JP2002332294A

JP2002332294A - 改良型の塩基性線維芽細胞増殖因子

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Publication number: JP2002332294A
Application number: JP2002064561A
Authority: JP
Inventors: Stewart A Thompson; エー．トンプソンスチュワート
Original assignee: Scios LLC
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1989-05-02
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2002-11-22
Also published as: CA2055462A1; WO1990013310A1; US5130418A; AU5831690A; EP0471793A1; EP0471793A4; JPH04507099A; JP3332085B2

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、安定で、使い易すく、活性が本来
の蛋白と同等な、そして、薬理学的製剤に適用可能な形
態の、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、提供
すること。【解決手段】以下の工程より成る、塩基性線維芽細胞増
殖因子蛋白を安定化する方法：塩基性線維芽細胞増殖因
子（ｂＦＧＦ）のアミノ酸配列を有する影響を受けやす
いペプチドを、該影響を受けやすいペプチドに含まれて
いる少なくとも一つ以上のシステインとＳ−Ｓ共有結合
を形成できる、該ｂＦＧＦの多量体化を防止するのに有
効な量の保護試薬を用いて、ｐＨ６あるいはそれ以上で
あって前記ｂＦＧＦが変質しないｐＨの緩衝液の存在下
で、該安定化操作が効果を発揮するのに十分な時間、処
理する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白組成物を安定
化する技術に関わる。さらに詳細には、ジスルフィド、
あるいは、他のＳ−Ｓ共有結合を形成できる化合物によ
り、塩基性線維芽細胞増殖因子を処理し、安定化する技
術に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】所望する蛋白をリコンビナントに製造す
ることに伴う、解決の難しい問題の一つは、リコンビナ
ント産生物の適切なプロセッシング及び折り畳み構造を
得ることにある。蛋白の一次構造をコードしている遺伝
子は、一般に、それが正常に複写及び翻訳される宿主と
は異なる宿主系内で発現されるので、その結果得られる
産生蛋白は、正しいアミノ酸配列を有する一方で、本来
の蛋白とは性質が異なっている。ある場合には、この違
いの一部は、分子構造の変化によることもある−−正常
には伴って起きるグリコシル化の欠如が最も一般的であ
る。しかし、蛋白の三次元構造は、細胞環境により異な
り得ることも理解すべきである。特に、種々のリコンビ
ナント宿主は、通常は細胞成分に付随している酸化又は
還元のレベルに関して異なる環境を有しているために、
本来の蛋白とは異なるジスルフィド結合組成を含有し、
さらに、一般的には、三次元構造の異なった、リコンビ
ナント蛋白を産生する。これらの変異は、蛋白の挙動及
び活性に有害な影響を与えることがある。

【０００３】塩基性線維芽細胞増殖囚子（ｂＦＧＦ）の
場合、本来の分子がグリコシル化されていないので、グ
リコシル化パターンには関連しない。しかしながら、リ
コンビナントに製造された物質は、脳下垂体から単離さ
れた物質とはクロマトグラフィーの挙動が異なり、そし
て、溶液中での多量体化を防止しするために手段を講じ
ない場合には、安定性の問題が生じる。本発明者がここ
に示し、さらにＳｅｎｏ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍＢｉｏｈｓＲｅｓＣｏｍｍ（１９８８）
１５１：７０１．に開示されているように、位置第７８
番及び第９６番のシスティンをセリンで置換すると、多
量体化が阻止される。天然のウシ脳下垂体から単離した
ｂＦＧＦも場合もまた、多量体化しない。単離された本
来のウシ脳下垂体のｂＦＧＦのアミノ酸組成分析によ
り、遺伝子は４個のシステインしかコードしていないの
に、６個のシステインが存在していることが示された。
この付加的なシステイン残基は、蛋白にジスルフィドが
結合したものであると提言された。（Ｅｓｃｈ，Ｆ．，
ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ
ＵＳＡ（１９８５）８２：６５０７．）．自然現象と
して、蛋白が、シスチン又はグルタチオンジスルフィド
との反応により、システインあるいはグルタチオンとの
複合体を形成することは、昔から示唆されまた教示され
ていた。１９６０年に、Ｅａｇｌｅ，Ｈ．，ｅｔａ
ｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９６０）２３５：１
７１９−１７２６．は、哺乳類細胞培養物は、例えば、
システイン、Ｓ₂Ｏ₃ ^-2、及びチオグリコール酸塩を含む
Ｓ−Ｓ共有結合を形成できる化合物を添加すると、保持
されることを示した。この著者らは、培地中の蛋白は、
Ｓ−Ｓ結合によりこれらの試薬と結合したと推論してい
る。ヒト血清アルブミンは、恐らくジスルフィド結合に
より二量体型で、また、システインまたはグルタチオン
により安定化され単量体型で存在することが、Ｋｉｎ
ｇ，Ｔ．Ｐ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９６１）２
３６：ＰＣ５．により、教示された。グルタチオンと結
合することは、ヘモグロビンの不均一性を説明するため
に、Ｈｕｉｓｍａｎ，Ｔ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＪＬ
ａｂ＆ＣｌｉｎＭｅｄ（１９６２）６０：３０２−３
１９．により、提案された。

【０００４】Ｈａｎａｐ，Ｋ．Ｒ．，ｅｔａｌ．，Ｂ
ｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（１９７３）
３１０：１０４−１１０．は、グルタチオンと血清アル
ブミンとの混合ジスルフィドの存在を示し、さらに、こ
れらがグルタチオン還元酵素により還元されることを見
いだした。Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（１９７７）４９
７：１９２−２０４．は、蛋白とグルタチオンとの混合
ジスルフィドの形成は、Ｓ−Ｓ／ＳＨ比を調節するため
の手段であると提案した。逆に、Ｍａｎｎｅｒｖｉｔ
ｃ，Ｂ．，ｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｉｍＪ（１９８
０）１９０：１２５−１３０．は、蛋白とのジスルフィ
ドの形成は、蛋白活性の調節のための機構であると、仮
定した。その例としてピルビン酸キナーゼが挙げられ
た。

【０００５】多くの哺乳類に於てｂＦＧＦをコードして
いる遺伝子中の３４及び１０１位にシステイン残基が保
存されていることから、これら二つの残基の間に分子内
ジスルフィドが形成されていると仮定され、そして、７
８及び９６位の位置でシステインがセリンに置き替わっ
た変異型のリコンビナントｂＦＧＦに於てこのジスルフ
ィドの形成が報告された（Ｆｏｘ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔａ
ｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９８８）２６３：１８
４５２）。

【０００６】リコンビナント的に製造されたｂＦＧＦ
に、グルタチオンの様な有機ジスルフィド含有化合物を
添加すると、安定性の増大と、本来の蛋白により近い挙
動が得られることが、発見された。この安定化型のｂＦ
ＧＦを精製すると、薬理学的に適用される処方に適した
調製物が得られる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安定で、使
い易すく、活性が本来の蛋白と同等な、そして、薬理学
的製剤に適用可能な形態の、塩基性線維芽細胞増殖因子
（ｂＦＧＦ）を、提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明の開示本発明は、安定で、使い易すく、活性が本来の蛋白と同
等な、そして、薬理学的製剤に適用可能な形態の、塩基
性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を、提供する。この
形態は、影響され易い型の塩基性線維芽細胞増殖因子、
あるいは、その類似体を、例えば、グルタチオンジスル
フィド（ＧＳＳＧ）の様な有機ジスルフィドでｂＦＧＦ
とＳ−Ｓ共有結合形成可能な保護試薬と処理することに
より得られる。この様にして安定化したｂＦＧＦを、次
に、薬理学的あるいは他の組成物として用いるために、
標準的なクロマトグラフィー技術によりさらに精製す
る。

【０００９】この様に、一つの見地からは、本発明は、
塩基性線維芽細胞増殖因子蛋白を安定化する方法に関す
るものでありこの方法は以下の工程を包含する。即ち、
ｂＦＧＦのアミノ酸配列を有する影響を受けやすいペプ
チドを、ｂＦＧＦとＳ−Ｓ共有結合を形成できる、好適
にはＲが有機置換基であって構造式ＲＳＳＲの化合物で
ある、保護試薬の、多量体化を防止するのに有効な量を
用いて、ｐＨ６あるいはそれ以上であって前記ｂＦＧＦ
が変質しないｐＨの緩衝液存在下で、該安定化操作が効
果を発揮するのに十分な時間、処理する工程を包含す
る。

【００１０】他の見地からは、本発明は、本発明の方法
にしたがって調製されたｂＦＧＦ、及び、本発明の方法
に有用な組成物に関する。

【００１１】本発明は以下を提供する：１．以下の工程より成る、塩基性線維芽細胞増殖因子蛋
白を安定化する方法：塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦ
ＧＦ）のアミノ酸配列を有する影響を受けやすいペプチ
ドを、該影響を受けやすいペプチドに含まれている少な
くとも一つ以上のシステインとＳ−Ｓ共有結合を形成で
きる、該ｂＦＧＦの多量体化を防止するのに有効な量の
保護試薬を用いて、ｐＨ６あるいはそれ以上であって前
記ｂＦＧＦが変質しないｐＨの緩衝液の存在下で、該安
定化操作が効果を発揮するのに十分な時間、処理する工
程。

【００１２】２．前記保護試薬が、各Ｒが独立して、該
保護試薬に水溶性を賦与するのに十分な親水性をもつ有
機置換基である、構造式ＲＳＳＲの化合物である、項目
１の記載の方法。

【００１３】３．前記の構造式ＲＳＳＲの化合物が、グ
ルタチオンジスルフィド及びシスチンから成る群がら選
択される、項目２に記載の方法。

【００１４】４．前記ｐＨが、ｐＨ６から８である、項
目１に記載の方法。

【００１５】５．さらに、処理したｂＦＧＦをクロマト
グラフィーによる精製に共する工程を包含する、項目１
に記載の方法。

【００１６】６．項目１に記載の方法で調製される安定
化した塩基性ＦＧＦであって、図８あるいは図９に示し
た上部の番号の第２４〜１５５番の残基で示されるアミ
ノ酸配列を含む場合には、前記保護試薬がグルタチオン
ジスルフィドではない、ｂＦＧＦ。

【００１７】７．項目５に記載の方法で調製される安定
化した塩基性ＰＧＦであって、図８あるいは図９に示し
た上部の番号の第２４〜１１５番の残基で示されるアミ
ノ酸配列を含む場合には、前記保護試薬がグルタチオン
ジスフィドではない、ｂＦＧＦ。

【００１８】８．影響を受けやすい塩基性線維芽細胞増
殖因子（ｂＦＧＦ）蛋白、および、該影響を受けやすい
ｂＦＧＦに含まれている少なくとも一つ以上のシステイ
ンとＳ−Ｓ共有結合を形成できる、該ｂＦＧＦを安定化
するのに有効な量の保護試薬、を含有する水性溶媒を含
む組成物であって、該水性溶媒のｐＨが、少なくとも６
で該ｂＦＧＦが変性しないｐＨを有する、組成物。

【００１９】９．前記の保護試薬が、各Ｒが独立して、
該保護試薬に水溶性を賦与するのに十分な親水性をもつ
有機置換基である、構造式ＲＳＳＲの化合物である、項
目８に記載の組成物。

【００２０】１０．前記の構造式ＲＳＳＲの化合物が、
グルタチオンジスルフィド及びシスチンから成る群がら
選択される、項目９に記載の組成物。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明で用いられている塩基性線
維芽細胞増殖因子という用語は、ｐＨ７においてカチオ
ン性であり、そして、ウシの脳及び副腎皮質由来毛細管
内皮細胞（ａｄｒｅｎａｌｃｏｒｔｅｘ−ｄｅｒｉｖ
ｅｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
（ＡＣＥ）ｃｅｌｌ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ウシの
副腎皮質細胞、胞状卵胞顆粒層細胞、あるいは、血管の
平滑筋細胞、等の培養細胞にｉｎｖｉｔｒｏ試験で使用
した際にマイトジェン活性を示すことが可能な、蛋白と
して定義される。これらの培養細胞を用いたｉｎｖｉ
ｔｒｏ試験については、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，
Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ
（１９８５）１２２：３２３−３３２．、Ｇｏｓｐｏｄ
ａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＪＣｅｌｌ
Ｂｉｏｌ（１９８３）９７：１６７７−１６８５．、Ｅ
ｓｃｈ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄ
ＳｃｉＵＳＡ（１９８５）８２：６５０７−６５１
１．、及び、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．，ｅｔ
ａｌ．，ＪＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ（１９８６）
１２７：１２１−１３６．、に記載されている。さら
に、鶏の漿尿膜を用いたｉｎｖｉｖｏ試験について
も、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．，ｉｎ”Ｈｏｒ
ｍｏｎａｌＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅ
ｓ−ＸＩＩ：２０５−２３０（Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒ
ｅｓｓ）．に記載されている。ｐＨ７においてカチオン
性であり、そして、上記の試験の少なくとも一つに活性
を持つ蛋白が、塩基性ＦＧＦと定義される。

【００２２】この定義を満足するアミノ酸配列には、様
々な実施様態がある。好適な実施様態は、それぞれウシ
及びヒトのライブラリーから単離された遺伝子にコード
された、塩基性ＦＧＦのアミノ酸配列を示した、図８及
び図９に示したものである。これらの遺伝子は、図中の
配列の下に”１”と番号付られたプロリンから始まる１
４６個のアミノ酸を持つ、例えば脳下垂体などから一般
に単離された、蛋白をコードしている。この示されたヒ
ト及びウシの１４６個のアミノ酸配列は、本発明の方法
が応用可能な塩基性ＦＧＦの二つの好適な例である。図
８及び図９に示した蛋白の活性型で、図に示したよう
に、１４６個のアミノ酸の配列のＮ−末端に伸張部分を
有するもの、および、１個のアミノ酸の配列のＮ−末端
から１５個以上のアミノ酸の配列を失ったもの、等も好
適である。特に好適なのは、Ｎ−末端のメチオニン（こ
れは、バクテリア中でリコンビナントｂＦＧＦを産生す
る間に取り除かれる）を除く７個または８個のアミノ酸
を上流にすべて持つアミノ酸配列の、全体で１５３個か
１５４個のアミノ酸を含有する型であり、また、基本配
列から最初の１５個のアミノ酸を欠き、１３１個のアミ
ノ酸を含む、短縮型である。リコンビナント的に蛋白を
製造すると、完全な１５５個のアミノ酸配列の発現した
ものから、翻訳後のプロセッシングによりＭｅｔが取り
除かれ、１５４個のアミノ酸型が得られる。配列の上部
に番号付された２あるいは３の位置に示されたＡｌａか
ら始まる、１５３個または１５４個のアミノ酸型若しく
は、その混合物が最も好適である。一般的に、本明細書
に用いている番号付体系は、配列の上部の番号を指して
いる。

【００２３】塩基性ＦＧＦの定義の中に入っており、前
述の試験の少なくとも一つ以上でＦＧＦ活性を示し、中
性ｐＨにおいてカチオン性であるうえに、さらに、ヘパ
リンと結合し、また、アミノ末端配列の合成類似体を用
いて調製した抗体あるいは、ウシまたはヒトの塩基性Ｆ
ＧＦに、あるいは、それら合成のまたは天然のペプチド
断片に対する他の抗体、と免疫学的に反応する、ほとん
どの、しかし全てではない、蛋白が適切である。一般的
に、これらの蛋白は、図８あるいは図９のｂＦＧＦに対
して少なくとも８０％の類似性があり、９０％以上の類
似性があることが望ましい。好適な例の一つに、１９８
７年７月７日付の米国特許出願第０７０，７９７号に記
載されているような、前記試験でＦＧＦ活性を保持した
ｂＦＧＦ類似体がある。これはここに参考文献として採
用される。本発明の方法の適切な基質となるように、ｂ
ＦＧＦは、−Ｓ−Ｓ−共有結合を形成可能なシステイン
を、たとえば、一つ、好適には二つのシステイン残基
を、３４および１０１番の位置（分子内ジスルフィド結
合部位とされている）に含まれている以外の位置に含有
している必要がある。

【００２４】一般的に本発明の方法は、いかなる”影響
され易い”、抗酸化剤が存在しないときにジスルフィド
結合した多量体を形成する、ｂＦＧＦ蛋白にも応用でき
る。蛋白が、多量体を形成しやすいというこの傾向は、
例えば、種々の異なる時間空気に曝された蛋白の溶液
を、標準的な高性能クロマトグラフィー法に懸け、高分
子量型の存在を検出することにより、簡単に評価でき
る。又、還元的及び非還元的条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ
に、これらの試料を懸けることにより、多量体化が検出
できる。還元的条件下での結果は、標準的な多量体化し
ていない分子量を与え、還元されていない物質は、多量
体の存在を示す。このような規則の下で多量体化する蛋
白について、本発明の方法を用いて、非多量体化形態に
よる安定化をおこなうことが出来る。

【００２５】通常、多量体化する蛋白は、分子内ジスル
フィド結合部位に含まれていないシステイン残基を、少
なくとも一つ以上含有している。もちろん、配列を調べ
ることは、分子内ジスルフィド結合が形成される範囲を
予測することではないので、単純にアミノ酸配列中のシ
ステイン数を評価することにより、どの蛋白が、本方法
による安定化に影響され易いかを識別することは不可能
である。しかしながら、本発明者により、例えば、塩基
性ＦＧＦといくらかの相同性を有する酸性ＦＧＦは、類
似の活性があり、中性ｐＨではアニオンであるが、多量
体化しないし、ＧＳＳＧとも反応しないことが本明細書
で示された。このことは、”影響の受け易さ”は、アミ
ノ酸配列からは明白とはならず、実験的に決定しなけれ
ばならないことを示している酸性ＦＧＦは、奇数個のシ
ステインを持っているので、分子内ジスルフィドの形成
は一つの自由なシステインを残し、そのために、この蛋
白は、二量体化が可能である。

【００２６】従って、”影響を受け易い”ｂＦＧＦ蛋白
を、次の様に定義することは、妥当である−−前に記述
した試験により示される様に、本発明の方法により安定
化され得るｂＦＧＦである。塩基性ＦＧＦの場合に
は、”影響を受け易い”ためには、図８及び図９に上部
に示した番号で示される７８及び／若しくは９６番の位
置（または、例えば類似体中の同様の位置に対応するシ
スティン）にシステインが少なくとも一つ以上存在する
ことが要求される。両方のシステインが存在すると、な
お好適である。”影響の受け易さ”を維持するために
は、本来の配列の中のどの位置であるのかを正確に特定
する必要はなく、さらに、一般的には、”影響を受け易
い”型の塩基性ＦＧＦ蛋白は、多量体化のために使え
る、即ち、当該の条件下では、分子内ジスルフィド結合
が形成される範囲に含まれない、少なくとも一つ、好適
には二つのシステイン残基を有している。

【００２７】哺乳類動物組織から単離された”天然の”
塩基性ＦＧＦは、最も一般的な単離用プロトコールに従
うと、恐らく既に存在していたグルタチオンジスルフィ
ドがｉｎｓｉｔｕで用いられ得ることにより、既に安
定化されている。塩基性ＦＧＦは、この天然に起こる安
定化が起こらない環境下で製造された場合にのみ、多量
体化を阻止する処理に対して影響を受け易い。これは、
還元試薬による蛋白の処理が、単離プロトコールに含ま
れている場合、あるいは、塩基性ＦＧＦのリコンビナン
ト製造の場合には、最も普遍的であるが、特に、原核細
胞系の場合に、あるいは、既に存在している安定化につ
いての正しい環境が使えない真核細胞系の場合、に起こ
る。

【００２８】保護試薬一般的に保護試薬は、目的蛋白質中のシステイン残基と
Ｓ−Ｓ共有結合を形成可能な試薬である。最も一般的に
は、形成される結合はジスルフィド結合であり、保護試
薬は、各Ｒが独立して、該保護試薬に水溶性を賦与する
のに十分な親水性をもつ有機置換基である、構造式ＲＳ
ＳＲの化合物である。ＲＳＳＲの最も好適な具体例は、
両Ｒ置換基が同じものである場合で、この化合物は入手
が非常に簡単で、及び／若しくは、成分とするスルフフ
ィドリル化合物から容易に調製できる。例えば、シスチ
ン、ホモシスチン、シスタミン、及び、グルタチオンジ
スルフィド（ＧＳＳＧ）は、普通に入手できる試薬であ
る。混合ジスルフィドを用いることによる特別の利点は
ないが、これらの成分が混合したジスルフィドも用いる
ことが出来る。同様に簡単に調製できる、しかし非常に
高価なものに、補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅＡ）のジ
スルフィドがある。

【００２９】これら例示した構造式ＲＳＳＲの化合物か
らわかるように、Ｒは一般には、水溶性となるように十
分な極性基で置換されたヒドカルビルである。そのた
め、ＧＳＳＧあるいはシスチンの様に、硫黄原子を含む
残基がアミノ酸またはペプチドの一部分であるものが、
好適なＲＳＳＲの例である。

【００３０】構造式ＲＳＳＲの保護試薬に加えて、Ｓ−
Ｓ共有結合を形成可能な無機化合物を使用することもで
きる。好適な無機試薬としては、テトラチオネートイオ
ン、即ち、Ｓ₄Ｏ₆ ^-2が挙げられる。この場合、目的ペプ
チドの安定化された形態は、構造−Ｓ−ＳＯ₃ ^-を有する
置換基を持ったシステイン誘導体を含有することにな
る。さらに、保護試薬として用いられるものに、構造式
ＲＳ−ＳＯ₃ ^-混合試薬がある。

【００３１】総括すると、保護試薬は、安定化される基
質蛋白のフリーのシステインのチオール基とＳ−Ｓ共有
結合を形成するならば、いかなる化合物でも使用でき
る。薬理学的使用を意図した蛋白の安定化に好適なの
は、薬理学的に許容できる誘導体を生成する試薬であ
る；従って、グルタチオンあるいはシステインの様な、
生体適合性の物質により、基質のシステインを誘導体に
換える化合物の使用が好適である。

【００３２】一般的方法影響され易い目的蛋白の安定化は、緩衝化水性溶液中で
行う。ｐＨは、６から、上限は、変性により蛋白の安定
性が保証される任意の範囲まで、が使用できる。フリー
のチオール基、あるいは、チオール反応性の基を含まな
いものならば、例えば、リン酸、トリス、あるいはその
他の緩衝液を含む、普通に用いられる緩衝溶液系が何で
も使用できる。副反応を防ぐために、約１ｍＭの、低濃
度のＥＤＴＡを加えることが望ましい。蛋白の溶解度に
依存した好適な濃度に、蛋白を緩衝液に溶解する。典型
的な濃度の範囲は、０．１−１０ｍｇ／ｍｌである。保
護試薬は、使用する目的蛋白の濃度により決定される、
好適な任意の濃度で用いてられる。反応を最後まで進行
させ完了させることが望ましいために、蛋白の１０から
１００倍過剰のモル比となるような試薬濃度が望まし
い。種々の蛋白濃度の溶液条件に対して、適切な量は、
０．１ｍＭ−１００ｍＭであり、さらに一般的には、
０．５−５ｍＭが、試薬の溶解性に応じて用いられる。
この反応混合物は、安定を賦与するのに十分な時間、代
表的には数時間から一晩の間、約４℃から約室温の間の
温度で、インキュベートする。得られる安定化蛋白は、
標準的な技術を用いて精製する。保護試薬の選定に依存
するが、通常は蛋白が溶液中の唯一の巨大分子であり、
そのためにゲル濾過により容易に回収できる；この蛋白
をさらに精製するためには、他の標準的な技術を使用し
得る。例えば、塩基性ＦＧＦが目的蛋白の場合、Ｇｏｓ
ｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ，Ｄ．ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮ
ａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ（１９８４）８１：
６９３６．に記述されている、ヘパリンセファロースア
フィニティークロマトグラフィーを用いることが出来
る。

【００３３】

【実施例】以下の実施例は、本発明を説明するためのも
のであり、制限するものではない。

【００３４】調製法ＡリコンビナントｂＦＧＦの調整ヒト塩基性ＦＧＦは、同時１９８６年８月３０日付で出
願された、係属中の米国特許出願第８６９，３６２号に
記載されているのと同様の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ中
でリコンビナント的に製造した。このｂＦＧＦを細胞溶
解液から回収し精製した。

【００３５】簡単に、かつ、特定的に述べると、使用し
たｂＦＧＦ遺伝子は、Ｎ−末端配列がＭｅｔＡｌａＧｌ
ｙＳｅｒＩｌｅで始まる、１５４個のアミノ酸型の蛋白
をコードしている。このｂＦＧＦ遺伝子は、位置２のａ
ｌａが欠失していること以外は、図９に示したのと同じ
配列を有する。この様にバクテリア中で、上記出願に従
い、ビコンビナント的に製造した場合、Ｎ−末端のメチ
オニンが切り取られ、均一な１５３個のアミノ酸型の蛋
白が得られる。

【００３６】この遺伝子は、標準的な原核細胞の発現ベ
クターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＥｃｏＲＩ制限部
位の間へ、クローニングされ、Ｅ．ｃｏｌｉＢへ、形
質転換された。培養物は、グリセリン保存溶液に保存す
るか、あるいは、Ｌ＋アンピシリンを含む培養皿上に置
かれた。

【００３７】単一のコロニーを、５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含む５０ｍｌのＬ−培地に接種し、一晩、３
０℃で培養した。この培養物の１０ｍｌを、１ｘカザミ
ノ酸及び、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、１Ｌ
のＭ９培地に接種した。この培養物は、Ａ₅₅₀に於ける
ＯＤ値が０．５になるまで成長させ、ベクターはｔｒｐ
プロモーターの支配領域に遺伝子を有するので５０μｇ
／ｍｌのインドールアクリル酸を用いて誘導した。培養
物は、一晩、３０℃で成長させた。次の朝、培養物を遠
心し、ペレットを必要になるまで−７８℃に凍結した。

【００３８】このペレットを、２０ｍＭのリン酸ナトリ
ウム、ｐＨ７、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメ
チルスルフォニルフルオライド、及び、０．５ｍｇ／ｍ
ｌのリゾチームから成る溶液の２５ｍｌに再懸濁した。
氷上に１５分間置いた後、細胞を破壊するために、懸濁
液を超音波処理した。各１００μｇのＲＮＡｓｅ及びＤ
ＮＡｓｅを添加した。氷上に１０分間置いた後、混合物
を遠心処理し、上清を精製用に採取した。

【００３９】上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７、１ｍＭのＥＤＴＡ、の溶液で平衡化したＳＰ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ（２．５ｃｍｘ２ｃｍ）カラムに懸け
た。このカラムは、２８０ｎｍの吸光度がベースライン
に復帰するまで同じ緩衝液で洗浄した。蛋白は、２０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７、１ｍＭのＥＤＴＡ、４
００ｍＭＮａＣｌの溶液で溶出した。

【００４０】このＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの
４００ｍＭＮａＣｌ分画を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ
７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、６００ｍＭＮａＣｌの溶
液で平衡化したｈｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅ
（２．５ｃｍｘ２ｃｍ）カラムに懸けた。このカラム
は、２８０ｎｍの吸光度がベースラインに復帰するまで
同じ緩衝液で洗浄した。蛋白は、２０ｍＭのリン酸ナト
リウム、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ＭＮａＣ
ｌの溶液で溶出した。

【００４１】ｈｅｐａｒｉｎＳｅｐｈａｒｏｓｅカラ
ムから得た蛋白溶液は、ＤＴＴで１０ｍＭの溶液とし、
氷上で３０分間インキュベートし、２０ｍＭのリン酸ナ
トリウム、ｐＨ７、１ｍＭのＥＤＴＡ、の溶液で４０倍
に希釈し、第一段階と同様にＳＰ−Ｓｈｐｈａｄｅｘ
で、再精製した。

【００４２】あるいは、最初のＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
カラムの後に、蛋白をＤＴＴで処理し、次に、最終段階
として、ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのクロマ
トグラフィーに懸けた。この工程を用いると、二番目の
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムの必要がなくなるが、蛋
白は、高塩濃度の緩衝液中に置かれたままになる。

【００４３】実施例１ｂＦＧＦのＧＳＳＧ処理の効果調製法Ａで得られた、Ｎ−末端からｍｅｔと一つのａｌ
ａがなくなっている以外は、第９図と同じの、１５３個
のアミノ酸のヒト配列の精製蛋白を、０．１ｍｇ／ｍｌ
となるように、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのリン
酸ナトリウム、ｐＨ７．５の溶液に加えた。この溶液
を、次に、グルタチオンジスルフィドで１ｍＭの濃度に
し、４℃で、一晩、インキュベートした。修飾型への変
操を最大にするために、１２時間後に溶液を４ｍＭのＧ
ＳＳＧ濃度とし、さらに２４時間、４℃でインキュベー
トした。得られた修飾ｂＦＧＦは、調製法Ａ（前述）の
方法に従い、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムで精製し
た。

【００４４】図１ａは、上記のように処理する前の、ア
セトニトリル／ＴＦＡ濃度勾配を用い、図に示した条件
下での、ＶｙｄａｃＣ₁₈カラムを用いた逆相ＨＰＬＣ
の結果を示している。主要ピークの溶出時間は、３５−
４０分であった。

【００４５】上記のように処理した後、主要ピークが大
体３０分付近にあり、処理ｂＦＧＦが形態を変えたこと
を示す、図１ｂの溶出パターンが得られた。

【００４６】比較のために、図１ｃ及び１ｄは、図８及
び図９に上部の数字で示した第７８番及び第９６番の位
置のシステインをセリンに置き換えた、ｂＦＧＦ類似体
の溶出パターンを示してある。この類似体は、約３３分
で単一ピークとして溶出し、上記処理は溶出パターンに
影響しない。従ってこの方法は明かに、１）これらの位置にシステインが含まれている、及び、２）これらの残基が存在しない類似体では、明白な効果
はない、ことを示している。

【００４７】図２ａは、本実験例に基づいて処理したｂ
ＦＧＦの逆相ＨＰＬＣ分析をさらに例示したものであ
り、Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｓの方法に基づいたウシ
脳下垂体からの物質の挙動を比較のために示している。
図２ａは、ＧＳＳＧ処理したリコンビナントｂＦＧＦの
ＨＰＬＣを示し；図２ｂは、脳下垂体から単離された物
質の、対応するＨＰＬＣを示し；図２ｃは、単離された
物質及び、処理されたりコンビナント物質の同時注入の
結果を示している。グルタチオンで処理されたりコンビ
ナントのｂＦＧＦの挙動は、天然の分離物質と同じであ
る。

【００４８】最後に、図３は、ＡＣＥ細胞の増殖試験に
於ける、実施例１のｂＦＧＦ及び、ＧＳＳＧ処理された
ｂＦＧＦの、活性プロフィールを示したものである。活
性の差は全く見られなかった。

【００４９】実施例２ＧＳＳＧ処理したリコンビナントｂＦＧＦの特性実施例１に記述したように処理したリコンビナントのｂ
ＦＧＦを、未処理のリコンビナントｂＦＧＦでは通常時
間経過と共に起こる多量体化反応を加速する実験目的の
ために、１ｍＭのＣｕＣｌ₂と１分間インキュベートし
た。得られたｂＦＧＦは、次に、ｈｅｐａｒｉｎ−ＴＳ
Ｋを用いた逆相ＨＰＬＣに懸けた。図４ａ及び４ｂは、
ウシ脳下垂体から単離した天然のｂＦＧＦのクロマトグ
ラフィーパターンには、Ｃｕ⁺²処理が全く影響しないこ
とを示している。しかしながら、図４ｃ及び４ｄに示し
たように、ＧＳＳＧで安定化していないリコンビナント
ｂＦＧＦをＣｕ⁺²で処理すると、ピークの複数化、及
び、保持時間の延長が起こる。

【００５０】図４ｅ及び４ｆは、ＧＳＳＧで安定化した
リコンビナントｂＦＧＦの挙動を示しており、天然型と
同様に、Ｃｕ⁺²処理の影響はみられない。

【００５１】実施例１で調製された安定化ｂＦＧＦは、
図５に示したように、少なくとも５日間は安定である。
図５ｄから５ｆは、安定化した物質を、ｈｅｐａｒｉｎ
−ＴＳＫのクロマトグラフィーに懸けた際の、一連のＨ
ＰＬＣ分析の結果である。この一連の図に示されている
ように、５日間の期間では変化はなかった。図５ａから
５ｅに示すように、同じ条件下で、未処理のｂＦＧＦは
多量体を形成し、出発物質の著しい減少を示している。

【００５２】実施例３システイン処理培養混合物中の１ｍＭのグルタチオンを１ｍＭのシスチ
ンに置き換え、反応をｐＨ７．０で行った以外は、実施
例１と同様の工程で行った。図６ａは、この様に処理さ
れた安定化ｂＦＧＦを、ＶｙｄａｃＣ₁₈カラムを用い
た逆相ＨＰＬＣに懸けた結果を示している。図６ｂ及び
６ｃは、システイン処理したｂＦＧＦは、脳下垂体から
単離したｂＦＧＦ物質とは正確に共同転移しなかったこ
とを示している。従って、このシステイン処理した物質
は、ウシ脳下垂体からの天然のｂＦＧＦとは、挙動に於
いて、明かに異なっている。

【００５３】実施例４ｂＦＧＦ類似体実施例１の工程に従い、ｂＦＧＦ類似体に対してＧＳＳ
Ｇ処理を行った。リコンビナントのｂＦＧＦを、第７８
番又は、第９６番の位置のシステインの替わりにセリン
を有する類似体に、置き換えた以外は同じ工程で行っ
た。図７ａ及び７ｂに示したように、この処理により、
７８−Ｓｅｒ変異蛋白では、溶出ピークが速くなり、従
って、ＧＳＳＧ処理がこの類似体に影響することを示し
ている。図７ｃ及び７ｄは、Ｓｅｒ−９６変異蛋白を用
いたときの（これらの条件下では、明かに反応は完全で
はないが）、同様の結果を示している。

【００５４】

【発明の効果】安定で、使い易すく、活性が本来の蛋白
と同等な、そして、薬理学的製剤に適用可能な形態の、
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、リコンビナント体ｂＦＧＦ、及び、そ
のリコンビナント体Ｃ７８／９６Ｓ類似体を、グルタチ
オンジスルフィド（ＧＳＳＧ）で処理した場合、及び、
処理しない場合の逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示してい
る。

【図２】図２は、ＧＳＳＧで処理したリコンビナント体
ｂＦＧＦ、及び、ウシ脳下垂体ｂＦＧＦ、の逆相ＨＰＬ
Ｃ分析の結果を示している。

【図３】図３は、ＧＳＳＧで処理していないリコンビナ
ント体ｂＦＧＦ、及び、ＧＳＳＧで処理したｂＦＧＦ、
の活性曲線を示す。

【図４Ａ】図４は、銅イオン（Ｃｕ⁺²）で前処理した場
合としない場合の、ＧＳＳＧで処理し、または、処理し
ない、リコンビナント体ｂＦＧＦ、および、銅イオン
（Ｃｕ⁺²）で前処理した場合としない場合の、ＧＳＳＧ
で処理したウシ脳下垂体ｂＦＧＦ、のヘパリン−ＴＳＫ
ＨＰＬＣ分析の結果を比較したものである。

【図４Ｂ】図４は、銅イオン（Ｃｕ⁺²）で前処理した場
合としない場合の、ＧＳＳＧで処理し、または、処理し
ない、リコンビナント体ｂＦＧＦ、および、銅イオン
（Ｃｕ⁺²）で前処理した場合としない場合の、ＧＳＳＧ
で処理したウシ脳下垂体ｂＦＧＦ、のヘパリン−ＴＳＫ
ＨＰＬＣ分析の結果を比較したものである。

【図５Ａ】図５は、ｂＦＧＦを、ＧＳＳＧで処理した場
合、及び、処理しない場合の、ヘパリン−ＴＳＫＨＰ
ＬＣ分析の結果を、五日間にわたり、比較したものであ
る。

【図５Ｂ】図５は、ｂＦＧＦを、ＧＳＳＧで処理した場
合、及び、処理しない場合の、ヘパリン−ＴＳＫＨＰ
ＬＣ分析の結果を、五日間にわたり、比較したものであ
る。

【図６】図６は、システインで処理したリコンビナント
体ｂＦＧＦ、及び、天然のウシ脳下垂体ｂＦＧＦ、の逆
相ＨＰＬＣ分析の結果を比較したものである。

【図７】図７は、ＧＳＳＧでの前処理をした場合及びし
ない場合の、リコンビナント体ｂＦＧＦ類似体の、逆相
ＨＰＬＣ分析の結果を示したものである。

【図８】図８及び図９は、それぞれウシおよびヒトの、
塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡ配列およびそれらから
推定されるアミノ酸配列である。

【図９】図８及び図９は、それぞれウシおよびヒトの、
塩基性ＦＧＦをコードするＤＮＡ配列およびそれらから
推定されるアミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スチュワートエー．トンプソンアメリカ合衆国カリフォルニア 94040 マウンテンビュー，ナンバー 1005，ライトアベニュー 928 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA03 DA06 HA01 HA17 4C084 AA07 BA01 BA05 CA59 DB54 NA03 ZC412 4H045 AA10 AA20 BA10 CA40 DA01 EA20 FA52

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程より成る、塩基性線維芽細胞
増殖因子蛋白を安定化する方法：塩基性線維芽細胞増殖
因子（ｂＦＧＦ）のアミノ酸配列を有する影響を受けや
すいペプチドを、該影響を受けやすいペプチドに含まれ
ている少なくとも一つ以上のシステインとＳ−Ｓ共有結
合を形成できる、該ｂＦＧＦの多量体化を防止するのに
有効な量の保護試薬を用いて、ｐＨ６あるいはそれ以上
であって前記ｂＦＧＦが変質しないｐＨの緩衝液の存在
下で、該安定化操作が効果を発揮するのに十分な時間、
処理する工程。