NO316926B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et dimerisk biologisk aktivt TGF-<beta>-protein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en foldingsfremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt, dimerisk TGF-B (transformerende vekstfaktor type fi)-lignende protein.

TGF-B lignende proteiner, dvs. proteiner fra TGF-6 superfamilien, spiller en sentral rolle i mange biologiske reguleringsveier så som embryonal utvikling eller regenerasjon av vev. De er meget potente biologiske stoffer som kan bli anvendt også terapeutisk i en serie av forskjellige formål. De best kjente medlemmene av TGF-6 superfamilien er selve TGF-J3.

TGF-B ble opprinnelig renset til homogenitet fra humane blodplater, human placente og bovin nyre og identifisert som et homodimerisk protein med en molekylmasse på omtrent 25.000 Da. Først karakterisert ved dets evne til å virke synergistisk med EGF eller TGF-a for å indusere forankrings-uavhengig vekst av utransformerte NRK celler og TGF-B er nylig blitt vist å utvise et antall regulatatoriske effekter på et stort antall av både normale og neoplastiske celler som indikerer viktigheten av dette proteinet som en multifunksjonell regulator for cellulær aktivitet. Avhengig av celle eller vevstypen, og tilstedevgerelse eller fravær av andre vekstfaktorer, kan TGF-B enten stimulere mitogenesen, celleproliferasjonen og veksten, eller kan effektivt inhibere nevnte prosesser, eller kan utvise andre virkninger som for eksempel kontroll av adipogenesen, myogenesen, chondrogenesen, osteogenesen og immuncellefunksjonen, stimulering av kjemotaksen, eller induksjon eller inhibisjon av differensieringen. Mange av virkningene til TGF-B er relatert til responsen til cellene eller vevene for å stresse eller skade, og reparering av den resulterende skaden. Etter betennelse spiller TGF-B hovedrollen i dannelsen av granuleringsvev, øker ekspresjonen til gener assosiert med ekstracellulær matriksdannelse så som fibronektin, kollagen og flere proteaseinhibitorer og stimulerer kollagen-matriks sammentrekningen til fibroblastene og dette foreslår den mulige rollen i bindevevssammentrekninen.

Frem til nå er det blitt beskrevet fem bestemte, men funksjonelt og strukturelt nært beslektede TGF-B betegnet som TGF-B 1, TGF-B2, TGF-B3, TGF-B4 og TGF-B5.

Alle TGF-B blir syntetisert som 390 til 412 aminosyreforløpere som gjennomgår proteolytisk spaltning for å produsere de modne formene, som består av de C-terminale 112 aminosyrene. I deres modne, biologiske aktive former er TGF-B1 til 5 syre- og varme-stabile disulfid-koblede homodimerer med to polypeptidkjeder på 112 aminosyrer hver. De fullstendige aminosyresekvensene til human (Derynck, R. et al.

(1985) Nature 316,701-705), murin (Derynck, R. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261, 4377-4379) og simian TGF-B I (Sharples, K. et al. (1987) DNA 6,239-244) viser betydelig sekvenskonservering og er bare forskjellig når det gjelder et enkelt aminosyreresidie. Sammenligning av aminosyresekvensen til human TGF-B 1, human TGF-B2 (deMartin, R. et al. (1987) EMBO J. 6, 3673-3677; Marquardt, H. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262, 12127-12131) og human TGF-B3 (Ten Dijke, P. et al. (1988) PNAS 85,4715-4719) har demonstrert at disse tre proteiner utviser i deres modne former omtrent 70-80% sekvensidentitet. En heterodimerisk TGF-B 1.2 er blitt isolert fra griseblodplater og består av en enhet TGF-B l disulfid-koblet til en subenhet TGF-B2 (Cheifetz, S. et al. (1987) Cell, 84,409-415).

Forsøk har vært gjennomført for å produsere TGF-B ved hjelp av rekombinante teknikker i stedenfor isolering av disse faktorene fra naturlige kilder (for eksempel blodplater) for å oppnå tilstrekkelige mengder for testing i forskjellige terapeutiske modaliteter. Det har derimot vist seg å være ekstremt vanskelig å oppnå biologisk aktiv rekombinant TGF-B. Som det fremgår fra sekvensene angitt i sekvenslisten under SEQ ID NO; 1 til 6, inneholder de 112 aminosyre-lange modne formene av TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 9 cysteinresidier. Som vist for TGF-B2 danner de 9 cysteinresidiene 4 intrakjede og 1 interkjede disulfidbinding [Schlunegger, MP. and Gruetter, M.G. Nature 358:430-434 (1992)]. Heterolog ekspresjon av TGF-B kan føre til et produkt som, til tross for at det har korrekt primær struktur, ikke folder riktig for å produsere korrekte, kompliserte sekundære eller tertiære strukturer og som derfor mangler den biologiske aktiviteten.

Når man tar kompleksiteten av native TGF-B molekylene i betraktning er det generelt blitt betraktet å være hensiktsmessig å uttrykke de respektive TGF-B genene i celler avledet fra høyere organismer. Til tross for at ekspresjon av rekombinante TGF-B kan bli oppnådd i eukaryote systemer er utbyttene til biologisk aktivt, korrekt foldet materiale som blir oppnådd fortsatt langt fra tilfredsstillende.

Forsøk er derfor blitt utført for å produsere biologisk aktiv TGF-B i en mikrobiell vert. I for eksempel bakterier er imidlertid de intracellulære betingelsene ikke hensiktsmessige for korrekt folding, dvs. disulfidbindingsdannelse og disulfid-stabilisert dimerisering, som sannsynligvis er vesentlig for aktivitet. Bare meget lite biologisk aktiv TGF-B var derfor mulig å oppnå etter ekspresjon av det respektive genet i E. coli under kontroll av lambda promoteren som beskrevet i europeisk patentsøknad EP-A-0 268 561. En annen rapport beskriver ekspresjon av et TGF-B cDNA i E. coli under kontroll av trp promoteren som tilveiebringer et radioaktivt merket proteinbånd med en tilsynelatende molekylvekt på 13.000 Da i et autoradiogram i en SDS polyakrylamidgel, men ingen aktivitet ble målt (Urushizaki, Y. et al. (1987) Tumor Res. 22,41-55).

Når rekombinante proteiner blir produsert i høye nivåer i bakterielle (så som E. coli) ekspresjonssystemer fremstår de ofte i form av sterkt uoppløselige intracellulære presipitater referert til som inklusjonslegemer eller refraktile legemer som kan bli gjenkjent som lysende flekker synlige innenfor det indre av cellene under et fase-kontrast mikroskop. Disse inklusjonslegemene, som lett kan bli separert fra oppløselige bakterielle proteiner, inneholder rekombinant protein i en for det meste denaturert og redusert form som ikke utviser den funksjonelle aktiviteten til dets naturlige motpart og som derfor ikke kan anvendes som et kommersielt produkt. Det er derfor generell enighet om at det rekombinante refraktile proteinet må bli oppløst under betingelser som er egnede for å opprettholde det i dets denaturerte form og deretter må bli foldet for å gjennomgå overgangen fra den denaturerte ufoldede formen ril riktig, funksjonelt aktiv 3-dimensjonal struktur, hvor konformasjonen blir stabilisert ved relativt svake interatomiske krefter så som hydrogenbinding, hydrofobe interaksjoner og ladningsinteraksjoner. Når det gjelder cystein inneholdende proteiner kan denne prosessen også innbefatte dannelse av disulfidbindinger. Når dannelsen av disulfidbindingene er fremmet kjemisk bør dannelsen av ukorrekte intramolekylære, og når det gjelder dimeriske eller multimeriske proteiner, intermolekylære broer bli forhindret eller i det minste bli minimalisert, siden dannelsen av uønskede, ukorrekt foldede isomerer kan tilveiebringe uhomogent materiale som dermed kompliserer den ytterligere rensingen av proteinet som har den ønskede strukturen, eller kan danne et protein med redusert aktivitet.

Folding av proteiner blir vanligvis utført i en flertrinnsrfemgangsmåte som omfatter solubilisering av proteinet under sterke denaturerende betingelser, og deretter redusering av konsentrasjonen av kaotropen for å muliggjøre folding av proteinet. En slik metode sviktet derimot ved folding av TGF-B. I europeisk patentsøknad EP-A-0 433 225 ble en vellykket fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt, dimerisk TGF-B-lignende protein beskrevet, hvor en svak detergent blir anvendt som muliggjør folding av TGF-B proteinet, mens detergenten forblir tilstede i foldebufferen.

Det er kjent fra tidligere teknikk (Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 113:6657-6662,1991) at dimetylsulfoksid (DMSO) kan bli anvendt for å fremme en selektiv og effektiv dannelse av disulfidbindinger i peptider. Fremgangsmåten er selektiv, dvs. uten bireaksjoner, og et bredt pH område kan bli anvendt. Korrekt disulfidbrodannelse ble derimot bare vist for peptider opp til omtrent 30 aminosyrer. I en annen publikasjon (Bentle et al., US-PS 4.731.449) ble dimetylsulfon eller en blanding av dimetylsulfon og urea anvendt for solubilisering av somatotropin fra inklusjonslegemer. Det solubiliserte proteinet kunne da bli renaturert ved å bringe den dimetylsulfon inneholdende oppløsningen av proteinet i kontakt med et svakt oksyderingsmiddel.

Det ble nå overraskende oppdaget at en fremgangsmåte hvor en svak detergent blir anvendt for folding av et TGF-B lignende protein kan bli forbedret dersom dimetylsulfoksid (DMSO, dimetylsulfon (DMSO2) eller dimetylformamid (DMF) blir tilsatt.

Det er en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av biologisk aktivt, dimerisk TGF-B lignende protein fra dets denaturerte eller på annen måte ikke-native form. Denne hensikten blir oppnådd ved det uventede funnet som omfatter at betraktelige mengder av ønsket dimerisk produkt kan bli oppnådd i et uventet utbytte når den monomeriske formen til nevnte protein blir behandlet med en foldebuffer som omfatter (a) en svak detergent og (b) DMSO, DMF eller DMSO2 eller en blanding av to eller tre av gruppen bestående av DMSO, DMS02°g DMF-

Foreliggende oppfinnelse vedrører en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type B (TGF-B)-lignende protein eller et salt derav, kjennetegnet ved å behandle den denaturerte monomeriske formen av nevnte TGF-fi-lignende protein med en foldebuffer som omfatter en svak detergent som muliggjør folding av monomerisk TGF-B-lignende protein til en romlig konformasjon som etter dimerisering er assosiert med den biologiske aktiviteten, mens nevnte monomer opprettholdes i en oppløselig form, og et organisk oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av DMSO, DMSO2, DMF, og en hvilken som helst blanding av 2 eller 3 medlemmer av gruppen bestående av DMSO, DMSO2 og DMF.

Betegnelsen "TGF-B-lignende protein" i foreliggende oppfinnelse betyr et protein som i dets monomeriske form har en sekvens med minst 75% homologi med minst en av aminosyresekvensene til en monomer fra følgende medlemmer av TGF-B superfamilien (som også faller inn under betegnelsen "TGF-B-lignende protein"): TGF-B1, TGF-62 og TGF-B3; en vekstinhibitor isolert fra det kondisjonerte mediet til BSC-1 apenyrecelle (dvs. polyergin; Holley, R.W. et al. (1980) PNAS 77, 5989-5992; Ristow, HJ. (1986) PNAS 83,5531-5533); TGF-B4 fra kyllingembryo chondrocytter (Jakowlew, S.B. et al. (1988) Molecular Endocrinology2,1186-1195); TGF-B5 fra Xenopus-Laevis Kondaiah, P. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265,1089-1093); TGF-fi-relaterte inhibiner og aktiviner (gonadalproteiner som regulerer hypofysesekresjonen av follikel stimulerende hormon); mullerian inhiberende forbindelse (MIS, som inhiberer utviklingen av mullerian kanalen i pattedyr hannembryoer; benmorfogeniske proteiner (BMP, en gruppe av polypeptider som er involvert i induksjon av brusk og bendannelsen; medlemmer av denne gruppen kjent i dag er BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 og BMP-9); transkriptet fra dekapentaplegisk genkompleks til Drosophila (dpp, som virker slik at det kontrollerer morfogenesen i flueembryo); Vg-1 (produktet til Xenopus transkriptet som er tilstede i vegetal polen til oocyter); og Vgr-1, et Vg-1 relatert pattedyrgen (Mason, A. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 135,957-964; Cate, R. et al. (1986) Cell 45,685-698; Wozney, J.M. et al. (1988) Science 242,1528-1534; Padgett, R. et al. (1986) Nature 325, 81-84; Weeks, D.L. and Melton, D.A. (1987) Cell 51,861-868; Lyons, K. et al. (1989) PNAS 86,4554-4558).

Også innbefattet i betydningen "TGF-B-lignende protein" er heterodimerer inneholdende subenheter av forskjellig TGF-B-lignende proteiner, eller fragmenter eller mutanter av ovennevnte proteiner som har beholdt en eller alle biologiske aktiviteter til opphavsmolekylet.

I en foretrukket betydning representerer betegnelsen "TGF-B-lignende protein" i foreliggende oppfinnelse et hvilket som helst protein fra TGF-B superfamilien. I en mer foretrukket betydning representerer det følgende proteiner fra TGF-B-superfamilien: TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-63 fra pattedyr så som human eller dyreopprinnelse, for eksempel simian, murin, gris, hest eller bovin, samt heterodimeriske TGF-B bestående av to forskjellige subenheter med 112 aminosyrer hver, og fragmenter og mutanter av et TGF-B inkludert hybridmolekyler hvor delene av forskjellige TGF-B er utvekslet; en vekstinhibitor isolert fra kondisjonert medium til BSC-1 apenyrecelle (dvs. polyergin); TGF-84 fra kyllingembryo chondrocytter; TGF-B5 fra Xenopus-Laevis; TGF-B-relaterte inhibiner og aktiviner (gonadale proteiner som regulerer hypofysesekresjonen til folikkelstimulerende hormon); mullerian inhiberende forbindelse (MIS, som inhiberer utviklingen av mulleriankanalen i pattedyr hannembryoer); benmorfogene proteiner (BMP, en gruppe polypeptider som er involvert i induksjon av brusk og ben dannelse; medlemmer av denne gruppen kjent i dag er BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 og BMP-9); transkriptet fra dekapentaplegisk genkompleks Drosophila

(dpp, som virker slik at det kontrollerer morfogenesen i flueembryo); Vg-1 (produktet til Xenopus transkriptet som er tilstede i vegetalpolen til oocyter); og Vgr-1, et Vg-1 relatert pattedyrgen. Også innbefattet i betydningne av "TGF-B-lignende protein" er heterodimerer inneholdende subenheter av forskjellige TGF-B-lignende proteiner, eller fragmenter og mutanter av ovennevnte proteiner som har beholdt en eller alle biologiske aktiviteter til opphavsmolekylet.

TGF-B-lignende proteiner blir selektert fra gruppen bestående av TGF-B1, TGF-B2, TGF-B3, heterodimeriske TGF-B, fragmenter og mutanter av et TGF-B inkluderte hybridmolekyler hvor deler av forskjellige TGF-B blir utvekslet, BMP, inhibiner og aktiviner. Selv mer foretrukket er de som blir selektert fra gruppen bestående av BMP-2, TGF-B 1, TGF-B2, TGF-B3 og heterodimerer og fragmenter og mutanter derav, inkludert hybridmolekyler hvor deler av forskjellige TGF-B blir utvekslet, fortrinnsvis TGF-Bl-3, TGF-B2-3 eller TGF-B3-2 definert nedenfor eller TGF-61-2 bestående, i N- til C-terminal rekkefølge, N-terminale 44 aminosyrer av human TGF-B 1 og C-terminale 68 aminosyrer av TGF-B2. mer foretrukne TGF-B proteiner er de som blir valgt fra gruppen bestående av proteiner med aminosyresekvensene angitt i sekvenslisten under SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7,9,11 eller 13. Det mest foretrukne TGF-B-lignende proteinet er TGF-B3. Betegnelsen BMP-2 innbefatter også varianter av BMP-2 som har samme biologiske aktivitet. Slike varianter er for eksempel de som blir fremstilt i eksemplene, dvs. BMP-2 fra SEQ ID NO: 13 med et ytterligere N-terminale methionin og BMP-2 fra SEQ ID NO: 13 som mangler den N-terminale aminosyren Gin.

Den biologiske aktiviteten til TGF-B for formålet heri er definert som enten

- cellemigrerings fremmende aktivitet til TGF-6 på fibroblaster, (Postlethwaite, A. E. et al. (1987) J. Exp. Med. 165,251, modifisert ifølge Burk, R (1973) PNAS 70,369), - inhibitorisk effekt til TGF-B på veksten av humane A 375 melanomceller (Brown, T.J. et al. (1987) J. Immunol. 139, 2977), - inhibisjon av CCL-64 celle DNA syntese analysen (Graycar, J.L. etal. (1989) Molecular Endocrinology 3:1977-1986)

eller

- inhibisjon av veksten av en kontinuerlig mink lunge epitelcellelinje Mv-l-Lu (ATCC/CCL64) som beskrevet i eksemplene nedenfor.

Monomerisk TGF-6-lignende protein avledet fra en hvilken som helst kilde eller metode kan bli foldet til tilsvarende dimerisk, biologisk aktivt TGF-B-lignende protein ifølge foreliggende fremgangsmåte. For eksempel kan den monomeriske formen av TGF-B-lignende protein bli avledet fra den naturlige kilden eller kan bli produsert ved hjelp av rekombinant DNA teknologi eller syntetisk ifølge fremgangsmåter velkjent innenfor fagområdet. I det tilfellet monomeren ikke er egnet for in vitro folding på grunn av kontaminanter kan oppløst og denaturert monomer bli renset ved kromatografi, for eksempel ved størrelseseksklusjonskromatografi på for eksempel Sephacryl S-100 HR.

Før den blir foldet må monomerisk TGF-B-lignende protein være tilstede i en denaturert (dvs. ufoldet), oppløst form. De såkalte kaotropiske midler som er velkjente innenfor fagområdet har evne til effektiv denaturering og oppløsning av proteinene, i vandig oppløsning og i egnede konsentrasjoner, forandring av romlig konfigurasjon til det respektive proteinet gjennom endringer i overflaten derav, enten gjennom endring av hydreringstilstanden, oppløsningsmiddelmiljøet, eller oppløsningsmiddel-overflate interaksjon. Eksempler på slike kaotropiske midler eller denatureringsmidler innbefatter urea, guanidin hydroklorid, natriumtiocyanat i konsentrasjoner i området 4 til omtrent 9 M, og detergenter så som SDS, som blir tilført i konsentrasjoner i størrelsesorden 0,01 til 2%. Surgjøring av den vandige oppløsningen inneholdende TGF-B-lignende protein til en pH på omtrent 2 til omtrent 4, for eksempel med lavmolekylvekt alifatisk organisk syre, fortrinnsvis med 2, 3 eller 4 C-atomer, mer foretrukket eddiksyre, samt basiske betingelser med for eksempel pH 10 og over og forhøyede temperaturer vil resultere i denaturering og solubilisering av monomeren. Monomeren blir deretter utsatt for "foldebetingelser" som muliggjør isolering av biologisk aktiv dimer. Betegnelsen "foldebetingelser" refererer til betingelser hvorved intra- og interkjede disulfldbindingsdannelsen blir fremmet og den denaturerte monomeren får innta en konformasjon assosiert med biologisk aktivitet. Denne prosessen involverer ikke noen forandring i primærstruktur (dvs. aminosyresekvens) til monomeren, men er relatert til dannelsen av den 3-dimensjonale konformasjonen til det dimeriske produktet som er assosiert med biologisk aktivitet. Denne fremgangsmåten innbefatter dannelse av disulfidbindinger og assosiasjon av monomerer til en dimerisk, biologisk aktiv struktur.

For dette formålet blir den denaturerte monomeren behandlet med en foldebuffer som omfatter (a) en svak detergent som definert nedenfor og (b) et organisk oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av DMSO, DMF, DMSO2 og en hvilken som helst blanding av to eller tre av gruppene bestående av DMSO, DMSO2 og DMF, ved nøytral eller alkalisk pH og ved en forsvarlig temperatur, for eksempel mellom omtrent 0°C og omtrent 40°C. En foretrukket er pH er mellom omtrent 7 og omtrent 10, mer foretrukket når det gjelder DMSO har omtrent pH 9 til 9,5, når det gjelder DMF omtrent pH 8,5 og når det gjelder DMSO2 omtrent pH 9,5. Konvensjonelle buffersystemer som kan bli anvendt for folding ifølge foreliggende oppfinnelse er buffere som tilveiebringer tilstrekkelig bufferkapasitet mellom pH 6 og 10. Alle buffere som ikke har noen inhiberende effekt på foldingen av proteiner kan anvendes i foreliggende oppfinnelse. For eksempel utgjør egnede buffere Tris, bis-Tris eller piperazinbuffere. Bufferene kan i tillegg inneholde et salt, om ønskelig, og en basisk aminosyre.

Salter som kan bli anvendt i foldebufferen utgjør for eksempel salter av Na<+>, Li<+>, K<+>, NH4+ Mg<2+>, Ca<2+>, eller Mn<2+> med Cl", F", Br, J", HCO3-, SO4<2->, fosfat, acetat, cyanat eller rhodanid eller andre alkalimetall- eller jordalkalimetall- halogen eller pseudohalogenforbindelser i en konsentrasjon opptil 3 M. Foretrukket er NaCl i en konsentrasjon på 1 til 2 M.

En basisk aminosyre som kan bli anvendt i foldebufferen er for eksempel arginin, fortrinnsvis i en konsentrasjon på 0,5M.

Foretrukket konsentrasjon av DMSO, DMSO2 eller DMF i foreliggende oppfinnelse er fra omtrent 5% til omtrent 40%, mer foretrukket er fra omtrent 10% til omtrent 30%. Ytterligere mer foretrukket konsentrasjon av DMSO er omtrent 10% til omtrent 30%, mer foretrukket er omtrent 20%. For DMF er ytterligere mer foretrukket konsentrasjon omtrent 10% til og med 30%, mer foretrukket er omtrent 10%; for DMSO2 er mer foretrukket konsentrasjon omtrent 10%. Blandinger av DMSO og DMF eller av DMSO og DMSO2 eller av DMF og DMSO2 kan bli anvendt i konsentrasjon på omtrent 5% til omtrent 40%, fortrinnsvis omtrent 10% til omtrent 30%, mer foretrukket er omtrent 10% til omtrent 20% for oppløsningsmidlene samlet.

En svak detergent egnet for folding av et protein fra TGF-fl superfamilien ifølge foreliggende oppfinnelse er en hvilke som helst detergent som muliggjør folding av monomerisk TGF-B-lignende protein til en romlig konformasjon som etter dimerisering er assosiert med den biologiske aktiviteten, mens nevnte monomer blir opprettholdt i en oppløselig form.

Slike detergenter kan være ikke-ioniske, kationiske, anioniske eller zwitterioniske. Foretrukne detergenter er ikke-ionisk detergent digitonin og mer foretrukket er zwitterioniske detergenter 3-(3-kloalmidopropyl)dimetylammonio-l-propansulfonat (CHAPS) og 3-(3-klolamidopropyl)dimetylammonio-2-hydroksy-l -propansulfonat (CHAPSO). Det er også mulig å anvende en blanding av detergenter, for eksempel en blanding av CHAPS og CHAPSO. Svak detergent er fortrinnsvis tilstede i foldebufferen ved en konsentrasjon på omtrent 1 til 100 mM, mer foretrukket er ved en konsentrasjon på 30 til 60 mM, mer foretrukket er ved en konsentrasjon på 30 mM.

I en foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder foldebufferen i tillegg en reduserende forbindelse. En egnet reduserende forbindelse som fremmer dannelsen av disulfider i proteiner eller peptider er for eksempel et lavmolekylvektsulfhydryl reagens valgt fra gruppen bestående av glutation i redusert form, ditiotreitol i dets reduserte form, B-merkaptoetanoI i dets reduserte form, merkaptometanol i dets reduserte form, cystein og cystamin. Fremgangsmåten kan derimot også anvendes dersom en slik forbindelse ikke er tilstede. En egnet konsentrasjon for sulfhydrylreagenset er for eksempel omtrent 1 til 100 mM, fortrinnsvis omtrent 1 til 10 mM, mer foretrukket er omtrent 2,5 mM.

Foldingen blir utført ved fornuftige temperaturer, for eksempel mellom omtrent 0 og omtrent 40°C, fortrinnsvis ved omtrent 4°C, og i tilstrekkelig tidsperiode, for eksempel mellom omtrent 2 og omtrent 720 timer. På grunn av at varigheten av foldingen avhenger av temperaturer som blir anvendt, kan temperaturen bli optimalisert i en hvilken som helst ønskelig foldetidsperiode og vice versa.

Produksjonen av et dimerisk, biologisk aktivt TGF-B-lignende protein ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli utført i en et-trinns fremgangsmåte, hvori monomeren til nevnte protein blir overført til foldebufferen og reaksjonsblandingen blir inkubert i en tidsperiode på for eksempel 2 timer opp til 7 eller flere dager ved en temperatur mellom for eksempel 0°C og 40°C, fortrinnsvis 4°C mens folding og dimerisering foregår kontinuerlig. Proteinkonsentrasjonen i løpet av foldereaksjonen er av stor viktighet på grunn av at når den er for høy kan monomerene gjennomgå vesentlig aggregering som fører til dannelse av uønskede høyere-ordens oligomerer. Endelige utbytter av dimerisk produkt blir øket dersom proteinkonsentrasjonen er mindre enn omtrent 2 mg/ml, og et konsentrasjonsområde på 0,01 til 0,5 mg/ml er foretrukket.

Foretrukne eksempler på foldeeksperimenter ifølge foreliggende oppfinnelse for folding av TGF-63 er som følger:

0,1 mg/ml TGF-B3,

100 mMTris,

eventuelt 1 til 50 mM av en forbindelse valgt fra gruppen bestående av redusert glutation, cystein, cystamin og B-merkaptoetanol (mens som allerede hevdet kan fremgangsmåten også bli anvendt dersom sulfhydrulredokssystemet ikke er tilstede),

1 M NaCl,

0,5 M arginin,

20 til 30% DMSO,

30 mM CHAPS eller CHAPSO,

pH 9 til 9,5;

eller

0,1 mg/ml TGF-B3,

100 mM Tris,

2,5 mM av en forbindelse valgt fra gruppen bestående av redusert glutation, cystein, cystamin og B-merkaptoetanol (mens som allerede angitt ovenfor kan fremgangsmåten også bli anvendt dersom det ikke er tilstede sulfhydrylredokssystem,

IM NaCl,

0,5 M arginin,

10% DMF,

30 mM CHAPS eller CHAPSO,

pH 8,5.

Etter foldingen blir den biologiske aktive dimeren renset for å fjerne ufullstendig foldet TGF-B-lignende protein og urenheter, spesielt pyrogener eller andre endotoksiner som kan være tilstede ved fremstillingen etter produksjon av det rekombinante proteinet i mikrobielle vertsceller. Separering av dimeren blir utført ved kromatografi så som størrelsesgel kromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi eller ionebyttekromatografi, for eksempel på en Mono S kolonne og revers fase HPLC.

Dimeriske biologiske aktive TGF-B-lignende proteiner produsert ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen, kan bli anvendt i forskjellige terapeutiske modaliteter.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1: eks<p>resjon av TGF- B 1. TGF- B2 og TGF- B3 i E. coli

Eksempel IA: generelle fremgangsmåter

bakteriell stamme:

- E. coli K12/LC 137: htpRam, Ion^, lacgm, mal^, frp^, phogm, rspL, tsx::TnlO, supCts (Goff, S.A. et al. (1984) PNAS 81, 6647-6651).

Plasmider:

- pPLMu (Buell, G. et al. (1985) Nucleic Acids Res. 13,1923-1938): dette plasmidet inneholder bakteriofag I Pl promoteren med fag Mu ner genribosom bindingssetet (Van Leerdam, E. et al. (1982) Virology 123,19-28). -pclg57: plasmid kodende for en termolabil X,clg57 repressor og som utviser resistens mot kanamycin (Remault, E. et al. (1983) Gene 22,103-113).

SDS gel- elektroforese:

SDS polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og proteinfarging blir utført som tidligere beskrevet (Laemmli, U.K. (1970) Nature 227,680-685) ved anvendelse av Miniprotean II celle fra BIORAD og 1 mm tykke 18% polyakrylamidgeler.

Varmeinduksion:

7 ml LB-medium (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) i et 20 ml dyrkningsrør inneholdende 40 ug av både ampicillin og kanamycin (LB/amp/kan) blir inokulert med en enkelt koloni og inkubert med risting over natt ved 30°C. 5 ml av denne over natt kulturen blir tilsatt til 15 ml LB/amp/kan i en 100 ml Erlenmeyer flaske. Denne flasken blir overført til en 42°C vannbad rister. En 2 ml prøve blir tatt før overføringen (ikke-induserende betingelser) og 1 ml prøver ved intervaller på 1 time etter overføringen (induseringsbetingelser). Cellene blir pelletert ved sentrifugering (5 min., 10.000 rpm i en Eppendorf sentrifuge (og supernatanten fjernet). Pelleten blir resuspendert i 100 ul prøvebuffer for SDS-PAGE og oppvarmet i 10 min. ved 95°C. 5 ul alikvoter blir tatt for SDS-PAGE.

Preparerin<g> av kompetente celler:

Kompetente E. coli celler blir dannet ved kalsiumkloirdprosedyren som beskrevet i Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Celler inneholdende plasmid pcl^<57> blir dyrket ved 30°C.

Eksempel IB: Konstruksjon av ekspresjonsvektorene pPLMu. hTGF- fil. pPLMu. hTHF-B 2 oe pPLMu. hTGF- B3 oe ekspresjon av TGF- B 1. TGF- B2 og TGF-B3

Kodende sekvenser til TGF-B1, TGF-B2 og TGF-B3 (vist i sekvenslisten) blir klonet inn i plasmid PGem-5ZF(+) (Promega) spaltet med Ncol, defosforylert med kalvetarm alkalisk fosfatase (Boehringer) og ifylt med Klenow polymerase (Gibco-BRL). De resulterende konstruksjonene blir betegnet pGKM 125 (TGF-B 1), pGKM 740 (TGF-B2) og pGKM 126 (TGF-B3) og anvendt for å transformere kompetente E. coli Yl 090 celler. Kloner inneholdende riktig innskudd kodende for TGF-61, TGF-62 og TGF-63 blir betegnet som E. coli Y1090/pGKM 125 (TGF-61), E.coliY1090/pGKM 740 (TGF-62) og E. coliY1090/pGKM 126 (TGF-63).

E.coli Y1090/pGKM 125, E.coliY1090/pGKM 740 og E.coliY1090/pGKM 126 cellene blir dyrket i LB medium og plasmid DNA blir dannet ifølge fremgangsmåten til Birnboim, H.C. og Doly, H. (1979) Nucleic Acids Research 7,1513. 5 ug plasmid DNA blir fullstendig spaltet i 50 ul restriksjonsbuffer med enten Ncol og Sali (pGKM125), Ncol og EcoRV (pGKM740) eller Ncol alene (pGKM126) som anbefalt av forhandleren (Boehringer). DNA blir presipitert ved tilsetning av 5 ul 3 M natriumacetat, 100 mM MgCl2,5 mM EDTA og 150 ul etanol. Etter inkubasjon ved -70°C i 15 min. blir DNA pelletert ved sentrifugering ved 13.000 g i 15 min. i en SS34 rotor i en Sorvall sentrifuge. Supernatanten blir fjernet og pelleten resuspendert i 80 ul 0,089 M TRIS borat, 0,089 M borsyre og 0,002 M EDTA (TBE buffer) inneholdende 0,25% bromfenol blå og 0,25% xylen cyanol. 4 ganger 20 ul prøver blir elektroforert gjennom en 1% agarose gel i TBE buffer inneholdende 0,5 ug/ml etidiumbromid ved 50 volt helt til bromfenol blå markøren når bunnen av den 10 cm lange og 0,8 cm tykke gelen. DNA fragmenter kodende for moden TGF-81, TGF-62 og TGF-63 blir visualisert under kortbølge UV lys, spaltet ut med et barberblad og elektroeluert fra gelstykket i en Schleicher & Schiill Biotrap apparatur ved å anvende 200 mamp i 1,5 timer. De eluerte DNA fragmentene blir presipitert (se ovenfor) og resuspendert i 20 ul TE. 5 fil plasmid pPLMu blir linearisert ved spaltning med enten Ncol og Sali, Ncol og EcoRV eller bare Ncol og gelrenset som beskrevet ovenfor for fragment DNA. 100 ng av linearisert og renset pPLMu vektor DNA og 3 ganger den molare ekvivalenten av det respektive rensede fragment DNA blir inkubert ved 4°C i 15 timer i 20 ul ligeringsbuffer (70 mM TRIS/HC1, pH 7,5,10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,1 mM adenosin-trifosfat) inneholdende 1 enhet DNA ligase (Boehringer). 10 ul av ligeringsblandingen blir tilsatt til 200 ul kald (4°C) kompetente E. coli LC 137 celler inneholdende plasmid pclg57. Etter 30 min. blir cellene varmesjokkbehandlet ved inkubasjon i 1,5 min. i et 42°C vannbad. 2 ml LB medium blir tilsatt og kulturen ristet i 60 min. ved 30°C. 200 ul alikvoter blir sådd ut på LB plater inneholdende ampicillin og kanamycin og inkubert i 22 timer ved 30°C. Enkeltkolonier blir dyrket og plasmid DNA analysert. Subkloning av DNA fragmenter kodende for TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 i pPLMu resulterer i plasmidene pPLMu.hTGF-Bl, pPLMu.hTGF-B2 og pPLMu.hTGF-B3. Kloner inneholdende ovennevnte konstruksjoner blir referert til som E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-Bl, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B2 ogE. coli 137/pPLMu.hTGF-B3.

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-Bl, E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B2 og E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B3 celler blir varmeindusert (se eksempel IA) og uttrykte proteiner blir analysert ved SDS-PAGE. TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3 fremkommer alle 2 timer etter varmeinduksjonen som varmeinduserte proteiner som migrerer med en tilsynelatende molekylmasse på omtrent 12.000 Da.

Eksempel 1C: fermentering av transformanter

Over natt kulturer av E.coliLC137/pPLMu.h.TGF-fll, E.coliC137/pPLMu.h.TGF-B2 og E.coliLC137/pPLMu.h.TGF-B3 i 21 Erlenmeyer flasker inneholdende 750 ml LB medium med 40 mg/l ampicillin og kanamycin blir dyrket ved 30°C. 300 ml av over natt kulturene blir tilsatt til 750 ml LB medium inneholdende antibiotika som nevnt ovenfor i 2 1 Erlenmeyerflasker og oppvarmet til 42°C ved risting i omtrent 3,5 minutter i et 65DC vannbad. Flaskene blir deretter overført til en 42°C rister og inkubert i 3 timer. Flaskene blir nedkjølt til 12°C i et isvannbad og cellene samlet etter sentrifugering i 10 minutter ved 8000 rpm i en GSA rotor (Sorvall).

Eksempel 2: ekspresjon av TGF-B 1, TGF-B 2 oe TGF-B 3 i Saccharomyces cerevisiae De kodende sekvensene til moden TGF-fll, TGF-B2 og TGF-B3 blir uttrykt i Saccharomyces cerevisiae under kontroll av den induserbare promoteren til gjærsyrefosfatase (PH05).

Ekspresjonsvektorene blir konstruert i to trinn:

A. konstruksjon av plasmid pJDB207/PH05-RIT 12;

B. konstruksjon av plasmidene pJDB207R/PH05-TGF-Bl, pJDB207R/PH05-TGF-B2 og pJDB207R/PH05-TGF-B3,

hvor A) tilveiebringer gjærvektoren og PH05 transkripsjonen terminator og B) tilveiebringer ekspresjonskassettene med et innskudd kodende for moden TGF-B 1, TGF-B2 og TGF-B3, under kontroll av PH05 promoteren.

Eksempel 2A: konstruksjon av plasmid pJDB207/ PH05- RIT 12

Plasmid p31RIT 12 (europeisk patentsøknad EP 277.313) blir linearisert med restriksjonsendonuklease Sali. Delvis HindUI spaltning i nærvær av ethidiumbromid resulterer i et 1 kb San/Hindffl fragment omfattende 276 bp Sall/BamHI pBR322 sekvensen, 534 bp promoteren til gjærsyrefosfatase PH05, gjærinvertase signalsekvensen (kodende for 19 aminosyrer) og PH05 transkripsjonen terminator. 1 kb San/HindHI fragmentet til p31RTT 12 blir klonet inn i gjær-E.coli skyttelvektoren pJDB207 (Beggs, J.D. i: Molecular Genetics in yeast, Alfred Benzon Symposium 16, Copenhagen, 1981, s. 383-389) som var blitt spaltet med Sali og HindUI. Det resulterende plasmidet inneholdende 1 kb innskuddet blir referert til som pJDB207/PH05-RIT 12.

Eksempel 2B: konstruksjon av plasmid pJDB207R/ PH05- TGF-B3

Plasmid pGKM740 (TGF-B3) (se eksempel l.G) blir spaltet med Ncol. De klebrige endene blir ifylt med en reaksjon med Klenow DNA polymerase. EcoRI linker (5-CCGGAATTCCGG; Biolabs) blir tilsatt og blandingen ligert. Det resulterende sirkulære plasmidet blir referert til som pGKMA668 (TGF-B3) og spaltet med EcoRI og Sali. Et 0,4 kb EcoRI/Sall fragment blir isolert fra en agarosegel, renset og resuspendert i sterilt vann i en konsentrasjon på 25 ug/ml. Fragmentet inneholder den modne kodende sekvensen til TGF-B3 med en ATG i ramme til kodon GCT som definerer aminosyren Ala 1 til moden TGF-B3.

PH05 promoteren blir isolert fra plasmid p31RIT 12 (se ovenfor) på et 534 bp BamHIÆcoRI fragment. Plasmid pJDB207/PH05-RIT 12 blir spaltet med BamHI og Xhol. Det store 6,8 kb BamHI/XhoI fragmentet blir isolert. PH05 transkripsjonen terminator forblir på fragmentet. BamHIÆcoRI PH05 promoterrfagmentet, EcoRI/SaTT fragmentet kodende for TGF-B3 og BamHI/XhoI vektorfragmentet blir ligert. En korrekt klon med TGF-63 genet under kontroll av PH05 promoteren klonet i en mot klokkeretning orientering inn i pJDB207 blir referert til som pJDB207R/PH05-TGF-B3.

På en analog måte blir moden TGF-61 og TGF-62 uttrykt i S. cerevisiae. Plasmider inneholdende de kodende sekvensene til TGF-61 og TGF-63 er henholdsvis pGKM125 og pGKM126 (se eksempel 1G). Etter spaltning av disse plasmidene med Ncol, tilsetning av EcoRI linkere og ligering, blir de resulterende sirkulære plasmidene spaltet med EcoRI og Sali. EcoRI/Sall fragmentene blir klonet inn i pJDB207 som beskrevet ovenfor. De resulterende plasmidene blir referert til som pJDB207R/PH05-TGF-61 og pJDB207R/PH05-TGF-B3.

Eksempel 2C: Transformasjon av S. cerevisiae stamme GRF18

Saccharomyces cerevisiae stamme GRF18 ( MATct. his3- ll. his3- 15. leu2- 3. Ieu2- 112, can^, DSM 3665) blir transformert med plasmidene

pJDB207R/PH05-TGF-Bl

pJDB207R/PH05-TGF-B2

pJDB207R/PH05-TGF-B3

ved anvendelse av transformasjonsprotokollen beskrevet av Hinnen, A. et al. (1978) PNAS 75,1929. Transformerte gjærceller blir selektert på gjærminimale mediumskåler som mangler leucin. Enkelt transformerte gjærkolonier blir isolert og referert til som Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-61

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-B2 og

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-TGF-63.

Eksempel 2D: fermentasjon av S. cerevisiae transformanter og preparering av celleekstrakter

Gjær transformanter, som nevnt ovenfor, inneholder plasmider med PH05 promoter-kontrollerte ekspresjonskassetter og krever derfor derepressjon av promoteren for ekspresjon av TGF-B 1, TGF-B2 eller TGF-B3. Transformanter blir hver og en dyrket i to suksessive forkulturer (10 ml og 50 ml) i gjær høy Pj minimalmedium dannet ifølge oppskriften til Difco Yeast Nitrogen Base uten aminosyrer, men som inneholder lOg/1 L-asparagin i stedenfor (NH^SCXj, 1 g/l L-histidin og 20 g/l glukose. Cellene til den andre forkulturen blir vasket i 0,9% NaCl og alle cellene blir anvendt for å inokulere 100 ml lav Pj minimalmedium dannet ifølge oppskriften til Difco Yeast Nitrogen Base medium (uten aminosyrer), men som inneholder 0,03 g/l KH2PO4,10 g/l L-asparagin, 1 g/l L-histidin og 20 g/l glukose. Kulturene blir agitert ved 30°C ved 180 rpm.

Celler fra 10 ml kultur blir samlet ved 5 timer, 24 timer og 48 timer ved sentrifugering ved 3000 rpm og vasket en gang i 0,9% NaCl. Cellepelleten blir resuspendert i lyseringsbuffer [66 mM kaliumfosfat pH 7,4,4 mM Zwittergent (Calbiochem)]. 8 g glasskuler (0,5-0,75 mm i diameter) og tilsatt og suspensjonen blir omfattende ristet 4-5 ganger i 2 min. hver på en vortex mikser i kulde. Celleekstraktet blir dekantert for å fjerne glasskulene. Celledebris i ekstraktet blir sedimentert ved sentrifugering i 5 min. ved 3000 rpm ved 4°C. Supematanten og pelletene blir separert og lagret ved -20°C.

Eksempel 3

Eksempel 3A: isolering av ikke- oppløselig monomerisk TGF-B 3 fra E. coli

E. coli LC 137/pPLMu.hTGF-B3 cellene blir fermentert som beskrevet i eksempel 1C. Celleødelegging og isolering av ikke-oppløselige TGF-B3 blir utført ved 4°C. Omtrent 18 g våte celler blir suspendert i 60 ml 0,1 M TRIS/HCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenyl Methan Sulphonyl Fluoride), pH 8,3 (oppbruddsbuffer). Cellene blir sendt to ganger gjennom en Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) ifølge forhandlerens instruksjoner og volumet blir bragt til 200 ml med oppbruddsbufferen. Suspensjonen blir sentrifugert i 20 min. ved 15000 g. Oppnådd pellet blir suspendert i 100 ml oppbruddsbuffer inneholdende 1 M NaCl og sentrifugert i 10 min. som ovenfor. Pelleten blir suspendert i 100 ml oppbruddsbuffer inneholdende 1% Triton X-100 (Pierce) og på ny sentrifugert i 10 min. som ovenfor. Den vaskede pelleten blir deretter suspendert i 50 ml 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% DTT og homogenisert i en teflon vevsmaler. Den resulterende suspensjonen inneholder rå monomeriske TGF-B3 i en ikke-oppløselig form.

Eksempel 3B: solubilisering og rensing av monomerisk TGF- B3

10 ml TGF-B3 suspensjon oppnådd ifølge eksempel 3 A blir surgjort med 10% eddiksyre til pH 2,5 og sentrifugert i en Eppendorf sentrifuge i 10 min. ved romtemperatur. Supematanten blir kromatografert på en Sephacryl S-100 kolonne (Pharmacia, 2,6 x 78 cm) i 10% eddiksyre ved en strømningsrate på 1,4 ml/min. (Alternativt kan kromatograferingen bli utført på Sephacryl S-100HR (Pharmacia) og kolonnen kan bli kjørt i 1% eddiksyre eller 5 mM HC1). Fraksjoner inneholdende monomerisk, denaturert TGF-B3 som eluerer mellom 190 min. og 220 min. blir slått sammen. Dette materialet blir anvendt for foldingen for å oppnå biologisk aktiv, dimerisk TGF-B3 (eksempel 4) eller for ytterligere rensing og strukturanalysering (eksempel 3D).

Eksempel 3C: isolering av monomerisk TGF- 13 3 fra Saccharomyces cerevisiae

Pelleten av oppbrutte celler oppnådd fra en 500 ml fermentasjon utført som beskrevet ovenfor blir suspendert i 20 ml 4M urea, 0,1 M TRIS, 1% DTT, pH 8,0. Blandingen blir oppbevart ved romtemperatur i 30 min. med vortex behandling hvert 5. minutt. Uoppløselig materiale blir fjernet ved sentrifugering ved 30.000 g i 30 min. ved 4°C og supematanten justert til pH 2,5 med eddiksyre og omfattende dialysert mot 5% eddiksyre over natt ved 4°C. Oppløsningen blir sentrifugert som ovenfor og den klare supematanten blir konsentrert ved ultrafiltrering på en YM 10 membran (Amicon) til et sluttvolum på 4 ml. Prøven blir deretter kromatografert på Sephacryl S-100 HR (Pharmacia) i 5% eddiksyre som beskrevet i eksempel 3 for å tilveiebringe monomerisk TGF-B3.

Eksempel 3D: <y>tterligere rensing av monomerisk TGF-B 3 ved RP- HPLC

Alikvoter av sammenslåtte fraksjoner fra Sepharyl S-100 kolonnen (eksempel 3.B) blir renset på en Vydac 214TP5415 HPLC revers fasekolonne (4,6 x 150 mm, The Separations Group, Hesperia, CA, USA). Kolonnen blir ekvilibrert i en blanding av 70% TFA 0,1% i vann og 30% TFA 0,08% i acetonitril og produktet blir eluert av en lineær gradient over 30 min. som avsluttes med en blanding av 55% TFA 0,1% i vann og 45% TFA 0,08% i acetonitril ved en strømningsrate på 1 ml/min. Eluatet blir registrert for absorbanse ved 216 nm og individuelle topper blir samlet manuelt ifølge UV absorbansen. Denaturert, monomerisk TGF-B3 blir eluert ved 21,5 min. Avhengig av den individuelle revers fase kolonnen anvendt for separering blir det samme preparatet av TGF-B3 eluert rundt 16 min. og 18 min.

TGF-B3 fraksjonene blir analysert ved RP-HPLC ved anvendelse av samme kolonne og oppløsningsmiddelsystem som ovenfor. TGF-B3 blir eluert av en lineær gradient over 42 min. begynnende fra 100% TFA 0,1% i vann og avsluttes med en blanding av 30% TFA i vann og 70% TFA 0,08% i acetonitril. TGF-B3 blir eluert som en enkelt topp etter 30,4 min. Avhengig av den individuelle kolonnen anvendt blir retensjonstider på 29 min. og 29,9 min. oppnådd.

Eksempel 3E: analysering av monomerisk TGF-B 3 ved SDS- PAGE

Individuelle alikvoter fra Sephacryl S-100 kolonnen (eksempel 3.B) eller revers fase kolonnen (eksempel 3.D) blir tørket i vakuum og analysert ved SDS-PAGE på 15% polyakrylamid slab geler farvet med Coomassie Blue R-250. Et enkelt bånd med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 12.000 Da blir oppnådd og kan ikke skjelnes fra redusert naturlig grise TGF-B3.

Eksempel 3F: N- terminal aminosyresekvens bestemmelse av monomerisk TGF- B3 TGF-B3 fra eksempel 3.B blir avdampet i vakuum, oppløst i 25 ul 0,1 M eddiksyre og utsatt for aminosyresekvens bestemmelse på en gassfase protein sekvenator modell 470A (Applied Biosystems).

N-terminal aminosyresekvens er identisk med den som er vist i sekvenslisten under SEQ ID NO: 6.

Eksempel 4: in vitro folding av TGF- B3

TGF-B3 oppnådd ovenfor blir foldet ved 4°C i en buffer bestående av 0,1 M Tris, 30 mM CHAPS, IM NaCl, 5 mM redusert glutation og 20% (v/v) DMSO. Om nødvendig blir pH til bufferen justert til pH 9,5 med NaOH. Sluttkonsentrasjonen av TGF-B3 er 0,1 mg/ml. Etter 7 dager ved 4°C blir oppløsningen surgjort med konsentrert eddiksyre til pH 3,5, konsentrert omtrent 10 ganger ved ultrafiltrering i en Amicon omrørt celle med YM 10 membran (Amicon). Konsentrert oppløsning blir fortynnet til opprinnelig volum med 0,1M eddiksyre og rekonsentrert. Denne prosedyren blir gjentatt 2 ganger. Oppløsningen blir deretter utsatt for ionebyttekromatografi som beskrevet i eksempel 5.

Eksempel 5: isolering av dimerisk biologisk aktiv TGF- B3 ved kationbytte kromatografi.

Oppløsningen oppnådd i eksempel 4 inneholdende mellom omtrent 10 og 50 mg TGF-63 blir applisert med 6 ml/min på en HiLoad 26/10 S-Sepharose høy ytelse kolonne (Pharmacia). Kolonnen blir først vasket med 20 mM natriumacetat, 30% isopropylalkohol, pH 4,0 (buffer A) i 5 minutter og deretter eluert med en lineær gradient over 45 min. begynnende med buffer A inneholdende 0,2 M NaCl og som blir avsluttet med buffer A inneholdende 0,5 M NaCl. Eluatet blir registrert ved 280 nm og manuelt separert. Fraksjoner blir undersøkt for dimerisk TGF-B3 ved ikke-reduserende SDS-PAGE og for biologisk aktivitet ved in vitro bioanalyse.

Eksempel 6: ytterligere rensning og karakterisering av dimerisk TGF-B3

Eksempel 6A: ytterligere rensning ved RP- HPLC

Fraksjoner inneholdende dimerisk biologisk aktiv TGF-B3 blir slått sammen, dialysert mot 0,1 M eddiksyre og fortynnet med samme volum av 0,1% TFA i vann og utsatt for RP-HPLC på Vydac 214TP510 kolonne (1 cm x 25 cm, The Separations, Gruop, USA). Kolonnen blir ekvilibrert ved en strømningsrate på 4,5 ml/min. med en blanding av 75% oppløsningsmiddel A [TFA 0,1% i vann] og 25% oppløsningsmiddel B [TFA 0,08% i acetonitril]. Etter applisering av prøven blir kolonnen vasket under ekvilibreringsbetingelser helt til absorpsjonen registrert ved 235 nm har nådd grunnlinjenivået. Kolonnen blir deretter eluert med 30 min med en lineær gradient begynnende ved ekvilibreringsbetingelser og som blir avsluttet med en blanding av 45% oppløsningsmiddel A og 55% oppløsningsmiddel B. Eluatet blir separert manuelt og analysert ved ikke-reduserende SDS-PAGE og ved in vitro bioanalyse.

Eksempel 6B: analysering ved SDS- PAGE

Alikvoter av renset TGF-B3 ifølge eksempel 6 blir tørket i vakuum og analysert ved SDS-PAGE på 15% polyakrylamid slab geler farvet med Coomassie Blue R-250. Ureduserte prøver utviser et enkelt bånd med tilsynelatede molekylvekt på rundt 25 kDa, mens reduserte prøver viser et bånd på rundt 12,5 kDa.

Eksempel 6C: molekylmasse bestemmelse

Renset TGF-B3 fira eksempel 6A blir analysert ved Electrospray ioniseringsmasse spektrometri (ESI-MS). Den totale massen som finnes er nær opp til den teoretiske ventede verdien:

Eksempel 6D: aminosvreanalyser

Aminosyreanalyser ble utført som beskrevet i Knecht, R. and Chang, J.-X., Analytical Chemistry 58:2375-2379 (1986). Resultatene er i samsvar med teorien.

Eksempel 6E: N- terminal aminosyresekvens bestemmelse

10-20 mg TGF-J33 ifølge eksempel 6A blir avdampet i vakuum, oppløst i 25 ml 10 mM eddiksyre og utsatt for aminosyresekvens bestemmelse på en gassfase sekvenator modell 477A (Applied Biosystems). Aminosyresekvensen til de første 10 residiene som er blitt bestemt var som ventet fra teorien.

Eksempel 6F: proteol<y>tisk fragmentering med Asp- N protease

92 mg (6,7 nmol) TGF-63 blir redusert, 4-vinylpyridyletylert, tørket i en vakuum sentrifuge og på ny løst opp i 200 ml 5 mM HC1,200 ml 0,2 M tris-acetat buffer, pH 7,8, inneholdende 10 mM Zwittergent 3-12 detergent (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA), blir tilsatt og blandet med proteinoppløsningen. Spaltningen blir utført med 2 mg (oppløst i 50 ml vann) endoproteinase Asp-N (fra Pseudomonas fragi mutant, Sequence Grade, Boehringer Mannheim Biochemica, FRG) ved 37°C. Etter 13 timer blir 50 ml 10% (v/v) TFA tilsatt og blandingen separert ved RP-HPLC på en Vydac 218TP5415 kolonne (4,6 mm x 150 mm, The Separations Group) med en lineær gradient på 45% (v/v) acetonitril i 0,1% TF A/vann i 40 min. ved en strømningsrate på 0,1 ml/min. Isolerte peptider blir analysert ved Electrospray Ionisation Mass Spectrometry, ESI-MS. Molekylære masser som blir bestemt er i samsvar med de beregnede verdiene for ventede Asp-N fragmenter.

Identifiserte fragmenter dekker den fullstendige aminosyresekvensen med unntagelse av residiene 1 og 2. Disse aminosyrene blir identifisert ved N-terminal sekvensbestemmelse av hele proteinet og ved analysering av V8 fragmentene.

Eksempel 6G: proteolytisk fragmentering med V8 protease

I likhet med eksperiment 9 med Asp-N protease blir 4-vinylpyridylert TGF-63 spaltet med protease V8 og fragmentene separert ved RP-HPLC og analysert ved ESI-MS. Molekylærmassene som blir bestemt er i samsvar med teoretiske verdier og viser videre identiteten til TGF-63. Fragmentene som er blitt identifisert dekker hele sekvensen med 112 aminosyreresidier.

Eksempel 7: in vitro aktivitetstest for foldet TGF-B : mink lunge epitel celle ( Mv- l- Lu) syre fosfatase analyse

TGF-B eller hybrid TGF-B blir screenet in vitro, i en cellulær bioanalyse som måler potensen til forbindelsen når det gjelder inhibering av veksten til en kontinuerlig minklunge epitel cellelinje Mv-l-Lu (ATCC/CCL64). Mv-l-Lu cellelinjen har vist seg å være en sensitiv reporter i bioanalysen for TGF-b og utviser en sigmoid-formet konsentrasjonsrespons med en rapportert EC50 på omtrent 10-50pg/ml (Tucker et al., Science 1984; 226: 705-707; Absher et al., J Immunol Methods 1991; 138: 301-303; Danielpour et al., J Cell Physiol 1989; 138: 79-86). Mv-l-Lu celler, hvor proliferasjonen er sterkt inhibert av TGF-B, blir for tiden betraktet som den cellelinjen som er mest egnet for utvikling av en analytisk bioanalyse for dette cytokinet (Kelley et al., Exp Lung Res 1992; 18: 877-887; Meager, J Immunol Methods 1991; 141: 1-14). Analysen blir utført i 96-brønn mikrotiterskåler ved anvendelse av celler som opprinnelig ble oppnådd, ved passering 46, fra American Type Culture Collection, Rockville MD, USA. Cellene blir sådd ved lav tetthet (5000 celler pr brønn) i vekstmedium (minimal essensielt medium med 5% v/v føtalt kalveserum) inneholdende seriefortynninger av en TGF-B standard eller prøve. Analysene blir deretter inkubert ved 37°C i en fuktig 5% CO2 inkubator i 72 timer. Inhibisjon av celleproliferasjonen blir bestemt ifølge en sensitiv enzymatisk cellefarvingsfremgangsmåte (som gir en kolorimetrisk vurdering av mengden sur fosfatase som blir produsert i hver brønn), i det intensiteten til farvingen tilsvarer antall celler som er tilstede i hver brønn. Absorbanse O.D. til hver brønn blir bestemt ved 405 nm og analysedata blir plottet og analysert ved hjelp av en egnet PC programvare. I denne analysen blir en enhet (U) aktivitet beskrevet som mengden av TGF-B nødvendig for halv-maksimal inhibisjon av Mv-l-Lu celleproliferasjon.

Eksempel 8: in vivo aktivitetstester for foldet TGF- B3

Eksempel 8A: leging av halvl- tykke sår hos eldre mus

Det er kjent at sårlegingsprosessen blir redusert med alderen og representerer derfor

hovedproblemer innen området geriatrisk medisin. In vivo biologiske effekter av foldet aktiv dimerisk TGF-B3 når det gjelder leging av halv-tykke sår (dannet etter annen grads forbrenning) blir undersøkt i en delvis manglende eller redusert sårrepareringssituasjon, dvs. i eldre dyr ved anvendelse av følgende protokoll: Enkelt middermale termiske sår blir dannet på dorsal thorax til bedøvde gamle C57/BL6 mus (alder 450 dager eller mere) hvor ryggene på forhånd var blitt barbert og fjernet med en kommersiell krem-type hårfjerningsmiddel, med en enkelt 10 sekunders

applikasjon av et messingtemplat (lxl cm, 8 gm) som var blitt ekvilibrert ved 80°C i et vannbad. Den resulterende blemmen blir fjernet kirurgisk og brannsårene behandlet daglig i S dager med en topisk applikasjon av 25 ml steril bærerbuffer oppløsning (bestående av 0,8% w/v hydroksypropylcellulose i en oppløsning av 10 mM histidin, 140 mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (500 ng, 100 ng eller 10ng) av foldet aktiv dimerisk TGF-63, eller med bare bufferoppløsning, eller latt være ubehandlet. Alle topiske anvendte materialer er sterile, endotoksin-frie og pyrogen-frie, og alle musene blir individuelt huset i løpet av eksperimentet. Hver eksperimentelle gruppe består av 5 dyr.

Etter 5 dagers behandling med TGF-B3 blir musene bedøvd, blærer (om tilstede) blir fjernet kirurgisk fra brannsårene, og brannsårene blir fotografert. Områder av brannsårene som har på ny dannet epithel blir angitt på overhead projektor film som er gjennomsiktige og med jevn størrelse og prosentandel av hvert opprinnelige brannsårområde som er blitt leget blir beregnet ved planimetri. Resultatene blir også sammenlignet med epithelial regenerasjonsprosessen i unge (56-84 dager gamle) C57/BL6 mus med identiske middermale brannsår som blir latt være ubehandlet i løpet av varigheten av eksperimentet.

Resultatene av planimetriske analyser demonstrerer at topisk applikasjon av foldet aktiv dimerisk TGF-B3 daglig i 5 dager i en egnet bærerbuffer stimulerer og aksellererer epitelialdannelsen i halv-tykke sår hos gamle mus på en doseavhengig måte sammenlignet med bare bærerbuffer eller ubehandlede sår. Unge mus er tilsynelatende nok kompetente for vellykket re-epitelialisering av deres sår i fravær av topisk applisert TGF-B3. Histologiske analyser viser grad av forsterket re-epitelialiseringsprosess sammen med en hyperkeratose av regenerert epidermis på dag 6 i TGF-J33-behandlede sår.

Eksempel 8B: leging av full- tykkelsessår hos voksne rotter

Biologiske effekter til foldet aktiv dimerisk TGF-B3 blir også undersøkt i en andre in vivo modell for sårleging, dvs. leging av full-tykkelsessår (dannet ved kirurgisk innsnitt) hos voksne rotter, ved anvendelse av følgende protokoll som beskrevet av Mustoe, T.A. et al. (1987) Science 237:1333.

Enkelt, fult-tykkelses 5-cm lange lineære innsnitt blir dannet med kirurgiske sakser 1,5 cm på begge sidene av dorsal midtlinjen til pentobarbitonbedøvde hann Wistar rotter

(300-350 g) hvor ryggene på forhånd er blitt barbert og behandlet med en kommersiell kremtype hårfjerningsmiddel. I de eksperimentelle gruppene mottar kantene av venstreside innsnitt (sett fra doral side øverst) enkelt topiske applikasjoner (100 ml) av en steril bærerbuffer (bestående av 0,8% w/v hydroksypropyl cellulose i en oppløsning av lOmM histidin, 140mM NaCl, pH 7,4) inneholdende forskjellige mengder (2 mg, 1 mg, 0,1 mg eller 0,01 mg) av en foldet aktiv dimerisk TGF-B3. Kantene til de kontralaterale høyreside innsnittene mottar tilsvarende like mengder av en placebo kontroll (bovin serumalbumin) i nevnte bærerbuffer og innsnittskantene i konrrolldyrene mottar bare bærerbuffer i venstre side innsnittene og ingen behandling i høyre side innsnittene etter kirurgisk innsnitt. Alle topiske anvendte materialer er sterile, endotoksin-frie og pyrogen-frie. Kantene til hvert sår blir deretter påført 5 jevnt plasserte, avbrutte horisontale mattress sting av 5-0ethilon. Alle dyrene blir huset separat og sårene blir helet i varierende perioder opp til og inkludert 21 dager etter behandlingen. Etter offringen blir hele dorsalhuden fjernet fra hvert dyr og alt subkutant fett blir forsiktig dissektert fra undersiden av huden ved anvendelse av en kirurgisk skalpell. En templat bestående av to parallelle kirurgiske knivblader (8 mm avstand mellom bladene) blir deretter anvendt for å ta ut striper av hud (mellom stingene på hvert innsnitt) for strekkfasthet målinger. Prøver blir tatt fra hver ende av hvert innsnitt for histologiske analyser. Maksimal belastning tolerert av hver uttatte hudprøve blir målt med en Universal Strength Machine Model 144501 (Zwick, Ulm, FRG). Målinger blir dannet på 30 mm x 8 mm strimler som blir forsikret mellom hydrauliske klyper og deretter strukket til bristepunktet i en rate på 10 mm pr minutt, med maksimal belastning registrert på en kartavleser. Målingene blir utført på triplikate prøver fra hvert sår og eksperimentelle grupper består av 4 dyr. Bruddstyrken blir ikke målt på sår som viser tegn på infeksjon eller omfattende haemorrhaging (mindre enn 3% av alle sårene).

Resultater av strekkfasthetmålingene demonstrerte at en enkelt topisk applikasjon av foldet aktiv dimerisk TGF-B3 i en egnet bærerbuffer fremmer bruddstyrken opp til to ganger, og aksellererer legingen, av full-tykkelsesinnsnittssår i voksne rotter på en doseavhengig måte over en periode på 21 dager sammenlignet med kontrollgruppen. Histologiske analyser viser betydelig øket influks av mononukleære celler, fibroblaster og kollagenproduksjon i TGF-B3-behandlede sår over en 21 dagers periode sammenlignet med kontrollsårene. En forbigående hyperkeratose sees også i TGF-B3 behandlede sår opp til 14 dager etter behandlingen.

Eksempel 9: preparering av solubilisertc monomeriske hybrid TGF- B proteiner og solubilisert monomerisk BMP- 2

Eksempel 9. 1. hybrid TGF- B

5 ml plasmid pPLMu blir linearisert ved spaltning med Ncol og Sali og gelrenset som beskrevet ovenfor for fragment DNA. lOOng linearisert og renset pPLMu vektor DNA og 3 x molare ekvivalent av respektivt renset fragment DNA kodende for hybrid TGF-61-3, TGF-B2-3 og TGF-B3-2, vist i sekvenslisten blir inkubert ved 4°C i 15 timer i 20 ul ligeringsbuffer (70 mM TRIS-HC1, pH 7,5,10 mM MgC12,5 mM DTT, 0,1 mM adenosin-trifosfat) inneholdende 1 enhet DNA ligase (Boehringer). 10 fil av ligeringsblandingen blir tilsatt til 200 ul kald (4°C) kompetente E. coli LC137 celler inneholdende plasmid pcl857. Etter 30 minutter blir cellene varmesjokk behandlet ved inkubasjon i 1,5 min. i et 42°C vannbad. 2 ml LB medium blir tilsatt og kulturen blir ristet i 60 min. ved 30°C. 200 ul alikvoter blir sådd ut på LB skåler inneholdende ampicillin og kanamycin og inkubert i 22 timer ved 30°C. Enkeltkolonier blir dyrket og plasmid DNA analysert. Subkloning av DNA fragmenter kodende for TGF-B 1-3, TGF-B2-3 og TGF-B3-2 i pPLMu resulterer i plasmidene pPLMu.TGF-Bl(44/45)B3, pPLMu.TGF-B2(44/45)B3 og pPLMu.TGF-B3(44/45)B2. Kloner inneholdende ovennevnte konstruksjoner blir referert til som E. coliC137/pPLMu.TGF-61(44/45)B3, E. coliC137/pPLMu.TGF-B2(44/45)B3 og E. coliCl37/pPLMu.TGF-B3(44/45)B2.

E. coliC137/pPLMu.TGF-Bl(44/45)B3, E. coliC137/pPLMu.TGF-B2(44/45)B3 og E. coliC137/pPLMu.TGF-B3(44/45)B2 blir varmeindusert (se eksempel 3.A) og uttrykte proteiner blir analysert ved SDS-PAGE. TGF-B1-3, TGF-B2-3 og TGF-B3-2 fremkommer alle 2 timer etter varmeinduksjon som varmeinduserte proteiner som migrerer med en tilsynelatende molekylmasse på omtrent 12.000 Da.

Over natt kulturer av E. coliC137/pPLMu.TGF-Bl(44/45)B3, E. coliCl37/pPLMu.TGF-62(44/45)63 og E. coliC137/pPLMu.TGF-B3(44/45)B2 i 2 1 Erlenmeyer flasker inneholdende 750 ml LB medium med 40 mg/l Ampicillin og Kanamycin blir dyrket ved 30°C. 300 ml over natt kulturer blir tilsatt til 750 ml LB medium inneholdende antibiotika som nevnt ovenfor i 2 1 Erlenmeyer flasker og oppvarmet til 42°C ved risting i omtrent 3,5 min. i et 65°C vannbad. Flaskene blir deretter overført til en 42°C rister og inkubert i 3 timer. Flaskene blir kjølt ned til 12°C i et isvann bad og cellene blir samlet etter sentrifugering i 10 minutter ved 80.000 rpm i en GSA rotor (Sorvall). Prosedyrene angitt nedenfor for produksjon av monomerisk solubilisert TGF-B1-3 hybrid blir også anvendt for solubilisering av TGF-B2-3 og TGF-B3-2.

E. coliC137/pPLMu.TGF-Bl(44/45)B3 cellene blir fermentert som beskrevet ovenfor og inklusjonslegemene blir dannet som følger. Celleoppbrudd og isolering av inklusjonslegemene blir utført ved 4°C. Omtrent 18 g av våtcellene blir suspendert i 60 ml 0,1 M TRIS/HCl, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF (Phenyl Methan Sulphonyl Fluoride), pH 8,3 (oppbruddsbuffer). Cellene blir sendt to ganger gjennom en Frenchpress (SLM Instruments, Inc.) ifølge forhandlerens instruksjoner og volumet blir brakt til 200 ml med oppbruddsbufferen. Suspensjonen blir sentrifugert i 20 min. ved 15.000 g. Den oppnådde pelleten blir suspendert i 100 ml oppbruddsbuffer inneholdende 1 M NaCl og sentrifugert i 10 min. som ovenfor. Pelleten blir suspendert i 100 ml oppbruddsbuffer inneholdende 1% Triton X-100 (Pierce) og på ny sentrifugert i 10 min. som ovenfor.

0,3 g av den vaskede pelleten blir deretter suspendert i 10 ml 20 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1% DTT, pH 8,0 og omrørt med en magnetisk rører i 1 time ved romtemperatur. Prøven blir deretter brakt til pH 2,5 med konsentrert eddiksyre og homogenisert i en teflon vevshomogenisator og sentrifugert i en Centricon H-401 sentrifuge (Kontron Instrumenter) med en bestemt vinkelrotor A.8.24 i 60 min., ved 15°C og 12.000 rpm. Eddiksyren til den klare supematanten inneholdende solubilisert monomerisk TGF-B hybrid blir utvekslet med 10 mM HC1 i en Amicon 8010 omrørt celle med YM405 filter ved gjentatt konsentrering og fortynning av oppløsningen med lOmMHCl.

Eksempel 9. 2: BMP

Inklusjonslegemer inneholdende den modne formen av BMP-2 (opprinnelig nomenklatur=BMP-2A) som beskrevet av Wozney et al., Science 242:1528-1534(1988) med den N-terminale sekvensen Q-A-K-H-K-Q-R-K-R-L-K-S-S-C-K-R-H blir dannet ifølge konvensjonelle prosedyrer i E. coli med T7 polymerase ekspresjonssystemet. BMP-2 DNA anvendt for ekspresjon er vist i sekvenslisten under SEQ ID NO: 13. Rekombinant BMP-2 har et ytterligere methionin ved N-terminusen. I en annen metode blir en mutant av BMP-2, dvs. (Ql)BMP-2 produsert og dette er det samme proteinet som ovenfor med unntagelse av at den første aminosyren er deletert og methionin ikke er tilstede ved N-terminusen. 10 ml BMP-2 eller (-Ql)BMP-2 inklusjonslegemesuspensjon blir surgjort med 10% eddiksyre til pH 2,5 og sentrifugert i en Eppendorf sentrifuge i 10 min. ved romtemperatur. Supematanten blir kromatografert på Sephacryl S-100 kolonne (Pharmacia, 2,6 x 78 cm) i 10% eddiksyre ved en strømningsrate på 1,4 ml/min. Fraksjoner inneholdende monomerisk, denaturert BMP-2 blir slått sammen. Det sammenslåtte materialet blir anvendt i følgende refoldingseksperimenter.

Eksempel 10: serier av refoldingseksperimenter med forskjellige TGF-B. THG- B-hvbrider og BMP- 2

Mangfoldigheten og den omfattende anvendbarheten ifølge oppfinnelsen blir eksemplifisert fra resultatene oppsummert i følgende to serier med eksempler. De spesifikke betingelsene og de individuelle proteinene som blir anvendt i in vitro protein refoldingseksperimentene er oppført. Andre eksperimentelle betingelser er som beskrevet i eksempel 4.

Den biologiske aktiviteten ble bestemt 3 og 7 dager etter begynnende in vitro proteinfolding.

Serie 1: In vitro folding med organisk oppløsningsmiddel DMSO eller DMF i nærvær av CHAPS eller CHAPSO: resultater av bioanalysen

Serie 1 (forts.)

Serie 2: In vitro folding av TGF-B3 i DMS02/CHAPS og av BMP2 og (-Ql)BMP-2 i DMSO/CHAPS

Deponering av mikroorganismer

Følgende mikroorganismer blir deponert til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig (FGR):

Claims (25)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et dimerisk, biologisk aktivt transformerende vekstfaktor type B (TGF-B)-lignende protein eller et salt derav, karakterisert ved å behandle den denaturerte monomeriske formen av nevnte TGF-B-lignende protein med en foldebuffer som omfatter en svak detergent som muliggjør folding av monomerisk TGF-B-lignende protein til en romlig konformasjon som etter dimerisering er assosiert med den biologiske aktiviteten, mens nevnte monomer opprettholdes i en oppløselig form, og et organisk oppløsningsmiddel valgt fra gruppen bestående av DMSO, DMSO2, DMF, og en hvilken som helst blanding av 2 eller 3 medlemmer av gruppen bestående av DMSO, DMSO2 og DMF.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen i tillegg inneholder en reduserende forbindelse.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den svake detergenten velges fra gruppen bestående av digitonin, CHAPS, CHAPSO og en hvilken som helst blanding av medlemmene av gruppen bestående av digitonin, CHAPS og CHAPSO.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den svake detergenten velges fra gruppen bestående av CHAPS, CHAPSO og en hvilken som helst blanding derav.

5. Fremgangsmåte ifølge krav l eller 2, karakterisert ved at den svake detergenten er tilstede i foldebufferen i en konsentrasjon på omtrent 1 til 100 mM.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den svake detergenten er tilstede i foldebufferen ved en konsentrasjon på 30 til 60 mM.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den svake detergenten er tilstede i foldebufferen i en konsentrasjon på 30 mM.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet velges fra gruppen bestående av DMSO, DMSO2 og DMF.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet blir anvendt i en konsentrasjon fra omtrent 5% til omtrent 40%.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet anvendes ved en konsentrasjon fra omtrent 10% til omtrent 30%.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DMSO anvendes i en konsentrasjon på omtrent 10% til omtrent 30%.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9. karakterisert ved at DMSO anvendes i en konsentrasjon på omtrent 30%.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DMF blir anvendt i en konsentrasjon på omtrent 10% til omtrent 30%.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DMF anvendes i en konsentrasjon på omtrent 10%.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at DMSO2 blir anvendt i en konsentrasjon på omtrent 10%.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at blandingen av DMSO og DMF anvendes i en konsentrasjon på 10 til 30% for begge oppløsningsmidlene kombinert.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at TGF-B-lignende protein velges fra gruppen bestående av TGF-B2, TGF-B3, hybrid TGF-B1-2, hybrid TGF-B1-3, hybrid TGF-B2-3, hybrid TGF-B3-2 og BMP-2.

18 Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at TGF-B-lignende protein er TGF-63.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at bufferen har en pH på omtrent 6 til omtrent 10.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at bufferen har en temperatur på omtrent 0°C til omtrent 40°C.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den reduserende forbindelsen er en redusert sulfhydrylforbindelse.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen velges fra gruppen bestående av glutation i dets reduserte form, B-merkaptoetanol i dets reduserte form, merkaptometanol i dets reduserte form, cystein, cystamin og ditiotreitol i dets reduserte form.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen anvendes i en konsentrasjon på omtrent 1 til 100 mM.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen anvendes i en konsentrasjon på omtrent 1 til 10 mM.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den reduserte sulfhydrylforbindelsen anvendes i en konsentrasjon på omtrent 2,5 mM.