NO300067B1 - Fremgangsmåte for å tilveiebringe renset, biologisk aktiv CSF-1 dimer - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å tilveiebringe renset, biologisk aktiv CSF-1 dimer. Den vedrører spesielt fremgangsmåter som muliggjør produksjon av biologisk aktive, dimere former av CSF-1 fra bakterielle verter som uttrykker gener som koder for monomeren. CSF-1 dimeren har meget høy spesifikk biologisk aktivitet.

Kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1) er et av flere proteiner som har evnen til stimulering av kolonidannelse ved benmargs-celler sådd ut i semifast kulturmedium. CSF-1 skjelnes fra andre kolonistimulerende faktorer i kraft av dens evne til å stimulere disse cellene til å bli hovedsakelig makrofagkolonier. Andre CSFer stimulerer produksjon av kolonier som består av neutrofile granulocytter og makrofager; hovedsakelig neutrofile granulocytter; eller neutrofile og eosinofile granulocytter og makrofager. En oversikt av disse CSFene er blitt publisert av Dexter , T.M., Nature (1984) 309:746, og av Vadas, M.A. , J Immunol (1983) 130:793. Det finnes for tiden ingen rutine in vivo analyse som er kjent for å være spesifikk for CSF-1 aktivitet.

Karaktertrekkene til nativt humant CSF-1 er omfattende, og det er til og med ikke enda klarlagt hvilken form av CSF-1 som er aktiv i menneskekroppen. Oppløselige former av naturlig-produsert CSF-1 er blitt renset i forskjellig grad fra human urin, muse L-celler, dyrket human bukspyttkjertel-karsinom (MIA PaCa) celler, og også fra forskjellige humane og muse-lungecelle kondisjonerte medier, fra humane T-lymfoblastceller, og fra humant placental-kondisjonert medium. Mange, hvis ikke alle isolerte native CSF-l-proteiner ser ut til å være glykosylerte dimerer, uansett kilde. Det er betraktelige forskjeller i molekylvekter når det gjelder de monomere komponentene av CSF-1, som sannsynligvis er et resultat av variasjoner i C-terminal prosessering og/eller grad av glykosylering. For eksempel viser Westernanalyse at CSF-1 utskilt av MIA PaCa-cellelinjen inneholder reduserte monomerer på omtrent 26 og 30 kd, og likeledes 40, 48 og 70 kd former. Andre CSF-1 molekylvekter er blitt rapportert. For eksempel, har den monomere reduserte formen av CSF-1, isolert fra human urin, en relativt lav molekylvekt på 25 kd når den er isolert, og 14-17 kd når den er omfattende deglykosylert in vitro (Das, S. og Stanley, E.R. , J Biol Chem (1982) 257:13679).

Eksistensen av "nativ-lignende" CSF-1 referanseproteiner er viktig på grunn av at disse proteinene tilveiebringer standarder som kan anvendes for å sammenligne kvaliteten og den biologiske aktiviteten til refoldete rekombinante former av CSF-1. På grunn av dette har vi stolt på oppløselig CSF-1 produsert av Mia PaCa cellelinjen og likeledes egenskaper til andre sterkt rensede CSF-l-molekyler som er blitt beskrevet i litteraturen. Den spesifikke aktiviteten til disse rensede "nativ-lignende" referanseproteinene har vanligvis falt i området 4 til 10 x IO<7> enheter pr. mg (målt ved in vitro musebenmargskoloni-dannende analyser).

CSF-1 er også blitt produsert fra rekombinant DNA ved anvendelse av to tilsynelatende relaterte cDNA-kloner: (1) en "kort" form som koder for en beskjed som, når den blir translatert, produserer et monomer protein på 224 aminosyrer som kommer etter en 32-aminosyre signalsekvens (Kawasaki, E.S., et al, Science (1985) 230:292-296, og PCT W086/04607, og begge er inkorporert heri ved referanse); og (2) en "lang" form, som koder for et monomerprotein på 522 aminosyrer, som også kommer etter signalsekvensen på 32-aminosyrer. Den lange formen er blitt klonet og blitt uttrykt av to grupper, som beskrevet i Ladner, M.B., et al, The EMBO J (1987) 6(9):2693-2698, og Wong, G. , et al, Science (1987) 235-1504-1509, som begge er inkorporert heri ved referanse. (DNA og aminosyresekvensene til både "kort" og "lang" formene er vist i figurene 5 og 6, respektivt; men 32-aminosyresignalsekvensen er derimot ufullstendig oppført i figur 6).

De lange og korte formene av CSF-l-kodende DNA ser ut til å ha oppstått fra en variabel spleisekobling ved delen som er oppstrøms for ekson 6 til genomt CSF-l-kodende DNA. Når CSF-1 blir uttrykt i visse eukaryote celler fra enten de lange eller korte cDNA-formene, blir den prosessert i varierende grad ved C-terminus og/eller varierende glykosylert. Dermed fremkommer CSF-l-proteiner med varierende molekylvekter når den reduserte monomere formen blir analysert ved Western analyse.

Aminosyresekvensene til de lange og korte formene, som antatt fra DNA-sekvensen til de isolerte klonene og ved deres beslektskap med den genome sekvensen, er identiske med hensyn på de første 149 aminosyrene ved N-terminusen til det modne proteinet, og divergerer deretter med hensyn på innbefat-ningen i den lengre klonen av et innskudd på 894 bp i tillegg som koder for 298 aminosyrer i tillegg etter glutamin 149. Både de korte og lange formene av genet tillater ekspresjon av proteiner med sekvenser inneholdende identiske regionen ved C-terminus, og likeledes ved N-terminus. Biologisk aktivt CSF-1 er blitt isolert når cDNA som koder for de første 150 eller 158 aminosyrene til den korte formen, eller koder for de første 221 aminosyrene i den lengre formen, blir uttrykt i eukaryote celler.

På grunn av de fleste, hvis ikke alle, av de native utskilte CSF-l-molekylene er glykosylerte eller dimere, oppstår sannsynligvis betraktelig posttranslasjonell prosessering in vivo. På grunn av kompleksiteten av det native CSF-l-molekylet, har det vært antatt hensiktsmessig å uttrykke CSF-1-genet i celler avledet fra høyere organismer. Det er usann-synlig at aktivt protein ville bli tilveiebragt når genet ble uttrykt i mere hensiktsmessige bakterielle verter, såsom E. coli. Bakterielle verter har ikke kapasiteten til å glykosy-lere proteiner, deres Intracellulære betingelser er heller ikke egnede for refolding, disulfidbindingsdannelse og disulfid-stabilisert dimerisering, som sannsynligvis er essensielt for fullstendig CSF-l-aktivitet. Eksperimentell produksjon av rekombinant CSF-1 i E. coli har, forut for denne oppfinnelsen, resultert i proteiner med veldig lav aktivitet, selv om dets identifikasjon som monomer CSF-1 har blitt bekreftet ved immunoanalyse, N-terminal sekvensering og aminosyreanalyse.

Det er nå blitt akseptert at inaktive former av rekombinant fremmede proteiner produsert i bakterier eventuelt krever ytterligere "refolding" trinn for å gjøre dem nyttige for hensiktene som de er ment for. Som et dimerisk protein inneholdende et stort antall cysteiner og disulfidbindinger, som er nødvendige for aktivitet, representerer CSF-1 en spesielt vanskelig utfordring for produksjon fra bakterielle systemer. Ofte er rekombinante proteiner produsert i E. coli, innbefattende CSF-1 produsert slik, i form av veldig uopp-løselig intracellulære proteinpresipitater referert til som innleiringslegemer eller refraktile legemer. Disse innleir-ingene kan lett bli separert fra oppløselige bakterielle proteiner, men deretter må de bli oppløst under betingelser som resulterer i vesentlig fullstendig denaturering av proteinet. Selv utskilte proteiner fra bakterielle kilder, som ikke nødvendigvis utgjør de samme oppløselighetsprob-lemene, kan kreve betraktelig manipulasjon for å gjenopprette aktiviteten. Hvert forskjellige protein krever eventuelt en forskjellig refoldingsprosedyre for å oppnå full biologisk aktivitet.

Et antall artikler har rapportert forsøk på refolding for individuelle proteiner produsert i bakterielle verter, eller som på annen måte er i denaturert eller ikke-nativ form. Representative eksempler er beskrevet nedenfor.

Reformering av et oligomerisk enzym etter denaturering ved natriumdodecylsulfat (SDS) ble rapportert av Weber, K. , et al, J Biol Chem (1971) 246:4504-4509. Denne fremgangsmåten ble ansett å løse et problem som oppstår ved binding av proteinet til SDS, og fremgangsmåten anvendte fjerning av det denaturerte proteinet fra SDS i nærvær av 6 M urea, sammen med anionutbytting for å fjerne SDS, etterfulgt av fortynning fra urea, alle i nærvær av reduksjonsmidler. Proteinene som i det minste var delvis refoldet innbefatter: aspartat trans-karbamylase, B-galaktosidase, kaninmuskelaldolase, og kappeprotein fra bakteriofag R-17.

Light, A., I Biotechniques (1985) 3:298-306, beskriver forskjellige forsøk på å refolde et stort antall proteiner. Det er innlysende fra beskrivelsen i denne referansen at de anvendbare teknikkene er veldig individuelle i forhold til bestemte proteiner. I noen tilfeller har refolding forårsaket at det ikke har vært mulig å tilveiebringe betraktelige mengder av bestemte proteiner og resultatene er veldig uforutsigbare. I tillegg ble refoldingsprosedyrer for rekombinant urokinase produsert i E. coli beskrevet i Vinkler, M.E. , Biotechnology (1985) 3:990-999. I dette tilfellet ble materialet løst opp i 8 M urea eller 5 M guanidin hydroklorid, og rearrangeringen av disulfidene ble muliggjort ved anvendelse av en buffer inneholdende et glutationredokssystem. Rekombinant human immun interferon, som ikke har noen disulfidbindinger, har blitt refoldet for å danne et mere aktivt preparat ved anvendelse av kaotrofiske midler i fravær av tiol-disulfid utbyttereagenser (PCT-søknad WO 86/06385). I et annet eksempel ble bakterielt syntetisert granulocytt makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), et medlem av CSF-gruppen, også produsert i E. coli og refoldet etter oppløsning i 6 M urea. Dette CSF er ikke beslektet med CSF-1, på grunn av at GM-CSF har en bestemt aminosyresekvens og også er monomer.

Anvendelse av refoldingsprosedyrer for å oppnå rekonstitusjon av aktivitet i multimere proteiner er også blitt beskrevet av Herman, R.H., et al, Biochemistry (1985) 24:1817-1821, for fosfoglyceratmutase, og av Cabilly, S. , Proe Nati Acad Sei USA (1984) 82:3273-3277, for immunoglobuliner. Enda en annen prosedyre for immunoglobulingjenoppretning var beskrevet av Boss, M.A., et al, Nucleic Acids Research (1984) 12:3791-3806. Alle disse prosedyrene anvender denaturering og anvendelse av hensiktsmessige oksydasjonsmidler og reduksjonsmidler eller sulfitolysereagenser. En beslektet tilnær-mingsmåte anvender tioredoksinkatalysatoren, og er beskrevet av Pigiet, V.P., Proe Nati Acad Sei USA (1986) 83:7643-7647.

Visse aspekter når det gjelder oppløsning, rensing og refolding av visse rekombinante proteiner produsert som refraktile legemer i bakterier er også beskrevet i U.S. 4,511,562; 4,511,503; 4,512,912; 4,518,526 og EPO publikasjon 114,506 (Genentech).

Referansene ovenfor er bare representative for en stor mengde litteratur som, når de blir studert sammen, viser individuelle trinn i protokoller som kan bli modifisert og kombinert i forskjellige rekkefølger for å tilveiebringe individuelt skreddersydde fremgangsmåter for spesielle proteiner produsert i henhold til spesielle ekspresjonssystemer. Det er innlysende at det er nødvendig å skreddersy prosedyrene på ny for å bli tilpasset et spesifikt tilfelle er en nødvendighet for produsering av refoldet produkt med full biologisk aktivitet i nyttige mengder.

For eksempel beskriver et antall publiserte fremgangsmåter et trinn for vellykket refolding av proteinet som er blitt produsert på en rekombinant måte. Det kommmer ikke klart frem fra disse referansene, men det er kjent innenfor fagområdet, at utgangsmaterialet for refolding kan eksistere i forskjellige former, avhengig av ekspresjonssystemet som blir anvendt. Når det gjelder bakteriell ekspresjon, er det derimot klart at produktet ikke blir glykosylert, og at i tillegg produksjon av et intracellulært disulfid-bundet dimerisk produkt er forhindret av de reduserende omgivelsene i bakterielle celler.

Den for tiden mest vanlige formen av rekombinant protein utgangsmateriale for refolding i et intracellulært, uoppløse-lig protein som blir produsert ved ekspresjon av et gen for modent eller bakterielt fusjonsprotein, som mangler en funksjonell signalsekvens, under kontroll av standard bakterielle promotere såsom trp eller P^. På grunn av at rekombinant produserte produkter i bakterier blir produsert i høye konsentrasjoner i reduserende miljø, og på grunn av at konstruksjonene vanligvis ikke gjør det mulig for bakteriene å utskille det rekombinante proteinet, danner disse fremmede proteinene ofte uoppløselige innleiringslegemer.

Signalsekvenser som virker i bakterier er kjente, innbefattende E. coli penicillinasesekvensen beskrevet av Gilbert et al, U.S. patent 4,411,994 og 4,338,397, B. licheniformis penP sekvensene beskrevet av Chang i U.S. patentnr. 4,711,843 og 4,711,844, og fosfatase A signalsekvensen (phoA) beskrevet av Chang, et al, i Europa patent publikasjon nr. 196,864, publisert 8. oktober 1986, og inkorporert heri ved referanse. Utskilling kan bli tilveiebragt i noen stammer. Hvis derimot Gram-negative verter blir anvendt, oppstår eventuelt ikke fullstendig utskilling, og proteinet forblir eventuelt i periplasmaområdet. Til tross for dette er det mye mere sannsynlig at proteiner uttrykt under kontroll av promotere og signalsekvenser såsom <p>hoA vil bli produsert i oppløselig form hvis de kan bli refoldet og danner de nødvendige disulfidbindingene i det ekstracellulære miljøet. Fremgangsmåtene beskrevet heri nedenfor er av verdi for både intracellulære produkter og utskilte produkter hvor refolding er nødvendig.

Det er ingen steder i litteraturen blitt beskrevet en spesifikk fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt dimer CSF-1 fra bakterier. Foreliggende oppfinnelse beskriver flere refoldingsfremgangsmåter som innbefatter CSF-l-proteiner med forskjellige primærstrukturer. De resulterende refoldete CSF-l-proteinene er fullstendig aktive og oppløse-lige, og de forskjellige molekylene varierer i fysiske egenskaper i tilstrekkelig grad slik at de ventes å utvise forskjellige farmakokinetiske og/eller farmakologiske egenskaper når de blir anvendt terapeutisk in vivo.

Oppfinnelsen er rettet mot en fremgangsmåte for tilveiebringing av biologisk aktivt, dlmer CSF-1 ved anvendelse av monomerutgangsmateriale produsert av bakterielle celler som er blitt transformert med egnede CSF-1 genkonstruksjoner. Fremgangsmåten drar nytte av de forskjellige egenskapene til de monomere og dimere formene av proteinet for å tilveiebringe nyttige rensningsfremgangsmåter, og anvender egnede reagenser for å omdanne den uoppløselige monomere formen til en aktiv, oppløselig, dlmer form.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for å tilveiebringe renset, biologisk aktiv CSF-1 dimer kjennetegnet ved at man: (a) dyrker rekombinante bakterier som uttrykker CSF-monomeren, (b) isolerer i et miljø med en tilstrekkelig konsentrasjon av kaotrofiske middel(er), fortrinnsvis guanidin eller urea, og reduseringsmiddel(er) for å ødelegge den tertiære strukturen til CSF-1, den reduserte monomere, oppløste formen av CSF-1 produktet fra bakterielle celler, (c) refolder monomeren fra (b) i et tidsrom på minst 24 timer under refoldende betingelser som innbefatter dannelsen av intra og inter-kjedede disulfidbindinger for å produsere CSF-1 dimer i en mengde på mindre enn 2 mg/ml; og betingelsene omfatter: (i) reduserer konsentrasjonen av det kaotrofiske midlet til 0.1-2M, og (ii) kontakter monomeren ifølge (b) med et redokssystem, som metallioner/luft eller sulfhydryl/disulfidkombinasjon, så som oksydert eller redusert glutation, ved en temperatur på 0-37°C, fortrinnsvis 0-4°C,

(d) renser refoldet, dimerisert CSF-1 fra (c).

I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for dannelse av heterodimere CSF-l-proteiner fra en blanding av forskjellige monomere former. Monomerene kan bli blandet direkte eller så kan de bli blandet i kraft av produksjon av den samme rekombinante cellen. Slike heterodimerer kan tillate produksjon av CSF-l-produktet med forbedret in vivo anvendbarhet.

Et annet aspekt innbefatter det ytterligere trinnet, hvis nødvendig, som innbefatter på ny å oppløse gjenværende uoppløselig CSF-1 som er tilstede på slutten av refoldingsfremgangsmåten og øker utbyttet gjennom resirkulering.

Et annet aspekt ifølge oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for tilveiebringing av klinisk rent CSF-1 dimer protein som innbefatter utsetting av det refoldete dimere proteinet for kromatografi ved anvendelse av en hydrofob bærer, såso fenyl-Sepahrose eller fenyl-TSK HPLC. Figur 1 viser delvis rensing av en type av monomer CSF-1 ved anvendelse av molekylær siktkromatografI. Figur 2 viser dimerisasjonsgraden Ifølge analysen ved anvendelse av molekylær siktkromatografi. Figur 3 representerer RP-HPLC analyse av en type denaturert og refoldet rekombinant E. coli CSF-1. Figur 4 viser en spektralanalyse for å bestemme oppløselig-heten av en type av denaturert og refoldet rekombinant E. coli CSF-1. Figur 5 viser cDNA og utledet aminosyresekvens for en cDNA-klon som koder for en "kort" form av humant CSF-1 betegnet pcCSF-17. Figur 6 viser cDNA og avledet aminosyresekvens for en cDNA-klon som koder for en "lang" form av humant CSF-1 betegnet pcCSF-4. Figur 7 viser resultatene til en reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE analyse for dimer asp5gSCSF/CV150 CSF-1.

A. Definisjoner

Som anvendt heri betegner "kaotrofisk miljø" et miljø som inneholder hensiktsmessige kaotrofiske midler, såsom urea i tilstrekkelig konsentrasjon for å ødelegge den tertiære strukturen til proteiner, eller som blir opprettholdt ved en temperatur eller annen betingelse som forårsaker slik ødelegging.

Kaotrofiske midler eller betingelser såsom temperatur og pH kan ødelegge strukturen på mange måter, innbefattende ødelegging av hydrogenbindinger. Egnet kaotrofisk miljø innbefatter 2-8 M urea, 4-7 M guanidin, detergenter såsom SDS ved konsentrasjoner rundt 0,1 vekt-#, og syre såsom eddiksyre ved konsentrasjoner på omtrent 1 M, basiske betingelser på f.eks. pH 11 eller høyere, og forhøyede temperaturer. Den normale fysiologiske konformasjonen av proteinene kan bli reversibelt og irreversibelt forandret når det blir plassert i et kaotrofisk miljø, og den primære strukturen kan bli "foldet opp" i varierende grad, avhengig av konsentrasjonen til det kaotrofiske middelet og grad av styrken på andre kaotrofiske betingelser. En bør merke seg at midler og/eller betingelser som skaper kaotrofisk miljø kan bli anvendt i kombinasjon eller etter hverandre. Blandinger av kaotrofiske midler kan for eksempel bli anvendt, eller så kan CSF-1 først bli plassert i et kaotrofisk miljø skapt av et kaotrofisk middel, deretter utsatt for et annet kaotrofisk miljø skapt av et annet middel eller ved temperatur.

Som anvendt heri betegner "reduksjonsmiddel" et reduksjonsmiddel som har evnen til å redusere disulfidbindinger til sulfhydrylgrupper. En mengde milde reduseringsstoffer som har evnen til å tilveiebringe denne omdanningen er tilgjeng-elige, men den mest vanlige innbefatter tiol-inneholdende andeler såsom p<->merkaptoetanol eller ditiotreitol. Andre funksjonelle reduksjonsmidler innbefatter redusert glutation og fritt cystein. Det er blitt lagt vekt på tiol-inneholdende forbindelser, men et hvilket som helst stoff som har evnen til å omdanne disulfid til tio uten uønskede sidereaksjoner er innbefattet i denne definisjonen.

"Reduserende betingelser" betegner betingelser som opprett-holder eller setter, etter som, CSF-l-proteinet i monomer redusert form. Hvis CSF-1 blir produsert i et miljø som bringer det opprinnelig i redusert form (dvs. cysteiner er i nevnte form, ikke cystin) kan det være tilstrekkelig med mildere betingelser enn det som ville være nødvendig hvis proteinet opprinnelig var i oksydert form.

"Refoldingsbetingelser" betegner betingelser hvori et denaturert protein får danne en konformasjon assosiert med fysiologisk aktivitet. Dette innbefatter spesifikt dannelse av disulfider og/eller assosiasjon til dimere eller multimere strukturer som er funksjonelt identiske for disse av det native protein. Slike betingelser innbefatter sakte fjerning av eller trinnvis fortynning av kaotrofe midler i nærvær eller fravær av midler som tillater dannelsen av disulfidbindinger som vanligvis er tilstede i den aktive konformasjonen. Hvis det benyttes høye konsentrasjoner av kaotrofiske midler for oppløsning, eller hvis proteinene blir denaturert

på grunn av disse midlene, kan de kaotrofe stoffene innbefattet i kaotrofen bli fjernet ved enkel fortynning, ved dialyse, ved hulfiber-diafiltrering, eller ved hjelp av et antall andre fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet hvorpå konsentrasjonen til mindre molekyler effektivt kan bli redusert, med eller uten en korresponderende reduksjon i konsentrasjonen til proteinet.

Det er ønskelig å fremme dannelsen av disulfidbinding i løpet av denne fremgangsmåten. Dette kan bli tilveiebragt ved luftoksydasjon eller ved tilsetting av reagenser egnet for denne hensikten i refoldingsbetingelser. Slike reagenser innbefatter "redokssystemer" som tillater den kontinuerlige oksydasjonen og reduksjonen av tiol/disulfidpar. En av de mest vanlige anvendte systemer er glutation, i både oksyderte og reduserte former. Det er kjent at oksydert glutation og redusert glutation er naturlig forekommende bestanddeler av pattedyrceller og kan, til og med i tillegg til eller sammen med isomerase katalysere denne reaksjonen, fremme tiol/di-sulf idbåndutveksling in vivo (Tietze, F., Anal Biochem (1969) 27:502). Andre par av oksydert (disulfid) og redusert (tiol) reagenser kan også bli anvendt; disulfide og tiole trenger derimot ikke være avledet fra det samme molekylet. I tillegg kan nye disulfidbindinger bli dannet ved sulfitolyse, etterfulgt av oksydasjon av de sulfonerte tiolgruppene. Denne fremgangsmåten er beskrevet i TJ.S. patent 4,620,948 til Builder et al, ovenfor.

Rensningsfremgangsmåten referert til heri innbefatter en mengde prosedyrer. Blant flere typer som kan være nyttige er størrelsefraksjonering ved anvendelse av molekylær siktkro-matograf i; ione-byttekromatografi under egnede betignelser, affinitetskromatografi ved for eksempel anvendelse av monoklonale antistoffer rettet mot den biologisk aktive formen av proteinet; adsorpsjonskromatografi ved anvendelse av uspesifikke bærere, såsom hydroksyapatitt, silisiumoksyd, aluminiumoksyd, osv.; og også gel-bærende elektroforese. Når det gjelder CSF-1 har hydrofob interaksjonskromatografi, såsom ved anvendelse av fenyl-Sepharose eller fenyl-TSK vist seg å være spesielt nyttig. I tillegg har den opprinnelige rensingen av monomer CSF-1 ved anvendelse av ione-byttekroma-tograf i (såsom DEAE-Sepharose kromatografi) vist seg å være en spesielt effektiv fremgangsmåte for å øke renheten av det dimere CSF-l-proteinet. Disse rensningsteknikkene er, generelt, velkjente innenfor fagområdet, og en detaljert beskrivelse av spesielle trekk med deres spesifikke anvendelse på CSF-l-proteiner er beskrevet i eksemplene nedenfor.

Som anvendt heri betyr "biologisk aktiv" et preparat av humant CSF-l-produsert rekombinant i bakterier som har essensielt den samme spesifikke aktiviteten i humane og musebenmargskolonidannende analyser som nativt, humant CSF-1 produsert av pattedyrceller.

"Klinisk ren" CSF-1 innbefatter et preparat av biologiskt aktivt humant CSF-1 produsert rekombinant i bakterier som er minst 9536 CSF-1 enten ved RP-HPLC eller ved enten reduserende eller ikke-reduserende SDS-PAGE og som har et endotoksininn-hold på mindre enn omtrent 1,0 ng/mg CSF-1 analysert ved standard LAL-analyse.

B. CSF- l- proteinet

Som beskrevet i innledningen er CSF-1 biologisk aktivt i den dimere formen. Det har vært mulig å tilveiebringe rekombinant DNA som koder for CSF-1 monomerer bestående av en mengde aminosyresekvenser og lengder. Figurene 5 og 6, respektivt, viser DNA og aminosyresekvenser for den korte og lange formen, som begge kommer etter en 32-aminosyresignalsekvens. Sekvensene til monomer CSF-l-protein er heri ansett å være den 224-aminosyre-korte formen (SCSF) og 552-aminosyre lange formen (LCSF) vist i disse figurene.

Plasmider som koder for en mengde CSF-l-former er for tiden tilgjengelig, og kan bli uttrykt i bakterielle systemer. Som beskrevet ovenfor kan genet som koder for den lange formen av CSF-1 bli uttrykt 1 sin helhet, eller så kan genet bli forkortet for å uttrykke C-terminalt deleterte former. I tillegg kan de første to eller tre N-terminale kodonene bli deletert slik at det resulterende proteinet er mere homogent. N-terminalt metionin som blir kodet oppstrøms for modent nativt sekvens N-terminus (som er opprettholdt i proteinet som "N-terminalt met" hvis ikke det blir fjernet ved etter-translasjonell prosessering), har vist seg å bli lettere fjernet fra disse N-terminale delesjonskonstruksjoner. Signifikant heterogenitet (oppløsbart ved RP-HPLC-analyse av den reduserte monomeren) finnes når genet som koder for den "native" N-terminale sekvensen) for eksempel, av den korte formen, mutein SCSF/CV150) bli uttrykt. Denne heterogeniteten elimineres når det korresponderende CSF-l-genet som mangler de to glutaminsyre N-terminale kodonene blir uttrykt. N-terminal forkortede former av andre korte og lange CSF-1-genkonstruksjoner kan på lignende måte også bli anvendt.

For hensiktsmessighet vil den primære strukturen til monomere proteiner kodet av de forskjellige cDNA-konstruksjonene som er beskrevet bli betegnet heri ved anvendelse av en forkortet versjon, som følger: LCSF betegner 522-aminosyresekvensen beskrevet for klonen pcCSF-4, beskrevet i Ladner et al-artikkelen referert til ovenfor, The EMBO J (1987) 6(9):2693-2698, og vist i figur 6. SCSF betegner 224-aminosyresekvensen beskrevet for klonen pcCSF-17, vist i figur 5, beskrevet i Kawasaki-artikkelen referert til ovenfor, Science (1985) 230:292-296, også inkorporert heri ved referanse. Denne bestemte pcCSF-17 klonen har et tyrosinresidie i posisjon 59, mens genet definert ved den genomiske klonen har vist seg å kode for asparginsyre i denne posisjonen. Derfor betegner ASP59SCSF et mutein av den beskrevne korte formen som har denne modifikasjonen. (Den beskrevne LCSF-klonen koder for Asp i posisjon 59). Muteiner som korresponderer med amino-syresubstitusjoner innenfor de "native" sekvensene som er beskrevet er på lignende måte betegnet ved substitusjonen angitt med posisjonen. Muteinformer av CSF-1 er beskrevet i Europa patentsøknad nr. 87309409.8, inngitt 23. oktober 1987, som er inkorporert heri ved referanse. Når konstruksjoner som formodentlig koder for disse proteinene blir uttrykt som modne proteiner i bakterier, kan de også ha beholdt et N-terminalt metionin. Siden nærvær eller fravær av N-terminalt metionin ikke kan forutsees, er denne muligheten ikke innbefattet i betegnelsen. C-terminale og N-terminale forkortelser i disse hoved SCSF og LCSF-sekvensene blir betegnet som CV og NV, respektivt. C-terminale delesjoner etterfølges av tallet som representerer antallet aminosyrer som er gjenværende i den native strukturen; for N-terminale delesjoner, vil NV etterfølges av antallet av aminosyrer som er deletert fra N-terminusen. Dermed betegner for eksempel LCSF/CV150 en konstruksjon som koder for et protein som inneholder de første 150 aminosyrene i den lange CSF-sekvensen; SCSF/CV158 betegner en konstruksjon som koder for et protein som inneholder de første 158 aminosyreresidiene til den korte formen; SCSF/NV2 betegner en konstruksjon som koder for den korte formen hvor to N-terminale aminosyrer er deletert. (Som beskrevet ovenfor divergerer LCSF og SCSF begynnende i posisjon 150 og rekon-vergerer nær C-termini). LCSF/NV2CV150 betegner en form som er lik LCSF/CV150 med unntagelse av at de to N-terminale glutaminsyreresidiene er deletert.

Spesielt foretrukne konstruksjoner som resulterer i CSF-1-proteiner i henhold til fremgangsmåten i oppfinnelsen, innbefatter gener som koder for LCSF/CV150, LCSF/CV190, LCSF/CV221, LCSF/CV223, LCSF og deres korresponderende NV2, NV3, tyrsg, ser^y, se<r>i59°g se<r>i57seri59 former. SCSF/CV158, SCSFYCV150, SCSF og deres korresponderende NV2 og NV3 og asp5q-former er også foretrukket.

Spesielt foretrukne utgangsmaterialer innbefatter produktene av genene som koder for SCSF/NV3CV150, LCSF/NV3CV221, ser157LCSF/NV3CV221. ser157LCSF/NV3CV221, og ser157se<r>15gLCSF/CV221.

De resulterende proteinene "behøver ikke nødvendigvis å ha beholdt lengden som genet beskriver, forårsaket av prosessering av forskjellige vertssystemer anvendt for ekspresjon. Derfor, selv om utgangsproteinene for refolding blir referert til ved samme betegnelse, bør det være klart at disse betegnelsene I realitet, refererer til genkonstruksjonen, og den virkelige lengden til utgangsmaterialet for fremgangsmåten beskrevet heri kan være kortere eller lengre (hvis det har N-terminalt Met) enn det som blir spesifisert av det C-terminale aminosyretallet.

C. Generell fremgangsmåte

"Otgangsmaterialet for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er CSF-l-protein fremstilt fra CSF-l-kodende DNA transformert inn i en bakteriell vert. CSF-l-genet kan bli uttrykt som et modent protein ved anvendelse av det hensiktsmessige CSF-l-kodende DNAet som kommer etter et ATG Met-kodende kodon eller som et fusjonsprotein hvori CSF-1-sekven.sen er plassert i leseramme med en protein-kodende sekvens, eller i utskilt form ved anvendelse av en signalsekvens som er funksjonell i den valgte verten. Hvis konstruksjonen koder for den "modne" formen av proteinet, kan N-terminalt metionin bli fullstendig prosessert, eller ikke i det hele tatt, eller delvis. Metionin er, selvfølgelig, ikke tilstede ved N-terminus til de utskilte formene uttrykt fra gener som har opererbart bundne signalsekvenser. Signalsekvenser er generelt de som er avledet fra bakterielle systemer såsom penicillinase eller fosfatase A. Hvis den utskilte formen blir anvendt, uansett om utskillingen er vellykket eller ikke, blir proteinet generelt produsert i en form som er mere oppløselig enn den som blir tilveiebragt når proteinet blir produsert som et modent protein eller et fusjonsprotein. Denne generaliser-ingen er ikke uten unntak.

Hvis det utskilte proteinet allerede er oppløselig, kan det være nødvendig uansett å anvende et kaotrofisk miljø for å tilveiebringe refoldingsfremgangsmåten. Hvis proteinet blir dannet i uoppløselig form, er det nødvendig først å oppløse proteinet.

Fremgangsmåten begynner derfor vanligvis med oppløst monomer i et kaotrofisk miljø, som blir opprettholdt under reduserende betingelser. Slik opprettholdelse kan . innbefatte anvendelse av et egnet reduksjonsmiddel, såsom p<->merkapto-etanol eller ditiotreitol (DTT) mens CSF-1 er kanskje allerede redusert, og utelukkelse av oksydasjonsmidler kan være tilstrekkelig. Det oppløste proteinet blir vanligvis opprettholdt i, for eksempel, 8 M urea eller 7 M guanidin hydroklorid, ved en pH på omtrent 7-8,6, i nærvær av omtrent 2-100 mM tiolforbindelse. Hvis man begynner med denne oppløste formen, kan monomerer enten bli refoldet direkte eller delvis renset fra gjenværende proteiner ved bruk av en egnet rensningsfremgangsmåte såsom kromatografi eller en adsorberende gel, kromatografi ved anvendelse av en ione-byttekolonne, eller gel-permeasjonskromatografi før refolding. Anvendelse av et rensningstrinn før refolding har den fordelen at forurensende vertsproteiner blir fjernet og materiale som kan nedbryte eller endre CSF-1 blir fjernet. Gel-permeasjonskromatografi er nyttig, siden den tillater en lettvint størrelsesseparasjon av den ønskede monomerlengden, som vanligvis er kjent på forhånd, fra urenheter med forskjellige molekylvekter. Når volumet til materialene øker, blir kapasiteten til gel-permeasjonskolonnene begrensende. For store volumer er for eksempel ione-byttekromatografi, DEAE-kromatografi, foretrukket. Det er nødvendig at rensingen blir utført under reduserende betingelser for å forhindre dannelsen av disulfid-bundne aggregater. Dermed, uansett hvilken kromatografisk fremgangsmåte som blir anvendt, er det foretrukket å innbefatte et egnet reduksjonsmiddel i oppløs-ningene som blir anvendt for å bli applisert på de kromatografiske kolonnene eller batchene og i de eluerende oppløs-ningene. I noen tilfeller kan lav pH, såsom pH 6, bli erstattet for reduksjonsmiddel, på grunn av at lav pH vil forhindre dannelse av disulfidbindinger i noen kromatografiske systemer, selv i fravær av reduksjonsmiddel.

Den delvis rensede monomeren blir deretter utsatt for refoldingsbetingelser for dannelsen av dimer. Proteinkonsentrasjonen i løpet av dette trinnet er av stor viktighet. Finale prosentutbytter av dimer per volum refoldingsreaksjon økes hvis proteinkonsentrasjonen er mindre enn omtrent 2 mg/ml CSF-l-protein; et konsentrasjonsområde på 0,03-0,5 mg/ml er foretrukket. Anvendelse av proteinkonsentrasjoner som er for høye kan resultere i dannelsen av uønskede oligomerer med høyere orden. Refoldingsbetingelsene kan innbefatte gradvis fjerning av kaotrofisk miljø i løpet av en hensiktsmessig tidsperiode (vanligvis flere timer) eller fortynning av prøven til den ønskede konsentrasjonen av protein og kaotrofisk middel. Fremgangsmåter som tilveiebringer en konstant proteinkonsentrasjon er også mulig, såsom dialyse eller hul fiber diafiltrering mens det kaotrofiske middelet sakte blir fjernet. Ved slutten av fremgangsmåten, når det kaotrofiske miljøet er borte, blir et ikke-denaturer-ende nivå oppnådd. Hvis for eksempel guanidinhydroklorid blir anvendt som kaotrofisk middel, blir en final konsentrasjon på mindre enn omtrent 2 M, og fortrinnsvis 0,1-1 M oppnådd og hvis urea blir anvendt som kaotrofisk middel, blir en final konsentrasjon på mindre enn omtrent 1 M og fortrinnsvis 0,1-0,5 M oppnådd.

Refoldingen i løpet av fjernignen av kaotrofisk middel blir utført på en måte som tillater oksydering av sulfhydryl-gruppene til disulfider for å tilveiebringe den resulterende biologisk aktive dimerkonfigurasjonen som, når det gjelder CSF-1 er stabilisert ved dannelsen av disulfider, en eller flere som kan binde de to kjedene. Intrakjededisulfider blir også dannet. Egnede redoksbetingelser som fremmer denne dannelsen av dimer innbefatter sulfhydryl/disulfidreagens-komb inasjonene, såsom oksydert og redusert glutation. Forholdet mellom redusert og oksydert glutation eller andre sulfhydryl/disulfidkombinasjoner er vanligvis fra omtrent 2 mM/0,1 mM til 0,5 mM/1,0 mM. Alternative fremgangsmåter for å tilveiebringe denne oksydasjonen er også akseptabel. For eksempel, enkel fjerning eller fortynning av reduksjons-middelet uten foranstaltninger for å utelukke luft og metallioner fører til dannelsen av ønskelige disulfidbindinger. pHen til oppløsningen i løpet av refoldingsfremgangsmåten bør alltid bli opprettholdt ved omtrent pH 7,5-9,0. Det er klart at i refoldingsfremgangsmåten gir de sterke reduk-sjonsbetingelsene som den opprinnelige rensningen ble utført under ikke lenger anvendt. Minimalisering av konsentrasjonen av salter, såsom natriumklorid, i løpet av refoldingsfremgangsmåten, tillater anvendelse av ionebyttekromatografi som et etterfølgende konsentrasjonstrinn og/eller rensningstrinn.

I løpet av refoldingsfremgangsmåten kan flere dimere og høyere oligomere spesies av CSF-1 bli dannet innbefattende de som har redusert oppløselighet i høyt saltinnhold og høyere ordensoligomerer som kan bli oppløst ved størrelse ekspre-sjonskromatografi. Denne aggregasjonsfremgangsmåten minimali-seres ved temperaturkontroll, hvori lave temperaturer på omtrent 0-4°C er foretrukket i forhold til høyere temperaturer på 25-37°C.

Mindre stabile dimere former av CSF-1 som kan bli isolert som en tidlig eluerende topp på revers-fase HPLC under visse betingelser, kan også bli dannet i løpet av refoldingsfremgangsmåten. Disse mindre stabile formene kan resultere fra dannelsen av uønskede disulfidbindinger. Cysteinresidier i posisjonene 157 og 159, tilstede i langform CSF-1, er ikke nødvendig for biologisk aktivitet. DNA-konstruksjoner som koder for CSF-1 inneholdende serinsubstitusjoner for en eller begge av disse cysteinene produserer høyere utbytter i foreliggende rensningsfremgangsmåte og kan også forandre oppløselighetskaraktertrekkene på en ønskelig måte.

Hvis gjenværende redoksreagenser er tilstede i refoldet CSF-1 kan dette medfører problemer i løpet av påfølgende rensningstrinn. Det er mange måter å blokkere eller forhindre di-sulf idutvekslinger som kan oppstå i nærvær av slike gjenværende redoksreagenser (f.eks. glutation) innbefattende fjerning ved, for eksempel, diafiltrering eller dialyse; fortynning; og senkning av pH til oppløsningen på riktig måte. Av fremgangsmåtene som er beskrevet ovenfor, er to av de mere foretrukne fremgangsmåtene ved redusering av pH til under pH 7,0 og diafiltrering.

Etter refolding fullføres konsentrasjons- og/eller de opprinnelige rensningstrinnene, dimeren blir ytterligere renset fra gjenværende redoksstoffer og fra andre proteiner ved anvendelse av fremgangsmåter som ligner de som er beskrevet for monomeren. Det er selvfølgelig Ikke nødvendig å velge den samme rensningsprosedyren; det kan ofte være foretrukket å anvende en annen tilnærming enn den som blir anvendt for rensning av oppløst monomer. Egnede måter innbefatter spesielt gelfiltrering, hydrofob interaksjonskromatografi, ione-byttekromatografi og revers-fase HPLC.

Før ytterligere rensning av refoldet, dimer CSF-1, kan fjerning av redoksstoff, hvis nærværende, og konsentrering av refoldete proteiner bli utført ved å direkte applisere det refoldete materialet på en ione-byttekromatografikolonne ved for eksempel anvendelse av DEAE Sepahrose. Slike fremgangsmåter blir vanligvis utført ved pH rundt 8, ved senkning av pH til området 5,5 til 7,0 reduserte oligomerdannelsen og økte utbyttet av dimer CSF-1.

Rensing av dimer er nødvendig for å fjerne urenheter, spesielt pyrogener eller andre endotoksiner som er resultat av den bakterielle produksjon av proteiner. En spesielt vellykket protokoll for fjerning av disse uønskede urenheter anvender kromatografi på en fenyl-TSK eller fenyl-Sepharose-kolonne. Kromatografien blir utført under betingelser og med reagenser som er endotoksin-frie. Det ønskede dimer CSF-1 er oppløselig og stabil i omtrent 1,5 M ammoniumsulfat ved nøytral pH, og blir applisert på kolonnene under disse betingelsene ved lave temperaturer, på omtrent 2°C-10°C, og fortrinnsvis omtrent 4°C. I tillegg blir aggregater og ustabile former av refoldet CSF-1 fjernet fra stabile dimere former av refoldet CSF-1 ved fjerning av et presipitat som dannes ved tilsetting av ammoniumsulfat. Det ønskede dimer-proteinet kan bli eluert ved anvendelse av en gradient med reduserende ammoniumsulfat og med økende etylenglykol i nøytral buffer. CSF-l-dimeren eluerer ved omtrent 0,6 M ammoniumsulfat, 3556 etylenglykol fra fenyl-TSK kolonnen. Alternative bærere kan også bli anvendt, og fenyl-Sepharose er foretrukket for produksjon i stor skala av det rensede CSF-1 dimere proteinet.

Den resulterende dimeren er av klinisk renhet. Den spesifikke aktiviteten til slike preparater er omtrent ekvivalent med aktiviteten til nativt, humant CSF-1 produsert av pattedyrceller. I situasjoner hvor utgangs CSF-1 har lav renhet, eller hvor høyere grader av final renhet er nødvendig, kan et rensningstrinn i tillegg (såsom DEAE kromatografi etter refolding) bli anvendt.

I de utføringene som innbefatter det i tillegg preliminære trinnet som innbefatter oppløsning av den monomeren formen av proteinet, blir utgangsmaterialene tilveiebragt som uoppløse-lig intracellulært protein, som kan bli separert fra oppløse-lige bakterielle proteiner ved lysis av cellene under egnede betingelser og isolering av det oppløste proteinet ved sentrifugering. Det isolerte uoppløselige proteinet blir deretter plassert direkte i et kaotrofisk miljø for å oppløse aggregater og tilveiebringe oppløsning/denaturering.

De isolerte, rensede dimere formene kan vises å være biologisk aktive ved anvendelse av forskjellige proliferasjonsana-lyser. En standardanalyse som imøteser det nødvendige kriteriet er in vivo kolonistimulerende analyse til Metcalf, D. , J Cell Physiol (1970) 76:89. Tilstedeværelse av CSF-1 i dette systemet resulterer i dannelsen av hovedsakelig makrofagkolonier. En annen analyse er økning i celleprolifer-asjon, målt ved <3>H tymidin-inkorporering i en CSF-l-avhengig cellelinje, såsom musemakrofaglinje BAC. I en annen form av denne analysen kan et kolorimetrisk deteksjonssystem basert på reduksjon av tetrazoliumsalt, NITT, bli anvendt. CSF-1 dimerer som resulterer fra fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er aktiv i slike analyser og er essensielt for andre proteiner produsert av bakterien.

Det er viktig at CSF-l-preparatene er klinisk rene. De er vesentlig fri for endotoksin, med mindre enn omtrent 1,0 ng endotoksin/mg CSF-1 ifølge analysen i standard limulus amebocyttlysat (LAL) analysen, Associates of Cape Cod, Inc., Woods Hole, MA. Ytterligere rensning kan være ønskelig, men preparater med omtrent 95% eller høyere renhet i CSF-1 protein, bestemt ved SDS-PAGE, blir tilveiebragt ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen. Den spesifikke aktiviteten er videre omtrent ekvivalent til eller høyere enn aktiviteten til det native proteinet.

D. Farmasøytiske sammensetninger

De refoldete og klinisk rene CSF-1 preparatene kan bli formulert for administrering ved konvensjonelle protokoller og regimer, fortrinnsvis systemisk, innbefattende intravenøs administrasjon. Sammensetningene kan innbefatte konvensjonelle hjelpestoffer, såsom vann for injeksjon, buffere, oppløselighetsmidler, og stabilisatorer, som er kjent innenfor fagområdet. En oppsummering av formuleringsteknikker for farmasøytiske sammensetninger, innbefattende protein, finnes i for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, siste utgave.

E. Dannelse av heterodimer

En "bør merke seg at fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater dannelse av heterodimerer fra forskjellige monomere enheter av CSF-1. For eksempel tilveiebringer det store antallet CSF-l-proteiner som blir dannet ved forskjellige C-terminale prosesseringer en mengde utgangsmaterialer som kan bli anvendt i dimerdannelsen. Dermed kan nye heterodimere materialer lett bli dannet. For eksempel kan den monomere formen av SCSF/CV150, sammen med den monomere formen av LCSF/CV190, bli blandet og behandlet i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen; heterodimeren kan bli separert fra homodimersideproduktene ved anvendelse av forskjellige kromatografiske fremgangsmåter. Lignende blandinger utsatt for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fører til heterodimerer av komponenter med aminosyresubsitusj oner -- f.eks. glu52 LCSF og LCSF/CV190.

De forskjellige monomerene kan bli blandet in vitro eller produsert i den samme cellen. Hvis den blir produsert i den samme cellen, blir en konstruksjon for ekspresjon av hver monomer ført inn i den samme verten; i slike utførelser er det foretrukket at hver konstruksjon bærer en annen markør (såsom Tc^ og Amp^) slik at kotransformerte verter blir selektert. Kotransformerte celler blir deretter dyrket og indusert for å tilveiebringe blandinger av de to formene.

Følgende eksempler skal illustrere og ikke begrense oppfinnelsen:

Eksempel 1

Dette eksempelet beskriver isolering av renset, biologisk aktivt protein uttrykt fra en konstruksjon som koder for asp59SCSF/CV150 i E. coli under kontroll av PL-promoteren i en vektor konstruert som beskrevet i Europa patentsøknad nr. 87309409.8, inngitt 23. oktober, 1987, anvist samme asignator og inkorporert heri ved referanse. Dette proteinet blir produsert i en monomer, uoppløselig form, intracellulært.

En E. coli X lysogen, DG116, transformert med plasmidover-uttrykker (O/E) pPLSCSFasp59/CV150, CMCC-cellelinjen deponer-ing nr. 2948, ble dyrket i en 10 1 fermentor i basaltmedium inneholdende 72 mM (NH4)2S04, 20 mM KE2P04, 2,0 ml/l TK9, med sterile tilsetninger av 10 g/l glukose, 3,0 mM MgS04<o>7H20, 72 jjM FeS04, 20 mg/l tiamin°HCl, og 50 mg/l ampicillin.

Cellene ble dyrket ved 30°C til OD^ggnm på 12; kasaminosyrer ble tilsatt til 2$; og deretter ble CSF-l-ekspresjon indusert ved skifting til 42°C. Cellene ble deretter dyrket i 3 timer til til final OD6g0nin på 16,5.

Cellene ble høstet ved sentrifugering og homogenisert ved anvendelse av 30 min sonikering ved 4°C. Homogenatet ble deretter sentrifugert og celledebriet beholdt. Debriet inneholdt det uoppløselige proteinet, som ble suspendert i 305é sukrose og sentrifugert ved 15.000 x g i 10 min. ved 4°C for å anrike for det uoppløselige proteinet.

Pelleten fra sentrifugeringen ble løst opp i 7 M guanidin HC1 i 0,1 M natriumfosfat, pH 7, inneholdende 50 mM DTT og 5 mM EDTA i 30 min. Suspensjonen ble deretter oppvarmet til 40°C i 5 min. og supernatanten isolert etter sentrifugering. Den isolerte supernatanten ble applisert på en 90 x 2,6 cm Sephacryl (S-200) kolonne ekvilibrert i den samme bufferen, men inneholdende 2 mM DTT istedenfor 50 mM. Kolonnen ble kjørt ved anvendelse av den samme bufferen, og proteinkonsentrasjonen ble registrert ved 280 nm adsorpsjon med resultatene vist i figur 1. Hovedparten av de bakterielle proteinene ble separert fra CSF-1, og som ble utvunnet som en 17 kd topp representerende omtrent 80$ ren CSF-l-monomer.

CSF-1 blandingen ble deretter fortynnet til 0,25 mg/ml protein i en korresponderende buffer inneholdende 7 M guanidinhydroklorid, 50 mM Tris, pH 8,5, og 5 mM EDTA som inneholdt et redokssystem, bestående av 2 mM redusert glutation (GSH) og 1 mM oksydert glutation (GSSG). For refolde delvis renset CSF-1, ble de sammenslåtte fraksjonene fra S-200-kolonnen dialysert mot denne bufferen (inneholdende 7 M guanidinhydroklorid og GSE/GSSG), og deretter latt folde ved sakte tilsetting av en oppløsning av 50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA, og GSH/GSSG i 0,1 M NaCl til dialysekaret. Tilsettingen ble utført ved 4°C over 48 t helt til den endelige guanidinkonsentrasjonen var omtrent 0,2 M. Dia-lysatet inneholdt ved dette stadiumet dimer CSF-1, som ble applisert direkte på en Sepharose 12 molekylærstørrelse-kolonne ekvilibrert i fosfat-bufret saltvann for ytterligere rensing. Elueringen ble igjen registrert ved 280 nm absorp-sjon. Elueringsmønsteret er vist i figur 2. Før utsetting for refoldingsbetingelser, eluerte CSF-1 som ventet for monomeren (figur 2a); men når proteinet ble utsatt for refoldingsbetingelser ved 0,3 mg/ml, som beskrevet ovenfor (eller, alternativt, 0,1 mg/ml), viste resultatene dannelsen av materialet med dimer-størrelse, som vist i figurene 2b og 2c, respektivt.

Dimerproduktet kromatograferte som en enkelt topp og revers-fase HPLC, som vist i figur 3b. Dimerproduktet er på over 90% av en enkeltform på RP-HPLC (Se figur 3b) og viser tilfreds-stillende stabilitet og full biologisk aktivitet. Med hensyn til andre proteiner, viser reduserende og ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse (fig. 7) at CSF-1 har en renhet på over 95%. Resultatene for S-200 sammenslåtte utgangsmaterialene før refolding, vist i figur 3a, viste en hovedvekt av monomerer (som eluerer som to hovedtopper av CSF-1). Den enkelte dimertoppen illustrert i figur 3b ble vist å bestå av to hovedkomponenter etter re-reduksjon til monomer (figur 3c) som separert ved RP-HPLC.

Proteinproduktet ble karakterisert for oppløselighet ved UV-synlig spektroskopi. Spektra ble registrert i 30-min intervaller etter fortynning av renset dimerfraksjonene i fosfat-bufret saltvann, som vist i figur 4. Som vist i panel A, forble spekteret av det endelige produktet konstant i løpet av en 2-t periode, som indikerer at det refoldete proteinet var stabilt og oppløselig under fysiologiske betingelser. I kontrast til dette, viste en lignende spektralanalyse av monomerutgangsmaterialet, vist som panel B i figur 4, ved 90-sec intervaller at proteinet var ustabilt og dannet raskt uoppløselige, lys-spredende aggregater.

Det rensede dimermaterialet preparert ovenfor ble analysert i musebenmargskolonianalyse i duplikat, sammen med en "kontroll" bestående av renset rekombinant CSF tilveiebragt fra et gen med lignende sekvens (SCSF) uttrykt som et aktivt utskilt molekyl med omtrentelig 158 aminosyrer i pattedyr-cellelinjen CV-1. Refoldet E. coli CSF-1 har en musebenmargs-analyse spesifikk aktivitet (i U/mg) på 2-4 x IO<7>, sammenlignet med omtrent 3 x IO<7> U/mg for CSF-1 tilveiebragt fra CV-l-celler. Det rensede urefoldete utgangsmaterialet har en spesifikk aktivitet som er omtrent 1000-ganger lavere.

(Musebenmargsanalysen er beskrevet av Moore, R., et al, J Immunol (1983) 131:2397 og av Prystowsky, M. , et al, Am J Pathol (1984) 114:149. Humant CSF-1 viser omtrent 10-ganger større aktivitet i en murin benmargsanalyse sammenlignet med aktiviteten i en human benmargsanalyse).

Nativt CSF-1, renset fra MIAPaCa-celler hadde en museben-margsanalyse spesifikk aktivitet på 4-8 x IO<7> U/mg.

Sirkulært dikroisme (CD) spekteret til refoldet E. coli-protein var essensielt identisk innenfor eksperimentelle feilkilder med "naturlig foldet" CSF-1 fra CV-l-celler.

Eksempel 2

Tyve gram frossen E. coli DG116 pasta fra celler som uttrykker en konstruksjon som koder for asp5gSCSF/CV150 under kontroll av PL-promoteren ble resuspendert i 200 ml 50 mM Tris, 10 mM EDTA (pH 8,5) og sonikert 30 min i et isbad, 60$ puls, og intensitet på 9.

Celledebriet ble oppnådd etter 10 min x 15.000 x g sentrifugering. Celledebriet ble resuspendert i 200 ml 30% sukrose (i 10 mM EDTA, pH 8,0) og sonikert 3 min for å løsne klumper og fritt uoppløselig protein. Suspensjonen ble deretter sentrifugert i 15 mi x 15.000 x g, og pelleten ble beholdt.

Sukrose-renset uoppløselig protein ble deretter oppløst i 15 ml 0,45 p filtrert 7 M guanidin HC1 (GuHCl), 0,1 M natriumfosfat, 5 mM EDTA, 50 mM DTT (pH 7,5-8,0) i omtrent 15 min. og deretter oppvarmet til omtrent 37-40°C i 10 min for å forsikre reduksjon av disulfidbindinger. Det oppløste materialet ble deretter sentrifugert i 10 min x 15.000 x g.

Seks til ti ml av klargjort, oppløst CSF-1 ble applisert på en 2,6 x 95 cm S-200 kolonne ekvilibrert i filter-sterilisert S-200 buffer (7 M GuHCl, 0,1 M natriumfosfat, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, pH 6,8) og størrelseseparert over natt ved romtemperatur ved 1 ml/min. Proteinet eluerte som en godt oppløst topp, og når fraksjonene ble slått sammen, inneholdt 40-70 mg protein ved omtrent 1,2-1,5 mg/ml (40-60 ml).

Proteininnholdet ble bestemt ved absorbans ved 280 nm, med den antagelsen at en A28O tilsvarer 1 mg/ml. Oppløsningen ble deretter fortynnet til 0,1-0,15 mg/ml protein, 0,5-0,7 M GuHCl, i buffer-inneholdende 50 mM Tris (pH 8,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM redusert glutation (GSH), 1 mM oksydert glutation (GSSG), ved tilsetting av den hensiktsmessige bufferen til proteinoppløsningen og ved å la den stå 24 t ved 4°C.

Fast ammoniumsulfat ble satt til 1,2 M final konsentrasjon og pH ble deretter justert til 7,0. Et presipitat ble dannet som inneholdt ukorrekte foldete former av CSF-1. Denne kan i det minste bli delvis utfunnet og resirkulert (se nedenfor). CSF-1-preparatet ble deretter behandlet for ytterligere fjerning av pyrogener/endotoksiner og gjenværende forurensninger på en f enyl-TSK-kolonne. Alle buffere og reagenser ble gjort pyrogen-frie. CSF-l-preparatet ble sentrifugert 10 min x 15.000 x g og filtrert gjennom et 0,45 jj filter (500 ml) disponibel enhet før den blir pumpet på en fenyl-TSK HPLC kolonne ekvilibrert i 1,5 M ammoniumsulfat, 0,1 M natriumfosfat (pH 7,0) kjørt ved 4°C.

Etter applisering av CSF-1 ble kolonnen vasket i 30 min. Proteinet ble deretter eluert med en 45-min gradient med økende ammoniumsulfat, økende etylenglykol B buffer (B buffer = 60$ etylenglykol, 0,01 M natriumfosfat (pH 7,0). CSF-1 proteinet eluerte ved omtrent 0,6 M ammoniumsulfat, 35$ etylenglykol.

Den første hovedtoppen som eluerte var biologisk aktivt, dimer CSF-1. CSF-l-toppen ble slått sammen og deretter dialysert omfattende mot 5% mannitol, 25 mM natriumfosfat (pE 7,4), filtersterilisert og lagret ved 4°C. Endotoksininnholdet varierte fra 0,1-1 ng/mg.

På en lignende måte ble E. coli-protein produsert under kontroll av Pj^-promoteren fra DNA som koder for asp5gSCSF/NVCV150, asp5gSCSF/NV3CV150, NV3CV158, LCSF/CV190 og LCSF/CV221 ble refoldet og renset. De endelige preparatene inneholdt 6-15 mg renset CSF-1 med et omtrentelig helhetlig utbytte på 15-30%, og en spesifikk aktivitet på 5-10 x 10<7 >U/mg i musebenmargsanalysen (ved anvendelse av A28O°§ ve<* å anta en verdi på 1,0 korresponderer med 1 mg CSF-1 pr. ml). Preparatene har også omtrent den samme spesifikke aktiviteten i human benmargsanalyse som renset nativt MIAPaCa CSF-1.

Eksempel 3

Direkte refolding av oppløste refraktile legemer Sukrose-renset, oppløst asp5gSCSF/CV150 refraktile legemer ble preparert som i eksempel 2, og hadde en proteinkonsentrasjon på 20 mg/ml. For refolding ble proteinkonsentrasjonen redusert ved fortynning til 1,5 mg/ml asp5gSCSF/CV150 (total CSF-1 var 38 mg) i 7 M GuHCl, 0,1 M natriumfosfat (pH 7,0), 5 mM EDTA, 1 mM DTT. Refolding ble initiert ved ti ganger fortynning til 0,15 mg/ml i 50 mM Tris (pH 8,5), 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM GSE, og 1 mM GSSG (samme refoldingsbuffer som ovenfor) ved 4°C og latt foregå i 24 t.

Omtrent 35% av CSF-l-monomeren ble refoldet til dimerform

(basert på den kjente retensjonstiden av dimer CSF-1)

detektert ved RP-HPLC. Rennetet til de refoldete dimerene ble beregnet til å være omtrent 63% ved RP-HPLC.

Eksempel 4

Resirkulerende aggregater

Presipitatet beskrevet i eksempel 2 inneholder antageligvis ukorrekt foldede former av CSF-1. Når de blir dannet fra refolding av omtrent 38 mg protein, består den av omtrent 10 mg pelleterbart presipitat. Dette presipitatet ble løst opp i S-200 buffer inneholdende 7 M GuHCl og 2 mM DTT/beskrevet i eksempel 2). Suspensjonen ble oppvarmet ved 37°C i 15 min for å redusere eventuelle disulfidbindinger, og den resulterende klare oppløsningen ble avkjølt til 4°C. Oppløsningen ble deretter fortynnet til 0,7 M GuHCl i refoldende buffer og refoldet, som beskrevet ovenfor. Ammoniumsulfat ble deretter tilsatt og CSF-1 refoldet dimer ble renset fra den resulterende oppløsningen for å fjerne pyrogener/endotoksiner ved fenyl-TSK HPLC som beskrevet ovenfor. Dette tilveiebragte over 3 mg oppløselig, dimer CSF-1.

Denne resirkuleringsprosessen, når den blir utført i stor skala, er ventet å forbedre utbyttet til prosessen for produsering av refoldet CSF-1 betraktelig.

Eksempel 5

E. coli-stamme DG116 ble transformert med plasmidvektor pLCSF221A, et plasmid inneholdende genet som koder for asp59LCSF/NV3CV221. Den transformerte E. coli-stammen DG116 ble deponert til American Type Culture Collection under aksesjonsnr. ATCC 67390, 14. april 1987. Den transformerte verten ble dyrket i en 100 1 standard luft-tilført Rushton turbinfermentor i basalt medium inneholdende 96 mM (NH4)2S04, 28 mM KH2P04, 4 mM Na3 citrat°2, 1,7 ml/l TK9 (30 mM ZnS04, 30 mM MgS04, 1 mM CuS04), med steril tilsetting av 6,5 g/l glukose, 2,2 mM MgS04°7 H20, 95 pm FeS04°7 E20 og 26 mg/l tiamin° HC1 ved 30°C inntil en OD68onni på 10 ble oppnådd. Kulturen ble deretter indusert ved et temperaturskifte til 37°C med samtidig sterile tilsetninger av kasaminosyrer til 2,3% (w/v) final konsentrasjon og MgS0°7 H20 til 1,7 mM final konsentrasjon.

Etter fire timers etter-induksjon ble cellene høstet ved fem-ganger konsentrering og diafUtrert mot 10 volumer 5 mM EDTA, pH 8,5, ved anvendelse av Dorr-Oliver tangential kryss-flyt mikroporøs filtrering. Cellene ble ødelagt ved tre omganger ved 51712,5 Kpa i en Manton-Gaulin høytrykksmekanisk celle-homogenisator. 1-Oktanol ble satt til 0,1% (v/v) og homogenatet ble holdt over natt ved 4°C.

Homogenatet ble bragt til 25° sukrose ved tilsetting av en 63% w/v sukroseoppløsning. Den uoppløselige proteinfraksjonen (refraktile legemer) ble separert fra celledebriet ved kontinuerlig flytskivekonsentreringssentrifugering (West-phalia SB7) ved 9000 x g, 1 liter/minutt og 4-6°C. Den våte pelleten ble blandet 50:50 (w/v) i deionisert vann og lagret ved —20°C i 45 g aliquoter.

Nitti gram av suspensjonen med refraktile legemer ble tint ved romtemperatur og homogenisert i 200 ml 0,1 M Tris, pH 8,5, inneholdende 25 mM EDTA og 10 mM DTT ved anvendelse av en Tekmar "tissumizer" i 1 minutt ved 50% hastighet. Suspensjonen ble justert til 1 liter 8 M urea, 2 mM DTT, 5 mM EDTA og 20 mM Tris, pH 8,5 og omrørt i omtrent 30 minutter ved romtemperatur. Uoppløselige debri ble fjernet ved anvendelse av 0,0929 m<2> 0,8-0,2 pm Sartorius engangsmembranfilter-hylse. Etter filtreringen ble suspensjonen inneholdende redusert CSF-1-monomer delvis renset ved DEAE-kromatografi. En prøve ved A28O Pa 10 (500 ml) ble applisert til hver av to 5 x 45 cm DEAE Sepharose rask flyt kolonner ekvilibrert i 0,1 M Tris, pH 8,5. Hver kolonne ble utviklet ved anvendelse av en 3600 ml, 0-0,4 M NaCl gradient i 4 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA og 2 mM DTT. Basert på antagelsen at 1 A2so tilsvarer 1 mg/ml, ble 4,5 g protein isolert.

DEAE-renset CSF-l-monomer ble avkjølt til 4°C og fortynnet 1:10 i foravkjølt 50 mM Tris, pH 8,5, inneholdende 5 mM EDTA, 2 mM redusert glutation og 1 mM oksydert glutation til en final estimert protein A2go-aDsorbans Pa 0»2. Til tross for at den opprinnelige dimerdannelsen hovedsakelig var fullført i løpet av 24 timer ifølge SDS-PAGE, ble refoldingsblandingen (22,5 liter) holdt i fem dager ved 4°C for å få et maksimalt utbytte av CSF-l-dimer med riktig konformasjon. Konformasjonen til dimer CSF-1 i den refoldete blandingen ble undersøkt ved revers-fase HPLC. Ved anvendelse av en C4-kolonne og en 35-55% acetonitrilgradient, eluerte dimer CSF-1 som to diskrete former; stabilt aktivt CSF-1 var den mere hydrofobe. Denne stabile, aktive CSF-l-formen representerte 65% av proteinet etter fem dagers inkubasjon.

Redusert og oksydert glutation ble fjernet ved diafiltrering mot 20 mM natriumfosfat, pH 7, og proteinet konsentrerte til en A280 absorbans på 1,2 ved anvendelse av en Amicon 0,929 m<2 >PM10 hul fiberhylse. Ammoniumsulfat ble satt til det dia-filtrerte materialet til en konsentrasjon på 1,2 M. Den presipiterte ustabile omdanneren (den mindre hydrofobe formen påvis ved revers fase HPLC) ble fjernet ved filtrering. Filtratet (2 g stabilt dimer CSF-1) ble applisert på et 5 x 20 cm sjikt rask flyt fenyl Sepharose ekvilibrert i 1,2 M ammoniumsulfat inneholdende 0,0025 M natriumfosfat, pH 7,0, og eluert i 6 timer i en samtidig reduserende (0,72 M til 0 M ammoniumsulfat) og økende (24% til 60% v/v etylenglykol) gradient på 1500 ml i 0,01 M natriumf osf atbuf fer, pH 7,0. Dimer CSF-1 eluerte ved omtrent 30-35% etylenglykol og ble godt separert fra tetramer CSF-1 og endotoksin, som begge ble eluert senere. Dimer CSF-1 ble diafiltrert mot 20 mM natriumf osf at, pH 7,5 og konsentrert til A280 på 10 ved anvendelse av en 0,0929 m<2> Amicon spiralhylse (Cartridge) (YM10). Utbyttet var på 1,3 g stabil dimer CSF-1 basert på A2go* Produsert CSF-1 hadde en biologisk aktivitet på omtrent 6 x IO<7> U/mg ved anvendelse av en CSF-l-avhengig celleprolifera-sjonsanalyse for å bestemme aktiviteten. Det endelige produktet inneholdt 98,6% dimer og 93% reduserbar dimer, bestemt ved ikke-reduserende og reduserende SDS-PAGE-analyse. Endotoksininnholdet var 0,01 ng/mg CSF-1 bestemt ved LAL-analyse og A28O nnu

Eksempel 6

DEAE- kromatografi etter refolding

En E. coli-stamme HW22, transformert med plasmid pJN653 inneholdende asp5gSCSF/NVCV158-genet ble dyrket i en 10-liter fermentor i det samme mediumet som er beskrevet i eksempel 5. Cellene ble dyrket ved 30°C til en absorbans på 680 nm på 10, og kasaminosyrer ble deretter satt til til 2%. CSF-l-ekspresjon ble indusert ved skifting av temperaturen på kulturen til 37° C. Etter 4 t ble absorbansen ved 680 nm 79; cellene ble høstet, homogenisert og refraktile legemer ble preparert som beskrevet i eksempel 5.

Tjuefem gram refraktil-legeme-suspensjon (omtrent 390 g protein) ble oppløst i 250 ml 8 M urea inneholdende 25 mM Tris, 10 mM natriumfosfat buffer (pH 8,4), 1 mM EDTA og 4 mM DTT. Etter 2 t ved romtemperatur ble oppløsningen gjort klar ved sentrifugering ved 15.000 x g i 15 min. En 150 ml aliquot av oppløste CSF-1 ble deretter applisert på en 5 x 8 cm DEAE-Sepharose (Pharmacia) kolonne ekvilibrert i 6 M urea inneholdende 25 mM Tris og 10 mM natriumf osf atbuf fer (pH 7,0). Kolonnen ble vasket med 1 sjikt volum av oppløsningen ovenfor som var blitt modifisert til å inneholde 1 mM DTT og 1 mM EDTA, og CSF-1 ble deretter eluert med en 1,4 1 saltgradient på 0-0,6 M natriumklorid i vaskebuffer. CSF-l-toppen eluerte ved omtrent 0,06 M natriumklorid. De gjenværende 90 ml oppløste refraktile legemene ble deretter renset over DEAE-Sepharose kolonnen på lignende måte. De kombinerte CSF-1 fraksjonene (165 ml) inneholdt omtrent 250 mg protein med en renhet på omtrent 50%.

CSF-1 ble deretter refoldet ved fortynning av DEAE-blandingen 10-ganger i refoldingsbuffer inneholdende 50 mM Tris (pH 8,5), 5 mM EDTA, 2 mM redusert glutation, 1 mM oksydert glutation, for-kjølet til 4"C. CSF-1 ble refoldet i 30 t ved 4°C. pH til refoldet CSF-1 ble justert til 6,8 ved anvendelse av 8,5% fosforsyreoppløsning. Oppløsningen ble gjort klar ved sentrifugering i 10 min ved 15.000 x g og applisert på en 5 x 4 cm DEAE-Sepharose-kolonne pre-ekvilibrert i 10 mM natriumf osf at, 25 mM Tris (pH 6,8). Kolonnen ble vasket med 300 ml av denne bufferen og eluert med en 700 ml 0-0,6 M natriumklorid-gradient i samme buffersystem. CSF-1 eluerte ved omtrent 120 mM natriumklorid. Ammoniumsulfat (4 M stock, pE 7,0) ble satt til 95 ml DEAE-blandingen til en endelige konsentrasjon på 1 M. CSF-1 ble filtrert gjennom et Nalgen 0,45 u filter og applisert (ved 4°C) på en 21,5 x 150 mm Bio-Rad TSK fenyl-5-PW kolonne ekvilibrert i depyrogenert 1,5 M ammoniumsulfat og 0,1 M natriumfosfat (pE 7,0). Kolonnen ble vasket med to sjikt volum av denne appliseringsbufferen og eluert i 0,1 M natriumf osf at (pE 7,0) ved anvendelse av en 45-min gradient hvori ammoniumsulfatkonsentrasjonen ble redusert fra 1,5 M til 0 M og etylenglykolkonsentrasjonen ble økt fra 0-60%. Alle operasjonene ble utført ved 4'C under essensielt pyrogenfrie betingelser. CSF-1 eluerte ved omtrent 0,6 M ammoniumsulfat i 30% etylenglykol. CSF-1 ble omfattende dialysert inn i 10 mM EEPES buffer (pE 7,5) inneholdende 150 mM natriumklorid og filtersterilisert gjennom et Millex 0,45 um filter.

Omtrent 50 mg renset asp59SCSF/NV3 CV158 CSF-1 ble tilveiebragt. Det endelige CSF-l-produktet hadde en større andel enn 90% av enkeltformer ifølge SDS-PAGE analyse og omtrent 96% renhet ved RP-HPLC i acetonitril/TFA. Den spesifikke aktiviteten var 1,7 x 10^ u/mg (enheter bestemt som kolonidannende enheter ekvivalenter ved anvendelse av en CSF-l-avhengig cellelinje, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Å2gonm og en antatt ekstinksjonskoeffisient på 1,0). Denne spesifikke aktiviteten er minst ekvivalent til, hvis ikke større enn, den spesifikke aktiviteten til nativt Mia PaCa CSF-1. Endotoksininnholdet, bestemt ved LAL-analyse var 0,5-1 ng/mg CSF-1.

Eksempel 7

En alternativ rensningsfremgangsmåte ble anvendt for å prosessere en refoldingsreaksjon av LCSF/NV3 CV221 fremstilt i henhold til fremgangsmåten I eksempel 5 opp til og innbefattende refoldingstrinnet. I denne modifiserte fremgangsmåten ble refoldet CSF-1 direkte applisert på en anionbytte-kolonne. Ved pH 6,8 fløt redokssystemreagensene direkte gjennom anionutbyttekolonnen, mens CSF-1 forble bundet og konsentrert på kolonnen. På denne måten ble CSF-1 separert fra redokssystemet ved en pH hvor tio-disulfid utvekslings-reaksjoner ble minimalisert, og som dermed forhindrer den signifikante oligomerdannelsen som ble funnet å oppstå hvis dette trinnet ble utført ved høyere pH (8,5).

Fem ml refoldet CSF-1 (1 mg totalt protein fra refoldings-reaksjonen beskrevet i eksempel 5) ble direkte applisert på en 7,5 x 75 mm Bio-Rad TSK DEAE-5-PW kolonne etter senking av pH til refoldet CSF-1 til 6,8 ved anvendelse av en 1 M fosforsyreoppløsning. DEAE-kolonnen var blitt ekvilibrert i 10 mM natriumfosfat, 25 mM Tris (pH 6,8). Etter applisering av CSF-1, ble kolonnen vasket med to sjikt volum av denne bufferen og deretter eluert med en 45 min 0-0,6 M natriumkloridgradient i samme buffer. Kolonnen separerte dimere CSF-1 fra monomere og oligomere former av CSF-1 (bestemt ved ikke-reduserende SDS-PÅGE og Western analyse av DEAE-fraksjonene). Utbyttet av dimer CSF-1 var omtrent 70%. Dette er et 5-ganger høyere utbytte enn det som blir tilveiebragt når den samme rensingen ble utført ved pH 8,5. Etter dette DEAE-rensningstrinnet er CSF-1 blitt renset bort ifra kontaminer-ende endotoksiner og den ustabile formen av CSF-1 dimeren som beskrevet i eksempel 6, begynnende med ammoniumsulfat-tilsettingen som går forut for fenyl-Sepharosetrinnet.

Eksempel 8

En alternativ fremgangsmåte for refolding av CSF-1 er blitt anvendt. Plasmid pLCSF221A ble indusert i E. coli og det uttrykte proteinet ble prosessert i vesentlig grad ifølge det som ble lært i eksempel 5 med unntagelse av noen modifika-sjoner. For eksempel ble de høstede cellene diafUtrert mot 5 mM EDTA uten pH-justering. Etter den andre passeringen gjennom homogen!satoren, ble pH justert til 6 med eddiksyre. I tillegg ble det tatt hensyn til luftoksydering for dannelse av disulfidbinding i løpet av refolding av CSF-l-molekylet.

DEAE-renset CSF-l-monomer ble fortynnet til en final konsentrasjon på 0,2 mg/ml i 50 Tris pH 8,5, 5 mM EDTA, og refoldet i fire dager ved 4°C i nærvær eller i fravær av gluation-redokssystemet. De refoldete proteinene ble videre renset vesentlig ifølge fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 5, igjen noe modifisert. Den refoldete dimere blandingen ble diaf Utrert og konsentrert til en OD på 1. Etter ammonium-sulf at-f elling ble prøven applisert på en fenyl-Sepharose raskflyt-kolonne og deretter eluert i en reduserende (0,78 til 0,18 M ammoniumsulfat) gradient på en 1800 ml i 0,01 M natriumfosfatbuffer (pH 7). Dimeren eluerer ved 0,6 M ammoniumsulfat. Til slutt ble dimer CSF-1 diafUtrert mot 0,588% natriumcitrat og 0,645% NaCl ved pH 7. I fravær av glutationredokssystemet, kan diafilteringstrinnet som er nødvendig for fjerning av glutation bli utelatt.

De endelige produktene fra refoldingene utført i nærvær eller i fravær av et redoksssystem ble sammenlignet ved SDS-PAGE, RP/HPLC, isoelektrisk fokusering og bioanalyse. Lignende molekylvekter og renheter (95% ved densitometri-scanning) under både reduserende og ikke-reduserende betingelser på 12% SDS-PAGE visualisert ved Coomassie-farging ble observert i begge refoldete prøver. Eevers-fase HPLC-analyse ble også anvendt for å sammenligne refoldingskinetikken etter 5 eller 12 dager CSF-1 refolding i nærvær eller fravær av glutationredokssystemet. Disse prøvene ble øyeblikkelig kjørt på en C4 Vydac-kolonne med en 35-55% acetonitril, 0,1% TFA gradient eluering ble utviklet i løpet av 30 minutter. Begge systemene resulterte i to hoved-dimer former med lignende retensjonstider og som så ut til å være i en relativt stabil likevekt i løpet av den analyserte tidsperioden. Phast (Pharmacia) isoelektriskfokusering (IEF) geler med 1,0 jig av hver av de refoldete CSF-l-preparatene viste lignende ioniske mønstere, med en hovedionisk form med en pl på omtrent 4,7 og en litt mere sur mindre form. Både spontant refoldet CSF-1 og CSF-1 som ble refoldet ved anvendelse av redoksssystemet hadde spesifikke aktiviteter på 1,2 x 10** U/mg i NSF-60 celle-proliferasjonsanalysen. CSF-1 produsert ved hjelp av disse to refoldingssystemene så dermed ut til å være vesentlig identiske i produktrenhet og biologisk aktivitet, ifølge analysene ved de beskrevne kriteriene. Utbyttet var også sammenlignbart for de to fremgangsmåtene.

I tillegg til utelukking av diafiltreringstrinnet for fjerning av glutation, kan konsentreringstrinnet bli erstattet av et alternativt rensningstrinn hvori det store volumet av refoldet dimer CSF-1 direkte blir applisert på en annen anion-byttekolonne for konsentrering før ammoniumsulfat-felling og påfølgende rensing ved hydrofob interaksjonskromatografi.

Eksempel 9

CSF-1 konstruksjoner hvori visse cysteiner er blitt forandret til seriner er også blitt refoldet. Disse refoldete proteinene er helt aktive in vitro, men har litt forskjellige RP-HPLC retensjonstider. For eksempel, ble dobbelt-serin-konstruksjonen, se<r>^57ser^5gLCSF/NV3CV221, refoldet ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 5, og dette resulterte i et CSF-l-preparat som utviser en enkelt topp på RP-HPLC. Når et hvilket som helst av de enkelt-serin konstruksjonene, se<r>157LCSF/NV3CV221 eller se<r>15gLCSF/NV3CV221, ble refoldet, ble det nødvendig å anvende en modifisert refoldingsprotokoll for å oppnå et produkt som var homogent når det ble analysert på RP-HPLC. Disse to produktene eluerte begge med den senere retens jonstid enn ser157ser159LCSF/NV3CV221 refoldete produktet, men var fullt aktivt in vitro.

E.coli-stamme DG116 ble transformert med enten plasmidvektor pLCSF221 eller pLCSF221C, plasmider inneholdende genet som koder for ser157LCSF/NV3CV221 eller ser159LCSF/NV3CV221, respektivt. Disse to E. coli-stammene ble dyrket i ryste-flasker ved 30°C i 500 ml prøvemedium beskrevet i eksempel 5 (final Å280nin På 0,2). CSF-l-uttrykking ble indusert ved skifting av temperaturen på kulturen til 42°C. Etter 4 t ble kulturen høstet ved sentrifugering og cellene resuspendert i 30 ml 50 mM Tris buffer (pH 8,5), 5 mM EDTA. Cellene ble lysert ved sonikering og celledebriet ble beholdt etter sentrifugering. Refraktile legemer ble deretter isolert ved resuspendering av celledebriet i 30% sukrose og pelletering av de refraktile legemene ved sentrifugering. De refraktile legemene ble oppløst i 10 M urea, 10 mM Tris (pH 8,5), 1 mM EDTA og 5 mM DTT. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering, etterfulgt av filtrering av filtrering gjennom et 0,2 um Millex-filter. CSF-l-monomerer ble deretter renset fra filtratet, ved anvendelse av ionebyttekromatografi på en Bio-Rad TSK DEAE-5-PW kolonne (7,5 x 75 mm) ekvilibrert i 6 M urea, 10 mM Tris (pH 8,5) inneholdende' 1 mM EDTA og 1 mM DTT. CSF-1 ble eluert med en 45 min, 0-0,4 M natriumkloridgradient. CSF-1 eluerte tidlig i gradienten som en enkelt, hovedproteintopp. Proteinet ble slått sammen og absorbansen ved 280nm ble bestemt. CSF-1 ble refoldet ved fortynning inn i en oppløsning inneholdende 50 mM Tris (pH 8,5), 5 mM EDTA, 2 mM redusert glutation, og 1 mM oksydert glutation til en final A280nm verdi På 0,2 ifølge beregninger fra ufortynnet DEAE-sammenblandede fraksjoner av Aggonm-absorbansen. CSF-1 ble refoldet i 48 t ved 4°C.

Nå ble et ytterligere oksydasjonstrinn tilført refoldings-protokollen for å tilveiebringe et produkt som var vesentlig homogen ifølge RP-HPLC-analyse. De refoldete CSF-l-proteinet ble dialysert ved 4°C i 24 t i 0,4 M urea, 50 mM Tris (pH 8,5), 5 mM EDTA inneholdende bare redusert glutation (2 mM). Dette trinnet kan fjerne glutation bundet til proteinet gjennom en blandet disulfid. 1 M fosforsyre ble deretter anvendt for å justere pH til 6,5, som dermed reduserer tio-disulfid utbyttegraden. CSF-1 ble renset ved ionebyttekromatografi på en Bio-Rad TSK DEAE-5-PW-kolonne ekvilibrert i 10 mM natriumf osf at, 25 mM Tris buffer (pH 6,5). Dette trinnet fjerner gjenværende glutation og renser proteinet ytterligere. Proteinet ble eluert med en 45 min, 0-0,6 M natriumkloridgradient. Refoldet, CSF-1 dimer sammenslåtte fraksjoner ble deretter utsatt for kupriklorid-oksydasjon ved anvendelse av en modifikasjon av fremgangsmåten som læres i U.S. patentnr. 4,572,798, og patentet er inkorporert heri ved referanse. CSF-1 ble fortynnet til 0,2 absorbansenheter (A280nm) i 10 mM natriumfosfat, 25 mM Tris buffer (pH 6,5) og behandlet med 50 umolar kupriklorid i 2 t ved romtemperatur.

Oksydert CSF-1 dimer viste seg å være oppløselig i 1,2 M ammoniumsulfat. Ytterligere rensing ved hydrofob interaksjonskromatografi på en fenyl-Sepharosekolonne som beskrevet i eksempel 5 kan bli utført.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte for å tilveiebringe renset, biologisk aktiv CSF-1 dimer karakterisert ved at man: (a) dyrker rekombinante bakterier som uttrykker CSF-monomeren, (b) isolerer i et miljø med en tilstrekkelig konsentrasjon av kaotrofiske middel(er), fortrinnsvis guanidin eller urea, og reduseringsmiddel(er) for å ødelegge den tertiære strukturen til CSF-1, den reduserte monomere, oppløste formen av CSF-1 produktet fra bakterielle celler, (c) ref older monomeren fra (b) i et tidsrom på minst 24 timer under refoldende betingelser som innbefatter dannelsen av intra og inter-kjedede disulfidbindinger for å produsere CSF-1 dimer i en mengde på mindre enn 2 mg/ml; og betingelsene omfatter: (i) reduserer konsentrasjonen av det kao trofiske midlet til 0.1-2M, og (li) kontakter monomeren ifølge (b) med et redokssystem, som metallioner/luft eller sulfhydryl/disulf idkombinasjon, så som oksydert eller redusert glutation, ved en temperatur på 0-37"C, fortrinnsvis 0-4°C, (d) renser refoldet, dimerisert CSF-1 fra (c).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at monomeren ifølge (b) blir opprettholdt under refoldende betingelser mellom 2 til 4 dager.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at trinnet (c) videre omfatter refolding av monomeren ifølge (b) ved en lav temperatur.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av guanidinsaltet blir redusert til mindre enn 2 M i trinn (c).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av urea blir redusert til mindre enn 1 M i trinn (c).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man renser den reduserte monomere formen av (b) ved en fremgangsmåte som velges fra gruppen bestående av: (i) størrelse-gelkromatografi; (ii) ione-byttekromatografi; og (lii)hydrofob interaksjonskromatografi.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at produktet av CSF-l-genekspres jon er et uopp-løselig CSF-l-protein og hvori fremgangsmåten videre innbefatter at man isolerer uoppløselig protein som inneholder CSF-1 og oppløser det uoppløselige proteinet for å tilveiebringe monomer CSF-1 fra (a).

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at refoldingsbetingelsene ifølge (c) innbefatter at man fortynner det kaotrofiske miljøet hvori disulfidbindinger dannes gjennom luftoksydasjon.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at refoldingsbetingelsene ifølge (c) innbefatter at man fortynner det kaotrofiske miljøet i nærvær av et redokssystem.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at dimerformen ifølge (c) renses ved anvendelse av en eller flere av fremgangsmåtene valgt fra gruppen bestående av: (i) størrelse-gelkromatografi; (ii) ione-byttekromatografi; (lii) affinitetskromatografi; og (iv) hydrofob interaksjonskromatografi.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at ione-byttekromatografi anvender DEAE Sepharose-kromatografi ved pH 5,5 til 7,0.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at proteinet renses ytterligere ved hydrofob interaksjonskromatografi ved anvendelse av fenyl-Sepharose eller fenyl-TSK.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte oppløsning innbefatter at man behandler med et kaotrofisk miljø i nærvær av et reduksjonsmiddel.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man separerer eventuelle uoppløselige aggregater som dannes fra CSF-l-proteiner under refoldingsbetingelsene ifølge (c), oppløser nevnte aggregater, og utsetter nevnte oppløste aggregater for refoldingsbetingelser.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at CSF-1 er ekspresjonsproduktet fra konstruksjoner som velges fra gruppen bestående av: asp5gSCSF/CV150 og de korresponderende NV2 eller NV3 analoger derav; asp5gSCSF/CV158 og den korresponderende NV3-analogen derav; LCSF/CV190; LCSF/CV221 og den korresponderende NV3-analogen derav; ser157<L>CSF/CV221, ser15gLCSF/CV221, og ser157seri5gLCSF/CV221 og NV2 eller NV3-analogene derav.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at CSF-1 er ekspresjonsproduktet fra konstruksjoner som velges fra gruppen bestående av: asp59SCSF/CV158 og NV2 eller NV3-analoger derav; asp5gSCSF/CV158 og den korresponderende NV2-analogen derav; LCSF, LCSF/CV150, LCSF/CV190, se<r>157seri5gLCSF/CV223 og de korresponderende NV2- eller NV3-analogene derav; LCSF/CV221 og den korresponderende NV2-analogen derav.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for å tilveiebringe en CSF-1 heterodimer, karakterisert ved at man utsetter en blanding av minst to forskjellige oppløste CSF-1 monomere primaersekvenser for refoldingsbetingelser og renser heterodimeren fra de refoldete CSF-1 homodimerene.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved CSF-l-genet koder for LCSF/NV3CV221, asp59SCSF/NV3CV150, asp5gSCSF/NV3CV158, ser157LCSF/NV3CV221, se<r>15gLCSF/NV3CV221, eller ser157ser159<L>CSF/NV3CV221.