CN1860226B - 使用OmpT蛋白酶突变体的多肽的切断方法 - Google Patents

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Abstract

具有以下特征的多肽的切断方法：与多肽中希望的切断部位相关的P1位为精氨酸或赖氨酸，P1’为天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸，在从P10位至P3或从P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位连接配上1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸(但是，配置1个碱性氨基酸时，除去P6或P4位)，使用OmpT蛋白酶或对其N末端至第97位的氨基酸进行了置换的突变酶，在该多肽中的希望切断部位进行切断。

Description

使用OmpT蛋白酶突变体的多肽的切断方法
技术领域
本发明涉及到利用大肠杆菌具有的OmpT蛋白酶或其突变体，从融合蛋白直接切出生理活性肽、蛋白质和它们的衍生物的方法。详细讲涉及到在使用大肠杆菌成熟型OmpT蛋白酶的融合蛋白的切断中，通过在切断部位的P3位、P4位以及P5位配置碱性氨基酸，使该切断部位的P1位和P1’位间的肽键的切断率上升的方法，以及使用对OmpT蛋白酶的N末端的第97位氨基酸进行置换后对该P1’位的底物特异性改变了的突变体，即使在P1’位的氨基酸为精氨酸或赖氨酸以外的氨基酸的情况也可以从融合蛋白有效游离、生产生理活性肽、蛋白质和它们的衍生物的方法。
背景技术
大肠杆菌OmpT蛋白酶是存在于大肠杆菌外膜级分中，主要是有选择地切断碱性氨基酸对间的肽键的蛋白酶。与该大肠杆菌OmpT蛋白酶氨基酸序列具有同源性、而且具有或推定有蛋白酶活性的蛋白质在沙门氏菌(Salmonella)、耶尔森氏菌(Yersinia)、志贺氏菌(Shigella)等肠内菌中也发现了，这样的一组蛋白质被称为omptin family。
大肠杆菌OmpT蛋白酶分子量约为33500。Sugimura等研究了OmpT蛋白酶底物特异性，报告了本酶是特异切断精氨酸-精氨酸、赖氨酸-赖氨酸、精氨酸-赖氨酸以及赖氨酸-精氨酸碱性氨基酸对之间的肽键的酶(Sugimura，K.and Nishihara，T.J.Bacteriol.170：5625-5632，1988)。
但是，本酶并不切断所有的碱性氨基酸对，不用说其特异性高。例如，虽然在人γ-干扰素中有10个地方存在碱性氨基酸，但10个当中只有2个地方被切断(Sugimura，K.and Higashi，N.J.Bacteriol.170：3650-3654，1988)。这可认为作为底物的人γ-干扰素的空间结构以及碱性氨基酸对周边的酶识别的部位的氨基酸序列的影响造成的。
在本说明书中，根据Schechter和Berger的表记方法(Schechter，I.and Berger，A.Biochem.Biophys.Res.Commun.27：157-162，1967)表记底物的氨基酸的位置。即，在Pn...P2-P1-P1’-P2’...Pn’中，P1位和P1’位间的肽键是切断部位，氨基酸用单字母或3字母表示，↓为切断部位。
例如，当氨基酸序列-亮氨酸-酪氨酸-赖氨酸-精氨酸-组氨酸-在赖氨酸与精氨酸间被切断时(-Leu-Tyr-Lys↓Arg-His-)，亮氨酸成为P3位，酪氨酸为P2位，赖氨酸为P1位，精氨酸为P1’位，组氨酸为P2’位的氨基酸。
另外，即使在切断部位及其周边氨基酸序列中导入氨基酸置换后，不受到切断的情况或新的切断部位生成的情况中，只要是没有特别说明，作为原来序列上的对应氨基酸的位置应当使用上述表记。
到目前为止，在碱性氨基酸对以外的氨基酸序列中也发现了OmpT蛋白酶切断部位，Dekker等人报告了使用由Ala-Arg-Arg-Ala(P2-P1↓P1’-P2’)氨基酸序列构成的在OmpT蛋白酶底物中导入了氨基酸置换的底物，OmpT蛋白酶一方面对作为切断部位的P1位的氨基酸-碱性氨基酸精氨酸和赖氨酸表现出高的特异性，另一方面对于P1’位的氨基酸表现出宽容(Dekker，N.et al.Biochemistry40：1694-1701，2001)。
本发明人发现在有尿素存在的多肽变性条件下，用本酶能够切断的融合蛋白的P1’位导入了氨基酸置换的融合蛋白作为底物，P1’位的氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸、以及脯氨酸以外的氨基酸时可切断(Okuno，K.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.66：127-134，2002，特愿2000-602803)。但是，在这些场合下，切断效率比P1’位氨基酸为精氨酸或赖氨酸的场合低。
关于对切断部位周边序列的特异性，当在P2位或P2’位配置酸性氨基酸时显示不受到切断(Dekker，N.et al.Biochemistry40：1694-1701，2001)。
另外，本发明人报告了在P4位或P6位配置碱性氨基酸精氨酸或赖氨酸时切断效率增加，相反配置酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸时，切断效率降低(Okuno，K.et al.Biotechnol.Appl.Biochem.36：77-84，2002，特愿2000-602803)。
有关对其它的切断部位周边序列的特异性虽然还不清楚，但由OmpT蛋白酶可切断碱性高的抗菌肽鱼精蛋白(Stumpe，S.etal.J.Bacteriol.180：4002-4006，1998)、以及与蛋白酶活性相关的OmpT蛋白酶菌体外结构域存在很多酸性氨基酸(Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.20：5033-5039，2001)推测电荷产生的作用对于OmpT蛋白酶和底物间的相互作用很重要。
有关OmpT蛋白酶的应用方面，由于对切断部位特异性高，另外由于是存在于大肠杆菌外膜的蛋白酶，所以本蛋白酶当使目的肽从通过基因重组技术制作的融合蛋白游离时，可用作加工酶(processingenzyme)。
Hanke等人在使用大肠杆菌的胆固醇酯酶的分泌生产中，使该酶与大肠杆菌溶血素A蛋白融合分泌到菌体外后，使存在于外膜的OmpT蛋白酶作用，由融合蛋白得到有活性的胆固醇酯酶上获得了成功。他们配置具有精氨酸-赖氨酸序列的链，用OmpT蛋白酶切断该序列(Hanke，C.et al.Mol.Gen.Genet.233：42-48，1992)。
另外，本发明人等发现了OmpT蛋白酶对变性剂具有抗性，表明通过利用这一性质，可以在变性剂存在下能够切断以包涵体表达的融合蛋白。即，在通过大肠杆菌表达体系以包涵体表达金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)V8蛋白酶衍生物融合蛋白，通过尿素使包涵体溶化后，在尿素存在下使OmpT蛋白酶作用，从融合蛋白中游离出V8蛋白酶衍生物部分，不用进行重折叠生产具有酶活性的V8蛋白酶衍生物(Yabuta，M.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.44：118-125，1995)方面获得了成功。
通常，由融合蛋白使目的多肽或目的蛋白质游离时，作为加工酶常常使用对氨基酸序列特异性高的酶。在这方面使用的蛋白酶中已知有Xa因子、凝血酶、肠激酶等，这些酶都是起源于哺乳类的酶，由于其供给量低、费用高，所以不适合通过融合蛋白法进行肽和蛋白质的工业上大量处理。另外就目的多肽、蛋白质作为医药品使用时，来自酶的病毒污染以及作为疯牛病的起因因子的变性朊蛋白的污染也必须考虑。
OmpT蛋白酶由于来源于大肠杆菌，显然作为加工酶使用时在供给量、费用以及安全性方面比上述的酶更优越。另外，OmpT蛋白酶由于也存在于包涵体，所以在以包涵体使融合蛋白表达时，仅通过尿素等变性剂对融合蛋白进行溶解，酶就可作用。另外，由于OmpT蛋白酶存在于大肠杆菌外膜，所以通过将菌体本身添加到反应体系中，就可以进行OmpT蛋白酶反应(Grodberg，J.andDunn，J.J.J.Bacteriol.170：1245-1253)。
在药品制造等工业上肽生产中，对大肠杆菌生产的融合蛋白进行加工，得到目的多肽时使用的很多蛋白酶由于都不是来自大肠杆菌，所以需要纯化后使用。因此，由于不需要纯化、只是添加大肠杆菌菌体本身、外膜级分或溶解包涵体，将OmpT蛋白酶作为加工蛋白酶使用对大幅度改善多肽的生产成本有用。然而，在以往使用大肠杆菌OmpT蛋白酶的融合蛋白的加工中，游离的多肽的N末端氨基酸除一部分例外，都被限定于赖氨酸或精氨酸。
OmpT蛋白酶的有用性虽然很大，但本发明以前，将OmpT蛋白酶作为融合蛋白的切断酶使用时，但在对切断部位及其周边的氨基酸序列怎样设计，在希望的部位是否可进行特异、而且有效切断方面的知识有限。因此，可有效切断的目的多肽的N末端氨基酸的种类受到限定。所以出现可得到的目的多肽的种类受到限制，或即使可以切断，也不能进行有效切断的问题。
专利文献1：特愿2000-602803
非专利文献1：Sugimura，K.and Nishihara，T.J.Bacteriol.170：5625-5632，1988
非专利文献2：Sugimura，K.and Higashi，N.J.Bacteriol.170：3650-3654，1988
非专利文献3：Schechter，I.and Berger，A.Biochem.Biophys.Res.Commun.27：157-162，1967
非专利文献4：Dekker，N.et al.Biochemistry 40：1694-1701，2001
非专利文献5：Okuno，K.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.66：127-134，2002
非专利文献6：Okuno，K.et al.Biotechnol.Appl.Biochem.36：77-84，2002
非专利文献7：Stumpe，S.et al.J.Bacteriol.180：4002-4006，1998
非专利文献8：Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.20：5033-5039，2001
非专利文献9：Hanke，C.et al.Mol.Gen.Genet.233：42-48，1992
非专利文献10：Yabuta，M.et al.Appl.Microbiol.Biotechnol.44：118-125，1995
非专利文献11：Grodberg，J.and Dunn，J.J.J.Bacteriol.170：1245-1253，1988
发明内容
在本发明中，作为本发明的课题就是克服上述的问题，作为加工酶利用OmpT蛋白酶或其突变体，使所有种类的目的多肽从融合蛋白中有效、且特异游离的方法，即将目的多肽的N末端氨基酸作为P1’位氨基酸残基，只对融合蛋白的P1-P1’一个地方进行有效切断。
对于上述课题，本发明人对OmpT蛋白酶的切断部位及其周边氨基酸序列进一步研究，如果发现新的切断方法或识别·切断序列，就可以解决上述那些限制，可认为本酶作为融合蛋白的加工酶更有用。另外，认为向OmpT蛋白酶本体导入部位特异的突变后，制作底物特异性与野生型不同的OmpT蛋白酶突变体，利用该突变体也是可能的。
由于切断部位周边的氨基酸序列对于OmpT蛋白酶的底物识别与切断重要，因此本发明人为了利用已知的切断部位，通过对切断部位及其周边氨基酸序列进行研究，找出新的底物特异性，将该特异性应用于融合蛋白的切断中进行了不断研究。
本发明中所谓「OmpT蛋白酶」指的是信号肽被除去后的来自大肠杆菌的成熟型OmpT蛋白酶或该OmpT蛋白酶以外的具有OmpT蛋白酶活性的蛋白质(OmpT样蛋白酶)。作为OmpT样蛋白酶如(1)鼠疫杆菌纤溶酶原激活物(Yersinia pestis plasminogen activator)、(2)鼠伤寒沙门氏杆菌E蛋白(Salmonella typhimurium E protein)、(3)大肠杆菌(Escherichia coli)以及(4)Shigella flexneri SopA等。
在本发明中所谓「OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体」指的是上述的OmpT蛋白酶的第97位的天冬氨酸(Asp97)被其它的氨基酸置换后的OmpT蛋白酶突变体或在上述OmpT样蛋白酶的氨基酸序列中对相当于从OmpT蛋白酶的N末端的97位氨基酸的氨基酸进行置换的突变体(OmpT样蛋白酶相当97位氨基酸突变体)。
作为置换OmpT蛋白酶的第97位的天冬氨酸的其它氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸。另外，作为OmpT样蛋白酶相当97位氨基酸突变体，在上述OmpT样蛋白酶中，(1)对于Yersiniapestis plasminogen activator，以117位(用在含有信号肽的全氨基酸序列中从N末端开始的氨基酸残基的数字表示。与OmpT的情况同样，如果用含有信号肽的氨基酸残基数表示，97位氨基酸变成了117位)的天冬氨酸、(2)对于鼠疫杆菌纤溶酶原激活物，将134位的天冬氨酸、(3)对于大肠杆菌OmpP将117位的天冬氨酸、以及(4)对于Shigella flexneri SopA将117位的天冬氨酸置换为例如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸后的突变体。
在本发明中所谓「目的肽」指的不仅是最终希望得到的肽，也包括从融合蛋白通过OmpT蛋白酶等切断后，再接受修饰反应或切断反应的制造中间体(所谓的前体肽)。
本发明中所谓「保护肽」是通过连接肽与目的肽构成融合蛋白的肽，也包括连接肽的意思。
在本发明中所谓「希望的切断部位」指的是多肽中的任意部位、由保护肽和通过连接肽融合的目的肽构成的融合蛋白中的连接肽C末端与目的肽N末端之间的部位或该连接肽中的任意部位。
本发明的主要的主题涉及到以下的(1)～(4)事项。
(1)以多肽中希望的切断部位涉及到的P1位为精氨酸或赖氨酸，P1’为天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸，在从P10位至P3或从P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位连续配置1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸(但是，配置1个碱性氨基酸时，除去P6或P4位)，使用OmpT蛋白酶在该多肽中希望的切断部位进行切断为特征的多肽的切断方法，以及以使用该切断方法从融合蛋白获得目的肽为特征的目的肽的制造方法。
(2)以使用OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体在多肽中希望的切断部位进行切断为特征的多肽的切断方法，以及以使用该切断方法从融合蛋白获得目的肽为特征的目的肽的制造方法。
(3)上述(2)所述的方法，其中，多肽中希望的切断部位涉及到的P1位为精氨酸或赖氨酸，P1’位为精氨酸或赖氨酸以外的氨基酸，在从P10位至P3或从P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位连续配置1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸。
(4)多肽的切断方法，其使用OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体在多肽中希望的切断部位进行切断，特征为当该多肽中不希望被蛋白酶切断的部位存在时，通过在该部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在该部位的切断。以及以使用该切断方法从融合蛋白获得目的肽为特征的目的肽的制造方法。
上述(1)是基于下述见解完成的，即通过将OmpT蛋白酶的切断部位的优选从P10位至P3(但是，只是P6或P4位的一处被碱性氨基酸置换的情况除去)，特别优选P5位至P3位的氨基酸置换为碱性氨基酸，切断率增加。但是由于OmpT具有容易切断连续的碱性氨基酸之间的肽键的性质，所以在P5位至P3位配置连续的碱性氨基酸时，这些部位的肽键可被OmpT切断。
可是，利用OmpT对3个连续的精氨酸的切断率比2个连续精氨酸的情况减少的已知性质，当在P5位至P3位配置3个连续的精氨酸时可抑制P5位至P3位的精氨酸之间的切断。即由此可促进在希望的部位的切断(P1位和P1’位的氨基酸之间的切断)，抑制在不希望的部位的切断(P5位至P3位的氨基酸之间的切断)。
由以上现象发现在希望的多肽中设计在希望切断部位的P3位、P4位以及P5位配置了碱性氨基酸(优选是精氨酸)的氨基酸序列，不仅对于该多肽中的希望的切断部位的P1’位为以往的精氨酸或赖氨酸的情况，而且对于除天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的其它氨基酸的情况OmpT蛋白酶也可非常有效地进行切断。
另外，该方法特别适合使含有目的肽的融合蛋白在大肠杆菌宿主中制造、通过大肠杆菌本来具有的或通过基因工程导入的OmpT蛋白酶从融合蛋白中切出在希望的切断部位的P1’位至C末端侧配置的N末端氨基酸为除天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸的目的肽。
关于上述(2)和(3)，发现当将从OmpT蛋白酶N末端开始的第97位氨基酸置换为特定的氨基酸时，在OmpT蛋白酶不能切断的切断部位实际上也可以切断，在目的肽的制造中由于对该肽的N末端氨基酸的种类可进行多样选择，所以有用性非常高。特别是在使用融合蛋白的目的肽的制法中，通过将与融合蛋白连接的连接序列设计为-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-目的肽，而且通过将从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位天冬氨酸特别优选置换为亮氨酸、蛋氨酸或组氨酸的蛋白酶突变体作为加工蛋白酶利用，即使可被游离的多肽的N末端氨基酸为赖氨酸或精氨酸以外的氨基酸也有效、且可特异游离。
在本申请中涉及到的实施例中，可以认为虽然使用来自大肠杆菌的OmpT蛋白酶的突变体可实施融合蛋白的切断，但使用OmpT蛋白酶以外的具有OmpT蛋白酶活性的酶或在其氨基酸序列中对从相当于OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸的氨基酸进行置换的突变体切断融合蛋白也是十分可能的。
另外，关于上述(4)，发现当多肽或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶及其异构体切断的部位存在时，通过在该部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在该部位的切断。这一见解特别是在由融合蛋白获得目的肽时的融合蛋白的设计中有用，可以非常有效地进行目的肽的制造。
更具体地讲，本发明涉及到以下事项。
(1)一种多肽的切断方法，其特征是：与多肽中希望的切断部位相关的P1位为精氨酸或赖氨酸，P1’为天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸，在从P10位至P3或从P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位连续配置1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸(但是，配置1个碱性氨基酸时，除去P6或P4位)，使用OmpT蛋白酶在该多肽中希望的切断部位进行切断。
(2)一种目的肽的制造方法，其特征是：用含有编码融合蛋白的基因的表达质粒转化宿主细胞，所述融合蛋白由通过希望的切断部位与C末端为精氨酸或赖氨酸的保护肽融合的N末端为天冬氨酸、谷氨酸或脯氨酸以外的氨基酸的目的肽构成，在融合蛋白质中该切断部位的P10位至P3或P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位连续配置1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸(但是，配置1个碱性氨基酸时，除去P6或P4位)，上述切断部位作为可被OmpT蛋白酶切断的切断部位，在该细胞内使该基因表达，通过上述蛋白酶在上述切断部位切断，可以由融合蛋白获得目的肽。
(3)上述(1)或(2)所述的方法，其中，当多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶切断的部位存在时，通过在该部位的P3位配置酸性氨基酸，可抑制在该部位的切断。
(4)上述(1)至(3)中任一项所述的方法，其中在多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P10～P3位之间配置2或3个连续的碱性氨基酸。
(5)上述(4)中所述的方法，其中在多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P5～P3位配置3个连续的碱性氨基酸。
(6)上述(1)～(5)中任一项所述的方法，其中碱性氨基酸为精氨酸和/或赖氨酸。
(7)上述(6)所述的方法，其中碱性氨基酸为精氨酸。
(8)一种制造方法，该方法是使用OmpT蛋白酶在多肽中希望的切断部位进行切断的多肽的切断方法或在融合蛋白中希望的切断部位进行切断目的肽的制造方法，其特征是当在该多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶切断的部位存在时，通过在该部位的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在该部位的切断。
(9)上述(3)～(8)中任一项所述的方法，其中酸性氨基酸为天冬氨酸。
(10)上述(1)～(9)中任一项所述的方法，其中多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(11)上述(1)～(9)中任一项所述的方法，其中多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(12)一种多肽的切断方法，其特征是：使用从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体，在多肽中希望的切断部位进行切断。
(13)一种多肽的切断方法，其特征是：当多肽中与希望的切断部位相关的P1位为精氨酸或赖氨酸、P1’位为精氨酸或赖氨酸以外的氨基酸时，使用从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体，在多肽中希望的切断部位进行切断。
(14)一种多肽的切断方法，其特征是：当多肽中与希望的切断部位相关的P1位为精氨酸或赖氨酸，P1’位为精氨酸或赖氨酸以外的氨基酸，在从P10位至P3或从P3’至P5’位的氨基酸序列中的任意部位连续配置1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸，使用从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体，在多肽中希望的切断部位进行切断。
(15)一种目的肽的制造方法，其特征是：用含有编码在希望的切断部位，通过可被从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体切断的切断部位与保护肽融合的目的肽构成的融合蛋白的基因的表达质粒转化宿主细胞，在该细胞内使上述基因表达，通过上述蛋白酶在上述切断部位进行切断，可从融合蛋白获得目的肽。
(16)一种目的肽的制造方法，其特征是：用含有编码融合蛋白的基因的表达质粒转化宿主细胞，其中在希望的切断部位，通过可被从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位的氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体切断，所述融合蛋白由通过该切断部位与C末端为精氨酸或赖氨酸的保护肽融合的N末端为精氨酸或赖氨酸酸以外的氨基酸的目的肽构成，在该细胞内使该基因表达，通过上述蛋白酶在上述切断部位进行切断，可从融合蛋白获得目的肽。
(17)一种目的肽的制造方法，其特征是：用含有编码融合蛋白的基因的表达质粒转化宿主细胞，所述融合蛋白是通过在希望的切断部位与C末端为精氨酸或赖氨酸的保护肽融合的N末端为精氨酸或赖氨酸酸以外的氨基酸的目的肽构成，在融合蛋白质中与该切断部位相关的P10至P3位或P3’位至P5’位的氨基酸序列的任意部位连续配置1个碱性氨基酸或2个或3个碱性氨基酸，上述切断部位作为可被从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体切断的切断部位，在该细胞内使该基因表达，通过上述蛋白酶在上述切断部位进行切断，可从融合蛋白获得目的肽。
(18)上述(12)～(17)任一项所述的方法，其特征是包括当多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶第97位氨基酸突变体切断的部位存在时，通过在与该部位相关的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在该部位的切断。
(19)上述(12)～(18)任一项所述的方法，其特征是包括在多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P10～P3位之间配置2或3个连续的碱性氨基酸。
(20)上述(19)中所述的方法，在多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P5～P3位配置3个连续的碱性氨基酸。
(21)上述(14)、(17)～(20)任一项所述的方法，其中碱性氨基酸为精氨酸和/或赖氨酸。
(22)上述(21)所述的方法，其中碱性氨基酸为精氨酸。
(23)一种制造方法，该方法是包括使用OmpT蛋白酶第97位氨基酸突变体在多肽中希望的切断部位进行切断的多肽的切断方法或包括在融合蛋白中希望的切断部位进行切断的目的肽的制造方法，其特征是当多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体切断的部位存在时，通过在与该部位相关的P3位配置酸性氨基酸，可以抑制在该部位的切断。
(24)上述(18)～(23)中任一项所述的方法，其中酸性氨基酸为天冬氨酸。
(25)上述(12)～(24)中任一项所述的方法，其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(26)上述(12)～(24)中任一项所述的方法，其中多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
(27)上述(12)～(26)中任一项所述的方法，其中从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸是亮氨酸、蛋氨酸或组氨酸。
(28)上述(12)～(26)中任一项所述的方法，其特征是使用多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P1’或目的肽的N末端为丝氨酸或丙氨酸，第97位氨基酸为亮氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体。
(29)上述(12)～(26)中任一项所述的方法，其特征是使用多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P1’位或目的肽的N末端为苯丙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，第97位氨基酸为蛋氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体。
(30)上述(12)～(26)中任一项所述的方法，其特征是使用多肽中或融合蛋白中与希望的切断部位相关的P1’或目的肽的N末端为丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺，第97位氨基酸为组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体。
(31)上述(2)～(11)、(15)～(30)中任一项所述的方法，其中目的肽是由22个氨基酸残基至45个氨基酸残基构成的肽。
(32)上述(31)所述的方法，其中目的肽是肾上腺皮质刺激激素(1-24)、胃动素或降钙素前体。
(33)上述(2)～(11)、(15)～(32)中任一项所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌。
(34)上述(1)～(33)中任一项所述的方法，其特征是作为切断用蛋白酶使用表达编码OmpT蛋白酶或表达编码从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体的基因的菌体本身。
(35)上述(1)～(33)中任一项所述的方法，其特征是使编码OmpT蛋白酶或编码从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体的基因与编码希望用该蛋白酶切断的多肽或融合蛋白的基因共表达。
附图的简要说明
图1是表示融合蛋白质PRR以及PRX结构的图。在融合蛋白PRR的氨基酸序列上表示出了各个氨基酸的位置，下面的数字表示从PRR的N末端开始的氨基酸序列编号。β-gl117S4H表示来自于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的从N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素样肽-1(7-37)、连接肽表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。(黑三角)表示在融合蛋白PRR中的OmpT蛋白酶切断部位。融合蛋白PRX是PRR的第141位天冬酰胺被其它19种氨基酸置换的融合蛋白。
图2是表示融合蛋白PAn结构的图。在融合蛋白PA的氨基酸序列上表示出了各个氨基酸的位置，下面的数字表示从PA的N末端开始的氨基酸序列编号。β-gal117S4H表示来自于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的从N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素样肽-1(7-37)、连接肽表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。(黑三角)表示在融合蛋白PA中的OmpT蛋白酶切断部位。斜黑体字表示融合蛋白PAn中氨基酸置换导入后的精氨酸。↓表示PAn的OmpT蛋白酶切断部位。在图中右侧给出了以融合蛋白PA的切断率为100％时的各融合蛋白的切断率。a也包括在Arg139-Arg140的切断率。b也包括在Arg141-Arg142的切断率。c也包括在Arg143-Ala144的切断率。
图3是表示融合蛋白PA1A3’，PA1’A3’，PA23’，PA323’，以及PA2’3’结构的图。在融合蛋白PA3’的氨基酸序列上表示出了各个氨基酸的位置，下面的数字表示从PA3’的N末端开始的氨基酸序列编号。β-gal117S4H表示来自于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的从N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素样肽-1(7-37)、连接肽表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。黑体字表示精氨酸。(切断率73％)、(黑三角)(切断率220％)表示在融合蛋白PA3’中的OmpT蛋白酶切断部位。斜体字表示在融合蛋白PA1A3’，PA1’A3’，PA23’，PA323’，以及PA2’3’中，在PA3’中氨基酸置换导入后的精氨酸，↓表示OmpT蛋白酶切断部位。在图中右侧给出了以融合蛋白PA的切断率为100％时的在各融合蛋白的Arg140-Arg141(●)和Arg143-Arg144(○)的切断率。ND表示不能检测。a表示在Arg100-Ala141的切断率。b也包括在Arg139-Arg140的切断率。c也包括在Arg142-Arg143的切断率。
图4是表示融合蛋白PA3D23’，PA4D23’，PA5D23’结构的图。在融合蛋白PA23’的氨基酸序列上表示出了各个氨基酸的位置，下面的数字表示从PA23’的N末端开始的氨基酸序列编号。β-gal117S4H表示来自于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的从N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、GLP-1(7-37)表示人胰高血糖素样肽-1(7-37)、连接肽表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第153位精氨酸的序列。精氨酸用黑体字表示。(黑三角)表示在融合蛋白PA23’中主要的OmpT蛋白酶切断部位。斜体表示在融合蛋白PA3D23’，PA4D23’和PA5D23’中，PA23’中氨基酸置换导入后的精氨酸，↓表示OmpT蛋白酶切断部位。在图中右侧给出了以融合蛋白PA的切断率为100％时的在各融合蛋白的Arg140-Arg141(●)和Arg143-Ala144(○)的切断率。ND表示不能检测。
图5是表示融合蛋白PRMT以及PMT结构的图。两个融合蛋白的氨基酸序列上的数字表示从N末端开始的氨基酸的序列编号。β-gal117S4H表示来自于从大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、连接肽在PRMT中表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第140位精氨酸的序列，在PMT中表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第143位精氨酸的序列。直至融合蛋白PRMT的140位精氨酸之前的氨基酸序列与从具有图1所示结构的融合蛋白PRR(特愿2000-602803)的N末端开始直至140位精氨酸的氨基酸序列一致。另外直至融合蛋白PMT的143位精氨酸之前的氨基酸序列与从融合蛋白PA23’(图4)的N末端开始直至143位精氨酸的氨基酸序列一致。●表示在融合蛋白PMT中的OmpT蛋白酶切断部位。○表示OmpT蛋白酶突变体D97M的切断部位。RAR-motilin包括通过Arg140-Arg141的切断从PMT游离的Arg-Ala-Arg-motilin的多肽，RRAR-motilin包括通过Arg139-Arg140的切断从PMT游离的Arg-Arg-Ala-Arg-motilin的多肽。
图6表示通过HPLC对融合蛋白PRMT以及PMT与野生型OmpT蛋白酶以及OmpT蛋白酶突变体D97M的反应(25℃、120分钟)进行解析的结果。
图7是表示W3110M25PMT以及W3110M25OmpT D97M表达菌在2L高密度培养中的培养液OD660随时间变化的图。○为W3110M25PMT，●为W3110M25OmpT D97M。两个重组大肠杆菌都在葡萄糖浓度1.5％、32℃下开始培养，在培养开始后约12小时，葡萄糖耗尽后，添加葡萄糖使浓度达到2％，将培养温度调到37℃，然后每当葡萄糖耗尽时同样按照终浓度达2％那样添加葡萄糖(W3110M25PMT，↑，W3110M25OmpT D97M，↓)，W3110M25PMT在培养开始后24小时停止培养，而W3110M25OmpT D97M在培养开始后20小时停止培养。
图8是表示经OmpT蛋白酶突变体D97M作用由融合蛋白PMT游离的胃动素随时间变化的图。
图9中，A表示60分钟后的反应液经HPLC分析的结果，B表示用SDS-PAGE分析的结果。带1只有PMT；2为PMT+D97M；3为胃动素标准品。反应液组成：4M尿素，50mM磷酸钠(pH7.0)，2mM EDTA，PMT OD660＝50，OmpT D97M OD660＝16；反应温度：25℃；120min-1进行振荡。
图10中，A表示在实施例1、3、5、7、9、16以及18中构建的融合蛋白表达质粒的结构。B表示实施例11中构建的OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶突变体表达质粒的结构。
图11表示融合蛋白PAC以及PCT的结构。各个融合蛋白的氨基酸序列下的数字表示从N末端开始的氨基酸序列编号。β-gal117S4H表示来自于从大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、连接肽表示从氨基酸序列编号的第128的谷氨酰胺至第143位精氨酸为止的序列。各个融合蛋白的第143位精氨酸之前的氨基酸序列与从融合蛋白PA23’(图4)的N末端开始直至143位精氨酸的氨基酸序列一致。
图12表示通过HPLC对融合蛋白与野生型OmpT蛋白酶以及OmpT蛋白酶突变体的反应进行解析的结果。PAC与D97L于25℃下反应10分钟、PCT与D97H于25℃下反应2小时。
图13表示实施例17中构建的OmpT蛋白酶突变体D97M表达质粒的结构。MCS：多克隆位点。
图14是表示利用从对实施例17制作的融合蛋白PMT和OmpT蛋白酶突变体D97M进行共表达的W3110M25转化大肠杆菌得到的包涵体，由融合蛋白PMT游离出的人胃动素经SDS-PAGE分析的结果。Mr，蛋白质分子量标准；带1，反应开始后20分钟；2，40分钟；3，60分钟；4，120分钟；5，180分钟；6，240分钟；7，300分钟；8，360分钟；9，1440分钟(24小时)；10，胃动素标准品。反应液组成：4M尿素，50mM磷酸钠(pH7.0)，2mM EDTA，包涵体OD660＝20；反应温度：25℃。
图15表示融合蛋白PMT、PMT6D以及PMT7D的结构。各个融合蛋白的氨基酸序列下的数字表示从N末端开始的氨基酸序列编号。β-gal117S 4H表示来自于从大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的N末端开始的117个氨基酸的保护蛋白质、连接肽表示从氨基酸序列编号的第128位的谷氨酰胺至第143位精氨酸为止的序列。这些融合蛋白的第143位精氨酸之前的氨基酸序列分别与从融合蛋白PA23’、PA 3D23’以及PA4D23’(图4)的N末端开始直至143位精氨酸的氨基酸序列一致。各个融合蛋白的可被OmpT蛋白酶突变体D97M切断的切断部位用箭头表示。AR-motilin是由因Arg141-Ala142的切断游离的Ala-Arg-motilin构成的多肽，RRAR motilin是由因Arg139-Arg140的切断游离的Arg-Arg-Ala-Arg-motilin构成的多肽。
图16表示通过HPLC对融合蛋白PMT与OmpT蛋白酶突变体D97M的反应(25℃、120分钟)进行解析的结果。括弧内的数字表示以由融合蛋白生成的胃动素浓度为100时的各个副产物浓度。
图17表示通过HPLC对融合蛋白PMT6D与OmpT蛋白酶突变体D97M的反应(25℃、120分钟)进行解析的结果。括弧内的数字表示以由融合蛋白生成的胃动素浓度为100时的各个副产物浓度。
图18表示通过HPLC对融合蛋白PMT7D与OmpT蛋白酶突变体D97M的反应(25℃、120分钟)进行解析的结果。括弧内的数字表示以由融合蛋白生成的胃动素浓度为100时的各个副产物浓度。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
pG117S4HompPRR是表达含有胰高血糖素样多肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的融合蛋白(PRR)的表达质粒。
本融合蛋白的保护蛋白质由含有大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117个氨基酸的β-gal117S4H作为保护蛋白质、配置了精氨酸-精氨酸序列的26个氨基酸构成的连接肽序列和GLP-1(7-37)构成。本发明人已经发现大肠杆菌OmpT蛋白酶切断PRR的连接肽序列中的精氨酸-精氨酸序列中央的肽键，使含有GLP-1(7-37)的44个氨基酸的目的多肽游离(Okuno，K.et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.66：127-134，2002)。
然后本发明人制作了以融合蛋白(PRR)为基础，P1位与P1’位为精氨酸、这些部位以外的从P10位至P5’位的氨基酸全部置换为丙氨酸的融合蛋白PA。
另外，从该融合蛋白PA出发，制作各个部位的每个丙氨酸都置换为精氨酸的融合蛋白(PAn)，通过在OmpT蛋白酶切断部位周边配置碱性氨基酸精氨酸研究对OmpT蛋白酶切断的影响。
结果新发现了当切断部位周边氨基酸序列的P10位至P3位或P3’位至P5’位存在碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸)时(但是，除去仅P6或P4位一处被碱性氨基酸置换的情况)，切断率上升。
另外，当P2位或P2’位为精氨酸时，加上作为切断部位配置的P1位或P1’位的2个精氨酸，精氨酸变成3个连续的序列，这种场合下切断率反而降低了。即，虽然通过使精氨酸存在于切断部位周边，切断率上升，但3个精氨酸连续的情况下，切断率倒降低了，判明通过将切断部位周边的氨基酸序列置换为精氨酸，可对切断率进行调控。
另外判明在P3’位存在精氨酸的融合蛋白PA3’(切断部位周边氨基酸序列为-Ala-Ala-Arg[P1]-Arg[P1’]-Ala-Arg[P3’]-Ala[P4’]-Ala-)中，P3’位的精氨酸与P4’位的精氨酸之间也会发生切断，发现了其中可有效切断精氨酸-精氨酸之间的序列。在碱性氨基酸连续串联排列以外的序列可有效切断底物这一事实由于对以OmpT蛋白酶作为加工酶使用非常重要，所以本发明人进行了进一步研究。
根据通过在切断部位周边配置精氨酸，切断效率上升的见解，以及对于精氨酸3个连续的情况，在精氨酸-精氨酸间难于切断的见解，研究各种氨基酸序列时，发现在氨基酸序列-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-中，主要的切断发生在-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-。即，通过配置3个连续的碱性氨基酸，显然具有促进在存在于该序列以后的碱性氨基酸部位的切断的性质。
然而，在上述氨基酸序列(-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-)中，即使在3个连续的精氨酸序列中也会发生切断。为了使这样情况減少，制作在N末端侧上游氨基酸序列配置了酸性氨基酸天冬氨酸的氨基酸序列-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-。通过使用该序列，精氨酸-丙氨酸间的切断率下降一半，可成功地抑制3个连续的精氨酸序列中的切断。即，在这些序列-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-或-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-中，要考虑使OmpT蛋白酶的切断在精氨酸-丙氨酸间容易发生那样的最适化。预期通过使用这些序列(-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-以及Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-)、特别优选使用Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-Ala-，即使P1’位为丙氨酸以外的氨基酸也可高效地切断。
根据以上结果，通过在-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg↓Ala-的切断部位的C末端侧氨基酸序列配置生理活性肽，是否可以用OmpT蛋白酶直接从融合蛋白切出该生理活性肽，以胃动素(N末端氨基酸为苯丙氨酸)作为目的多肽进行了研究。尝试制作以胃动素作为目的多肽的融合蛋白PMT，使OmpT蛋白酶作用，切出胃动素。
可是判明不能有效地从融合蛋白PMT切出胃动素。由此结果可以认为作为OmpT蛋白酶的底物特异性，已知对P1’位的氨基酸是宽容的，但是为了在有效切断中利用，认为有必要在本蛋白酶自体导入突变，提高对P1’位氨基酸的特异性。
解析OmpT的结晶结构的论文(Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.20：5033-5039，2001)已发表，在与此有关的论文(Kramer，RA.et al.FEBS lett.505：426-430，2001)中，考察底物的P1’位氨基酸与OmpT蛋白酶的Asp97(从N末端开始的第97位天冬氨酸)是否相互作用。为了研究对这第97位氨基酸进行置换时发生的底物特异性的变化，制作将OmpT的Asp97置换为20种氨基酸(包括对天冬氨酸的同义置换)的突变体的质粒，将这些质粒导入OmpT缺损大肠杆菌BL21株后，制备OmpT蛋白酶突变体OmpT D97X(X对应于20种氨基酸)表达大肠杆菌20株。
以目的是研究OmpT蛋白酶的P1’位底物特异性而制备的具有如图1所示结构的融合蛋白质PRX(X对应于20种氨基酸，参照特愿2000-602803)作为底物，使上述突变体作用，研究各个融合蛋白质的切断。其结果判明将OmpT蛋白酶的97位天冬氨酸置换为丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸的序列，虽然在切断率有高低之分，但具有切断融合蛋白质PRX的活性。已清楚突变体OmpT D97L对于丝氨酸、丙氨酸，OmpT D97M对于苯丙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸以及酪氨酸，OmpT D97H对于丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、半胱氨酸以及天冬酰胺分别表现出高的特异性。
利用由此得到的见解，考虑使胃动素的N末端氨基酸为苯丙氨酸，使当P1’部位为苯丙氨酸时很好切断的OmpT D97M作用于前述的融合蛋白PMT，可以高效切出胃动素。即本发明人通过对OmpT蛋白酶的切断部位周边的序列进行最适化，以及利用OmpT蛋白酶突变体，在到目前为止在所希望的位置OmpT蛋白酶切断困难的切断也变得可切断方面获得了成功。
另外为了验证该手法在工业上利用，对表达融合蛋白PMT大肠杆菌以及表达OmpT D97M蛋白酶突变体的大肠杆菌进行高密度培养，直接向含有从表达融合蛋白PMT大肠杆菌制备的包涵体的反应液中添加表达OmpT D97M蛋白酶突变体的大肠杆菌本身，于25℃、作用1小时。向该反应液添加20mM乙酸(pH 4.0)，除去沉淀后，将上清液进行阳离子交换和反相层析。通过这一系列操作每1L表达融合蛋白PMT的大肠杆菌培养液可以以52％回收率生产纯度99.0％或更高的胃动素160mg，充分表现出可工业化生产的水准。
另外为了证实该多肽生产系的通用性，制备作为目的多肽配置人肾上腺皮质刺激激素(1-24)(N末端氨基酸为丝氨酸)以及人降钙素前体(N末端氨基酸为半胱氨酸)的融合蛋白，用OmpT蛋白酶突变体进行处理。任一个实验结果都可以得到所希望的目的多肽，成功地表现出该体系的通用性之广。
另外，制备对融合蛋白PMT和OmpT D97M蛋白酶突变体进行共表达的大肠杆菌，只是用尿素对培养该大肠杆菌得到的包涵体进行溶解，也可确认从融合蛋白PMT可以使人胃动素游离。
另外，在下述的实施例中没有给出具体的实验操作，只要是没有特别叙述，都根据以下的方法。
(1)表达质粒的构建
表达质粒的构建使用大肠杆菌JM109，按照常规方法进行。构建的表达质粒是目的质粒这一事实可通过利用为导入突变进行PCR得到的DNA区域以及通过合成DNA置换得到的DNA区域的碱基序列决定确认。实施例1、3、5、7、9、16、18中制作的质粒的结构如图10A所示，实施例11中制作的质粒的结构如图10B所示。实施例17中制作的质粒如图13所示。
(2)OmpT蛋白酶酶活性的测定
OmpT蛋白酶活性以强啡肽A(肽研究所制造)作为底物进行测定。
向含有0.1％Triton X-100的50mM磷酸钠(pH 6.0)40μL中加1mg/mL的强啡肽A 5μL，再加入OmpT蛋白酶活性测定样品5μL，开始反应。反应在25℃下进行10分钟，加1N HCl 5μL停止反应。将反应液经10000×g、3分钟离心分离，回收上清液，取20μL进行HPLC分析。
HPLC分析使用YMC PROTEIN RP柱，于柱温度40℃、流速1mL/min下进行。用含有0.1％三氟乙酸的10％乙腈洗3分钟后，通过10分钟含0.1％三氟乙酸的10-15％乙腈的线性梯度洗脱。监测220nm的吸收，检测出分解产物肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg。将在该反应条件下，25℃1分钟内切断强啡肽A1μmol时的OmpT蛋白酶活性定为1unit。
(3)SDS-聚丙烯酰胺电泳
为了研究融合蛋白的切断使用的SDS-聚丙烯酰胺电泳，凝胶使用テフコ公司生产的16％Peptide-PAGEmini、电泳缓冲液使用BioRad公司生产的Tricine电泳缓冲液、分子量标准使用テフコ公司或BioRad公司生产的蛋白质分子量标准。向样品添加等量的含有4M尿素的2×SDS-PAGE样品缓冲液，100℃、加热5分钟。取10μL进行电泳，在テフコ公司指定的电泳条件下进行电泳。电泳后用含有考马司亮蓝-R-250的染色液进行染色。
(4)包涵体的制备
在本实施例中，当大肠杆菌中融合蛋白以包涵体表达，大肠杆菌表达OmpT蛋白酶时，得到的包涵体仅用尿素溶解就受到OmpT蛋白酶的切断。因此为了避免切断，用表达融合蛋白质粒转化OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵体形式表达。将表达各融合蛋白的W3110M25重组大肠杆菌在2L三角烧瓶中用含有四环素10mg/L的LB液体培养基(0.5％(w/v)酵母提取物、1％(w/v)胰胨(tryptone)、0.5％氯化钠)400mL于37℃下，以150rpm旋转培养一晚。
翌日，通过在4℃、6000×g条件下离心分离10分钟，回收菌体，对菌体进行超音波处理，破碎菌体。向该菌体破碎液加去离子水，调整到30mL，在4℃、25000×g条件下进行15分钟离心分离，废弃上清回收沉淀级分(包涵体)。再悬浮于30mL的50mM Tris-HCl(pH8.0)，5mM EDTA，1％Triton X-100中，于4℃、25000×g条件下进行15分钟离心分离，得到沉淀。将该沉淀用30mL的去离子水悬浮后，在4℃、25000×g条件下进行15分钟离心分离，回收沉淀。向沉淀中加去离子水，调整到1.5mL，悬浮后通过在4℃、10000×g条件下进行30分钟离心分离，得到沉淀，再度重复同操作，直至达到OD660＝100，用去离子水将沉淀悬浮，将这样制备的包涵体作为OmpT蛋白酶反应的底物使用。
(5)OmpT蛋白酶反应
以融合蛋白作为底物，象下述那样进行OmpT蛋白酶反应。向10M尿素20μL中加1M磷酸钠(pH 7.0)2.5μL、以及50mM EDTA 2μL，添加融合蛋白包涵体(OD660＝100)10μL，溶解包涵体。再添加10.5μL水，然后添加1.4units/mL的OmpT蛋白酶5μL，在反应液量50μL中开始反应。反应温度为25℃，进行30分钟。
与OmpT蛋白酶反应得到的多肽的定量只要没有特别说明，通过HPLC在以下的条件下进行。向OmpT蛋白酶反应液中添加150μL的6％乙酸、2M尿素，停止反应，在10000×g下进行3分钟离心分离，将上清液20μL加到YMC PROTEIN RP柱上。HPLC在柱温度40℃、流速1mL/min条件下进行。通过20分钟含0.1％三氟乙酸的30-50％乙腈的线性梯度洗脱，监测214nm吸收，进行多肽的定量。
(6)多肽的质量解析
为了推定切断部位，使用Thermo Finnigan公司生产SSQ710对通过HPLC分离的多肽进行质量分析。
(7)大肠杆菌外膜级分的制备
象以下那样制备宿主为W3110M 25的表达OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶突变体的大肠杆菌的外膜级分，在实施例10、14、16以及18中作为OmpT蛋白酶或OmpT蛋白酶突变体用在融合蛋白的切断反应中。培养方法与(4)同样进行，培养结束后、通过4℃、6000×g、10分钟离心分离得到菌体。通过将该菌体用10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mMEDTA(TE)悬浮、超声波处理，破碎菌体。将菌体破碎液经4℃、1000×g、10分钟离心分离后，废弃沉淀，回收破碎液。再将该破碎液经4℃、36000×g、40分钟离心分离，回收沉淀，用TE悬浮，再度于4℃、36000×g条件下进行40分钟离心分离。将得到的沉淀在TE悬浮使之达到D660＝10。不使用时冷冻保存在-20℃下。
实施例
以下给出实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1.融合蛋白PAn的制备
OmpT蛋白酶是存在于大肠杆菌外膜的内切蛋白酶。由于考虑到在本酶的切断中切断部位周边的氨基酸序列中的碱性氨基酸有非常大的影响，所以本发明人利用本酶的已知的切断部位，进行如下所示的实验，研究碱性氨基酸的位置与切断率的关系。
制作可被OmpT蛋白酶切断的具有如图2所示结构的融合蛋白PA(将通过连接肽来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)与人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的融合蛋白的切断部位的P10位至P2位以及P2’位至P5’位的丙氨酸置换为精氨酸，对存在于连接肽内的OmpT蛋白酶切断部位进行了变换的融合蛋白PAn(图2：n对应于切断部位的氨基酸的位置[Pn]，由P10至P2以及由P2’至P5’)，对于OmpT蛋白酶的切断进行研究。
无论是在融合蛋白的连接部分插入了作为大肠杆菌OmpT蛋白酶的识别·切断部位的精氨酸-精氨酸序列的融合蛋白PRR(图1)的表达质粒，还是以具有图10A所示结构的pG117S4HompPRR(参照特愿2000-602803)为基础，通过用PCR进行部位特异的突变导入以及与合成DNA的置换表达融合蛋白PA的质粒，都构建如具有图10A所示结构的pG117S4HompPA。另外，融合蛋白PAn的表达质粒pG117S4HompPAn是在具有如图2所示结构的融合蛋白PA的表达质粒pG117S4HompPA中使用PCR导入置换碱基后构建的。构建的质粒的结构如图10A所示。用这些融合蛋白表达质粒转化OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵体形式表达。
实施例2.OmpT蛋白酶对融合蛋白PAn的切断
使用将具有可被OmpT蛋白酶切断的结构的如图2所示融合蛋白PA的OmpT蛋白酶切断部位周边的丙氨酸置换为精氨酸的融合蛋白PAn(图2)，研究OmpT蛋白酶的切断率。使PAn在pH 7.0下与根据特愿2000-602803，使用苯甲脒琼脂糖(ベンザミジンセフアロ一ス)6B纯化的OmpT蛋白酶标准品反应。酶反应后，由HPLC分析结果得到的切断率也表示在图2中。另外，由质量分析结果得到的切断部位也表示在图2。
所有的PAn在与原来的PA相同部位被OmpT蛋白酶切断，PA2，PA2’以及PA3’在另外部位也发生切断(图2)。特别是PA3’在Arg140-Arg141以及Arg143-Ala1442个地方被切断(切断率分别为220，73％)，这表明在连续的碱性氨基酸以外的氨基酸之间(Arg143-Ala144)可进行切断。
在除了PA2与PA2’之外的所有PAn中确认切断率上升，可以认为通过在切断部位周边氨基酸序列中的P10至P3以及P3’至P5’配置精氨酸，可以使切断率提高。其中PA4表现出最高切断率，约为PA的5倍，可知在P4位配置精氨酸是最有效果的。另一方面在PA2以及PA2’中，切断率减少到约1/3，可知如果变成3个连续的精氨酸序列，切断率降低。
实施例3.融合蛋白PA1A3’、PA1’A3’的制备
已知OmpT蛋白酶是主要切断连续的碱性氨基酸之间的酶。可是由实施例2的结果可知融合蛋白PA3’在Arg140-Arg141和Arg143-Ala1442处被切断，而且其中的一处是-Arg↓Ala-的切断。在这个-Arg↓Ala-的切断率与连续的碱性氨基酸间的切断率比较虽然低，但有可能改善为在工业上可利用的切断率。
因此为了抑制在融合蛋白PA3’的2个切断部位Arg140-Arg141以及Arg143-Ala144中的Arg140-Arg141的切断，制备具有Arg140或Arg141置换为丙氨酸的氨基酸序列的融合蛋白PA1A3’和PA1’A3’(图3)，研究这些融合蛋白被OmpT蛋白酶的切断。同时使用这些融合蛋白，对于Arg143-Ala144的切断究竟需要Arg140(以Arg143、Ala144分别作为P1位、P1’位的P4位)和Arg141(以Arg143、Ala144分别作为P1位、P1’位的P3位)的哪一个也进行了研究。
融合蛋白PA1A3’以及PA1’A3’的表达质粒pG117S4HompPA1A3’和pG117S4HompPA1’A3’使用PCR向具有如图3所示结构的融合蛋白PA3’的表达质粒pG117S4HompPA3’导入置换碱基后构建。图10A给出了构建的质粒的结构。用这些融合蛋白表达质粒转化OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵体形式表达。
实施例4.OmpT蛋白酶对融合蛋白PA1A3’以及PA1’A3’的切断
对如图3所示融合蛋白PA1A3’以及PA1’A3’可被OmpT蛋白酶切断的切断部位以及切断率进行了研究。根据特愿2000-602803，用经苯甲脒琼脂糖6B纯化的OmpT蛋白酶标准品在pH 7.0下与PA1A3’以及PA1’A3’反应。酶反应后，由HPLC分析结果得到的切断率、以及由质量分析结果得到的切断部位都表示在图3中。可知PA1A3’以及PA1’A3’都是在Arg143-Ala144被切断。
然而，无论那一个切断率与在PA的Arg140-Arg141的切断率相比，切断率值都低。另外在PA1’A3’中也确认了在Arg140-Ala141的切断。当认为Arg143-Ala144为切断部位P1-P1’时，在Arg143-Ala144的切断只要存在P3位精氨酸(PA1A3’的Arg141)或是P4位精氨酸(PA1’A3’的Arg140)中的任一个都会发生，表明在P4位和P3位两处配置了精氨酸的PA3’与PA1A3’以及PA1’A3’相比切断率更高。
实施例5.融合蛋白PA23’、PA323’和PA2’3’的制备
由实施例4的结果可知融合蛋白PA1A3’和PA1’A3’在Arg143-Ala144被切断，特别是PA1A3’只在Arg143-Ala144被切断，而且其切断率低。因此尝试在融合蛋白PA3’导入氨基酸置换，设计使-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)的切断率进一步提高那样的氨基酸序列。根据实施例2的结果，象以下那样制备具有预想使-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)的切断率提高，而使连续的碱性氨基酸间(Arg140-Arg141)的切断率下降的氨基酸序列(使2个连续的精氨酸变成3个连续或4个连续的精氨酸)的融合蛋白PA23’、PA323’以及PA2’3’(图3)，研究这些融合蛋白被OmpT蛋白酶的切断情况。
融合蛋白PA23’以及PA2’A3’的表达质粒pG117S4HompPA23’和pG117S4HompPA2’A3’使用PCR向具有如图3所示结构的融合蛋白PA3’的表达质粒pG117S4HompPA3’导入置换碱基后构建的。而融合蛋白PA323’的表达质粒pG117S4HompPA323’使用PCR向具有如图3所示结构的融合蛋白PA23’的表达质粒pG117S4HompPA23’导入置换碱基后构建的。图10A给出了构建的质粒的结构。用这些表达融合蛋白质粒转化OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵体形式表达。
实施例6.OmpT蛋白酶对融合蛋白PA23’、PA323’以及PA2’3’ 的切断
对如图3所示的融合蛋白PA23’、PA323’以及PA2’A3’可被OmpT蛋白酶切断的切断部位以及切断率进行了研究。根据特愿2000-602803使用经苯甲脒琼脂糖6B纯化的OmpT蛋白酶标准品在pH7.0下与PA23’PA323’以及PA2’3’在25℃反应30分钟。酶反应后、由HPLC分析结果得到的切断率、以及由质量分析结果得到的切断部位都表示在图3中。确认PA23’、PA323’和PA2’3’在Arg143-Ala144被切断。PA23’在Arg143-Ala144的切断率表现出是PA在Arg140-Arg141切断率的2.9倍切断率。
另外还看到了在Arg139-Arg140和Arg140-Ar141的切断，其切断率为在Arg143-Ala144切断的13％。在PA323’的Arg143-Ala144的切断率也表现出是在PA的Arg140-Arg141的切断率的2.9倍切断率，另外也看到了在Arg140-Arg141的切断，是在Arg143-Ala144切断率的59％。关于PA2’3’，确认在Arg143-Ala144的切断率低至在PA的Arg140-Arg141的切断率的63％，以及在Arg140-Arg141以及Arg142-Arg143的切断。以上结果表明这3种融合蛋白中，PA23’具有使-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)切断率提高，而使连续的碱性氨基酸间切断率下降的最适序列。
实施例7.融合蛋白PA5D23’、PA4D23’和PA3D23’的制备
实施例6的结果表明在融合蛋白PA23’中Arg143-A1a144的切断率非常高。另外还确认了在Arg139-Arg140或Arg140-Arg141的切断。因此，由于认为在切断部位旁边存在酸性氨基酸时可抑制它的切断，所以为了抑制在Arg139-Arg140或在Arg140-Arg141的切断，象以下那样制备将Ala136、Ala137或Ala138置换为天冬氨酸的融合蛋白PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’(图4)，研究它们被OmpT蛋白酶切断的情况。
融合蛋白PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’的表达质粒pG117S4HompPA5D23’、pG117S4HompPA4D23’以及pG117S4HompPA3D23’利用PCR向具有图4所示结构的融合蛋白PA23’的表达质粒pG117S4HompPA23’导入置换碱基后构建。构建的质粒的结构如图10A所示。用这些融合蛋白表达质粒转化OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25，使融合蛋白以包涵体形式表达。
实施例8.OmpT蛋白酶对融合蛋白PA5D23’、PA4D23’和PA3D23’ 的切断
对图4所示融合蛋白PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’被OmpT蛋白酶切断的切断部位以及切断率进行了研究。使PA5D23’、PA4D23’和PA3D23’在pH 7.0下与根据特愿2000-602803使用苯甲脒琼脂糖6B纯化的OmpT蛋白酶标准品在25℃下反应30分钟。酶反应后，由HPLC分析结果得到的切断率，由质量分析结果得到的切断部位都表示在图4中。确认PA5D23’、PA4D23’以及PA3D23’的主要切断部位是Arg143-Ala144。
特别是PA4D23’在Arg143-Ala144的切断率如果与PA23’比虽然下降，但表现出是在PA的Arg140-Arg141切断率的2倍切断率。另一方面没有检测到在PA23’检测到的Arg139-Arg140以及Arg140-Arg141的切断。即、将Arg140-Arg141设计为P1-P1’时，通过在P3位配置天冬氨酸，可以抑制该切断。同样将Arg139-Arg140设计为P1-P1’时，认为通过在P2位配置天冬氨酸，可以抑制该切断。在PA5D23’的Arg143-Ala144切断率虽然表现出是在PA的Arg140-Arg141切断率的1.9倍切断率，但也看到了在Arg140-Arg141的切断。
对于PA3D23’，与PA4D23’同样没有检测到在Arg139-Arg140以及在Arg140-Arg141的切断。即、当将Arg140-Arg141作为P1-P1’考虑时，通过在P4位配置天冬氨酸，认为可以抑制该切断。同样当将Arg139-Arg140作为P1-P1’考虑时，通过在P3位配置天冬氨酸，认为可以抑制该切断。在Arg143-Ala144的切断率与在PA的Arg140-Arg141切断率同等程度，但比PA4D23’低。以上事实表明这3种融合蛋白中，PA4D23’具有使在-Arg↓Ala-(Arg143-Ala144)切断率更高，而且具有用于抑制连续的碱性氨基酸间的切断的最适序列。
因此，当希望用OmpT蛋白酶从由保护蛋白质-连接肽-目的多肽构成的融合蛋白切出N末端氨基酸为天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸以外的17种氨基酸中任一个的目的多肽时，认为通过在-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-氨基酸序列的C末端后配置该目的多肽，有可以特异切出该目的多肽的可能性。
实施例9.融合蛋白PRMT和PMT的制备
实施例6的结果表明OmpT蛋白酶可以有效地切断图3所示融合蛋白PA23’中本酶切断部位周边的氨基酸序列中-Arg↓Ala-。由此予想到切断部位即使是-ArgXaa-(Xaa为酸性氨基酸天冬氨酸、谷氨酸以及脯氨酸以外的17种氨基酸)也可有效切断。因此本发明人就接在实施例6中使用的融合蛋白PA23’的143位精氨酸之后N末端为酸性氨基酸、脯氨酸以外的氨基酸，以及置换为碱性氨基酸以外的氨基酸时，本酶怎样切断进行研究。
首先作为对照制作在具有可被OmpT蛋白酶切断Arg140-Arg141的如图1所示结构的融合蛋白PRR(特愿2000-602803参照)N末端开始的第140位精氨酸之后配置了人胃动素的融合蛋白PRMT(图5)。然后制作在融合蛋白PA23’(图3和图4)N末端开始的第143位精氨酸之后配置了人胃动素的融合蛋白PMT(图5)。
融合蛋白PRMT的表达质粒pG117S4HompPRMT以及PMT的表达质粒pG117S4HompPMT的结构如图10A所示。用这2种融合蛋白表达质粒分别转化OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25，制作融合蛋白生产菌。对得到的菌株培养后，以包涵体形式制备融合蛋白PRMT和PMT。
实施例10.OmpT蛋白酶对融合蛋白PRMT和PMT的切断
对于图5所示的融合蛋白PRMT以及PMT被OmpT蛋白酶的切断使用以W3110M25为宿主表达OmpT蛋白酶的大肠杆菌的膜级分通过SDS-PAGE或HPLC进行研究。在SDS-PAGE中，虽然可确认OmpT蛋白酶对融合蛋白PMT的切断，但没有检测到PRMT的切断。通过HPLC虽然也可确认融合蛋白PMT的切断，但主要是在Arg139-Arg140或Arg140-Arg141的碱性氨基酸对间的切断，在Arg143-Phe144的肽切断片段，即人胃动素通过质量分析只检测到极微量。
由此可知只是将切断部位周边的氨基酸序列做成-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg-motilin，不能通过OmpT蛋白酶将作为主要的肽切断片段的人胃动素切出。由此认为本蛋白酶对P1’位的氨基酸的底物特异性不严格，为了在有效切断中利用，有必要通过向本蛋白酶自体导入突变，进一步提高对P1’位氨基酸的特异性。因此制作OmpT蛋白酶突变体，对是否可以利用该突变体从融合蛋白主要切出人胃动素进行了研究。
实施例11.OmpT蛋白酶突变体表达大肠杆菌的制备
为了考察在解析OmpT蛋白酶的结晶结构的论文(Vandeputte-Rutten，L.et al.EMBO J.20：5033-5039，2001)以及与之相关的论文(Kramer，RA.et al.FEBSLlett.505：426-430，2001)中底物的P1’位氨基酸与OmpT蛋白酶的Asp97是否进行相互作用，象以下那样利用PCR制作将OmpT蛋白酶的Asp97置换为20种氨基酸(包括对天冬氨酸的同义置换)的质粒，将这些质粒导入OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌BL21株，制备OmpT蛋白酶突变体表达大肠杆菌20株。
为了对OmpT蛋白酶的Asp97容易导入突变，尽可能使利用PCR扩增的DNA区域减少，首先通过将编码具有图10B所示结构的OmpT蛋白酶表达质粒pOmpTTcE(参照特愿2000-602803)的OmpT蛋白酶Ser99的AGT变换为TCT，构建利用PCR导入了制限酶部位XbaI的OmpT蛋白酶表达质粒pOmpTXbaI。然后对将OmpT蛋白酶的Asp97置换为20种氨基酸(包括对天冬氨酸的同义置换)的突变体OmpT D97X(X表示置换后的20种氨基酸)进行表达的质粒pOmpTD97X由OmpT蛋白酶表达质粒pOmpTXbaI通过利用PCR导入突变来构建。表达质粒pOmpTXbaI以及pOmpTD97X的结构如图10B所示。
将得到的20种表达质粒pOmpTD97X分别导入OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌BL21株制备OmpT蛋白酶突变体OmpT D97X表达大肠杆菌20株。将这些大肠杆菌在试管内用含有四环素10μg/mL的LB液体培养基2mL于37℃下振荡培养至OD660＝1左右后，将菌体通过离心分离回收。向这些菌体中加1mL的TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)，悬浮后，通过离心分离回收菌体。再重复进行同样操作，向得到的菌体添加TE达到OD660＝2，将悬浮的溶液作为OmpT蛋白酶突变体OmpTD97X反应用的菌体悬浮液。这些菌体悬浮液在使用之前一直冷冻保存在-20℃下。
实施例12.OmpT蛋白酶突变体表达大肠杆菌菌体悬浮液中含有的 OmpT蛋白酶突变体量的确认
为了确认OmpT蛋白酶突变体表达大肠杆菌菌体悬浮液中含有的OmpT蛋白酶突变体量在所有的菌体悬浮液中是等量，使用抗OmpT蛋白酶抗体进行免疫印迹和免疫染色。抗OmpT蛋白酶抗体通过将纯化OmpT蛋白酶对兔进行免疫致敏，从得到的抗血清中纯化IgG级分，再从该级分中回收对纯化OmpT蛋白酶具有亲和性的级分来制备。
将相当于每1个样品槽OD660＝0.01的菌体悬浮液进行12％SDS-PAGE，电泳结束后，使用PVDF膜进行免疫印迹。将制备的印迹膜在封闭液(5％(w/v)skimmilk/1x TBST*)中浸渍，于室温下进行30分钟振荡。然后将膜浸渍在用封闭液稀释了1000倍的抗OmpT蛋白酶抗体中，于室温下振荡100分钟。然后舍去液，用1x TBST*洗3次，每次5分钟。然后再将膜浸渍在用封闭液稀释1000倍的过氧化物酶结合抗兔IgG抗体液中，于室温下振荡45分钟。
用1×TBST*清洗4次，每次10分钟，然后用ECL试剂盒(AmershamPharmacia公司生产)进行检测。从作为宿主的OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌BL21株没有检测到带，但从其它的菌体悬浮液可以检测到几乎同等强度的带，由此可以认为OmpT蛋白酶突变体表达大肠杆菌菌体悬浮液中含有的OmpT蛋白酶突变体量在所有的菌体悬浮液中大致等量。(*1xTBST＝10mM Tris-HCl(pH 7.0)，150mM NaCl，0.05％Tween 20)
实施例13.OmpT蛋白酶突变体OmpT D97X的P1’位底物特异性的 研究
由于OmpT蛋白酶存在于大肠杆菌外膜，可以通过向反应液中原样加菌体，使其与底物作用。因此，为了研究OmpT蛋白酶突变体OmpTD97X的P1’位底物特异性，以具有图1所示结构的融合蛋白质PRX(参照特愿2000-602803)作为底物，象以下那样研究与OmpT蛋白酶突变体OmpT D97X的反应性。向10M尿素20μL中加1M磷酸钠(pH 7.0)2.5μL、以及50mM EDTA 2μL，添加融合蛋白包涵体(OD660＝100)5μL，对包涵体进行溶解。
然后向包涵体溶解液中加10.5μL水，添加在实施例11中制备的OmpT蛋白酶突变体表达大肠杆菌菌体悬浮液10μL，在反应液量50μL中开始反应。反应于25℃下进行60分钟。在与OmpT蛋白酶反应时相同的条件下，利用HPLC对反应后得到的肽片段进行定量。结果如表1所示。
Figure S04828525020060420D000331
将野生型OmpT蛋白酶(D97D)与融合蛋白PRR反应的切断率作为100％表示相对切断率。-表示相对切断率不到3.0％。OmpT蛋白酶突变体D97V，D97I，D97P，D97W，D97G，D97Y，D97K和D97R与20种融合蛋白PRX的任一个的相对切断率都不到3.0％。融合蛋白PRL，PRP，PRW，PRG，PRQ，PRD，PRE和PRH与任一个OmpT蛋白酶突变体OmpTD97X的相对切断率也都不到3％。
该结果表明，可以得到几个切断率比较高，底物特异性与野生型OmpT蛋白酶不同的突变体。已知D97D(野生型)对融合蛋白PRR和PRK、D97L对PRS、D97M对PRF和PRY、D97H对PRA、PRV、PRI、PRM、PRT、PRC以及PRN分别表现出最高的特异性。其中使用对PRF特异性高的D97M突变体与在实施例9制备的融合蛋白PRMT和PMT进行反应，研究是否可将人胃动素切出。
实施例14.通过OmpT蛋白酶D97M突变体从融合蛋白PMT切出人 胃动素
利用OmpT蛋白酶D97M突变体从人胃动素融合蛋白PRMT和PMT(图5)切出人胃动素的研究使用宿主为W3110M25的表达野生型OmpT蛋白酶(D97D)和OmpT蛋白酶突变体D97M的大肠杆菌外膜级分进行。向10M尿素20μL中加1M磷酸钠(pH 7.0)2.5μL、和50mM EDTA2μL，添加融合蛋白包涵体(OD660＝100)10μL，对包涵体进行溶解。然后加10.5μL水，再添加重组大肠杆菌外膜级分5μL，于反应液量50μL中开始反应。反应于25℃下进行120分钟。
向反应液添加150μL的6％乙酸、2M尿素，停止反应，在10000×g下进行3分钟离心分离，将上清液50μL加到YMC PROTEIN RP柱。HPLC在柱温度40℃、流速1mL/min下进行。通过15分钟含有0.1％三氟乙酸的20-27.5％乙腈的线性梯度洗脱，监测214nm的吸收。切断部位通过分离多肽片段，进行质量分析鉴定。图6中给出了通过HPLC对对照OmpT蛋白酶D97D野生型以及D97M突变体对人胃动素融合蛋白PRMT以及PMT的切断进行分析的结果。另外在表2给出了这些切断部位与切断率。
表2OmpT蛋白酶突变体OmpT D97M从融合蛋白PMT切出胃动素
ND表示不能检测。-表示不能进行融合蛋白的结构上检测。
*从PRMT通过切断Arg140-Phe141、从PMT通过切断Arg143-Phe144，游离
由从PMT通过Arg140-Arg141的切断游离的Arg-Ala-Arg-motilin构成的多肽
由从PMT通过Arg139-Arg140的切断游离的Arg-Arg-Ala-Arg-motilin构成的多肽
切断率都是以用D97D野生型对PMT进行切断时在Arg139-Arg140的切断率作为100的相对切断率表示。在用D97D野生型不能切断PRMT，而切断PMT的场合下，主要是在Arg139-Arg140和Arg140-Arg141切断。不过使用D97M突变体可切断PRMT，切出胃动素。已知PMT也可被切断，游离出胃动素，但在Arg139-Arg140的切断也被确认。然而，由PMT游离的胃动素的量比PRMT高3.5倍。该结果表明在胃动素的切出中需要D97M突变体，由于切断部位周边的序列不同，胃动素的切断效率也有变化。
实施例15.将胃动素作为模型肽使用OmpT蛋白酶突变体生产多肽 例子
作为使用OmpT蛋白酶突变体生产多肽例子，将W3110M25胃动素融合蛋白PMT生产菌(实施例9参照)以及OmpT蛋白酶突变体OmpTD97M表达菌(将W3110 M25用pOmpTD97M转化来制作)分别以各2L规模进行高密度培养，使用W3110 M25OmpT D97M表达菌菌体从PMT切出胃动素，再通过进行纯化，生产胃动素。该过程由以下3步构成。
而胃动素的定量通过用6％乙酸、2M尿素对反应液进行稀释后的溶液在与实施例14所述的HPLC分析法同样的条件下进行分析，作为标准品使用由肽研究所购入的人胃动素。而胃动素的纯度除了通过50分钟含有0.1％三氟乙酸的0-50％乙腈的线性梯度洗脱以外，通过与定量时同样条件的HPLC进行分析。
(1)W3110 M25胃动素融合蛋白PMT生产菌以及OmpT蛋白酶突变 体OmpT D97M表达菌的2L规模高密度培养
W3110 M25胃动素融合蛋白PMT生产菌以及OmpT蛋白酶突变体OmpT D97M表达菌的2L规模高密度培养象以下那样进行，由各个菌分别制备包涵体和表达菌体。将PMT生产菌和OmpT D97M表达菌在500mL三角烧瓶中用含有四环素10mg/L的LB液体培养基100mL，于37℃下旋转培养过夜。翌日、将该培养液转移到加入了2L的含4g/LK2HPO4，4g/L KH2PO4，2.7g/L Na2HPO4，0.2g/L NH4Cl，1.2g/L(NH4)2SO4，4g/L酵母提取物，2g/L MgSO4·7H2O，40mg/L CaCl2·2H2O，40mg/L FeSO4·7H2O，10mg/L MnSO4·nH2O，10mg/L AlCl3·6H2O，4mg/L CoCl2·6H2O，2mg/L ZnSO4·7H2O，2mg/L Na2MoO4·2H2O，1mg/L CuCl2·2H2O，0.5mg/L H3BO4，15g/L葡萄糖，10mg/L四环素的培养基的搅拌培养器中，于32℃下开始培养。
葡萄糖耗尽后、按照终浓度达2％那样添加甘油，将培养温度提高到37℃。然后在每次甘油耗尽时逐次按照终浓度达2％那样添加甘油，继续培养。培养经过如图7所示。PMT生产菌在培养开始后24小时结束，培养液容量为1700mL。用Manton-Gaulin将菌体破碎后，通过于4℃、6000×g下的10分钟离心分离，得到沉淀。将该沉淀用2000mL的去离子水悬浮，通过于4℃、6000×g下的10分钟离心分离，回收沉淀。再将得到的沉淀悬浮于2000mL的50mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM EDTA，1％Triton-X 100中，通过4℃、6000×g、10分钟的离心分离，回收沉淀。
将该沉淀悬浮于2000mL的去离子水，于4℃、6000×g下进行10分钟离心分离，回收沉淀。再度重复同样操作，得到26g沉淀。将该沉淀悬浮于26mL的去离子水中，作为包涵体悬浮液(OD660＝250，45mL)，在使用之前一直冷冻保存在-20℃下。OmpT蛋白酶突变体W3110M25OmpT D97M表达菌在培养开始后20小时结束培养，培养液容量为2100mL。通过将培养液于4℃、6000×g下进行10分钟离心分离，得到沉淀。将该沉淀用2000mL的TE(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mMEDTA)悬浮，于4℃、6000×g下通过10分钟离心分离回收沉淀。再度重复同样操作，回收311g沉淀。将该沉淀悬浮于去离子水，作为菌体悬浮液(OD660＝320，390mL)，在使用之前，一直于-20℃下冷冻保存。
(2)OmpT蛋白酶突变体W3110 M25 OmpT D97M表达菌对包涵体融 合蛋白PMT的切断
向8mL 10M尿素中添加1M磷酸钠(pH 7.0)1mL、以及50mMEDTA 0.8mL，添加融合蛋白包涵体PMT(OD660＝250)4mL，对包涵体进行溶解。然后向其中加5.2mL水，添加(1)中制备的OmpT蛋白酶突变体W3110 M25OmpT D97M表达菌悬浮液(OD660＝320)1mL，在反应液量20mL中开始反应。反应于25℃下以120min-1振荡，进行60分钟。60分钟后，向13.5mL反应液(相当于W3110 M25胃动素融合蛋白PMT生产菌培养液100mL份的包涵体)中添加40.5mL的20mM乙酸(pH 4.0)，通过于4℃、25000×g下进行10分钟离心分离，得到上清液。通过离心分离可以除去几乎所有的未反应融合蛋白、保护肽和来自大肠杆菌的蛋白质。
通过向该上清液加20mM乙酸(pH 4.0)，将容量调整到200mL，供以下纯化用。通过向该上清液加20mM乙酸(pH 4.0)使pH降低，可以吸附于以下的阳离子交换层析。另外在图8中给出了为了决定胃动素切出的反应时间，在相同条件下直至120分以前对胃动素游离随时间变化进行观察的结果。另外，用HPLC和SDS-PAGE对在反应开始后、在60分钟的融合蛋白的切断进行分析的结果也一并表示在图9的A以及B中。就像SDS-PAGE给出的那样，由于在反应开始后60分钟，融合蛋白PMT几乎完全被切断，游离的胃动素的增加几乎停止。因此反应时间定为60分钟。
另外不仅检测到在Arg143-Phe144切断生成的人胃动素，也检测到在Arg139-Arg140切断生成的多肽(RRAR-motilin)。在SDS-PAGE上，与人胃动素相比，看到RRAR-motilin的带浓、量多(图9B)，但从HPLC的分析结果看，产生了与前面结果矛盾的结果，即人胃动素的峰比RRAR-motilin的面积大、且量多的结果(图9A)。这可认为其原因是在SDS-PAGE中RRAR-motilin比人胃动素更容易被染色。因此，认为SDS-PAGE的结果中带的深浅没有正确反映两者的量比。
(3)胃动素的纯化
向预先用20mM乙酸(pH 4.0)平衡的Amersham Pharmacia公司生产SP-sepharose Fast Flow(27mL，Φ26mm×50mm)加上述的上清液200mL。然后用100mL的20mM乙酸(pH 4.0)以及100mL的20mM乙酸(pH 4.0)，0.1M NaCl清洗柱子。用200mL 20mM乙酸(pH 4.0)，0.1-0.5M NaCl的线性梯度进行洗脱。该阳离子交换色谱的流速都是以5mL/min操作。洗脱级分按照每5mL一次进行收集，从这些HPLC分析结果选择级分，进行收集。通过这样操作可以除去融合蛋白PMT在Arg139-Arg140被切断产生的多肽。
将收集的级分加到预先用0.1％三氟乙酸(TFA)平衡好的Vydac214TPB1520(24mL，Φ10mm×300mm)。通过0.1％TFA 100mL进行清洗，用200mL 0.1％TFA，0-30％乙腈线性梯度进行洗脱。该反相层析的流速都以1.6mL/min操作。按照每4mL一次对洗脱级分分别收集，由那些级分的HPLC分析结果选择收集级分。本纯化的结果如表3所示。
表3人胃动素的纯化结果
Figure S04828525020060420D000381
使用相当于0.1L W3110 M25 PMT培养液的包涵体进行纯化
在本纯化中得到的标准品的HPLC分析、质量分析以及N末端氨基酸分析的结果与人胃动素给出的结果一致。表明通过本纯化可以在每1L的W3110M25胃动素融合蛋白PMT生产菌培养液中以52％回收率得到纯度99.0％以上的人胃动素160mg。
实施例16.使用OmpT蛋白酶突变体从融合蛋白使生理活性多肽游 离例子
除了人胃动素以外，为了研究使用OmpT蛋白酶突变体是否可使生理活性多肽从融合蛋白游离，构建如图11所示的表达人肾上腺皮质刺激激素(1-24)融合蛋白PAC和人降钙素前体融合蛋白PCT的具有如图10A所示结构的质粒，从导入了这些质粒的W3110M25的转化体中以包涵体形式制备各融合蛋白。分别与表达OmpT蛋白酶突变体D97L或D97H的大肠杆菌W3110 M25的外膜级分于25℃下反应10分钟或2小时。作为对照，两融合蛋白也都用野生型OmpT蛋白酶进行反应。HPLC的解析结果如图12所示。
另外，通过HPLC分离各融合蛋白的切断片段，都进行质量分析。HPLC使用YMC PROTEIN RP柱，在柱温度40℃、1mL/min流速下进行。通过50分钟含有0.1％三氟乙酸的10-50％乙腈的线性梯度进行洗脱，对214nm的吸收进行监测。融合蛋白PAC在Arg143-Ser144被野生型OmpT蛋白酶切断，游离出人肾上腺皮质刺激激素(1-24)。另外在Arg140-Arg141也被切断，游离出RAR-ACTH。虽然在图12没有表示出，但在Arg143-Ser144和Lys158-Lys159也都被切断，还生成ACTH(1-15)和ACTH(16-24)。另外，PAC在Arg143-Ser144被D97L切断，游离出的人肾上腺皮质刺激激素(1-24)为野生型OmpT蛋白酶作用情况的2.9倍。
在另外部位切断产生的副产物没有游离。融合蛋白PCT被野生型OmpT蛋白酶在Arg139-Arg140和Arg140-Arg141切断，游离出RRAR-CT和RAR-CT。PCT被D97H在Arg139-Arg140、Arg141-Ala142和Arg143-Cys144切断，游离出RRAR-CT、AR-CT和人降钙素前体。确认从任一个融合蛋白都可以通过变异型OmpT蛋白酶使目的生理活性多肽游离。这并不是说利用本实施例所示连接肽序列和OmpT蛋白酶突变体的生理活性多肽生产系只应用于特定的生理活性多肽，可以认为其通用性广泛。
实施例17.融合蛋白PMT与OmpT蛋白酶突变体D97M的共表达
对于在大肠杆菌中以包涵体形式表达融合蛋白，该宿主大肠杆菌表达OmpT蛋白酶的情况，只是将得到的包涵体用尿素溶解，就受到OmpT蛋白酶的切断。因此对于OmpT蛋白酶缺损大肠杆菌株W3110M25作为宿主，对表达融合蛋白PMT的表达质粒pG117S4HompPMT(实施例9参照)和表达OmpT蛋白酶突变体D97M的质粒进行共表达的情况，研究了通过包涵体溶解是否可游离人胃动素。表达OmpT蛋白酶突变体D97M的质粒pOmpTD97M由于与pG117S4HompPMT复制起点相同，所以不能共表达。
为了可共表达，象以下那样构建来自pMW218的OmpT蛋白酶突变体D97M表达质粒(图13)。以质粒pOmpTD97M(实施例11参照)为模板，使用含有XhoI和HindIII制限酶部位的引物，通过PCR对pOmpTD97M的乳糖启动子至trpA终止子序列进行扩增。将得到的DNA片段用XhoI和HindIII消化后，插入到pMW218经SalI和HindIII消化了的DNA片段，制作来自pMW218的OmpT蛋白酶突变体D97M表达质粒。用如图13所示的来自pMW218的OmpT蛋白酶突变体D97M表达质粒转化W3110M25胃动素融合蛋白PMT生产菌(实施例9参照)。
将该W3110M25重组大肠杆菌在2L三角烧瓶中用含有四环素10mg/L以及卡那霉素20mg/L的LB液体培养基400mL于37℃下旋转培养过夜。包涵体的制备除了使用去离子水清洗以外都是按照常规方法进行。人胃动素从得到的包涵体游离的反应象以下那样进行。向10M尿素160μL中加1M磷酸钠(pH 7.0)20μL、以及50mM EDTA 16μL，添加融合蛋白包涵体(OD660＝100)80μL，对包涵体进行溶解。向溶解液中加124μL水，开始反应。
反应在25℃下进行，在反应开始后20、40、60、120、180、240、300、360、1440分后取样，通过SDS-PAGE进行分析(图14)。由分析结果可知通过1440分钟即24小时反应，融合蛋白PMT几乎完全被分解。这表明虽然并不象实施例15那样使用表达OmpT蛋白酶突变体D97M的质粒pOmpTD97M转化大肠杆菌那样迅速，但通过将反应时间延长，只是将由共表达菌得到的包涵体溶解，就可以完全分解融合蛋白PMT，使人胃动素游离。
实施例18.融合蛋白PMT、PMT6D、PMT7D与OmpT蛋白酶突变体D97M 的反应
由实施例14结果可知使用OmpT蛋白酶突变体D97M可由融合蛋白PMT生成胃动素，但在Arg139-Arg140切断也可生成副产物RRAR-motilin。另外，实施例8的结果表明通过在不希望切断的部位P3或P4位配置酸性氨基酸天冬氨酸，可以抑制在该部位的切断。
其中，胃动素融合蛋白PMT的Arg139-Arg140由于是不希望切断的部位，制作图15所示的表达胃动素融合蛋白PMT6D、PMT7D的具有如图10A所示结构的质粒，用这些质粒转化W3110 M25大肠杆菌株，以包涵体形式回收这些融合蛋白，使用这些包涵体，在胃动素融合蛋白浓度4mg/mL(OD660大约为20)、4M尿素、2mM EDTA、50mM磷酸钠、OmpT蛋白酶突变体D97M 0.52mg/mL(OD660为1)中于25℃下、反应2小时。另外包涵体蛋白质浓度通过HPLC象以下那样测定。向6％乙酸、2M尿素添加包涵体，达到OD660＝1，进行10000×g的3分钟离心分离，将上清液50μL加到YMC PROTEIN RP柱上。HPLC在柱温度40℃、流速1mL/min下进行。
进行40分钟含有0.1％三氟乙酸的20-60％乙腈的线性梯度洗脱，对220nm的吸收进行监测。作为标准品使用牛血清清蛋白(BSA)，决定包涵体蛋白质浓度。另外将大肠杆菌外膜级分中的OmpT蛋白酶突变体D97M悬浮液(OD660＝0.5)进行SDS-PAGE，作为标准品使用纯化OmpT，通过浓度计测定突变体浓度。图16、17和18给出了HPLC分析反应液的结果。从胃动素融合蛋白PMT、PMT6D、PMT7D分别游离出了280、250、370μg/mL的胃动素。
另外图16～图18给出了以从各个融合蛋白游离的胃动素浓度为100时的副产物AR-motilin(在Arg141-Ala142被切断后生成)、RRAR-motilin(在Arg139-Arg140被切断后生成)的浓度。在PMT(图16)中，分别生成2.8、33％的副产物，而在PMT6D(图17)中为3.5、16％，特别RRAR-motilin的生成被抑制。另外在PMT7D(图18)中没有检测到来自RRAR-motilin的峰。结果与实施例8的结果一致，可知对于使用OmpT突变体酶的情况，通过在不希望切断的部位的P3或P4位配置酸性氨基酸天冬氨酸，可以抑制在该部位的切断。从PMT7D游离出的胃动素最多(370μg/mL)，这可认为是没有副产物生成，胃动素游离浓度变高的原因。
以下给出了本发明涉及到的各种融合蛋白的各个基本全氨基酸序列。
融合蛋白PRR(序列编号：1；图1；实施例1～2、13)
与PRR相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys    15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala    30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr    45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg    60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu    75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn    90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr   105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His   120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu   135
Leu Arg Leu Tyr
Figure S04828525020060420D000421
His His Gly Ser Gly Ser Pro Tyr Arg                               150
His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser   165
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val   180
Lys Gly Arg Gly                                               184
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列、双下划线部分表示作为OmpT蛋白酶切断部位的碱性氨基酸对(Arg140-Arg141)。来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸为止的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺开始至氨基酸编号153的精氨酸的氨基酸序列构成。
PA系融合蛋白(序列编号：2；图2；实施例1～2)
PA涉及到的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys    15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala    30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr    45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg    60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu    75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn    90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr   105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His   120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala   135
Ala Ala Ala Ala
Figure S04828525020060420D000431
Ala Ala Ala Ala Gly Ser Pro Tyr Arg                               150
His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser   165
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val   180
Lys Gly Arg Gly                                               184
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列，双重下划线部分表示作为OmpT蛋白酶切断部位的碱性氨基酸对(Arg140-Arg141)。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号153的精氨酸的氨基酸序列构成。
PA 3’系融合蛋白(序列编号：3；图2～3；实施例3～6)
与PA3’相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys   15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala   30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr   45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg   60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu   75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn   90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr  105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His  120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala  135
Ala Ala Ala AlaAla
Figure S04828525020060420D000442
Ala Gly Ser Pro Tyr Arg                                          150
His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser  165
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val  180
Lys Gly Arg Gly                                              184
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列，双重下划线部表示OmpT蛋白酶切断部位(Arg140-Arg141以及Arg143-Ala144)。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号153的精氨酸的氨基酸序列构成。
PA23’系融合蛋白(序列编号：4；图3～4；实施例5～8)
与PA23’相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys     15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala     30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr     45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg     60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu     75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn     90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr    105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His    120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala    135
Ala Ala Ala
Figure S04828525020060420D000451
AlaAla Gly Ser Pro Tyr Arg                                            150
His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser    165
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val    180
Lys Gly Arg Gly                                                184
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人胰高血糖素肽-1(7-37)(GLP-1(7-37))的氨基酸序列，双重下划线部表示OmpT蛋白酶切断部位(Arg139-Arg140、Arg140-Arg141以及Arg143-Ala144)。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号153的精氨酸的氨基酸序列构成。
融合蛋白PRMT(序列编号：5；图5；实施例9～10、14)
与PRMT相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys    15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala    30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr    45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg    60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu    75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn    90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr   105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His   120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu   135
Lue Arg Leu Tyr
Figure S04828525020060420D000461
 Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr Gly Glu Leu   150
Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln               162
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人胃动素的氨基酸序列，双重下划线部表示相当于融合蛋白PRR的OmpT蛋白酶切断部位P1位的精氨酸(Arg140)。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号140的精氨酸的氨基酸序列构成。
融合蛋白PMT(序列编号：6；图5；实施例9～10、14～15、17～ 18)
与PMT相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys    15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala    30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr    45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg    60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu    75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn    90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr   105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His   120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala   135
Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Phe Val Pro Ile Phe Thr Tyr   150
Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln   165
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人胃动素的氨基酸序列。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号143的精氨酸的氨基酸序列构成。
融合蛋白PAC(序列编号：7；图11；实施例16)
与PAC相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys  15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala  30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr  45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg  60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu  75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn     90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr    105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His    120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala    135
Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Ser Tyr Ser Met Glu His Phe    150
Arg Trp Gly Lys Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val Lys Val    165
Tyr Pro                                                        167
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人肾上腺皮质刺激激素(1-24)的氨基酸序列。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号143的精氨酸的氨基酸序列构成。
融合蛋白PCT(序列编号：8；图11；实施例16)
与PCT相关的序列
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys   15
Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala   30
His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr   45
Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg   60
Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Glu Ser Leu Leu   75
Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Asp Ser Ser Asn   90
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr  105
Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His  120
His His His Pro Gly Gly Arg Gln Met His Ala Ala Ala Ala Ala  135
Ala Ala Ala Arg Arg Arg Ala Arg Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys  150
Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe  165
Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly                  176
在上述氨基酸序列中，下划线部表示人降钙素前体的氨基酸序列。来自大肠杆菌β-半乳糖苷酶的N末端117氨基酸的保护蛋白质(β-gal117S4H)由氨基酸编号1的蛋氨酸至氨基酸编号127的精氨酸的氨基酸序列构成。连接肽由氨基酸编号128的谷氨酰胺至氨基酸编号143的精氨酸的氨基酸序列构成。
Figure IYZ000001412366300031
Figure IYZ000001412366300051
Figure IYZ000001412366300061

Claims (11)

1.一种多肽的切断方法，其特征是：在Pn...P2-P1-P1’-P2’...Pn’中，P1位和P1’位间的肽键是切断部位，使目的肽从融合蛋白中游离时，将目的肽的N末端氨基酸作为P1’位氨基酸残基，与多肽中希望的切断部位相关的P1位为精氨酸，P1’位为精氨酸或赖氨酸以外的氨基酸，在从P5位至P3位的氨基酸序列中连续配置3个精氨酸，
其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P1’位是丝氨酸或丙氨酸，使用第97位氨基酸是亮氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体在该多肽中希望的切断部位进行切断，
其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P1’位是苯丙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，使用第97位氨基酸是蛋氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体在该多肽中希望的切断部位进行切断，或
其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P1’位是丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺，使用第97位氨基酸是组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体在该多肽中希望的切断部位进行切断。
2.一种目的肽的制造方法，其特征是：用含有编码融合蛋白的基因的表达质粒转化宿主细胞，所述融合蛋白是通过在希望的切断部位与C末端为精氨酸的保护肽融合的N末端为精氨酸或赖氨酸酸以外的氨基酸的目的肽构成的，在Pn...P2-P1-P1’-P2’...Pn’中，P1位和P1’位间的肽键是切断部位，使目的肽从融合蛋白中游离时，将目的肽的N末端氨基酸作为P1’位氨基酸残基，在融合蛋白质中的与该切断部位相关的P5至P3位的氨基酸序列中连续配置3个精氨酸，上述切断部位是可被下述OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体切断的切断部位，
其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P1’位或目的肽的N末端是丝氨酸或丙氨酸，使用第97位氨基酸是亮氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体，
其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P1’位或目的肽的N末端是苯丙氨酸、丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或酪氨酸，使用第97位氨基酸是蛋氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体，或
其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P1’位或目的肽的N末端是丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或天冬酰胺，使用第97位氨基酸是组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体；
在该细胞内使该基因表达，在上述切断部位通过上述蛋白酶切断，由融合蛋白获得目的肽。
3.权利要求1或2的方法，该方法是包括使用OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体在多肽中希望的切断部位进行切断的多肽的切断方法或包括在融合蛋白中希望的切断部位进行切断的目的肽的制造方法，其特征是当多肽中或融合蛋白中不希望被OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体切断的部位存在时，通过在与该部位相关的P3位配置天冬氨酸，可以抑制在该部位的切断。
4.权利要求1或2中任一项所述的方法，其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P5位至P1位的氨基酸序列是Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
5.权利要求1或2中任一项所述的方法，其中与多肽中或融合蛋白中希望的切断部位相关的P7位至P1位的氨基酸序列是Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Arg。
6.权利要求1或2中任一项所述的方法，其中从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸是亮氨酸、蛋氨酸或组氨酸。
7.权利要求1或2所述的方法，其中目的肽是由22个氨基酸残基至45个氨基酸残基构成的肽。
8.权利要求7所述的方法，其中目的肽是肾上腺皮质刺激激素(1-24)、胃动素或降钙素前体。
9.权利要求2所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌。
10.权利要求1或2所述的方法，作为切断用蛋白酶使用表达编码从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸是亮氨酸、蛋氨酸或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体的基因的菌体本身。
11.权利要求1或2所述的方法，使编码从OmpT蛋白酶的N末端开始的第97位氨基酸是亮氨酸、蛋氨酸、或组氨酸的OmpT蛋白酶97位氨基酸突变体的基因与编码希望用该蛋白酶切断的多肽或融合蛋白的基因共表达。
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