpT D97M, ↓), W3110 M25 PMT는 배양 개시 후 24시간 경과시, W311O M25 0mpT D97M는 20시간 경과시에 배양을 종료하였다.
도 8은 융합 단백질 PMT로부터의 OmpT 프로테아제 변이체 0mpT D97M에 의한 모틸린 유리의 경시 변화이다.
도 9의 A는 60분 경과한 반응액을 HPLC로 분석한 것이고, B는 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 레인 1, PMT 단독; 2, PMT+D97M; 3, 모틸린 표준물질. 반응액 조성: 4 M 요소, 50 mM 인산 나트륨(pH 7.0), 2 mM EDTA, PMT OD660 = 50, OmpT D97M OD660 =16; 반응 온도: 25 ℃; 120 min-1으로 진탕함.
도 10의 A는 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 16 및 18에서 구축한 융합 단백질 발현 플라스미드의 구조이다. B는 실시예 11로 구축한 0mpT 프로테아제 또는 OmpT 프로테아제 변이체 발현 플라스미드의 구조이다.
도 11은 융합 단백질 PAC 및 PCT의 구조이다. 각 융합 단백질의 아미노산 서열 아래 숫자는 N 말단으로부터의 아미노산 번호이다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 단백질이고, 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 143번째의 아르기닌까지이다. 각 융합 단백질의 143번째 아르기닌까지의 아미노산 서열은, 융합 단백질 PA23'(도 4)의 N 말단으로부터 143번째 아르기닌까지의 아미노산 서열과 동일하다.
도 12는 융합 단백질과 야생형 0mpT 프로테아제 및 0mpT 프로테아제 변이체의 반응을 HPLC로 해석한 결과이다. PAC는 D97L와 10분간, PCT는 D97H와 2시간동안, 25 ℃로 반응시켰다.
도 13은 실시예 17에서 구축한 OmpT 프로테아제 변이체 D97M 발현 플라스미드의 구조이다. MCS, 다중 클리닝 사이트( Multi Clining Sites).
도 14는 실시예 17에서 제작한 융합 단백질 PMT와 0mpT 프로테아제 변이체 D97M를 공동발현하는 W3110 M25 형질전환 대장균에서 수득한 봉입체를 사용하여, 융합 단백질 PMT에서 인간 모틸린의 분리를 나타내고 있는 SDS-PAGE 분석 결과이다. Mr, 단백질 분자량 마커; 레인 1, 반응 개시 후 20분; 2, 40분; 3, 60분; 4, 120분; 5, 180분; 6, 240분; 7, 300분; 8, 360분; 9, 1440분(24시간); 10, 모틸린 표준형. 반응액 조성: 4 M 요소, 50 mM 인산 나트륨(pH 7.0), 2 mM EDTA, 봉입체 0D660 = 20; 반응 온도: 25 ℃.
도 15는 융합 단백질 PMT, PMT6D 및 PMT7D의 구조를 나타낸 도면이다. 융합 단백질 아미노산 서열상의 숫자는 N 말단으로부터의 아미노산 배열 번호를 나타낸다. β-gal117S4H는 대장균 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 단백질이고, 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민에서 143번째 아르기닌까지이다. 이들 융합 단백질의 143번째 아르기닌까지의 아미노산 서열은, 각각 융합 단백질 PA23', PA3D23' 및 PA4D23'(도 4)의 N 말단으로부터 143번째 아르기닌까지의 아미노산 서열과 일치한다. 각각의 융합 단백질에 OmpT 프로테아제 변이체 D97M에 의한 절단 부위를 화살표로 나타낸다. AR-모틸린은 Arg141-Ala142의 절단으로 유리되는 Ala-Arg-모틸린으로 이루어진 폴리펩티드이고, RRAR-모틸린은 Arg139-Arg140의 절단으로 유리되는 Arg-Arg-Ala-Arg-모틸린으로 이루어진 폴리펩티드이다.
도 16은 융합 단백질 PMT와 0mpT 프로테아제 변이체 D97M의 반응(25 ℃, 120분)을 HPLC로 해석한 결과이다. 괄호 내 숫자는 융합 단백질로부터 생성된 모틸린 농도를 100으로 한 경우의 각 부산물 농도를 나타낸다.
도 17은 융합 단백질 PMT6D와 0mpT 프로테아제 변이체 D97M의 반응(25 ℃, 120분)을 HPLC로 해석한 결과이다. 괄호 내 숫자는 융합 단백질에서 생성된 모틸린 농도를 100으로 한 경우의 각 부산물 농도를 나타낸다.
도 18은 융합 단백질 PMT7D와 0mpT 프로테아제 변이체 D97M의 반응(25 ℃, 120분)을 HPLC로 해석한 결과이다. 괄호 내 숫자는 융합 단백질에서 생성된 모틸린 농도를 100으로 한 경우의 각 부산물 농도를 나타낸다.
이하, 실시예를 기재하여 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예 1. 융합 단백질 PAn의 제조
0mpT 프로테아제는 대장균 외막에 존재하는 엔도프로테아제이다. 본 효소에 의한 절단에서, 절단 부위의 주변 아미노산 서열내 염기성 아미노산의 영향력이 매우 큰 것으로 여겨져, 본 발명자는 상기 효소의 기존 절단부위를 이용하여 하기 실험을 수행함으로써 염기성 아미노산 위치와 절단율과의 관련성을 검토하였다.
OmpT 프로테아제에 의해 절단되는 구조를 가지는 도 2의 융합 단백질 PA(링커 펩티드를 매개로, 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단 117 번째 아미노산까지의 보호 단백질(β-gal117S4H)과 인간 글루카곤계 펩티드-1(7-37)(GLP-1(7-37))로 이루어진 융합 단백질을, 절단 부위에 대한 Pl0 위치로부터 P2 위치 및 P2' 위치로부터 P5' 위치의 알라닌을 아르기닌으로 치환함으로써, 링커 펩티드내의 OmpT 프로테아제 절단 부위가 변환된 융합 단백질 PAn(도 2: n은 절단 부위에 대한 아미노산 위치[Pn]에 해당되며, P10에서 P2 및 P2'에서 P5'까지)를 제작하고, 0mpT 프로테아제에 의한 절단을 검토하였다.
대장균 OmpT 프로테아제의 인식·절단 부위인 아르기닌-아르기닌 서열이 융합 단백질의 링커 부분에 삽입된 융합 단백질 PRR (도 1)의 발현 플라스미드이며 도 10A에 나타낸 구조를 가지는 pG117S4HompPRR(일본 특허 출원번호 2000-602803 참조)를 토대로 PCR하여, 부위 특이적 변이 도입 및 합성 DNA의 치환에 의해 융합 단백질 PA를 발현하는 플라스미드인, 도 10A에 나타낸 구조를 가지는 pGl17S4Homp PA를 구축하였다. 또한, 융합 단백질 PAn의 발현 플라스미드 pG117S4HompPAn는, 도 2의 구조를 가지는 융합 단백질 PA의 발현 플라스미드 pG117S4HompPA에 PCR로 염기 치환함으로써 구축하였다. 구축한 플라스미드의 구조는 도 10A에 나타낸다. 이들 융합 단백질 발현 플라스미드를 0mpT 프로테아제 결손 대장균주인 W311O M25에 형질전환하여, 융합 단백질을 봉입체로 발현시켰다.
실시예 2. OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PAn의 절단
OmpT 프로테아제에 의해 절단된 구조를 가진 도 2의 융합 단백질 PA의 OmpT 프로테아제 절단 부위 주변의 알라닌을, 아르기닌으로 치환한 융합 단백질 PAn(도 2)를 사용하여, OmpT 프로테아제에 의한 절단율을 검토하였다. PAn는 pH 7.0으로 일본 특허 출원번호 2000-602803에 따라 벤즈아미딘세파로스 6B로 정제한 0mpT 프로테아제 표준물질과 반응시켰다. 효소 반응 후, HPLC 분석 결과로부터 얻어진 절단율 역시 도 2에 나타내었다. 또한, 질량 분석 결과로 확인한 절단 부위를 도 2에 나타내었다.
모든 PAn는 원래의 PA와 동일한 부위에서 0mpT 프로테아제에 의해 절단되며, PA2, PA2' 및 PA3'는 그 외의 부위에서도 절단되는 것으로 확인되었다(도 2). 특히, PA3'는 Arg140-Arg141 및 Arg143-Ala144의 2곳에서 절단되며(절단율 각각 220,73%), 연속하는 염기성 아미노산 사이 이외에서도(Arg143-Ala144) 절단되었다.
또한, PA2와 PA2'를 제외한 모든 PAn에서 절단율이 상승되었으므로, 절단 부위 주변 아미노산 서열내 P10로부터 P3 및 P3'로부터 P5'에 아르기닌을 배치함으로 써 절단율을 향상시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 이들중, PA4의 절단율이 가장 높아 PA에 약 5배였으며, P4 위치에 아르기닌을 배치하는 것이 가장 효과적임을 알 수 있었다. 한편, PA2 및 PA2'의 절단율은 약 1/3로 감소하여, 3회 연속된 아르기닌 서열에서 절단율이 저하됨을 알 수 있었다.
실시예 3. 융합 단백질 PA1A3', PA1'A3'의 제조
0mpT 프로테아제는 연속하는 염기성 아미노산 사이를 주로 절단하는 효소인 것으로 알려져 있다. 그러나, 실시예 2의 결과로부터 융합 단백질 PA3'가 2곳 Arg140-Arg141 및 Arg143-Ala144에서 절단되는 것으로 확인되었으며, 그 중 1곳은 -Arg↓Ala-의 절단으로 확인되었다. -Arg↓Ala-에서의 절단율은 연속하는 염기성 아미노산의 사이의 절단율과 비교하면 낮지만, 공업적으로 이용할 수 있을 가능성이 있는 절단율을 개선할 수 있을 것으로 여겨진다.
그래서, 융합 단백질 PA3'의 절단 부위 2곳, Arg140-Arg141 및 Arg143-Ala144 중에서 Arg140-Arg141의 절단을 억제하기 위해, Arg140 또는 Arg141을 알라닌으로 치환한 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질 PA1A3'및 PA1' A3'(도 3)을 제조하고, 이의 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 검토하였다. 아울러, 이들 융합 단백질을 사용하여 Argl43-Ala144의 절단시 Arg140(Argl43, Ala144 각각 P1 위치, P1' 위치로 하였을때 P4 위치임)와 Arg141(Argl43, Ala144를 각각 P1 위치, P1' 위치로 하면 P3 위치임)중 어디에 필요한지를 검토하였다.
융합 단백질 PA1A3' 및 PA1'A3'의 발현 플라스미드 pG117S4HompPA1A3' 및 pGl17S4HompPA1'A3'를, 도 3의 구조를 가지는 융합 단백질 PA3'의 발현 플라스미드 pG117S4HompPA3'에 PCR로 염기 치환하여 구축하였다. 구축한 플라스미드의 구조를 도 10A에 나타내었다. 이들 융합 단백질 발현 플라스미드를 0mpT 프로테아제 결손 대장균주인 W3110 M25에 형질전환시켜, 융합 단백질을 봉입체로 발현시켰다.
실시예 4. OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PA1A3' 및 PA1'A3'의 절단
도 3의 융합 단백질 PA1A3' 및 PAl'A3'의 0mpT 프로테아제에 의한 절단 부위 및 절단율을 검토하였다. PA1A3' 및 PA1'A3'를 pH 7.0에서 일본 특허 출원번호 2000-602803에 따라 벤자미딘세파로스 6B를 사용하여 정제한 0mpT 프로테아제 표준물질과 반응시켰다. 효소 반응 후, HPLC에 따른 절단율 및 질량 분석의 결과로부터 확인한 절단 부위를 도 3에 나타내었다. PA1A3' 및 PA1'A3'은 모두 Arg143-Ala144에서 절단되었다. 그러나, 이들의 절단율은 PA의 Arg140-Arg141에서의 절단율에 비해 낮았다. PA1'A3'에서도, Arg140-Ala141가 절단되었다. Arg143-Ala144를 절단 부위 P1-P1'라 하였을때, P3 위치의 아르기닌(PA1A3'의 Arg141) 또는 P4 위치의 아르기닌(PA1'A3'의 Arg140) 중 어느 하나가 존재하면 Arg143-Ala144에서 절단되지만, P4 위치 및 P3 위치 모두에 아르기닌을 배치한 PA3'이 PA1A3' 및 PA1'A3'보다도 절단율이 높을 것으로 시사되었다.
실시예 5. 융합 단백질 PA23', PA323' 및 PA2'3'의 제조
실시예 4의 결과에서, 융합 단백질 PA1A3' 및 PA1'A3'은 Arg143-Ala144에서 절단되며, 특히 PA1A3'는 Arg143-Ala144 만 절단되지만 절단율은 낮았다. 그래서, 융합 단백질 PA3'에 아미노산 치환을 도입하여, -Arg↓Ala- (Arg143-Ala144)의 절단율을 상승시키는 아미노산 서열을 제작하고자 하였다. 실시예 2의 결과에 따라, -Arg↓Ala- (Arg143-Ala144)의 절단율을 높히고 연속하는 염기성 아미노산의 사이(Arg140-Arg141)의 절단율을 감소시킬 것으로 예상되는 아미노산 서열(2회 연속하는 아르기닌을, 3회 연속 또는 4회 연속하는 아르기닌)을 가지는 융합 단백질 PA23', PA323' 및 PA2'3'(도 3)을 다음과 같이 제조하고, 그들의 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 검토하였다.
융합 단백질 PA23'및 PA2'3'의 발현 플라스미드 pGl17S4HompPA23' 및 pGl17S4HompPA2'3'를, 도 3에 나타낸 구조를 가지는 융합 단백질 PA3'의 발현 플라스미드 pGl17S4HompPA3'에 PCR로 염기 치환하여 구축하였다. 또한, 융합 단백질 PA323'의 발현 플라스미드 pGl17S4HompPA323'를, 도 3에 나타낸 구조를 가지는 융합 단백질 PA23'의 발현 플라스미드 pGl17S4HompPA23'에 PCR로 염기 치환하여 구축하였다. 구축한 플라스미드의 구조를 도 10A에 나타내었다. 이들 융합 단백질 발현 플라스미드를 0mpT 프로테아제 결손 대장균주인 W311O M25에 형질전환하여, 융합 단백질을 봉입체로 발현시켰다.
실시예 6. OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PA23', PA323' 및 PA2'3'의 절단
도 3에 나타낸 융합 단백질 PA23', PA323' 및 PA2'3'의 0mpT 프로테아제에 의한 절단 부위 및 절단율을 검토하였다. 일본 특허 출원번호 2000-602803에 따라, PA23', PA323' 및 P2'3'를 pH 7.0에서 벤즈아미딘세파로스 6B로 정제한 0mpT 프로테아제 표준물질과 25 ℃에서 30분간 반응시켰다. 효소 반응 후, HPLC에 따른 절단율과, 질량 분석의 결과로부터 확인된 절단 부위를 도 3에 나타내었다. PA23', PA323'및 PA2'3'은 Arg143-Ala144로 절단되는 것으로 확인되었다. PA23'의 Arg143-Ala144에서의 절단율은 PA의 Arg140-Arg141에서의 절단율의 2.9배였다.
Arg139-Arg140 및 Arg140-Arg141에서의 절단도 확인되었지만, Arg143-Ala144에서의 절단율도 13%였다. pA323'의 Arg143-Ala144에서의 절단율도 PA의 Arg140-Arg141에서의 절단율의 2.9배였지만, Arg140-Arg141에서도 절단되었으며 Arg143-Ala144에서의 절단율의 59%였다. PA2'3'에서 Arg143-Ala144의 절단율은, PA의 Arg140-Arg141에서의 절단율의 63%로 낮았으며, Arg140-Arg141 및 Arg142-Arg143에서의 절단도 확인되었다. 이상의 결과는, 이들 3종의 융합 단백질 중 PA23'가 -Arg↓Ala- (Arg143-Ala144)의 절단율을 증가시키며 연속하는 염기성 아미노산의 사이의 절단율을 감소시키는 최적의 서열임을 나타낸다.
실시예 7. 융합 단백질 PA5D23', PA4D23' 및 PA3D23'의 제조
융합 단백질 PA23'에서 Arg143-Ala144의 절단율이 매우 높은 것으로 실시예 6에서 확인되었다. 그러나 Arg139-Arg140 또는 Arg140-Arg141에서의 절단도 확인되었다. 그래서, 절단 부위 근처에 산성 아미노산이 있는 경우 이 절단을 억제할 수 있으므로, Arg139-Arg140 또는 Arg140-Arg141에서의 절단을 억제하기 위해 Ala136, Ala137 또는 Ala138를 아스파르트산으로 치환한 융합 단백질 PA5D23' , PA4D23'및 PA3D23'(도 4)를 다음과 같이 제조하였고, 이들의 OmpT 프로테아제에 의한 절단을 검토하였다.
융합 단백질 PA5D23', PA4D23' 및 PA3D23'의 발현 플라스미드 pG117S4HompPA5D23', pGl17S4HomPA4D23'및 pGll7S4HompPA3D23'를, 도 4에 나타낸 구조를 가지는 융합 단백질 PA23'의 발현 플라스미드 pG117S4HompPA23'를 PCR로 염기치환하여 구축하였다. 구축한 플라스미드 구조를 도 10A에 나타내었다. 이들 융합 단백질 발현 플라스미드를 0mpT 프로테아제 결손 대장균주인 W311O M25에 형질전환하여, 융합 단백질을 봉입체로 발현시켰다.
실시예 8. OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PA5D23', PA4D23' 및PA3D23'의 절단
도 4의 융합 단백질 PA5D23', PA4D23' 및 PA3D23'의 0mpT 프로테아제에 의한 절단 부위 및 절단율을 검토하였다. 일본 특허 출원번호 2000-602803에 따라, pH 7.0으로 벤즈아미딘세파로스 6B를 사용하여 정제한 0mpT 프로테아제 표준물질과 PA5D23', PA4D23' 및 PA3D23'를 25℃에서 30분간 반응시켰다. 효소 반응 후, HPLC 분석 결과로부터 얻어진 절단율, 질량 분석 결과로부터 얻어진 절단 부위를 도 4에 나타내었다. PA5D23', PA4D23' 및 PA3D23'의 주된 절단 부위는 Arg143-Ala144인 것이 확인되었다.
특히, PA4D23'의 Arg143-Ala144에서의 절단율은 PA23'에 비해 감소된, PA의 Arg140-Arg141에서의 절단율의 2배였다. 한편, PA23'에서 Arg139-Arg140 및 Arg140-Arg141에서의 절단은 검출되지 않았다. 즉, Arg140-Arg141를 P1-P1'로 하였을때 P3 위치에 아스파르트산 배치로 상기 절단이 억제되는 것으로 생각할 수 있다. 마찬가지로 Arg139-Arg140를 P1-P1'로 두었을때, P2 위치에 아스파르트산을 배치함으로써 그 절단을 억제할 수 있는 것으로 생각된다. PA5D23'의 Alg143-Ala144에서의 절단율은, PA의 Arg140-Arg141에서의 절단율의 1.9배였지만 Arg140-Arg141에서도 절단되었다.
PA3D23'에서도, PA4D23'와 마찬가지로 Arg139-Arg140 및 Arg140-Arg141에서의 절단은 검출되지 않았다. 즉, Arg140-Arg141를 P1-P1'로 하였을때 P4 위치에 아스파르트산을 배치함으로써 그 절단을 억제할 수 있을 것으로 생각할 수 있다. 동일하게, Arg139-Arg140를 P1-P1'로 하였을때, P3 위치에 아스파르트산을 배치하는 것으로 그 절단이 억제되는 것으로 생각할 수 있다. 그러나 Arg143-Ala144에서의 절단율은 pA의 Arg140-Arg141에서의 절단율과 동일하였고, PA4D23'보다 낮았다. 이상의 결과는, 이들 3종의 융합 단백질 중 PA4D23'이 -Arg↓Ala- (Arg143-Ala144)에서의 절단율을 증가시키고 연속하는 염기성 아미노산의 사이의 절단을 억제하는, 최적의 서열임을 나타낸다.
따라서, 보호 단백질-링커 펩티드-목적 폴리펩티드로 이루어지는 융합 단백질에서 N 말단 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산 및 프롤린 이외의 17 종의 아미노산 중 어느 하나인 목적 폴리펩티드를, OmpT 프로테아제를 사용하여 자르고 싶은 경우, -Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-의 아미노산 서열의 C 말단에 연속적으로 목적 폴리펩티드를 배치함으로써, 특이적으로 적출할 수 있을 것으로 여겨진다.
실시예 9. 융합 단백질 PRMT 및 PMT의 제조
실시예 6의 결과로부터, 0mpT 프로테아제는 도 3으로 나타낸 융합 단백질 PA23'의 본 효소의 절단 부위 주변 아미노산 서열에서 -Arg↓Ala-를 효율적으로 절단하는 것으로 확인되었다. 이로부터 절단부위가 -ArgXaa- (Xaa 산성 아미노산인 아스파르트산, 글루탐산 및 프롤린 이외의 17 아미노산)이더라도 효율적으로 절단할 수 있을 것으로 예상되었다. 본 발명자는 실시예 6에 사용한 융합 단백질 PA23'의 143번째의 아르기닌에 연속하여, N 말단이 산성 아미노산, 프롤린 이외의 아미노산이며, 또한, 염기성 아미노산 이외의 아미노산을 치환하는 경우에, 상기 효소에 의한 절단이 어떻게 되는지를 검토하였다.
먼저, OmpT 프로테아제에 의해 Arg140-Arg141가 절단되고 도 1에 나타낸 구조 를 가지는 융합 단백질 PRR (일본 특허 출원번호 2000-602803 참조)의 N 말단으로부터 140번째의 아르기닌에 연속하여 인간 모틸린이 배열된 융합 단백질 PRMT(도 5)를 대조군으로 제작하였다. 다음으로, 융합 단백질 PA23'(도 3 및 도 4)의 N 말단으로부터 143번째의 아르기닌에 연속하여 인간 모틸린이 배열된 융합 단백질 PMT(도 5)를 제작하였다.
융합 단백질 PRMT의 발현 플라스미드 pGl17S4HompPRMT와 PMT의 발현 플라스미드 pG117S4HompPMT의 구조를 도 10A에 나타내었다. 이들 2종의 융합 단백질 발현 플라스미드를 0mpT 프로테아제 결손 대장균주인 W311O M25에 각각 형질전환하여, 융합 단백질 생산균을 제작하였다. 얻어진 균주를 배양하여, 융합 단백질 PRMT 및 PMT 를 봉입체로 제조하였다.
실시예 10. OpmT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PRMT 및 PMT의 절단
도 5에 나타낸 융합 단백질 PRMT 및 PMT의 0mpT 프로테아제에 의한 절단은, W311O M25를 숙주로 하고 0mpT 프로테아제를 발현하는 대장균의 막분획을 사용하여 SDS-PAGE 또는 HPLC에 의해 검토하였다. SDS-PAGE로 OmpT 프로테아제에 의한 융합 단백질 PMT 절단을 확인할 수 있었지만, PRMT의 절단은 검출되지 않았다. HPLC에서도 융합 단백질 PMT의 절단은 확인할 수 있었지만, 이는 주로 Arg139-Arg140, Arg140-Arg141의 염기성 아미노산 사이에서의 절단이며, Arg143-Phe144에서의 펩티드 절단 단편 즉 인간 모틸린은 질량 분석시 매우 조금 검출할 수 있었을 뿐이었다.
이로부터 절단부위 주변의 아미노산 서열을 -Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-모틸린으 로 한 경우, 0mpT 프로테아제에 의해 주된 펩티드 절단 단편으로서 인간 모틸린을 적출하는 것이 불가능하다는 것을 알았다. 이로써 본 프로테아제의 기질 특이성에서 P1' 위치의 아미노산에 대해 관대한 점을 효율적인 절단에 이용하는 경우, 본 프로테아제 자체에 변이를 도입함으로써, 또한 P1' 위치의 아미노산에 대한 특이성을 높일 필요가 있다고 생각되었다. 그리하여 0mpT 프로테아제 변이체를 제작하고, 이를 사용하여 융합 단백질로부터 인간 모틸린을 주로 절단할 수 있는지 여부를 검토하였다.
실시예 11. OmpT 프로테아제 변이체 발현 대장균의 제조
0mpT 프로테아제의 결정 구조를 해석한 논문(Vandeputte-Rutten, L. et al. EHB0 J. 20: 5033-5039, 2001) 및 이의 관련 논문(Kramer, RA. et al. FEBS Lett. 505: 426-430, 2001)에, 기질의 P1' 위치의 아미노산과 OmpT 프로테아제의 Asp97이 상호작용 가능성이 고찰되어 있으므로, OmpT 프로테아제의 Asp97에 다음과 같이 PCR을 이용하여 20종의 아미노산(아스파르트산과 같은 의미의 치환을 포함)으로 치환한 플라스미드를 제작하고, 이를 OmpT 프로테아제 결손 대장균 BL21주에 도입하여 0mpT 프로테아제 변이체 발현 대장균 20주를 제조하였다.
OmpT 프로테아제의 ASp97에 변이 도입을 쉽게 하고, 가능한 한 PCR로 증폭한 DNA 영역을 적게 하기 위해, 도 10B에 나타낸 구조를 가진 0mpT 프로테아제 발현 플라스미드 p0mpTTcE(일본 특허 출원번호 2000-602803 참조)의 OmpT 프로테아제 Ser99를 코딩하는 AGT를 TCT로 바꾸는 것으로, 제한 효소 부위 XbaI를 PCR로 도입한 OmpT 프로테아제 발현 플라스미드 p0mpTXbaI를 먼저 구축하였다. 다음으로, 0mpT 프로테아제의 Asp97를 20종의 아미노산(아스파르트산과 같은 의미의 치환을 포함)으로 치환한 변이체 0mpT D97X(X는 치환 후 20종의 아미노산을 나타냄)를 발현하는 플라스미드 pOmpTD97X0mpT는, 프로테아제 발현 플라스미드 p0mpTXbaI에 PCR로 변이를 도입하여 구축하였다. 발현 플라스미드 pOmpTXbaI 및 pOmpTD97X의 구조는 도 10B에 나타내었다.
얻어진 20종의 발현 플라스미드 p0mpTD97X를 각각 0mpT 프로테아제 결손 대장균 BL21주에 도입하여, 0mpT 프로테아제 변이체 0mpT D97X 발현 대장균 20주를 제조하였다. 이들 대장균은 시험관에서 테트라사이클린 10 μg/mL를 포함하는 LB 액체 배지 2 mL에서 37 ℃로 0D66 0 =1 정도까지 진탕 배양한 후, 균체를 원심분리에 의해 회수하였다. 여기에 1 mL의 TE(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 가하여 현탁 후, 원심분리에 의해 균체를 회수하였다. 또한, 같은 조작을 반복하여 얻어진 균체에 OD660 = 2가 되도록 TE를 첨가하여 현탁한 것을, 0mpT 프로테아제 변이체 OmpTD97X 반응용 균체 현탁액으로 하였다. 이들 균체 현탁액은 사용전까지 -20 ℃로 동결 보존하였다.
실시예 12. OmpT 프로테아제 변이체 발현 대장균 균체의 현탁액중에 포함된 OmpT 프로테아제 변이체 발현 함량 확인
OmpT 프로테아제 변이체 발현 대장균 균체의 현탁액 중에 포함되어 있는 OmpT 프로테아제 변이체 발현 함량이, 모든 균체 현탁액에서 동량인지를 확인하기 위해, 항 OmpT 프로테아제 항체를 사용하여 웨스턴블롯팅 및 면역 염색을 수행하였다. 항 0mpT 프로테아제 항체는, 정제 OmpT 프로테아제를 토끼에 면역 감작하여 수득한 항혈청으로부터 IgG 분획을 정제한 다음 정제 OmpT 프로테아제에 친화성이 있는 분획을 회수함으로써 제조하였다.
하나의 레인에 0D660 = O.O1에 해당되는 균체 현탁액을 12% SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동한 다음, PVDF 막을 사용하여 웨스턴블롯팅을 실시하였다. 제조한 전사막을 블로킹액 (5%(w/v) 스킴 밀크/1x TBST*)에 침지하여, 실온에서 30분간 진탕하였다. 이후, 블로킹액에 1000배 희석한 항 0mpT 프로테아제 항체에 막을 침지하여, 실온에서 100분간 진탕하였다. 그 후, 액을 버리고, 1x TBST*에서 5분간 3회 세정하였다. 또한, 블로킹액으로 1000배 희석한 퍼옥시다제 결합 항 토끼 IgG 항체액에 막을 침지하고, 실온에서 45분간 진탕하였다.
1xTBST*으로 10분간 4회 세정한 후, ECL 키트(Amersham Pharmacia 사 제품)로 검출하였다. 숙주인 OmpT 프로테아제 결손 대장균 BL21주에서는 밴드가 검출되지 않았고, 그 외의 균체 현탁액에서는 동등한 강도로 밴드가 검출되었으므로, OmpT 프로테아제 변이체 발현 대장균 균체의 현탁액 중에 포함되어 있는 OmpT 프로테아제 변이체의 함량은 모든 균체 현탁액에서 동일한 것으로 생각되었다. (*1x TBST = 10 mM Tris-HCl (pH 7.0), 150 mM NaC1, 0.05% Tween 20)
실시예 13. OmpT 프로테아제 변이체 OmpT D97X의 P1' 위치에 대한 기질 특이성 검토
OmpT 프로테아제는 대장균 외막에 존재하기 때문에, 반응액에 균체인 상태로 가함으로써 기질과 반응시킬 수 있다. 따라서, 0mpT 프로테아제 변이체 0mpT D97X의 P1' 위치 기질 특이성을 조사하기 위한 목적으로, 도 1의 구조를 가지는 융합 단백질 PRX(일본 특허 출원번호 2000-602803 참조)를 기질로 사용하여, OmpT 프로테아제 변이체 OmpT D97X와의 반응성을 다음과 같이 조사하였다. 10 M 요소 20 μL에 1 M 인산 나트륨(pH 7.0) 2.5 μL 및 50 mM EDTA 2 μL을 첨가하고, 융합 단백질 봉입체(OD660 = 100) 5 μL를 가하여, 봉입체를 용해시켰다. 여기에 물 10.5 μL을 가하고, 실시예 11로 제조한 0mpT 프로테아제 변이체 발현 대장균 균체의 현탁액 10 μL를 첨가하여, 반응액 50 μL로 반응을 개시하였다. 반응은 25 ℃에서 60분간 실시하였다. 반응에서 얻어진 펩티드 단편은 0mpT 프로테아제 반응시와 동일 조건의 HPLC로 정량하였다. 결과는 표 1에 나타내었다.
표 1. 0mpT 프로테아제 변이체 OmpT D97X에 의한 융합 단백질 PRX의 절단
융합단백질 PRX OmpT 프로테아제 변이체 OmpT D97X
D97D D97A D97L D97F D97M D97S D97T D97C D97N D97Q D97E D97H
PRA 5.4 3.8 7.1 3.1 6.0 4.0 6.8 6.2 3.8 4.0 6.5 8.4
PRV 3.5 - - - 3.0 - - 3.2 - - 5.0 7.8
PRI - - - - - - - - - - - 3.1
PRF - - 4.7 - 7.7 - 3.7 4.6 - - 3.4 4.1
PRM - - - - - - - - - - - 4.6
PRS 3.9 - 9.1 - 7.1 - 7.4 5.6 4.1 4.4 7.2 8.7
PRT - - - - - - - - - - - 3.0
PRC 3.1 - 3.9 - 6.5 3.1 4.6 4.8 - 4.1 6.9 11
PRY - - 3.2 - 6.2 - - - - - - -
PRN - - - - - - - - - - - 3.5
PRK 88 - - - - - - 3.9 - - 39 4.5
PRR 100 - - - - - - 4.0 - - 49 4.6
야생형 0mpT 프로테아제(D97D)와 융합 단백질 PRR의 반응시 절단율을 100%로 두어, 상대적인 절단율을 나타내었다. -는 상대 절단율이 3.0 % 미만임 나타낸다. 0mpT 프로테아제 변이체 D97V, D97I, D97P, D97W, D97G, D97Y, D97K 및 D97R은 20 종의 모든 융합 단백질 PRX와의 상대 절단율이 3.0% 미만이었다. 융합 단백질 PRL, PRP, PRW, PRG, PRQ, PRD, PRE 및 PRH의 0mpT 프로테아제 변이체 0mpT D97X와의 상대 절단율은 3% 미만이었다.
이러한 결과로, 비교적 절단율이 높고, 야생형 OmpT 프로테아제와는 기질 특이성이 상이한 변이체 몇 개를 수득할 수 있었다. 융합 단백질 PRR 및 PRK에 대해선 D97D(야생형)가, PRS에는 D97L이, PRF와 PRY에는 D97M이, PRA, PRV, PRI, PRM, PRT, PRC 및 PRN에는 D97H가, 각각 가장 높은 특이성을 나타내었다. 이들 중, PRF에 특이성이 높은 D97M 변이체를 사용하여 실시예 9에서 제조한 융합 단백질 PRnT 및 PMT와의 반응을 수행하고, 인간 모틸린 절단 여부를 검토하였다.
실시예 14. OmpT 프로테아제 D97M 변이체에 의한 융합 단백질 PMT로부터 인간 모틸린의 유리
0mpT 프로테아제 D97M 변이체에 의한 인간 모틸린 융합 단백질 PRMT 및 PMT(도 5)로부터의 인간 모틸린의 절단 검토는, 숙주를 W3110 M25로하는 야생형 0mpT 프로테아제(D97D) 및 0mpT 프로테아제 변이체 D97M를 발현하는 대장균의 외막 분획을 사용하여 실시하였다. 10 M 요소 20 μL에 1 M 인산 나트륨(pH 7.0) 2.5 μL 및 50 mM EDTA 2 μL를 합하고, 여기에 융합 단백질 봉입체(OD660 = 100) 10 μL를 첨가하여 봉입체를 용해시켰다. 여기에 물 10.5 μL을 가하고, 재조합 대장균의 외막 분획 5 μL를 첨가하여 반응액 50 μL로 반응을 개시하였다. 반응은 25 ℃에서 120분간 실시하였다.
반응액에 150μL의 6% 아세트산, 2 M 요소를 첨가하여 반응을 정지시키고, 10000xg에서 3분간 원심분리한 다음 상청액 50 μL를 YMC PR0TEIN RP 컬럼에 주입하였다. HPLC 컬럼 온도는 40 ℃이고, 유속 1 mL/min로 수행하였다. 15분간 0.1% 트리플루오르 아세테이트를 포함하는 20-27.5% 아세트니트릴의 선형 농도구배로 용출을 실시하고, 214 nm에서 흡광도를 측정하였다. 절단 부위는 폴리펩티드 단편을 분리하여 질량 분석함으로써 동정하였다. 도 6은, 대조군인 0mpT 프로테아제 D97D 야생형 및 D97M 변이체에 의한 인간 모틸린 융합 단백질 PRMT 및 PMT의 절단을 HPLC로 분석한 것이다. 또한, 표 2에 그것의 절단 부위와 절단율을 나타내었다.
표 2. 0mpT 프로테아제 변이체 0mpT D97M에 의한 융합 단백질 PMT로부터의 모틸린 절단
융합단백질 D97M D97D(야생형)
모틸린* RAR-모틸린† RRAR-모틸린‡ 모틸린* RAR-모틸린† RRAR-모틸린‡
PRMT 22 - - ND - -
PMT 78 ND 24 ND 23 100
ND는 검출 불능을 나타낸다. -는 융합단백질의 구조상 검출할 수 없음을 나타낸다.
* PRMT에서는 Arg140-Phe141, PMT에서는 Arg143-Phe144의 절단에 의한 유리
†PMT로부터 Arg140-Arg141의 절단에 의해 유리되는 Arg-Ala-Arg-모틸린 폴리펩티드
‡PMT로부터 Arg139-Arg140의 절단에 의해 유리되는 Arg-Arg-Ala-Arg-모틸린 폴리펩티드
절단율은 D97D 야생형으로 PMT를 절단하는 경우 Arg139-Arg140에서의 절단율을 100하여, 모두 상대 절단율로 표시하였다. D97D 야생형으로 PRMT는 절단되며, PMT를 절단하는 경우에는 Arg139-Arg140 및 Arg140-Arg141에서 주로 절단되었다. 그런데 D97M 변이체를 사용하면, PRMT는 절단되고 모틸린이 적출되었다. PMT도 절단되어 모틸린이 유리되었으며, Arg139-Arg140에서의 절단도 확인되었다. 그러나, PMT로부터 유리되는 모틸린의 양은 PRMT보다 3.5배 높았다. 이러한 결과는 모틸린이 적출에 D97M 변이체가 필요하며, 절단 부위의 주변 서열에 의해 모틸린의 절단 효율이 변화한다는 것을 나타낸다.
실시예 15. 모틸린을 모델 펩티드로 하여 OmpT 프로테아제 변이체를 이용한 폴리펩티드 생산예
0mpT 프로테아제 변이체를 사용한 폴리펩티드 생산예로, W3110 M25 모틸린 융합 단백질 PMT 생산균(실시예 9 참조) 및 0mpT 프로테아제 변이체 0mpT D97M 발현균(W3110 M25를 p0mpTD97M로 형질전환하여 제작함)을 각각 2L 스케일로 고밀도 배양하고, W3110 M25 0mpT D97M 발현균 균체를 사용하여 PMT로부터 모틸린을 절단 및 정제하여 모틸린을 생산하였다. 이는 다음 3 단계로 이루어진다.
그리고, 모틸린 정량은 6% 아세트산, 2M 요소로 희석한 반응액을 실시예 14과 동일한 HPLC 분석법으로 분석하고, 펩티드 연구소로부터 구입하고 인간 모틸린을 표준물질로 사용하여 수행하였다. 또한, 모틸린 순도는 50분간 0.1% 트리플루오르아세트산을 포함하는 0-50% 아세트니트릴의 선형 농구 구배로 용출을 실시한 것을 제외하고는 정량시와 동일 조건의 HPLC로 분석하였다.
(1) W3110 M25 모틸린 융합 단백질 PMT 생산균 및 OmpT 프로테아제 변이체 OmpT D97M 발현균의 2L 스케일 고밀도 배양
W3110 M25 모틸린 융합 단백질 PMT 생산균 및 0mpT 프로테아제 변이체 0mpT D97M 발현균의 2L 스케일 고밀도 배양을 다음과 같이 수행하고, 각각으로부터 봉입체 및 발현균체를 수득하였다. PMT 생산균 및 0mpT D97M 발현균을 50O mL 삼각 플라스크에서 테트라사이클린 1O mg/L를 포함하는 LB 액체 배지 10O mL상에서 37 ℃로 하룻밤동안 선회 배양하였다. 다음날, 이를 4 g/L K2HP04, 4 g/L KH2P04, 2.7 g/L Na2HP04, O.2 g/L NH4Cl, 1.2 g/L (NH4)2SO4, 4 g/L 효모 엑기스, 2 g/L MgSO4·7H20, 40 mg/L CaCl2·2H20, 40 mg/L FeS04·7H20, 10 mg/L MnS04·nH20, 10 mg/L AlCl3·6H20, 4 mg/L CoCl2, 6H20, 2 mg/L ZnS04·7H20, 2 mg/L Na2Mo04·2H20, 1 mg/L CuCl2·2H2O, 0.5 mg/L H3B04, 15 g/L 글루코오스, 10 mg/L 테트라사이클린을 포함하는 배양배지 2 L가 있는 교반 배양기로 옮겨 32 ℃에서 배양을 개시하였다.
글루코오스 고갈 후, 2 %가 되도록 글리세롤을 첨가하고 배양 온도를 37 ℃로 올렸다. 그 후 글리세롤이 고갈할 때마다 2 %가 되도록 글리세롤을 첨가하면서 배양을 계속하였다. 배양 경과는 도 7에 나타내었다. PMT 생산균은 배양 개시 후 24시간 경과시 종료하였고, 배양액 용량 170O mL이었다. 만톤고린으로 균체를 파쇄한 후, 4 ℃에서 6000xg로 10분간 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 이 펠렛을 2000 mL의 탈이온수에 현탁하여, 4 ℃에서 6000xg로 10분간 원심분리하여, 펠렛을 회수하였다. 펠렛은 200O mL의 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 5 mM EDTA, 1% 트리톤-X100에 현탁하여, 4 ℃에서 6000xg로 10 분간 원심분리하여 펠렛을 회수하였다.
이 펠렛을 200O mL의 탈이온수에 현탁하고, 4 ℃에서 6000xg로 10분간 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 동일 조작을 재차 반복하여, 펠렛 26 g을 수득하였다. 이를 26 mL의 탈이온수에 현탁하고, 봉입체 현탁액(OD660 = 250, 45 mL)으로 사용하기 전까지 -20 ℃에서 동결 보존하였다. 0mpT 프로테아제 변이체 W3110 M25 0mpT D97M 발현균은 배양 개시 후 20시간 경과한 다음 배양을 종료하였고, 배양액 용량은 210O mL이었다. 배양액을 4 ℃에서 6000xg로 10분간 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 이를 2000 mL의 TE(10 mM Tris-HC1(pH 8.0), 1 mM EDTA)에 현탁하고, 4 ℃에서 6000xg로 10분간 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 동일 조작을 재차 반복하여, 펠렛 311 g을 수득하였다. 이를 탈이온수에 현탁하고, 균체 현탁액(OD660 = 32O, 39O mL)로 사용하기전까지 -20 ℃에서 동결 보존하였다.
(2) OmpT 프로테아제 변이체 W3110 M25 OmpT D97M 발현균에 의한 봉입체 융 합 단백질 PMT의 절단
10 M 요소 8 mL에 1 M 인산 나트륨(pH 7.0) 1 mL 및 50 mM EDTA O.8 mL를 가하고, 융합 단백질 봉입체 PMT(OD660 = 250) 4 mL을 첨가하여, 봉입체를 용해시켰다. 여기에 빙수 5.2 mL를 가하고, (1)에서 제조한 0mpT 프로테아제 변이체 W3110 M25 0mpT D97M 발현균 현탁액(0D660 = 320) 1 mL을 첨가하여, 반응액 20 mL로 반응을 개시하였다. 반응은 25 ℃에서 120 min-1으로 진탕하여 60분간 수행하였다. 60 분후, 반응액 13.5 mL(W3110 M25 모틸린 융합 단백질 PMT 생산균 배양액 100 mL분의 봉입체에 해당됨)에 40.5 mL의 20 mM 아세트산(pH 4.0)을 첨가하고, 4 ℃에서 25000xg로 l0분간 원심분리하여 상청액을 수득하였다. 이로써, 거의 모든 미반응 융합 단백질, 보호 펩티드 및 대장균 유래 단백질을 제거할 수 있었다.
상기 상청액에 20 mM 아세트산(pH 4.0)을 가하여 용량을 200 mL로 조정하고, 이를 사용하여 정제하였다. 상기 상청액에 20 mM 아세트산(pH 4.0)를 첨가하여 pH를 낮춤으로써, 하기 양이온 교환 크로마토그래피에 흡착시킬 수 있다. 또한, 도 8에 모틸린 적출의 반응 시간을 결정하기 위해, 동일한 조건으로 120분까지 모틸린 유리의 경시 변화를 관찰한 결과를 나타내었다. 또한, 반응 개시 후 60분 경과시, 융합 단백질의 절단을 HPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과를 도 9의 A 및 B에 나타내었다. SDS-PAGE에서 나타난 바와 같이, 반응 개시 60분 경과시 융합 단백질 PMT가 완전히 절단되어 유리되는 모틸린의 증가가 정지되었다. 이에, 반응 시간을 60분으로 하였다.
또한, Arg143-Phe144로 절단되어 생기는 인간 모틸린 뿐만 아니라 Arg139-Arg140이 절단되어 생기는 폴리펩티드(RRAR-motilin)도 검출되었다. SDS-PAGE 상에서는 인간 모틸린 보다 RRAR-모틸린 쪽의 밴드가 진하고 양적으로 많아 보였다(도 9의 B). 그러나, HPLC 분석 결과에서는 인간 모틸린 피크가 RRAR-모틸린 보다 영역이 넓어 양적으로 많은 것으로 확인되어, 이러한 결과(도9A)와 모순되었다. 이는 SDS-PAGE에서, RRAR-모틸린이 인간 모틸린 보다 염색되기 쉬운 것이 원인인 것으로 생각할 수 있다. 따라서, SDS-PAGE에서 밴드의 강도가 정확한 함량비를 반영하는 것은 아닌 것으로 생각된다.
(3) 모틸린의 정제
20 mM 아세트산(pH 4.0)으로 미리 평형화한 아머샴·파마시아 사의 SP-세파로스 패스트 플로우(27 mL, Φ 26 mm X 50 mm)에, 전술한 상청액 200 mL를 주입하였다. 이후, 20 mM 아세트산(pH 4.0) 및 20 mM 아세트산(pH 4.0), 0.1 M NaCl을 각각 10O mL씩 흘려주어, 세정하였다. 용출은 20 mM 아세트산(pH 4.0), 0.1-0.5 M NaCl의 선형 농도 구배로 20O mL 흘려주어, 실시하였다. 양이온 교환 크로마토그래피의 유속은 모두 5 mL/min로 조절하였다. 용출 분획을 5 mL씩 분취하고, HPLC 분석 결과로부터 분획을 선별하여 모았다. 이로써 융합 단백질 PMT가 Argl39-Arg140로 절단되어 생기는 폴리펩티드의 제거를 할 수 있었다.
상기 모운 것을 O.1% 트리플루오르아세트산(TFA)으로 미리 평형화한 Vydac 214 TPB1520(24 mL, Φ 10mm X 30Omm)에 주입하였다. 0.1% TFA l0O mL를 흘려주 어 세정하고, 용출은 0.1% TFA, 0-30% 아세트니트릴의 선형 농도 구배로 20O mL을 흘려주었다. 이 역상 크로마토그래피의 유속은 모두 1.6 mL/min로 수행하였다. 용출 분획을 4 mL씩 분취하고, HPLC 분석 결과로부터 분획을 선별하여 모았다. 본 정제의 결과는 표 3에 나타낸다.
표 3. 인간 모틸린의 정제 결과
정제단계 용량(mL) 인간모틸린 농도(mg/mL) 인간 모틸린(mg) 회수율(%) 순도(%)
반응 13.5 2.32 31 100 5.87
산 침전 200 0.159 32 100 48.8
양이온 교환 40.0 0.591 24 77 94.2
역상 22.5 0.696 16 52 >99.0
W3110 M25 PMT 배양액 0.1 L에 해당되는 봉입체를 이용하여 정제함.
본 정제로 얻어진 표준물질의 HPLC 분석, 질량 분석 및 N 말단 아미노산 분석의 결과는 인간 모틸린의 나타낸 것과 상동하였다. 본 정제에 의해 W3110 M25 모틸린 융합 단백질 PMT 생산균의 배양액 lL로부터 순도 99.0% 이상의 인간 모틸린을 회수율 52%로 160 mg 수득할 수 있음을 나타낸다.
실시예 16. OmpT 프로테아제 변이체를 사용한 융합 단백질로부터 생리활성 폴리펩티드 유리 예
인간 모틸린 이외에 0mpT 프로테아제 변이체를 사용하여 생리 활성 폴리펩티드를 융합 단백질로부터 유리할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 도 11에 나타낸 사람 부신피질 자극 호르몬(1-24) 융합 단백질 PAC 및 인간 칼시토닌 전구체 융합 단백질 PCT를 발현하는 도 10A에 나타낸 구조를 가지는 플라스미드를 구축하고, 이를 W3110 M25에 도입한 형질전환체로부터 각 융합 단백질을 봉입체로 제조하였다. 각각을 OmpT 프로테아제 변이체 D97L 또는 D97H 발현 대장균 W311O M25의 외막 분획과 10분 또는 2시간동안 25 ℃에서 반응시켰다. 대조군으로서 양 융합 단백질 함께 야생형 OmpT 프로테아제를 사용한 반응도 수행하였다. HPLC 결과는 도 12에 나타내었다.
또한, HPLC로 각 융합 단백질의 절단 단편을 분리하여 질량 분석을 수행하였다. HPLC는 YMC PROTEIN RP 컬럼을 사용하여 컬럼 온도 40 ℃에서 유속 1 mL/min으로 수행하였다. 50분간 0.1% 트리플루오르아세트산을 포함하는 10-50% 아세트니트릴의 선형 농도 구배로 용출을 수행하고, 214 nm에서의 흡광도를 모니터링하였다. 융합 단백질 PAC은 야생형 OmpT 프로테아제에 의해 Arg143-Ser144로 절단되어, 사람 부신피질 자극 호르몬 (1-24)이 유리되었다. 또한, Arg140-Arg141에서도 절단되어, RAR-ACTH가 유리되었다. 도 12에는 나타나 있지 않은, Arg143-Ser144 및 Lys158-Lys159도 절단되어, ACTH (1-15) 및 ACTH(16-24)가 생겼다. 또한, PAC는 D97L에 의해 Arg143-Ser144에서 절단되었으며, 사람 부신피질 자극 호르몬(1-24)은 야생형 0mpT 프로테아제에 의한 절단에 비해 2.9배 절단율이 우수하였다.
다른 부위에서 절단되어 발생되는 부산물은 유리되지 않았다. 융합 단백질 PCT는 야생형 OmpT 프로테아제에 의해 Arg139-Arg140및 Arg140-Arg141로 절단되고, RRAR-CT 및 RAR-CT로 유리되었다. PCT7는 D97H에 의해 Arg139-Arg140, Arg141-Ala142 및 Argl43-Cys144로 절단되어, RRAR-CT, AR-CT 및 인간 칼시토닌 전구체로 유리되었다. 모든 융합 단백질에서, 목적으로 하는 생리 활성 폴리펩티드가 변이형 OmpT 프로테아제에 의해 유리되는 것으로 확인되었다. 이로부터 본 실시예로 나타낸 링커 펩티드 서열과 OmpT 프로테아제 변이체를 이용한 생리 활성 폴리펩티드 생산시스템은, 특정한 생리 활성 폴리펩티드에만 이용이 한정되지 않으며, 그 범용성이 매우 넓은 것으로 생각할 수 있다.
실시예 17. 융합 단백질 PMT와 OmpT 프로테아제 변이체 D97M의 공동발현
대장균에서 융합 단백질을 봉입체로 발현시키고, 숙주 대장균이 0mpT 프로테아제를 발현하는 경우, 얻어진 봉입체를 단지 요소에 용해하여 OmpT 프로테아제에 의해 절단되게 된다. 그래서, OmpT 프로테아제 결손 대장균주 W3110 M25를 숙주로서, 융합 단백질 PMT의 발현 플라스미드 pGl17S4HompPMT(실시예 9 참조)와 0mpT 프로테아제 변이체 D97M를 발현하는 플라스미드를 공동발현한 경우에, 인간 모틸린이 봉입체 용해에 의해 유리되는지 여부를 검토하였다. OmpT 프로테아제 변이체 D97M를 발현하는 플라스미드 p0mpTD97M는 pG117S4HompPMT와 복제 오리진이 동일하여, 혼용되지 않는다.
공동발현을 가능하게 하기 위해, pMW218 유래의 0mpT 프로테아제 변이체 D97M 발현 플라스미드(도 l3)를 다음과 같이 구축하였다. 플라스미드 pOmpTD97M(실시예 11 참조)을 주형으로, XhoI 및 HindIII 제한 효소 부위를 포함하는 프라이 머를 사용하여 PCR로 pOmpTD97M의 락토스 프로모터로부터 trpA 전사종결인자까지를 증폭하였다. 수득된 DNA 단편을 XhoI 및 HindIII로 잘라, SalI 및 HindIII로 절단된 pMW218 DNA 단편에 삽입하여, pMW218 유래의 0mpT 프로테아제 변이체 D97M 발현 플라스미드를 제작하였다. W3110 M25 모틸린 융합 단백질 PMT 생산균(실시예 9 참조)에, 도 13에 나타낸 pMW218 유래의 0mpT 프로테아제 변이체 D97M 발현 플라스미드를 형질전환하였다.
이 W311O M25 재조합 대장균을 2 L 삼각 플라스크에서 테트라사이클린 10 mg/L 및 카나마이신 20 mg/L를 포함하는 LB 액체 배양배지 40O mL상에서 37 ℃로 하룻밤동안 선회 배양하였다. 봉입체의 제조시 모두 탈이온수를 사용하여 세정하였으며, 이외는 통상적인 방법으로 수행하였다. 수득한 봉입체로부터 인간 모틸린의 유리 반응은 다음과 같이 수행하였다. 10 M 요소 160 μL에 1 M 인산나트륨(pH 7.0) 20 μL, 및 50 mM EDTA 16 μL를 가하고, 융합 단백질 봉입체(OD660 = 10O) 8O μL를 첨가하여, 봉입체를 용해하였다. 여기에 물 124 μL 더하여 반응을 개시하였다.
반응은 25 ℃에서 수행하였고, 반응 개시 후 20, 40, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 1440 분 경과시 샘플링하여 SDS-PAGE로 분석하였다(도 14). 분석 결과, 1440분, 즉 24시간 반응시 융합 단백질 PMT가 완전하게 절단되었다. 이로부터 실시예 15와 같이 0mpT 프로테아제 변이체 D97M를 발현하는 플라스미드 pOmpTD97M의 형질전환 대장균을 사용하는 경우, 신속하지 않지만, 반응 시간을 길게 함으로써 공동발현균으로부터 얻어진 봉입체을 용해하는 것만으로도 융합 단백질 PMT를 완전히 절단할 수 있어, 인간 모틸린을 유리할 수 있는 것으로 확인되었다.
실시예 18. 융합 단백질 PMT, PMT6D, PMT7D와 OmpT 프로테아제 변이체 D97M의 반응
실시예 14의 결과로부터 0mpT 프로테아제 변이체 D97M에 의해 융합 단백질 PMT로부터 모틸린이 생성되는 것을 알 수 있었지만, Arg139-Arg140에서도 절단되어 부산물인 RRAR-모틸린이 생성되었다. 한편, 실시예 8의 결과로부터 절단이 불필요한 부위의 P3 또는 P4 위치에 산성 아미노산인 아스파르트산을 배치함으로써 그 부위에서의 절단을 억제할 수 있음을 확인하였다.
모틸린 융합 단백질 PMT의 Arg139-Arg140는 절단이 불필요한 부위 이므로, 도 15에 나타낸 모틸린 융합 단백질 PMT6D, PMT7D를 발현하는 도 10A에 나타낸 구조를 가지는 플라스미드를 제작하고, 이들을 W311O M25 대장균에 형질전환하여, 이들 융합 단백질을 봉입체으로 회수하고, 이들 봉입체를 사용하여, 모틸린 융합 단백질 농도 4 mg/mL (0D660는 대략 20), 4 M 요소, 2 mM EDTA, 50 mM 인산 나트륨, 0mpT 프로테아제 변이체 D97M 0.52 mg/mL (OD660는 1)로 25 ℃에서 2시간 반응시켰다. 그리고, 봉입체 단백질 농도는 HPLC로 다음과 같이 측정하였다. 6% 아세트산, 2 M 요소에 봉입체를 0D660 = 1이 되도록 첨가하고, 10000xg에서 3분간 원심분리한 다음 상청액 50 μL를 YMC PROTEIN RP 컬럼에 주입하였다. HPLC 컬럼 온도는 40 ℃이 며, 유속 1 mL/min로 수행하였다.
40분간 0.1% 트리플루오르아세트산을 포함하는 20-60% 아세트니트릴의 선형 농도 구배로 용출시키고, 220 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 소혈청 알부민(BSA)을 사용하여 봉입체 단백질 농도를 결정하였다. 또한, 대장균의 외막 분획내 OmpT 프로테아제 변이체 D97M의 현탁액(OD660 = 0.5)을 SDS-PAGE에 전기영동하고, 표준물질로 정제 OmpT를 사용하여, 덴시토미터로 변이체 농도를 측정하였다. 반응액의 HPLC 분석 결과는 도 16, 17 및 18에 나타내었다. 모틸린 융합 단백질 PMT, PMT6D, PMT7D로부터 각각 280, 250, 370 μg/mL의 모틸린이 유리되었다.
또한, 각각으로부터 유리된 모틸린 농도를 100으로 한 경우의 부산물 AR-모틸린(Arg141-Ala142로 절단되어 생성됨), RRAR-모틸린(Arg139-Arg140로 절단되어 생성됨)의 농도를 도 16 - 도 18에 나타내었다. PMT(도 16) 부산물이 각각 2.8, 33%로 생성되고, PMT 6D(도 17)는 3.5, 16%로 생성되었으며, 특히 RRAR-모틸린의 생성은 억제되었다. 또한, PMT7D(도 18)에서는 RRAR-모틸린 유래의 피크가 검출되지 않았다. 이는 실시예 8의 결과에 일치하는 것으로, OmpT 변이체 효소를 사용한 경우에도 절단을 원하는 하지 않는 부위의 P3 또는 P4 위치에 산성 아미노산인 아스파르트산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제할 수 있음을 알 수 있었다. PMT7D로부터 가장 많이 모틸린이 유리된 것은(370 μg/mL), 부산물이 생성하지 않아 모틸린 유리 농도가 높아졌기 때문인 것으로 생각된다.
하기에, 본 발명에 따른 각종 융합 단백질 각각의 기본적인 전체 아미노산 서열을 개시한다.
융합 단백질 PRR(서열번호 1, 도 1, 실시예 1-2, 13)
PRR 관련 서열
Figure 112006021559675-pct00001
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7-37)(GLP-1(7-37))의 아미노산 서열이고, 이중 밑줄은 0mpT 프로테아제 절단 부위인 염기성 아미노산(Arg140-Arg141)이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌에서부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 153번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
PA-유도체 융합 단백질(서열번호 2, 도 2, 실시예 1-2)
PA 서열
Figure 112006021559675-pct00002
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7- 37)(GLP-1(7-37))의 아미노산 서열이고, 2중 밑줄은 0mpT 프로테아제 절단 부위인 염기성 아미노산(Arg140-Arg141)이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌으로부터 127번 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번 아미노산인 글루타민으로부터 153번 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
PA3'-유도체융합 단백질(서열번호 3, 도 2-3, 실시예 3-6)
PA3' 서열
Figure 112006021559675-pct00003
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7- 37)(GLP-1(7-37))의 아미노산 서열이고, 2중 밑줄은 0mpT 프로테아제 절단 부위(Arg140-Arg141및 Arg143-Ala144)이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌 으로부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 153번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
PA23'-유도체 융합 단백질(서열번호 4, 도 3-4, 실시예 5-8)
PA23' 서열
Figure 112006021559675-pct00004
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 글루카곤계 펩티드-1(7- 37)(GLP-1(7-37))의 아미노산 서열이고, 2중 밑줄은 0mpT 프로테아제 절단 부위(Arg139-Arg140, Arg140-Arg141 및 Arg143-Ala144)이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번 째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인메티오닌으로부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 153번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
융합 단백질 PRMT(서열번호 5, 도 5, 실시예 9-10, 14)
PRMT 서열
Figure 112006021559675-pct00005
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 모틸린의 아미노산 서열이고, 2중 밑줄은 융합 단백질 PRR의 0mpT 프로테아제 절단 부위 P1 위치에 해당되는 아르기닌(Arg140)이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌으로 부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 140번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
융합 단백질 PMT(서열번호 6, 도 5, 실시예 9-10, 14-15, 17-18)
PMT 서열
Figure 112006021559675-pct00006
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 모틸린의 아미노산 서열이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌으로부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 143번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루 어진다.
융합 단백질 PAC(서열번호 7, 도 11, 실시예 16)
PAC 서열
Figure 112006021559675-pct00007
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 부신피질 자극 호르몬(1-24)의 아미노산 서열이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌으로부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 143번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
융합 단백질 PCT(서열번호 8, 도 11, 실시예 16)
PCT 서열
Figure 112006021559675-pct00008
상기 아미노산 서열에서, 밑줄은 인간 칼시토닌 전구체의 아미노산 서열이다. 대장균의 β-갈락토시다제의 N 말단에서 117번째까지의 아미노산으로부터 유래된 보호 보호 단백질(β-gal117S4H)은 1번째 아미노산인 메티오닌으로부터 127번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열으로 이루어진다. 링커 펩티드는 128번째 아미노산인 글루타민으로부터 143번째 아미노산인 아르기닌까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
SEQUENCE LISTING <110> Daiichi Suntory Pharma Co., LTD. <120> Method for cleavage of polypeptide using OmpT protease variant <130> P860 <160> 8 <210> 1 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PRR fusion protein <400> 1 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly 130 135 140 Ser Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 165 170 175 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 180 <210> 2 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PA fusion protein <400> 2 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 165 170 175 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 180 <210> 3 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PA3' type fusion protein <400> 3 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ala Arg Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 165 170 175 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 180 <210> 4 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PA23' type fusion protein <400> 4 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Ala 130 135 140 Ala Gly Ser Pro Tyr Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 145 150 155 160 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 165 170 175 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 180 <210> 5 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PRMT type fusion protein <400> 5 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Lue Arg Leu Tyr Arg Phe Val Pro Ile 130 135 140 Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys 145 150 155 160 Gly Gln <210> 6 <211> 165 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PMT type fusion protein <400> 6 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Phe 130 135 140 Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu 145 150 155 160 Arg Asn Lys Gly Gln 165 <210> 7 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PAC type fusion protein <400> 7 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Ser 130 135 140 Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg 145 150 155 160 Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro 165 <210> 8 <211> 176 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Basic amino acid sequence of PCT type fusion protein <400> 8 Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp 1 5 10 15 Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro 20 25 30 Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro 35 40 45 Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe 50 55 60 Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu Asp Leu Pro Glu Ala 65 70 75 80 Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr 85 90 95 Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro 100 105 110 Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His Pro Gly Gly Arg Gln 115 120 125 Met His Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Cys 130 135 140 Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn 145 150 155 160 Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly 165 170

Claims (38)

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  12. 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알 라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
  13. 폴리펩티드내 원하는 절단 부위에 대한 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 P1' 위치가 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 경우에, 0mpT 프로테아제의 N 말단에서 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
  14. 폴리펩티드내 원하는 절단 부위의 P1 위치가 아르기닌 또는 라이신이고 Pl'위치가 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산이며, P10 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열내 임의의 부위에 1개의 염기성 아미노산 또는 2개 또는 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하고, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 상기 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 절단 방법.
  15. 원하는 절단 부위가, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단되는 절단 부위를 매개로, 보호 펩티드와 융합된 목적 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    상기 세포에서 상기 유전자를 발현시켜, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단됨으로써 상기 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
  16. 원하는 절단 부위가, 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단되는 절단 부위를 매개로, C 말단이 아르기닌 또는 라이신인 보호 펩티드와 융합된, N 말단이 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 목적 펩티드로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    상기 세포에서 상기 유전자를 발현시켜, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단됨으로써 상기 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
  17. 원하는 절단 부위를 매개로, C 말단이 아르기닌 또는 라이신인 보호 펩티드와 융합된, N 말단이 아르기닌 또는 라이신 이외의 아미노산인 목적 펩티드로 이루어진 융합 단백질내에, 상기 절단 부위에 대한 P10 위치에서 P3 위치까지의 또는 P3' 위치에서 P5' 위치까지의 아미노산 서열내 임의의 부위에 1개의 염기성 아미노산 또는 2개 또는 3개의 염기성 아미노산을 연속 배치하고, 상기 절단 부위가 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의해 절단되는 절단부위인 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 가지는 발현 플라스미드로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    상기 세포에서 상기 유전자를 발현시켜, 상기 절단 부위가 상기 프로테아제에 의해 절단됨으로써 상기 융합 단백질로부터 목적 펩티드가 수득되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드의 제조 방법.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내에 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의한 절단이 불필요한 부위가 존재하는 경우, 상기 부위에 대한 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P10 위치 및 P3 위치 사이에 2회 또는 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P5 위치 및 P3 위치 사이에 3회 연속하여 염기성 아미노산을 배치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제14항 또는 제17항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌 및/또는 라이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 염기성 아미노산은 아르기닌 및/또는 라이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,상기 염기성 아미노산은 아르기닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하여, 폴리펩티드내 원하는 절단 부위를 절단하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 절단 방법 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위를 절단하는 단계를 포함하는 목적 펩티드의 제조방법으로서,
    상기 폴리펩티드내 또는 상기 융합 단백질내에 OmpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체에 의한 절단이 불필요한 부위가 존재하는 경우, 상기 부위에 대한 P3 위치에 산성 아미노산을 배치함으로써 상기 부위에서의 절단을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 산성 아미노산은 아스파르트산인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 산성 아미노산은 아스파르트산인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P5 위치로부터 P1 위치까지의 아미노산 서열이 Arg-Arg-Arg-Ala-Arg인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P7 위치로부터 P1 위치까지의 아미노산 서열이 Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산은 루신, 메티오닌 또는 히스티딘인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P1' 위치 또는 목적 펩티드의 N 말단은 세린 또는 알라닌이고, 97번째 아미노산은 루신인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P1' 위치 또는 목적 펩티드의 N 말단은 페닐알라닌, 알라닌, 세린, 시스테인 또는 티로신이고, 97번째 아미노산은 메티오닌인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드내 또는 융합 단백질내 원하는 절단 부위에 대한 P1' 위치 또는 목적 펩티드의 N 말단은 알라닌, 발린, 이소루신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인 또는 아스파라긴이고, 97번째의 아미노산은 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제15항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 펩티드는 22개 내지 45개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 목적 펩티드는 부신피질 자극 호르몬(1-24), 모틸린 또는 칼시토닌 전구체인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제15항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 0mpT 프로테아제를 코딩하는 유전자, 또는 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 코딩하는 유전자를 발현하는 균체 자체를, 절단용 프로테아제로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제12항 내지 제17항, 제25항, 및 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 0mpT 프로테아제를 코딩하는 유전자, 또는 0mpT 프로테아제의 N 말단으로부터 97번째의 아미노산이 알라닌, 루신, 페닐알라닌, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 글루탐산 또는 히스티딘인 0mpT 프로테아제의 97번 아미노산 변이체를 코딩하는 유전자와, 상기 프로테아제에 의해 절단될 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 공동발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
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