【発明の詳細な説明】
生物学的に活性な二量体型タンパク質の製造のための新規の方法
本発明は生物学的に活性な二量体型 TGF−β (β型トランスフォーミング増殖
因子) 様タンパク質の調製のためのフォルディング方法に関する。
発明の背景
TGF−β様タンパク質、即ち、 TGF−β超科は胎芽の発育又は組織の再生の如
き数多くの生物学的調節経路における中心的な役割を果たす。これらは非常に有
能な生物学的因子であり、それらは多種多様の目的のために治療的にも利用され
うる。 TGF−β超科の最も良く知られる構成員は TGF−βそれ自体である。
TGF−βは当初ヒト血小板、ヒト胎盤及びウシの腎臓から均質となるまで精製
され、そして約25,000Daの分子量を有するホモ二量体型タンパク質と同定されて
いる。最初は、未形質転換NRK 細胞の定着非依存性増殖を誘導するようにEGF 又
は TGF−αと相乗的に作用できる能力により特徴付けられたが、最近になり、 T
GF−βが多種多様な正常及び新生細胞の双方に対して莫大な調節作用を発揮する
ことが示され、細胞活性の多機能調節因子としてのこのタンパク質の重要性が示
唆されるようになった。細胞又は組織のタイプ、並びにその他の増殖因子の有無
に依存して、 TGF−βは有系分裂、細胞増殖及び成長を刺激しうるか、又はこれ
らの過程を効率的に阻害しうるか、又はその他の作用、例えば脂質生成、筋発生
、軟骨形成、骨形成及び免疫細胞機能の調節、化学走性の刺激、又は分化の誘導
もしくは阻害を発揮しうる。TGF−βの多くの作用は細胞又は組織
のストレス又は負傷に対する応答性及びその結果としての損傷の修復に関連する
。炎症発生の後、 TGF−βは顆粒組織の形成に主要たる役割を果たし、フィブロ
ネクチン、コラーゲン及び数種のプロテアーゼインヒビターの如き細胞外マトリ
ックスの形成に関与する遺伝子の発現性を増大させ、そしてフィブロプラストに
よるコラーゲン−マトリックス収縮を刺激し、従って接続組織の収縮における役
割の可能性が示唆される。
TGF−β1, TGF−β2, TGF−β3, TGF−β4及び TGF−β5と命名された5種
類の機能的且つ構造的に近縁する TGF−βが今までに述べられている。
TGF−βは全て 390〜412 個のアミノ酸前駆体として合成され、これはC末端
側の 112個のアミノ酸より成る成熟形態となるようにタンパク質分解を受ける。
その成熟生物活性形態においては、 TGF−βはそれぞれ 112個のアミノ酸の2本
のポリペプチド鎖の酸性及び熱安定性ジスルフィド連結型ホモ二量体である。ヒ
トの TGF−β1(Derynck,R.ら (1985) Nature 316,701-705)、ネズミの TGF-
β1 (Derynck, R. ら (1986) J. Biol. Chem. 261, 4377-4379) 及びサルの TGF
-β1 (Sharples,K.ら (1987) DNA 6,239-244) の完全アミノ酸配列は著しい
配列保存性を示し、1個のアミノ酸残基のみで相違する。ヒト TGF−β1、ヒト T
GF−β2(de Martin, R. ら (1987) EMBO J. 6, 3673-3677;Marquardt, H. ら (
1987) J.Biol.Chem.262,12127-12131)及びヒト TGF−β3 (Ten Dijke,P.
ら (1988) PNAS 85,4715-4719) のアミノ酸配列の対比はこれら3種のタンパク
質がその成熟形態において約70〜80%の配列同一性を示すことが実証されている
。ヘテロ二量体型 TGF−β1,2がブタの血小板から単離されており、そして TGF
−β2の1個のサブユニットにジスルフィド連結した TGF−β1の1個のサブユニッ
トより成る (Cheifetz,S.ら (1987) Cell 48,409-415) 。
最近、様々な治療方式において試験できるよう十分な量で得るために TGF−β
を、天然起源 (例えば血小板) からこれらの因子を単離するのではなく、組換技
術を介して製造すること狙いとする試みがなされている。しかしながら、生物学
的に活性な組換 TGF−βを得ることが非常に難しいことが実証された。配列表に
おいてSEQ ID No.1〜6で示す表配列からわかる通り、 TGF−β1, TGF−β2及び
TGF−β3の成熟形態を含む 112個のアミノ酸は9個のシステイン残基を含む。 T
GF−β2に関して示されている通り、この9個のシステイン残基は4本の分子内及
び1本の分子内ジスルフィド結合を形成している[Schlunegger,M.P.and Grue
tter,M.G.,Nature 358:430-434 (1992)]。 TGF-βの異種発現は、適正な一
次構造は有するものの、適正な二次又は三次構造となるように適正にフォルディ
ングせず、従って生物活性を欠いた生成物を招きうる。
天然 TGF−β分子の複雑さを考慮すると、関連の TGF−β遺伝子をより高等な
生物より誘導された細胞の中で発現せしめることが好都合と一般に考えられる。
組換 TGF−β2の発現は真核系において達成されうるが、得られる生物学的に活
性な適正にフォルディングされた物質の収量は満足たるものからかけ離れている
。
従って、微生物宿主において生物活性 TGF−βを製造する試みがなされている
。しかしながら、例えば細菌においては、その細胞内条件は適正なフォルディン
グ、ジスルフィド結合形成及びジスルフィド安定化二量体であって活性にとって
明らかに本質的な事象を誘導するようなものではない。即ち、ヨーロッパ特許出
願EP-A-0,268,561に記載の如き、ラムダプロモーターのコントロール下でのE. コリ
(E .coli)における関連遺伝子の発現ではごくわずかな生物活性 TGF−βし
か得られない。別の報告には、trp プロモーターのコ
ントロール下でのE.コリにおける TGF−β cDNA の発現が記述され、SDS ポリ
アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにおいて13,000Daの見かけ上の分
子量を有する放射能ラベルされたタンパク質バンドが生み出されているが、しか
し活性は全く測定されなかった(Urushizaki,Y.ら (1987) Tnmor Res.22,41-
55)。
組換タンパク質が細菌 (例えばE.コリ) 発現系において高レベルで産生され
るとき、それらは往々にして封入体又はリフラクチル体 (R体) と呼ばれる高度
に不溶性の細胞内沈殿物の形態で認められ、これらは位相差顕微鏡のもとで細胞
の囲い内で見える輝点として認識されうる。可溶性細菌タンパク質から容易に分
離できうるこれらの封入体は、その天然の対応物の機能活性を発揮せず、それ故
商品としての価値のないほとんど変性及び還元された形態の組換タンパク質を含
む。従って、組換リフラクチル−タンパク質は、それをその変性形態に保つのに
適当な条件下で可溶化し、次いで変性したほどけ形態から適正な機能的に活性な
三次元構造へと転移させるためにフォルディングさせるべきであることが一般的
に同意され、そのコンホメーションは比較的弱い原子価力、例えば水素結合、疎
水性相互作用及び帯電相互作用により安定化されるものである。システイン含有
タンパク質の場合、このプロセスはジスルフィド結合の形成も包括しうる。ジス
ルフィド結合の形成を化学的に促進せしめる場合、不適正な分子内結合の形成を
、そして二量又は多量体型タンパク質の場合、分子間結合が阻止又は最小限化さ
れるべきであり、その理由は所望されない不適正にフォルディングされた異性体
は不均一な物質をもたらし得、それ故所望の構造を有するタンパク質の更なる精
製を複雑にするか、又は低い活性を有するタンパク質をもたらしうるからである
。
タンパク質のフォルディングは通常強力な変性条件下でのタンパ
ク質の可溶化、その後のタンパク質のフォルディングを可能にするためのカオト
ロピズム濃度の低下を含んで成る多段式プロセスにおいて実施される。しかしな
がら、かかる手法は TGF−βのフォルディングにおいて失敗している。ヨーロッ
パ特許出願EP-A-0,433,225において、生物活性二量体型 TGF−β様タンパク質の
製造について成功を収めた方法が記載され、それにおいては界面活性剤がフォル
ディングバッファーの中に入ったまま TGF−β様タンパク質のフォルディングを
可能にする温和な界面活性剤を使用している。
従来技術(Tam ら、J.Am.Chem.Soc.113 :6657-6662,1991)よりわかる通
り、ペプチドの中でのジスルフィド結合の選択的且つ効率的な形成を促進するた
めにジスルフィドスルホキシド (DMSO) が使用できうる。この方法は選択的であ
り、即ち副反応がなく、そして広いpH域が適用されうる。しかしながら、適正な
ジスルフィド結合の形成は約30個のアミノ酸までのペプチドにしか、示されてい
ない。別の公開物 (Bentleら、米国特許第4,731,440 号) において、ジメチルス
ルホン又はジメチルスルホンと尿との混合物が封入体からのソマトトロピンの可
溶化のために使用されている。この可溶化タンパク質はこのタンパク質のジメチ
ルスルホン含有溶液を温和な酸化剤と接触させることにより再生されうる。
驚くべきことに、 TGF−β様タンパク質のフォルディングのために温和な界面
活性剤を利用する方法は、ジメチルスルホキシド (DMSO) 、ジメチルスルホン (
DMSO2) 又はジメチルホルムアミド (DMF) を添加することにより改良できうるこ
とがこの度発見された。
発明の目的
本発明の目的は生物活性二量体型 TGF−β様タンパク質をその変性又はそうで
なければ非天然形態から作り出すための改良方法を提
供することにある。目的は、そのタンパク質の単量体を、 (a) 温和な界面活性
剤、並びに (b) DMSO,DMF もしくはDMSO2、又はDMSO,DMSO2及びDMF より成る
群のうちの2もしくは3種の混合物を含んで成るフォルディングバッファーで処理
したとき、大量の所望の二量体型生成物が予測し得なかった収量において生成さ
れるという予測し得なかった発見により達成される。
発明の詳細な説明
本発明はβ型トランスフォーミング増殖因子 (TGF−β) 様タンパク質の二量
体型生物活性タンパク質の製造のための改良方法に関し、この方法は TGF−β様
タンパク質を (a) TGF−β超科のタンパク質のフォルディングを可能にする温
和な界面活性剤と (b) DMSO,DMF 及びDMSO2並びにDMSO,DMSO2及びDMF より成
る群のうちの2又は3種の任意の混合物より成る群から選ばれる有機溶媒とを含ん
で成るフォルディングバッファーで処理することを含んで成る。
本発明に関する「 TGF−β−様タンパク質」は以下の TGF−β超科の構成員 (
これは「 TGF−β様タンパク質」なる語にも属する) の単量体のアミノ酸配列の
少なくとも一つに対して75%以上の相同性を有する配列をその単量体において有
するタンパク質を意味する:
TGF−β1, TGF−β2及び TGF−β3; BSC−1サル腎細胞のコンディンショニ
ング培地から単離された増殖インヒビター (即ち、ポリエルギン;Holley,R.W
.ら (1980) PNAS 77,5989-5992;Ristow,H.J. (1986) PNAS 83,5531-5533
) ;ニワトリの胚芽軟質細胞由来の TGF-β4 (Jackowlew,S.B.ら (1988) Mole
cular Endocrinology 2,1186-1195) ;アフリカツメガエル由来の TGF−β5 (K
ondaiah,P.ら (1990) J.Biol.Chem.265,1089-1093) ; T
GF−β−関連インヒビン及びアクチビン (卵胞刺激ホルモンの下垂体分泌を調節
する性腺タンパク質) ;Mullerian 阻害物質 (MIS;これは雄の哺乳動物胎児に
おけるミュラー管の発育を阻害する) ;骨形態発生タンパク質 (BMP、軟骨及び
骨の形成の誘導に関与するポリペプチド群;今日知られるこの群の構成員は BMP
−2, BMP−3, BMP−4, BMP−5, BMP−6, BMP−7, BMP−8及び BMP−9であ
る) ;ショウジョウバエのデカペンタプレジック (decapentaplegic) 遺伝子複
合体由来の転写体 (dpp、これはハエ胎芽の形態発生のコントロールを担う) ;V
g−1 (アフリカツメガエル転写体の産物であり、卵母細胞の植物極に存在する)
;並びにVgr−1、即ちVg-1関連哺乳動物遺伝子 (Mason,A.ら (1986) Biochem
.Biophys.Res.Commun.135,957-964 ;Cate,R.ら (1986) Cell 45,685-69
8;Wozney, J. M. ら (1988) Science 242, 1528-1534;Padgett, R. ら (1986)
Nature 325, 81-84 ;Weeks, D. L. and Melton, D. A. (1987) Cell 51, 861-
868;Lyons, K. ら (1989) PNAS 86,4554-4558) 。
「 TGF−β−様タンパク質」の意味の中に含まれるのは種々の TGF−β様タン
パク質のサブユニット、又はこの親分子の生物活性の一部又は全部を保持してい
る上記のタンパク質のフラグメント又は突然変異体を含むヘテロ二量体である。
好適な意味において、本明細書における「 TGF−β−様タンパク質」なる語は
TGF−β超科の任意のタンパク質を意味する。より好適な意味において、これは
以下の TGF−β超科のタンパク質より成る群から選ばれるタンパク質を意味する
:哺乳動物起源、例えばサル、ネズミ、ブタ、ウマ又はウシの TGF−β1, TGF
−β2及び TGF−β3並びに 112個づつのアミノ酸の2種類のサブユニットより成
るヘテロ二量体型 TGF−β、並びに TGF−βのフラグメント及び
突然変異体、例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子
; BSC−1サル腎細胞のコンディショニング培地から単離された増殖インヒビタ
ー (即ち、ポリエルギン) ;ニワトリ胚芽軟質細胞由来の TGF−β4;アフリカ
ツメガエル由来の TGF−β5; TGF−β関連インヒビン及びアクチビン (卵胞刺
激ホルモンの下垂体分泌を調節する性腺タンパク質) ;Mullerian 害物質 (MIS
;これは雄の哺乳動物胎児のミュラーの発育を阻害する) ;骨形態発生タンパク
質 (BMP;軟骨及び骨の形成の誘導に関与するポリペプチドの群;今日知られる
この群の構成員は BMP−2, BMP−3,BMP−4, BMP−5, BMP−6, BMP−7, BM
P−8及び BMP−9) ;ショウジョウバエのデカペンタプレジック遺伝子複合体の
転写体 (dpp;これはハエ胎芽の形態発生のコントロールを担う) ;Vg−1 (アフ
リカツメガエル転写体の産物;これは卵母細胞の植物極に存在する) ;並びに V
gr−1、即ち、Vg−1関連哺乳動物遺伝子。「 TGF−β様タンパク質」の意味の中
に更に含まれるのは種々の TGF−β様タンパク質のサブユニットを含むヘテロ二
量体、又はその親分子の生物活性の一部又は全てを保持する上記のタンパク質の
フラグメント又は突然変異体である。
より好ましい TGF−β様タンパク質は、 TGF−β1, TGF−β2, TGF−β3、
ヘテロ二量体型 TGF−β、 TGF−βのフラグメント又は突然変異体、例えばそれ
ぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子、BMP、インヒビン及び
アクチビンから選ばれる。より好ましいのは、 BMP−2, TGF−β1, TGF−β2
及び TGF−β3、並びにそのヘテロ二量体並びにフラグメント及び突然変異体、
例えばそれぞれの TGF−βの一部が入れ替っているハイブリド分子、好ましくは
以降に定義するハイブリド TGF−β1−3、ハイブリド TGF−β2−3もしくは TGF
−β3−2又は TGF−β1−2
であって、N−からC−末端の順序で、ヒト TGF−β1のN末端側の44個のアミ
ノ酸及び TGF−β2のC末端側の68個のアミノ酸より成るものである。更により
好ましいのは配列表の中でSEQ ID No.1,3,5,7,9又は11に示すアミノ酸配列
を有するものである。最も好適な TGF−β様タンパク質は TGF−β3である。
BMP−2なる語は、同一の生物活性を有する BMP−2の変異体も含む。かかる変
異体は例えば実施例において製造したもの、即ち、追加のN末端メチオニンを有
するSEQ ID No.13の BMP−2及びN末端アミノ酸Gln を欠くSEQ ID No.13の BMP
−2である。
本発明の目的のための TGF-βの生物活性は、
−線維芽細胞に対する TGF−βの細胞移動促進活性 (Postlethwaithe, A. E. ら
(1987) J. Exp. Med. 165, 251 ;Burk, R. (1973) PNAS 70,369に従って改
良) ;
−ヒトA375 黒色腫細胞の増殖に対する TGF−βの阻害作用 (Brown,T.J.ら
(1987) J.Immunol.139,2977) ;
−CCL-64細胞DNA 合成阻害アッセイ (Graycar,J.L.ら (1989) Molecular End
ocrinology 3:1977-1986) 又は
−以降の実施例に記載の連続ミンクの肺上皮細胞系Mv−1−Lu (ATCC/CCL64)の
増殖の阻害;
のいづれかとして規定する。
任意の起源又は方法に由来する単量体型 TGF−β様タンパク質は本法に従って
対応の二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質へとフォルディングされうる。例
えば、 TGF−β様タンパク質の単量体は天然起源に由来するか、又は当業界公知
の方法により組換DNA 技術を介してもしくは合成的に製造されうる。単量体が夾
雑物に原因してin vitroフォルディングに適さない場合、可溶化及び変性化単量
体をクロマトグラフィーにより、例えばSephacryl S-100 HRの如き
でのサイズ排除クロマトグラフィーにより精製できうる。
フォルディングされる前に、この単量体型 TGF−β−様タンパク質は変性 (即
ち、ほどけ) 可溶化形態において存在していなくてはならない。タンパク質を効
率的に変性及び溶解できるのは当業界に公知のいわゆるカオトロピック剤であり
、これは水性溶液で、且つ適当な濃度で、対応のタンパク質の立体形状をその表
面の改変を通じて、即ち水和状態、溶媒環境又は溶媒−界面相互作用の変化を通
じて変化させるものである。かかるカオトロピック剤又は変性剤の例には尿素、
グアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム (約4〜約9Mの濃度域) 、及び界面
活性剤、例えばSDS (これは0.01〜2%程度の濃度で添加) が含まれる。また、 T
GF−β様タンパク質を含む水性溶液の約2〜約4のpHに至る、例えば低分子量脂肪
族有機酸、好ましくは2,3又は4個のC原子を有するかかる酸、より好ましくは
酢酸による酸性化、並びに例えばpH10以上の塩基性条件、更には高温が、単量体
の変性及び可溶化をもたらすであろう。
次いでこの単量体を、生物活性二量体の回復を可能にする「フォルディング条
件」にかける。「フォルディング条件」とは、その条件下で分子内及び分子間ジ
スルフィド結合の形成が促進され、そしてその変性単量体が生物活性に係るコン
ホメーションを帯びるようにする条件をいう。このプロセスはこの単量体の一次
構造 (即ち、アミノ酸配列) の任意の変化には関与しないが、生物活性に結びつ
く二量体型生成物の三次元コンホメーションの形成には関連する。このプロセス
はジスルフィド結合の形成、及び二量体型生物活性構造への単量体の会合を含む
。
この目的のため、変性単量体を (a) 以降に定義する温和な界面活性剤と、 (
b) DMSO,DMF,DMSO2、並びにDMSO,DMSO2及びDMF より成る群のうちの2又は3
種の任意の混合物より成る群から選ば
れる有機溶媒とを含んで成るフォルディングバッファーで、中性又はアルカリ性
のpH及び妥当な温度、例えば約0℃〜約40℃において処理する。好適なpHは約7〜
約10、DMSOの場合は約pH9〜9.5 がより好ましく、DMF の場合は約pH8.5 が好ま
しく、そしてDMSO2の場合は約pH9.5 が好ましい。
本発明に従うフォルディングのために利用されうる慣用のバッファー系はpH6
〜10において十分な緩衝能を供するバッファーである。タンパク質のフォルディ
ングに対して阻害作用を有さない全てのバッファーが本発明において適用可能で
ある。例えば、適当なバッファーはトリス−、ビス−トリス、又はピペラジンバ
ッファーである。これらのバッファーは更に、所望するなら塩、及び所望するな
ら塩基性アミノ酸を含みうる。
フォルディングバッファーにおいて利用できうる塩は、例えば3Mに至る濃度
のNa+,Li+,K+,NH4 +,Mg+,Ca2+もしくはMn2+と、Cl-,F-,Br-,J-,HCO3 -
,SO4 2-、リン酸、酢酸、シアン酸もしくはロダン酸との塩、又はその他のアル
カリ金属−もしくはアルカリ土類金属−ハロゲンもしくは偽ハロゲン化合物であ
る。1〜2Mの濃度のNaClが好ましい。
フォルディングバッファーの中に使用できる塩基性アミノ酸は例えば好ましく
は 0.5Mの濃度のアルギニンである。
本発明の目的のためのDMSO,DMSO2又はDMF の好適な濃度は約5%〜約40%、よ
り好ましくは約10%〜約30%である。DMSOの更に好ましい濃度は約10%〜約30%
、より好ましくは約20%である。DMF に関しては、更により好ましい濃度は約10
%〜約30%、より好ましくは約10%である。DMSO2に関しては、更により好まし
い濃度は約10%である。DMSOとDMF との混合物、DMSOとDMSO2との混合物、又はD
MF とDMSO2との混合物は、合わせた溶媒に関し、約5%〜約40
%、好ましくは約10%〜約30%、より好ましくは約10%〜約20%の濃度において
使用されうる。
本発明に係る TGF−β超科のタンパク質のフォルディングに適する温和な界面
活性剤は単量体型 TGF−β様タンパク質を立体コンホメーションであって、二量
化後に生物活性に結びつくコンホメーションにフォルディングさせ、しかもこの
単量体を可溶形態に保つ任意の界面活性剤である。
かかる界面活性剤は非イオン性、カチオン性、アニオン性又は双イオン性であ
ってよい。好適な界面活性剤は非イオン界面活性剤ジジトニン、そしてより好ま
しくは双イオン性界面活性剤3− (3−クロラミドプロピル) ジメチルアンモニオ
−1−プロパンスルホネート(CHAPS)及び3− (3−クロラミドプロピル) ジメチル
アンモニオ−2−ヒドロキシ−1−プロパンスルホネート (CHAPSO) である。界面
活性剤の混合物、例えばCHAPS とCHAPSOとの混合物を使用することも可能である
。温和な界面活性剤はフォルディングバッファーの中に約1〜100mM の濃度、よ
り好ましくは30〜60mMの濃度、更により好ましくは30mMの濃度で主として存在す
る。
本発明の好適な態様において、このフォルディングバッファーは更に還元物質
を含む。タンパク質又はペプチドのジスルフィド結合性を高める適当な還元物質
は例えば還元型のグルタチオン、還元型のジチオスレイトール、還元型のβ−メ
ルカプトエタノール、還元型のメルカプトメタノール、システイン及びシステア
ミンより成る群から選ばれる低分子量スルフヒドリル試薬である。適当な濃度は
例えば約1〜100mM、好ましくは約1〜約10mM、より好ましくは約2.5mM である。
フォルディングは妥当な温度、例えば約0〜約40℃、好ましくは約4℃で、妥当
な時間、例えば約2〜約 720hかけて行う。フォル
ディングの時間は利用する温度に依存するため、温度を任意の所望のフォルディ
ング時間のために最適化し得、そしてその逆も真なりである。
本発明に係る二量体型生物活性 TGF−β様タンパク質の製造は一段手順で実施
し得、それにおいては前記タンパク質の単量体をフォルディングバッファーに移
し、そしてその反応混合物を例えば2時間から7日以上の期間、例えば0℃〜40℃
の温度、好ましくは4℃において、フォルディング及び二量化を連続的に行いな
がらインキュベートする。フォルディング反応の際のタンパク質濃度はかなり重
要であり、その理由は、高すぎてしまうと、単量体は著しく凝集してしまい、所
望されないほど高次元のオリゴマーの形成が起きてしまうからである。タンパク
質濃度が約2mg/ml未満であると、二量体型生成物の最終収率は高まり、0.01〜
0.5mg/mlの濃度域が好ましい。
TGF−β3のフォルディングに関する本発明に従うフォルディング実験の好適な
例は以下の通りである:
0.1mg /mlの TGF−β3;
100mM のトリス;
任意的に還元型のグルタチオン、システイン、システアミン及びβ−メルカプ
トエタノールより成る群から選ばれる1〜50mMの物質 (しかしながら、上述の通
り、本法はシスルヒドリルレドックス系抜きでも有効である) ;
1MのNaCl;
0.5Mのアルギニン;
20〜30%のDMSO;
30mMのCHAPS 又はCHAPSO;
pH9〜9.5 ;
又は
0.1mg /mlの TGF−β3;
100mM のトリス;
還元型のグルタチオン、システイン、システアミン及びβ−メルカプトエタノ
ールより成る群から選ばれる2.5mM の物質 (しかしながら、上述の通り、本法は
シスルヒドリルレドックス系抜きでも有効である) ;
1MのNaCl;
0.5Mのアルギニン;
10%のDMF ;
30mMのCHAPS 又はCHAPSO;
pH8.5。
フォルディング後、生物活性二量体を精製し、不完全にフォルディングした T
GF−β様タンパク質、並びに不純物、特にこのポリペプチドを微生物宿主細胞に
おいて製造するときに調製品の中に存在しうるパイロジェン又はその他の内毒素
を除去する。二量体の分離はクロマトグラフィー、例えばサイズ排除クロマトグ
ラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィ
ー (例えばMono Sカラム上) 、及び逆相HPLCにより行う。
本発明は更に、本発明の方法に従って製造した二量体型生物活性 TGF−β様タ
ンパク質に関する。これらの TGF−β様タンパク質は様々な治療方式に利用でき
る。
以下の実施例は本発明の例示であり、限定するものではない。実施例1:E.コリの中での TGF−β1, TGF−β2及び TGF−β3の発現 実施例1A:一般方法 細菌株:
−E.コリK12/LC 137:htpRam,lonR9,lacam,malam,trpam,Phoam,rspL
,tsx::Tn10 ,supCts(Goff,S.A.ら (1984) PNAS 81,6647-6651)。プラスミド:
−pPLMu (Buell,G.ら (1985) Nucleic Acids Res.13,1923-1938) :このプ
ラスミドはファージMu ner遺伝子リボソーム結合部位をもつバクテリオファージ
λPLプロモーターを担持する (Van Leerdam,E.ら (1982) Virology 123,19-
28)。
−pcl857:熱不安定性λCL857レプレッサーをコードし、且つカナマイシンに対
する耐性を授けるプラスミド (Remault,E.ら (1983) Gene 22,103-113) 。SDS −ゲル電気泳動:
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 及びタンパク質染色はBIORA
D由来のMiniprotean IIセル及び厚さ1mmの18%のポリアクリルアミドゲルを利用
して既に説明されている通り(Laemmli,U.K. (1970) Nature 227,680-685)に
実施する。熱誘導:
40μgづつのアンピシリン及びカナマイシン(LB/amp /kan)を含む20mlの培
養チューブ中の7mlのLB−培地 (Maniatisら (1982) ,Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory,New York) に単一のコロニーを接種し、そして振
盪しながら一夜30℃でインキュベートする。この一夜培養物5mlを100ml のエー
レンマイヤーフラスコ中の15mlのLB/amp /kan に加える。このフラスコを42℃
の浴槽シェーカーに移す。移す前に2mlのサンプルを取り (非誘導条件) 、そし
て移してから1時間間隔で1mlづつのサンプルを取る (誘導条件) 。細胞を遠心分
離 (5min ;10,000rpm ;エンペンドルフ遠心機で) によりペレット化し、そし
て上清液を捨てる。この
ペレットをSDS-PAGE用の100 μlのサンプルバッファーに再懸濁し、そして95℃
で10min 加熱する。5μlのアリコートをSDS-PAGEに載せる。コンピテント細胞の調製:
コンピテントE.コリ細胞はManiatisら (1982) ,Molecular Cloning,Cold
Spring Harbor Laboratory,New Yorkに記載の塩化カルシウム手順により調製す
る。プラスミドpcl857を担持する細胞を30℃で増殖させる。実施例1B:発現ベクターpPLMu.hTGF−β1,pPLMu.hTGF−β2及びpPLMu.hTGF− β3の構築並びにTGF−β1, TGF−β2及び TGF−β3の発現
TGF−β1, TGF−β2及び TGF−β3それぞれのコード配列 (配列表に示す) を
NcoIで消化しておいたプラスミドPGem-5ZF(+)(Promega)の中にクローニングし
、仔牛小腸アルカリ性ホスファターゼ (Boehringer) で脱リン酸化し、そしてク
レノウポリメラーゼ (Gibco-BRL) で補完 (フィル・イン) する。得られる構築
体をpGKM 125 (TGF−β1) ,pGKM 740 (TGF−β2) 及びpGKM 126 (TGF−β3) と
命名し、そしてコンピテントE.コリY1090細胞を形質転換するのに用いる。TG
F−β1, TGF−β2及び TGF−β3をコードする適正なインサートを担持するクロ
ーンをそれぞれE.コリY1090/pGKM 125(TGF−β1),E.コリY1090/pGKM 7
40(TGF−β2)及びE.コリY1090/pGKM 126(TGF−β3)と命名する。
E.コリY1090/pGKM125,E.コリY1090/pGKM 740及びE.コリY1090/p
GKM 126細胞をLB培地の中で増殖させ、そしてプラスミドDNA をBirnboim,H.C
.及びDoly,H. (1979) Nucleic Acids Research 7,1513の方法により調製す
る。5μgのプラスミドDNA を50μl制限バッファーの中で、NcoIとSalI(pGK
M 125), Nco
IとEcoRV(pGKM 740)又は NcoI単独(pGKM 126)のいづれかで、供給者 (Boehri
nger) の推奨に従って完全に切断する。DNAを5μlの3Mの酢酸ナトリウム、100
mM のMgCl2,5mMのEDTA及び 150μlのエタノールの添加により沈殿させる。−7
0℃で15分インキュベートした後、DNA をSorvall 遠心機の中のSS34ローターに
おいて13,000gで15分の遠心によりペレットにする。上清液を捨て、そしてペレ
ットを0.25%のブロモフェノールブルー及び0.25%のキシレンシアノールを含む
80μlの 0.089Mのトリス:ポレート、 0.089Mの硼酸及び 0.002MのEDTA(TBE
バッファー) の中に再懸濁する。20μlのサンプルを4回、 0.5μg/mlのエチ
ジウムブロミドを含むTBE バッファーの中で1%のアガロースゲルを通じて50ボ
ルトにおいて、ブロモフェノールブルーマーカーが長さ10cm厚さ0.8cm のゲルの
底に達するまで電気泳動させる。成熟 TGF−β1, TGF−β2及び TGF−β3それ
ぞれをコードするDNA フラグメントを短波UV光
Biotrap 装置の中で200mamp を1.5 時間適当にゲル断片から電気溶出させる。溶
出したDNA フラグメントを沈殿させ (前記参照) 、そして20μlTEに再懸濁する
。
5μlのプラスミドpPLMu を NcoIと SalI, NcoIとEcoRV、又は NcoI単
独のいづれかでの消化により線状化し、そしてフラグメントDNA について前述し
た通りにゲル精製する。100ng の線状化且つ精製したpPLMu ベクターDNA 及び3
倍モル当量の対応の精製フラグメントDNA を4℃で15時間、1単位のDNA リガーゼ
(Boehringer) を含む20μlのライゲーションバッファー (70mMのトリス/HCl
,pH7.5,10mMのMgCl2,5mMのDTT ,0.1mM のアデノシン−シリン酸) の中でイ
ンキュベートする。
10μlのライゲーション混合物をプラスミドpcl857を担持する2
00μlの低温 (4℃) コンピテントE.コリLC 137細胞に加える。30分後、細胞
を42℃の湯浴の中での1.5 分のインキュベーションにより加熱ショックにかける
。2mlのLB培地を加え、そしてこの培養物を30℃で60分振盪する。200μlのアリ
コートをアンピシリン及びカナマイシンを含むLBプレート上でプレート培養する
。個々のコロニーを培養し、そしてプラスミドDNA を分析する。pPLMu 中での T
GF−β1, TGF−β2及び TGF−β3をコードするDNA フラグメントのサブクロー
ニングはプラスミドpPLMu.hTGF−β1,pPLMu.hTGF−β2及びpPLMu.hTGF−β3の
それぞれをもたらす。上記の構築体を含むクローンをそれぞれ、E.コリLC 137
/pPLMu.hTGF−β1,E.コリLC 137/pPLMu.hTGF−β2及びE.コリLC 137/pP
LMu.hTGF−β3と称する。
E.コリLC 137/pPLMu.hTGF−β1,E.コリLC 137/pPLMu.hTGF−β2及びE .コリ
LC 137/pPLMu.hTGF−β3細胞を熱誘導し (実施例1A参照) 、そして発現
したタンパク質をSDS-PAGEにより分析する。
TGF−β1, TGF−β2及びTGF−β3は全て熱誘導して2時間後に約12,000Daの見
かけ上の分子量で泳動する熱誘導タンパク質として認定される。実施例1C:形質転換体の発酵
40mg/lのアンピシリン及びカナマイシンを有する750ml のLB培地を含む2l
のエーレンマイヤーフラスコ中のE.コリLC 137/pPLMu.hTGF−β1,E.コリL
C 137/pPLMu.hTGF−β2及びE.コリLC 137/pPLMu.hTGF−β3の一夜培養物を3
0℃で増殖させる。300ml の一夜培養物を2lのエーレンマイヤーフラスコ中の上
記の抗生物質を含むLB培地750ml に加え、そして65℃の湯浴の中で約3.5 分振盪
することにより42℃に加熱する。次いでフラスコを42℃のシェ
ーカーに移し、そして3時間インキュベートする。これらのフラスコを氷冷水槽
の中で12℃にまで冷やし、そしてGSA ローター (Sorvall) の中で8,000rpmでの1
0分遠心分離の後に集める。実施例2:サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)の中での TGF-β1, TGF-β2及び TGF-β3の発現
成熟 TGF-β1, TGF-β2及び TGF-β3のコード配列を酵母酸性ホスファターゼ
の誘導性プロモーター (PH05)のコントロール下でサッカロマイセス・セレビジ エ
の中で発現させる。
発現ベクターは2段階で構築する:
A.プラスミドpJDB 207/PH05−RIT 12の構築、
B.プラスミド pJDB 207R/PH05− TGF−β1, pJDB 207R/PH05− TGF−β2及
び pJDB 207R/PH05− TGF−β3の構築。
ここでA)は酵母ベクター及びPH05転写ターミネーターを供し、そしてB)はPH05
プロモーターのコントロール下にある成熟 TGF−β1, TGF−β2及び TGF−
β3のそれぞれをコードするインサートをもつ発現カセットを供する。実施例2A:プラスミドpJDB 207/PH05−RIT 12の構築
プラスミドp31 RIT 12(ヨーロッパ特許出願EP277,313)を制限エンドヌクレア
ーゼ SalIにより線状化する。エチジウムブロミドの存在下での部分HindIII消
化は、276bp の SalI/BamHI pBR 322配列、534bp の酵母酸性ホスファターゼPH05
プロモーター、酵母インベルターゼシグナル配列 (19個のアミノ酸をコード
) 及びPH05転写ターミネーターを含んで成る1kbの SalI/HindIIIフラグメント
をもたらす。
この1kbのp31 RIT 12のSalI/HindIIIフラグメントを、SalI及びHindIIIで
切っておいた酵母−E.コリシャトルベクターpJD 207(Beggs,J.D.:Molecul
ar Genetics in yeast,Alfred Benzon
Symposium 16,Copenhagen,1981,pp.383-389)にクローニングする。この1kbの
インサートを含む得られるプラスミドをpJDB 207/PH05−RIT 12と命名する。実施例2B:プラスミドpJDB 207R /PH05− TGF−β3の構築
プラスミドpGKM 740(TGF−β3)(実施例1.G参照)を NcoIで切る。その接着
末端をクレノウDNA ポリメラーゼによる反応で補完する。EcoRIリンカー (5′
−CCGGAATTCCGG;Biolabs)を加え、そしてその混合物をライゲーションする。得
られる環状プラスミドをpGKMA 668 (TGF−β3) と称し、そしてEcoRI及びSalI
により切断する。0.4kb のEcoRI/SalIフラグメントをアガロースゲルから単
離し、精製し、そして滅菌水の中に25μg/mlの濃度で再懸濁する。このフラグ
メントは TGF−β3の成熟コード配列を含み、成熟 TGF−β3のアミノ酸 AlaIを
規定するコドンGCT に対して枠内に(in frame to)ATG を有する。
PH05プロモーターを534bp のBamHI/EcoRIフラグメント上のプラスミドp31
RIT 12 (上記参照) から単離する。プラスミドpJD 207/PH05−RIT 12をBamHI
及び XhoIで切断する。大型の6.8kb のBamHI/XhoIフラグメントを単離する
。PH05転写ターミネーターはフラグメント上に残ったままである。BamHI/EcoR
IPH05プロモーターフラグメント、 TGF−β3をコードするEcoRI/SalIフラグ
メント、及びBamHI/XhoIベクターフラグメントをライゲーションする。PH05
プロモーターのコントロール下にある TGF−β3遺伝子がpJDB 207の中に反時計
方向でクローニングされている一の適正なクローンを pJDB 207R/PH05− TGF−
β3と命名する。
似たようにして、成熟 TGF−β1及び TGF−β2をS.セレビジエの中で発現さ
せる。 TGF−β1及び TGF−β3のコード配列を含むプラスミドはそれぞれpGKM 1
25及びpGKM 126である (実施例1.
G参照)。これらのプラスミドをNcoIで消化し、EcoRIリンカーを付加し、そ
してライゲーションした後、得られる環状プラスミドをEcoRI及び SalIで切断
する。EcoRI/SalIフラグメントを上記の通りにしてpJDB 207R の中にクロー
ニングする。得られるプラスミドを pJDB 207R/PH05− TGF−β1及び pJDB 207
R/PH05− TGF−β3と呼ぶ。実施例2C:S.セレビジエ株GRF 18の形質転換
サッカロマイセス・セレビジエ株GRF 18(MAT α,his 3−11,his 3−15,leu 2−3,leu−112,canR,DSM 3665
)を次のプラスミドにより
pJDB 207R/PH05−TGF−β1
pJDB 207R/PH05−TGF−β2
pJDB 207R/PH05−TGF−β3
Hinnen,A.ら (1978) PNAS 75,1929に記載の形質転換プロトコールを利用し
て形質転換させる。
形質転換した酵母細胞をロイシンを欠く酵母最小培地プレート上で選別する。
個々の形質転換コロニーを単離し、そして以下の通りに呼ぶ:
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18/ pJDB 207R/PH05− TGF−β1
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18/ pJDB 207R/PH05− TGF−β2及び
サッカロマイセス・セレビジエGRF 18/ pJDB 207R/PH05− TGF−β3。実施例2D:S.セレビジエ形質転換体の発酵及び細胞抽出物の調製
上記の酵母形質転換体はPH05プロモーターコントロール式発現カ
セットを含み、それ故 TGF−β1, TGF−β2又は TGF−β3の発現のためのプロ
モーターの抑制を必要とする。形質転換体をそれぞれ、アミノ酸は含まないが(N
H4)2SO4の代わりに10g/lのL−アスパラギン、1g/βのL−ヒスチジン及び
20g/lのグルコースを含むDifco 酵母窒素ベースの処方に従って調製した酵母
高Pi最小培地の中で2段予備培養 (10ml及び50ml) で増殖させる。第2予備培養
物の細胞を 0.9%のNaClで洗い、そして全ての細胞を、アミノ酸は含まないが0.
03g/lのKH2PO4,10g/lのL−アスパラギン、1g/lのヒスチジン及び20
g/lのグルコースを含むDifco 酵母窒素基礎培地の処方に従って調製した100m
l の低Pi最小培地に接種するために用いる。この培養物を30℃にて180rpmで撹拌
する。
10mlの培養物由来の細胞を5h,24h及び48h目において3000rpm での遠心に
より集め、そして 0.9%のNaClの中で1回洗う。細胞ペレットを溶解バッファー
[66mMのリン酸カリウムpH7.4, 4mMのZwittergent(Calbiochem)]の中に再懸濁
する。8gのガラスビーズ (直径 0.5〜0.75mm) を加え、そしてこの懸濁物をVor
tex Mix上で2分づつ4〜5回低温で強く振盪させる。その細胞抽出物をデカンテー
ションしてガラスビーズから除去する。抽出物中の細胞破片を3000rpm で4℃に
て5分間の遠心により沈降させる。上清液及びペレットを分け、そして−20℃で
保存する。実施例3 実施例3A:E.コリからの不溶性単量体型 TGF−β3の回収
E.コリLC 137/pPLMu.hTGF−β3を実施例1Cに記載の通りにして発酵させる
。細胞破壊及び不溶性 TGF−β3の回収を4℃で実施する。約18gのウェット細胞
を60mlの 0.1Mのトリス/HCl,10mMのEDTA, 1mMのPMSF (フェニルメタンスル
ホニルフルオリド) 、pH8.3(破壊バッファー)に懸濁する。細胞をフレンチプレ
ス(SLM
Instruments,Inc.)にその製造者の仕様書に従って2回通し、そしてその容量を
破壊バッファーで200ml にする。その懸濁物を15,000gで20分遠心する。得られ
るペレットを1MのNaClを含む100ml の破壊バッファーに懸濁し、そして上記の
通りに10分遠心する。そのペレットを1%のトリトンX−100(Pierce)を含む100m
l の破壊バッファーに懸濁し、そして再び上記の通りに10分遠心する。洗浄した
ペレットを次に50mlの20mMのトリス/HCl, 1mMのEDTA, 1mMのPMSF、1%のDTT
に懸濁し、そしてテフロン製組織グラインダーでホモジナイズする。得られる懸
濁物は不溶性形態の粗単量体型 TGF−β3を含む。実施例3B:単量体型 TGF−β3の可溶化及び精製
実施例3Aに従って得られる TGF−β3懸濁物10mlを10%の酢酸でpH2.5 にまで
酸性化し、そしてエッペルドルフ遠心機で室温で10分遠心する。その上清液をSe
phacryl S−100 カラム (Pharmacia, 2.6×78cm) で、10%の酢酸中で 1.4ml/
min の流速においてクロマトグラフィーにかける。 (他方、このクロマトグラフ
ィーはSephacryl S−100 HR(Pharmacia)で行ってよく、そしてカラムは1%の酢
酸又は5mMのHCl で流す) 。190min〜220minで溶出する単量体型変性 TGF−β3を
プールする。この材料を生物活性二量体型 TGF−β3を得るためのフォルディン
グのために (実施例4) 、又は更なる精製及び構造分析のために (実施例3D) 使
用する。実施例3C:サッカロマイセス・セレビジエからの単量体型 TGF−β3の回収
上記の通りにして実施した500ml 発酵から得られる破壊細胞のペレットを20ml
の4Mの尿素、0.1Mのトリス、1%のDTT,pH8.0に懸濁する。この混合物を室温
に30分保ち、5分毎に断続的にボルテキシングにかける。不溶性材料を30,000g
、30分、40℃の遠心分
離により除去し、そしてその上清液を酢酸でpH2.5 に調整し、そして5%の酢酸
に対して4℃で一夜かけて徹底的に透析する。その溶液を上記の通りに遠心し、
そして清浄な上清液をYM10膜(Amicon)上での限外濾過により4mlの最終容量とな
るまで濃縮する。次いでこのサンプルをSephacryl S−100 HR(Pharmacia)で5%
の酢酸において、実施例3Bに記載の通りにしてクロマトグラフィーにかけ、単
量体型 TGF−β3が得られる。実施例3D:RP−HPLCによる単量体型 TGF−β3の更なる精製
Sephacryl S−100 カラムからのプール画分のアリコート (実施例3B) をVyd
ac 214 TP 5415 HPLC逆相カラム(4.6×150mm,The Separation Group,Hesperia
,CA,USA)で精製する。このカラムを 0.1%のTFA の水溶液70%と0.08%のTFA
のアセトニトリル溶液30%との混合物で平衡にし、そしてその生成物を0.1%のT
FA の水溶液55%と0.08%のTFA のアセトニトリル溶液45%との混合物で終了す
る1ml/min の流速で30分にわたる線状勾配により溶出させる。溶出は216nm で
の吸収でモニターし、そして個々のピークをUV吸収に従って手動で集める。変性
した単量体型 TGF−β3は21.5min で溶出する。分離のために利用する個々の逆
相カラムに依存して、同一の TGF-β3の調製品がそれぞれ16min 及び18min 前後
で溶出する。
TGF−β3画分を上記と同じカラム及び溶媒系を利用するRP−HPLCにより分析す
る。 TGF−β3を 0.1%のTFA の水溶液 100%で開始し、このTFA の水溶液30%
と0.08%のTFA のアセトニトリル溶液70%との混合物で終了する42min にわたる
線状勾配により溶出させる。 TGF−β3は30.4min 後に単一ピークとして溶出す
る。使用する個々のカラムに依存して、29min 及び29.9min の滞留時間が得られ
る。実施例3E:SDS-PAGEによる単量体型 TGF−β3の分析
Sephacryl S−100 カラム (実施例3B) 又は逆相カラム (実施例3D) の個々
のアリコートを真空乾燥し、そしてクマジーブルーR−250 で染色した15%のポ
リアクリルアミドスラブゲルでのSDS−PAGEにより分析する。見かけ上分子量約1
2,000Daの一本のバンドが得られ、これは還元型の天然のブタ TGF−β3と区別で
なかった。実施例3F:単量体型 TGF−β3のN末端アミノ酸配列の決定
実施例3B由来の TGF−β3を真空エバポレーションにかけ、25μlの0.1Mの
酢酸に溶かし、そして気相タンパク質シーケンサーモデル 470A (Applied Bios
ystems) でのアミノ酸配列決定にかける。
N末端アミノ酸配列は配列表の中のSEQ ID No.に6示すものと同一である。実施例4: TGF−β3のin vitroフォルディング
上記の通りにして得た TGF−β3を0.1Mのトリス、30mMのCHAPS、1MのNaCl、
5mMの還元型グルタチオン及び20% (v/v) のDMSOのそれぞれより成るバッフ
ァーの中で4℃にてフォルディングする。バッファーのpHはNaOHでpH9.5 に調整
する。 TGF−β3の最終濃度は 0.1mg/mlとする。4℃で7日後、その溶液を濃酢
酸でpH3.5 に酸性化し、YM10膜 (Amicon) の付いたAmico 撹拌式セルの中での限
外濾過により約10倍濃縮する。その濃縮溶液を0.1Mの酢酸によりもとの容量に
希釈し、そして再度濃縮する。この手順を2回繰り返す。次いでこの溶液を実施
例5記載の通りにしてイオン交換クロマトグラフィーにかける。実施例5:カチオン交換クロマトグラフィーによる二量体型生物活性 TGF-β3の 単離
約10〜50mgの TGF−β3を含む実施例4において得られる溶液を
HiLoad 26/10 S-Sepharose高性能カラム(Pharmacia)に載せる。このカラムをま
ず20mMの酢酸ナトリウム、30%のイソプロピルアルコール、pH4.0(バッファーA
)により5分洗い、次いで 0.2MのNaClを含むバッファーAで始まり、そして 0.5
MのNaClを含むバッファーAで終わる45分にわたる線状勾配により溶出させる。
溶出は280nm でモニターし、そして手動式に分画する。画分を非還元SDS-PAGEに
より二量体型 TGF−β3について、及びin vitroバイオアッセイにより生物活性
について検定する。実施例6:二量体型 TGF−β3の更なる精製及び特性決定 実施例6A:HPLCによる精製
二量体型生物活性 TGF−β3を含む画分をプールし、0.1Mの酢酸に対して透析
するか又は同容量の0.1%のTFA 水溶液で希釈し、そしてVydac 214 TP 510カラ
ム (1cm×25cm,The Separations Group,USA) でのRP−HPLCにかける。そのカ
ラムを75%の溶媒A[ 0.1%のTFA 水溶液]及び25%の溶媒B[0.08%のTFA の
アセトニトリル溶液]の混合物により 4.5ml/min の流速で平衡にする。サンプ
ルの添加後、そのカラムを235nm でモニターした吸収が基底値に到達するまで平
衡条件下で洗浄する。次いでカラムをこの平衡条件で始まり、そして45%の溶媒
Aと55%の溶媒Bの混合物で終わる線状勾配により30分以内で溶出させる。溶出
液を手動式に分画し、そして非還元SDS-PAGE及びin vitroバイオアッセイにより
分析する。実施例6B:SDS-PAGEによる分析
実施例6の精製 TGF−β3のアリコートをそれぞれ真空乾燥し、そしてクマジー
ブルーR−250で染色する15%のポリアクリルアミドスラブゲルでのSDS-PAGEに
より分析する。還元させていないサンプルは約25kDa の見かけ上の分子量の一本
のバンドを示し、一方還元サンプルは約12.5kDa においてバンドを示す。実施例6C:分子量決定
実施例6A由来の精製 TGF−β3を電子スプレー式イオン化質量分析器 (ESI-MS
) により分析する。全質量は理論的に期待される値に非常に近いことがわかる。実施例6D:アミノ酸分析
アミノ酸分析はKnecht,R.and Chang,J.-X.,Analytical Chemistry 58 :
2375-2379(1986)に記載の通りに実施する。その結果は理論通りであった。実施例6E:N−末端アミノ酸配列の決定
10〜20μgの実施例7Aの TGF−β3を真空エバポレーションし、25μlの10mM
の酢酸に溶かし、そして気相シーケンサーモデル 477A (Applied Biosystems)
でのアミノ酸配列決定にかける。最初の10個の残基のアミノ酸配列は理論通りで
あった。実施例6F:Asp-N プロテアーゼによるタンパク質分解断片化
92mg (6.7mmole) の TGF−β3を還元し、4−ビニルピリジルエチル化し、真空
遠心分離で乾かし、そして20mlの5mMのHCl に再溶解する。10mMのZwittergent 3
−12界面活性剤 (Calbiochem Corporation,La Jolla,CA) を含む200ml の 0.2
Mのトリス−酢酸バッファーpH7.8 を加え、そしてタンパク質溶液と混合する。
切断は 2mg (50mlの水に溶解) のエンドプロテイナーゼAsp-N (シュードモナス
・フラギ(Pseudomonas fragi)突然変異体、Sequence Grade,Boehringer Mannhe
im Biochemica,FRG 由来) により37℃で実施する。13時間後、50mlの10% (v
/v) のTFA を加え、そしてその混合物をVydac 218 TP 5415 カラム(4.6mm×15
0mm,The Separations Group)での、5〜45% (v/v) のアセトニトリルの 0.1
%のTFA 溶液/水溶液の 0.1ml/min の流速での40min での線状勾配によるRP−
HPLCにより分離させる。単離したペプチドを電子スプレーイオ
ン化質量分析器ESI-MSにより分析する。決定される分子量は予測したAsp-N フラ
グメントに関する計算値と良好に一致する。
同定されたフラグメントは残基1及び2を除き、完全アミノ酸配列をカバーする
。これらのアミノ酸はタンパク質全体のN末端配列決定により、及びV8フラグ
メントの分析により同定する。実施例6G:V8プロテアーゼによるタンパク質分解断片化
実施例9に類似して、Asp-N プロテアーゼにより、4−ビニルピリジル化 TGF−
β3をプロテアーゼV8により消化し、そしてそのフラグメントをRP−HPLCにより
分離し、そしてESI-MSにより分析する。決定される分子量は理論値により一致し
、 TGF−β3の同定を実証する。同定されたフラグメントは 112個のアミノ酸残
基の全配列をカバーする。実施例7:フォルディングした TGF−βについてのin vitro活性試験:ミンク肺 上皮細胞 (Mv−1−Lu) 酸性ホスファターゼアッセイ
TGF−β又はハイブリドタンパク質をin vitroで、連続ミンク肺上皮細胞系Mv
−1−Lu(ATCC/CCL64)の増殖を阻害する化合物の効能を測定する細胞バイオアッ
セイでスクリーニングする。Mv−1−Lu細胞系は TGF−βのバイオアッセイにお
ける高感度なリポーターであると実証されており、シグモイド型の濃度応答を示
し、約10〜50pg/mlのリポートEC50を有す(Tuckerら、Science 1984;226 :705
-707 ;Absherら、J. Immunol Methods 1991 ;138 :301-303;Danielpourら
、J.Cell Physiol,1989 ;138 :79-86)。増殖が TGF−βにより強く阻害され
るMv−1−Lu細胞はこのサイトカインの分析バイオアッセイの開発に最も適する
細胞系であると現在考えられている (Kelleyら、Exp Lung Res 1992 ;18:877-
887 ;Meager,J. Immunol Methods 1991 ;141 :1-14) 。アッセイは96穴マ
イクロタイタープレートの中で、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、Rockville MD,USA 由来の46継代目においてオリジナル的に得
られる細胞を利用して実施する。細胞を TGF−β標準品又はサンプルの希釈系列
を含む増殖培地 (5%v/v胎児牛血清を有する最小必須培地) の中に低密度 (
ウェル当り5000細胞) で播種する。次にアッセイを37℃にて多湿5%CO2インキュ
ベーターの中で72時間インキュベートする。細胞増殖の阻害は高感度酵素的細胞
染色法 (これは各ウェルの中で産生される酸性ホスファターゼの量の比色換算値
を供する) により決定され、染色の強さは各ウェルの中に存在する細胞の数に
対応する。各ウェルの吸収O.D.を405nm で決定し、そしてアッセイデーターをプ
ロットし、そして適当なPCソフトウェアプログラムにより分析する。このアッセ
イにおいて、1単位 (U) の活性はMv−1−Lu細胞増殖の最大阻害の半分に必要
な TGF−βの量として記述する。実施例8:フォルディングした TGF−β3のin vivo 活性試験 実施例8A:老齢マウスにおける部分的に厚みを帯びた創傷の治癒
創傷治癒過程は年齢を追うごとに悪くなることが知られ(GroveG.L. (1982)
Arch.Dermatol.Res.272 :381)、従って老人医療分野における主たる問題を
占める。従って、部分的に厚みを帯びた創傷 (II度火傷により生成) の治癒に及
ぼすフォルディングした活性二量体型 TGF−β3のin vivo 生物効果を部分欠陥
又は損われた創傷修復状況で、即ち老齢動物で、Schultz,G.S.ら (1987) Scie
nce 235 :350 に記載のものと類似する以下のプロトコールを利用して調べる。
1個の中皮熱傷を麻酔したC57/BL6マウス (生後 450日以上) (その背中は予
め毛剃りしてあり、そして市販クリーム型除毛剤で脱毛しておいた) の背胸部上
に、80℃の湯浴に平衡化しておいたしんちゅうテンプレート (1×1cm,8g) の1
0秒間の適用により施
す。得られる水庖を外科的に除去し、そして火傷を5日間にわたり毎日様々な量
(500ng,100ng又は10ng) のフォルディングした活性二量体型 TGF−β3を含む25
μlの無菌ビヒクルバッファー溶液 (10mMのヒスチジン、140mM のNaCl,pH7.4
の溶液中の 0.8%w/vのヒドロキシプロピルセルロースより成る) 又はバッフ
ァーのみの適用により処置するか、又は未処置のままにしておく。局部塗布した
材料は無菌、無内毒素がなく、且つ無パイロジェンであり、そしてマウスは全て
実験中個別のカゴに入れておいた。各実験グループは5匹の動物より成る。
TGF−β3による処置の5日後、マウスを麻酔し、水庖 (あるなら) を火傷から
外科的に除去し、そして火傷を写真撮影する。上皮を再生した火傷の領域の外形
を均一な厚みの透明オーバーヘッドプロジェクターフィルム上において抽き、そ
して治癒した各オリジナルの火傷領域の率を面積測定法により算定する。結果を
、実験の際に未処置のままにしておいた同一の中皮火傷を負った若齢 (生後56〜
84日) のC57/BL6マウスにおける上皮再生過程とも比較する。
面積測定分析の結果は、適当なビヒクルバッファー中のフォルディングした活
性二量体型 TGF−β3の5日間にわたる毎日の局部塗布が、ビヒクルバッファーの
み又は未処置の創傷と比較したときに、用量依存式に老齢マウスでの部分的に厚
みを帯びた創傷の上皮再生を刺激及び加速することを示した。若齢マウスは局部
塗布する TGF−β3を全く抜きにして、その創傷を有効に再上皮形成するのに十
分に見かけ上有能である。長期分析は、強められた上皮形成過程を、 TGF−β3
処置創傷における6日目での再生表皮の角質増殖症を伴って示す。実施例8B:成ラットにおける全体に厚みを帯びた創傷の治癒
フォルディングした活性二量体型 TGF−β3の生物効果も創傷修
復の第2in vivo モデル、即ち、Mustoe,T.A.ら (1987) Science 237 :1333
に記載のものと類似の以下のプロトコールを利用する成ラットにおける全体に厚
みを帯びた創傷 (外科的切開により作成) の治癒に基づいて調べる。
1個の全体に厚みを帯びた長さ5cmの直線切開を 1.5cm×2で、背中を予め毛剃
りしておき、且つ市販のクリームタイプ除毛剤で脱毛しておいたペントバルビト
ン麻酔した雄のWistarラット (300〜 350g) の背中線の両側に施す。この実験
グループにおいて、左側の切開 (背側の最上部から見て) の縁に、様々な量 (2m
g, 1mg,0.1mg 又は0.01mg) のフォルディングした活性二量体型 TGF−β3を含
む無菌ビヒクルバッファー (10mMのヒスチジン、140mM のNaCl,pH7.4 の溶液中
の 0.8%w/vのヒドロキシプロピルセルロースより成る) の一回の局部塗布(1
00μl)を施す。逆側の右側切開の縁には前記ビヒクルバッファー中の対応の等
量の偽薬コントロール (牛血清アルブミン) を施し、そしてコントロール動物に
おける切開の縁においては、左側の切開にはビヒクルバッファーのみを施し、そ
して右側切開においては外科切開後処置を施しておかない。局部塗布する材料は
全て無菌、無内毒素及び無パイロジェンである。各創傷の縁を5−0 Ethilonの5
針の均等に施した介在式水平マットレス縫合糸で接合させる。動物は全て個別に
カゴに入れ、そして創傷は処置後21日以内の様々な期間にわたり治癒のために放
置する。殺した後、背皮全体を各動物から剥ぎ、そして全ての皮下脂肪を外科用
メスを用いて各皮膚の下側から慎重に除去する。2本の平行な外科メスより成る
テンプレート (刃間の距離は8mm) を引張強さ測定のための皮膚片 (各切開上の
縫合の間) を切り出すために用いる。サンプルを長期分析のために各切開の一端
から採取する。各切り出した皮膚サンプルにより寛容される最大負荷を万能引張
強さ装置
モデル144501(Zwick,Ulm,FRG)で測定する。測定は、油圧式クランプで固定し
ておいた、且つ10mm/分の速度で破断点に至るまで延伸した30mm×8mmの片で行
い、最大負荷をチャートレコーダーで記録する。測定は各創傷由来の三重測定サ
ンプルで行い、そして実験グループは4匹の動物より成る。感染症又は過剰な出
血の徴候を示す創傷 (全創傷の3%未満) については破断強さの測定を行わない
。
引張強さ測定の結果は、適当なビヒクルバッファー中のフォルディングした活
性二量体型 TGF−β3の一回の局部塗布が、コントロールグループと比較したと
きに、2倍に至るまで破断強さを強め、そして成ラットの全体に厚みを帯びた切
開創傷を21日間にわたり用量依存式で治癒を加速せしめることを実証する。長期
分析は、コントロール創傷と比べたとき、21日間にわたり TGF−β3処置した創
傷における単核細胞、線維芽細胞の流入、及びコラーゲン産生の著しい増大を示
す。一過性の角質増殖症も処置後14日まで TGF−β3処置創傷においても明示さ
れる。実施例9:可溶化単量体型ハイブリド TGF−βタンパク質及び可溶化単量体型 BM P−2の調製 実施例9.1:ハイブリド TGF−β
5mlのプラスミドpPLMu を NcoI及び SalIでの消化により線状にし、そして
フラグメントDNA に関して上記した通りにゲル精製する。100ng の線状化、且つ
精製したpPLMu ベクターDNA 、並びに配列表に示すハイブリド TGF−β1−3, T
GF−β2−3及び TGF−β3−2のそれぞれをコードする3倍モル当量の対応の精製
フラグメントDNA を4℃で15時間、1単位のDNA リガーゼ(Boehringer)を含む20ml
のライゲーションバッファー (70mMのトリス−HCl,pH7.5 ,10mMのMgCl2, 5ml
のDTT 、0.1mM のアデノシン三リン酸)
の中でインキュベートする。
10mlのライゲーション混合物をプラスミドpcL857を担持する200ml の低温 (4
℃) コンピテントE.コリLC 137細胞) に加える。30分後、細胞を42℃の湯浴の
中での1.5 分のインキュベーションにより加熱ショックせしめる。2mlのLB培地
を加え、そしてその培養物を30℃で60min 振盪する。200μlのアリコートをア
ンピシリン及びカナマイシンを含むLBプレート上にプレートし、そして30℃で22
hインキュベートする。個々のコロニーを培養し、そしてプラスミドDNA を分析
する。pPLMu の中での TGF−β1−3, TGF−β2−3及び TGF−β3−2をコードす
るDNA フラグメントのサブクローニングはプラスミド pPLMu.TGF−β1 (44/45)
β3, pPLMu.TGF−β2 (44/45) β3及び pPLMu.TGF−β3 (44/45) β2のそれぞ
れをもたらす。上記の構築体を含むクローンをE.コリLC 137/ pPLMu.TGF−β
1 (44/45) β3,E.コリLC 137/pPLMu.TGF −β2 (44/45) β3及びE.コリ
LC 137/ pPLMu.TGF−β3 (44/45) β3とそれぞれ呼ぶ。
E.コリLC 137/ pPLMu.TGF−β1 (44/45) β3,E.コリLC 137/pPLMu.TG
F −β2 (44/45) β3及びE.コリLC 137/ pPLMu.TGF−β3 (44/45) β3を以
下の通り (実施例3Aも参照のこと) に熱誘導し、そして発現したタンパク質をS
DS-PAGEにより分析する。TGF−β1−3, TGF−β2−3及び TGF−β3−2は全て、
熱誘導して2h後に熱誘導化、タンパク質として出現し、約12,000Daの見かけ上
の分子量をもって泳動した。
E.コリLC 137/ pPLMu.TGF−β1 (44/45) β3,E.コリLC 137/pPLMu.TG
F −β2 (44/45) β3及びE.コリLC 137/ pPLMu.TGF−β3 (44/45) β3の、
40mg/lのアンピシリン及びカナマイシンを有する750ml のLB培地を含む2lの
エーレンマイヤーフ
ラスコ中の一夜培養物を30℃で増殖させる。300ml の一夜培養物を2lのエーレ
ンマイヤーフラスコ中の上記の抗生物質を含む750mlのLB培地に加え、そして65
℃の湯浴の中で約3.5 分振盪することにより42℃に加熱する。次いでこのフラス
コを42℃のシェーカーに移し、そして3hインキュベートする。このフラスコを
氷冷水槽の中で12℃に冷却し、そして細胞をGSA ローター(Sorvall)の中での800
0rpm での10分の遠心分離により集める。
単量体型可溶化 TGF−β1−3ハイブリドの製造のための下記の手順も TGF−β
2−3及び TGF−β3−2の可溶化に適用する。
E.コリLC 137/ pPLMu.TGF−β1 (44/45) β3細胞を上記の通りに発酵させ
、そして封入体を下記の通りにして調製する。細胞破壊及び封人体の回収は4℃
で行う。約18gのウェット細胞を60mlの 0.1Mのトリス/HCl ,10mMのEDTA, 1
mMのPMSF (フェニルメタンスルホニルフルオリド) 、pH8.3(破壊バッファー)の
中に懸濁する。この細胞をフレンチプレス(SLM Instruments, Inc.)にその製造
者の仕様書に従って2回通し、そしてその容量を破壊バッファーで200ml にする
。その懸濁物を15,000gで20分遠心する。得られるペレットを1MのNaClを含む1
00ml の破壊バッファーに懸濁し、そして上記の通りに10分遠心する。そのペレ
ットを1%のトリトンX−100(Pierce)を含む、100ml の破壊バッファーに懸濁し
、そして再び上記の通りに10分遠心する。
0.3gの洗浄ペレットを10mlの20mMのトリス/HCl, 1mMのEDTA, 1mMのPMSF,
0.1%のDTT,pH8.0 に懸濁し、そして室温で1h磁気撹拌する。そのサンプルを
濃酢酸でpH2.5 にし、そしてテフロン製組織ホモジナイザーでホモジナイズし、
そしてCentricon H-401 遠心機(Kontron Instruments)の中で固定角ローターA
.8.24を用い、60min ,15℃,12,000rpm で遠心する。透明な上清液の酢
酸をYM05フィルターの付いたAmicon 8010 撹拌式セルの中で10mMのHCl により、
繰り返し濃縮及び10mMのHCl によるその溶液の希釈により変換する。実施例9.2: BMP
N末端配列Q−A−K−H−K−Q−R−K−R−L−K−S−S−C−K−
R−Hを有するWozneyら、Science 242 :1528-1534(1988)に記載のBMP−2 (本
来の名称= BMP−2A) の成熟形成を含む封入体を慣用の方法に従い、T7ポリメ
ラーゼ発現系を有するE.コリの中で調製する。発現のために用いる BMP−2 DN
Aを配列表の中のSEQ ID No.13で示す。組換 BMP−2はN末端に追加のメチオニン
を有す。第2の手法において、 BMP−2の突然変異体、即ち(−Q1)BMP−2を作っ
た。これは第1アミノ酸が欠失し、且つメチオニンがN末端にないことを除き上
記と同一のタンパク質である。
10mMの BMP-2又は(−Q1)BMP−2封入体懸濁物を10%の酢酸でpH2.5 に酸性化
し、そしてエッペンドルフ遠心機で室温で10min遠心する。この上清液をSephacr
yl S−100 カラム (Pharmacia,2.6×78cm) で10%の酢酸中で1.4ml/min の流
速でクロマトグラフィーにかける。単量体型の変性 BMP−2を含む画分をプール
する。プールした材料を以下のリフォルディング実験に利用する。実施例10:種々の TGF−β及び TGF−β−ハイブリド及び BMP−2による一連の リフォルディング実験
本発明の多様性及び広範囲の適用性は以下の一連の実施例にまとめた結果によ
り例示される。in vitroタンパク質リフォルディング実験に利用した特定の条件
及び個々のタンパク質を列挙する。その他の実験条件は実施例4に記載の通りで
ある。生物活性はin vitroタンパク質フォルディングを開始してから3及び7日後
に決定した
。
微生物の寄託
以下の微生物はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen(DSM),Mascheroder
Weg 1b,D-3300 Braunschweig(FRG)に寄託してある:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AU,BB,BG,BR,BY,CA,CN,C
Z,EE,FI,GE,HU,IS,JP,KG,KP
,KR,KZ,LK,LR,LT,LV,MD,MG,
MN,MX,NO,NZ,PL,RO,RU,SG,S
I,SK,TJ,TM,TT,UA,US,UZ,VN