FI118083B - Uusi menetelmä biologisesti aktiivisen dimeerisen proteiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

τ' / ..¾ 118083 ί

UUSI MENETELMÄ BIOLOGISESTI AKTIIVISEN DIMEERISEN PROTEIININ VALMISTAMISEKSI

Keksintö koskee laskostusmenetelmää biologisesti aktiivi-5 sen, dimeerisen TGF-βίη (transformoivan kasvutekijän tyyppi β:η) kaltaisen proteiinin valmistamiseksi.

TGF-β:n kaltaisilla proteiineilla, so. TGF^-superperheen proteiineilla, on keskeinen merkitys monissa biologisissa 10 säätelyreaktioissa, kuten esimerkiksi alkionkehityksessä tai kudoksen regeneraatiossa. Ne ovat hyvin tehokkaita biologisia agensseja, joita voidaan käyttää myös terapeut tisesti moniin eri tarkoituksiin. TGF-β-superperheen par-hai ten tunnettuja jäseniä ovat TGF-β :t itse.

15 TGF-β puhdistettiin homogeeniseksi alun perin ihmisen verihiutaleista, ihmisen istukasta ja naudan munuaisista, ja se identifioitiin homodimeerisenä proteiinina, jonka molekyylipaino on noin noin 25 000 Da. Ensin se karakte-20 risoitiin sen kyvyn perusteella vaikuttaa synergisesti / EGF:n tai TGF-a:n kanssa indusoiden ei-transformoitujen NRK-solujen kiinnityskohdasta (anchorage) riippumatonta kasvua, ja äskettäin TGF-β:11a on osoitettu olevan useita säätelyvaikutuksia moniin erilaisiin sekä normaaleihin V * 25 että neoplastisiin soluihin, mikä osoittaa tämän proteii- " * · i,*·· nin merkityksen monitoimintaisena soluaktiivisuuden sää- .¾ :]* ί telijänä. Solun tai kudoksen tyypistä sekä muiden kasvu- t tekijöiden läsnäolosta tai puutteesta riippuen TGF-β voi ·*· :*.t# joko stimuloida mitogeneesiä, solujen lisääntymistä ja -¾ .·;·. 30 kasvua tai tehokkaasti inhiboida mainittuja prosesseja, tai sillä voi olla muita toimintoja, kuten esimerkiksi .. adipogeneesin, myogeneesin, kondrogeneesin, osteogeneesin • · · *... ja immuunisolutoiminnan säätely, kemotaksian stimulointi • · · tai erilaistumisen induktio tai inhibitio. Monet TGF-βίη *:·*: 35 vaikutukset koskevat solujen tai kudosten vastetta stres- :***: sille tai vauriolle sekä näistä aiheutuvan vahingon pa- rantumista. Tulehduksen jälkeen TGF-β:11a on tärkeä mer- * · kitys granulaatiokudoksen muodostumisessa, se lisää nii- • ♦ · * * • · 118083 f 2 Ί den geenien ilmentymistä, jotka liittyvät soluväliaineen, kuten fibronektiinin, kollageenin ja useiden proteaasi-inhibiittoreiden, muodostumiseen ja stimuloi fibroblas-tien aikaansaamaa kollageenimatriksin supistumista, mikä 5 viittaa sillä olevan mahdollisesti merkitystä sidekudoksen supistumisessa.

Tähän mennessä on kuvattu viisi erillistä, mutta toiminnallisesti ja rakenteellisesti läheisesti yhteen kuuluvaa 10 TGF-p:aa, jotka on nimetty TGF-pl:ksi, TGF-p2:ksi, TGF- p3:ksi, TGF-p4:ksi ja TGF-p5:ksi. Kaikki TGF-p:t syntetisoidaan 390-412 aminohapon esiasteina, joista proteolyyt-tisen pilkonnan jälkeen muodostuvat kypsät muodot, jotka koostuvat 112 C-terminaalisesta aminohaposta. TGF-p:t 1-5 15 ovat niiden kypsissä, biologisesti aktiivisissa muodoissaan happo- ja lämpöstabiileita kahden sellaisen polypep- > tidiketjun disulfidilla sitoutuneita homodimeerejä, joista molemmissa on 112 aminohappoa. Ihmisen (Derynck, R. et ai., (1985) Nature 316: 701-705), muriinin (Derynck, R.

20 et ai., (1986) J. Biol. Chem. 261: 4377-4379) ja apinan TGF-pi:n (Sharpies, K. et ai., (1987) DNA 6: 239-244) täydellisissä aminohapposekvensseissä on huomattava sek-venssisäilyvyys niin, että ne eroavat vain yhden amino- .*·,· happotähteen osalta. Ihmisen TGF-pl:n, ihmisen TGF-p2:n • · .·. : 25 (deMartin, R. et ai., (1987) EMBO J. 6: 3673-3677; Marqu- .**·. ardt H. et ai., (1987) J. Biol. Chem. 262: 12127-12131) • · ja ihmisen TGF-p3:n (Ten Dijke, P. et ai., (1988) PNAS ···, 85: 4715-4719) aminohapposekvenssien vertailu on osoitta- S · · nut, että näillä kolmella proteiinilla on kypsissä muo- .. 30 doissaan noin 70-80 %:n sekvenssi-identtisyys. Sian veri- • · : ** hiutaleista on eristetty heterodimeerinen TGF-pi.2, jonka * * V* koostumuksessa yksi TGF-pi:n alayksikkö on liittynyt di- ·:**· sulfidisidoksella yhteen TGF-p2:n alayksikköön (Cheifetz, S. et ai., (1987) Cell 48: 409-415).

*·· .:. 35 · Äskettäin on yritetty valmistaa TGF-p:ja pikemminkin yh- • · * ' • · · • t Λ 118083 ! 3 :5 distelmä-DNA-tekniikoilla kuin eristämällä näitä tekijöitä luontaisista lähteistä (esim. verihiutaleista), jotta niitä saataisiin riittäviä määriä testaukseen erilaisissa terapeuttisissa modaliteeteissa (hoitotavoissa). Biologi-5 sesti aktiivisen yhdistelmä-TGF-p:n saaminen on kuitenkin osoittautunut erittäin vaikeaksi. Kuten sekvenssilistassa SEKV. ID NO:issa 1-6 esitetyistä sekvensseistä voidaan ha ; väitä, 112 aminohapon pituiset TGF-pi:n, TGF-p2:n ja TGF-β3:η kypsät muodot sisältävät 9 kysteiinitähdettä. Kuten 10 TGF-82:n kohdalla on osoitettu, 9 kysteiinitähdettä muodostavat 4 ketjunsisäistä ja 1 ketjujen välisen disulfidi sidoksen [Schlunegger, M.P. ja Gruetter, M.G., Nature 358: 430-434 (1992)]. TGF-βιη heterologinen ilmentäminen saattaa johtaa tuotteeseen, joka ei virheettömästä pri-15 maarirakenteesta huolimatta laskostu kunnolla oikeiden, ,ζ monimutkaisten sekundaari- tai tertiäärirakenteiden muodostumiseksi ja jolta siten puuttuu biologinen aktiivisuus.

20 Kun otetaan huomioon natiivien TGF-p-molekyylien monimutkaisuus, vastaavien TGF-p-geenien ilmentämistä on tavaili sesti pidetty tarkoituksenmukaisena korkeammilta organis-·,·. meiltä peräisin olevissa soluissa. Vaikka yhdistelmä-TGF- . β-molekyylien ilmentäminen voidaan toteuttaa eukaryootti- • * · · * * * 25 sissa järjestelmissä, biologisesti aktiivisen, virheettö- • * · *· * mästi laskostuneen materiaalin saannot ovat silti kaikkea * · * * *···* muuta kuin tyydyttäviä.

• · ’>. * V : Sen vuoksi biologisesti aktiivista TGF-p:aa yritettiin 30 tuottaa mikrobi-isännässä. Solunsisäiset olosuhteet eivät kuitenkaan esim. bakteereissa edistä oikeaa laskostumis- * ;*J*; ta, disulfidisidoksen muodostumista eivätkä disulfidin * . stabiloimaa dimerisaatiota, joka on ilmeisesti olennaisen tärkeää aktiivisuudelle. Niinpä biologisesti aktiivista • · ...* 35 TGF-p:aa voitiin saada vain vähän sen jälkeen, kun vas- :***: taavaa geeniä oli ilmennetty E. collssa lambdapromootto- ;*·.· rin säätelemänä, kuten EP-patenttihakemuksessa EP-A-0 268 • · 118083 4 : 4 ! f 561 on kuvattu. Toinen selostus kuvaa TGF-βιη cDNA:n ilmentämistä E. colissa trp-promoottorin säätelemänä, jolloin SDS-polyakryyliamidigeelin autoradiogrammissa saatiin radioaktiivisesti leimattu proteiinivyöhyke, jonka 5 näennäinen molekyylipaino oli 13 000 Da, mutta mitään ^ aktiivisuutta ei mitattu (Urushizaki, Y. et ai. (1987)

Tumor Res. 22: 41-55).

Kun yhdistelmäproteiineja tuotetaan korkeina tasoina bak-10 teerien (esim. E. colin) ilmentämisjärjestelmissä, ne esiintyvät usein erittäin liukenemattomina solunsisäisinä saostumina, joita kutsutaan inkluusiokappaleiksi tai ref-raktiilikappaleiksi (refractile bodies), jotka voidaan tunnistaa faasikontrastimikroskoopilla solujen rajojen si 15 säilä näkyvinä kirkkaina täplinä. Nämä inkluusiokappa- leet, jotka voidaan helposti erotella liukoisista baktee-riproteiineista, sisältävät yhdistelmäproteiinia suurimmaksi osaksi denaturoidussa ja pelkistetyssä muodossa, jolla ei ole luontaisen vastineensa toiminnallista aktii-20 visuutta ja joka on siksi kaupallisena tuotteena käyttökelvoton. Sen vuoksi ollaan yleisesti yhtä mieltä siitä, että refraktiilinen yhdistelmäproteiini on liuotettava *.*. olosuhteissa, jotka soveltuvat pitämään sen denaturoidus- » ·. : sa muodossaan, ja sen jälkeen se on laskostettava niin, ? • ·* '. *. 25 että se muuttuu denaturoidusta laskostamattomasta muodos- • » · • · ta oikeaan, toiminnallisesti aktiiviseen kolmiulotteiseen • * ***· rakenteeseen, jota konformaatiota stabiloivat verrattain t **· * heikot atomienväliset voimat, kuten vetysidokset, hydro- * · · * ·.* * fobiset vuorovaikutukset ja varausvuorovaikutukset. Kys- 30 teiiniä sisältävien proteiinien kohdalla tähän prosessiin * · { *·· saattaa kuulua disulfidisidosten muodostuminen. Kun di- sulfidisidosten muodostumista edistetään kemiallisesti, 'ti· virheellisten molekyylinsisäisten, ja dimeeristen tai • · ... multimeeristen proteiinien kohdalla molekyylienvälisten, i : ·** 35 siltojen muodostuminen tulisi estää tai ainakin minimoi- da, koska ei-toivottujen, virheellisesti laskostuneiden ·*·.· isomeerien muodostuminen saattaa johtaa epähomogeeniseen • · ·'·*

118083 I

5 ” materiaaliin, mikä näin ollen tekee halutunrakenteisen proteiinin lisäpuhdistuksen monimutkaiseksi, tai voidaan saada sellainen proteiini, jonka aktiivisuus on vähentynyt.

5 '

Proteiinit laskostetaan tavallisesti monivaiheisessa prosessissa, jossa proteiini liuotetaan voimakkaasti denaturoivissa olosuhteissa, minkä jälkeen kaotroopin konsent-raatiota alennetaan proteiinin laskostumisen mahdollista-10 miseksi. Tällainen lähestymistapa kuitenkin epäonnistui TGF-p:n laskostamisessa. EP-patenttihakemuksessa EP-A-0 433 225 kuvataan kuitenkin onnistunut menetelmä biologi- Ä sesti aktiivisen dimeerisen TGF-p:n kaltaisen proteiinin valmistamiseksi, jossa menetelmässä käytetään laimeaa 15 detergenttiä, joka mahdollistaa TGF-p-proteiinin laskostumisen, vaikka detergentti säilyy laskostuspuskurissa.

Tiedetään, että dimetyylisulfoksidia (DMSO) voidaan käyttää edistämään valikoivaa ja tehokasta disulfidisidosten 20 muodostumista peptideissä (Tam et ai., J. Am. Chem. Soc.

113: 6657-6662, 1991). Menetelmä on valikoiva, so. sivu- a reaktioita ei ole, ja siinä voidaan käyttää laajaa pH- *.1. aluetta. Virheetön disulfidisillan muodostuminen osoitet- ♦ · 1 • · : tiin kuitenkin vain noin 30 aminohapon kokoisiin pepti- • · · f 1 • · 25 deihin. Toisessa julkaisussa (Bentle et ai., US-patentti l 1 I./ 4,731,440) somatotropiinin liuottamiseen in- • · .1.** kluusiokappaleista käytettiin dimetyylisulfonia tai dime- » 1..

tyylisulfonin ja urean seosta. Sitten liuennut proteiini > 1 1 · ·1 ' voitiin renaturoida saattamalla proteiinin dimetyylisul- 30 fonia sisältävä liuos yhteyteen heikon hapettimen kanssa.

• ♦ • · * 1 1 : : ί Nyt havaittiin yllättäen, että menetelmää, jossa TGF-p:n kaltaisen proteiinin laskostamiseen käytetään laimeaa de- • · ...^ tergenttiä, voidaan parantaa lisäämällä dimetyylisulfok-

I

‘11 35 sidia (DMSO:ta), dimetyylisulfonia (DMS02:ta) tai dimetyy- ·...· liformamidia (DMFrää).

• · • · · · 1 1 8083 I1 6 .

Keksintö koskee parannettua menetelmää biologisesti aktii visen, dimeerisen TGF-p:n kaltaisen proteiinin tuottamiseksi sen denaturoidusta tai muusta ei-natiivista muodosta. Tämä tavoite saavutetaan sellaisen odottamattoman 5 havainnon perusteella, että merkittäviä määriä haluttua dimeeristä tuotetta voidaan saada odottamattomalla saannolla, kun mainitun proteiinin monomeeristä muotoa käsitellään laskostuspuskurilla, joka sisältää (a) laimeaa detergenttiä ja (b) DMSO:ta, DMF:ää tai DMS02:ta tai niis-10 tä kahden tai kolmen seosta.

Keksintö koskee parannettua menetelmää dimeerisen, biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän tyyppi β:η (TGF-p:n) kaltaisen proteiinin tuottamiseksi, jossa mene-15 telmässä TGF-βίη kaltaista proteiinia käsitellään laskos- , tuspuskurilla, joka sisältää (a) laimeaa detergenttiä, jo ka mahdollistaa TGF-β-superperheen proteiinin laskostumisen ja (b) orgaanista liuotinta, joka on DMS0:ta, DMF:ää tai DMS02: ta tai mitä tahansa kahden tai kolmen edellisen 20 seosta.

Termillä "TGF-p:n kaltainen proteiini" tarkoitetaan tämän V. keksinnön yhteydessä proteiinia, jolla on monomeerisessä * /. ; muodossaan sekvenssi, jolla on vähintään 75 %:n homologia 25 vähintään yhteen seuraavien TGF-p-superperheen jäsenten *..* (jotka myös sisältyvät termiin "TGF-p:n kaltainen proteii • · ’*/* ni") monomeerin aminohapposekvensseistä: Λ • * · : TGF-βΙ, TGF-p2 ja TGF-p3; kasvun inhibiittori, eristetty 30 apinan munuaissolujen BSC-1 vakioidusta (conditioned) • · • ’·· kasvualustasta (so. polyergiini; Holley, R.W. et ai.

(1980) PNAS 77: 5989-5992; Ristow, H.J.(1986) PNAS 83: 5531-5533); kanan alkion kondrosyyteistä peräisin oleva ...4 TGF-p4 (Jakowlew, S.B. et ai. (1988) Molecular Endoc- i t » *!’ 35 rinology 2: 1186-1195); Xenopus-Laevisista peräisin oleva • ·· TGF-p5 (Kondaiah, P. et ai. (1990) J. Biol. Chem. 265: Ϊ/*· 1089-1093); TGF-p:n kaltaiset inhibiinit ja aktiviinit 1 1 8083 j Ί ί (sukupuolirauhasproteiineja, jotka säätelevät aivolisäkkeen follikkelia stimuloivan hormonin eritystä); Miillerin inhibitiotekijä (MIS, joka inhiboi MUllerin tiehyiden kehitystä nlsäkäskoirassikiöillä); luun morfogeeniset 5 proteiinit (BMP, ryhmä polypeptidejä, jotka osallistuvat ruston ja luun muodostuksen induktioon; tämän ryhmän nykyisin tunnetut jäsenet ovat BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 ja BMP-9); Drosophilan dekapentaple-gisen (decapentaplegic) geenikompleksin transkripti (dpp, 10 joka säätelee morfogeneesiä kärpäsen alkiossa); Vg-1 (Xe-nopuksen transkriptin tuote, jota esiintyy oosyyttien vegetatiivisessa osassa) ja Vgr-1, Vg-1:n kaltainen nisä-käsgeeni (Mason A. et ai. (1986) Biochem. Biophys. Res.

Commun. 135: 957-964; Cate, R. et ai. (1986) Cell 45: 15 685-698; Wozney, J.M. et ai. (1988) Science 242: 1528- 1534; Padgett, R. et ai. (1986) Nature 325: 81-84; Weeks, D.L. ja Melton, D.A. (1987) Cell 51: 861-868; Lyons, K. et ai. (1989) PNAS 86: 4554-4558).

20 "TGF-p:n kaltaisiin proteiineihin" sisältyvät myös hetero dimeerit, jotka sisältävät eri TGF-p:n kaltaisten proteii nien alayksikköjä, tai edellä mainittujen proteiinien • » V : fragmentit tai mutantit, joissa on säilynyt yksi tai kaik • * V*j ki kantamolekyylin biologisista aktiivisuuksista.

:*· : 25 « t

Edullisesti "TGF-B:n kaltainen proteiini" on tämän keksin M· nön yhteydessä mikä tahansa TGF-p-superperheen proteiini, j*:*. Edullisemmin se on joku seuraavista TGF-p-superperheen proteiineista: nisäkkäästä, kuten esimerkiksi ihmisestä 30 tai eläimestä, esim. apinasta, muriinista, siasta, hevo- • «t sesta tai naudasta peräisin oleva TGF-pi, TGF-p2 ja TGF- • · * * β3, samoin kuin heterodimeeriset TGF-p:t, jotka koostuvat *:*·: kahdesta eri alayksiköstä, joista kummassakin on 112 ami- :1: nohappoa, sekä TGF-p:n fragmentit ja mutantit, mukaan * * · ,*..t 35 lukien hybridimolekyylit, joissa eri TGF-p:ojen osia on *·**. vaihdettu; kasvun inhibiittori, eristetty apinan munuais- • * · • · · * * 118083 f 8 ' . . ! solujen BSC-1 vakioidusta kasvualustasta (so. polyergii- " ni); kanan alkion kondrosyyteistä peräisin oleva TGF-p4; Xenopus-Laevisista peräisin oleva TGF-βδ, TGF-β:n kaltaiset inhibiinit ja aktiviinit (sukupuolirauhasproteiineja, 5 jotka säätelevät aivolisäkkeen follikkelia stimuloivan hormonin eritystä); Mullerin inhibitiotekijä (MIS, joka inhiboi Miillerin tiehyiden kehitystä nisäkäskoirassiki-öillä); luun morfogeeniset proteiinit (BMP, ryhmä poly-peptidejä, jotka osallistuvat ruston ja luun muodostuksen 10 induktioon; tämän ryhmän nykyisin tunnetut jäsenet ovat BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 ja BMP-9); Drosophilan dekapentaplegisen geenikompleksin tran-skripti (dpp, joka säätelee morfogeneesiä kärpäsen alkiossa); Vg-1 (Xenopuksen transkriptin tuote, jota esiin-15 tyy oosyyttien vegetatiivisessa osassa) ja Vgr-1, Vg-1:n kaltainen nisäkäsgeeni. "TGF-β:n kaltaisiin proteiineihin" sisältyvät myös heterodimeerit, jotka sisältävät eri TGF-p:n kaltaisten proteiinien alayksikköjä, tai edellä mainittujen proteiinien fragmentit tai mutantit, joissa - - 20 on säilynyt yksi tai kaikki kantamolekyylin biologisista ? aktiivisuuksista.

Vielä edullisempia TGF-p:n kaltaisia proteiineja ovat ,·. s TGF-βΙ, TGF-p2, TGF-p3, heterodimeeriset TGF-β:t, TGF-β-.η • · · · 25 fragmentit ja mutantit, mukaan lukien hybridimolekyylit, !..* joissa eri TGF-β:jen osia on vaihdettu, BMP:t, inhibiinit • · *"'* ja aktiviinit. Vielä edullisempia ovat BMP-2, TGF-βΙ, •>4*' TGF-p2, TGF-p3 ja heterodimeerit sekä niiden fragmentit *.* * ja mutantit, mukaan lukien hybridimolekyylit, joissa eri 30 TGF-β:ojen osia on vaihdettu, edullisesti TGF-pi-3, TGF- ! *·· β2-3 tai TGF-p3-2, jotka määritellään jäljempänä, tai TGF-pi-2, joka koostuu N-terminaalista C-terminaaliin *.· kulkevassa järjestyksessä ihmisen TGF-pl:n 44 N-terminaa- * a ...# lisesta aminohaposta ja TGF-p2:n 68 C-terminaalisesta 1 35 aminohaposta. Vielä edullisempia TGF-β:n kaltaisia prote- ··· iineja ovat ne, joissa on sekvenssilistassa SEKV. ID NO:- » · ϊ/·· issa 1, 3, 5, 7, 9, 11 tai 13 kuvatut aminohapposekvens- 118083 9 λ ' -¾ sit. Kaikkein edullisin TGF-p:n kaltainen proteiini on | TGF-p3. Termiin BMP-2 kuuluvat myös BMP-2:n variantit, joilla on sama biologinen aktiivisuus. Sellaisia variantteja ovat esimerkiksi esimerkeissä valmistetut, so. SEKV.

5 ID NO:13:n mukainen BMP-2, jossa on ylimääräinen N-termi-naalinen metioniini, ja SEKV. ID NO:13:n mukainen BMP-2, josta puuttuu N-terminaalinen aminohappo Gin.

TGF-βίη biologinen aktiivisuus tähän tarkoitukseen määri-10 tellään joko - TGF-p:n solun migraatiota edistävänä aktiivisuutena fibroblasteja kohtaan (Postlethwaite, A.E. et ai. (1987) J. Exp. Med. 165: 251, modifioitu R. Burkin (1973) PNAS 70: 369, mukaan), 15 - TGF-p:n inhibitiovaikutuksena ihmisen A 375 -melanoo- masolujen kasvuun (Brown, T.J. et ai. (1987) J. Immunol.

139: 2977), - CCL-64-solun DNA-synteesimäärityksen inhibitiona (Gray-car, J.L. et ai. (1988) Molecular Endocrinology 3: 1977- 20 1986) tai - minkin jatkuvan keuhkoepiteelisolulinjan Mv-l-Lu ,*·’· (ATCC/CCL64) kasvun inhibitiona, kuten jäljempänä esimer- .*.1 keissä kuvataan.

• ·· Λ: 25 • ·

Mistä tahansa lähteestä tai millä tahansa menetelmällä ♦ · ’ **’ saatu monomeerinen, TGF-p:n kaltainen proteiini voidaan i ·..

*... laskostaa vastaavaksi keksinnön mukaiseksi dimeeriseksi, | t · ·* * biologisesti aktiiviseksi TGF-p:n kaltaiseksi proteiinik- 30 si. Esimerkiksi TGF-p:n kaltaisen proteiinin monomeerinen ·« i *·· muoto voi olla peräisin luontaisesta lähteestä tai se voi , ί,ί· daan tuottaa yhdistelmä-DNA-tekniikalla tai synteettises- ti alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä. Tapauksessa, • * ··· jossa monomeeri ei sovellu in vitro-laskostamiseen konta- "I* 35 minanttien vuoksi, liuotettu ja denaturoitu monomeeri • ·· voidaan puhdistaa kromatografiällä, esim. kokoeks- • kluusiokromatografiällä esim. Sephacryl S-100 HR:llä.

10 118083

Ennen laskostusta monomeerisen TGF-β:n kaltaisen proteiinin on oltava denaturoidussa (so. ei-laskostuneessa) liuo , tetussa muodossa. Alalla hyvin tunnetut niin kutsutut kao trooppiset aineet kykenevät denaturoimaan ja liuottamaan 5 proteiineja tehokkaasti, ne muuttavat vesiliuoksessa ja sopivina konsentraatioina kyseisen proteiinin avaruusrakenteen sen pinnan muutoksilla, joko muuttamalla hydrataa tiötilaa, liuotinympäristöä tai liuotin-pintavuorovaiku-tusta. Tällaisia kaotrooppisia aineita tai denaturointiai 10 neita ovat esimerkiksi urea, guanidiinihydrokloridi, nat-riumtiosyanaatti noin 4 ja noin 9 M:n välisellä konsent-raatioalueella sekä detergentit, kuten SDS, joita käytetään 0,01-2 %:n luokkaa olevina konsentraatioina. Myös TGF-p:n kaltaista proteiinia sisältävän vesiliuoksen hap- Ä: 15 pamuuden lisääminen pH-arvoon noin 2-4, esim. pienraolekyy lipainoisella alifaattisella orgaanisella hapolla, jossa on edullisesti 2, 3 tai 4 C-atomia, edullisemmin etikkaha polla, samoin kuin emäksiset olosuhteet, esim. pH 10 ja sen ylittävät arvot, ja korkeat lämpötilat johtavat mono-20 meerin denaturoitumiseen ja liukenemiseen.

Sitten monomeeri altistetaan "laskostusolosuhteille", jot ·.·, ka mahdollistavat biologisesti aktiivisen dimeerin tai- • · · ! . teenoton. Termillä "laskostusolosuhteet" tarkoitetaan olo

• * J

• «f * * 25 suhteita, joissa edistetään ketjunsisäisten ja ketjunvä- • · * *· · listen disulfidisidosten muodostumista ja denaturoitu mo- «i* v · *···* nomeeri voi omaksua sen biologiseen aktiivisuuteen liitty i vän konformaation. Tässä prosessissa ei muuteta lainkaan f' • e·.·'' ' monomeerin primaarirakennetta (so. aminohapposekvenssiä), 30 vaan siinä muodostetaan dimeeriselle tuotteelle sellainen kolmiulotteinen rakenne, joka liittyy biologiseen aktiivi .*·*: suuteen. Tähän prosessiin kuuluu disulfidisidosten muodos « • , tuminen ja monomeerien yhdistyminen dimeeriseksi, biologi sesti aktiiviseksi rakenteeksi.

··· *../ 35 ·*”: Tätä tarkoitusta varten denaturoitua monomeeriä käsitel- ··* .*.tj lään laskostuspuskurilla, joka sisältää (a) laimeaa deter * · η 1 1 8083 . :i Λ genttiä, joka määritellään jäljempänä, ja (b) orgaanista liuotinta, joka on DMSO:ta, DMF:ää tai DMS02:ta tai mitä tahansa kahden tai kolmen edellisen seosta, neutraalissa tai emäksisessä pH:ssa sekä kohtuullisessa lämpötilassa, 5 esim. noin O °C:n ja noin 40 eC:n välillä. Edullinen pH on noin 7 ja noin 10 välillä, edullisemmin DMSO:n tapauksessa pH-arvo on noin 9-9,5, DMF:n tapauksessa noin 8,5 j a DMS02: n tapauksessa pH-arvo on noin 9,5.

10 Tavanomaiset puskurijärjestelmät, joita voidaan käyttää keksinnön mukaiseen laskostukseen, ovat puskureita, joil- S· la saadaan riittävä puskurikapasiteetti pH-välillä 6-10.

Kaikki ne puskurit, joilla ei ole inhibitiovaikutusta pro * teiinien laskostumiseen, ovat tässä keksinnössä käyttökel 15 poisia. Sopivia puskureita ovat esimerkiksi Tris-, bis-Tris- tai piperatsiinipuskurit. Puskurit voivat sisältää lisäksi haluttaessa suolaa sekä haluttaessa emäksistä ami nohappoa.

20 Suoloja, joita voidaan käyttää laskostuspuskurissa, ovat esimerkiksi Na+:n, Li+:n, K+:n, NH4+:n, Mg2+:n, Ca2+:n tai

Mn2+:n suolat Cl':n, F":n, Br":n, J":n, HC03":n, S042":n, fos- /*· faatin, asetaatin, syanaatin tai rodanidin kanssa tai • .*. J muut alkalimetalli- tai maa-alkalimetalli- halogeeni- tai 5 * * · · ·.

: 25 -pseudohalogeeniyhdisteet 3 M konsentraatioon saakka.

* I.** Edullinen on NaCl 1-2 M:n konsentraationa.

i » • · I ·..

Emäksinen aminohappo, jota voidaan käyttää laskostuspusku | * · ** rissa, on esimerkiksi arginiini, edullisesti 0,5 M:n kon- % 30 sentraationa.

·· Ϊ **» * * ·· ! Keksinnön tarkoituksiin edullinen DMS0:n, DMS02:n tai i DMF:n konsentraatio on noin 5 %:sta noin 40 %:iin, edulli semmin noin 10 %:sta noin 30 %:iin. Vielä edullisempi S » 35 DMS0:n konsentraatio on noin 10 %:sta noin 30 %:iin, vie- * ·· lä edullisemmin noin 20 %; DMFrlle edullisempi konsent- • · ·.’·· raatio on noin 10 %:sta noin 30 %:iin, vielä edullisemmin 12 1 1 8083 noin 10 %; DMS02:lle vielä edullisempi konsentraatio on noin 10 %. DMSO:n ja DMF:n tai DMSO:n ja DMS02:n tai DMF:n ja DMS02:n seoksia voidaan käyttää noin 5 %:n ja noin 40 %:n välisenä konsentraationa, edullisesti noin 10 %:sta 5 noin 30 %:iin, edullisemmin noin 10 %:sta noin 20 %:iin, liuottimien seoksesta laskettuna.

Keksinnön mukaisen TGF-β-superperheen proteiinin laskos-tukseen sopiva laimea detergentti on mikä tahansa deter-10 gentti, joka mahdollistaa monomeerisen, TGF-βιη kaltaisen proteiinin laskostuminen avaruusrakenteeksi, joka dimeri-saation jälkeen liittyy biologiseen aktiivisuuteen, joka detergentti pitää mainitun monoraeerin samalla liukoisessa muodossa.

15

Sellaiset detergentit voivat olla ionittomia, kationisia, anionisia tai amfoteerisiä. Edullinen detergentti on ioni ton detergentti digitoniini, ja edullisempia ovat amfo-teeriset detergentit 3-(3-klolamidopropyyli)dimetyyliam-20 monio-l-propaanisulfonaatti (CHAPS) ja 3-(3-klolamidopro-pyyli)dimetyyliammonio-2-hydroksi-l-propaanisulfonaatti (CHAPSO). On mahdollista käyttää myös detergenttien seos-.'·*· ta, esim. CHAPSin ja CHAPSOn seosta. Laimea detergentti Ϊ on laskostuspuskurissa edullisesti konsentraationa noin : 25 1-100 mM:n, edullisemmin konsentraationa 30-60 mM ja vie-

* J

I.· lä edullisemmin konsentraationa 30 mM.

* f·· *

Keksinnön edullisessa suoritustavassa laskostuspuskuri si ·* * sältää lisäksi pelkistintä. Sopiva pelkistin, joka suosii 30 disulfidien muodostumista proteiineissa tai peptideissä, ; **· on esim. pienmolekyylipainoinen sulfhydryylireagenssi, jo * · * Y 5 ka on gliitationi pelkistetyssä muodossaan, ditiotreitoli pelkistetyssä muodossaan, β-merkaptoetanoli pelkistetyssä » · ... muodossaan, merkaptometanoli pelkistetyssä muodossaan, I s 35 kysteiini tai kysteamiini. Menetelmä toimii kuitenkin • ·Ρ ·,,,' ilman tällaisen aineen läsnäoloa. Sopiva konsentraatio * * ir*.-’ sulfhydryylireagenssille on esim. noin 1-100 mM, edulli- ,3 1 1 8083 sesti noin 1-10 mM, edullisemmin noin 2,5 mM.

Laskostus suoritetaan kohtuullisissa lämpötiloissa, esimerkiksi noin 0 °C:n ja noin 40 “C:n välillä, edullisesti 5 noin 4 eC:ssa, ja kohtuullisessa ajassa, esimerkiksi noin 2 tunnin ja 720 tunnin välillä. Koska laskostuksen kesto riippuu käytetystä lämpötilasta, lämpötila voidaan optimoida mitä tahansa haluttua laskostusaikaa varten ja päinvastoin.

10

Keksinnön mukaisen dimeerisen, biologisesti aktiivisen TGF-p:n kaltaisen proteiinin valmistus voidaan suorittaa Λ yksivaiheisella menetelmällä, jossa mainitun proteiinin monomeeri siirretään laskostuspuskuriin ja reaktioseosta 15 inkuboidaan esim. noin 2 tunnista 7:ään tai useampaan vuorokauteen esimerkiksi noin 0 °C:n ja noin 40 °C:n välisessä lämpötilassa, edullisesti 4 °C:ssa, samalla kun kaiken aikaa tapahtuu laskostusta ja dimerisaatiota. Las-kostusreaktion aikaisella proteiinikonsentraatiolla on 20 suuri merkitys, koska jos se on liian korkea, monomeerit saattavat aggregoitua huomattavassa määrin, mikä johtaa ei-toivottujen korkeampiasteisten oligomeerien muodostu-#V· miseen. Dimeerisen tuotteen loppusaannot kohoavat, jos ; proteiinikonsentraatio on alle noin 2 mg/ml, edullinen t*t ; 25 konsentraatioalue on 0,01-0,5 mg/ml.

• · • * * *

Seuraavassa esitetään edullisia esimerkkejä keksinnön • ]' mukaisista laskostuskokeista TGF-p3:n laskostamiseen: · • · * 5' 30 0,1 mg/ml TGF-p3:a, ; ’·· 100 mM Tris, M* t t ' ' s : : mahdollisesti 1-50 mM ainetta, joka on pelkistetty gluta- *e; tioni, kysteiini, kysteamiini tai β-merkaptoetanoli (me- • · ... ne-telmä toimii kuitenkin myös ilman sulfhydryyli-redox- s : **’ 35 järjestelmän läsnäoloa, kuten edellä mainittiin), :'*’ϊ * 1 M NaCl, j'*.i 0,5 M arginiinia, • ·

118083 I

'· -¾ •-Ä 14 i ; , .Λ 20-30 % DMSOrta, 30 mM CHAPSia tai CHAPSOa, pH 9-9,5; 5 tai 0,1 mg/ml TGF-p3:a, 100 mM Tris, 2,5 mM ainetta, joka on pelkistetty glutationi, kysteii-10 ni, kysteamiini tai β-merkaptoetanoli (menetelmä toimii kuitenkin myös ilman sulfhydryyli-redox-järjestelmän läsnäoloa, kuten jo edellä mainittiin), f • 1 M NaCl, 0,5 M arginiinia, .

15 10 % DMFrää, 30 mM CHAPSia tai CHAPSOa, : % pH 8,5. .'·

Laskostuksen jälkeen biologisesti aktiivinen dimeeri puh-20 distetaan, jotta siitä saadaan poistettua epätäydellisestä laskostunut TGF-p:n kaltainen proteiini ja epäpuhtaudet, erityisesti pyrogeenit tai muut endotoksiinit, 8 joita saattaisi olla valmisteessa läsnä yhdistelmäprote- 4 * · ·/· : iinin mikrobi-isäntäsoluissa tapahtuneen tuotannon jäl- 25 keen. Dimeerin erottelu tehdään kromatografiällä, kuten • · £ ;*· · esimerkiksi koon mukaan lajittelevalla (sizing) geelikro- • * .***. matografialla, hydrofobisten vuorovaikutusten kromatogra- j ;·. f iällä tai ioninvaihtokromatograf iällä, esim. Mono S ' - * ♦ * -pylväällä, ja käänteisfaasi-HPLCrllä.

30

Edelleen keksintö koskee dimeerisiä, biologisesti aktii- • · :>4** visia TGF-p:n kaltaisia proteiineja, kun ne on tuotettu • · · *·* ' keksinnön mukaisella menetelmällä. Näitä TGF-β:n kaltai- ;*·; siä proteiineja voidaan käyttää monenlaisissa terapeutti- - 35 sissa modaliteeteissa.

» f ··* * • · · • * ...

*···* Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä, eikä niitä ole • * · * · · * * is 1 1 8083 tarkoitettu rajoittaviksi.

Esimerkki It TGF-Bl:n. TGF-B2:n la TGF-B3:n ilmentäminen 5 E. colissa

Esimerkki IA: Yleiset menetelmät Bakteerikanta: - E. coli K12/LC 137: htpR,,,, lonR9, lac^, mal.,,, trp,,,, 10 pho^ rspL, tsx::Tnl0, supCtB (Goff, S.A. et ai. (1984) PNAS 81: 6647-6651).

Plasmldit: - pPLMu (Buell, G. et ai. (1985) Nucleic Acids Res. 13: 15 1923-1938): Tässä plasmidissa on bakteriofagin I PL-pro- moottori faagin Mu ner-geenin ribosominsitoutumiskohdan kanssa (Van Leerdam, E. et ai. (1982) Virology 123: 19-28).

- pcl857: plasmidi, joka koodaa termolabiilia XclB57-repres- 20 soria ja antaa resistenssin kanamysiinille (Remault, E.

et ai. (1983) Gene 22: 103-113).

-.*. SDS-qeelielektrof o reesi: • · · l . SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) ja pro * ·· * ’ 25 teiinivärjäys tehdään, kuten aikaisemmin on kuvattu • * · *;_#* (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227: 680-685), käyttämällä • · *···* BIORADin Miniprotean II -kennoa (cell) ja 1 mm:n paksui- ♦ * ·..··* : *·* siä 18%: isiä polyakryyliamidigeelejä.

• · · · ,'r> • · · m * » 30 Lämpö induktio: ·**.. 7 ml:aan LB-kasvualustaa (Maniatis et ai. (1982), Molecu- lar Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 20 * . ml:n viljelyputkessa, joka sisältää 40 pg sekä ampisillii • · 4 · · nia että kanamysiiniä (LB/amp/kan), siirrostetaan yksi pe • · *”·* 35 säke ja inkuboidaan ravistelemalla yli yön 30 °C:ssa. Vii :***: si millilitraa tätä yli yön viljelmää lisätään 15 ml:aan • · * • · • · * * * Φ * · 16 " 118083 LB/amp/kan-kasvualustaa 100 ml:n erlenmeyerpullossa. Tämä pullo siirretään 42 °C:n vesihauderavistelijaan. Ennen siirtoa (ei-indusoivat olosuhteet) otetaan 2 ml:n näyte ja 1 tunnin väliajoin siirron jälkeen 1 ml:n näytteet 5 (indusoivat olosuhteet). Solut pelletoidaan sentrifugoi- 4 maila (5 min, 10 000 rpm Eppendorf-sentrifugissa) ja su-pernatantti heitetään pois. Pelletti resuspendoidaan 100 μΐ:aan näytepuskuria SDS-PAGEa varten ja kuumennetaan 10 minuutin ajan 95 °C:ssa. SDS-PAGElle pannaan 5 μ1:η erät.

10

Kompetenttien solujen valmistus:

Kompetentit E. coli -solut valmistetaan kalsiumkloridime-netelmällä, kuten on kuvattu teoksessa Maniatis et ai. *r (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 15 New York. Plasmidin pcle57 sisältäviä soluja kasvatetaan 30 °C:ssa.

Esimerkki IB; Ilmentämisvektorien pPLMu.hTGF-81, pPLMu.-hTGF-B2 ia pPLMu.hTGF-B3 konstruointi 1a TGF-Bl:n. TGF- l 20 82:n ia TGF-B3:n ilmentäminen TGF-βΙίη, TGF-p2:n ja TGF-83:n koodaavat sekvenssit (esitetään sekvenssilistassa) kloonataan kukin erikseen plas-* · .

*·' ’ midiin PGem-5ZF( + ) (Promega), joka on pilkottu NcoI:llä, • · » *·.**: 25 defosforyloitu vasikan suolen alkalisella fosfataasilla • · V · (Boehringer) ja täydennetty Klenowin polymeraasilla (Gib- co-BRL). Tuloksena saatuja konstrukteja nimitetään pGKM 125:ksi (TGF-βΙ), pGKM 740:ksi (TGF-82) ja pGKM I26:ksi f (TGF-83) ja niitä käytetään transformoimaan kompetentit 30 E. coli Y 1090 -solut. Klooneja, jotka sisältävät oikeat ;·. TGF-pl:tä, TGF-p2:ta ja TGF~83:ea koodaavat insertit, nimitetään vastaavasti seuraavasti: E.coli Y1090/pGKM 125 • · * (TGF-βΙ), E.coli Y1090/pGKM 740 (TGF-82) ja E.coli Y1090-/pGKM 126 (TGF-83).

• * · 35 • · · • * * * * • * • * · • · · • * 3.7 118083 E.coli YOO/pGKM 125, E.coli Y1090/pGKM 740 ja E.coli Y1090/pGKM 126 -soluja kasvatetaan LB-kasvualustassa ja plasmidi-DNA valmistetaan H.C. Birnboimin ja H. Dolyn menetelmällä (1979) Nucleic Acids Research 7: 1513. Viisi 5 mikrogrammaa plasmidi-DNA:ta pilkotaan täydellisesti 50 pl:ssa restriktiopuskuria joko NcoI:llä ja Sällillä (PGKM125), Ncol:llä ja EcoRVillä (pGKM740) tai pelkästään Ncol:llä (pGKM126) seuraamalla toimittajan (Boehringer) suosituksia. DNA saostetaan lisäämällä 5 μΐ 3 M nat-10 riumasetaattia, 100 mM MgCl2:ia, 5 mM EDTArta ja 150 μΐ etanolia. Sen jälkeen, kun on inkuboitu -70 eC:ssa 15 minuutin ajan, DNA pelletoidaan sentrifugoimalla 13 000 g:llä 15 minuutin ajan SS34-roottorissa Sorvall-sentrifu- . * gissa. Supernatantti heitetään pois ja pelletti resuspen-15 doidaan 80 pl:aan 0,089 M TRlS-boraattia, 0,089 M boori-happoa ja 0,002 M EDTA:ta (TBE-puskuria), joka sisältää 0,25 % bromifenolisinistä ja 0,25 % ksyleenisyanolia.

Elektroforeesi ajetaan neljä kertaa 20 μ1:η näytteille l%:isen agaroosigeelin läpi TBE-puskurissa, joka sisältää 20 0,5 pg/ml etidiumbromidia, 50 voltilla, kunnes brom- fenolisininen markkeri saavuttaa 10 cm pitkän ja 0,8 cm paksun geelin alareunan. DNA-fragmentit, jotka koodaavat kypsää TGF-pi:tä, TGF^2:ta ja vastaavasti TGF-p3:a, vi- • · V * sualisoidaan lyhytaaltoisella UV-valolla, leikataan irti • · 25 partaterällä ja sähköeluoidaan geelin palasta Schleicher : & Schull Biotrap -laitteella käyttämällä 200 mamp 1,5 tunnin ajan. Eluoidut DNA-fragmentit saostetaan (katso • · * i*·,. edellä) ja resuspendoidaan 20 pliaan TE:tä.

» · 30 Viisi mikrolitraa plasmidia pPLMu linearisoidaan pilkkoja maila joko Ncol:llä ja Sällillä, Ncol:llä ja EcoRVillä *... tai pelkästään Ncol:llä ja geelipuhdistetaan, kuten edel- • · * lä on kuvattu fragmentti-DNA:ille. 100 ng:aa linearisoi- *i"l tua ja puhdistettua pPLMu-vektori-DNA:ta ja vastaavan :***: 35 puhdistetun fragmentti-DNA:n kolminkertaista molaarista • · · ,’.,t ekvivalenttia inkuboidaan 4 °C:ssa 15 tunnin ajan 20

μΐ :ssa ligaatiopuskuria (70 mM TRIS/HC1, pH 7,5, 10 mM

• > · » »t • · 118083 18

MgCl2:ia/ 5 mM DTT:tä, 0,1 mM adenosiini-trifosfaattia), joka sisältää 1 yksikön DNA-ligaasia (Boehringer).

Kymmenen mikrolitraa ligaatioseosta lisätään 200 pl:aan 5 kylmiä (4 °C) kompetentteja E. coll LC 137 -soluja, jotka sisältävät plasmidin pcl8S7. Kun 30 minuuttia on kulunut, soluille aiheutetaan lämpösokki inkuboimalla niitä 1,5 mi nuutin ajan 42 °C:n vesihauteessa. Lisätään 2 ml LB-kasvu alustaa ja viljelmää ravistellaan 60 minuutin ajan 30 10 °C:ssa. Kahdensadan mikrolitran erät maljataan LB-maljoil le, jotka sisältävät ampisilliinia ja kanamysiiniä, ja in kuboidaan 22 tunnin ajan 30 °C:ssa. Yksittäisiä pesäkkei- ' .

tä viljellään ja plasmidi-DNA analysoidaan. TGF-pl:tä, TGF-p2:ta ja TGF-p3:ea koodaavien DNA-fragmenttien subk-15 loonaamisella pPLMu:hun saadaan plasmidit pPLMu.hTGF-βΙ, pPLMu.hTGF-p2 ja vastaavasti pPLMu.hTGF-p3. Edellä mainitut konstruktit sisältäviä klooneja kutsutaan nimillä E.

COll LC 137/pPLMu.hTGF-pl, E. COli LC 137/pPLMu.hTGF-p2 ja vastaavasti E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3.

20 E. coll LC 137/pPLMu.hTGF-pl, E. COli LC 137/pPLMu.hTGF- β2 ja E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3 -soluja indusoidaan .lämmöllä (katso esimerkki IA) ja ilmentyneet proteiinit V! analysoidaan SDS-PAGElla. TGF-pl, TGF-p2 ja TGF-p3 ilmes- *· *· 25 tyvät kaikki 2 tunnin kuluttua lämpöinduktion jälkeen • · · *· · lämpöindusoituina proteiineina, jotka kulkevat noin 12 • · · 000 Da:n näennäisellä molekyylipainolla.

« · : Esimerkki 1C: Transformanttien fermentolnti 30 E.coll LC 137/pPLMu.h.TGF-pl:n, E.coli LC 137/pPLMu.-h.TGF-p2:n ja E.coli LC 137/pPLMu.h.TGF-p3:n yli yön vil- * . jelmiä 2 l:n erlenmeyerpulloissa, jotka sisältävät 750 ml • w · · * LB-kasvualustaa, jossa on 40 mg/1 ampisilliinia ja kana- • · *···' 35 mysiiniä, kasvatetaan 30 °C:ssa. Kolmesataa millilitraa ϊ.,.ϊ yli yön viljelmiä lisätään 750 ml:aan LB-kasvualustaa, • 9 9 9 9.

9*9' 9 9·.

118083 19 joka sisältää antibiootteja edellä mainitunmukaisesti, 2 ^ l:n erlenmeyerpulloissa ja kuumennetaan 42 ®C:seen ravistelemalla noin 3,5 minuutin ajan 65 eC:n vesihauteessa.

Sitten pullot siirretään 42 °C:n ravistimeen ja niitä 5 inkuboidaan 3 tunnin ajan. Pullot jäähdytetään 12 °C:seen jäävesihauteessa ja solut otetaan talteen sen jälkeen, kun on sentrifugoitu 10 minuutin ajan 8000 rpm:llä GSA-roottorissa (Sorvali).

10 Esimerkki 2: TGF-Bl;n. TGF-B2:n 1a TGF-B3:n ilmentäminen Saccharomuces cerevisiaessa

Kypsän TGF-βΙιη, TGF-p2:n ja TGF-p3:n koodaavat sekvenssit ilmennetään Saccharomyces cerevisiaessa hiivan happa-15 man fosfataasin (PH05) indusoituvan promoottorin säätelemänä.

Ilmentämisvektorit konstruoidaan kahdessa vaiheessa: A. plasmidin pJDB207/PH05-RIT 12 konstruointi; 20 B. plasmidien pJDB207R/PH05-TGF-pl, pJDB207R/PH05-TGF-p2 ja pJDB207R/PH05-TGF-p3 konstruointi, jolloin A)-kohdassa saadaan hiivavektori ja PH05-trans- * · ’·* * kription terminaattori ja B)-kohdassa saadaan ekspressio- **. *: 25 kasetit, joissa on kypsää TGF-βΙ:tä, TGF^2:ta ja vastaa- • · ·.' t vasti TGF^3:a koodaava insertti PHOSzn promoottorin sää- telemänä.

• · • «* e*·*: Esimerkki 2A: Plasmidin PJDB207/PH05-RIT 12 konstruointi 30 _ Plasmidi p31RIT 12 (EP-patenttihakemus EP 277.313) li- nearisoidaan restriktioendonukleaasilla Sali. Osittainen • · ·

HindiII-pilkonta etidiumbromidin läsnäollessa johtaa 1 * ***** kb:n Sall/Hindlll-fragmenttiin, joka sisältää 276 bp:n *«» 35 Sall/BamHl pBR322-sekvenssin, hiivan happaman fosfataasin .***. PH05 534 bp:n promoottorin, hiivan invertaasin signaali- ··· .·. : sekvenssin (koodaa 19 aminohappoa) sekä PHOSz n transkrip- • * * 118083 20 tion terminaattorin.

Plasmidin p31RIT 12 1 kb:n Sall/Hindlll-fragmentti kloonataan hiiva-E.coll-sukkulavektorlin pJDB207 (Beggs, J.D.

5 teoksessa Molecular Genetics in Yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, s. 383-389), joka on pilkottu Sällillä ja Hindlllilla. Tuloksena saatua plasmidia, joka sisältää 1 kb:n insertin, kutsutaan pJDB207/PH05-RIT 12:ksi. i, 10

Esimerkki 2B; Plasmidin PJDB207R/PH05-TGF-B3 konstruointi

Plasmidi pGKM740 (TGF-p3) (katso esimerkki l.G) pilkotaan

Ncolillä. Kohesiiviset päät (sticky ends) täytetään reak- 15 tiolla Klenowin DNA-polymeraasin kanssa. Lisätään EcoRI- linkkeriä (5'-CCGGAATTCCGG; Biolabs) ja seos liitetään yhteen. Tuloksena saatua rengasmaista plasmidia kutsutaan pGKMA668:ksi (TGF-B3) ja se pilkotaan EcoRIillä ja Sallii lä. Agaroosigeelistä eristetään 0,4 kbin EcoRI/Sall-frag- 20 mentti, puhdistetaan ja resuspendoidaan steriiliin veteen 25 pg/ml:n konsentraationa. Fragmentti sisältää TGF-p3:n kypsän koodaavan sekvenssin, jossa on ATG kehyksen sisäl- . . lä kodonille GCT, mikä määrää kypsän TGF-p3:n aminohapon • · • · · • Ala 1.

t • f · ; *· ·: 25 • * ί Plasmidista p3lRIT 12 (katso edellä) eristetään 534 bpin

«M

*...* BamHI/EcoRI-fragmentilla oleva Pff05-promoottori. Plasmidi * · ' \ *·· pJDB207/PH05-RIT 12 pilkotaan BamHIilla ja Xholillä. Eris « : : tetään suuri, 6,8 kbin BamHI/XhoI-fragmentti. Fragmentil- 30 la säilyy PH0Sin transkription terminaattori. BamHI/Eco-Rl-Pff05-promoottorifragmentti, TGF-p3:ea koodaava Eco-RI/SalI-fragmentti ja BamHI/XhoI-vektorifragmentti liite- • . tään yhteen. Yhtä oikeaa kloonia, jossa on TGF-p3-geeni « * PHÖ5-promoottorin säätelemänä kloonattuna vastapäiväiseen t · ·;·* 35 orientaatioon pJDB207:ään, kutsutaan pJDB207R/PH05-TGF- B3:ksi.

·*· . , • f • » · I *· • · 118083 i 21

Kypsät TGF-βΙ ja TGF-p2 ilmennetään analogisella tavalla S. cerevlsiaessa. TGF-pi:n ja TGF-p3:n koodaavat sekvenssit sisältävät plasmidit ovat pGKM125 ja vastaavasti pGKMl26 (katso esimerkki l.G). Kun nämä plasmidit on pil-5 kottu NcoI:llä, EcoRI-linkkerit lisätty ja ligaatio suori tettu, tuloksena saadut rengasmaiset plasmidit pilkotaan EcoRlrllä ja Sällillä. EcoRi/Sali-fragmentit kloonataan plasmidiin pJDB207, kuten edellä on kuvattu. Tuloksena saatuja plasmideja kutsutaan pJDB207R/PH05-TGF-pi:ksi ja 10 pJDB207R/PH05-TGF-p3:ksi.

Esimerkki 2C; S. cerevlsiae -kannan GRF18 transformaatio ΐ

Saccharomyces cerevislaen kanta GRF18 (MATa, his3-ll, 15 his3-15, leu2-3, leu2-112, canR, DSM 3665) transformoidaan plasmideilla pJDB207R/PHO5-TGF-pl pJDB207R/PH05-TGF-β2 pJDB207R/PH05-TGF-p3 20 käyttämällä transformaatiomenetelmää, joka on kuvattu artikkelissa Hinnen A. et ai., (1978) PNAS 75: 1929.

Transformoidut hiivasolut valikoidaan hiivan minimimal-joilla, joista puuttuu leusiini. Yksittäiset transfor- • · * \ . moidut hiivapesäkkeet eristetään ja ne on nimetty seuraa- * · · *· ** 25 vasti: • # · *· #‘ Saccharomyces cerevlsiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-pi • · *···* Saccharomyces cerevlsiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p2 ja ϊ ** Saccharomyces cerevlsiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-p3.

* * · • · · • * · 30 Esimerkki 2D: S. cerevislaen transformanttien fermentaa- • * ; **· tio ia solu-uutteiden valmistus * * · * · · · ·

Hiivatransformantit, kuten edellä on mainittu, sisältävät • * ···, plasmidit, joissa on PH05-promoottorin säätelemät ekspres I · *·* 35 siokasetit, ja sen vuoksi promoottorin esto on poistetta- *···* va TGF-pi:n, TGF-p2:n tai TGF-p3:n ilmentymiseksi. Kuta- • · • · t • *· • · 1 1 8083 ’ 22 : kin transformanttia kasvatetaan kahdessa peräkkäisessä esiviljelmässä (10 ml ja 50 ml) korkean Pi-pitoisuuden omaavassa hiivan minimikasvatusalustässä, joka on valmistettu Difcon hiiva-typpi-peruskasvatusalustan reseptin 5 mukaan ilman aminohappoja, mutta (NH4)2S04:n sijasta se sisältää 10 g/1 L-asparagiinia, 1 g/1 L-histidiiniä ja 20 g/1 glukoosia. Toisen esiviljelmän solut pestään 0,9%:isella NaCltlla ja kaikkia soluja käytetään siirros-tamaan 100 ml matalan P±-pitoisuuden omaava minimikasva-10 tusalusta, joka on valmistettu Difcon hiiva-typpi-perus-alustan reseptin mukaan (ilman aminohappoja), mutta se sisältää 0,03 g/1 KH2P04 10 g/1 L-asparagiinia, 1 g/1 L-, histidiiniä ja 20 g/1 glukoosia. Viljelmiä ravistellaan 30 °C:ssa 180 rpmrllä.

15

Solut otetaan talteen 10 ml:n viljelmästä 5, 24 ja 48 tun nin kohdalla sentrifugoimalla 3000 rpm:llä ja pestään ker ran 0,9%:isella NaClilla. Solupelletti resuspendoidaan lyysauspuskurissa [66 mM kaliumfosfaattia pH 7,4, 4 mM 20 Zwittergenttiä (Calbiochem)]. Lisätään 8 g lasihelmiä (läpimitaltaan 0,5-0,75 mm) ja suspensiota ravistellaan voimakkaasti 4-5 kertaa aina 2 minuutin ajan kulloinkin Vortex Mixerillä kylmässä. Solu-uute dekantoidaan lasi- • · *.* * helmien poistamiseksi. Uutteessa oleva solujäännös sedi- • tr ·.*·· 25 mentoidaan sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 3000 rpmrllä ϊ,* · 4 eC:ssa. Supernatantti ja pelletit erotetaan ja säilyte- ;***: tään -20 °C:ssa.

·*· t’\.

Esimerkki 3 4 · · 1 1 30 Esimerkki 3A: Liukenemattoman, monomeerisen TGF-B3:n tal- ·· teenotto E. colista • · 1 • ♦· ttt • · · *. E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-p3 -soluja fermentoidaan, kuten esimerkissä 1C on kuvattu. Solujen hajotus ja liukenemat-35 toman TGF-p3:n talteenotto suoritetaan 4 eC:ssa. Noin 18

,···. g märkiä soluja suspendoidaan 60 ml:aan 0,1 M

• · TRIS/HC1:ää, 10 mM EDTA:ta, 1 mM PMSFrää (fenyylime- • i» • * „„ 1 1 8083 ' 23 taanisulfonyylifluoridi), pH 8,3 (hajotuspuskuri). Solut johdetaan kaksi kertaa Frenchpressin (SLM Instruments,

Inc.) läpi valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tilavuus saatetaan 200 mlrksi hajotuspuskurilla. Suspensiota sent-5 rifugoidaan 20 minuutin ajan 15 000 g:llä. Saatu pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka sisältää 1 M NaCl:ia, ja sitä sentrifugoidaan 10 minuutin ajan kuten edellä. Pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka sisältää 1 %:n Triton X-100:aa (Pierce), ja 10 sitä sentrifugoidaan jälleen 10 minuutin ajan kuten edellä. Pesty pelletti suspendoidaan sitten 50 ml:aan 20 mM Tris/HCl:ää, 1 mM EDTA:ta, 1 mM PMSFtää, 1 % DTT:tä ja J

homogenisoidaan Teflon-verkkojauhimessa (tissue grinder). r

Tuloksena saatu suspensio sisältää puhdistamatonta mono-15 meeristä TGF-p3:a liukenemattomassa muodossa.

' .3

Esimerkki 3B: Monomeerisen TGF-B3:n liuotus 1a puhdistus

Esimerkin 3A mukaisesti saadusta TGF*^3-suspensiosta 10 20 ml tehdään happamaksi 10%:isella etikkahapolla pH-arvoon 2,5 ja sentrifugoidaan Eppendorf-sentrifugissa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Supernatantti kromatogra-foidaan Sephacryl S-100 -pylväällä (Pharmacia, 2,6 x 78 * · *.’* cm) 10%:isessa etikkahapossa virtausnopeudella 1,4 • · *.*·; 25 ml/min. (Vaihtoehtoisesti kromatografia voidaan suorittaa

· Sephacryl S-100HR -pylväällä (Pharmacia) ja pylväs voitas daan ajaa l%:isessa etikkahapossa tai vastaavasti 5 mM

:*·.. HCl:ssä). Ne monomeeristä denaturoitua TGF^3:a sisältä- j*·** vät fraktiot yhdistetään, jotka eluoituvat 190 minuutin 30 ja 220 minuutin välillä. Tätä materiaalia käytetään las-;·. kostamiseen biologisesti aktiivisen, dimeerisen TGF-B3: n * ψ· '···' saamiseksi (esimerkki 4) tai lisäpuhdistukseen ja raken- e··*’..

*. neanalyysiin (esimerkki 3D).

«···· * · M· 35 Esimerkki 3C: Monomeerisen TGF-63tn talteenotto Saccharo- ,*·*. miices cerevisiaesta ··· * * · ί 24 118083

Rikkoutuneiden solujen muodostama pelletti, joka on saatu 500 ml:sta edellä kuvatulla tavalla suoritettua fermentaa tiota, suspendoidaan 20 ml:aan 4 M ureaa, 0,1 M TRISiä, 1 % DTT:tä, pH 8,0. Seosta pidetään huoneenlämpötilassa 30 5 minuutin ajan sekoittaen (vortexing) jaksoittain joka 5 minuutin välein. Liukenematon materiaali poistetaan sent-rifugoimalla 30 000 g:llä 30 minuutin ajan 4 °C:ssa ja supernatantin pH säädetään arvoon 2,5 etikkahapolla ja dialysoidaan voimakkaasti 5%:ista etikkahappoa vastaan 10 yli yön 4 “C:ssa. Liuosta sentrifugoidaan kuten edellä ja kirkas supernatantti konsentroidaan ultrasuodatuksella YM 10 -kalvolla (Amicon) lopulliseen 4 ml:n tilavuuteen.

Sitten näyte kromatografoidaan Sephacryl S-100 HR:llä (Pharmacia) 5%:isessa etikkahapossa, kuten esimerkissä 3 15 on kuvattu, jolloin saadaan monomeeristä TGF-p3:a.

Esimerkki 3D: Monomeerisen TGF-B3:n llsäpuhdistaminen RP-HPLC:llä 20 Sephacryl S-100-pylväästä saatujen yhdistettyjen fraktioi den (esimerkki 3.B) erät puhdistetaan Vydac 214TP5415 HPLC -käänteisfaasipylväällä (4,6 x 150 mm, The Separa- ΐ tions Group, Hesperia, CA, USA). Pylväs tasapainotetaan *.’ * seoksessa, jossa on 70 % 0,l%:ista TFA:ta vedessä ja 30 % V*i 25 0,08%:ista TFA:ta asetonitriilissä, ja tuotetta eluoidaan * # ·/ · lineaarigradientilla 30 minuutin ajan virtausnopeudella 1 ml/min päätyen seokseen, jossa on 55 % 0,l%:ista TFA:ta « v* i\, vedessä ja 45 % 0,08%:ista TFA:ta asetonitriilissä. Eluaa tista seurataan absorbanssia 216 nm:ssä ja yksittäiset , * 'p 30 piikit otetaan talteen manuaalisesti UV-absorbanssin mu- ..φ kaan. Denaturoitu, monomeerinen TGF-p3 eluoituu 21,5 mi- • * * nuutissa. Erotteluun käytettävästä yksittäisestä kään- J t # *. teisfaasipylväästä riippuen sama TGF-p3-valmiste eluoi- tuum vastaavasti noin 16 ja 18 minuutissa.

i : 35 • » « ,♦··, TGF-p3-fraktiot analysoidaan RP-HPLC:llä käyttämällä sa- • ♦ maa pylvästä ja liuotinjärjestelmää kuin edellä. TGF-p3:a < " · f • · 25 1 1 8083 eluoidaan lineaarigradientilla 42 minuutin ajan aloittamalla 100 %:sta 0,l%:ista TFA:ta vedessä ja päätyen seokseen, jossa on 30 % TFA:ta vedessä ja 70 % 0,08%:ista TFA:ta asetonitriilissä. TGF-p3 eluoituu yhte-5 nä piikkinä 30,4 minuutin kuluttua. Käytetystä yksittäisestä pylväästä riippuen saadaan 29 minuutin ja vastaavasti 29,9 minuutin retentioajat.

Esimerkki 3E: Monomeerlsen TGF-B3:n analysointi SDS-PAGE1 10 la

Sephacryl S-100-pylväästä (esimerkki 3.B) tai käänteis-faasipylväästä (esimerkki 3.D) saadut yksittäiset erät kuivataan tyhjössä ja analysoidaan SDS-PAGElla 15%:isillä 15 polyakryyliamidi-geelilevyillä, jotka on värjätty Coomas-sie Blue R-250:llä. Saadaan yksi, näennäiseltä molekyyli-painoltaan noin 12 000 Da:n vyöhyke, jota ei voida erottaa pelkistetystä luontaisesta sian TGF-p3:sta.

20 Esimerkki 3F: Monomeerlsen TGF-B3;n N-terminaalisen aminohapposekvenssin määritys TGF-p3 esimerkistä 3.B haihdutetaan tyhjössä, liuotetaan i • t *·* * 25 pl:aan 0,1 M etikkahappoa ja sen aminohapposekvenssi f • · *.**i 25 määritetään kaasufaasiproteiinisekvensoijalla, jonka mal- ·/ | li 470A on (Applied Biosystems).

• » * · f ·· N-terminaalinen aminohapposekvenssi on identtinen sekvens j'j*. silistassa SEKV. ID NO:ssa 6 esitetyn sekvenssin kanssa.

30 • Esimerkki 4: TGF-B3; n laskostus in vitro : : : *, Edellä saatu TGF-p3 laskostetaan 4 eC:ssa puskurissa, jon ka koostumus on 0,1 M Trisiä, 30 mM CHAPSia, 1 M NaCl:a, I *: 35 5 mM pelkistettyä glutationia ja vastaavasti 20 % (v/v) .1,^ DMS0:ta. Puskurin pH säädetään tarvittaessa pH-arvoon 9,5 **’, Na0H:lla. TGF-p3:n lopullinen konsentraatio on 0,1 mg/ml.

• *· $ 1 1 8083 ·;1 2d

Kun liuosta on pidetty 7 päivän ajan 4 eC:ssa, sen happa- ^ muutta lisätään väkevällä etikkahapolla pH-arvoon 3,5, ja se konsentroidaan noin 10-kertaisesti ultrasuodattamalla Amicon-sekoituskammiossa (stirred cell) YMlO-kalvolla 5 (Amicon). Konsentroitu liuos laimennetaan alkuperäiseen tilavuuteen 0,1 M etikkahapolla ja konsentroidaan uudelleen. Tämä menettely toistetaan kahdesti. Sitten liuoksel le tehdään ioninvaihtokromatografia, kuten esimerkissä 5 on kuvattu.

10 t

Esimerkki 5; Dimeerisen biologisesti aktiivisen TGF-B3:n eristys kationinvaihtokromatoqrafiällä 3.5

Esimerkissä 4 saatua liuosta, joka sisältää noin 10-50 mg TGF-p3:a, syötetään virtausnopeudella 6 ml/min HiLoad 26/10 S-Sepharose High Performance -pylvääseen (Pharmacia). Ensin pylväs pestään 20 mM natriumasetaatilla, 20 30%:isella isopropyylialkoholilla, pH 4,0 (A-puskuri) 5 minuutin ajan ja eluoidaan sitten lineaarigradientilla 45 minuutin ajan aloittamalla A-puskurista, joka sisältää 0,2 M NaCl, ja päätymällä A-puskuriin, joka sisältää 0,5 ' M NaCl:a. Eluaattia seurataan 280 nm:ssä ja fraktioidaan Ψ * */·: 25 manuaalisesti. Fraktioista tutkitaan dimeerinen TGF-p3 '? » · */ j ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla ja biologinen aktiivisuus in vitro -biomäärityksellä.

• • * • ·· ·*·’· Esimerkki 6: Dimeerisen TGF-B3:n lisäpuhdistus ja karakte « 30 rlsointi ·*. Esimerkki 6A: Lisäouhdistus RP-HPLC:llä

• M

«tl • * · \, Fraktiot, jotka sisältävät dimeeristä biologisesti aktii- vista TGF-p3:a, yhdistetään, dialysoidaan 0,1 M etikka-ί*’*ϊ 35 happoa vastaan tai laimennetaan samalla tilavuudella 0,1- y..' %:ista TFA:ta vedessä ja suoritetaan RP-HPLC Vydac **'. 214TP510 HPLC -käänteisfaasipylväällä (1 cm x 25 cm, The « < t • ·· • · 27 118083 f

Separations Group, USA). Pylväs tasapainotetaan virtausnopeudella 4,5 ml/min seoksella, jossa on 75 % liuotinta A [0,l%:ista TFA:ta vedessä] ja 25 % liuotinta B [0,08%:ista TFArta asetonitriilissä]. Näytteen syöttämi-5 sen jälkeen pylväs pestään tasapaino-olosuhteissa, kunnes 235 nm:ssä seurattu absorptio on saavuttanut perusviivan tason. Sitten pylvästä eluoidaan 30 minuutin ajan lineaa-rigradientilla, joka alkaa tasapaino-olosuhteista ja päätyy seokseen, jossa on 45 % liuotinta A ja 55 % liuotinta 10 B. Eluaatti fraktioidaan manuaalisesti ja analysoidaan ei-pelkistävällä SDS-PAGE:lla sekä in vitro -biomäärityk-sellä.

Esimerkki 6B: SDS-PAGE-analvvsi 15

Esimerkin 6 puhdistetun TGF-p3:n erät vastaavasti kuivataan tyhjössä ja analysoidaan SDS-PAGE:lla 15%:isilla po-lyakryyliamidi-geelilevyillä, jotka on värjätty Coomassie Blue R-250:lla. Pelkistämättömät näytteet tuottavat yh-20 den, näennäiseltä molekyylipainoltaan noin 25 kDa:n vyöhykkeen, kun taas pelkistetyt näytteet tuottavat noin 12,5 kDa:n vyöhykkeen.

·.·. Esimerkki 6C: Molekwlipainon määritys • · · : . 25 **· • ·· 1 Esimerkin 6A puhdistettu TGF-B3 analysoidaan elektroni- » · · suihku-ionisaatiomassaspektrometrialla (ESI-MS). Havaittu • · *··1 kokonaismassa on hyvin lähellä teoreettisesti odotettua : " arvoa.

• · · i.: : 30

Esimerkki 6D: Aminohappoanalyysi • # ♦ ···· • · · s

Aminohappoanalyysi suoritettiin, kuten on kuvattu artikke * . lissa Knecht, R. ja Chang, J.-X., Analytical Chemistry 35 58: 2375-2379 (1986). Tulokset sopivat hyvin yhteen teo- • · *···1 rian kanssa.

"·1· * · ♦ · ···-.· · • « « *·♦'·· 118083 28

Esimerkki 6E: N-terminaalisen aminohapposekvenssin määritys 10-20 mg esimerkin 6A TGF-p3:a haihdutetaan tyhjössä, 5 liuotetaan 25 ml:aan 10 mM etikkahappoa ja sen aminohapposekvenssi määritetään kaasufaasisekvensoijalla, joka oli mallia 477A (Applied Biosystems). Kymmenen ensimmäisen tähteen määritetty aminohapposekvenssi oli teorian perusteella odotetun mukainen.

10 |

Esimerkki 6F: Proteolvvttinen fraomentointi Asp-N-proteaa silla 15 92 mg (6,7 nmol) TGF-p3:a pelkistetään, 4-vinyylipyridyy- lietyloidaan, kuivataan tyhjösentrifugissa ja liuotetaan

uudelleen 200 ml:aan 5 mM HCl:ää. Lisätään 200 ml 0,2 M

Tris-asetaattipuskuria, pH 7,8, joka sisältää 10 mM Zwit- tergentti 3-12 -detergenttiä (Calbiochem Corporation, La 20 Jolla, CA), ja sekoitetaan proteiiniliuoksen kanssa. Pil- konta suoritetaan 2 mg:n (liuotettu 50 ml:aan vettä) kanssa endoproteinaasia Asp-N (Pseudomonas fragi -mutan- tista, sekvenssilaatu, Boehringer Mannheim Biochemica, ·.*. Saksa) 37 °C:ssa. Kun 13 tuntia on kulunut, lisätään 50 • · * .·. : 25 ml 10%:ista (v/v) TFA:ta ja seos erotellaan RP-HPLC:llä " • *· ^j Vydac 218TP5415 -pylväällä (4,6 mm x 150 mm, The Separa- • · t..* tions Group) lineaarigradientilla 5%:isesta 45%:iseen • · ';·*’ (v/v) asetonitriiliin 0,l%:isessa TFA/vedessä 40 minuutin • · • " ajan virtausnopeudella 0,1 ml/min. Eristetyt peptidit • · · ···.·*' V ' 30 analysoidaan elektronisuihku-ionisaatiomassaspektromet- rialla (ESI-MS). Määritetyt molekyylipainot sopivat hyvin j yhteen odotettujen Asp-N-fragmenttien laskennallisten { arvojen kanssa.

* ····· • * ... 35 Identifioidut fragmentit käsittävät koko aminohapposek- • * *··/* venssin tähteitä 1 ja 2 lukuunottamatta. Nämä aminohapot * · * tunnistetaan kokonaisen proteiinin N-terminaalisen sek- « # • ·· » · 118083 * 29 venssin määrityksen sekä V8-fragmenttien analyysin perusteella.

Esimerkki 6G: Proteolvvttinen fracrmentointl V8-oroteaasil 5 la '

Samalla tavalla kuin kokeessa 9 Asp-N-proteaasin kanssa 4-vinyylipyridyloitu TGF-p3 pilkotaan proteaasilla V8 ja fragmentit erotellaan RP-HPLC:llä ja analysoidaan ESI-10 MS:llä. Määritetyt molekyylipainot sopivat hyvin yhteen teoreettisten arvojen kanssa, mikä edelleen varmistaa TGF-p3:n tunnistuksen. Identifioidut fragmentit kattavat koko 112 aminohappotähteen sekvenssin.

15 Esimerkki 7: Laskostetun TGF-β:n in vitro -aktlivisuustut .'.'i kimus: Minkin keuhkoepiteelisolun (Mv-l-Lu) hapan fosfa- | taasimääritvs TGF-β tai hybridi-TGF-β seulotaan in vitro biologisessa 20 solumäärityksessä, joka mittaa yhdisteen tehon minkin jatkuvan keuhkoepiteelisolulinjan Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) kasvun inhiboinnissa. Mv-l-Lu-solulinja on osoittautunut olevan herkkä reportteri TGF-β:jen biomäärityksessä muo- -t ·.·. dostamalla sigmoidin muotoisen konsentraatiovasteen, jon- • · 1 * ·. : 25 ka raportoitu EC50 on noin 10-50 pg/ml (Tucker et ai., • ·· ; Science 1984, 226: 705-707; Absher et ai., J. Immunol.

• · ,··, Methods 1991, 138: 301-303; Danielpour et ai., J. Cell • 1

Physiol., 1989, 138: 79-86). Mv-l-Lu-soluja, joiden li- *... sääntymistä TGF-β inhiboi voimakkaasti, pidetään tällä : : : * 30 hetkellä parhaiten sopivana solulinjana tämän sytokiinin analyyttisen biomäärityksen kehittämiseen (Kelley et ai., * 1 • 2 Exp. Lung Res. 1992, 18: 877-887; Meager, J. Immunol.

* 1 1 .

*.1 1 Methods., 1991, 141: 1-14). Määritys suoritetaan 96-ko- .;··· loisilla mikrotiitterilevyillä käyttämällä soluja, jotka ?> .·1·. 35 saatiin alun perin viljelyvaiheesta (passage) 46 talle- tuslaitokselta American Type Culture Collection, Rockvil- • ® » · • 1 1 • 1· 2 • · j 118083 30 ί; le, MD, USA. Solut siirrostetaan alhaisella tiheydellä (5000 solua/kolo) kasvualustassa (minimiessentiaalikasvu-alusta, jossa on 5 % (v/v) naudan sikiön seerumia), joka sisältää TGF-8-standardin tai näytteen laimennossarjoja.

5 Sitten määrityksiä inkuboidaan 37 °C:ssa kostutetussa 5%:isessa C02-inkubaattorissa 72 tunnin ajan. Solujen lisääntymisen inhibitio määritetään herkällä entsymaatti-sella solunvärjäysmenetelmällä (jolla saadaan kussakin kolossa tuotetun happaman fosfataasimäärän kolorimetrinen 10 arvio), värjäyksen voimakkuus vastaa kussakin kolossa olevien solujen lukumäärää. Kunkin kolon absorbanssi O.D. määritetään 405 nm:ssä ja määritysaineisto plotataan ja analysoidaan sopivalla PC-ohjelmalla. Tässä määrityksessä yksi aktiivisuusyksikkö (U, unit) kuvataan sellaisena 15 TGF-βιη määränä, joka tarvitaan inhiboimaan puolet Mv-1-Lu-solujen maksimaalisesta lisääntymisestä.

Esimerkki 8: Laskostuneen TGF-B3:n in vivo -aktiivisuus- tutkimukset 20 Esimerkki 8A: Osittaisswyisten (Partial-Thickness) haavo 1en paraneminen vanhoissa hiirissä

Haavan paranemisprosessien tiedetään heikkenevän iän myö- ».·. tä ja sen vuoksi ne ovat tärkeitä ongelmia geriatrisessa • · 1 •t · 25 lääketieteessä. Siitä syystä tutkitaan laskostuneen, ak- * ·· ^ 1. tiivisen dimeerisen TGF-83:n biologisia vaikutuksia in • vivo osittaissyvyisten haavojen (muodostuneet toisen as- • t teen palovammoissa) paranemiseen osittain vajavaisessa i tai heikentyneessä haavan paranemistilanteessa, nimittäin | · · ·' ' 30 vanhoissa eläimissä, seuraavaa menettelytapaa käyttäen: · : ’·· Anestesioitujen vanhojen C57/BL6-hiirien (450 päivää tai • · 1 V 1· vanhempia), joiden selät on aikaisemmin ajettu paljaiksi t kaupallisella voidemaisella karvanpoistoaineella, dorsaa- » · ...< 35 liin rintakehään aiheutetaan yksittäisiä middermaalisia 5 · **’ lämpövaurioita käyttämällä 10 sekunnin ajan yhtä messinki * · 1 esinettä (lxl cm, 8 g), joka on tasapainotettu 80 • 1 • 1 # • · § 118083 31 :> eC:ssa vesihauteessa. Tuloksena muodostuva rakkula poistetaan kirurgisesti ja palovammoja käsitellään päivittäin 5 päivän ajan panemalla paikallisesti 25 ml steriiliä apuainepuskuriliuosta (joka koostuu 0,8%:isesta (w/v) 5 hydroksipropyyliselluloosasta liuoksessa, jossa on 10 mM histidiiniä, 140 mM NaCl, pH 7,4), joka sisältää eri määriä (500 ng, 100 ng tai 10 ng) laskostettua aktiivista dimeeristä TGF-p3:a, tai pelkästään puskuriliuoksella tai ne jätetään hoitamatpa. Kaikki paikallisesti annettavat 10 materiaalit ovat steriilejä, endotoksiinittomia ja pyro- geenittömiä, ja kaikki hiiret pidetään kokeen aikana hä- f keissä yksittäin. Jokainen koeryhmä koostuu viidestä eläimestä.

15 Viiden päivän TGF- P3 -hoidon jälkeen hiiret nukutetaan, rakkulat (jos niitä on) poistetaan kirurgisesti palovam- .¾ moista ja palovammat valokuvataan. Ne palovamma-alueet, joissa epiteeli on regeneroitunut, piirretään piirtoheitinkalvolle yhtenäisen paksuisina (areas ... are outlined { 20 onto uniform thickness transparent overhead projector film), ja jokaisen parantuneen alkuperäisen palovamma-alueen prosenttiosuus lasketaan planimetrillä. Tuloksia verrataan myös epiteelin regeneraatioprosessiin nuorissa :¾ *.·. (56-84 päivän ikäisissä) C57/BL6-hiirissä, joilla on sa- ·.: 25 manlaisia middermaalisia palovammoja, jotka jätetään ko- • · · 1 t keen aikana hoitamatta.

• · • · ···.

• · *··' Planimetristen analyysien tulokset osoittavat, että las- i • · • * : * kostuneen, aktiivisen dimeerisen TGF-p3:n paikallinen * · · *.· * 30 anto päivittäin viiden päivän ajan sopivassa apuainepus- kurissa stimuloi ja nopeuttaa epiteelin uusiutumista van- :*·.. hojen hiirien osittaissyvyisissä haavoissa annoksesta • .-!» riippuvalla tavalla verrattuna pelkästään apuainepusku- :f * * . rilla käsiteltyihin tai hoitamattomiin haavoihin. Nuoret ***** 35 hiiret kykenevät ilmeisesti riittävän onnistuneesti uu- » * *··· distamaan haavoihinsa epiteelin ilman mitään paikallises- :***: ti annettavaa TGF-p3:ea. Histologisissa analyyseissä pal- • · · * · • * · • ·· • · 118083 32 jastuu voimistuneen epiteelin uusiutumisprosessin laajuus ' yhdessä uudistuneen ihon hyperkeratoosin kanssa kuudentena päivänä TGF-p3-hoidetuissa haavoissa.

5 Esimerkki 8B: Tävssvvyisten (full-thickness) haavojen paraneminen aikuisilla rotilla

Laskostuneen aktiivisen dimeerisen TGF-p3:n biologisia vaikutuksia tarkastellaan myös toisessa in vivo haavan pa 10 ranemismallissa, nimittäin täyssyvyisten haavojen (muodos tettu kirurgisella leikkauksella) paranemiseen aikuisilla rotilla käyttämällä samanlaista menetelmää kuin on kuvattu artikkelissa Mustoe, T.A. et ai., (1987) Science 237: 1333.

15 4

Pentobarbitonilla anestesiolduille Wistar-urosrotille (300-350 g), joiden selät on aikaisemmin ajeltu ja karvat poistettu kaupallisella voidemaisella karvanpoistoaineel-la, tehdään leikkaussaksilla yksi täyssyvyinen 5 cm pitkä 20 lineaarinen leikkaushaava molemmille puolille 1,5 cm:n päähän dorsaalisesta keskiviivasta. Koeryhmissä vasemmalla puolella (katsottuna selkäpuoli ylöspäin) olevan haavan reunoihin applikoidaan kerran topikaalisesti (100 ml) /:*; steriiliä apuainepuskuria (joka koostuu 0,8%:isesta (w/v) 25 hydroksipropyyliselluloosasta liuoksessa, joka sisältää : 10 mM histidiiniä, 140 mM NaCl:ia, pH 7,4), joka sisältää • * /.··* eri annoksia (2 mg, 1 mg, 0,1 mg tai 0,01 mg) laskostet- tua aktiivista dimeeristä TGF-p3:a. Vastakkaisella oi- » ·..

*#ii kealla puolella olevan haavan reunoihin pannaan vastaava j · * ** * 30 määrä plasebo-kontrollia (naudan seerumin albumiinia) mainitussa apuainepuskurissa, ja kontrollieläinten haavo- ·· • *·* jen reunoihin pannaan vasemman puolen haavoissa apu- * * ♦ ! ainepuskuria ja oikean puolen haavat jätetään leikkaus- haavan tekemisen jälkeen hoitamatta. Kaikki paikallisesti • * ...t 35 annettavat materiaalit ovat steriilejä, endotoksiinitto- Ί* mia ja pyrogeenittömiä. Sitten jokaisen haavan reunat ·· lähennetään 5:llä tasaisesti asetetulla horisontaalisella * · » · • * · * · ' :h 118083 4 33 katkonaisella patjaompeleella 5-0 Ethilon. Kaikkia eläimiä pidetään erikseen häkeissään ja haavojen annetaan parantua käsittelyn jälkeen eri ajanjaksoja 21 päivään asti sen sisältäen. Eläinten lopetuksen jälkeen jokaises-5 ta eläimestä irrotetaan koko selänpuolen iho j a kaikki ihonalainen rasva leikataan huolellisesti pois jokaisen ihon alapuolelta leikkausspaattelia käyttäen. Sitten ihosta leikataan suikaleita (kunkin leikkaushaavan ommelten välistä) käyttämällä templaattia, joka koostuu kah-10 desta samansuuntaisesta leikkausterästä (terien väli on 8 mm), vetolujuuden mittaamiseksi. Histologiseen analyysiin otetaan näytteet jokaisen leikkaushaavan toisesta päästä.

Kunkin leikatun ihonäytteen kestämä maksimikuorma mitataan laitteella Universal Tensile Strength Machine, malli 15 144501 (Zwick, Ulm, Saksa). Mittaukset tehdään 30 mm x 8 mm suikaleille, jotka kiinnitetään lujasti hydraulisten puristinten väliin, minkä jälkeen niitä venytetään murtu-mispisteeseen nopeudella 10 mm/minuutti, ja maksimikuorma rekisteröidään piirturiin (chart recorder). Mittaukset 20 tehdään kolmelle näytteelle kustakin haavasta ja koeryhmät koostuvat 4 eläimestä. Murtumislujuutta ei mitata haavoille, joissa näkyy infektion merkkejä tai liiallista verenvuotoa (alle 3 % kaikista haavoista).

• · • · « · · ; 25 Vetolujuuden mittaustulokset osoittavat, että yksi topi- • * · 1 *. kaalinen anto laskostettua aktiivista dimeeristä TGF-B3: a : · : I..* sopivassa apuainepuskurissa vahvistaa täyssyvyisten leik- « * kaushaavojen murtumislujuutta jopa kaksinkertaisesti ja t * *

• nopeuttaa paranemista aikuisilla rotilla annoksesta riip- I

• · · *·* ‘ 30 puvalla tavalla yli 21 päivän ajanjaksona kontrolliryh mään verrattuna. Histologiset analyysit paljastavat mer- • · • *·* kittävästi kohonneen mononukleaaristen solujen, fibro- * * * !'t : : : blastien ja kollageenin tuotannon lisääntymisen (influx) TGF-p3-hoidetuissa haavoissa 21 päivän ajanjakson aikana • · ... 35 kontrollihaavoihin verrattuna. Myös selvää ohimenevää i : *" hyperkeratoosia esiintyy TGF-p3-hoidetuissa haavoissa 14 päivään asti hoidon jälkeen.

• · • * · »M • · 118083 1 34 :,

Esimerkki 9: Liuotettujen monomeeristen hvbridi-TGF-B-pro teiinien ia liuotetun monomeerisen BMP-2:n valmistus Esimerkki 9.1. Hvbridi-TGF-B

5 Viisi millilitraa plasmidia pPLMu linearisoidaan pilkkomalla NcoI:llä ja Sällillä ja geelipuhdistetaan, kuten edellä fragmentti-DNA:ille on kuvattu. 100 ng:aa lineari-soitua ja puhdistettua pPLMu-vektori-DNA:ta ja 3 x molaa-rinen ekvivalentti vastaavaa puhdistettua fragmentti-10 DNA:ta, joka koodaa sekvenssilistassa esitettyjä hybridejä TGF-pi-3, TGF-p2-3 ja vastaavasti TGF-p3-2, inkuboi- '% daan 4 °C:ssa 15 tunnin ajan 20 pl:ssa ligaatiopuskuria (70 mM TRIS-HCl:ää, pH 7,5, 10 mM MgCl2:ia, 5 mM DTT:tä, 0,1 mM adenosiinitrifosfaattia), joka sisältää 1 yksikön 15 DNA-ligaasia (Boehringer).

Sitten 10 μΐ ligaatioseosta lisätään 200 pl:aan kylmiä (4 °C) kompetentteja E. coli LC137 -soluja, joissa on plasmi di pcl857. Kun 30 minuuttia on kulunut, soluille annetaan 20 lämpösokki inkuboimalla niitä 1,5 minuutin ajan 42 1 C:n vesihauteessa. Lisätään 2 ml LB-kasvualustaa ja viljelmää ravistellaan 60 minuutin ajan 30 °C:ssa. LB-maljoille, jotka sisältävät ampisilliinia ja kanamysiiniä, maljataan /2; 200 μ1:η erät ja inkuboidaan 22 tunnin ajan 30 eC:ssa. Yk • : 25 sittäisiä pesäkkeitä viljellään ja plasmidi-DNA analysoi- daan. TGF-pl-3:a, TGF-p2-3:a ja TGF-p3-2:ta koodaavien • · I..1 DNA-fragmenttien subkloonaus pPLMu:hun johtaa plasmidei- ’:3 hin pPLMu.TGF-βΙ( 44/45)β3, pPLMu.TGF-p2(44/45)S3 ja vas- t 2· *t4, taavasti pPLMu.TGF-p3(44/45)β2. Edellä mainittuja konst- li1 ·1 30 rukteja sisältäviä klooneja kutsutaan nimillä E.coli LC137/pPLMu.TGF-βΐ(44/45)β3, E.coli LC137/pPLMu.TGF- • '1 β2(44/45)β3 ja vastaavasti E.coli LC137/pPLMu.TGF- * · · V: β3(44/45)β2.

····«-• · ,1·. 35. E.coli LC137/PPLMU.TGF-βΚ44/45)p3:ea, E.coli LC137/pPL- * ♦ ·

Mu.TGF-p2(44/45)p3:ea ja E.coli LC137/pPLMu.TGF- m · • ··1 ··· 2 • · · 3 • · '% i ' 35 118083 β3(44/45)β2:ta indusoidaan lämmöllä (katso esimerkki 3.A) ja ilmentyneet proteiinit analysoidaan SDS-PAGE:11a. TGF-β1-3, ΤβΡ-β2-3 ja TGF^3-2 ilmestyvät kaikki 2 tunnin kuluttua lämpöinduktiosta lämmön indusoimina proteiinei-5 na, jotka kulkevat noin 12 000 Da:n näennäisellä molekyy-lipainolla.

E.coli LC137/pPLMu.TGF-βΙ(44/45)β3:n, E.coli LC137/pPLMu.TGF-β2(44/45)β3:n ja E.coIiLC137/pPLMu.TGF-10 β3(44/45)β2:η yli yön viljelmiä 2 l:n erlenmeyerpullois- sa, jotka sisältävät 750 ml LB-kasvualustaa, jossa on 40 mg/1 ampisilliinia ja kanamysiiniä, kasvatetaan 30 “C:ssa. Kolmesataa millilitraa yli yön viljelmiä lisätään 750 ml:aan LB-kasvualustaa, joka sisältää antibiootteja 15 kuten edellä on mainittu, 2 l:n erlenmeyerpulloissa ja kuumennetaan 42 eC:seen ravistelemalla noin 3,5 minuutin ajan 65 °C:n vesihauteessa. Sitten pullot siirretään 42 eC:iseen ravistimeen ja niitä inkuboidaan 3 tunnin ajan.

Pullot jäähdytetään 12 °C:seen jää-vesihauteessa ja solut 20 otetaan talteen sen jälkeen, kun on sentrifugoitu 10 minuutin ajan 8000 rpm:llä GSA-roottorissa (Sorvali).

Monomeerisen liuotetun TGF^l-3-hybridin tuottamiseen jäi ί jempänä annetut menetelmät koskevat myös TGF^2-3:n ja 25 TGF^3-2:n liuotusta. · • · » ♦ • · · • · • · .*·*. E.coli LC137/pPLMu.TGF^l(44/45^3-soluja fermentoidaan, ·*. kuten edellä on kuvattu, ja inkluusiokappaleet valmiste- *·;·, taan seuraavasti. Solujen hajotus ja inkluusiokappaleiden t . » 30 talteenotto suoritetaan 4 eC:ssa. Noin 18 g märkiä soluja suspendoidaan 60 ml;aan 0,1 M TRIS/HCl:ää, 10 mM EDTA:ta, • · 1 mM PMSF:ää (fenyylimetaanisulfonyylifluoridia), pH 8,3 * t · *.' * (hajotuspuskuri). Solut johdetaan kaksi kertaa Frenchpres « ···»· sin (SLM Instruments, Inc.) läpi valmistajan ohjeiden t**·. 35 mukaisesti ja tilavuus saatetaan 200 ml:ksi hajotuspusku- * · · rilla. Suspensiota sentrifugoidaan 20 minuutin ajan 15 • · ’·*·* 000 g:llä. Saatu pelletti suspendoidaan 100 ml:aan hajo- • · * • ·» • * 118083 36 tuspuskuria, joka sisältää 1 M NaCl:ia, ja sitä sentrifu-goidaan 10 minuutin ajan kuten edellä. Pelletti suspen-doidaan 100 ml:aan hajotuspuskuria, joka sisältää 1 % Triton X-100:aa (Pierce), ja sitä sentrifugoidaan jälleen 5 10 minuutin ajan kuten edellä.

0,3 g pestyä pellettiä suspendoidaan sitten 10 ml:aan 20 mM Tris/HCl:ää, 1 mM EDTA:ta, 1 mM PMSF:ää, 0,1 % DTT:tä, pH 8,0, ja sekoitetaan magneettisekoittimellä 1 tunnin 10 ajan huoneenlämpötilassa. Sitten näyte saatetaan pH-ar-voon 2,5 väkevällä etikkahapolla ja homogenisoidaan Tef-lon-verkkohomogenisaattorilla ja sentrifugoidaan Centri-con H-401-sentrifugilla (Kontron Instruments), jossa on kiinteäkulmainen roottori A.8.24, 60 minuutin ajan 15 15 °C:ssa ja 12 000 rpm:llä. Kirkkaan supernatantin, joka sisältää liuennutta monomeeristä TGF-p-hybridiä, etikka-happo vaihdetaan 10 mM HCl:n kanssa Amicon 8010 -sekoi-tuskammiossa, jossa on YM05-suodatin, toistuvalla kon-sentroinnilla ja liuoksen laimentamisella 10 mM HCl:llä.

20

Esimerkki 9.2: BMP

Inkluusiokappaleet, jotka sisältävät sellaisen BMP-2:n (alkuperäinen nimitys BMP-2A) kypsää muotoa, kuten on 25 kuvattu artikkelissa Wozney, et ai.. Science 242: 1528- 4 · | 1534 (1988), jossa on N-terminaalinen sekvenssi Q-A-K-H- ,···, K-Q-R-K-R-L-K-S-S-C-K-R-H, valmistetaan tavanomaisten • · ·' menetelmien mukaisesti E. colissa T7-polymeraasin ilmen- l * ··

*...t tämisjärjestelmällä. Ilmentämiseen käytetty BMP-2:n DNA

t » « * 30 esitetään sekvenssilistassa SEKV. ID N0:ssa 13. Yhdistel- mä-BMP-2:ssa on N-terminaalissa ylimääräinen metioniini.

* 4 * Toisessa lähestymistavassa tuotetaan BMP-2:n mutantti, ·*· V * so. (-Q1 )BMP-2, joka on muuten sama proteiini kuin edel- ..··· linen, mutta ensimmäinen aminohappo on poistettu eikä N- ,···. 35 terminaalissa ole metioniinia.

*· ··♦ • · ·

Kymmenen millilitraa BMP-2:n tai (-Ql)BMP-2:n inkluusio- • 44 4 · ' "7 37 118083 kappalesuspensiota tehdään happamaksi 10%:isella etikkaha polla pH-arvoon 2,5 ja sentrifugoidaan Eppendorf-sentrifu gissa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Supernatantti kromatografoidaan Sephacryl S-100 -pylväällä (Pharmacia, 5 2,6 x 78 cm) 10%:isessa etikkahapossa virtausnopeudella 1,4 ml/min. Ne fraktiot yhdistetään, jotka sisältävät monomeeristä denaturoitua BMP-2:ta. Yhdistettyä materiaalia käytetään seuraaviin laskostuskokeisiin.

10 Esimerkki 10; Saria laskostuskokeita eri TGF-β-molekyyleillä. TGF-B-hvbrideillä ia BMP-2:lla ' li jjh Γ

Keksinnön monipuolisuudesta ja laajasta sovellettavuudes- 5 ta ovat esimerkkeinä tulokset, joista esitetään yhteenve-15 to kahdessa seuraavassa esimerkkien sarjassa. Ne spesifiset olosuhteet ja yksittäiset proteiinit luetellaan, joita käytettiin proteiini in vitro -laskostuskokeissa. Muut koeolosuhteet ovat, kuten esimerkissä 4 on kuvattu.

20 Biologinen aktiivisuus määritettiin 3. ja 7. päivänä proteiinin in vitro -laskostuskokeen alkamisesta.

• m • · « 4 • · 1 ...

• 4 · • »4 • · - · % 4 41 2 34 • t • 4 4 41 4 4 4 4 ♦ · 4 r» 4 441·'·' I · ♦ • · · *4 • « 4 4 4 1 · 4 1 1 : » ♦ * 4 4#»1 * · • · 1 i : • · 1 4 »4 4 • · 2 • · 3 • · 4 · · * · » 118083 .

38

Sarja 1: In vitro laskostus orgaanisella liuottimena DMSO tai DMF CHAPSin tai CHAPSOn läsnäollessa: Biomääri-tyksen tulokset

No CHAPS/CHAPSO RSH_DMSO DMF pH TGF-β Aktiivisuus 1. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 8.0 83 + 2. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 9.0 83 ++ 3. ) 30mM CHAPS 2.5mM GSH 20% 8.0 83 ++ 4. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 30% 8.0 83 ++ 5. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 9.5 83 ++ 6. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 20% 9.5 83 ++ 7. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 30% 9.5 83 ++ 8. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 40% 9.5 83 ++ 9. ) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 50% 9.5 83 + 10. )30mM CHAPS 10mMGSH 10% 8.0 83 + 11. )30mMCHAPS I.OmMGSH 20% 9.5 83 ++ 12. )30mM CHAPS S.OmMGSH 20% 9.5 83 ++ 13. )30mM CHAPS 10mMGSH 20% 9.5 83 ++ 14. ) 30mM CHAPS 20mM GSH 20% 9.5 83 + 15. ) 30mM CHAPS 50mM GSH 20% 9.5 83 + 16. )30mM CHAPS 2.5mM Kysteiini 20% 9.5 83 ++ 17. ) 30mM CHAPS 2.5mM Kysteamiini 20% 9.5 83 ++ .1/: 18.)30mM CHAPS 2.5mM 8-ME 20% 9.5 63 + 19.)30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 6.5 63 + :/ j 20.)30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 7.5 63 + 21 ,)30mM CHAPS 2.5mM GSH 10% 8.5 63 ++ t22.) 30mM CHAPS 2.5mM GSH 10% 9.5 63 ++ 23. )30mM CHAPS 2.5mM GSH 20% 9.5 63 ++ » 24. ) 30mM CHAPS 2.5mM GSH 30% 9.5 83 ++ 25. ) 30mM CHAPS 2.5mM GSH 40% 9.5 63 + iT: 26.) 30mM CHAPS 2.5mM GSH 10% 10.5 63 + 27. ) 30mM CHAPS O.OmM GSH 10% 8.5 63 ++ 28. ) 30mM CHAPS 2.5mM GSH 10% 8.5 62 ++ t : • « · » · · I · » 1 * · 1 • ♦ 1 • % 1 118083 ' 39

Sarja 1 (jatkoa)

No CHAPS/CHAPSO RS-H DMSO DMF pH TGF-β Aktiivisuus 29.)30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 8.5 81-3 ++ 5 30.) 30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 8.5 83-2 ++ 31 .)30mM CHAPS 2.5mMGSH 10% 8.5 82-3 ++ 32. )30mM CHAPSO 2.5mM GSH 20% 9.5 83 ++ 33. ) 30mM CHAPSO 2.5mMGSH 20% 9.5 82 ++ 10 34.) 30mM CHAPSO 2.5mM GSH 20% 9.5 81-3 ++ 35. ) 30mM CHAPSO 2.5mMGSH 20% 9.5 83-2 ++ ; 36. ) 30mM CHAPSO 2.5mM GSH 20% 9.5 82-3 ++ ! RSH: sulfhydryylireagenssi, joka on taulukossa speslfioi-15 tu GSH: pelkistetty glutationi p-Me: β-merkaptoetanoli DMF: dirnetyyliformamidi DMSO: dimetyylisulfoksidi 20 p3: TGF-p3; β2: TGF-p2; β1-3: TGF-βΙ-3-hybridi; β3-2: TGF-p3-2-hybridi; p2-3: TGF-p2-3-hybridi

Aktiivisuus: +: keskinkertainen aktiivisuus in vitro - i ·.·, biomäärityksessä, joka on kuvattu esimerkissä 7 « « · ; 25 ++: korkea aktiivisuus in vitro -biomäärityksessä, joka » ·· I · on kuvattu esimerkissä 7 t 1 » « · • · 9 · • · • 1· « « t .

*

* M

j ; : * • 1 • 99 9 999 9 « · 9 9 9 m . ♦ «·««· • · » « · ; : * 1 1 4 ·«· 9 1 C ♦ 991 Λ 9 9 · 1 · 118083 40

Sarja 2: TGF-p3:n in vitro -laskostus DMS02/CHÄPSissa ja BMP2:n ja (-Ql)BMP-2:n DMSO/CHÄPSissa 5 « ...

No CHAPS GSH DMSO DMSOo pH Proteiini_Aktiivisuus 1. ) 30mM 2.5mM GSH 20% 9.2 BMP-2 + 2. ) 30mM 2.5mM GSH 20% 7.5 (-Q1 )BMP-2 + 3. ) 30mM 2.5mM GSH 20% 8.0 (-Q1)BMP-2 + 10 4.) 30mM 2.5mM GSH 20% 8.5 (-Q1)BMP-2 +

5. ) 30mM 2.5mM GSH 20% 9.0 (-Q1)BMP-2 + I

6. ) 30mM 2.5mM GSH 20% 9.5 BMP-2 + i 7. ) 30mM 2.5mM GSH 20% 9.5 (-Q1)BMP-2 + 8. ) 30mM O.OmMGSH 10% 9.5 83 + 9. ) 30mM 2.5mM GSH 10% 9.5 83 + 20 GSH: pelkistetty glutationi DMSO: dimetyylisulfoksidi DMS02: diraetyylisulfoni BMP-2: BMP-2, jossa on ylimääräinen N-terminaallnen me-

I I

»iJ tioniini * ·’·.· 25 (-Ql)BMP-2: BMP-2, josta puuttuu N-terminaalinen glutamii ö; . ·\ β3: TGF-p3; » » a **. Aktiivisuus: +: TGF-p3 keskinkertainen aktiivisuus in t *.· .**·. vitro -biomäärityksessä, joka on kuvattu esimerkissä 7 • · ♦ 30 tai laskostuneen BMP-2:n ja vastaavasti (-Ql)BMP-2:n muo- „ dostuminen määritettynä joko Y. Takuwan ym. mukaisella in f **· vitro -biomäärityksellä (1991, Biochemical and Biophy- • i * *, sical Research Communication, voi. 174: 96-101, "Bone *i*" Morphogenetic Protein-2 stimulates alkaline phosphatase »*"i 35 activity and collagen synthesis in cultured osteoblastic (·» j cells, MC3T3-E1", tai kromatografialla ja elektroforee- *·/'! silla.

• · # • 4« 118083 41

Mikro-organismien talletus

Seuraavat mikro-organismit on talletettu talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Masche-5 roder Weg lb, D-3300 Braunschweig (Saksa): mikro-organismi talletuspäivä talletusnumero E. coll LC 137/pPLMu.hTGF-pi 28.11, 1989 DSM 5656 E. coll LC 137/pPLMu.hTGF-β2 28.11, 1989 DSM 5657 10 E. coll LC 137/pPLMu.hTGF-β3 28.11, 1989 DSM 5658

Saccharomyces cerevlsiae GRF18 4.3, 1986 DSM 3665 a a • * « t · · : ··* * • · · • · · · . · · · ' • · ♦ * Ψ « · « • · · : :···: * · • a » • • · a • a a a • · • * • · * ·

* a V

• · > m a * • a · a * *

• B

• a **««» • ·

♦ '".'"I

• a* "·.<' • · ····· * aa· • · a a a aa a a a a a ♦ a • aa.

• aa.

• ·

SEKVENSSILISTAUS

42 I

118083 5 (1) YLEISET TIEDOT: (1) HAKIJA:

(A) NIMI: CIBA-GEIGY AG

(B) KATU: Klybeckstr. 141 (C) KAUPUNKI: Basel (E) MAA: SVEITSI ί (F) POSTINUMERO (ZIP): 4002 (G) PUHELIN: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 '····: ij (il) KEKSINNÖN NIMITYS: Uusi menetelmä biologisesti aktii visen dimeerisen proteiinin tuottamiseksi (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 14 (iv) KONEKOODIMUOTO: (A) VÄLINETYYPPI: Levyke (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin julkaisulupa #1.0, versio #1.30 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID N0:1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: ·. (A) PITUUS: 339 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi .· (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen ' . (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

*.1 : (ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA - mRNA

• ♦ ·1 • 1 «

.. : (iii) HYPOTEETTINEN: EI

* · 1 ' ,«·· : J...: (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. coll LC137/pPLMu.hTGF-pl *... (DSM 5656) ····1······..

* (ix) OMINAISPIIRRE: * (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi Γ·.. (B) SIJAINTI: 1..336

*... (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-βΙ" I

·. : : : ** . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:l: ··1·» 1 1 - · · · : 1· : ··· • · « · · : · • · « • · 1

118083 I

GCC CTG GAC ACC AAC TAT TGC TTC AGC TCC ACG GAG AAG AAC TGC TGC 48 I

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys I

1 5 10 15 I

GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG AAG TGG 96 I

Val Arg Gin Leu Tyr He Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp I

20 25 30 I

ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC CTC GGG CCC TGC 144 |l

He His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys I

35 40 45 I

CCC TAC ATT TGG AGC CTG GAC ACG CAG TAC AGC AAG GTC CTG GCC CTG 192 ii

Pro Tyr He Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu . V

50 55 60 - TAC AAC CAG CAT AAC CCG GGC GCC TCG GCG GCG CCG TGC TGC GTG CCG 240

Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 ^ CAG GCG CTG GAG CCG CTG CCC ATC GTG TAC TAC GTG GGC CGC AAG CCC 288 ϊ .· Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro He Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro * : .V: 85 90 95 ·; =:·! • · * · · ·· 1· · . .···, AAG GTG GAG CAG CTG TCC AAC ATG ATC GTG CGC TCC TGC AAG TGC AGC 336 } · · .1’1 Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met He Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser loo 105 no ··# .. V 1 I TGA - 339 • 1 • · • · · · , • · · • · 1 • · » · • . :: t M1 * 1 • · · * · • · ·«· t « · · • 1· 118083 ·ί (2) SEKVENSSIN ID NO:2 TIEDOT: 44 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:2:

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15

Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gin Tyr Ser Lys Vai Leu Ala Leu 50 55 60

Tyr Asn Gin His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Vai Pro 65 70 75 80 ·· " , , Gin Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Vai Tyr Tyr Vai Gly Arg Lys Pro : 1 85 90 95 ► * · ·1 • · ·· V J Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Arg Ser Cys Lys Cys Ser • ·1« * · · ; · ♦ * · · * · I ·..

:T: loo 105 no • '» ’χ • 1 • · • · ·· .

·· · ··· . · · · · Λ * · · · • · - · ····· • m " 1 · · • t : • · ··· « t m Ψ ··· · • · · • «· « · 118083 (2) SEKVENSSIN ID NO:3 TIEDOT: 45 l! •Λ! (±) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 339 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA - mRNA

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. coli LC137/pPLMu.hTGF-p2 (DSM 5657) (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-p2" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:3: GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC 48

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys 115 120 125 CTA CGT CCA CTT TAO ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TGG 96

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 130 135 140 ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC 144 • . ·

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys > *: 145 150 155 160 ; /.*.

* *** * CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG GTC CTG AGC TTA 192 • · · .* *· *ί Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu ·· V : 165 170 175 · • ··· * · * Γ*.. TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT CCT TGC TGC GTG TCC 240 i*;*; Tyr Asn Thr Ile Asn Pro* Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Ser *, * 180 185 190 • .

* » * · ** * ·· CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC TAC ATT GGC AAA ACA CCC 288 • s * * • *, Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro = , *:·*: 195 200 205 • · • i : =: : • AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336 # j '1. Lys Ile Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser • · · * “· 210 215 220 (2) SEKVENSSIN ID NO:4 TIEDOT: - 1 1 8083 ,1

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: H

(A) PITUUS: 112 aminohappoa H

(B) TYYPPI: aminohappo H

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen H

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini I

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:4:

·, M

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys I

1 5 10 15 I

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30 I

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu 50 55 60 . Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Ser * 65 70· 75 80 «f * y.

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro V1 2 3: 85 90 95 • · ♦ 1 5 ** \ : *« ;1 ! Lys Ile Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser loo 105 no ·;.·.· *·· • 1 1 1'

*.1 V

·· * • 1 • ♦ ·· ·1 · • 1 1 * · · • · 1 · -• · .1 ···· ··· ! ,···.

2 * · · · 3 #φ· * · .

• · · • · 1 • 1 ' : 47 (2) SEKVENSSIN ID NO:5 TIEDOT: 118083 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 339 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksiRuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(li) MOLEKYYLITYYPPI: CDNA - mRNA

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. coll LC137/pPLMu.hTGF-p3 (DSM 5658) (ix) OMINAISPIIRRE: i (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi * (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-p3" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:5: GOT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC OGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT 48 4

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 115 120 125 GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG 96

Vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp * 130 '135 140 • « : V: : *·* * GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144 ·. ·*· · .* *· *· Vai His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys * · .. v : 145 150 155 160 • *...* !*·.. CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192 m /·*; Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu 165 170 175 * ·.··/ . : ·.. i, TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GGA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240 • * * · t *. Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Pro . *:·*: 180 185 190 -····' . i : • ** · :: ·*· • · • · * • · • · * * * * · • * 118083 "i 48 CAG GÄC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 195 200 205 AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 336

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 210 : 215 220 7GA (2) SEKVENSSIN ID NO:6 TIEDOT: 339 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini ^ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:61.

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys - 1 5 10 15

Vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys. Trp 20 25 30 j

Vai His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 . 1 1 .....

• 1 1 ; ».**; Ero Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu 50 55 ' 60 ·· ♦ ♦ ···' • Λ m : ♦ · • · ♦ · ,1.t> Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Pro *·;·. 65 70 75 80 .· 1.1 1 e

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Vai Gly Arg Thr Pro • 1 ·: 85 90 95 » · · • · » » < I · • » .1 ' ' . 1!**: Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met Vai Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser • ·' 100 105 110 * l 1 * · a 1 ··♦ e 1 # · ...

• · · * « * 1 1 · (2) SEKVENSSIN ID NO:7 TIEDOT: 118083 ' - -Si 49 > (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 336 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: muu nukleiinihappo (A) KUVAUS: /kuvaus="TGF-pi:n ja TGF-p3:n DNA:n yhdistelmähybridi-DNA" (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: Έ. COli LC137/pPLMu.TGF-pl(44/45)p3 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 1..132 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-pl:n 44 N-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 133..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "ihmisen TGF-p3:n 68 C-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote= "TGF-pi-3-niminen hybridi-TGF-p" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:7: • } ♦ # : .V: GCC CTG GAC acc aac tat tgc ttc agc tcc acg gag aag AAC TGC TGC 48 • · *. ;*·.♦ Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys .* - · .·.: l 5 ίο is *· ’· *. e M» : : ! GTG CGG CAG CTG TAC ATT GAC TTC CGC AAG GAC CTC GGC TGG AAG TGG 96

S

Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp ··*·' 20 25 30 ♦ • . .

• * * *·* ATC CAC GAG CCC AAG GGC TAC CAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144 ϊ^ϊ ϊ Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys *' 35 AO 45 9 · * Ψ m * ··* . i : • ··* ·: - ♦#· ; : » · · • ♦ • * · » ·· 50 i 118083 CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240

Tyr Asn Thr Leu Asn PrO 'Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC 335

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:8 TIEDOT; (I) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA; lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini *: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:8: ·· \ • « ♦ · • * . Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys .1 *·’’· 1 5 10 15 : *: ***** ? *·*.· Vai Arg Gin Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Txp Lys Trp Γ·· 20 25 30 9 · · ft 4 · *· « *· Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys . 35 40 45 ; « * * * ... ϊ *. \l *' ' - - -1 ί .* r Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu Ϊ 4«··· • · · ··· ,···.

• ·· li • * # · · • ft· • * 118083 51 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95

Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 (2) SEKVENSSIN ID NO:9 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 336 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen .

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: nimi nukleiinihappo (A) KUVAUS: /kuvaus="hybridi-TGF-p2-3:ea koodaava yhdistelmähybridi-DNA" (Vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. COli LC137/pPLMu.TGF-p2(44/45)β3 (ix) OMINAISPIIRRE: : . (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi :.··:* (B) SIJAINTI: 1..132 : (D) MUU INFORMAATIO: /tuote* "ihmisen TGF-p2:n *;#<* 44 N-terminaalista aminohappoa" • * • · (ix) OMINAISPIIRRE: : *** (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 133..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote- "ihmisen TGF-p3:n 68 C-terminaalista aminohappoa" « · • ** (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 ·;♦·: (D) MUU INFORMAATIO: /tuote* "hybridi-TGF-p2-3" ··../· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:9: • · · * * « * · * • * '11 • « · * · · • ·

118083 I

GCT TTG GAT GCG GCC TAT TGC TTT AGA AAT GTG CAG GAT AAT TGC TGC 48 I

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys H

1 5 10 15 I

CTA CGT CCA CTT TAC ATT GAT TTC AAG AGG GAT CTA GGG TGG AAA TGG 96 I

Leu Arg Pro Leu Tyr He Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp I

20 25 30 I

ATA CAC GAA CCC AAA GGG TAC AAT GCC AAC TTC TGC TCA GGC CCT TGC 144

He His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys I

35 40 45 I

CCA TAC CTC CGC AGT GCA GAC ACA ACC CAC AGC ACG GTG CTG GGA CTG 192 I

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu .fl

50 55 60 I

TAC AAC ACT CTG AAC CCT GAA GCA TCT GCC TCG CCT TGC TGC GTG CCC 240

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 CAG GAC CTG GAG CCC CTG ACC ATC CTG TAC TAT GTT GGG AGG ACC CCC 288

Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr He Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro V : 85 90 95 • 1 1 • ·1 « 1 :** ; AAA GTG GAG CAG CTC TCC AAC ATG GTG GTG AAG TCT TGT AAA TGT AGC . 336 : ! Lys Val Glu Gin Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser ·· • · * · · • · · '·' 100 105 no • · • ft 1 * • · · • · 1 .

• · · ♦ ····· • · ♦ ·1 I ; • 1 · • 1 1 ; • · • 1 Λ m 1 I 1 » • 1 1 · . ' -/ΐ 118083 ? 53 , il (2) SEKVENSSIN ID N0:10 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 112 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D), TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:10:

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Vai Gin Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15 ;

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Vai Leu Gly Leu 50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Pro ; . . 65 70 75 80 • · -• * * • · . · ··· ···.-- *· *| Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Vai Gly Arg Thr Pro **.* 85 90 95 • · · e·'.···· • * • · ♦ • *.· Lys Vai Glu Gin Leu Ser Asn Met Vai Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser :T: loo 105 no j**·· (2) SEKVENSSIN ID NO:ll TIEDOT: *·· 5·* 1 (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 336 emäsparia ; * (B) TYYPPI: nukleotidi ,*·*; (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen *·,* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • * *“*'t (ii) MOLEKYYLITYYPPI: muu nukleiinihappo * · · • · · • * 118083 54

(A) KUVAUS: /kuvaus»"hybridi-TGF-(33-2:ta koodaava yhdistelmähybridi-DNA

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: E. COli LC137/pPLMu.TGF-p3(44/45)β2 (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 1..132 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote» "ihmisen TGF-p3:n 44 N-terminaalista aminohappoa" (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: kypsä peptidi (B) SIJAINTI: 133..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote» "ihmisen TGF-p2:n 68 C-terminaalista aminohappoa" ; (ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..336 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote» "hybridi-TGF^3-2" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:U: GOT TTG GAC ACC AAT TAC TGC TTC CGC AAC TTG GAG GAG AAC TGC TGT 48

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15 GTG CGC CCC CTC TAC ATT GAC TTC CGA CAG GAT CTG GGC TGG AAG TGG 96

Vai Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp . . 20 25 30 : Φ · • · · • · V·’: GTC CAT GAA CCT AAG GGC TAC TAT GCC AAC TTC TGT GCT GGA GCA TGC 144 • » *.* ; Vai His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys :***: 35 40 45 ··· • · • *· CCG TAT TTA TGG AGT TCA GAC ACT CAG CAC AGC AGG GTC CTG AGC TTA 192 »

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Vai Leu Ser Leu 50 55 60 • * • * · • \ • · · ...

* · * *\ ’ TAT AAT ACC ATA AAT CCA GAA GCA TCT GCT TCT CCT TGC TGC GTG TCC 240 / *:**: Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Vai Ser 65 70 75 80 * · · • * · * ; CAA GAT TTA GAA CCT CTA ACC ATT CTC TAC TAC ATT GGC AAA ACA CCC 288 • 4 * * * Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95 118083 a

AAG ATT GAA CAG CTT TCT AAT ATG ATT GTA AAG TCT TGC AAA TGC AGC 336 I

Lys He Glu Gin Leu Ser Asn Met Ile Vai Lys Ser Cys Lys Cys Ser I

100 105 110 I

(2) SEKVENSSIN ID NO:12 TIEDOT: I

(i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: I

(A) PITUUS: 112 aminohappoa

(B) TYYPPI: aminohappo I

(D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini I

(xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:12: M

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 3 5 10 15

Val Arg Pro Leu Tyr lie Asp Phe Arg Gin Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gin His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 ! « · • · · ...

• ft · ; Tyr Asn Thr He ton Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser ♦ · 65 70 75 80 ] ft · • 1 • •ft • 1 • Gin Asp Leu Glu Pro Leu Thr lie Leu Tyr Tyr He Gly Lys Thr Pro : 85 90 95 • Lys He Glu Gin Leu Ser ton Met He Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 no « · « 1 · 0 « I ί • · 1 · · ' • · • · · ft · • ft ft ft ft ft .

ft ft 118083 56 (2) SEKVENSSIN ID NO:13 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 345 emäsparia (B) TYYPPI: nukleotidi (C) JUOSTEISUUS: kaksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA - mRNA

(ix) OMINAISPIIRRE: (A) NIMI/SELITYS: koodaava sekvenssi (B) SIJAINTI: 1..342 (D) MUU INFORMAATIO: /tuote* "ihmisen luun morfogeneettinen proteiini-2" (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:13: CAA GCC AAA CAC AAA CAG CGG AAA CGC OTT AAG TCC AGC TGT AAG AGA 48

Gin Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 115 120 125 CAC CCT TTG TAC GTG GAC TTC AGT GAC GTG GGG TGG AAT GAC TGG ATT 96

His Pro Leu Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile 130 135 140 GTG GCT CCC CCG GGG TAT CAC GCC TTT TAC TGC CAC GGA GAA TGC CCT 144

Vai Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 145 iso 155 160 * • · • · ·

A A A

• A

.*· ! TTT CCT CTG GCT GAT CAT CTG AAC TCC ACT AAT CAT GCC ATT GTT CAG 192 A · A · .···. Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Vai Gin .Γ* 165 170 175 A A • A»

A

A AA 2 * · ·* * ACG TTG GTC AAC TCT GTT AAC TCT AAG ATT CCT AAG GCA TGC TGT GTC 240

Thr Leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Vai

A A

• *·· 180 185 190 AA· AA·'

A A A A

A ' '

A

A A A · ·

A A

»AA 1,1 i :

A A A A

A A A

A · ' AA A A · A ·

• A A A AA

A · 118083 , 57 CCG ACA GAA CTC AGT GCT ATC TCG ATG CTG TAC CTT GAC GAG AAT GAA 288

Pro Thr Glu Leu Ser Ala lie Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 195 200 205 AAG GTT GTA TTA AAG AAC TAT CAG GAC ATG GTT GTG GAG GGT TGT GGG 336

Lys Vai Val Leu Lys Asn Tyr Gin Asp Met Vai Val Glu Gly Cys Gly 210 215 220 TGT CGC TAG 345

Cys Arg 225 (2) SEKVENSSIN ID NO:14 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN OMINAISPIIRTEET: (A) PITUUS: 114 aminohappoa (B) TYYPPI: aminohappo (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: proteiini (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEKVENSSI ID NO:14: * » • • · « · · • · · • 1 « 1 • · · ♦ * · • · · • 1 p · • · » · * · • ·· • ·1 ♦ 1 1 * 1 1 • 1 • · * · · • # · « · 1 ♦ · · ... ;«< * ··2· * ··1 * : • 1 · ··« ' » 1 • # • · · • · · • ·· 2 • · 58 118083 ϊ

Gin Ala Lys His Lys Gin Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 1 5 10 15 ?

His Pro Leu Tyr Vai Asp Phe Ser Asp Vai Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30

Vai Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45

Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Vai Gin 50 55 60 ί

Thr Leu Vai Asn Ser Vai Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Vai 65 70 75 80

Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 85 90 95

Lys Vai Vai Leu Lys Asn Tyr Gin Asp Met Vai Vai Glu Gly Cys Gly . . 100 105 110 - • * * * *.· *· " Cys Arg s * · · • · * ♦ ··· • · « · ···''' t * * · * • *· * · » a a a • * • · • a • a · • »«· « · * • φ · * y • · t ; ······ • t · a 9 · • · * a # · ' ,> a · • · a • ·· • a

Claims (25)

1. Menetelmä dimeerisen biologisesti aktiivisen transformoivan kasvutekijän tyyppi β:η (TGF-p:n) kaltaisen prote- 5 iinin tai sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että mainitun TGF-p:n kaltaisen proteiinin denaturoitua monomeeristä muotoa käsitellään laskostuspuskurilla, joka sisältää laimeaa detergenttiä, joka sallii monomeerisen TGF-βιη kaltaisen proteiinin laskostumisen avaruusraken-10 teeseen, joka dimerisaation jälkeen liittyy biologiseen aktiivisuuteen, samalla kun mainittu monomeeri säilyy liu koisessa muodossa, ja orgaanista liuotinta, joka on DMS0:ta, DMS02:ta, DMF:ää tai jotakin kahden tai kolmen edellisen seosta. 15 »

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa puskuri sisältää lisäksi pelkistintä. ' .i

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa 20 laimea detergentti on digitoniinia, CHAPSia, CHAPSOa tai jotakin näiden seosta.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, jossa laimea * · V i detergentti on CHAPSia, CHAPSOa tai jotakin näiden seos- t/.j 25 ta. • · . t · « % · • * Γ":

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa • · ·*·,. laimea detergentti on laskostuspuskurissa noin 1-100 mM:n konsentraationa. ♦ ♦ * 30 ..

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa I #· *... laimea detergentti on laskostuspuskurissa 30-60 mM:n kon- • · * *·* * sentraationa. i • · · · * • · Γ**: 35

7. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa • · « laimea detergentti on laskostuspuskurissa 30 mM:n konsent *;·** raationa. * · · • · · » · ‘ 60 118083 :

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa orgaaninen liuotin on DMS0:ta, DMS02:ta tai DMF:ää.

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa 5 orgaanista liuotinta käytetään noin 5-40 %:n konsentraationa.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa orgaanista liuotinta käytetään noin 10-30 %:n konsentraatio 10 na.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa DMS0: ta käytetään noin 10-30 %:n konsentraationa.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa DMSO: ta käytetään noin 30 %:n konsentraationa.

13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa ^ DMF:ää käytetään noin 10-30 %:n konsentraationa. 20

14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa DMF:ää käytetään noin 10 %:n konsentraationa.

• * ·.· * 15. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa « · s.*·; 25 DMS02:ta käytetään noin 10 %:n konsentraationa.

• · ♦ » * » * » · {**’: 16. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, jossa • · * **·„ DMS0:n ja DMF:n seosta käytetään noin 10-30 %:n konsent- ψ raationa liuottimien seoksesta laskettuna. « « · * 30 ..

17. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa *... TGF-βιη kaltainen proteiini on TGF-p2, TGF-p3, hybridi- *** TGF-pl-2, hybridi-TGF-pi-3, hybridi-TGF-p2-3, hybridi- *:*·: TGF-P3-2 tai BMP-2. Γ’: 35 • M .I.#

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, jossa TGF- • ♦ p:n kaltainen proteiini on TGF-p3. » · · 118083

19. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa puskurin pH on noin 6-10.

20. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jossa 5 puskurin lämpötila on noin 0 °C:sta noin 40 °C:seen.

21. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa pelkistin on pelkistetty sulfhydryyliyhdiste.

22. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa pel kistetty sulfhydryyliyhdiste on glutationi pelkistetyssä muodossaan, β-merkaptoetanoli pelkistetyssä muodossaan, merkaptometanoli pelkistetyssä muodossaan, kysteiini, kys teamiini tai ditiotreitoli pelkistetyssä muodossaan. 15

23. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa pelkistettyä sulfhydryyliyhdistettä käytetään noin 1-100 mM:n konsentraationa.

24. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa pel kistettyä sulfhydryyliyhdistettä käytetään noin 1-10 mM:n konsentraationa. • · * * Y]

25. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, jossa pel- *· ' 25 kistettyä sulfhydryyliyhdistettä käytetään noin 2,5 mM:n • · 9. f *, ! konsentraationa. * · · • f • * • * * 4 « : \. * • · » • « · 1« : ♦ » * « • · · · , • · · .·-.···.· « * • * #«··» • * · * : • · « ·*·' 0·ψ • · • · · ♦ 99 9 · 118083