CN110382523B - 重组多肽及其组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组多肽、包含该重组多肽的同型二聚体和异型二聚体蛋白、编码该重组多肽的核酸分子，以及包含该核酸分子的载体及宿主细胞。本发明也提供包含该重组多肽的组合物，以及制备、使用该重组多肽的方法。

Description

重组多肽及其组合物及方法
技术领域
电子送件的序列表参照
电子送件的序列表内容(Name:3902.001PC01_SeqListing_ST25.txt,Size:134,451 bytes；and Date of Creation:December 21,2017)已整合入本公开的内文中以供参照。
现有技术
骨是一种高度刚性的组织，构成脊椎骨骼的一部分并具有衍生自其广泛基质结构的独特机械性质。动物终其一生中，骨组织会不断地更新。
骨生成及更新的过程由特定的细胞进行。成骨作用(osteogenesis，骨生成或骨成长)是由成骨细胞(osteoblasts，骨生成细胞)进行。骨再成型作用(Bone remodeling)是由称为破骨细胞(osteoclasts)的骨吸收细胞与骨生成的成骨细胞间相互作用所完成。由于这些过程是由特定的活细胞进行，所以化学(例如：药物和/或激素)、物理及物理化学的变化可影响骨组织的质量、数量及形状。
各种生长因子(例如：PDGF)及细胞激素会参与骨生成的过程。因此，辨识出可在预定位点诱导骨生成的生理可接受的化学介质(例如：激素、药物、生长因子及细胞激素)是相当有价值的。然而，为了成功地将化学介质作为治疗工具，需克服几个障碍。障碍之一包括开发具有骨诱导(osteoinductive)活性的重组多肽。例如：重组人类血小板衍生的生长因子-BB中的骨诱导活性尚未得到证实。另一障碍是在化学介质中骨诱导的变异性。例如：去矿物质骨基质(demineralized bone matrix，DBM)是一种化学介质，是一种衍生自加工骨的骨诱导同种异体移植物。市场上以DBM为基础的产品越来越多，但是在不同产品及同一产品不同批号之间已发现骨诱导的变异性。因此，需要一种化学介质展现一致的骨诱导活性，例如：重组多肽及相关组合物。
发明内容
本公开涉及一种重组多肽，其包含：第一域(domain)，其选自由SEQ ID NO:35及SEQ ID NO:39所组成的群组；第二域，其选自由SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:49所组成的群组；及第三域，其选自由SEQ ID NO:57及SEQ ID NO:61所组成的群组；其中该第一域择一融合于该第二域的C端或N端，该第三域融合于该第二域或该第一域，且其中该重组多肽具有诱导碱性磷酸酶活性的能力。
在一个实施方案中，其中该第一域相较于该第二域位于接近该重组多肽的C端、该第三域相较于该第二域位于接近该重组多肽的N端、或该第一域相较于该第三域位于接近该重组多肽的N端。
在一个实施方案中，该重组多肽的该第二域包含在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间的一个分子内二硫键(intramolecular disulfide bond)。
在一个实施方案中，该重组多肽的该第三域包含：第氨基酸序列PKACCVPTE(SEQID NO:356)及第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO:357)，且其中该第三域包含在该第一和该第二氨基酸序列之间的二个分子内二硫键。
在一个实施方案中，该重组多肽包含在该第氨基酸序列的该第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的该第2个氨基酸之间的第一分子内二硫键，以及在该第氨基酸序列的该第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的该第4个氨基酸之间的第二分子内二硫键。
在一个实施方案中，该重组多肽包含在该第氨基酸序列的该第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的该第2个氨基酸之间的第一分子内二硫键，以及在该第氨基酸序列的该第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的该第4个氨基酸之间的第二分子内二硫键。
在一个实施方案中，该重组多肽选自由SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:268、SEQ IDNO:276、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:300、SEQ ID NO:308、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:340及SEQ ID NO:348所组成的群组。
本公开涉及一种同型二聚体蛋白，其包含任一如上所述的二个相同的重组多肽，其中该同型二聚体蛋白包含在该二个相同重组多肽的第一域之间的一个分子间二硫键。
在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白包含在该二个相同重组多肽的其一的该第一域中的第15个氨基酸和另一重组多肽的该第一域中的第15个氨基酸之间的一个分子间二硫键。
在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白的该二个相同重组多肽的其一或全部的该第二域包含一分子内二硫键。
在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白的每一该重组多肽的该第三域包含：第氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO:356)及第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO:357)，且其中该同型二聚体蛋白包含在该二个相同重组多肽的其一的该第三域中的该第氨基酸序列和该另一重组多肽的该第三域中的该第二氨基酸序列之间的二个分子间二硫键。在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白包含在该二个相同重组多肽的其一的该第氨基酸序列的该第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第2个氨基酸之间的第一分子间二硫键，以及在该二个相同重组多肽的其一的该第氨基酸序列的该第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第4个氨基酸之间的第二分子间二硫键。在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白包含在该二个相同重组多肽的其一的该第氨基酸序列的该第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第2个氨基酸之间的第一分子间二硫键，以及在该二个相同重组多肽的其一的该第氨基酸序列的该第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第4个氨基酸之间的第二分子间二硫键。
在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白的每一该重组多肽的该第三域包含：第氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，且该同型二聚体蛋白包含：在该二个相同重组多肽的其一的该第三域中的该第氨基酸序列和该其一重组多肽的该第三域中的该第二氨基酸序列之间的二个分子内二硫键。在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白包含：在该其一重组多肽的该第氨基酸序列的该第4个氨基酸和该其一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第2个氨基酸之间的第一分子内二硫键，以及在该其一重组多肽的该第氨基酸序列的该第5个氨基酸和该其一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第4个氨基酸之间的第二分子内二硫键。在一个实施方案中，该同型二聚体蛋白包含：在该其一重组多肽的该第氨基酸序列的第5个氨基酸和该其一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第2个氨基酸之间的第一分子内二硫键，以及在该其一重组多肽的该第氨基酸序列的该第4个氨基酸和该其一重组多肽的该第二氨基酸序列的该第4个氨基酸之间的第二分子内二硫键。
本公开涉及一种异型二聚体蛋白，其包含任一如上所述的重组多肽的二个相异的重组多肽，其中该异型二聚体蛋白包含：在该二个相异重组多肽的第一域之间的一个分子间二硫键。
在一个实施方案中，该异型二聚体蛋白包含在该二个相异重组多肽的其一的该第一域中的第15个氨基酸和另一重组多肽的该第一域中的第15个氨基酸之间的一个分子间二硫键。
在一个实施方案中，该异型二聚体蛋白的该二个相异重组多肽的其一或全部的该第二域包含一分子内二硫键。
本公开涉及一种重组多肽，其包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO:260、SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:276、SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:292、SEQ ID NO:300、SEQID NO:308、SEQ ID NO:316、SEQ ID NO:324、SEQ ID NO:332、SEQ ID NO:340及SEQ ID NO:348所组成的群组，其中该重组多肽具有诱导碱性磷酸酶活性的能力。
本公开涉及一种组合物，其包含任一如上所述的重组多肽、任一如上所述的同型二聚体蛋白或任一如上所述的异型二聚体蛋白。
本公开涉及一种持续性释出组合物，其包含磷酸钙载体，该磷酸钙载体选自由磷酸三钙(TCP)、α-磷酸三钙(α-TCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、双相磷酸钙(BCP)及其混合物所组成的群组；及可生物分解基质，该可生物分解基质选自由聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)及其混合物所组成的群组；及如前所述的同型二聚体蛋白。更进一步地，该持续性释出组合物包含(a)约2-11％(w/w)的该磷酸钙载体；(b)约88-97％(w/w)的该可生物分解基质；及(c)约0.017-0.039％(w/w)的该同型二聚体蛋白。
本公开涉及一种需要这种治疗的对象中促进长骨骨折愈合的方法，其包含：制备含有如前所述的同型二聚体蛋白的组合物，该同型二聚体蛋白均匀地容置在一缓释型可生物分解磷酸钙载体内，该可生物分解磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解磷酸钙载体于该对象体内时不渗漏，从而使该长骨骨折愈合限制于该磷酸钙载体的体积内；且植入该组合物于该长骨骨折发生位置，其中该同型二聚体蛋白的量为约0.03mg/g至约3.2mg/g的该磷酸钙载体。
在一个实施方案中，该促进长骨骨折愈合的方法更进一步包含：随着该磷酸钙载体降解，该所容置的同型二聚体蛋白于该磷酸钙载体位置逐渐暴露，其中该磷酸钙载体具有约0.4至约1.8的钙与磷酸盐比率。
本公开涉及一种可生物分解组合物，具有诱导骨生成以在一个位置形成骨质的能力，其包含：如前所述的同型二聚体蛋白；及可生物分解磷酸钙载体，其具有多个孔洞。更进一步地，该同型二聚体蛋白是约0.003-0.32％(w/w)。
在一个实施方案中，其中该可生物分解组合物的该可生物分解磷酸钙载体的孔隙率大于70％，且孔径为约300μm至约600μm。
在一个实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体的孔洞是连通分布于该可生物分解磷酸钙载体；其中该同型二聚体蛋白的有效量为约0.03mg/g至约3.2mg/g的该可生物分解磷酸钙载体。
在一个实施方案中，该可生物分解组合物适用于使一个组织凸出，该组织选自鼻沟、眉间、中面部组织、下颚轮廓线、下巴及脸颊。
在一个实施方案中，该位置是选自长骨骨折缺损、二个相邻脊椎骨体的空间、不愈合骨的缺陷、上颚截骨切口、下颚截骨切口、矢状劈开截骨切口、颏整型截骨切口、快速颚扩张截骨切口、以及在二个相邻脊椎骨的二个相邻横突之间纵向延伸的空间。
在一个实施方案中，单一剂量的该同型二聚体蛋白为约0.006mg至约15mg。
在一个实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解磷酸钙载体于该对象体内时不渗漏，从而使所形成的骨质限制于该可生物分解磷酸钙载体的体积内。
本公开涉及一种用以促进关节固定(arthrodesis)的方法，其包含将如前所述的该同型二聚体蛋白及可生物分解磷酸钙载体施用在一个畸形或退化的关节。
在一个实施方案中，施用该同型二聚体蛋白的步骤是包括每一次治疗将约0.006mg至约10.5mg的该同型二聚体蛋白施用至该畸形或退化的关节。
本公开涉及一种促进脊椎融合的方法，该方法的步骤包含：暴露一个上脊椎骨和一个下脊椎骨；在该上脊椎骨和该下脊椎骨之间辨别出一个用以融合的部位；在该上脊椎骨及该下脊椎骨的各个用以融合的该部位上暴露一个骨表面；及于该部位上施用如前所述的该同型二聚体蛋白及可生物分解磷酸钙载体。
在一个实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体是一种不可压缩递送载具，且其中该不可压缩递送载具是施用于需要骨生长但不自然发生骨生长的二个骨表面之间的该部位。
在一个实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体包含至少一个用以施用于该部位的植入棒，该植入棒在该上脊椎骨及该下脊椎骨之间纵向延伸。
本公开涉及一种脊椎融合装置，其含有如前所述的可生物分解组合物；及一个脊椎融合器，其被配置用以容置该可生物分解磷酸钙载体。
本公开涉及一种于有需求的对象的脊椎中产生骨质以融合二个相邻脊椎骨体的方法，其步骤包括：准备用于产生该骨质的组合物；及将该组合物引入该二个相邻脊椎骨体之间的位置。更进一步地，该组合物含有如前所述的同型二聚体蛋白，该同型二聚体蛋白均匀地容置在一缓释型可生物分解载体内，该可生物分解载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解载体于该对象体内时不渗漏，从而使所形成骨质限制于该缓释型可生物分解载体的体积内。随着该缓释型可生物分解载体降解，所容置的同型二聚体蛋白于该缓释型可生物分解载体位置逐渐暴露，且其中该同型二聚体蛋白的量为该位置约0.2mg/部位(即每一部位约0.2mg)至约10.5mg/部位(即每一部位约10.5mg)。
在一个实施方案中，该缓释型可生物分解载体具有多孔结构，且来自该二个相邻脊椎骨的细胞迁移到该多孔结构中以产生该骨质。
在一个实施方案中，该缓释型可生物分解载体具有一个初始体积，且随着该缓释型可生物分解载体被再吸收，该骨质取代该缓释型可生物分解载体的该初始体积。
本公开涉及一种在有需求的对象中通过后方融合术(posterior fusion)或椎间孔融合术(transforaminal fusion)用以融合相邻脊椎骨体的方法，其步骤包括：准备一个盘空间，用以在该相邻脊椎骨之间的椎间空间中接收一个椎间盘植入物；将含有如前所述的同型二聚体蛋白的一个缓释型载体引入该椎间盘植入物中；并将该椎间盘植入物引入该相邻脊椎骨之间的盘空间中，以在该盘空间中产生骨质。更进一步地，该同型二聚体蛋白的量为约0.2mg/部位至约10.5mg/部位的该缓释型载体。
本公开涉及一种用于填补骨孔隙的可模制组合物，其包含：含有该可模制组合物约90wt％至约99.5wt％的可模制基质；及如前所述的该同型二聚体蛋白。更进一步地，于植入后约1、24、48、72、168、240或约336小时，从该可模制组合物释出少于约25％百分率的该同型二聚体蛋白。
本公开涉及一种持续性释出组合物，其包含磷酸钙载体；可生物分解基质；及如前所述的重组蛋白。更进一步地，该磷酸钙载体是约2-11％(w/w)，该可生物分解基质是约88-97％(w/w)，及该重组蛋白是约0.017-0.039％(w/w)。
在一个实施方案中，该磷酸钙载体选自由磷酸三钙(TCP)、α-磷酸三钙(α-TCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、双相磷酸钙(BCP)及其任意组合所组成的群组。在一个实施方案中，该可生物分解基质选自由聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)及其任意组合所组成的群组。
本公开涉及一种在一个对象中用以促进长骨骨折愈合的方法，其包含：(a)制备组合物，其含有如前所述的重组蛋白及可生物分解磷酸钙载体；(b)使该组合物硬化；及(c)在一个位置植入该组合物。更进一步地，该位置是所述对象中发生长骨骨折的受伤部位，且该重组蛋白是约0.003-0.32％(w/w)。
在一个实施方案中，该方法进一步包含(d)随着该磷酸钙载体降解，于该位置暴露该组合物。在一个实施方案中，该磷酸钙载体包含约0.4-1.8的钙与磷酸盐比率(calcium-to-phosphate ratio)。
本公开涉及一种在一个对象中用以促进关节固定(arthrodesis)的方法，其步骤包括：将含有如前所述的重组蛋白及可生物分解磷酸钙载体之组合物施用于所述对象中的一个位置。更进一步地，该重组蛋白的量是约0.006至10.5mg，且该位置选自由畸形关节、退化性关节及其组合所组成的群组。
本公开涉及一种在一个对象中用以促进脊椎融合的方法，其包含：(a)暴露所述对象的一个上脊椎骨和一个下脊椎骨；(b)在该上脊椎骨和该下脊椎骨之间辨别出一个用以融合的部位；(c)在该上脊椎骨和该下脊椎骨的各个用以融合的部位上暴露一个骨表面；及(d)于该部位上施用如前所述的重组蛋白及可生物分解磷酸钙载体。
在一个实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体是一种不可压缩递送载具，其能够施用于需要骨生长但不自然发生骨生长的部位。
在一个实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体于该用以促进脊椎融合的方法中包含有在该上脊椎骨和该下脊椎骨之间纵向延伸的一植入棒。
本公开涉及一种脊椎融合装置，其含有如前所述的可生物分解组合物；及一个脊椎融合器，其被配置用以保留该可生物分解磷酸钙载体。
本公开涉及一种在一个对象的脊椎中用以产生骨质以融合二个相邻脊椎骨体的方法，其步骤包括：(a)准备用于产生该骨质的组合物，该组合物包含有如前所述的重组蛋白及一缓释型可生物分解载体；(b)使该组合物硬化；(c)将该组合物引入该二个相邻脊椎骨体之间；及(d)释出该组合物并暴露该重组蛋白。更进一步地，该重组蛋白的量是约0.2至10.5mg/部位。
在一个实施方案中，该缓释型可生物分解载体具有能够接收用以产生骨质的细胞的多孔结构。
在一个实施方案中，该缓释型可生物分解载体具有一个初始体积，且随着该缓释型可生物分解载体被再吸收，该骨质取代该缓释型可生物分解载体的该初始体积。
本公开涉及一种于有需求的对象中用以融合相邻脊椎骨体的方法，其步骤包括：(a)准备一个盘空间，用以在该相邻脊椎骨之间接收一个椎间盘植入物；(b)将包含有如前所述的重组蛋白的缓释载体引入该椎间盘植入物中；(c)将该椎间盘植入物引入该盘空间；及(d)于该盘空间中产生骨质。更进一步地，该重组蛋白的量是约0.2至10.5mg/部位。
本公开涉及一种用以植入于骨孔隙中的可模制组合物，其包含：可模制基质及如前所述的重组蛋白。更进一步地，该可模制基质的量是约90至99.5％(w/w)；并且于植入后的预定时间之后，少于25％的该重组蛋白从该可模制组合物释放。
在一个实施方案中，该预定时间是约1、24、48、72、168、240或336小时。
附图简要说明
图1A和1B所示为实验组A-G的雌兔(NZW品系)尺骨的代表性X光影像。每个实验组中的尺骨包含外科手术创造的20mm大的圆周缺陷(即缺损部位)。于实验组A-F，将植入物制成于该缺损部位之中。实验组A-E中的每个尺骨接受200mg的β-TCP植入物。实验组A、B、C和D中的该β-TCP是分别作为包含有二个重组多肽的同型二聚体蛋白(即SEQ ID NO：260，含有分子内二硫键C44-C48)的2、6、20和60μg载体。实验组E中的该β-TCP不携带任何重组多肽。实验组F接受髂骨碎片自体植入物。实验组G在该缺损部位未接受任何植入物。对实验组A-G各组于0周(即手术后立即摄影，以「0W」表示)时，以及在手术后2、4、6及8周(即分别以「2W」、「4W」、「6W」及「8W」表示)时拍摄X光影像。该尺骨上的植入部位(实验组A-F)或缺损部位(实验组G)位于每个影像中白色星号的正上方。
图2A及2B所示为实验组A-G的代表性计算机断层扫描(CT)影像。植入部位(实验组A-F)或缺损部位(实验组G)中心处的横断面影像随着时间的变化，所显示为0周(即手术后立即摄影，以「0W」表示)，以及手术后4周及8周(即分别以「4W」和「8W」表示)。实验组A-G是如图1所述。
图3所示为未经手术改造无缺损的尺骨及实验组A-G(即分别以「A」至「G」表示)的抗扭强度测试结果图示。显示了牛顿-公尺(Newton-meters，以「N-m」表示)的最大扭矩。实验组A-G是如图1所述。
图4至9所示为实验组1至6的绵羊脊柱的代表性X光影像。实验组1至3是接受3.5g的β-TCP单一植入物，该植入物是分别带有10.5、3.5或1.05mg包含有二个重组多肽的同型二聚体蛋白(即SEQ ID NO：260，含有分子内二硫键C44-C48、C80-C112及C79-C114)。实验组4是接受3.5g的β-TCP单一植入物，该植入物不带有任何同型二聚体蛋白。实验组5是接受骨自体移植的单一植入物。实验组6是接受含有3.15mg rhBMP-2的可吸收胶原蛋白海绵的单一植入物。图4至9的每张图中，从左至右所示分别为实验组1至6的手术后(post-operatively)、第4周及第12周(收获)拍摄的放射线图像。于图4至9中，分别将实验组1至6指定为「2179」、「2192」、「2187」、「2160」、「2162」及「2166」。
图10所示为椎体融合器的代表性图式。每排左侧的图像所示为该椎体融合器的俯视图，右侧的图像所示为侧视图。放大倍率：顶行＝x0.67；中行＝x2；底行＝x4。椎体融合器尺寸：约8mm×24mm×10mm。
图11所示为运动角度范围的代表性图式，分别为：在0周时测量接受150mg的β-TCP植入物的绵羊脊柱(即「零时」)；在12周时测量接受150mg的β-TCP植入物的绵羊脊柱，该β-TCP分别带有0、0.1、0.5、1.0、2.0或4.0mg包含有二个重组多肽的同型二聚体蛋白(即SEQID NO：260，含有分子内二硫键C44-C48，及分子间二硫键C79-C112及C80-C114)；在12周时测量接受骨自体移植的植入物的绵羊脊柱。绵羊是雌性，品系为Ewe。图式显示了每种测试条件和方向的运动范围的平均值和标准偏差。
图12A至C所示分别为代表性微电脑断层扫描(μCT)影像的轴向、冠状及矢状面图像，其是接受带有如图11所述的同型二聚体蛋白的量为0.1mg/部位的植入物的绵羊脊柱。其中「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及「I」分别表示腹侧、背侧、右侧、左侧、上方及下方。该部位产生了骨骼而充满了椎体融合器内大部分的空间，然而，在两终板接口处出现透明。
图13A至C所示分别为代表性微电脑断层扫描(μCT)影像的轴向、冠状及矢状面图像，其是接受带有如图11所述的同型二聚体蛋白的量为0.5mg/部位的植入物的绵羊脊柱。其中「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及「I」如图12A至C所述。该部位表现出良好的骨骼质量，但移植物内存在一些透明线。
图14A至C所示分别为代表性微电脑断层扫描(μCT)影像的轴向、冠状及矢状面图像，其是接受带有如图11所述的自体移植物的绵羊脊柱。其中「V」、「D」、「R」、「L」、「S」及「I」如图12A至C所述。该部位在当下时间点骨骼并未完全填满该器。此外，终板内还有一些透明。
图15a及15b所示为微粒在14天释放期间的该同型二聚体蛋白释放的相对量(图15a)及该同型二聚体蛋白释放的累积百分比(图15b)。
图16所示为代表性扫描电子显微镜影像，其是在-20℃、4℃及25℃下储存6个月的聚乳酸-乙醇酸/同型二聚体蛋白-磷酸三钙(PLGA/Hp-β-TCP)。
图17所示为代表性X光影像，其是植入如图16所述的PLGA/Hp-β-TCP且带有不同剂量的同型二聚体蛋白于0周及4周后的Balb/C小鼠胫骨。每张影像中的白色箭头是用以标识该骨缺损。(C组：坏死骨对照(即没有植入任何支架的骨碎片)；PT组：PLGA/β-TCP(即无同型二聚体蛋白)；POT-02组：PLGA/0.2μg Hp-β-TCP；POT-08组：PLGA/0.8μg Hp-β-TCP；POT-1.6组：PLGA/1.6μg Hp-β-TCP；及POT-3.2组：PLGA/3.2μg Hp-β-TCP)。
图18所示为于坏死骨中植入4周后新骨生成/面积百分比的代表性图式，其中各组如图17所述。
图19A至D所示为本文的实施例制剂的横断面表示图：携带本文的多肽/蛋白质的载体(如β-TCP)颗粒(图19A)；与携带该本文的多肽/蛋白质的载体颗粒混合的凝胶(图19B)；包含本文的多肽/蛋白质的凝胶(图19C)；及包含本文的多肽/蛋白质的凝胶，其是具有均匀分布在该凝胶外层的携带本文的多肽/蛋白质的载体颗粒(图19D)。
图20所示为在特定小时的时间区间内所释放的同型二聚体蛋白的累积百分比的图式。
具体实施方案
本文提供重组多肽、包含该重组多肽的同型二聚体及异型二聚体蛋白、编码该重组多肽的核酸分子及载体，及表达该重组多肽的宿主细胞。本文也提供该重组多肽的组合物及制造、使用该重组多肽的方法。
本文引用的所有出版物在此通过引用整体并入，包括但不限于本文引用的所有期刊文章、书籍、手册、专利申请和专利，其程度和范围如同每个单独的出版物被具体地和单独地指出通过引用而并入。
[专门用语]
除非另有定义，本文中所有技术和科学用语与本发明所属领域中具有通常知识者所理解的含义相同。如在整个本申请中所使用的，以下术语应具有如下意义。
除非上下文中另有指定外，本文及申请专利范围所述单数格式的「一」、「一个」、「一种」及「该」包含复数指涉。因此，例如：「一域」是包含一个域或多个域、「该重组多肽」包含一个或多个重组多肽，诸如此类。本文中的用语例如：「一」、「该」、「一或多」、「复数」及「至少为一」可互相代换。
除非另有说明，本文所述的「或」表示「和/或」之意。相似地，本文所述的「包含」、「包括」、「含有」、「囊括」、「具有」也可互相代换而不受限制。
除此之外，本文所述的「和/或」、「及/或」被用作特指表达两个特定特征或构件的其一或全部。因此，用语「和(及)/或」用于表达语句如「A和/或B」是包含「A和B」、「A或B」、「(单独)A」「(单独)B」之意。相同的，用语「和/或」用于表达语句如「A、B和/或C」是包含如后所述的意义：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；(单独)A；(单独)B；(单独)C。
应当理解，本文用语「包含」无论在描述任何方面的情况下，也提供了以「由…组成」和/或「基本上由…组成」所描述的其他类似方面的意义。
「氨基酸」是一种具有一个与氢原子连结的中心碳原子(α-碳原子)、一个羧基(该碳原子在本文中称为「羧酸碳原子」)、一个氨基(该氮原子在本文中称为「氨基氮原子」)以及一侧链R基团的结构的分子。当并入肽、多肽或蛋白质时，氨基酸会在脱水反应中失去其氨基酸羧基上的一或多个原子将一个氨基酸与另一个氨基酸连结。因此，当并入蛋白质时，将氨基酸称为「氨基酸残基」。
「蛋白质」或「多肽」是指经由肽键连结的二或更多个单独氨基酸的任何聚合物(无论是否为天然存在)，并且是发生在当与氨基酸(或氨基酸残基)上的α-碳原子键结的羧基上的羧酸碳原子对于与一个邻近氨基酸上非α-碳原子键结的氨基的氨基氮原子变为共价键。所述的「蛋白质/蛋白」是包含「多肽」和「肽」的意义(内文用语会互相代换)。除此之外，蛋白质包含多个多肽次单元(如：DNA聚合酶III、RNA聚合酶II)或其他组合物(如：RNA分子、也会在端粒酶中发生)在本文中也被理解包含进「蛋白质」的意义。相似地，蛋白质和多肽的碎片也在本公开涉及的「蛋白质」范畴。一方面，本公开的多肽包含二或多个亲代肽段的嵌合体。用语「多肽」也涉及和包含该多肽翻译后修饰(Post-translation modification，PTM)的产物，包含但不限于二硫键生成、糖基化、胺甲酰化、脂化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知的保护/阻断基团衍生、分解蛋白切割、被非天然氨基酸修饰、或任何其他调控或修饰，例如与标记成分接合。多肽可衍生自天然生物来源或通过基因重组技术产生，其未必是从特定核酸序列翻译。其可经由任何方法包括化学合成的方式生成。「经分离」的多肽或片段、变体或其衍生物是指不在其天然环境中的多肽。不需要特定程度的纯化。例如：经分离多肽可以是简单的从其天生或天然环境移除。为了本公开之用，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽及蛋白质被认为是经过分离的，视同天然或重组多肽已经被经由任何适当技术分离、分级、部分或大体上的纯化。
本文所述的「域」可被用语「肽段」代换，其是涉及较大的多肽或蛋白质的部分或碎片。域不需具有本身的功能活性，然而在一些例子中，域可具有其自身的生物活性。
一个给定蛋白质的特定氨基酸序列(即当从氨基末端到羧基末端写入时，该多肽的「一级结构」)是由mRNA编码部分的核苷酸序列所确定，其又由遗传信息来指明，通常是基因组DNA(包括细胞器DNA，如：粒线体或叶绿体DNA)。因此，确定基因的序列有助于预测对应多肽的一级序列，更具体而言是经由该基因或多核苷酸序列的编码预测多肽或蛋白质的作用或活性。
本文所述的「N端」是指多肽中相对于该多肽上氨基末端的氨基酸、域或肽段的方位或位置。例如：「A域位于B域和C域的N端」意指A域是位于相较于B域和C域更靠近氨基末端的位置，如此，当B域和C域的位置未特别指定时，该多肽中的域其自氨基末端的排列顺序则可理解为A-B-C或A-C-B。此外，包含零的任何数量氨基酸可存在于一域之间，该域是另一域的N端。相似地，包含零的任何数量氨基酸可存在于该多肽的N端及一域之间，该域是该多肽中其它域的N端。
本文所述的「C端」是指多肽中相对于多肽上羧基末端的氨基酸、域或肽段的方位或位置。例如：「A域位于B域和C域的C端」意指A域是位于相较于B域和C域更靠近羧基末端的位置，如此，当B域和C域的位置未特别指定时，该多肽中的域其自氨基末端的排列顺序则可理解为B-C-A或C-B-A。此外，包含零的任何数量氨基酸可存在于一域之间，该域是另一域的C端。相似地，包含零的任何数量氨基酸可存在于该多肽的C端及一域之间，该域是该多肽中其它域的C端。
当提及二硫键时，本文所述的「分子内」及「分子间」，其是分别涉及发生在多肽链之内及多肽链之间的二硫键。
当涉及二个或更多个域以广义地指形成本文所公开的重组多肽中任何化学或物理偶合(coupling)该二个或更多个域时，用语「融合」、「操作性连结(operably linked)」及「操作性结合(operably associated)」在本文中可互相代换。在一个实施方案中，如本文所公开的重组多肽是包含来自二个或更多个相异多肽的多个域的嵌合体多肽。
包含本文所公开的二个或更多个域的重组多肽可以由包含编码每个域的多核苷酸序列的单个编码序列所编码。除非另有说明，编码每个域的多核苷酸序列为「in frame(在框架内)」，如此包含该多核苷酸序列的单一mRNA的翻译会使单一多肽包含每个域。一般而言，本文所公开的重组多肽中的域会直接彼此融合或被肽连结子(peptide linker)所分离。编码肽链接子的各种多核苷酸序列是本领域已知的。
本文所述的「同型二聚体蛋白(质)」、「异型二聚体蛋白(质)」、及「同型二聚体或异型二聚体蛋白(质)」是指具有二个相同或相异重组多肽的蛋白。因此，本文所述的该「同型二聚体蛋白(质)」、「异型二聚体蛋白(质)」、及「同型二聚体或异型二聚体蛋白(质)」亦指「同型二聚体重组蛋白(质)」、「异型二聚体重组蛋白(质)」、及「同型二聚体或异型二聚体重组蛋白(质)」。更进一步地，本文所述的「重组蛋白(质)」是指「同型二聚体蛋白(质)」、「异型二聚体蛋白(质)」、或「同型二聚体或异型二聚体蛋白(质)」。
本文所述的「多核苷酸」或「核酸」是指聚合形式的核苷酸。在一些情况下，多核苷酸包含其来源的有机体天然存在的基因组中的一序列，该序列若非是非直接紧邻该编码序列就是直接紧邻(在5’终端或3’终端上)该编码序列。因此，该用语包含例如：被并入载体中的重组DNA、被并入自主复制的质粒或病毒中的重组DNA、或被并入原核或真核的基因组DNA中的重组DNA，或者是独立于其他序列如同分离分子(如cDNA)般存在的重组DNA。本文所述的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或该核苷酸之一的修饰型。本文所述的多核苷酸尤其是指单链及双链DNA、单链及双链区域混合体的DNA、单链及双链RNA以及单链及双链区域混合体的RNA、包含DNA及RNA的杂交分子，其可以是单链，或更典型地是双链或单链及双链区域混合体。用语多核苷酸包含基因组DNA或RNA(取决于生物体，即病毒的RNA基因组)及被该基因组DNA编码的mRNA，以及cDNA。于某些实施方案中，多核苷酸包含传统磷酸二酯键或非传统键(如：酰胺键，在肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)中发现)。「经分离」核酸或多核苷酸是指从其天然环境中移出的核酸分子如：DNA或RNA。举例而言，为了本公开的目的，「经分离」认为是核酸分子包含多核苷酸，该多核苷酸编码载体中含有的重组多肽。进一步举例经分离的多核苷酸包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中从其他多核苷酸纯化(一部分或大部分)的重组多核苷酸。经分离的RNA分子包含本公开的多核苷酸的体内(in vivo)或体外(in vitro)RNA转录物。根据本公开的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的多核苷酸和核酸(如：核酸分子)。
本文所述的「编码区」或「编码序列」是多核苷酸的一部分，其由可翻译成氨基酸的密码子组成。尽管「终止密码子(stop codon)」(TAG、TGA或TAA)一般不会被翻译成氨基酸，其被认为可以是编码区的一部分，但任何毗邻序列如：启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等等并非编码区的一部分。编码区的边界通常由位于5’端的起始密码子(即编码所得多肽的氨基末端)，及位于3’端的翻译终止密码子(即编码所得多肽的羧基末端)所决定，但本发明不限于此。
本文所述的「表达控制区」是指转录控制单元，其可操作地与编码区结合，以引导或控制由编码区编码的产物表达，包括如：启动子、增强子、操纵子、阻遏子、核糖体结合位点、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构及转录终止信号。举例而言，若启动子功能的诱导导致包含编码产物的编码区的mRNA转录，且如果启动子和编码区之间的连接性质不会干扰启动子引导由编码区编码的产物其表达的能力或是干扰DNA模板被转录的能力，则编码区和启动子是「可操作地结合」。表达控制区包含位于编码区上游(5’非编码序列)内部或下游(3’非编码序列)的核苷酸序列，其会影响相关联编码区的转录、RNA加工、稳定性、或翻译。如果编码区用于真核细胞中的表达，则多腺苷酸化信号及转录终止序列通常位于编码序列3’端。
「核苷酸片段」、「寡核苷酸片段」或「多核苷酸片段」是指一较之大多核苷酸分子的一部分。多核苷酸片段不需对应至蛋白质经编码的功能域，然而在某些情况下，该片段将编码蛋白质的功能域。多核苷酸片段的长度可为大约6个或更多的核苷酸(例如：6-20、20-50、50-100、100-200、200-300、300-400个或更多核苷酸的长度)。
本文所述的「载体」是指用以将核苷酸分子克隆和/或转移到宿主细胞中的任何媒介物。用语「载体」包括病毒及非病毒载体(如：质粒、噬菌体、黏粒、病毒)，用以体外、离体或体内将该核酸导入至一细胞中。
本文所述的「宿主细胞」及「细胞」用语可相互代换，其是指携带或能够携带核酸分子(如：重组核酸分子)的任何类型的细胞或细胞群体，如：原代细胞、培养的细胞、或来自细胞系的细胞。宿主细胞可以是原核细胞或是真核细胞，例如：真菌细胞如酵母菌细胞、各种动物细胞如昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本文所述的「培养(Culture、to culture、culturing)」是指允许细胞生长、分裂或维持细胞处于存活状态的体外条件下孵育细胞。本文所述的「经培养细胞」是指经体外繁殖的细胞。
本文所述的「骨诱导性/骨诱导性(Osteoinductive)」是指可诱导(或称诱导)骨和/或软骨的形成或生长，包括例如：诱导与骨和/或软骨生成或生长相关的标记(如：诱导碱性磷酸酶活性)。
本文所述的「酵母双杂交试验」或「酵母双杂交系统」用语可被相互代换，其是指用以检测蛋白质对之间的交互作用的试验或系统。在典型的双杂交筛选试验/系统中，转录因子被分裂为两个独立的片段，分别为结合域(binding domain，BD)和活化域(activationdomain，AD)，片段各别提供于独立的质粒上，且片段各别与感兴趣的蛋白质融合。该酵母双杂交试验系统包含(1)一个「诱饵」载体，其包括一个诱饵蛋白质及系统中所用该转录因子的结合域；(2)一个「猎物」载体，其包括一个猎物蛋白质(或一个裂物蛋白质文库，被筛选用以与该诱饵蛋白质进行交互作用)及该转录因子的活化域；及(3)一个合适的报导酵母菌株，其含有结合序列用以于系统中所使用的该转录因子的该结合域。当诱饵-猎物发生交互作用时，该转录因子的该活化域驱动一个或更多个报导蛋白质的表达。将该诱饵载体和该猎物载体导入该报导酵母菌株，其中经表达的诱饵蛋白质和经表达的猎物蛋白质可能相互作用。或者，可将各自含有诱饵载体或猎物载体的独立单倍体酵母菌株配对，而所得到的二倍体酵母菌株表达两种蛋白质。相互作用的诱饵及猎物蛋白质对会导致该转录因子的重组和活化，然后与该报导酵母菌株中所提供与其兼容的活化域结合，依次触发该报导基因的表达，其随后可被侦测。
[重组多肽及组合物]
本文的公开涉及一种重组多肽，其包含任二个或多个选自由SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355所组成的群组的域，包含但不限于如表3所示二个域的任何组合。在一个实施方案中，该重组多肽包含任三个域，包含但不限于如表3所示三个域的任何组合。
如本文所述的重组多肽的任一域可位于相对该重组多肽的氨基末端或羧基末端的任何位置。举例而言，如本文所述的重组多肽的任一域可位于该重组多肽中任一个或多个其他域的N端。相似地，如本文所述的重组多肽的任一域可位于该重组多肽中任一个或多个其他域的C端。
本公开一种重组多肽，其包含任二个或多个选自由SEQ ID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及355所组成的群组的域，其具有相较于在该重组多肽中任何个别域更高地活化素受体IIB蛋白质(即ActRIIBecd)细胞外域的亲和力。ActRIIB的核酸序列及多肽序列以及天然存在的变异是已知的。举例而言，ActRIIBecd可为如本文所述的SEQ ID NO：9，其对应如本文所述的SEQ ID NO：8的27-117残基。亲和力可通过如：放射性免疫测定法(RIA)、表面等离子共振(如：BIAcoreTM)或本领域已知的任何其他结合分析来测量。在一个些实施方案中，此般重组多肽包含二个域的组合，选自如后的域的组合：SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：61及SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：35、SEQID NO：57及SEQ ID NO：47，其中该二个域中的任一个是位于另一域的N端或C端。在一些实施方案中，此般二个域的组合产生一个包含选自由如后所述序列的群组所组成的重组多肽：SEQ ID NO：188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248及254。在一些实施方案中，此般重组多肽包含三个域的组合，该域的组合选自如下：SEQ ID NO：39、49及61；SEQ IDNO：35、47及57；SEQ ID NO：39、47及61；SEQ ID NO：35、49及57；SEQ ID NO：39、57及47；SEQID NO：35、61及49，其中任一域是位于另一或另二个域的N端或C端。在一些实施方案中，此般三个域的组合产生一个包含选自如后所述序列的群组所组成的重组多肽：SEQ ID NO：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340及348。
本公开一种重组多肽，其包含SEQ ID NO：39的第一域、SEQ ID NO：49的第二域及SEQ ID NO：61的第三域，其中该第一域相较于该第二域位于接近该重组多肽的C端、该第三域相较于该第二域位于接近该重组多肽的N端、或其组合。于某些实施方案中，该重组多肽包含第一域选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组、第二域选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组、第三域选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组，其中该第一域相较于该第二域位于接近该重组多肽的C端、该第三域相较于该第二域位于接近该重组多肽的N端、或当该第一域、第二域及第三域分别为SEQ ID NO：39、49及61时其的组合。
于某些实施方案中，本文所公开的重组多肽包含一个翻译后修饰(post-translation modification，PTM)，包含但不限于二硫键形成、糖基化、胺甲酰化、脂化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白裂解切割、通过非天然存在氨基酸修饰，或任何其他操作或修饰，例如：与标记成分接合。
于某些实施方案中，重组多肽可包含一个或更多个半胱氨酸，其在生理条件下或任何其他标准条件(例如：纯化条件或储存条件)下能够参与一个或更多个二硫键的生成。于某些实施方案中，二硫键是在重组多肽中的二个半胱氨酸残基间所形成的分子内二硫键。于某些实施方案中，二硫键是在二聚体中二个重组多肽之间形成的分子间二硫键。在某些实施方案中，分子间二硫键是在如本文所述的二个相同重组多肽之间所形成，其中该二个相同的重组多肽形成一同型二聚体。于某些实施方案中，同型二聚体包括至少一个或多于三个分子间二硫键。于某些实施方案中，分子间二硫键是在如本文所述的二个相异重组多肽之间所形成，其中该二个相异重组多肽形成一异型二聚体。于某些实施方案中，异型二聚体包括至少一个或多于三个分子间二硫键。
本公开一种重组多肽，其包含第一域，其选自由SEQ ID NO：35及SEQ ID NO：39所组成的群组；第二域，其选自由SEQ ID NO：47及SEQ ID NO：49所组成的群组；以及一第三域，其选自由SEQ ID NO：57及SEQ ID NO：61所组成的群组；其中该重组多肽包含一个分子内二硫键。
于某些实施方案中，该第一域、该第二域、该第三域或其组合包含一个分子内二硫键。于某些实施方案中，一个或更多个分子内二硫键位于单一域之内、一域和另一域之间、具有多于二个半胱氨酸的一个域和一个或多个另一域之间、或其组合。于某些实施方案中，该第一域包含一二硫键。于某些实施方案中，该第二域包含一二硫键。于某些实施方案中，该第三域包含一二硫键。于某些实施方案中，每一个域包含一二硫键。当涉及分子内二硫键时，本文所述的「域包含一二硫键」是指当一个域中存在多于一个半胱氨酸时单一域中二个半胱氨酸之间的二硫键，或是指在两个的其中一域中的半胱氨酸和另一域中的半胱氨酸之间的二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽的该第二域包含在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间的一个分子内二硫键。于某些实施方案中，于该第一域和该第三域之间、该第三域内、或两者皆是，该重组多肽进一步包含一个或多个附加的分子内二硫键。于某些实施方案中，于该第三域的第9个氨基酸和该第三域的第43氨基酸之间、在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第41氨基酸之间、在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第43氨基酸之间、或在该第三域的第9氨基酸和该第三域的第41个氨基酸之间，该重组多肽进一步包含一个分子内二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽于该第三域的第9氨基酸和该第三域的第43的氨基酸之间进一步包含一个二硫键，以及在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第41氨基酸之间包含一个二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽在该第三域的第8氨基酸和该第三域的第43的氨基酸之间进一步包含一个二硫键，以及在该第三域的第9氨基酸和该第三域的第41氨基酸之间包含一个二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽的该第三域包含第氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)和第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，其中该第三域在该第氨基酸序列和该第二氨基酸序列之间包含二个分子内二硫键或二个分子间二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽在该第氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含一个第一分子内二硫键或第一分子间二硫键，以及在该第氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含一个第二分子内二硫键或第二分子间二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽在该第氨基酸序列的第5个氨基酸和该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含一个第一分子内二硫键或第一分子间二硫键，以及在该第氨基酸序列的第4个氨基酸和该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含一个第二分子内二硫键或第二分子间二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽在该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸之间进一步包含一个分子内二硫键。
本公开涉及一种重组多肽，其包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、及SEQ IDNO：348所组成的群组，其中该重组多肽包含一个分子内二硫键。于某些实施方案中，该分子内二硫键包含一个或多个二硫键，其包含从重组多肽氨基末端编号的半胱氨酸15、半胱氨酸44、半胱氨酸48、半胱氨酸79、半胱氨酸80、半胱氨酸112、半胱氨酸114、及其组合，该重组多肽选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324、及SEQ ID NO：332所组成的群组。于某些实施方案中，该分子内二硫键包含从重组多肽氨基末端编号的半胱氨酸44、半胱氨酸48、或两者皆含，该重组多肽选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324、及SEQ ID NO：332所组成的群组。
于某些实施方案中，选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324、及SEQ ID NO：332所组成的群组的重组多肽，其从该重组多肽的氨基末端编号的半胱氨酸44和半胱氨酸48之间包含一分子内二硫键。于某些实施方案中，于半胱氨酸79和半胱氨酸112之间、半胱氨酸80和半胱氨酸114之间、半胱氨酸80和半胱氨酸112之间、或半胱氨酸79和半胱氨酸114之间，该重组多肽进一步包含一分子内二硫键或一分子间(即，于二聚体中)二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽于半胱氨酸79和半胱氨酸112之间进一步包含一分子内二硫键或一分子间二硫键，以及于半胱氨酸80和半胱氨酸114之间进一步包含一分子内二硫键或一分子间二硫键。于某些实施方案中，该重组多肽于半胱氨酸80和半胱氨酸112之间进一步包含一分子内二硫键或一分子间二硫键，以及于半胱氨酸79和半胱氨酸114之间进一步包含一分子内二硫键或一分子间二硫键。
本公开涉及一种同型二聚体蛋白，其包含如本文所述的二个相同的重组多肽。
本公开涉及一种异型二聚体蛋白，其包含如本文所述的二个相异的重组多肽。
于某些实施方案中，于该二个重组多肽的第一域之间、该二个重组多肽的第二域之间、该二个重组多肽的第三域之间、该二个重组多肽的该第一域和该第二域之间、该二个重组多肽的该第一域和该第三域之间、该二个重组多肽的该第二域和该第三域之间、或其组合，如本文所述之同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白包含一个或多个分子间二硫键。
于某些实施方案中，于该二个的其一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸和该另一重组多肽的该第一域的第15个氨基酸之间，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白包含一分子间二硫键。于某些实施方案中，于该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间、在该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间、在该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间、或在该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白进一步包含一分子间二硫键。于某些实施方案中，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白进一步于该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一二硫键，以及于该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一二硫键。于某些实施方案中，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白进一步于该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一二硫键，以及于该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一二硫键。
于某些实施方案中，于该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间、于该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间、在该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间、或在该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白包含一分子间二硫键。于某些实施方案中，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白于该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一二硫键，以及在该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一二硫键。于某些实施方案中，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白于该二个的其一重组多肽的该第三域的第8个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第43个氨基酸之间包含一二硫键，以及在该二个的其一重组多肽的该第三域的第9个氨基酸和该另一重组多肽的该第三域的第41个氨基酸之间包含一二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白的每一该重组多肽的该第三域包含第氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO：356)及第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO：357)，其中该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白于该二个的其一重组多肽的该第三域中的该第氨基酸序列和该另一重组多肽的该第三域中的该第二氨基酸序列之间包含二个分子间二硫键。于某些实施方案中，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白于该二个的其一重组多肽的该第氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含第一分子间二硫键，以及于该二个的其一重组多肽的该第氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含第二分子间二硫键。于某些实施方案中，该同型二聚体蛋白或该异型二聚体蛋白于该二个的其一重组多肽的该第氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间包含第一分子间二硫键，以及于该二个的其一重组多肽的该第氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间包含第二分子间二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽包含如本文所述的任一个或多个该分子内二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽的该第二域包含一分子内二硫键。于某些实施方案中，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽于该第二域的第23个氨基酸和该第二域的第27个氨基酸包含一分子内二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白的该单一或全部二个重组多肽包含一分子内二硫键，位于从该重组多肽的氨基末端编号的SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：324、或SEQ ID NO：332的任一个的半胱氨酸44和半胱氨酸48之间、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：340、或SEQ ID NO：348的任一个的半胱氨酸88和半胱氨酸92之间、SEQ ID NO：268、或SEQ ID NO：300的任一个的半胱氨酸23和半胱氨酸27之间、或SEQ ID NO：276、或SEQ ID NO：316的任一个的半胱氨酸67和半胱氨酸71之间。
于某些实施方案中，如本文所述的同型二聚体蛋白包含二个重组多肽，其中每一个多肽包含相同序列，其中该序列选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ IDNO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、及SEQ ID NO：348所组成的群组。在一个些实施方案中，该重组多肽包含如本文所述的相同分子内二硫键。在一些实施方案中，该重组多肽包含如本文所述的相异分子内二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的异型二聚体蛋白包含二个相异重组多肽，其中每一个多肽包含相异序列，该序列选自由SEQ ID NO：260、SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ IDNO：324、SEQ ID NO：332、SEQ ID NO：340、及SEQ ID NO：348所组成的群组。于某些实施方案中，该异型二聚体蛋白中的该二个的其一重组多肽包含序列SEQ ID NO：260，而该另一重组多肽包含一序列其选自由SEQ ID NO：268、SEQ ID NO：276、SEQ ID NO：284、SEQ ID NO：292、SEQ ID NO：300、SEQ ID NO：308、SEQ ID NO：316、SEQ ID NO：324、SEQ ID NO：332、SEQID NO：340、及SEQ ID NO：348所组成的群组。在一些实施方案中，该重组多肽包含如本文所述的相同分子内二硫键。在一些实施方案中，该重组多肽包含如本文所述的相异分子内二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白在如表4或5中所列的半胱氨酸对之间包含该一个或多个该二硫键。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白包含骨诱导活性。骨诱导活性可以常规实务上用于测量此类活性的任何条件状况下量测(即「骨诱导条件」)。
例如：C2C12细胞是来自营养不良小鼠肌肉的鼠类的肌纤维母细胞品系。将C2C12细胞暴露于具有骨诱导活性的多肽可将C2C12细胞从肌肉转移到骨的分化，例如：通过诱导骨相关蛋白如碱性磷酸酶的表达为特征的成骨细胞形成。碱性磷酸酶是一种广泛接受的骨标记，且检测碱性磷酸酶活性的测定被接受可用以表达骨诱导活性。参见如：Peel等人(2003年公开于J.Craniofacial Surg.14：284-291)、Hu等人(2004年公开于GrowthFactors 22：29033)及Kim等人(2004年公开于J.Biol.Chem.279：50773-50780)的研究。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白具有诱导碱性磷酸酶活性的能力。
于某些实施方案中，骨诱导活性可利用医学影像技术或骨样本的组织学检验来进行检测，或是任何其他用以检测骨生成或成长的常规检验方法。于某些实施方案中，上述检测包括放射摄影影像，例如：X光影像。于某些实施方案中，上述检测包括计算机断层摄影(CT)扫描。在一些实施方案中，上述检测包括分子影像或核影像(即，正电子发射断层摄影术(PET))。于某些实施方案中，上述检测包括组织学检验。于某些实施方案中，上述检测包括苏木素-伊红(HE)染色法。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白可包含但不限于片段、变体或其衍生物分子。当涉及多肽时，用语「片段」、「变体」、「衍生物」和「类似物」包含保留参考多肽的至少一些性质或生物活性的任何多肽。多肽片段可包含分解蛋白片段、缺失片段、及当植入动物中时更容易到达作用位点的片段。多肽片段可包含变体区域，包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有经改变氨基酸序列的多肽。可以使用本领域已知的诱变技术产生非天然存在的变体。本公开的多肽片段可包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。变体多肽在本文中也可称为「多肽类似物」。本公开的多肽片段也可包括衍生分子。本文所用多肽或多肽片段的「衍生物」是指一主体多肽，其具有一个或多个由官能侧基团的反应以化学性衍生的残基。「衍生物」也包括含有20个标准氨基酸的一种或多种天然存在氨基酸衍生物的多肽。例如：4-羟脯氨酸可被取代以作为脯氨酸；5-羟赖氨酸可被取代以作为赖氨酸；3-甲基组氨酸可被取代以作为组氨酸；高丝氨酸可被取代以作为丝氨酸；及鸟氨酸可被取代以作为赖氨酸。
于某些实施方案中，如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白或异型二聚体蛋白其包含一标记。于某些实施方案中，该标记是一种可催化基质化合物或组合物的化学改变的酶标记、放射性标记、荧光团、发色团、成像剂、或包括金属离子的金属。
于某些实施方案中，本文所述的重组多肽包括一个或多个保守的氨基酸取代。「保守的氨基酸取代」是一种具有相似侧链的相异氨基酸残基的氨基酸取代。本领域已定义具有相似氨基酸侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(如：赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如：天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(如：甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(如：苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、及芳香族侧链(如：酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，若多肽中的氨基酸被来自同一侧链家族的另一氨基酸替换，则认为该取代是保守的。在另一个实施方案中，氨基酸链可被以差异在于顺序和/或侧链家族成员的组成的结构相似的链进行保守的替换。
于某些实施方案中，本公开的重组多肽通过如本文所述的核酸分子或载体所编码，或是通过如本文所述的宿主细胞所表达。
[核酸分子、载体及宿主细胞]
本公开涉及一种经分离的核酸分子，其包含一编码如本文所述的任一重组多肽的多核苷酸序列。
于某些实施方案中，该经分离的核酸分子包含任二个或多个编码如本文所述的域的多核苷酸序列。于某些实施方案中，该经分离的核酸分子包含任二个或多个多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、及78所组成的群组，其编码如本文所述的域分别对应SEQID NO：33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、及355。于某些实施方案中，该经分离核酸分子包含二个或三个多核苷酸序列的任何组合，多核苷酸序列编码本文表3中所示的二个或三个域的对应组合。
于某些实施方案中，该经分离的核苷酸分子包含一多核苷酸序列，该多核苷酸序列选自由SEQ ID NO：115、157、187、193、199、205、211、217、223、229、235、241、247、253、259、267、275、283、291、299、307、315、323、331、339、及347所组成的群组，其编码如本文所述的重组多肽分别对应SEQ ID NO：116、158、188、194、200、206、212、218、224、230、236、242、248、254、260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340、及348。
于某些实施方案中，多核苷酸序列经密码子优化(codon-optimized)。
本公开涉及一种重组核酸分子，其包含表达控制区可操作的连结至如本文所述的经分离的核酸分子。于某些实施方案中，该表达控制区是启动子、增强子、操纵子、阻遏子、核糖体结合位点、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点、茎环结构、转录终止信号、或其组合。于某些实施方案中，该表达控制区是一个启动子。表达控制区可以是转录控制区和/或翻译控制区。
本发明所属技术领域已知各种转录控制区。转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于：来自巨细胞病毒的启动子及增强子片段(立即早期启动子，与内含子-A(intron-A)接合)、猴病毒40(早期启动子)、及逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒)。其他转录控制区包括那些衍生自脊椎动物基因如：肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素及兔β-球蛋白，以及在真核细胞中能控制基因表达的其他序列。另外，适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴介质诱导型(lymphokine-inducible)启动子(如：干扰素或介白素可诱导的启动子)。
类似地，本发明所属技术领域已知各种翻译控制控制单元。翻译控制单元包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始与终止密码子，以及衍生自微小核糖核酸病毒的单元(特别是内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，亦称为CITE序列)。
于某些实施方案中，该重组核酸分子是一种重组载体。
载体可以是将核酸克隆和/或转移至宿主细胞内的任何媒介。本领域已知和已使用大量载体，包括例如：质粒、噬菌体、黏粒、染色体、病毒、经修饰的真核病毒、经修饰的细菌病毒。将多核苷酸插入至合适的载体可以通过将适当的多核苷酸片段连接至具有互补的粘末端的所选载体中来完成。
可以将载体设计成编码选择性标记或报告基因，该选择性标记或报告基因提供用来选择或辨识已并入该载体的细胞。选择性标记或报告基因的表达允许宿主细胞辨识和/或选择，该宿主细胞是并入且表达该载体上所含的其他编码区。本领域已知及已使用的选择性标记基因包括例如：对于氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、新霉素、嘌霉素、双丙胺磷除草剂(bialaphos herbicide)、磺酰胺、及其类似物提供抗性的基因，以及使用作为表型标记的基因，即花青素调节基因、异戊烯基转移酶基因、及其类似物。本领域已知及已使用的报告基因包括例如：荧光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基移转酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡萄糖醛酸酶(Gus)、及其类似物。选择性标记也可当作报告基因。
用语「质粒」是指通常带有基因的染色体外单元，该基因并非细胞中心代谢的一部分，且通常是环状双链DNA分子形式。此般单元可以是衍生自任何来源的自主复制序列(ARS)、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已被连接或重组成一独特构造，该独特构造能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当3’端未翻译序列一起导入细胞中。
可以使用的真核病毒载体包括但不限于：腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体及痘病毒，如牛痘病毒载体、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电荷脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物及生物聚合物。哺乳动物表达载体可包含非转录单元如：复制起源、连结至待表达基因的合适启动子和增强子、及其他5’端或3’端毗邻非转录序列及5’端或3’端非翻译序列，如必需的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供给者与接受者位点及转录终止序列。
该重组载体可以是一种「重组表达载体」，其是指任何核酸构造，该核酸构造含有用以转录和翻译已插入的编码序列的必需单元，或是在RNA病毒载体的情况下，当导入至适当宿主细胞时用以复制和翻译的必需单元。
本公开涉及一种制备重组载体的方法，其包含将如本文所述的经分离的核酸分子插入至一个载体内。
本公开涉及一种经分离的宿主细胞，其包含如本文所述的经分离的核酸分子或重组核酸分子。于某些实施方案中，该经分离的宿主细胞包含如本文所述的重组载体。
核酸分子可以通过本领域已知的方法导入至宿主细胞中，例如：转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、基因枪的使用、或DNA载体转运蛋白。
本公开涉及一种制备重组宿主细胞的方法，其包含将如本文所述的经分离的核酸分子或重组核酸分子导入至一个宿主细胞内。于某些实施方案中，该方法包含将如本文所述的重组载体导入至一个宿主细胞内。
如本文所述的宿主细胞可表达任何如本文所述的经分离的核酸分子或重组核酸分子。关于在宿主细胞中核酸分子的表达所使用的术语「表达/表现」是指通过基因引起生物化学的过程，例如：RNA或多肽。该过程包括细胞内所具有该基因的功能出现的任何具体呈现，包括但不限于：瞬态表达或稳定表达。其包括但不限于将该基因转录成信使RNA(mRNA)以及将该mRNA翻译成多肽。
宿主细胞包括但不限于原核生物或真核生物。适当宿主细胞的代表性实例包括：细菌细胞、真菌细胞如酵母菌、昆虫细胞及经分离的动物细胞。细菌细胞可包括但不限于革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如：大肠杆菌(Escherichia coli)。或者，也可使用乳酸杆菌(Lactobacillus)属物种或芽孢杆菌(Bacillus)属物种作为宿主细胞。真核细胞可以包括但不限于已建立的哺乳动物来源细胞品系。合适的哺乳动物细胞品系包括例如：COS-7、L、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa及BHK细胞品系。
该宿主细胞可以在适合用以活化启动子、选择转化体或扩增如本文所述的核酸分子的经适当修饰的常规营养培养基中进行培养。该培养的条件如温度、pH等等，可以是当使用选择用以表达的宿主细胞时已知使用或经常规修饰的任何条件，并且对于本发明所属技术领域中具有普通知识者是显而易见的。
本公开涉及一种制造重组多肽的方法，其包含：培养如本文所述的经分离的宿主细胞，以及从该宿主细胞分离该重组多肽。从经培养的宿主细胞分离多肽的技术，可以是当从该选择用以表达的宿主细胞分离多肽时已知使用或经常规修饰的任何技术，并且对于本发明所属技术领域中具有普通知识者是显而易见地。
[组合物及装置]
本公开涉及一种组合物，其包含如本文所述的重组多肽、同型二聚体蛋白、或异型二聚体蛋白。
于某些实施方案中，该组合物进一步包含生理可接受载体、赋形剂、或稳定剂。参见如1990年美国宾州伊士顿的麦克出版社(Mack Publishing Co.,Easton,PA)出版的雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)。可接受载体、赋形剂、或稳定剂可包含对受试者无毒的物质。于某些实施方案中，该组合物或该组合物中一个或多个成分是无菌的。无菌成分可使用如过滤(如通过无菌过滤膜)或放射线照射(如通过γ-射线照射)来制备。
于某些实施方案中，如本文所述的组合物进一步包含同种异体移植物或自体移植物的骨或骨碎片。
于某些实施方案中，如本文所述的组合物进一步包含骨移植替代物。
于某些实施方案中，该骨移植替代物是一种生物陶瓷(bioceramic)材料。用语「生物陶瓷材料」及「生物陶瓷」于本文中可相互代换。于某些实施方案中，该生物陶瓷在体内是可生物相容的且是可再吸收的。于某些实施方案中，该生物陶瓷是任何以磷酸钙盐类为基础的生物陶瓷。于某些实施方案中，该生物陶瓷选自由磷酸三钙(TCP)、α-磷酸三钙(α-TCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、双相磷酸钙(BCT)、氢氧磷灰石、硫酸钙及碳酸钙所组成的群组。于某些实施方案中，该生物陶瓷是β-磷酸三钙(β-TCP)。
于某些实施方案中，该骨移植替代物是一种生物活性玻璃(bioactive glass)。于某些实施方案中，该生物活性玻璃包含二氧化硅(SiO2)、氧化钠(Na2O)、氧化钙(CaO)、或氧化铂(Pt2O5)。
本公开涉及一种可生物分解组合物，其包含：如本文所述的同型二聚体蛋白，具有诱导骨生成以在一个位置形成骨质的能力；及带有孔洞之可生物分解磷酸钙载体(如β-TCP)，孔洞是连通分布于该可生物分解磷酸钙载体；其中该同型二聚体蛋白的有效量为约0.03mg/g至约3.2mg/g的该可生物分解磷酸钙载体，且该可生物分解磷酸钙载体的孔隙率是大于70％，且孔径为约300μm至约600μm。
于某些实施方案中，该可生物分解组合物适用于使一个组织凸出，该组织选自鼻沟、眉间、中面部组织、下颚轮廓线、下巴、脸颊、及其组合所组成的群组。
于某些实施方案中，该位置置选自由长骨骨折缺损、二个相邻脊椎骨体的空间、不愈合骨的缺陷、上颚截骨切口、下颚截骨切口、矢状劈开截骨切口、颏整型截骨切口、快速颚扩张截骨切口、在二个相邻脊椎骨的二个相邻横突之间纵向延伸的空间、及其组合所组成的群组。
于某些实施方案中，单一剂量的该同型二聚体蛋白为约0.006mg至15mg。
于某些实施方案中，该可生物分解的磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解的磷酸钙载体于该对象体内时不渗漏，从而使所形成的骨质限制于该可生物分解的磷酸钙载体的体积内。
本公开涉及一种持续性释出组合物，其包含磷酸钙载体、可生物分解基质、及一如本文所述的同型二聚体蛋白。
于某些实施方案中，该磷酸钙载体选自由：磷酸三钙(TCP)、α-磷酸三钙(α-TCP)、β-磷酸三钙(β-TCP)、双相磷酸钙(BCP)及其组合所组成的群组。
于某些实施方案中，该可生物分解基质选自由：聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PVA)、及其组合所组成的群组。
于某些实施方案中，该持续性释出组合物包含：(a)约2-11％(w/w)的该磷酸钙载体；(b)约88-97％(w/w)的该可生物分解基质；及(c)约0.017-0.039％(w/w)的该同型二聚体蛋白。
本公开涉及一种用于填补骨孔隙的可模制组合物，其包含：含有该可模制组合物约90wt％至约99.5wt％的可模制基质；及如本文所述之一同型二聚体蛋白，其中，于植入后约1、24、48、72、168、240或约336小时，从该可模制组合物释出少于约25％百分率的该同型二聚体蛋白。
本公开涉及一种脊椎融合装置，其包含一如本文所述的可生物分解组合物；及一个脊椎融合器(如护架(peek cage))，其被配置用以保留该可生物分解磷酸钙载体。
方法：
本公开涉及一种需要这种治疗的对象中促进长骨骨折愈合的方法，其包含：制备含有如本文所述的同型二聚体蛋白的组合物，该同型二聚体蛋白均匀地容置在一缓释型可生物分解磷酸钙载体内(如β-TCP)，该可生物分解磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解磷酸钙载体于该对象体内时不渗漏，从而使该长骨骨折愈合限制于该磷酸钙载体的体积内；且植入该组合物于该长骨骨折发生位置，其中该同型二聚体蛋白的量为约0.03mg/g至约3.2mg/g的该磷酸钙载体。
于某些实施方案中，该促进长骨骨折愈合的方法更进一步包含：随着该磷酸钙载体降解，所容置的同型二聚体蛋白于该磷酸钙载体位置逐渐暴露，其中该磷酸钙载体具有约0.4至约1.8的钙与磷酸盐比率。
本公开涉及一种促进脊椎融合的方法，其包含：暴露一个上脊椎骨和一个下脊椎骨；在该上脊椎骨和该下脊椎骨之间辨别出一个用以融合的部位；在该上脊椎骨及该下脊椎骨的各个用以融合的该部位上暴露一个骨表面；及于该部位上施用如本文所述之一同型二聚体蛋白及可生物分解磷酸钙载体(如β-TCP)。
于某些实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体是一种不可压缩递送载具，且其中该不可压缩递送载具是施用于需要骨生长但不自然发生骨生长的二个骨表面之间的该部位。
于某些实施方案中，该可生物分解磷酸钙载体包含至少一个用以施用于该部位的植入棒，该植入棒在该上脊椎骨及该下脊椎骨之间纵向延伸。
于某些实施方案中，该部位选自由二个相邻脊椎骨体的空间、以及在二个相邻脊椎骨的二个相邻横突之间纵向延伸的空间。
本公开涉及一种用以促进关节固定(arthrodesis)的方法，其包含将如前所述之一同型二聚体蛋白及可生物分解磷酸钙载体施用在一个畸形或退化的关节。
于某些实施方案中，施用该同型二聚体蛋白是包括将从约0.006mg至约10.5mg的该同型二聚体蛋白施用至该畸形或退化的关节。
本公开涉及一种于有需求的对象的脊椎中产生骨质以融合二个相邻脊椎骨体的方法，其步骤包括：准备用于产生该骨质的组合物，该组合物含有一如本文所述的同型二聚体蛋白，该同型二聚体蛋白均匀地容置在一缓释型可生物分解载体内，该可生物分解载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解载体于该对象体内时不渗漏，从而使所形成骨质限制于该缓释型可生物分解载体的体积内；及将该组合物引入该二个相邻脊椎骨体之间的位置，且其中随着该缓释型可生物分解载体降解，所容置的同型二聚体蛋白于该缓释型可生物分解载体位置逐渐暴露，更且其中该同型二聚体蛋白的量为该位置的约0.2mg/部位(即每一部位约0.2mg)至约10.5mg/部位(即每一部位约10.5mg)。
于某些实施方案中，该缓释型可生物分解载体具有多孔结构，其中来自该二个相邻脊椎骨的细胞迁移到该多孔结构中以产生该骨质。
于某些实施方案中，该缓释型可生物分解载体具有一个初始体积，且随着该缓释型可生物分解载体被再吸收，该骨质取代该缓释型可生物分解载体的该初始体积。
本公开涉及一种在有需求的对象中通过后方融合术(posterior fusion)或椎间孔融合术(transforaminal fusion)用以融合相邻脊椎骨体的方法，其步骤包括：准备一个盘空间，用以在该相邻脊椎骨之间的椎间空间中接收一个椎间盘植入物；将一缓释型载体引入该椎间盘植入物中，其中如本文所述的同型二聚体蛋白的量为从约0.2mg/部位至约10.5mg/部位的该缓释型载体；并将该椎间盘植入物引入该相邻脊椎骨之间的盘空间中，以在该盘空间中产生骨质。
以下实施例是用以说明而非限制本发明。
[实施例]
[实施例1]-质粒构建
为了构建质粒pQE-80L-Kana，利用BspHI(BioLab公司)从pET-24a(+)(Novagen公司)切割卡那霉素抗性基因，以产生875-bp卡那霉素抗性基因(+3886到+4760)片段(SEQ IDNO：1)。用BspHI切割pQE-80L(凯杰公司)载体以去除氨苄青霉素抗性基因(+3587到+4699)片段(SEQ ID NO：2)，然后将该卡那霉素抗性基因片段连接到该pQE-80L载体中以生成4513-bp质粒(pQE-80L-Kana)。(SEQ ID NO：3)。
[实施例2]-酵母双杂合(two-hybrid)筛选
A.诱饵质粒构建
使用市售系统(媒合双杂合系统2；美国加州帕洛阿尔托的CLONTECH公司)进行酵母双杂合筛选。为构建诱饵质粒，pCRII/ActRIIB作为模板进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)(1994年Hilden等人公开于Blood 83(8):2163-70的研究)以生产IIB型活化素受体(ActRIIB)蛋白的细胞外域(+103到+375bp)(SEQ ID NO：4)的编码区。设计用于扩增ActRIIB该细胞外域(ActRIIBecd)的引物(XmaI：5'-CCCGGGACGGGAGTGCATCTACAACG-3'(SEQ ID NO：5)；SalI：5'-GTCGACTTATGGCAAATGAGTGAAGCGTTC-3'(SEQ ID NO：6))使其在5’末端分别包含一个XmaI和SalI限制位点。使用模板DNA10ng、每个引物0.2μM、每个dNTP 0.2mM、1X PCR缓冲液(10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)、pH 8.3、50mM氯化钾(KCl)及1.5mM氯化镁(MgCl2))以及pfuDNA聚合酶(劲因科技有限公司)1.25U，在总体积50μl下进行PCR。进行PCR 30次循环：在95℃下变性30秒，接着在45℃下退火1分钟，在68℃下延伸5分钟。以XmaI-SalI切割该PCR产物，然后在框架内亚克隆(subcloned)到在pAS2-1载体(CLONTECH公司GenBank登入号：U30497)中GAL4的DNA-结合域中相同的限制位点，以产生质粒pAS-ActRIIBecd。
已知ActRIIB的核酸序列和多肽序列以及天然存在的变体。例如野生型ActRIIB核酸序列为SEQ ID NO：7。对应的多肽序列为SEQ ID NO：8。ActRIIB的细胞外域(ActRIIBecd)为SEQ ID NO：9，其对应SEQ ID NO：8的残基21-117，且由核酸序列SEQ ID NO：4编码。
B.pACT2/MC3T3cDNA文库构建
为了构建pACT2/MC3T3cDNA文库，由Tu Q.等人(2003年公开于J Bone MinerRes.18(10):1825-33)所公开大约7×106克隆的小鼠MC3T3-E1成骨细胞cDNA文库，并进行一些修饰以容许cDNA文库插入小于1.5kb，该文库构建到pACT2载体(CLONTECH公司GenBank登入号：U29899)中，其中在S1核酸酶处理后(英杰生命科技公司cDNA合成系统CAT.编号18267-013)，在pACT2载体中克隆该双链cDNA，其经SmaI切割以表达具有GAL4活化域的融合蛋白。接着根据制造商(美国加州帕洛阿尔托的CLONTECH公司)的方案，以「HIS3Jump-Start」程序筛选pACT2/MC3T3cDNA文库。在另一个实施方案中，该pACT2cDNA文库是由市售产品获得。
C.酵母菌株选择
首先以诱饵质粒转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y190细胞(美国加州帕洛阿尔托的CLONTECH公司，MATa、ura3-52、his3-D200、lys2-801、ade2-101、trp1-901、leu2-3、112、gal4D、gal80D、URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ、cyhr2、LYS2::GALUAS-HIS3TATA-HIS3)，并在不含色氨酸的合成葡萄糖培养基(SD-Trp)上进行筛选。随后以pACT2/MC3T3cDNA文库转化在该SD-Trp培养基上生长的转化体，并在不含色氨酸和亮氨酸的培养基(SD-Trp-Leu)上进行筛选。于不含色氨酸、亮氨酸及组氨酸(SD-Trp-Leu-His)并具有30mM的3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole)的培养基上(美国密苏里州圣路易，西格玛奥瑞奇公司)收集并再培养该诱饵与文库共转化后的克隆，以抑制Y190细胞的渗漏生长。进一步测定在此步骤中所选的克隆其β-半乳糖苷酶活性。经过30℃培养3天后，将培养皿拍照摄影。至少进行了三次独立实验，并有相似结果。从个别阳性克隆纯化该pACT2文库质粒，并在大肠杆菌(Escherichia coli.)中进行扩增。用珀金埃尔默ABI自动DNA测序仪测序插入阳性克隆中的该cDNA，如表1所示(引物5'-AATACCACTACAATGGAT-3'(SEQ ID NO：10))。
表1
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[实施例3]-易误(Error-prone)随机诱变PCR
A.从质粒设计引物的诱变
将来自实施例2的阳性克隆的DNA序列诱导突变。
在一个实施方案中，经测序的阳性克隆被亚克隆到pQE-80L-Kana中，接着进行随机诱变PCR。用于扩增阳性克隆DNA序列如表1所示的引物，经设计在其5’末端包含一个MseI或BamHI限制位点。该PCR条件如实施例2所述。该PCR产物以MseI-BamHI进行切割，接着在框架内亚克隆到该pQE-80L-Kana载体中的相同限制位点。在Leung等人(1989年公开于Technique,1,11-15)公开的易错PCR基础下，经些微修饰，将随机诱变导入至该亚克隆的pQE-80L-Kana质粒内。使用线性化pQE-80L-Kana(经XhoI切割)作为模板DNA。用于使诱变PCR扩增的引物(MseI：5'-GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAA(SEQ ID NO：29)；BamHI：5'-CCGGGGTACCGAGCTCGCATGCGGATCCTTA(SEQ ID NO：30))，经设计在其5’末端分别包含一个MseI或BamHI限制位点。使用模板DNA10ng、每个引物40pM、每个dNTP 0.2mM、1X PCR缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl及1.5mM MgCl2)、氯化锰(MnCl2)0.2-0.3mM、二甲亚砜1％及Taq DNA聚合酶1.25U(美国加州卡尔斯巴德的英杰公司)，在总体积50μl下进行诱变PCR。诱变PCR进行30次循环：在94℃下变性30秒，接着在55℃下退火2分钟，在72℃下延伸3分钟。用MseI和BamHI切割该PCR产物。这个片段与经MseI和BamHI切割的pQE-80L-Kana的4.5-kb片段连接。以所得的pQE-80L-Kana衍生物转化大肠杆菌BL 21(Novagen公司)。菌落在LTB-琼脂培养基(LB补充有1％v/v甘油三丁酸酯、0.1％v/v吐温乳化剂-80、100mg/L的卡那霉素、0.01μM的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷及1.5％琼脂)的培养皿中于37℃环境下生长。
B.表1引物的诱变
在另一个实施方案中，基于先前Lenug所公开的易错PCR并经一些修改，将随机诱变导入至来自该阳性克隆的该pACT2文库质粒中。使用该线性化pACT2(经XbaI切割)作为模板DNA。使用具有如表1所示MseI和BamHI限制位点的合成寡核苷酸作为诱变PCR扩增反应的引物。使用模板DNA10ng、每个引物40pM、每个dNTP 0.2mM、1X PCR缓冲液(10mM Tris-HCl、pH 8.3、50mM KCl及1.5mM MgCl2)、MnCl2 0.2-0.3mM、二甲亚砜1％及Taq DNA聚合酶1.25U(美国加州卡尔斯巴德，英杰公司)，在总体积50μl下进行诱变PCR。诱变PCR进行30次循环：在94℃下变性30秒，接着在55℃下退火1.5分钟，在72℃下延伸4分钟。用MseI和BamHI切割该PCR产物。将此片段与经MseI和BamHI切割的pQE-80L-Kana的4.5-kb片段连接。以所得的pQE-80L-Kana衍生物转化大肠杆菌BL 21(Novagen公司)。菌落在LTB-琼脂培养基(LB补充有1％v/v甘油三丁酸酯、0.1％v/v吐温乳化剂-80、100mg/L的卡那霉素、0.01μM的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷及1.5％琼脂)的培养皿中于37℃环境下生长。
[实施例4]-ActRIIBecd相关多肽的表达
使用如实施例3所述经稳定转化的大肠杆菌细胞，以表达来自实施例2的该诱变DNA的与ActRIIBecd交互作用的多肽(即「域」)。
A.转化体发酵
在一个实施方案中，将具有pQE-80L-Kana衍生物的大肠杆菌BL21转化体在含有卡那霉素25-32μg/mL的65mL培养基(10g/L BBL植物蛋白胨、5g/L Bacto酵母提取物、10g/LNaCl)于500mL锥形瓶中，在30℃至37℃下，以180±20rpm搅拌，进行过夜培养(约10小时)。将前述过夜培养物37-420mL加至3.7-42L的TB培养基(BBL植物蛋白胨18g、Bacto酵母提取物36g、磷酸二氢钾(KH2PO4)18.81g、甘油6mL，于1L水中)中，该培养基于5-50L发酵罐中含有23.8-38.5μg/mL的卡那霉素及1-3mmol/L的异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，并且将温度控制在37℃至42℃范围内，以260-450rpm搅拌该培养基10-24小时。在GSA旋转器(索福公司)中，经8,000rpm离心10分钟后，在冰水浴中收集该细胞。
在另一个实施方案中，将1L的LB液体培养基(具有100mg/L卡那霉素)与新鲜长成的菌落(具有pQE-80L-Kana衍生物的大肠杆菌BL21转化体)或10mL的新鲜长成的培养物接菌，并在37℃下孵育直到OD600达0.4-0.8。通过加入40或400μM的IPTG在37℃下经3至5小时，以诱导该多肽表达。经离心后(约8,000rpm)，于4℃下收集细胞。
B.回收与纯化来自大肠杆菌的多肽
如先前实施例4A所述，发酵大肠杆菌BL21/pQE-80L-Kana衍生物细胞。在一个实施方案中，在4℃下将来自那些衍生物的多肽进行细胞破碎和回收。将约18g的湿细胞悬浮于60mL的0.1M的TRIS/HCl、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mM PMSF(苯基甲烷磺酰氟)、pH 8.3(破碎缓冲液)之中。根据制造商的说明书，细胞通过法式细胞破碎器(Frenchpress，SLM仪器公司)2次，并用破碎缓冲液将体积调整至200mL。将悬浮液在15,000g下离心20分钟。将所获得的沉淀物悬浮于含有1M氯化钠(NaCl)的100mL破碎缓冲液中，并如上所述离心10分钟。将沉淀物悬浮于含有1％Triton X-100(Pierce公司)的100mL破碎缓冲液中，并再次如上所述离心10分钟。然后将冲洗下来的沉淀物悬浮于50mL的Tris/HCl、1mM EDTA、1mM PMSF、1％DTT(二硫苏糖醇)中，并在特氟隆(Teflon)组织研磨机中均质化。所得的悬浮液中含有不可溶型态的粗多肽(crude polypeptide)。
将根据前述实施方案所获得的10mL多肽悬浮液以10％乙酸酸化至pH 2.5，并使用Eppendorf离心机在室温下离心10分钟。上清液在10％乙酸流速1.4mL/min下，使用Sephacryl S-100型柱子(法玛西亚公司，2.6×78cm)进行层析。合并在适当时间区间洗脱的含多肽的层析馏分。使用此材料用于重折叠以得到生物活性多肽或是用于进一步纯化。
将来自前述实施方案的5mg多肽溶解于140mL的50mM的Tris/HCl、pH 8.0、1M的NaCl、5mM的EDTA、2mM的还原型谷胱甘肽、1mM的氧化型谷胱甘肽和33mM的Chaps生化试剂(Calbiochem公司)中。在4℃下经72小时后，将上述溶液的酸碱值以盐酸(HCl)调整至pH2.5，并将前述混合物在Amicon超滤杯(stirred cell)中以YM10薄膜(美国麻州丹佛斯，Amicon公司)进行超滤10倍浓缩。将前述经浓缩的溶液以10mM的HCl稀释至原始体积，并再经同样方法浓缩至最终体积为10mL。所形成的沉淀物以5000g离心30分钟移除。在非还原状态下，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)判断含有二硫键的多肽的前述上清液。使用表面等离子体共振式生物分子传感器(BIAcoreTM)量测前述制剂的生物活性(实施例5)。
将来自前述实施方案中的该浓缩溶液以1mL/min流速施加到Mono S HR 5/5型柱子(法玛西亚公司)，该柱子经85％缓冲液A(20mM乙酸钠、30％异丙醇，pH 4.0)及15％缓冲液B(含有1M氯化钠的缓冲液A)的混合物平衡。然后以相同流速冲洗该柱子，保持上述缓冲液混合物的组成恒定直到280nm吸光度读值达基线水平，接着在平衡状态下开始注射线性梯度超过20分钟，最后以50％缓冲液A/50％缓冲液B的混合物结束。生物活性多肽在梯度开始后约9分钟被洗脱，并将其收集。利用生物活性测定及非还原条件下的SDS-PAGE判断。
在另一个实施方案中，该多肽经由实施例4所收集细胞的包涵体制备。在室温下隔夜提取(50mM的乙酸钠、pH 5、8M的尿素、14mM的2-巯基乙醇)，并对水彻底透析后，该多肽重折叠、浓缩，并通过Sephacryl S-100HR型柱子(法玛西亚公司)以1％的乙酸或5mM的HCL在流速1.8mL/min下浓化。最后以蛋白质层析仪(FPLC，FractogelEMD SO3 -650、50mM的乙酸钠、pH 5、30％的2-丙醇)纯化并以从0至1.5M的NaCl梯度洗脱。合并在适当时间区间洗脱的含多肽馏分。对水彻底透析后，该多肽经冷冻/干燥后储存于-20℃。以SDS-PAGE分析该多肽的纯度，接着以考马斯亮蓝R染色。
在另一个实施方案中，将衍生自例如上述实施例4A的每1克的细胞颗粒再悬浮于10-20mL的10mM的TRIS/HCl、150mM的NaCl、1mM的EDTA、5mM的DTT、pH 8.0(破碎缓冲液)中，并以声波处理使细胞破裂，该声波处理是使用具有1号增幅器(Enhance Booster#1)探针的Misonix S4000仪器在30A(仪器刻度)上使用5分钟。可选择性地通过离心(18,000×g经20分钟或15,000×g经30分钟)澄清前述细胞裂解混合物，并将沉淀物以含有1v/v％TritonX-100的10-20mL破碎缓冲液冲洗数次，并如上述离心10分钟。将细胞裂解物以含有6M尿素的100-200mL破碎缓冲液溶解，并如上述离心10分钟，保留含有该多肽的上清液以进一步纯化。
将前述上清液溶解于重折叠缓冲液(100mL的Tris/HCl pH 8.0、500mM的精氨酸-HCl、5mM的EDTA、25mM的Chaps、2mM的氧化型谷胱甘肽和1mM的还原型谷胱甘肽)中。在室温经4-7天后，该多肽以FPLC(Fractogel EMD SO3 -650、20mM乙酸钠、pH 4-5、30％2-丙醇和25mM Chaps)纯化并以从0至3M的NaCl梯度洗脱。合并在适当时间区间洗脱的含多肽馏分。以SDS-PAGE分析该多肽的纯度，接着以考马斯亮蓝R染色。
于某些实施方案中，本公开的异型二聚体可以通过如先前在实施例3所述在瞬态表达系统中共表达(co-expression)来制备，且可以从该培养基分离出该异型二聚体以实施例5的测定进行筛选。
[实施例5]-体外BIAcoreTM测定
生物传感器实验。在一个实施方案中，在BIAcoreTM T100/T200型仪器(PharmaciaBiosensor AB公司)的多信道模式(串流路径涉及细胞流动室1+2+3+4)下进行实验。流速为10μl/min，温度为25℃，并以2.5点/秒记录数据。利用氨基偶联法将所有四个片段的传感器芯片CM5涂覆链霉亲和素(streptavidin，西格玛公司)至密度2000pg/mm2(2000共振单位)。将ActRIIBecd(10mg)和胺-PEG3-生物素(amine-PEG3-Biotin，10mg，美国伊利诺伊州罗克福德，Pierce公司)溶于200μl的水中，并加入10mg的氰基硼氢化钠(NaCNBH3)以制备生物素化的ActRIIBecd。将反应混合物于70℃下加热24小时，之后再进一步加入10mg的NaCNBH3，接着将该反应物于70℃下再加热24小时。冷却至室温后，该混合物以旋转柱子(3,000截留分子量(MWCO))脱盐。收集生物素化的ActRIIBecd，经冷冻干燥后用于链霉亲和素(SA)芯片制备。然后将氨基生物素化的ActRIIBecd在流速为5μL/min下独立地固定在细胞流动室2-4上10分钟，并在10mM乙酸钠中浓度为20μM，pH 4.0，密度为50-250共振单位(RU)。将储存的该多肽溶解于甘氨酸缓冲液(2.5g的甘氨酸、0.5g的蔗糖、370mg的L-谷氨酸盐、10mg的氯化钠和10mg的吐温乳化剂-80，于100mL水中，pH 4.5)中以制备10mg/mL溶液，接着用先前的甘氨酸缓冲液稀释以制备成各种浓度的分析物。在分析物(如先前所述的ActRIIBecd相关多肽(即，域))流动期间记录感应图谱，首先通过细胞流动室1(对照)，接着通过细胞流动室2(生物素化的ActRIIBecd)。将细胞流动室2获得的感应图谱减去细胞流动室1获得的感应图谱。通过仪器提供的程序(Pharmacia Biosensor AB公司，1995年软件手册，BIA评估2.1)，评估在1、11、3.33、10、30和90nM分析物上获得的感应图谱的平衡结合、结合速率和解离速率。分析物和牛血清白蛋白(BSA，阴性对照)列于表2中。使用如前所述的珀金埃尔默ABI自动DNA测序仪进行与分析物相关克隆中该pQE-80L-Kana衍生物的测序(引物5'-CTCGAGAAATCATAAAAAAT TTATTTG-3'(SEQ ID NO：31))，该pQE-80L-Kana衍生物具有相较于白蛋白更高的亲和力常数。
表2
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NB：结合(Binding)低于侦测极限(KD>1mM)
[实施例6]-重组多肽的制造
为了确定是否可以增强亲和力常数，使用Atanassov等人(2009年公开于PlantMethods 5:14)所公开的PCR融合(PCR-Fusion)方法经一些修改，将表2中的各别域彼此融合以制造重组多肽。使用Phusion DNA聚合酶(芬兰，Finnzymes公司)和标准热循环仪进行PCR融合。以BP Clonase II和LR Clonase II酶混合物(英杰公司)进行通路重组反应(Gateway recombination reactions)。感受态大肠杆菌DH5α细胞是根据Nojima等人公开内容(1990年公开于Gene 96(1)：23-28)制备。使用公司的Spin Miniprep试剂盒和/>公司的凝胶提取和PCR纯化试剂盒(德国，凯杰公司)纯化质粒DNA和PCR片段。
所得重组多肽的DNA模板、PCR引物和DNA/多肽序列如表3所示。PCR融合涉及来自质粒模板的二个或三个平行PCR扩增。在来自平行反应的凝胶经纯化PCR片段上，进行通过单个重叠延伸扩增片段的PCR融合。根据Phusion DNA聚合酶指引(NewEnglandBiolabs公司：PhusionTM高保真度(HF)DNA聚合酶手册)在本稿中对于所有PCR扩增用于反应混合及条件的循环参数皆相同。质粒模板的退火温度为55℃。
对于融合二个PCR片段，使用30μl重叠延伸反应，其包含：16μl的该二个PCR片段混合物(通常每个8μl，约200-800ng，DNA)、6μl的5×Phusion HF缓冲液、3μl的2mM dNTP混合物、0.3μl的PhusionTM DNA聚合酶(2U/μl)。在重叠延伸混合物中不加入引物。当融合三个DNA片段时，使用18μl该PCR混合物(通常每个6μl)。一般而言，使用等体积的经纯化PCR片段不会检查精确的DNA浓度。若该经扩增PCR片段的摩尔比看起来明显不同(例如：在琼脂糖电泳后估计DNA带强度超过5-7倍)，来自纯化过的PCR片段体积则应对应调整。上述反应混合物在98℃孵育30秒、60℃孵育1分钟、72℃孵育7分钟。使用PCR纯化试剂盒纯化该重叠延伸反应后所获得的DNA。如前所述，PCR产物经切割并结合于pQE-80L-Kana载体中用以蛋白质/多肽表达。利用先前讨论过的BIAcoreTM T100/T200型(GE Healthcare公司)监测经纯化的蛋白质/多肽对于ActRIIBecd的亲和力，并使用实施例5中BIA评估软件版本4.1(GEHealthcare公司)进行数据分析。
表3
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NB：结合(Binding)低于侦测极限(KD>1mM)
数据显示，与来自每一单个克隆的个别多肽相比，来自如后述的二个克隆组合所形成的重组多肽，其亲和力常数(KD)较低：克隆编号10可操作地连接克隆编号15(SEQ IDNO：188)、克隆编号15可操作地连接克隆编号10(SEQ ID NO：194)、克隆编号15可操作地连接克隆编号21(SEQ ID NO：200)、克隆编号21可操作地连接克隆编号15(SEQ ID NO：206)、克隆编号21可操作地连接克隆编号10(SEQ ID NO：212)、克隆编号10可操作地连接克隆编号21(SEQ ID NO：218)、克隆编号8可操作地连接克隆编号14(SEQ ID NO：224)、克隆编号14可操作性地连接克隆编号8(SEQ ID NO：230)、克隆编号19可操作地连接克隆编号8(SEQ IDNO：236)、克隆编号8可操作地连接克隆编号19(SEQ ID NO：242)、克隆编号19可操作性地连接克隆编号14连接(SEQ ID NO：248)及克隆编号14可操作地连接克隆编号19(SEQ ID NO：254)。换言之，来自所述组合所形成的该重组多肽相对于来自克隆编号8(SEQ ID NO：35)、克隆编号10(SEQ ID NO：39)、克隆编号14(SEQ ID NO：47)、克隆编号15(SEQ ID NO：49)、克隆编号19(SEQ ID NO：57)及克隆编号21(SEQ ID NO：61)的每个克隆的各别多肽，具有对ActRIIBecd更高的亲和力。
除此之外，来自三个克隆的组合而制成重组多肽，该克隆是使用：克隆编号8(SEQID NO：35)、克隆编号10(SEQ ID NO：39)、克隆编号14(SEQ ID NO：47)、克隆编号15(SEQ IDNO：49)、克隆编号19(SEQ ID NO：57)及克隆编号21(SEQ ID NO：61)。令人意外的，与来自各别克隆的多肽或来自二个克隆组合的多肽相比，来自如后述的三个克隆组合所形成的重组多肽的KD较低，该克隆为：克隆编号10可操作地连接克隆编号15及21(SEQ ID NO：260)、克隆编号15可操作地连接克隆编号10及21(SEQ ID NO：268)、克隆编号21可操作地连接克隆编号15及10(SEQ ID NO：276)、克隆编号21可操作地连接克隆编号10及15(SEQ ID NO：284)、克隆编号8可操作地连接克隆编号14及19(SEQ ID NO：292)、克隆编号14可操作地连接克隆编号8及19(SEQ ID NO：300)、克隆编号19可操作地连接克隆编号8及14(SEQ ID NO：308)、克隆编号19可操作地连接克隆编号14及8(SEQ ID NO：316)、克隆编号10可操作地连接克隆编号14及21(SEQ ID NO：324)、克隆编号8可操作地连接克隆编号15及19(SEQ IDNO：332)、克隆编号10可操作地连接克隆编号19及14(SEQ ID NO：340)及克隆编号8可操作地连接克隆编号21及15(SEQ ID NO：348)。
[实施例7]-翻译后修饰
研究关于翻译后修饰(PTM)对于该重组多肽KD值的影响。PTM的一个实施例是二硫键连接。表4所示为二硫键位置和结合亲和力之间关系的数据，结果显示PTM会影响该重组多肽对ActRIIBecd的结合亲和力。该PTM测定是根据以下实验进行。
A.酶切割和二甲基标记
如实施例4和6制备多肽。标准蛋白购自西格玛公司(美国密苏里州圣路易斯)。可选择性地使用pH 6含有5mM的N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM，西格玛公司)的100mM乙酸钠(美国纽泽西州非力普堡，J.T.Baker公司)在室温下阻断游离半胱氨酸30分钟。酶切割直接于乙酸钠中在37℃下以1：50胰蛋白酶(美国威斯康星州麦迪逊，劲因公司)进行。在二甲基标记之前，将蛋白质切割物使用100mM的乙酸钠(pH 5)进行三倍稀释。
于某些实施方案中，如实施例4和6制备的重组多肽以50mM三乙基碳酸氢铵(Triethylammonium bicarbonate，TEABC，T7408，西格玛奥瑞奇公司)缓冲液(pH 7)稀释，并分装于二个试管用以不同酶切割。首先，加入NEM(N-乙基顺丁烯二酰亚胺，E3876，西格玛奥瑞奇公司)至最终浓度5mM以阻断游离半胱氨酸。烷基化反应在室温下进行30分钟。经NEM烷基化后，该两个试管的其一于37℃下加入胰蛋白酶(V5111，劲因公司)(1：65)18小时，随后在37℃下以Glu-C(P8100S，New England BioLabs公司)(1：50)进行隔夜切割。另一试管则于37℃下加入Glu-C(1：50)18小时，随后在37℃下以胰凝乳蛋白酶(1：50)进行隔夜切割。
为进行二甲基标记，于50μL的蛋白质切割物中加入2.5μL的4％(w/v)甲醛-H2(J.T.Baker公司)或2.5μL的4％(w/v)甲醛-D2(奥瑞奇公司)，接着加入2.5μL的600mM氰基硼氢化钠(西格玛公司)，上述反应在pH 5-6进行30分钟。
B.质谱分析
使用配有CapLC系统(美国麻州密尔福，沃特斯公司)的ESI Q-TOF利用毛细柱子(台湾，志圣工业股份有限公司，内径75μm、长度10cm)进行测量扫描(MS，m/z 400-1600；MS/MS，m/z 50-2000)。将该经烷基化及二甲基化标记的蛋白质切割物进行液相层析串联式质谱(LC-MS/MS)分析，其在含有0.1％甲酸的乙腈线性梯度5％至50％中45分钟。
于某些实施方案中，上述经切割及标记的蛋白质切割物以高分辨质谱(Q-Exactive Plus MS)连接快速液相层析(Ultimate 3000RSLC)系统进行分析。使用C18柱子(Acclaim PepMap RSLC,75μm x 150mm,2μm,)进行液相层析(LC)分离，其使用的梯度如下：
时间(min) A％ B％ 流速(μL/min)
0 99 1 0.25
6 99 1 0.25
45 70 30 0.25
48 40 60 0.25
50 20 80 0.25
60 20 80 0.25
65 99 1 0.25
70 99 1 0.25
移动相A：0.1％甲酸
移动相B：95％乙腈/0.1％甲酸
以m/z 300-2000范围进行全MS扫描，并将MS扫描中10个最强的离子用于串联式质谱(MS/MS)光谱碎片分析。
C.资料分析
使用MassLynx 4.0从原始数据产生峰值列表(减去30％，3/2Savitzky Golay平滑法，中央三通道80％质心)。可以用相对高地减法以消除背景噪声。真正的a1离子通常显示为主波峰，以使其可保留于峰值列表中。
D.反相层析
在具有二元泵的安捷伦1100型高效液相层析系统(Agilent 1100HPLC)装备有UV检测器和自动进样器。将蛋白质注入75℃操作下的Zorbax 300SB C8柱子(150±2.1mm，5μm，)。流速为0.5ml/min。移动相A为含有0.1％三氟乙酸的水。移动相B为70％异丙醇、20％乙腈、以及0.1％三氟乙酸水溶液。样品在10％B的负载条件下注入，并在2分钟内增加至19％B。在两分钟时开始1.1％B/min的线性洗脱梯度，并在24分钟时结束。然后使用95％B冲洗该柱子5分钟。将该柱子于负载条件下5分钟以重新平衡。此方法能够部分分离区别二硫键异构物。
表4
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a)分子内二硫键连接。
b)分子间二硫键连结以二聚化。
如表4所示，不同半胱氨酸位置间的二硫键会影响亲和力常数(KD)的值。除此之外，数据也显示，二聚体中两个重组多肽间的二硫键会显著降低KD值。换言之，二聚化作用可能有助于重组多肽的二聚体和该ActRIIBecd间体外的分子交互作用。
观察到一些重组多肽自发性形成如表4所示的二聚体蛋白。所有该二聚体蛋白可经由如实施例4B所述的凝胶过滤将其从重组多肽中分离纯化。于此实施方案中，该二聚体蛋白是同型二聚体蛋白，因为其单体相同。于其它实施方案中，若如实施例4中所述的经稳定转化的大肠杆菌细胞由选自SEQ ID No：260、268、276、284、292、300、308、316、324、332、340和348所组成的群组的两个相异重组多肽共表达，则该二聚体蛋白可以是异型二聚体蛋白。
[实施例8]-碱性磷酸酶生物活性测定
使用已公开的C2C12细胞中碱性磷酸酶诱导检验法，研究该重组多肽与细胞受体结合以及诱导信号传导途径的能力。参见如：Peel等人(2003年公开于J CraniofacialSurg.14:284-291)及Hu等人(2004年公开于Growth Factors 22:29033)的研究。
在汇合之前将C2C12细胞(美国弗吉尼亚州马纳萨斯，ATCC登录号CRL-1772)传代，并再悬浮于补充有10％经热灭活的胎牛血清的DMEM中1×105细胞/mL。将96孔组织培养板(康宁公司，Cat#3595)的每孔植入100μL细胞悬浮液。加入连续稀释标准品及测试样本的等分试样，并将培养物保持于37℃和5％的CO2环境中。测试样本包括经限制的培养基、经纯化的重组多肽以及作为阳性对照的市售经纯化的重组人类BMP-2「rhBMP-2」(美国明尼亚波利斯，R&D Systems公司)。rhBMP-2已显示在骨及软骨发展上扮演重要角色，例如：Mundy GR等人(2004年公开于Growth Factors.22(4)：233–41)的研究。阴性对照培养物(培养基不加入样本或rhBMP-2)经培养2至7天。培养基每两日更换一次。
收获培养物时以生理盐水漂洗(0.90％的NaCl，pH 7.4)，并将漂洗后的盐水丢弃。在培养物中加入50μL提取溶液(Takara Bio公司，catalogue#MK301)，然后在室温下超声波处理10分钟。溶菌液的碱性磷酸酶(ALP)的检测，是通过如Peel等人(2003年公开于JCraniofacial Surg.14:284-291)所公开监测碱性缓冲液(美国密苏里州圣路易，西格玛奥瑞奇公司，catalog P5899)中硝基酚磷酸酯的水解作用，或是根据制造商的说明书使用TRACP&ALP检测试剂盒(Takara Bio公司，catalogue#MK301)。通过记录405nm吸光度测定ALP活性。经重复样本的平均ALP活性计算活性评分。使用4参数曲线拟合法(4-parametercurve fit)对连续稀释样本及其相对活性评分作图以计算各个重组多肽的EC50浓度。数据显示如表5。在一些实施方案中，使用考马斯亮蓝(布拉德福)蛋白质检测法(Coomasie(Bradford)Protein Assay，Pierce生物科技股份有限公司，catalogue#23200)将每个孔中细胞蛋白质含量的该ALP活性进行标准化。通过将每个孔的该ALP活性除以每个孔的蛋白质含量以计算每个样本该经标准化的ALP活性。
在另一个实施方案中。进行由Katagiri,T.等人(1990年公开于Biochem.Biophys.Res.Cornrnun.172,295-299)所公开的碱性磷酸酶检测。将来自C3H10T1/2品系的小鼠纤维母细胞培养于加上10％胎生小牛血清的BME-Earle培养基，将1mL的1x 105细胞/mL等分试样置于24孔培养板中，维持37℃和10％CO2环境下24小时。移除上清液后，加入带有各种浓度样本的1mL新鲜培养基。在进一步培养4天后，将细胞溶解于0.2mL缓冲液(0.1M的甘油、pH 9.6、1％的NP-40、1mM的MgCl2、1mM的ZnCl2)中，碱性磷酸酶活性在50μL等分试样溶胞液中测定，该溶胞液是经过使用pH 9.6缓冲液作为基质，以0.3mM对硝基酚磷酸酯150μL处理。在37℃下培养20分钟后记录405nm的吸光度。该活性是与每个样本中的蛋白质含量(BCA蛋白质检测法，Pierce化学公司)有关。
表5
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NA：尚未分析。
a)分子内二硫键连接。
b)分子间二硫键连结以二聚化。
如表5所示，具有某些二硫键的大多数重组多肽，其EC50值较rhBMP-2的EC50值为低。换言之，具有某些二硫键的大多数重组多肽能够诱导骨或软骨生成或成骨作用相关的信号传导路径。
[实施例9]-体内骨诱导活性
在兔子的尺骨轴缺损中，对于同型二聚体蛋白的骨诱导活性进行评估，前述同型二聚体蛋白的骨诱导活性包括依据实施例6所制造的二个重组多肽(即SEQ ID NO：260，包括分子内二硫键C44-C48)及作为载体材料的多孔β-磷酸三钙(β-TCP)。该磷酸钙载体具有约0.4至约1.65的钙与磷酸盐比率。
在40只雌兔(NZW品系，日本SLC股份有限公司)上，以外科手术暴露左和右的尺骨轴制造圆周20mm大的缺损。简言之，使用氯胺酮盐酸盐(商品名Ketalar，第一三共股份有限公司)及甲苯噻嗪(xylazine，商品名Selactar 2％注射液，拜耳医药有限公司)以3：1的组合进行复合麻醉。在长时间的手术中使用相同溶液作为额外麻醉。手术前，将氟霉宁(Flumarin学名flomoxef sodium，塩野义制药股份有限公司)作为抗生素皮下给药。前臂一般区域的毛使用电动剃刀将其刮除，并使用希必定酒精(Hibitane，葡萄糖酸氯己定-乙醇溶液，大日本住友制药股份有限公司)进行消毒。在尺骨的每个肢的后内侧部位制造一纵向切口。将肌肉组织抬起以暴露该尺骨。使用手术刀从该暴露尺骨的手部关节25mm处制造一标记。使用15mm直径的钻头在该标记处纵向及垂直钻孔，密切注意不造成该骨断裂。使用骨剪将该骨分割。在距离近端方向20mm处也制造一标记，并以相似方式分割。当分割时，该尺骨覆盖骨膜，接着将该骨膜移除，并用盐水彻底清洁该骨碎片。
如下表6所示，根据实验组A-G的其一，对每个尺骨植入或不植入植入物。实验组A-D的尺骨植入由β-TCP携带特定剂量同型二聚体蛋白的单一植入物。实验组E的尺骨植入仅β-TCP的单一植入物，没有任何同型二聚体蛋白。实验组F的尺骨植入骨自体移植的单一植入物。实验组G的尺骨则没有植入物。之后，迅速缝合肌肉及真皮组织。
表6
实验组A-E中所使用的β-TCP为1-3mm的颗粒型式，其孔隙率为75％，孔径为50-350μm(日本，SuperporeTM公司，pentax陶瓷人工骨系列，「HOYA」人工骨替代物)。
于某些实施方案中，实验组A-E中所使用的β-TCP为1-3mm的颗粒型式，其孔隙率为70％或以上，孔径为300-600μm(台湾微创医疗器材公司，「台微医」康骨益人工骨替代物)。
实验组A-D中包含重组多肽(即SEQ ID NO：260)的同型二聚体蛋白是在每只动物植入前立即使用0.5mM盐酸(以注射剂(大冢制药公司)进行标准溶液稀释)从冷冻批次准备。对于单侧植入设定流体体积为180μl，并在已灭菌培养皿中200mg的β-TCP颗粒上均匀滴加。当流体完全滴落，以刮勺轻轻搅拌该β-TCP颗粒，在室温下静置超过15分钟，接着进行植入。
关于实验组F，自体移植骨是利用骨剪从左翼或右翼的胯骨获得。将骨加工成碎片，且植入的骨量与实验组A-E的量相同。
X光评估
拍摄侧面及前面的X光影像(即，放射线照片)，分别为植入后立即拍摄以及每两周拍摄一次直至植入后8周。使用该放射线照片评估植入部位的状况及骨生成的程度。每一实验组代表性实施例的X光影像如图1A(实验组A-D)及图1B(实验组E-G)所示。
在2周时，在所有实验组别中可以清楚地看到受植床其移植材料的颗粒和边界的对比。在4周时，在该同型二聚体蛋白组(即实验组A-D)中的TCP颗粒变的不明显，显示出该颗粒的吸收及骨生成的进度。在具有高剂量同型二聚体蛋白的实验组C和实验组D的部分样本中，该植入部位和该受植床之间的边界变的不明显。在6周时，实验组B中该植入部位和该受植床之间的边界变的不明显。在实验组C和实验组D的某些样本中观察到该受植床的连续性及骨皮质生成的改善。在8周时，实验组A和实验组B中该受植床的边界变得更加不明显。实验组C中该受植床的连续性及骨皮质生成改善。实验组D中观察到该尺骨缺损区的重建，如6周的影像所示。
在单独使用TCP的实验组E中，随着时间可观察到该受植床有骨生成。然而，即使在8周时剩余的TCP颗粒仍清晰可见，显示该植入部位上骨生成不足并且该受植床中的连续性差。因此，实验组E中缺损的修复在8周时仍然不完整。
在具有自体移植的实验组F中，随着时间可观察到骨生成的进度，且在8周时跟该受植床已达融合。然而，生成并不均匀。
在仅具有缺损而没有移植物的实验组G中，在8周时于桡骨上可观察到些微骨生成，而没有任何其他该缺损的修复。
计算机断层(Computerized Tomography，CT)扫描
在移植后当下、移植后4周及8周时使用CT扫描，以1mm间隔进行轴定向(GE横河医疗系统有限公司)。主要扫描该植入部位的影像。在图2A(实验组A-D)和图2B(实验组E-G)中的代表性实施例显示该植入部位中心随着时间推移的横截面影像变化。
在具有同型二聚体蛋白的实验组A至D中，在移植后立刻观察到的颗粒在4周的横截面影像中部分降解，显示骨生成发生。在60μg剂量的实验组D中，进一步观察到骨生成的进度，并且在一些样本中观察到骨髓腔生成。8周时，在6μg以上剂量组别的影像中观察到骨髓腔和骨皮质生成的进度。在仅有TCP的实验组E中，即使在8周时仍有颗粒团聚体。在有自体移植的实验组F中，8周时观察到骨髓腔生成，如再成型过程中。在仅有缺损的实验组G中，仅观察到些微的骨生成。
抗扭强度测试
该移植材料从植入后8周安乐死的兔子中取出，从每一实验组的尺骨样本分离出的桡骨上进行抗扭强度测试。使用858Mini Bionix II工具(MTS系统公司)进行测试。该测试在50mm长的区域进行，即在该尺骨轴中心的20mm长的重建区域及在该重建区域的近侧和远侧15mm长的区域。每侧的边缘用牙科树脂固定。将树脂部分夹在量测设备中。以30°/min的旋转速度将左侧尺骨以逆时钟方向旋转，右侧尺骨以顺时钟方向旋转，以确定失败时的最大扭矩。并检查和比较分别获得的健康兔子尺骨。健康兔子尺骨是从日本白兔获得，与实验组A至E中使用的类型不同。然而，日本白兔在安乐死时的年龄和性别与实验组A至E相同，即26周龄的雌兔。
图3所示为该抗扭强度测试下每一实验组所获得的最大扭矩。在具有同型二聚体蛋白的实验组A至D中，最大扭矩和剂量的相依性高。
与单独使用TCP的实验组E相比，在具有同型二聚体蛋白剂量2μg及超过2μg的的实验组A至D中观察到显著高的值。
与仅有缺损的实验组G相比，在具有同型二聚体蛋白剂量6μg及超过6μg的实验组B至D中观察到显著高的值。
在完整无缺损尺骨、自体移植或同型二聚体蛋白的实验组别间未观察到显著差异。
由于在实验组E和实验组G中骨生成不足，当分离桡骨时，难以确保在一些样本中的支承。故，在测试中仅使用实验组E的2个样本和实验组G的4个样本，而实验组A至实验组D和实验组F则各使用6个样本。
下表7所示为使用相同动物模型的本发明与Kokubo等人(2003年公开于Biomaterials24:1643–1651，2003)对于CHO衍生BMP-2的评估研究间测试条件和结果的比较。与Kokubo等人的报告相比，本发明在更为困难的条件下进行，例如：较大的骨缺损、较小剂量的活性剂，以及在抗扭强度测试之前较短的植入期间。然而，本发明显示尺骨成功修复，且本发明中的最大扭矩非常相似。
表7
*PGS：涂布PLGA的明胶海绵
^h.p.：同型二聚体蛋白
组织学评估
在8周和4周的实验组别中对所有动物制备标本。将尸体剖检时获得的组织保存于4％多聚甲醛溶液中并以10％的EDTA脱钙。接着将该组织以石蜡包埋。在平行于桡骨长轴的平面上制作薄片样本，以苏木素和伊红(HE)染色，并进行组织学评估。以确定骨生成和对该受植床的融合条件。
在具有同型二聚体蛋白的实验组A至D中，在4周时骨生成进展成横纹型。在高剂量同型二聚体蛋白的样本中观察到主动性地骨生成。在60μg剂量的实验组D中观察到显著大量的新生骨和血管新生。在低剂量的实验组A和实验组B的一些样本中观察到残余材料，在实验组C和实验组D中则几乎没有观察到残余材料。在实验组A和实验组B中，一些样本的该受植床边界附近观察到软骨生成。在所有样本中，该受植床直接与该横纹型的新生骨连接。在8周时，2μg剂量的实验组A仍可观察到横纹及残余材料。在受植床边界附近也可观察到软骨。即使再成型不足，仍可观察到骨生成的进展。在一些样本中观察到桡骨中骨皮质的生成。剂量超过6μg的实验组B至实验组D，通过再成型形成骨皮质及骨髓。在更高剂量的实验组别中进步更为显著。在植入部位上的连续性也增加。
在单独使用TCP的实验组E中，在桡骨中观察到移植材料上有骨生成，但即使在8周时残余材料仍清晰可见，显示在轴上骨生成不足且连续性差。
在具有自体移植物的实验组F中，4周时可见移植骨碎片上良好的骨生成，且新生骨与受植床接触。在受植床边界附近观察到软骨生成。8周时可观察到新生骨再成型及骨皮质生成的进展，但是仍可观察到残余的移植骨碎片。
在仅有缺损的实验组G中，仅在桡骨中观察到骨生成，且该缺损尚未完成修复。
于实施方案中，提供了需要这种治疗的对象中促进长骨骨折愈合的方法。该方法包含制备含有该同型二聚体蛋白的组合物，该同型二聚体蛋白均匀地容置在一缓释型可生物分解磷酸钙载体(如β-TCP)内，该可生物分解磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解磷酸钙载体于该对象体内时不渗漏，从而使该长骨骨折愈合限制于该磷酸钙载体的体积内，且植入该组合物于该长骨骨折发生位置，其中该同型二聚体蛋白的量为该磷酸钙载体的约0.03mg/g至约3.2mg/g。
[实施例10]-绵羊后外侧融合的体内研究
在绵羊的后外侧融合模型中，对于同型二聚体蛋白的骨诱导活性进行评估，前述同型二聚体蛋白的骨诱导活性包括依据实施例6所制造之一重组多肽(Rcp)(即SEQ ID NO：260，包括分子内二硫键C44-C48、C80-C112及C79-C114)及作为载体材料的多孔β-磷酸三钙(β-TCP)。该磷酸钙载体具有约1.2至约1.8的钙与磷酸盐比率。
绵羊后外侧融合模型以Zoletil(8-12mg/kg，肌肉注射(IM))及异氟烷(2％)和氧气(每分钟2公升)放气，使绵羊镇静。插入气管内导管，并使动物通气，使用异氟烷(2至3％)和氧气(每分钟2至4公升)维持麻醉。给予抗生素(1gm静脉注射(IV)；苯唑西林(Benacillin)5ml肌肉注射(IM))。在手术前注射卡洛芬(Carprofen，一种非类固醇抗发炎药(NSAID)，4ml肌肉注射(IM))和丁基原啡因(Burprenorphine，商品名/>0.324mg皮下注射(SC))。依据需求，在手术前及手术过程中以4至10ml/kg/h静脉内给予晶体溶液(哈特曼氏(Hartmann)液)。
在第3腰椎至第4腰椎高度处(L3-L4)，创造一平行于腰椎横突的15-cm大的中线切口。钝性腹膜后剥离使腰椎前外侧部分暴露。此举可不受膈肌干扰。将软组织收起。使用气动切削钻头(产品名Midas Rex)剥离所有动物于该高度间的横突(侧向15mm)及相邻脊椎体。
将移植物材料置于该横突的剥离面和根据实验组1至6中的其一的该脊椎体(脊椎旁床)之间，实验组1至6如下表8所示。实验组1至3植入由β-TCP携带特定剂量同型二聚体蛋白的单一植入物。实验组4植入仅β-TCP的单一植入物，没有任何同型二聚体蛋白。实验组6植入具有特定剂量rhBMP-2的可吸收胶原蛋白海绵(absorbable collagen sponge，ACS)的单一植入物，此为公认的骨诱导因子作为阳性对照组。实验组5植入骨自体移植的单一植入物。自体移植物是采集自自体移植实验组动物中的髂(骨)崤。使用骨钳将该骨粉碎颗粒化，并将5.0g的自体移植骨用于融合的每一侧。该切口以2-0可吸收缝线缝合，而皮肤以3-0缝线缝合。
表8
/>
^h.p.:同型二聚体蛋白。
及/>分别为商售骨移植物及骨填补材。
实验组1至4中所使用的β-TCP是2-4mm颗粒的型式，其具有70％的孔隙率及50-350μm的孔径(日本，SuperporeTM公司，pentax陶瓷人工骨系列，「HOYA」人工骨替代物)。
于某些实施方案中，实验组1至4中所使用的β-TCP为2-8mm的颗粒型式，其孔隙率为65％或以上，孔径为250-730μm(台湾微创医疗器材公司，「台微医」康骨益人工骨替代物)。
于实验组1中，通过将2ml注射用水加入至具有10mg同型二聚体蛋白的每一个小瓶中，以制备包含Rcp(即SEQ ID NO：260)的同型二聚体蛋白储备溶液H。该储备溶液H与体积比为3：1的注射用水混合，形成同型二聚体蛋白高剂量溶液(Homodimeric Protein HighDose Solution，于2.8ml溶液中含有10.5mg同型二聚体蛋白)。2.8ml同型二聚体蛋白高剂量溶液是通过均匀滴入至3.5gβ-TCP颗粒来递送。
于实验组2中，通过将4ml注射用水加入至具有10mg同型二聚体蛋白的每一个小瓶中，以制备同型二聚体蛋白储备溶液ML(2.5mg/ml)。该储备溶液ML与体积比为1：1的注射用水混合，形成同型二聚体蛋白中剂量溶液(homodimeric protein Middle Dose Solution，于2.8ml溶液中含有3.5mg同型二聚体蛋白)。2.8ml同型二聚体蛋白中剂量溶液是通过均匀滴入至3.5gβ-TCP颗粒来递送。
于实验组3中，通过将4ml注射用水加入至具有10mg同型二聚体蛋白的每一个小瓶中，以制备同型二聚体蛋白储备溶液ML(2.5mg/ml)。该储备溶液ML与体积比为17：3的注射用水混合，形成同型二聚体蛋白低剂量溶液(homodimeric protein Low Dose Solution，于2.8ml溶液中含有1.05mg同型二聚体蛋白)。2.8ml同型二聚体蛋白低剂量溶液是通过均匀滴入至3.5gβ-TCP颗粒来递送。
实验组6是以和/>作为移植材料进行商售产品的比较，两者皆是由美敦力(Medtronic)公司分销。/>是由以CHO表达系统所制备的rh-BMP-2以及可吸收胶原海绵(「ACS」)所组成。/>是颗粒状磷酸钙骨替代物，其是由85％的β-TCP及15％的羟磷石灰(Hydroxyapatite)所组成。将/>及/>结合应用于后外侧腰椎融合已显示具有疗效，其是由E.Dawson等人以证据强度2的临床研究报导(骨关节外科手术期刊(J Bone Joint Surg Am.)2009；91:1604-13)。用于实验组6的移植材料是由每一部位3.15mg的rh-BMP-2、4cc的ACS、及5cc的/>所组成，移植材料的制备步骤是依照E.Dawson的报告。手术记录中记录/>和/>的批号。
在手术后的首7日，每日监测该动物，并在每只动物的手术后监测表上记录观察结果。
于4周时拍摄所有动物前后方向的放射线摄影。以Zoletil(8-12mg/kg，肌肉注射)及异氟烷(2％)和氧气(每分钟2公升)放气，使动物镇静。该放射线摄影是用于比较术后X光是否有新骨出现以及TCP材料的吸收。于手术后12周，以致死心脏注射Lethobarb牺牲所有动物。
为监测骨形成的时间，如下表9所示，于三个不同的时间点静脉内注射三种不同的荧光染料。
表9：荧光染料使用的日期和剂量*
*使用前通过0.22μm过滤器全部过滤
X光评估
收获腰椎(L1-L6)，并用数字相机拍摄照片。使用机器将收获的脊椎造影(设定24kV，45秒)。拍摄后前侧(posterior-anterior，PA)的数字放射线摄影，由三位不知情的(盲试)观察员在右侧和左侧对新骨形成和融合进行分级。使用定性分级系统以评估该放射线摄影(表10)。融合的评估是基于从一横突至次节的骨的连续性(0＝不连续，1-为连续)。基于表10中概述的百分比对融合块每侧上横突间的骨量进行分级。基于与具有相同材料量的0时(0time)放射线摄影进行比较，以记录TCP再吸收的量。
表10：放射线摄影分级参数
所有动物的后前侧放射线摄影于术后、4周、及12周拍摄。每一实验组的代表性X光如图4至9所示。实验组1、2、3、4、5、及6的术后X光显示颗粒明显。于第4周的时间点，实验组1及实验组2有些可见的颗粒，可以注意到其存在。实验组3及实验组4的颗粒较多，实验组6清楚的显示剩余的粒子或颗粒。于第12周时，实验组1、实验组2、及实验组3已无法从骨中分辨出粒子或颗粒。实验组4显示少量的骨形成，且没有清晰可见的颗粒。实验组6于12周时颗粒仍然明显。
3位盲试观察员进行放射线摄影评估。分级是由融合的二项式评估及融合块内存在骨量的5及评估所组成。结果如表11所示。首先计算每只动物的各级平均值，接着计算各实验组的平均值及标准偏差。
表11：显示平均值和(标准偏差)的分级汇总结果
实验组 左融合 右融合 左骨 右骨
1 0.777(0.17) 1(0) 4.83(0.27) 4.11(0.68)
2 0.777(0.40) 0.833(0.40) 3.50(1.09) 4.22(0.75)
3 0.666(0.51) 0.833(0.40) 3.44(1.40) 3.06(1.25)
4 0.222(0.40) 0.166(0.40) 1.11(0.17) 1(0)
5 0.277(0.44) 0.611(0.38) 3.06(1.28) 3.06(1.25)
6 1(0) 1(0) 4.78(0.17) 4.83(0.18)
[实施例11]-绵羊椎体间融合模型的体内骨诱导活性
在绵羊椎体间融合模型中，对于同型二聚体蛋白的骨诱导活性进行评估，前述同型二聚体蛋白的骨诱导活性包括依据实施例6所制造的重组多肽(即SEQ ID NO：260，包括分子内二硫键C44-C48及分子间C79-C112及C80-C114二硫键)、作为载体材料的多孔β-磷酸三钙(β-TCP)、及作为容纳器(accommodator)的护架(peek cage)。该磷酸钙载体具有约0.7至约1.7的钙与磷酸盐比率，且β-TCP孔隙率是大于70％、孔径为约300-600μm。
术前准备
根据标准操作程序为手术准备动物(物种：绵羊Ovis Aries；品种：BorderLeicester Merino Cross；来源：新南韦尔斯大学(UNSW)批准的供货商-新南韦尔斯州，干草，Hay Field Station，动物是新南韦尔斯大学动物护理和道德委员会批准后购买；年龄：四岁；性别：雌性(母羊))。手术前24小时，通过将酚太尼枸椽酸盐(fentanyl，100mg–2mcg/kg/hr)的透皮贴片施用于每只动物的右前腿(使用左前腿的静脉路径)以进行预先镇痛。进行之前，将羊毛剪掉并以酒精棉片清洁皮肤以确保足够的吸收。至少手术前12小时使动物禁食并禁水。
手术
分配给本研究的羊只是在手术当日随机选择。羊只一旦被选择后，根据标准操作程序分配一编号并进行耳标。该辨识编号被记录于研究记录本。
于手术当日及开始前，研究兽医检查每只动物以确保其未患病或其他任何可能干扰研究目的或进行的状况。于研究记录本中记录每只动物的状况及适合纳入研究的动物编号。
根据标准操作程序，于程序期间诱导、麻醉、保持、及监测动物。左前腿头部静脉通路。根据标准操作程序于静脉施予哈特曼氏溶液前采集血液进行手术前分析。血样上标记「手术前(PRE-OP)」、研究ID、动物编号、日期，并将其送至澳洲生物科技产业研究中心(IDEXX)用于常规生物化学(4ml)及血液学(4ml)。
根据标准操作程序的修改版进行手术。
手术程序-L45微创脊椎前方融合术(XLIF)+椎弓螺钉(pedicle screw)
于手术之前，所有动物都受到48小时的食物限制(NPO)，并安置在隔离畜舍护理设施中。施用麻醉药物并诱导全身麻醉后，无菌地处理腰椎区后位、髂(骨)崤及胫骨近端。
移植物混合程序
将该同型二聚体蛋白(10mg/瓶)溶于0.3mL蒸馏水中，以制备33.3mg/mL的同型二聚体蛋白(HP)储备溶液A。将一块β-TCP(约150mg)置于椎间融合器中。于每一组中，从HP储备溶液A稀释或分得的「同型二聚体蛋白溶液(HP溶液)」，其均匀地滴在置于无菌培养皿的β-TCP块(约150mg)上。液体完全滴完后，在植入之前使β-TCP块于室温下放置超过15分钟。
实验组A至F使用上述与β-TCP载体结合的同型二聚体蛋白(Hp)作为移植材料，各部位的同型二聚体蛋白剂量如表12所示。混合程序的制备如下。
表12
于实验组A，Hp 4mg/部位：通过将0.3ml注射用水加入至具有10mg同型二聚体蛋白的每一个小瓶中，以制备同型二聚体蛋白(Hp)储备溶液A(33.3mg/ml)。将β-TCP块(约150mg)置入护架(peek cage)中。将120μL的Hp储备溶液A均匀滴入至150mgβ-TCP块内。
于实验组B，同型二聚体蛋白2mg/部位：将水与Hp储备溶液A以体积比1：1的比例混合，以获得Hp溶液B(16.7mg/mL)。将β-TCP块(约150mg)置入护架中。将120μL的Hp溶液B均匀滴入至150mgβ-TCP块内。
于实验组C，同型二聚体蛋白1mg/部位：将水与Hp溶液B以体积比1：1的比例混合，以获得Hp溶液C(8.3mg/mL)。将β-TCP块(约150mg)置入护架中。将120μL的Hp溶液C通过均匀滴入至150mgβ-TCP块来递送。
于实验组D，同型二聚体蛋白0.5mg/部位：将水与Hp溶液C以体积比1：1的比例混合，以获得Hp溶液D(4.2mg/mL)。将β-TCP块(约150mg)置入护架中。将120μL的Hp溶液D均匀滴入至150mgβ-TCP块内。
于实验组E，同型二聚体蛋白0.1mg/部位：将水与Hp溶液D以体积比1：4的比例混合，以获得Hp溶液E(0.8mg/mL)。将β-TCP块(约150mg)置入护架中。将120μL的Hp溶液E均匀滴入至150mgβ-TCP块内。
于实验组F，同型二聚体蛋白0mg/部位：将β-TCP块(约150mg)置入护架中。将120μL的水均匀滴入至150mgβ-TCP块内。
椎体间护架
触诊横突以确定适当的脊椎节段。该节段通过荧光检查进行验证。将Caspar针置入第4节(L4)和第5节(L5)腰椎体，并使用Caspar牵开器(retractor)以分开椎间盘空间。该椎间盘被迅速的剥离和刮除，并准备软骨板。将填充有移植材料的椎体间装置小心地放入该椎间盘空间，并松开该牵开器。软组织重新合并，并将皮肤分层闭合。
图10所示为椎体间护驾的外观。
椎弓螺钉(pedicle screw)
完成XLIF手术后，将动物置于俯卧位，并用无菌技术肢手术用布覆盖；初始皮肤切口位于腰椎第3节(L3)至荐椎第一节(S1)下背中央的背侧中线处。必要时，使用Cobb剥离子(elevator)和电烙电刀沿着椎弓矢状面上进行钝性剥离–允许暴露L45面和横突，并在该节段插入椎弓螺钉及杆。
使用移动式X光机(POSKOM)及数字胶片盒(AGFA)在手术后立即拍摄后前侧的放射线摄影。数据以DICOM格式储存。并使用ezDICOM医学显示器软件输出JPG影像。此是根据标准操作程序执行。
术后监测
在手术后的首7日，每日监测并记录该动物。在本研究期间，兽医技术人员每日至少检查动物一次，并每周进行记录。技术人员发现任何健康问题皆会向兽医工作人员报告，以供实验室主持人进一步评估和管理。
依照研究现场标准操作程序监测绵羊。手术后首周每日以及此后每周，监测手术切口、食欲、皮肤和毛发变化、眼睛和黏膜、呼吸系统、循环系统、姿势/步态、行为模式(发生震颤、痉挛、过度流涎、及嗜眠)。此后监测的体征为警觉性/注意力、食欲，以及手术部位、眼睛外观、步行、及保持抬头的能力。介入标准是有感染的迹象。
手术后，在首3日动物接受口服抗生素(Kelfex)和镇痛剂(丁基原啡因，0.005-0.01mg/kg，肌肉注射)。手术后首7日进行每日神经评估。此后基于临床监测提供术后疼痛缓解。
移出物(EXPLANT)
按照标准操作程序，于指定时间点，在诱导及麻醉前确认每只动物的辨识编号。
根据标准操作程序，在麻醉诱导后，从颈静脉或头静脉采血。血样标有研究ID、动物编号、及日期。将血样密封在生物危害带中并保持在摄氏30度以下运送到SORL，并将其送至澳洲生物科技产业研究中心(IDEXX)用于常规生物化学(4ml)及血液学(4ml)。运输时间记录于记录本。
根据标准操作程序，在仍处于麻醉诱导的状况下，以致死注射Lethobarb使动物安乐死。尸体立即运送至SORL并保持温度在低于摄氏30度之下。
根据标准操作程序检查并解剖每只动物。收获腰椎并用数字相机拍照。检查手术部位是否有不良反应或感染迹象，并将结果记录及拍照。
于收获后立即，在所有动物12周内通过人工触诊评估融合团块的稳定性。两名经训练且富经验的盲试观察员一起作业，以评估该溶合团块侧向弯曲和屈曲–延伸时随着将该椎弓杆完好无损的移除。
当人工触诊评估该治疗节段的右侧及左侧的侧向弯曲以及屈曲–延伸性时，将融合分级为融合(僵硬，无活动性)或不融合(不僵硬，检测到活动性)。当评估右侧及左侧之侧向弯曲以及屈曲–延伸时，以非治疗节段的活动性作为人工触诊时的相对比较。
运动范围(RANGE OF MOTION，ROM)测试
小心从脊椎收获L45节段。将4mm x 15mm的螺钉插入该脊椎体，以用于辅助封装样品。
将节段小心地装入树脂中以进行ROM评估。使用Denso机器人测定屈曲–延伸性(flexion–extension，FE)、侧向弯曲(lateral bending，LB)、及轴向旋转(axialrotation，AR)等的运动范围。在测试前将椎弓杆移除。在FE、LB、及AR测试时，于脊椎上施加7.5Nm的纯矩，并由检测设备记录角变形。每一负荷曲线进行3次重复，得到每一治疗节段的FE、LB、及AR平均值，如图11所示。于机械测试后将样本定位在磷酸盐缓冲的福尔马林中，以将该融合之一面以石蜡组织学、另一面以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)组织学作为如下轮廓。ROM数据使用SPSS以ANOVA分析。
如表13所示，人工触诊指出剂量低于0.5mg是非僵硬活动节段，而剂量0.5mg、0.5mg以上及自体移植是僵硬活动节段。
表13
*FE:屈曲–延伸性
^LB:侧向弯曲
如图11所示，在任何治疗组别中对于轴向旋转的运动范围几乎没有变化。然而，对于所有治疗的组别的屈曲延伸性从完整而下降，并随着同型二聚体蛋白剂量提高呈现稳定性增加的趋势。自体移植及1.0mg同型二聚体蛋白最为相似。所有的治疗组别的侧向弯曲亦下降，降至<50％的完整值。随着同型二聚体蛋白剂量提高，侧向弯曲的活动范围亦呈现下降。剂量的影响在0.1mg至0.5mg阶段最为普遍。
微米级计算机断层扫描(Micro Computed tomography)–脊椎
用Inveon扫描仪(美国，西门子)在脊椎上进行微米级计算机断层扫描(μCT/MicroCT)。对于所有扫描设定切片厚度大约为50微米。CT扫描以DICOM格式储存。基于轴向、矢状、及冠状重塑三维模型，并进行检查。DICOM库送至研究发起人进行进一步分析。
为每只动物提供轴向、矢状、及冠状影像以及前侧、后侧三维模型。通过检查冠状及矢状面评估μCT的重塑，以检验受治疗节段间的融合。将整体μCT库通过两名经训练且富经验的观察员对治疗组别不知情的情况下(盲试)，使用相同的放射线摄影分级评分(表14)对该μCT进行分级。每个融合也将依据1至4的等级进行分级，该等级是代表骨量于质量上的分级：1：0-25％、2：26-50％、3：51-75％、4：76-100％。
表14 μCT的分级标准
级数 等级 说明
0 无新生骨 无可见的新生骨形成
1 可见新生骨 有可见的新生骨形成，但骨无连续
2 可见新生骨 具有可见透明的连续桥接性新生骨
3 可能有融合 连续桥接性新生骨形成
在三个正交平面以及前后视图中的三维模型中制备每只动物的μCT代表性影像。使用西门子Inveon体内微型计算器断层扫描仪对射线照相后的所有动物进行微米级计算机断层(μCT)扫描，以获得三个平面中脊椎融合的高分辨率放射照相影像。此是根据标准操作程序执行；然而，除此之外还使用500微米累加图像技术对每只动物进行更厚的重塑。需注意的是，对三维重塑进行了审查以评估整体融合状态，且报告和附录中提供了所有动物的代表性影像。此是根据标准操作程序进行。对于矢状和冠状CT影像进行审查，并根据表14提出对于融合的总体分级。参图12至14所示。
融合分级
在使用剂量0Hp mg/部位时，主要在终板处显示出残留的TCP和一些骨生成。在使用剂量0.1Hp mg/部位的情况下，产生新生骨并且存在最小量的残留TCP，但是并未见固态骨架桥接。在使用剂量0.5Hp mg/部位的情况下，产生良好的骨质量，但移植物内存在一些透明线。在使用剂量1.0Hp mg/部位和2.0Hp mg/部位的情况下，护架内的空间充满优质骨，并具有最小的透明面积。在使用剂量4.0Hp mg/部位的情况下，基于体积产生高等级的骨；然而，骨骼内部存有透明感，包括一些大型和小型袋部。自体移植(髂嵴)表现出可变的结果，具有良好的骨形成和不结合的区域。下表总结了每个部位的评分。
基于Micro CT分析的融合分级显示于表15中。总体骨分级和融合分级以1.0mg和2.0mg的Hp剂量达到峰值。骨以1至4的等级进行分级，其是代表骨质量的量处于：1：0-25％、2：26-50％、3：51-75％、4：76-100％。融合分级0至3是基于：0-无新生骨、1-可见新生骨，但不连续、2-可能(possible)有融合，呈现透明、3-可能(probable)与桥接骨融合。
表15
组别 ID 剂量Hp mg/部位 时间(周) 骨分级 融合分级
F W2781 0mg 12 2 1
F W2792 0mg 12 2 1
E w2790 0.1mg 12 3 1
E W2791 0.1mg 12 3 1
D W2788 0.5mg 12 4 2
D W2789 0.5mg 12 4 2
C W2786 1.0mg 12 4 2
C W2787 1.0mg 12 4 3
B W2784 2.0mg 12 4 2
B W2785 2.0mg 12 4 3
A W2782 4.0mg 12 4 2
A W2783 4.0mg 12 3 2
G W2793 自体移植(髂崤) 12 4 2
G W2794 自体移植(髂崤) 12 2 2
[实施例12]-控制释放系统制备(双重乳液法/基础物质/亲水性药物)
在一个实施方案中，将0.25g的PLGA(poly lactic-co-glycolic acid，乳酸/乙醇酸比率65/35，MW 40000-75000，Sigma-Aldrich公司)溶于2.5mL的二氯甲烷(Merck)使用震荡器(1000rpm)震荡5分钟，以形成10％的PLGA溶液(10％油相溶液)。将2.5mL再蒸馏水(double-distilled water，DDW)与10％的PLGA溶液缓慢混合，并在1,000rpm下搅拌15分钟，以形成第一乳液(w/o)。将第一乳液添加到10mL的0.1％(w/v)聚乙烯醇(PVA，MW～130000，Fluka公司)第二水溶液中，以500rpm搅拌并抽空气5分钟以形成第二乳液(w/o/w)。连续搅拌第二乳液4小时，然后静置1分钟。通过以4,000rpm离心5分钟收集沉淀中的颗粒。用5mL的DDW洗涤颗粒数分钟。离心并洗涤三次后，收集离心颗粒并冻干3天以形成PLGA微粒。将2mg和/或4mg的β-TCP粉末(Sigma-Aldrich公司)与50μL的DDW及10μg同型二聚体蛋白(Hp)混合形成浆液，其中该同型二聚体蛋白是含有根据实施例6(即，SEQ ID NO：260)所制造的重组多肽。然后将浆液混合或涂布在50mg的PLGA微粒表面，并冻干3天以形成PLGA微粒，其是控制释放系统(控释系统)之一。于某些实施方案中，冻干的控释系统可以被压制而形成扁平片剂(flat piece)。
在另一个实施方案中，将2.5mL的二氯甲烷与0.25g的PLGA(供货商Sigma公司)混和并搅拌5分钟(1,000rpm)，以形成10％的油相溶液(P1)。在P1中加入0.25mL再蒸馏水(double-distilled water，DDW)并搅拌15分钟(1,000rpm)，以形成第一乳液相(w/o，P2)。将P2置于10mL的0.1％(w/v)聚乙烯醇(PVA，MW～130000，Fluka公司)中，并搅拌(500rpm)4小时(P3)。P3以4,000rpm离心5分钟，弃去上清液，收集残余溶液。向P3中加入5mL的PBS并重复三次，收集残余溶液并冻干。将PLGA微球体的冻干粉末称重，计算产率(％)。将0.06mL的DDW与2mg的β-TCP粉末(Sigma-Aldrich公司)混合，然后将20μg的同型二聚体蛋白加入至β-TCP中搅拌5分钟。之后，将50mg的PLGA微球体加入到β-TCP与二聚体蛋白的混合物中并均匀搅拌。将含PLGA、β-TCP与二聚体蛋白的微球体(PLGA/Hp-β-TCP)冻干并压制成Φ10mm大小的片剂。(适当的压力为5～10公斤)。
在一些实施方案中，2mg和/或4mg的β-TCP粉末可被替换为4mg磷酸三钙(TCP)或1mg的α-磷酸三钙(α-TCP)。于某些实施方案中，PLGA 65/35可以用PLGA 50/50、聚乳酸(polylactic acid，PLA)或聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)替代。
从PLGA/Hp-β-TCP释放同型二聚体蛋白(Hp)的评估
将100mg的PLGA/Hp-β-TCP浸泡在1mL人体血清中，并37℃、转速60rpm下振荡。在15分钟、1小时、第1天、第2天、第3天、第7天、第10天、及第14天收集含有经释放的同型二聚体蛋白的人体血清溶液，并在每个时间点用800μL新鲜人体血清替换。将所收集的人体血清储存于-80℃，并用直接ELISA分析法同时分析所有样本。
图15a和15b所示为被覆β-TCP和同型二聚体蛋白的PLGA微粒的释放曲线。ELISA分析结果显示，以物理方式吸附或非共价键结合在PLGA微粒或/β-TCP表面上的同型二聚体蛋白经由扩散和PLGA分解作用，同型二聚体蛋白随着时间连续释放到人体血清溶液中，在15分钟和1小时分别释放17％和31.5％的同型二聚体蛋白相对量。同型二聚体蛋白的相对释放百分比分别为14.5％(60分钟至第1天)、14.3％(第1天至第2天)、7.6％(第2天至第3天)、9.3％(第3天至第7天)、5.4％(第7天至第10天)和0.4％(第10天至第14天)，此释放曲线显示同型二聚体蛋白由此PLGA/Hp-β-TCP片剂中呈现缓慢释放模式。此PLGA/Hp-β-TCP制剂缓解了常见的突发释放问题[Giteau等人，Int J Pharm 350：14(2008)]；大多数递送系统在首几个小时内会突发性的释放，通常释放60％以上的包封/表面结合产物[Woodruff等人，JMol Histol 38：425(2007)及Sawyer等人，Biomaterials 30：2479(2009)]。
图16所示为电子显微镜下PLGA微粒的形态和直径分布。PLGA微粒为球状，直径分布为100μm至150μm。
在另一个实施方案中，将2g的PLGA溶解于20mL的二氯甲烷(DCM)中，以形成10％的PLGA/DCM溶液。将双相磷酸钙(BCP)粉末分散于水中以形成水溶液。然后将水溶液与PLGA/DCM溶液混合并使用磁搅拌器搅拌30分钟，以形成乳液。接着，将乳液加入造粒机(granularmachine)中，以进行喷雾造粒程序形成PLGA微粒。
在Balb/C小鼠骨坏死模型中评估PLGA/Hp-β-TCP的新生骨形成
手术程序
于动物骨坏死模型中，为仿真真正的骨坏死情况，将整个胫骨骨膜剥离。用锯切出小鼠右侧胫骨中轴2mm长。使用液态氮将切割的骨表面冷冻5分钟，以模仿坏死的骨。接着，将该骨段倒转并放回到其在胫骨中的原始位置，并通过使用注射器针头(第26号)作为髓内固定而将其两端与胫骨的其他部分固定。再将测试物品放置在骨折周围之后，用丝缝线缝合伤口。将小鼠分为6组，包括坏死骨对照组(C)、PLGA/β-TCP(PT)组、PLGA/0.2μg Hp-β-TCP(POT-0.2)组、PLGA/0.8μg Hp-β-TCP(POT-0.8)组、PLGA/1.6μg Hp-β-TCP(POT-1.6)组、及PLGA/3.2μg Hp-β-TCP(POT-3.2)组。手术后4周，观察每个实验组中3至6只小鼠。
X光观察
术后4周，在43KVP和2mA时间为1.5s下用X光(日本，SOFTEX公司，M-100型)对胫骨骨折进行放射线照相检查。在整个观察期间应用适当的放大倍数，并将所得的显微照片一起与对照进行比较。
图17显示与对照组(C)或PLGA/β-TCP(PT)组相比，在植入包含不同剂量的同型二聚体蛋白PLGA/Hp-β-TCP 4周后，小鼠胫骨骨坏死片段骨痂形成的X光照片。对照组的骨修复效果出现不完全的融合，而在PT组骨坏死区存在一个小缺口。在POT-0.2、POT-0.8、POT-1.6和POT-3.2组中观察到明显的融合区块。结果表明，PLGA/Hp-β-TCP组的骨修复效果优于对照组和PT组。
骨组织的组织学分析
同时应用组织化学分析来评估骨组织中的显微变化。在苏木精-伊红(H&E)染色之前，使用0.5％的EDTA将所有骨组织样本脱钙。将所得样本包埋在石蜡中，制备5μm切片。切片常规用H&E染色并用显微镜观察。放大400倍时，将骨痂面积与对照组进行比较。
如图18所示，在植入PLGA/Hp-β-TCP(POT)4周后评估新骨生成。PLGA/β-TCP(PT)组的骨生成速率与对照组相比显示出相似的结果。而与PT组和对照组相比，POT组的骨生成速率增加，除了POT-3.2组之外，其他剂量组是以剂量依赖性(dose-dependent)方式增加。此般结果证实了同型二聚体蛋白控制释放载体的潜在优点，其可以在Balb/C小鼠骨坏死模型上诱导骨再生。
[实施例13]-持续释放系统
凝胶(putty)制备
粉末是根据表16的配方来制备及混合。粉末在4℃下储存过夜。在制备凝胶当日，所有材料(即该粉末、β-TCP、甘油、及去离子水)用紫外光照射20分钟。根据2×0.5×0.5cm的动物实验骨缺陷范围，并根据表16中所示的配方制备约0.9g重的凝胶。
表16
*1半水合硫酸钙(台湾，MT3公司)；*2二水合硫酸钙(美国，J.T.baker公司)；*3羟丙基甲基纤维素(美国，Sigma-Aldrich公司)；*4同型二聚体蛋白(Hp)，包括根据实施例6所制备的重组多肽(即，SEQ ID NO：260)最终体积20μg；*5磷酸钙(美国，Sigma-Aldrich公司)；*6磷酸三钙Beta形式(台湾，Wiltrom公司)；*7甘油(日本Showa公司)。
配方A：在无菌条件下，将160微升的0.125mg/mL的Hp溶液滴入约50mg的β-TCP，并使其吸附15分钟。
配方B：在无菌条件下，将40微升的0.5mg/mL的Hp溶液滴入约50mg的β-TCP，并使其吸附15分钟。将粉末和液体(如表16的配方B所示)和预先制备的β-TCP颗粒混合在一起并模制成型。
配方C：将粉末和液体(如表16的配方C所示)均匀混合。
配方D：在无菌条件下，将40微升的0.25mg/mL的Hp溶液滴入约50mg的β-TCP，并使其吸附15分钟以形成Hp/β-TCP颗粒。将粉末和液体(如表16的配方D所示)混合在一起以形成基质，并将该基质模制成特定形状。Hp/β-TCP颗粒均匀分布在该基质的外层。
配方E：在无菌条件下，将40微升的0.5mg/mL的Hp溶液滴入约50mg的β-TCP，并使其吸附15分钟以形成Hp/β-TCP颗粒。将粉末和液体(如表16的配方E所示)混合在一起以形成基质，并将该基质模制成特定形状。Hp/β-TCP颗粒均匀分布在该基质的外层。
配方F：在无菌条件下，将40微升的0.25mg/mL的Hp溶液滴入约50mg的β-TCP，并使其吸附15分钟以形成Hp/β-TCP颗粒。将粉末和液体(如表16的配方F所示)混合在一起以形成基质，并将该基质模制成特定形状。Hp/β-TCP颗粒均匀分布在该基质的外层。
配方G：将粉末和液体(如表16的配方G所示)均匀混合。
样本制备
将表16中所示的配方凝胶置于15ml试管中。将含有或不含有用Hp浸泡的β-TCP的凝胶置于3mL人体血清中，并使其在37℃、5％的CO2下静置。于初始时、1小时、第1天、第2天、第3天、第7天、第10天、第14天、及第21天收集含有经释放Hp的人体血清溶液，并且在每个时间点用2.5mL新鲜人体血清替换。将所收集的人体血清储存于-80℃，并用ELISA测定法分析所有样本。
OIF量化
为了量化同型二聚体蛋白的总浓度，使用ELISA方法定量人血清中同型二聚体蛋白的浓度(该测定法是来自美国inVentive卫生临床系统(inVentive Health clinicalsystems)开发的分析方法)。简言之，将样本、QC样本及标准品加入至覆盖I07捕获抗体(由Pharma Foods国际股份有限公司生成)的96孔板中。反应并除去未结合的物质后，加入HRP-I07检测抗体。该步骤之后是进一步的洗涤步骤并与显色基质进行反应。停止显色反应并在适当的波长下测量光密度。从标准偏差的非线性回归中计算同型二聚体蛋白的浓度。
为评估生物可吸收骨传导复合材料(如β-TCP或凝胶)对同型二聚体蛋白的释放曲线行为，并加以评估其是否适合骨再生。观察到自配方A释放的同型二聚体蛋白在开始时具有突发释放曲线，但在突发期后(约0至1小时)观察到如图20所示的缓慢释放(缓释)模式。而与配方A相比，配方B和配方C中的同型二聚体蛋白被凝胶或基质包裹起来，以至于在开始的几小时内无法释放。与此相对，当在被覆于凝胶或基质表面上含有β-TCP颗粒的同型二聚体蛋白(例如配方D)时，则达到了持续释放的效果。据了解，凝胶是一种具有加速骨再生能力的骨移植替代物。凝胶的组成决定了增塑、硬化、或固化能力。此后，不同的配方比例可以实现持续释放的剂型，前述配方例如选择二水合硫酸钙或硫酸钙用于制备凝胶。
骨替代材料的发展趋向于生物可吸收材料、骨传导材料、骨诱导(诱导)材料、以及生物兼容材料。换言之，复合骨缺陷填充材料的发展方向是开发具有多功能性的材料。在设计的凝胶中含有的骨替代材料具有适合骨细胞向内生长的孔隙，而同型二聚体蛋白可以在材料分解过程中缓慢并长期性的释放，以使间叶干细胞分化成前成骨细胞(preosteoblasts)，进而分化为造骨细胞(osteoblasts)。因此，将有效的加速骨缺陷部位的愈合。
[实施例14]-临床研究设计
研究设计1
一项随机、评估者-盲试、对照的研究，调查三个剂量等级同型二聚体蛋白(Hp)的疗效和安全性，该同型二聚体蛋白是包括根据实施例6(即，SEQ ID NO：260)所制造的重组多肽/β-TCP治疗开放性胫骨骨折需要骨移植才能进行。总共约35名患者具有初始开放性胫骨骨折(Gustilo IIIA型或IIIB型)参与本研究并将其分成(随机)4组以及一对照组(约5名患者)，其他各组由约10名患者(见下文)所组成。一瓶含有5.5mg同型二聚体蛋白的冻干粉末。还原后(用于获得预期浓度的确切水量将如表17中所述)，经还原的同型二聚体蛋白将与β-TCP混合，以制成最终浓度为1.5mg/g Hp/β-TCP(第2组)、2mg/g Hp/β-TCP(第3组)、或3mg/g Hp/β-TCP(第4组)，然后将特定量的混合物施用于发生骨折后3个月内的骨折部位。对照组(第1组)患者将接受自体移植骨移植但缺乏同型二聚体蛋白及/或β-TCP。在30周的主要研究期间，将追踪受试者的疗效及安全性，在完全的治疗后延长安全性追踪至52周。在一些实施方案中，所使用的β-TCP总量是基于对医生的判断和调整。
表17
*对于最终浓度为3.0mg/g(Hp/β-TCP)，需要2瓶冻干粉末与1瓶β-TCP混合；每瓶冻干粉末是由1.5ml的WFI还原；每瓶1ml还原Hp(总共2ml)与1瓶(2.4g)β-TCP混合。
患者纳入/排除标准
若受试者适用以下「所有」的纳入标准，则纳入该名受试者：
受试者≥20岁；
手术前72小时内非生育潜力的女性或在妊娠试验中具有阴性结果的女性、或男性；
初始开放性胫骨骨折(Gustilo IIIA型或IIIB型)和骨折3个月内植骨；
在双侧胫骨开放性骨折中，随机治疗分配于右胫骨；
在初始损伤后3个月内进行确定性治疗；及
具有生育潜力的女性受试者(即没有经过手术绝育或未经绝经后至少1年的女性)和具有生育潜力的男性受试者的伴侣必须同意在整个研究期间使用医学上可接受的避孕方法。医学上可接受的避孕方法包括荷尔蒙贴布、植入或注射宫内节育器、或双重屏障法(带有泡沫或阴道杀精子栓的保险套、带有杀精子的膈膜)。完全禁欲可被认为是一种可接受的避孕方法。在研究之前口服避孕药是一种可接受的避孕方法，但在研究期间需要另一种替代方法；
若受试者适用以下「任何」的排除标准，则排除该名受试者：
具有初始意识损失的头部损伤；
来自骨折的脓性排液、或活动性骨髓炎的迹象；
间隔综合征(Compartment syndrome)；
病理性骨折；佩吉特氏病(Paget's disease)或其他骨营养不良(osteodystrophy)病史；或异位骨化病史；
影响骨生成的内分泌或代谢疾病(例如：甲状腺或副甲状腺低下或亢进、肾性骨病变(renal osteodystrophy)、艾登二氏症综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、或成骨不全症)；
具有肾功能和/或肝功能异常，并具有肌酸酐或ALT值>5倍正常上限；
最近5年具有恶性肿瘤、对于任何恶性肿瘤进行放射治疗、或化学疗法的病史；
自体免疫疾病(例如全身性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)或皮肌炎(dermatomyositis))；
先前暴露于rhBMP-2；
对蛋白质药物过敏，例如：单克隆抗体、γ球蛋白、及磷酸三钙；
植入手术的28天内用任何研究性疗法进行治疗；
治疗使用强的松(prednisone)7天或更长时间(6个月内累积剂量>150mg或其他具有等效剂量的类固醇)、降血钙素(calcitonin，6个月内)。治疗使用二磷酸酯类(12个月内使用30天或更长时间)、治疗剂量的氟化物(12个月内使用30天)；
哺乳期的女性受试者；及
基于医生的判断，不适合参与本研究的任何病症。
疗效评估
初级终点：
初级研究的疗效终点是在确定伤口闭合后30周内接受次级介入的受试者的比例。
次级终点：
确定伤口闭合后的术后第6周、第12周、第18周、第24周、第42周、和第52周接受次级介入的受试者比例；
从确定伤口闭合到次级介入的时间；
确定伤口闭合后的术后第6周、第12周、第18周、第24周、第30周、第42周、和第52周临床骨折愈合的比率；
从确定伤口闭合至临床骨折愈合的时间；
确定伤口闭合后的术后第6周、第12周、第18周、第24周、第30周、第42周、和第52周放射线摄影愈合的比率；
从确定伤口闭合至放射线摄影愈合的时间；
用语「次级介入」是指与进行或任何发生可能刺激骨折愈合的事件的任何程序有关，其包括但不限于：骨移植、交换钉、板固定、钉动力化、超声波、电刺激、或磁场刺激或其他可能促进愈合的事。
用语「临床骨折愈合」是指从骨折部位的人工触诊没有压痛出现。在一些实施方案中，用语「临床骨折愈合」是指在完全负重的骨折部位无疼痛或轻微疼痛(疼痛评分0-3)，使用视觉仿真量表记录疼痛评分。
用语「放射线摄影骨折愈合」是指考虑到前后位片和侧位片的放射线摄影，研究者和/或个别的放射科医师鉴定到皮质层桥接及/或骨折部位处4个皮质的3个皮质上的骨折线消失的情形。
方法评估
安全评估方法
不良反应(Adverse effect，AE)：类型、严重程度、管理和结果。
系统性AE：不论因果关系如何，在治疗后发生或恶化的任何系统征兆、症状、疾病、实验室测试结果、放射线摄影发现、或生理学观察。
局部AE：包括炎症、感染(任何疑似或确诊为伴有软组织或骨的浅层或深层感染、伴随或不伴随细菌学确认)、硬件故障、疼痛(新增或提高)、外周水肿、异位骨化/软组织钙化、及与伤口愈合有关的并发症。
疗效评估方法
初级疗效结果和次级疗效结果基于全分析集(Full Analysis Set，FAS)群体和符合方案集(Per Protocol，PP)群体进行分析。初级分析将于FAS群体中进行。
初级疗效终点是在确定伤口闭合后30周内接受次级介入的受试者的比例。使用Cochran-Armitage趋势测试对FAS群体进行初级分析，以指出随着同型二聚体蛋白剂量增加的反应率的线性趋势。对初级疗效终点以PP群体进行支持性分析。
此外，次级疗效终点分析或总结如下：
确定伤口闭合后30周内放射线摄影骨折愈合的受试者比例及临床骨折愈合的受试者比例，将使用Cochran-Armitage趋势测试个别进行比较，以指出随着同型二聚体蛋白剂量增加的反应率的线性趋势。
从确定伤口闭合到次级介入的时间评估、从确定伤口闭合到临床骨折愈合的时间评估、以及从确定伤口闭合到放射线摄影骨折愈合的时间评估，将通过使用描述性统计学(平均值(mean)、标准偏差(SD))按照组别个别概述。
在确定伤口闭合后的术后第6周、第12周、第18周、第24周、第42周、和第52周内，接受次级介入的受试者的比例、临床骨折愈合的受试者比例、和放射线摄影骨折愈合的受试者比例将通过使用描述性统计学(n、％)按照组别个别概述。如果适用，每组95％置信区间(CI)将基于Clopper-Pearson置信区间估计法计算单一二项式比例。
研究设计2
一项随机、评估者-盲试、对照的研究，调查三个剂量等级同型二聚体蛋白(Hp)的安全性和疗效，该同型二聚体蛋白是包括根据实施例6(即，SEQ ID NO：260)所制造的重组多肽/β-TCP结合器(cage)及后侧辅助固定，于患有单节段(L1至S1之间)退化性椎间盘疾病(degenerative disk disease，DDD)使用后侧开放法以腰椎椎体间融合的病患之中。将24名受试者随机分配(1：1：1：1)至4组(1个对照组及3个不同剂量组)，用于治疗每组的临床试验研究用装置如下：
对照组(6名受试者)：标准护理(后侧开放法以伴随器使用的腰椎椎体间融合术)加上自体骨移植植入(有或无β-TCP)；
1mg Hp/部位(6名受试者)：每个部位(site)以标准护理加1mg同型二聚体蛋白；
2mg Hp/部位(6名受试者)：每个部位以标准护理加2mg同型二聚体蛋白；及
3mg Hp/部位(6名受试者)：每个部位以标准护理加3mg同型二聚体蛋白。
同型二聚体蛋白将以5.5mg Hp/瓶的冻干粉末与水一起供应于注射。还原后，该同型二聚体蛋白将与β-TCP混合，最终浓度为1mg Hp/部位、2mg Hp/部位、或3mg Hp/部位。然后将特定量的混合物施加到器中，特定量是取决于所使用器的大小。
在三种不同浓度的储备溶液中还原同型二聚体蛋白(用于获得预期浓度的确切体积将在表18中说明)，且在聚醚醚酮(PEEK)器(Wiltrom股份有限公司/xxx系列)中各储备溶液中每0.24ml需要与β-TCP块(0.3g)混合。
应用于DDD部位的同型二聚体蛋白最终浓度为：1.0mg Hp/部位、2.0mg Hp/部位、3.0mg Hp/部位。
同型二聚体蛋白的储备溶液：5.5(mg)/1.32(ml)＝4.2(mg/ml)；
同型二聚体蛋白(mg)/部位最终浓度为：4.2(mg/ml)×0.24(ml)＝1.0mg。
表18
自体移植物的来源可以是后上髂脊(posterior superior iliac spine，PSIS)或从后椎板切除术获得的骨碎片。如果自体移植物量不足，自体移植物可与β-TCP混合。根据研究者的判断，可以在所有组别中使用单侧或双侧后外侧融合(可以是单侧或双侧)局部移植和后部辅助固定措施。手术前连续3天静脉注射万古霉素(每6小时500mg)。
在24周的主要研究期间，将追踪受试者的疗效及安全性，且在指标手术后延长安全性追踪至24个月。在一些实施方案中，临床研究者和独立评估者将通过评估试验期间的放射线摄影结果来评估功效。
纳入标准：
若受试者适用以下「所有」的纳入标准，则纳入该名受试者：
受试者≥20岁；
在L1至S1间有单节段DDD显示出椎间盘源性背部疼痛、神经根压迫继发神经根病变或不伴神经根压迫的神经根病变表现、表现为腿部或臀部放射状疼痛病史、感觉异常、麻木、或无力、或有神经源性跛行病史；
有放射学证据显示腰椎退化性疾病，如：椎间盘高度降低；髓鞘核突出；黄韧带、纤维环纤维化、或小关节囊肥大或增厚；小关节肥大、小关节间隙变窄、或小关节周围骨赘形成；三叶草椎管形状(trefoil canal shape)；或侧面(次关节)狭窄；或椎体终板骨赘形成；并至少有下列之一：
上方(颅骨)脊椎体在相较于下方(尾骨)脊椎体之前或后方的矢状面平移(滑动)大于4mm或角度大于10°、或上方(颅骨)脊椎体在相较于下方(尾骨)脊椎体的侧向的冠状面平移(滑动)大于4mm、或者腰椎管和/或椎间孔狭窄(狭窄症(stenosis))；
对非手术性治疗无反应至少6个月；
手术前72小时内非生育潜力的女性或在妊娠试验中具有阴性结果的女性、或男性；
具有生育潜力的女性受试者(即没有经过手术绝育或未经绝经后至少1年的女性)和具有生育潜力的男性受试者的伴侣必须同意在整个研究期间使用医学上可接受的避孕方法。医学上可接受的避孕方法包括荷尔蒙贴布、植入或注射宫内节育器、或双重屏障法(带有泡沫或阴道杀精子栓的保险套、带有杀精子的膈膜)。完全禁欲可被认为是一种可接受的避孕方法。在研究之前口服避孕药是一种可接受的避孕方法，但在研究期间需要另一种替代方法；
若为女性，受试者是非哺乳期；
愿意在参与任何研究相关程序之前提供签名知情同意书(ICF)，并在试验期限中遵守研究要求。
排除标准：
若受试者适用以下「任何」的排除标准，则排除该名受试者：
大于等级1的脊髓滑脱症1(Meyerding的分类)；
所涉及的节段有脊椎仪器植入或椎体间融合术病史、或于计划插入椎弓螺钉的节段有脊椎体骨折；
确定的骨质软化症(osteomalacia)；
过去5年有活性恶性肿瘤或前恶性肿瘤病史(除原发性皮肤基底细胞癌和宫颈原位癌外)；
活性局部或全身性感染；
总体肥胖，定义为BMI≥30；
发烧>38℃；
精神上失能。若为可疑，则取得精神科咨询；
Waddell非器质性体征≥3；
酒精或药物滥用，定义为目前正在接受酒精及/或药物滥用的治疗。酒精滥用是一种饮酒模式，会对健康、人际关系、或工作能力造成伤害；
自身免疫性疾病(例如：全身性红斑狼疮(SLE)或皮肌炎)；
对蛋白质药物过敏(单克隆抗体或γ球蛋白)；
先前暴露于rhBMP-2；
影响骨生成的内分泌或代谢疾病(例如：甲状腺或副甲状腺低下或亢进、肾性骨病变(renal osteodystrophy)、艾登二氏症综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、或成骨不全症)；
治疗使用强的松(prednisone)7天或更长时间(6个月内累积剂量>150mg或其他具有等效剂量的类固醇)、降血钙素(calcitonin，6个月内)。治疗使用二磷酸酯类(12个月内使用30天或更长时间)、治疗剂量的氟化物(12个月内使用30天)、及在植入指定治疗之前30天内使用抗肿瘤、免疫刺激、或免疫抑制剂；
植入手术的28天内用任何研究性疗法进行治疗；
脊柱侧弯大于30度；
受试者具有显著中枢神经系统(CNS)、心血管、肺、肝、肾、代谢、胃肠、泌尿、内分泌、或血液疾病的病史或临床表现；
具有会妨碍本研究中治疗的安全性和疗效的准确临床评估的医学疾病或症状，例如：运动无力、感觉丧失、或会抑制正常步行或其他日常生活活动的痛苦状况；
具有肾功能及/或肝功能异常，并具有肌酸酐或ALT或AST值>5倍正常上限；
具有对PEEK过敏或不耐症的纪录；
对万古霉素过敏(allergy)或过敏症(hypersensitivity)的病史；
根据医生的判断，任何不适合受试者参加研究的情况。
计划研究时间：
筛选期：14天。确保受试者已经签署了ICF并评估该受试者是否符合研究条件。所述评估包括体格检查、生命征象、心电图、血液或尿液妊娠试验、实验室检验、术前临床和放射性评估。应收集人口统计学、病史、伴随用药和不良事件等资料。
治疗期：1天。检查受试者是否符合研究条件，取得基线样本/数据并管理研究结果。所述评估包括体格检查、生命征象和放射检查。应收集手术信息、伴随用药和不良事件等数据。
追踪期：在24周的主要研究期间追踪受试者，且在植入后延长安全性追踪至24个月。在治疗后第6周、第12周、第18周、第24周、第12个月、第18个月、第24个月进行评估。所述评估包括伴随治疗、体格检查、实验室评估、生命征象和放射线摄影检查(前视/后视及侧视、屈曲/延伸片)。在第24周和第24个月进行高分辨率薄层CT扫描(1mm切片，轴向矢状和冠状重塑指标为1mm)。
疗效评估
初级终点：
初级研究的疗效终点是术后第24周具有融合成功的受试者比例。
次级终点：
在术后第12个月、第18个月、及第24个月具有融合成功的受试者比例。
从基线到放射线摄影融合的时间。
在术后第24周、第12个月、第18个月、及第24个月内进行额外手术/介入的受试者比例；记录手术时间(从皮肤切口到伤口闭合)、失血(手术过程中)和住院时间。
在术后第24周、第12个月、第18个月、及第24个月Oswestry功能障碍指数(Oswestry Disability Index，ODI)的成功率；ODI问卷用于评估患者背部功能。ODI得分介于0-100之间。最好的分数是0(没有失能)，最差的分数是100(最大失能)。ODI成功率报告为受试者其ODI得分的百分比达到：术前得分-术后得分≥15。
在术后第24周、第12个月、第18个月、及第24个月，视觉模拟量表(VisualAnalogous Scale，VAS)的成功率得到改善。背部疼痛成功率报告为受试者其背部疼痛改善的百分比达到：术前得分-术后得分>0。腿部疼痛成功率报告为受试者腿部疼痛改善的百分比达到：术前得分-术后得分>0。
疗效分析
初级疗效结果和次级疗效结果将基于全分析集(Full Analysis Set，FAS)群体和符合方案集(Per Protocol，PP)群体进行分析。初级分析将于FAS群体中进行。
初级研究的疗效终点是术后第24周具有融合成功的受试者比例。使用Cochran-Armitage趋势测试对FAS群体进行初级分析，以指出随着同型二聚体蛋白剂量增加的反应率的线性趋势。对初级疗效终点以PP群体进行支持性分析。
此外，次级疗效终点分析或总结如下：
在术后第12个月、第18个月、及第24个月具有融合成功的受试者比例，以及在术后第24周、第12个月、第18个月、及第24个月内进行额外手术/介入的受试者比例，将使用Cochran-Armitage趋势测试个别进行比较，以指出随着同型二聚体蛋白剂量增加的反应率的线性趋势。
从基线到放射线摄影融合的时间评估，将通过使用描述性统计学(平均值(mean)、标准偏差(SD))按照组别概述。
手术时间(从皮肤切口到伤口闭合)、失血(手术过程中)和住院时间的时间评估，将通过使用描述性统计学(平均值(mean)、标准偏差(SD))按照组别个别概述。
术后第24周、第12个月、第18个月、及第24个月的ODI成功率及术后第24周、第12个月、第18个月、及第24个月的VAS成功率将通过使用描述性统计学(n、％)按照组别个别概述。如果适用，每组95％置信区间(CI)将基于Clopper-Pearson置信区间估计法计算单一二项式比例。
本发明不限于本文所述的具体实施例的范围。实际上，除了所描述的内容之外，对于本发明所属技术领域的技术人员根据先前描述及附图中显而易见的各种修饰。此般修饰意同落入所附申请专利范围的范畴中。
其它实施方案在所附的权利要求书范围内。
序列表
<110> 博晟生医股份有限公司（BioGend Therapeutics Co., Ltd.）
奧斯堤欧制药股份有限公司（Osteopharma Inc.）
孙大伟（Sun, Da-Wei）
<120> 重组多肽及其组合物及方法
<130> 3902.001PC01
<150> US 62/440,663
<151> 2016-12-30
<150> US 62/562,515
<151> 2017-09-25
<160> 357
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 875
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 卡那霉素抗性基因 (+3886 to +4760) 片段
<400> 1
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 60
ttcaacggga aacgtcttgc tctaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat 120
atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt 180
atgggaagcc cgatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg 240
atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca 300
tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga 360
aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc 420
tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg 480
atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga 540
gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata 600
aacttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc 660
ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag 720
accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac 780
agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc 840
atttgatgct cgatgagttt ttctaagaat taatt 875
<210> 2
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 氨苄青霉素抗性基因 (+3587 to +4699) 片段
<400> 2
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 60
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 120
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 180
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 240
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 300
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 360
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 420
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 480
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 540
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 600
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 660
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 720
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 780
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 840
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 900
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 960
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 1020
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 1080
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tat 1113
<210> 3
<211> 4513
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana
<400> 3
ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aactatgaga 120
ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc gcatgcgagc tcggtacccc gggtcgacct 180
gcagccaagc ttaattagct gagcttggac tcctgttgat agatccagta atgacctcag 240
aactccatct ggatttgttc agaacgctcg gttgccgccg ggcgtttttt attggtgaga 300
atccaagcta gcttggcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc 360
actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt 420
cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta 480
aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc 540
ctgatgaatg ctcatccgga atttcgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg 600
gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc 660
tggagtgaat accacgacga tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg 720
tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc 780
tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac 840
ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg 900
ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt 960
aatgaattac aacagtactg cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt 1020
tattggtgcc cttaaacgcc tggggtaatg actctctagc ttgaggcatc aaataaaacg 1080
aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct 1140
cctgagtagg acaaatccgc cctctagatt acgtgcagtc gatgataagc tgtcaaacat 1200
gagaattgtg cctaatgagt gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 1260
ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 1320
ggcggtttgc gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag 1380
ctgattgccc ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg 1440
ccccagcagg cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc 1500
ttcggtatcg tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt 1560
aatggcgcgc attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac 1620
gatgccctca ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc 1680
ttcccgttcc gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag 1740
acgcagacgc gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc 1800
caatgcgacc agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact 1860
gttgatgggt gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc 1920
ttccacagca atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg 1980
ttgcgcgaga agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat 2040
cgacaccacc acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg 2100
cgacggcgcg tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc 2160
cgccagttgt tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac 2220
tttttcccgc gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg 2280
ataagagaca ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac 2340
cctgaattga ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcaccattc 2400
gatggtgtcg gaatttcggg cagcgttggg tcctggccac gggtgcgcat gatctagagc 2460
tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 2520
gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 2580
ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 2640
actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 2700
aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 2760
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2820
cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2880
gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2940
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 3000
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3060
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3120
atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3180
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3240
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3300
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3360
ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3420
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3480
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3540
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg aattaattct 3600
tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata 3660
ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat 3720
aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct 3780
attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact 3840
gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag 3900
ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc 3960
gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa 4020
tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat 4080
tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca 4140
tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt 4200
agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac 4260
aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca 4320
ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc 4380
ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg 4440
taagcagaca gttttattgt tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 4500
ctttcgtctt cac 4513
<210> 4
<211> 273
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
cgggagtgca tctactacaa cgccaactgg gagctggagc gcaccaacca gagcggcctg 60
gagcgctgcg aaggcgagca ggacaagcgg ctgcactgct acgcctcctg gcgcaacagc 120
tctggcacca tcgagctcgt gaagaagggc tgctggctag atgacttcaa ctgctacgat 180
aggcaggagt gtgtggccac tgaggagaac ccccaggtgt acttctgctg ctgtgaaggc 240
aacttctgca acgaacgctt cactcatttg cca 273
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 5
cccgggacgg gagtgcatct acaacg 26
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 6
gtcgacttat ggcaaatgag tgaagcgttc 30
<210> 7
<211> 1539
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60
cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120
accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180
gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240
gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300
ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360
ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420
tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480
cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540
ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600
tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660
ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720
cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780
ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840
atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900
ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960
gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020
ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080
acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140
ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200
aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260
cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320
aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380
tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440
attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500
accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatctaa 1539
<210> 8
<211> 512
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ile Val Leu Leu Ala Phe Trp Met Tyr
145 150 155 160
Arg His Arg Lys Pro Pro Tyr Gly His Val Asp Ile His Glu Asp Pro
165 170 175
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Glu Ile Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys Ala Gln
195 200 205
Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys
210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys
225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys
275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp
290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg
305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu
355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile
370 375 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys
385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro
435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp
450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu
465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 9
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
1 5 10 15
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
20 25 30
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
35 40 45
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
50 55 60
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
65 70 75 80
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro
85 90
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 10
aataccacta caatggat 18
<210> 11
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pACT2文库质粒插入
<400> 11
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca aatgtaacat acaccctttg 60
tac 63
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 12
ttaaccatgg gccaagccaa acgc 24
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 13
ggatccttag tacaaagggt gtatgttac 29
<210> 14
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pACT2文库质粒插入
<400> 14
gtgagcttca aagacattgg gtggaatgac catgctagca gccagccggg gtatcacgcc 60
cgtccctgcc acggacaatg ccagaatatt ctggctgatc atctgaacga agattgtcat 120
gccattgttc agctgaagcc ccgctctgtt 150
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 15
ttaaccatgg tgagcttcaa agaca 25
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 16
ggatccttaa acagagcggg gcttcagct 29
<210> 17
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pACT2文库质粒插入
<400> 17
atcgttgtgg ataataaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtcttcc ccatccgctg 60
taccttgacg agaataaaaa gcctgtatat aagaactatc aggacgcgct tctgcatagt 120
tgtgggtgtc gc 132
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 18
ttaaccatga tcgttgtgga taataag 27
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 19
ggatccttag cgacacccac aactatgca 29
<210> 20
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pACT2文库质粒插入
<400> 20
acgtatccag cctctccgaa gccgatgagg tggtcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg 90
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 21
ttaaccatga cgtatccagc ctctccg 27
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 22
ggatccttac actgtccctg tctggttcc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pACT2文库质粒插入
<400> 23
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctggc cgcgagcctc ccgcaagtgc tgcctggtgc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 24
ttaaccatgg agcccctggg cggcgc 26
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 25
ggatccttac gaggccgtca ccgcgcgca 29
<210> 26
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pACT2文库质粒插入
<400> 26
actgcgctgg ctgggactcg gggagcgcag ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc 60
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga 120
ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg cacgtggact ttaaggagct gggc 174
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 27
ttaaccatga ctgcgctggc tgggac 26
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 28
ggatccttag cccagctcct taaagtcca 29
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 29
gaattcatta aagaggagaa attaa 25
<210> 30
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 30
ccggggtacc gagctcgcat gcggatcctt a 31
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
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ctcgagaaat cataaaaaat ttatttg 27
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
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tac 63
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<211> 21
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 33
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 34
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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gcccaagcca aacataaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
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<212> DNA
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 40
gctcaagcca aacacaaagg tcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
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<211> 21
<212> PRT
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
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<212> DNA
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 42
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tac 63
<210> 43
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 43
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 44
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<211> 50
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 45
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
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Ser Val
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<223> pQE-80L-Kana衍生物
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
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35 40 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 49
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50
<210> 50
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<212> DNA
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<223> pQE-80L-Kana衍生物
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<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 51
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50
<210> 52
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 53
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<210> 54
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
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<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 54
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<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 55
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35 40 45
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<212> DNA
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
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<220>
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<400> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 58
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<211> 44
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 59
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<213> 人工序列(artificial sequence)
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<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 60
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<210> 61
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 61
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 62
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<211> 44
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 63
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<210> 64
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<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 64
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tgtgggtgtc gc 132
<210> 65
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 65
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<210> 66
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 66
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<211> 44
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
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<400> 67
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<400> 69
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<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 70
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<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 71
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<212> DNA
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<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 72
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ggaggtctcc ggaaccggac agggacagtg 90
<210> 73
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 73
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1 5 10 15
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20 25 30
<210> 74
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 74
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc cacgagcctc ccgcaagtgc tgcctggggc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
<210> 75
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 75
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Gly Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
35 40
<210> 76
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 76
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc agcgagcctc ccgcaagtgc tgcctggttc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
<210> 77
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 77
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Gln Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Val Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
35 40
<210> 78
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 78
accgccctag atgggactcg gggagcgcag ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc 60
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga 120
ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg cacgtggact ttaaggagct gggc 174
<210> 79
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 79
gcccaagcca aacataaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgctcaag ccaaacacaa aggtcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 120
ttgtac 126
<210> 80
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 80
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Arg Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
35 40
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 81
ttaaccatgg cccaagccaa acat 24
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 82
gtttggcttg agcgtacaaa gggtg 25
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 83
caccctttgt acgctcaagc caaac 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 84
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 85
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 85
gctcaagcca aacacaaagg tcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgcccaag ccaaacataa agggtataaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 120
ttgtac 126
<210> 86
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 86
Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Ala Gln Ala Lys His Lys Gly Tyr Lys Arg Leu
20 25 30
Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
35 40
<210> 87
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 87
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 88
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 88
gtttggcttg ggcgtacaaa gggtg 25
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 89
caccctttgt acgcccaagc caaac 25
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 90
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 91
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 91
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tggatcgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt gtggatttct ctgacgttgg gtggaatgac 180
catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc ttctattgcc acggagaatg cccgttccca 240
ctggctgatc atctgaactc aacgaaccat gccattgttc agacccttgt taattctgtt 300
<210> 92
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 92
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala
50 55 60
Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro
65 70 75 80
Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu
85 90 95
Val Asn Ser Val
100
<210> 93
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 93
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 94
cagagaaatc cacaacagaa ttaac 25
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 95
gttaattctg ttgtggattt ctctg 25
<210> 96
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 96
ggatccttaa acagaattaa caagg 25
<210> 97
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 97
gtggatttct ctgacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc aacgaaccat 120
gccattgttc agacccttgt taattctgtt gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac 180
tggatcgtgg caccgccggg gtatcacgcc ttctattgcc acggagaatg cccgttccca 240
ctggctgatc atctgaactc agataaccat gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 300
<210> 98
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 98
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala
50 55 60
Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro
65 70 75 80
Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu
85 90 95
Val Asn Ser Val
100
<210> 99
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 99
ttaaccatgg tggatttctc tgacg 25
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 100
cgctgaaatc cacaacagaa ttaac 25
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 101
gttaattctg ttgtggattt cagcg 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 102
ggatccttaa acagaattaa cgagg 25
<210> 103
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 103
aatagcaaaa tacccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat tagcatgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtcgaaggg 120
tgtgggtgtc gcaatagcaa agatcccaag gcatgctgtg tcccgacaga actcagtgcc 180
ataagcatgc tgtaccttga cgagaatgag aaggtggtac tcaagaacta tcaggacatg 240
gtagtccatg ggtgtgggtg tcgc 264
<210> 104
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 104
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Asn Ser Lys Asp
35 40 45
Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu
50 55 60
Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met
65 70 75 80
Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
85
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 105
ttaaccatga atagcaaaat accca 25
<210> 106
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 106
gatctttgct attgcgacac ccacac 26
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 107
gtgtgggtgt cgcaatagca aagatc 26
<210> 108
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 108
ggatccttac gacacccaca cccat 25
<210> 109
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 109
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgccat aagcatgctg 60
taccttgacg agaatgagaa ggtggtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcaatagcaa aatacccaag gcatgctgtg tcccgacaga actcagtgcc 180
attagcatgc tgtaccttga cgagaatgag aagcctgtac tcaagaacta tcaggacatg 240
gtagtcgaag ggtgtgggtg tcgc 264
<210> 110
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 110
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Asn Ser Lys Ile
35 40 45
Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu
50 55 60
Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met
65 70 75 80
Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
85
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 111
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 112
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 112
gtattttgct attgcgacac ccacac 26
<210> 113
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 113
gtgtgggtgt cgcaatagca aaatac 26
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 114
ggatccttag cgacacccac accct 25
<210> 115
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 115
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacacgtatc cagcctctcc gaagccgatg aggcataaaa tgcggagctg cgcgtgctgc 120
gccggaggtc tccggaaccg aacagggaca gtg 153
<210> 116
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 116
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His
20 25 30
Lys Met Arg Ser Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Arg Thr
35 40 45
Gly Thr Val
50
<210> 117
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 117
ttaaccatgg ctcaagccaa acacaa 26
<210> 118
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 118
gaggctggat acgtgtacaa agggtg 26
<210> 119
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 119
caccctttgt acacgtatcc agcctc 26
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 120
ggatccttac actgtccctg ttcgg 25
<210> 121
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 121
acgtatccag cctctccgaa gccgatgagg cataaaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccgaac agggacagtg gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc 120
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tac 153
<210> 122
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 122
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Lys Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Arg Thr Gly Thr Val Ala Gln
20 25 30
Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His
35 40 45
Pro Leu Tyr
50
<210> 123
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 123
ttaaccatga cgtatccagc ctctcc 26
<210> 124
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 124
gtttggcttg agccactgtc cctgttc 27
<210> 125
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 125
gaacagggac agtggctcaa gccaaac 27
<210> 126
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 126
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 127
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 127
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt acgtatcccg cctctccgaa gccgatgagg 180
cattcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg 240
<210> 128
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 128
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Ser Met Arg
50 55 60
Ser Cys Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Gln Thr Gly Thr Val
65 70 75 80
<210> 129
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 129
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 130
ggcgggatac gtaacagaat taacg 25
<210> 131
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 131
cgttaattct gttacgtatc ccgcc 25
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 132
ggatccttac actgtccctg tctgg 25
<210> 133
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 133
acgtatcccg cctctccgaa gccgatgagg cattcaatgc ggagctgcgc gtgctgcgcc 60
ggaggtctcc ggaaccagac agggacagtg gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac 120
tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc ttctattgcc acggagaatg cccgttccca 180
ctggctgatc atctgaactc agataaccat gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 240
<210> 134
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 134
Thr Tyr Pro Ala Ser Pro Lys Pro Met Arg His Ser Met Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ala Cys Cys Ala Gly Gly Leu Arg Asn Gln Thr Gly Thr Val Val Asp
20 25 30
Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr
35 40 45
His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His
50 55 60
Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
65 70 75 80
<210> 135
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 135
ttaaccatga cgtatcccgc ctctcc 26
<210> 136
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 136
cgctgaaatc caccactgtc cctgtc 26
<210> 137
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 137
gacagggaca gtggtggatt tcagcg 26
<210> 138
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 138
ggatccttaa acagaattaa cgaggg 26
<210> 139
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 139
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgagcccc tgggcggcgc gcgctgggaa gcgttcgacg tgacggacgc ggtgcagagc 120
caccgccgct cgccacgagc ctcccgcaag tgctgcctgg ggctgcgcgc ggtgacggcc 180
tcg 183
<210> 140
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 140
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe
20 25 30
Asp Val Thr Asp Ala Val Gln Ser His Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ser
35 40 45
Arg Lys Cys Cys Leu Gly Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
50 55 60
<210> 141
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 141
ttaaccatgg ctcaagccaa acacaaac 28
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 142
ccgcccaggg gctcgtacaa agggtgtc 28
<210> 143
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 143
gacacccttt gtacgagccc ctgggcgg 28
<210> 144
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 144
ggatccttac gaggccgtca ccgcgcgc 28
<210> 145
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 145
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc cacgagcctc ccgcaagtgc tgcctggggc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 180
tac 183
<210> 146
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 146
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Pro Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Gly Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr
35 40 45
Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
50 55 60
<210> 147
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 147
ttaaccatgg agcccctggg cggcg 25
<210> 148
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 148
gtttggcttg agccgaggcc gtcac 25
<210> 149
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 149
gtgacggcct cggctcaagc caaac 25
<210> 150
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 150
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 151
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 151
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg 180
ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac cgccgctcgc agcgagcctc ccgcaagtgc 240
tgcctggttc tgcgcgcggt gacggcctcg 270
<210> 152
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 152
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr
50 55 60
Asp Ala Val Gln Ser His Arg Arg Ser Gln Arg Ala Ser Arg Lys Cys
65 70 75 80
Cys Leu Val Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser
85 90
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 153
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 154
gcccaggggc tcaacagaat taacg 25
<210> 155
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 155
cgttaattct gttgagcccc tgggc 25
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 156
ggatccttac gaggccgtca ccgcg 25
<210> 157
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 157
gagcccctgg gcggcgcgcg ctgggaagcg ttcgacgtga cggacgcggt gcagagccac 60
cgccgctcgc agcgagcctc ccgcaagtgc tgcctggttc tgcgcgcggt gacggcctcg 120
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 180
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 240
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt 270
<210> 158
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 158
Glu Pro Leu Gly Gly Ala Arg Trp Glu Ala Phe Asp Val Thr Asp Ala
1 5 10 15
Val Gln Ser His Arg Arg Ser Gln Arg Ala Ser Arg Lys Cys Cys Leu
20 25 30
Val Leu Arg Ala Val Thr Ala Ser Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp
35 40 45
Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His
50 55 60
Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His
65 70 75 80
Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
85 90
<210> 159
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 159
ttaaccatgg agcccctggg cggcg 25
<210> 160
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 160
gctgaaatcc accgaggccg tcacc 25
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 161
ggtgacggcc tcggtggatt tcagc 25
<210> 162
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 162
ggatccttaa acagaattaa cgagg 25
<210> 163
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 163
accgccctag atgggactcg gggagcgcag ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc 60
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga 120
ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg cacgtggact ttaaggagct gggcgctcaa 180
gccaaacaca aacagtacaa acgccttaag tccagctgta agagacaccc tttgtac 237
<210> 164
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 164
Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys
35 40 45
Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Ala Gln Ala Lys His Lys
50 55 60
Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
65 70 75
<210> 165
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 165
ttaaccatga ccgccctaga tgggac 26
<210> 166
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 166
gtttggcttg agcgcccagc tcctta 26
<210> 167
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 167
taaggagctg ggcgctcaag ccaaac 26
<210> 168
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 168
ggatccttag tacaaagggt gtctct 26
<210> 169
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 169
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaccgccc tagatgggac tcggggagcg cagggaagcg gtggtggcgg cggtggcggt 120
ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc ggcggcggcg caggcagggg ccacgggcgc 180
agaggccgga gccgctgcag tcgcaagtca ctgcacgtgg actttaagga gctgggc 237
<210> 170
<211> 79
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 170
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly
20 25 30
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser
50 55 60
Arg Cys Ser Arg Lys Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly
65 70 75
<210> 171
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 171
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 172
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 172
catctagggc ggtgtacaaa gggtg 25
<210> 173
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 173
caccctttgt acaccgccct agatg 25
<210> 174
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 174
ggatccttag cccagctcct taaag 25
<210> 175
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 175
gtggatttca gcgacgttgg gtggaatgac tgggctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccctcgt taattctgtt accgccctag atgggactcg gggagcgcag 180
ggaagcggtg gtggcggcgg tggcggtggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcggcggc 240
ggcggcgcag gcaggggcca cgggcgcaga ggccggagcc gctgcagtcg caagtcactg 300
cacgtggact ttaaggagct gggc 324
<210> 176
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 176
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser
85 90 95
Arg Lys Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly
100 105
<210> 177
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 177
ttaaccatgg tggatttcag cgacg 25
<210> 178
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 178
catctagggc ggtaacagaa ttaac 25
<210> 179
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 179
gttaattctg ttaccgccct agatg 25
<210> 180
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 180
ggatccttag cccagctcct taaag 25
<210> 181
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 181
gctcaagcca aacacaaaca gtacaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcagcgacgt tgggtggaat gactgggctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccct cgttaattct gtt 213
<210> 182
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 182
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
65 70
<210> 183
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 183
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 184
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 184
cgctgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 185
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 185
caccctttgt acgtggattt cagcg 25
<210> 186
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 186
ggatccttaa acagaattaa cgagg 25
<210> 187
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 187
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120
gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180
catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gtt 213
<210> 188
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 188
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
65 70
<210> 189
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 189
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 190
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 190
cactgaagtc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 191
caccctttgt acgtggactt cagtg 25
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 192
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 193
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 193
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tac 213
<210> 194
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 194
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
65 70
<210> 195
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 195
ttaaccatgg tggacttcag tgacg 25
<210> 196
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 196
gtttggcttg agcaacagag ttgac 25
<210> 197
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 197
gtcaactctg ttgctcaagc caaac 25
<210> 198
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 198
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 199
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 199
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc 180
ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta 240
aagaactatc aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc gc 282
<210> 200
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 200
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu
50 55 60
Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu
65 70 75 80
Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg
85 90
<210> 201
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 201
ttaaccatgg tggacttcag tgacg 25
<210> 202
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 202
gaatcttaga gttaacagag ttgac 25
<210> 203
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 203
gtcaactctg ttaactctaa gattc 25
<210> 204
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 204
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 205
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 205
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgtggactt cagtgacgtg gggtggaatg actggattgt ggctcccccg 180
gggtatcacg ccttttactg ccacggagaa tgcccttttc ctctggctga tcatctgaac 240
tccactaatc atgccattgt tcagacgttg gtcaactctg tt 282
<210> 206
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 206
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Ser
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val
85 90
<210> 207
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 207
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 208
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 208
actgaagtcc acgcgacacc cacaa 25
<210> 209
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 209
ttgtgggtgt cgcgtggact tcagt 25
<210> 210
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 210
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 211
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 211
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgctcaagc caaacacaaa cagcggaaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtac 195
<210> 212
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 212
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Ala Gln Ala Lys
35 40 45
His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr
65
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 213
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 214
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 214
ttggcttgag cgcgacaccc acaac 25
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 215
gttgtgggtg tcgcgctcaa gccaa 25
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 216
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 217
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 217
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaactcta agattcctaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg 120
ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag 180
ggttgtgggt gtcgc 195
<210> 218
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 218
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg
65
<210> 219
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 219
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 220
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 220
gaatcttaga gttgtacaaa gggtg 25
<210> 221
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 221
caccctttgt acaactctaa gattc 25
<210> 222
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 222
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 223
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 223
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcaaggacgt tgggtggaat gaccatgctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccaa ggttaattct gtt 213
<210> 224
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 224
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Lys Val Asn Ser Val
65 70
<210> 225
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 225
ttaaccatgg gccaagccaa acgca 25
<210> 226
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 226
ccttgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 227
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 227
caccctttgt acgtggattt caagg 25
<210> 228
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 228
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 229
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 229
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tac 213
<210> 230
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 230
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr
65 70
<210> 231
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 231
ttaaccatgg tggatttcaa ggacg 25
<210> 232
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 232
gtttggcttg gccaacagaa ttaac 25
<210> 233
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 233
gttaattctg ttggccaagc caaac 25
<210> 234
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 234
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 235
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 235
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcggccaagc caaacgcaaa gggtataaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtac 195
<210> 236
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 236
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Gly Gln Ala Lys
35 40 45
Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr
65
<210> 237
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 237
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 238
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 238
ttggcttggc cgcgacaccc acacc 25
<210> 239
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 239
ggtgtgggtg tcgcggccaa gccaa 25
<210> 240
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 240
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 241
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 241
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaatagca aagatcccaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg 120
ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat 180
gggtgtgggt gtcgc 195
<210> 242
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 242
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg
65
<210> 243
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 243
ttaaccatgg gccaagccaa acgca 25
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 244
gatctttgct attgtacaaa gggtg 25
<210> 245
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 245
caccctttgt acaatagcaa agatc 25
<210> 246
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 246
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 247
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 247
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcgtggattt caaggacgtt gggtggaatg accatgctgt ggcaccgccg 180
gggtatcacg ccttctattg ccacggagaa tgcccgttcc cactggctga tcatctgaac 240
tcagataacc atgccattgt tcagaccaag gttaattctg tt 282
<210> 248
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 248
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Lys
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn Ser Val
85 90
<210> 249
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 249
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 250
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 250
cttgaaatcc acgcgacacc cacac 25
<210> 251
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 251
gtgtgggtgt cgcgtggatt tcaag 25
<210> 252
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 252
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 253
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 253
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
ttctattgcc acggagaatg cccgttccca ctggctgatc atctgaactc agataaccat 120
gccattgttc agaccaaggt taattctgtt aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc 180
ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc 240
aagaactatc aggacatggt agtccatggg tgtgggtgtc gc 282
<210> 254
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 254
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu
50 55 60
Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu
65 70 75 80
Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg
85 90
<210> 255
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 255
ttaaccatgg tggatttcaa ggacg 25
<210> 256
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 256
gatctttgct attaacagaa ttaac 25
<210> 257
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 257
gttaattctg ttaatagcaa agatc 25
<210> 258
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 258
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 259
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 259
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120
gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180
catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300
ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgc 345
<210> 260
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 260
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 261
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 261
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 262
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 262
cactgaagtc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 263
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 263
caccctttgt acgtggactt cagtg 25
<210> 264
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 264
gaatcttaga gttaacagag ttgac 25
<210> 265
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 265
gtcaactctg ttaactctaa gattc 25
<210> 266
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 266
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 267
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 267
gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc 60
ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat 120
gccattgttc agacgttggt caactctgtt gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc 180
cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg tacaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300
ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgc 345
<210> 268
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 268
Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn
35 40 45
Ser Val Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 269
ttaaccatgg tggacttcag tgacg 25
<210> 270
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 270
gtttggcttg agcaacagag ttgac 25
<210> 271
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 271
gtcaactctg ttgctcaagc caaac 25
<210> 272
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 272
gaatcttaga gttgtacaaa gggtg 25
<210> 273
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 273
caccctttgt acaactctaa gattc 25
<210> 274
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 274
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 275
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 275
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgtggactt cagtgacgtg gggtggaatg actggattgt ggctcccccg 180
gggtatcacg ccttttactg ccacggagaa tgcccttttc ctctggctga tcatctgaac 240
tccactaatc atgccattgt tcagacgttg gtcaactctg ttgctcaagc caaacacaaa 300
cagcggaaac gccttaagtc cagctgtaag agacaccctt tgtac 345
<210> 276
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 276
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Val Asp Phe Ser
35 40 45
Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala
50 55 60
Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn
65 70 75 80
Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Ala Gln
85 90 95
Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His
100 105 110
Pro Leu Tyr
115
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 277
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 278
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 278
cactgaagtc cacgcgacac ccaca 25
<210> 279
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 279
tgtgggtgtc gcgtggactt cagtg 25
<210> 280
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 280
gtttggcttg agcaacagag ttgac 25
<210> 281
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 281
gtcaactctg ttgctcaagc caaac 25
<210> 282
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 282
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 283
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 283
aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg 60
taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta aagaactatc aggacatggt tgtggagggt 120
tgtgggtgtc gcgctcaagc caaacacaaa cagcggaaac gccttaagtc cagctgtaag 180
agacaccctt tgtacgtgga cttcagtgac gtggggtgga atgactggat tgtggctccc 240
ccggggtatc acgcctttta ctgccacgga gaatgccctt ttcctctggc tgatcatctg 300
aactccacta atcatgccat tgttcagacg ttggtcaact ctgtt 345
<210> 284
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 284
Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg Ala Gln Ala Lys
35 40 45
His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 285
ttaaccatga actctaagat tccta 25
<210> 286
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 286
gtttggcttg agcgcgacac ccaca 25
<210> 287
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 287
tgtgggtgtc gcgctcaagc caaac 25
<210> 288
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 288
cactgaagtc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 289
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 289
caccctttgt acgtggactt cagtg 25
<210> 290
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 290
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 291
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 291
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
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catgccattg ttcagaccaa ggttaattct gttaatagca aagatcccaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta 300
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<210> 292
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 292
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Lys Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 293
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 293
ttaaccatgg gccaagccaa acgca 25
<210> 294
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 294
ccttgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 295
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 295
caccctttgt acgtggattt caagg 25
<210> 296
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 296
gatctttgct attaacagaa ttaac 25
<210> 297
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 297
gttaattctg ttaatagcaa agatc 25
<210> 298
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 298
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 299
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 299
gtggatttca aggacgttgg gtggaatgac catgctgtgg caccgccggg gtatcacgcc 60
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ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat gggtgtgggt gtcgc 345
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<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 300
Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro Pro
1 5 10 15
Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala
20 25 30
Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val Asn
35 40 45
Ser Val Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser
50 55 60
Cys Lys Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 301
ttaaccatgg tggatttcaa ggacg 25
<210> 302
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 302
gtttggcttg gccaacagaa ttaac 25
<210> 303
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 303
gttaattctg ttggccaagc caaac 25
<210> 304
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 304
gatctttgct attgtacaaa gggtg 25
<210> 305
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 305
caccctttgt acaatagcaa agatc 25
<210> 306
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 306
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 307
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 307
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
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aactcagata accatgccat tgttcagacc aaggttaatt ctgtt 345
<210> 308
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 308
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn
20 25 30
Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys Arg Gly Gln Ala Lys
35 40 45
Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu
50 55 60
Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 309
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 310
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 310
gtttggcttg gccgcgacac ccaca 25
<210> 311
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 311
tgtgggtgtc gcggccaagc caaac 25
<210> 312
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 312
ccttgaaatc cacgtacaaa gggtg 25
<210> 313
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 313
caccctttgt acgtggattt caagg 25
<210> 314
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 314
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 315
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 315
aatagcaaag atcccaaggc atgctgtgtc ccgacagaac tcagtgcccc cagcccgctg 60
taccttgacg agaatgagaa gcctgtactc aagaactatc aggacatggt agtccatggg 120
tgtgggtgtc gcgtggattt caaggacgtt gggtggaatg accatgctgt ggcaccgccg 180
gggtatcacg ccttctattg ccacggagaa tgcccgttcc cactggctga tcatctgaac 240
tcagataacc atgccattgt tcagaccaag gttaattctg ttggccaagc caaacgcaaa 300
gggtataaac gccttaagtc cagctgtaag agacaccctt tgtac 345
<210> 316
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 316
Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Pro Leu Tyr
115
<210> 317
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 317
ttaaccatga atagcaaaga tccca 25
<210> 318
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 318
cttgaaatcc acgcgacacc cacac 25
<210> 319
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 319
gtgtgggtgt cgcgtggatt tcaag 25
<210> 320
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 320
gtttggcttg gccaacagaa ttaac 25
<210> 321
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 321
gttaattctg ttggccaagc caaac 25
<210> 322
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 322
ggatccttag tacaaagggt gtctc 25
<210> 323
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 323
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggatt tcaaggacgt tgggtggaat gaccatgctg tggcaccgcc ggggtatcac 120
gccttctatt gccacggaga atgcccgttc ccactggctg atcatctgaa ctcagataac 180
catgccattg ttcagaccaa ggttaattct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300
ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgc 345
<210> 324
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 324
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His
20 25 30
Ala Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Lys Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 325
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 325
ttaaccatgg ctcaagccaa acac 24
<210> 326
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 326
cttgaaatcc acgtacaaag ggtg 24
<210> 327
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 327
caccctttgt acgtggattt caag 24
<210> 328
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 328
gaatcttaga gttaacagaa ttaag 25
<210> 329
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 329
gttaattctg ttaactctaa gattc 25
<210> 330
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 330
ggatccttag cgacacccac aaccc 25
<210> 331
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 331
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120
gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180
catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaatagca aagatcccaa ggcatgctgt 240
gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta 300
ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat gggtgtgggt gtcgc 345
<210> 332
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 332
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp
20 25 30
Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys
35 40 45
Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val
50 55 60
Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys
65 70 75 80
Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn
85 90 95
Glu Lys Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys
100 105 110
Gly Cys Arg
115
<210> 333
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 333
ttaaccatgg gccaagccaa acgc 24
<210> 334
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 334
actgaagtcc acgtacaaag ggtc 24
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 335
caccctttgt acgtggactt cagt 24
<210> 336
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 336
gatctttgct attaacagag ttgac 25
<210> 337
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 337
gtcaactctg ttaatagcaa agatc 25
<210> 338
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 338
ggatccttag cgacacccac accca 25
<210> 339
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 339
gctcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaatagca aagatcccaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc ccccagcccg 120
ctgtaccttg acgagaatga gaagcctgta ctcaagaact atcaggacat ggtagtccat 180
gggtgtgggt gtcgcgtgga tttcaaggac gttgggtgga atgaccatgc tgtggcaccg 240
ccggggtatc acgccttcta ttgccacgga gaatgcccgt tcccactggc tgatcatctg 300
aactcagata accatgccat tgttcagacc aaggttaatt ctgtt 345
<210> 340
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 340
Ala Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Asp Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Pro Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val His Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg Val Asp Phe Lys Asp Val Gly Trp Asn Asp His Ala Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Asp Asn His Ala Ile Val Gln Thr Lys Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
<210> 341
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 341
ttaaccatgg ctcaagccaa acaca 25
<210> 342
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 342
gatctttgct attgtacaaa gggtg 25
<210> 343
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 343
caccctttgt acaatagcaa agatc 25
<210> 344
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 344
cttgaaatcc acgcgacacc cacac 25
<210> 345
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 345
gtgtgggtgt cgcgtggatt tcaag 25
<210> 346
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 346
ggatccttaa acagaattaa ccttg 25
<210> 347
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 347
ggccaagcca aacgcaaagg gtataaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60
tacaactcta agattcctaa ggcatgctgt gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg 120
ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag 180
ggttgtgggt gtcgcgtgga cttcagtgac gtggggtgga atgactggat tgtggctccc 240
ccggggtatc acgcctttta ctgccacgga gaatgccctt ttcctctggc tgatcatctg 300
aactccacta atcatgccat tgttcagacg ttggtcaact ctgtt 345
<210> 348
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物PCR融合产物
<400> 348
Gly Gln Ala Lys Arg Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys
1 5 10 15
Arg His Pro Leu Tyr Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro
20 25 30
Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys
35 40 45
Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly Cys
50 55 60
Arg Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro
65 70 75 80
Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu
85 90 95
Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val
100 105 110
Asn Ser Val
115
<210> 349
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 349
ttaaccatgg gccaagccaa acgc 24
<210> 350
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 350
gaatcttaga gttgtacaaa gggtg 25
<210> 351
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 351
caccctttgt acaactctaa gattc 25
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 352
tcactgaagt ccacgcgaca cccac 25
<210> 353
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 353
gtgggtgtcg cgtggacttc agtga 25
<210> 354
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 354
ggatccttaa acagagttga ccaac 25
<210> 355
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> pQE-80L-Kana衍生物
<400> 355
Thr Ala Leu Asp Gly Thr Arg Gly Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys
35 40 45
Ser Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly
50 55
<210> 356
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 重组多肽的第三域片段
<400> 356
Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu
1 5
<210> 357
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 重组多肽的第三域片段
<400> 357
Gly Cys Gly Cys Arg
1 5

Claims (14)

1.一种同型二聚体蛋白，其包含二个相同的重组多肽，其中该重组多肽的氨基酸序列由第一肽段、第二肽段、及第三肽段界定，其中：
该第一肽段的序列为SEQ ID NO:39；
该第二肽段的序列为SEQ ID NO:49；及
该第三肽段的序列为SEQ ID NO:61；
其中该第一肽段择一融合于该第二肽段的C端或N端，该第三肽段融合于该第二肽段或该第一肽段，该第二肽段包含一个分子内二硫键，且其中该重组多肽具有诱导碱性磷酸酶活性的能力；
其中该同型二聚体蛋白包含在该二个重组多肽的该第一肽段之间的分子间二硫键。
2.如权利要求1的同型二聚体蛋白，其中每一该重组多肽的该第三肽段包含：第一氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO:356)及第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO:357)，且其中该同型二聚体蛋白包含在该二个重组多肽的其一的该第三肽段中的该第一氨基酸序列和另一重组多肽的该第三肽段中的该第二氨基酸序列之间的二个分子间二硫键。
3.如权利要求1的同型二聚体蛋白，其中每一条该重组多肽的该第三肽段包含：第一氨基酸序列PKACCVPTE(SEQ ID NO:356)及第二氨基酸序列GCGCR(SEQ ID NO:357)，该同型二聚体蛋白包含：
(a)在该二个重组多肽的其一的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的第一分子内二硫键，以及在该二个重组多肽的其一的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的第二分子内二硫键；或
(b)在该二个重组多肽的其一的该第一氨基酸序列的第5个氨基酸和另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第2个氨基酸之间的第一分子内二硫键，以及在该二个重组多肽的其一的该第一氨基酸序列的第4个氨基酸和该另一重组多肽的该第二氨基酸序列的第4个氨基酸之间的第二分子内二硫键。
4.一种可生物分解组合物，具有诱导骨生成以在一个位置形成骨质的能力，其包含：
如权利要求1的同型二聚体蛋白，其中该重组多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:260；及
可生物分解的磷酸钙载体，其具有多个孔洞。
5.如权利要求4的可生物分解组合物，其中该可生物分解的磷酸钙载体的孔隙率大于70％，且孔径为300μm至600μm，其中该同型二聚体蛋白是0.003-0.32％(w/w)。
6.如权利要求4的可生物分解组合物，其中该可生物分解的磷酸钙载体的孔洞连通分布于该可生物分解的磷酸钙载体；其中该同型二聚体蛋白的有效量为0.03mg/g至3.2mg/g的该可生物分解的磷酸钙载体。
7.如权利要求4的可生物分解组合物，其中该可生物分解组合物适用于使一个组织凸出，该组织选自鼻沟、眉间、中面部组织、下颚轮廓线、下巴及脸颊，其中该位置选自由长骨骨折缺损、二个相邻脊椎骨体的空隙、不愈合骨的缺陷、上颚截骨切口、下颚截骨切口、矢状劈开截骨切口、颏整型截骨切口、快速颚扩张截骨切口以及在二个相邻脊椎骨的二个相邻横突之间纵向延伸的空间所组成的群组。
8.如权利要求4的可生物分解组合物，其中单一剂量的该同型二聚体蛋白为0.006mg至15mg，其中该可生物分解的磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解的磷酸钙载体于体内时不渗漏，从而使所形成的骨质限制于该可生物分解的磷酸钙载体的体积内。
9.如权利要求4的可生物分解组合物在制备促进一对象长骨骨折愈合的药物中的用途，其包含：制备含有如权利要求1的同型二聚体蛋白的组合物，该同型二聚体蛋白均匀地容置在缓释型可生物分解磷酸钙载体内，该可生物分解磷酸钙载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解磷酸钙载体于该对象体内时不渗漏，从而使该长骨骨折愈合限制于该磷酸钙载体的体积内；且植入该可生物分解组合物于该长骨骨折发生位置，其中该同型二聚体蛋白的量为0.03mg/g至3.2mg/g的该磷酸钙载体。
10.如权利要求4的可生物分解组合物在制备促进一对象脊椎融合的药物中的用途，其包含：暴露一个上脊椎骨和一个下脊椎骨；在该上脊椎骨和该下脊椎骨之间辨别出一个用以融合的部位；在该上脊椎骨及该下脊椎骨的各个用以融合的该部位上暴露一个骨表面；及于该部位上施用如权利要求4的同型二聚体蛋白及可生物分解磷酸钙载体。
11.如权利要求10的用途，其中该可生物分解磷酸钙载体是一种不可压缩递送载具，且其中该不可压缩递送载具是施用于需要骨生长但不自然发生骨生长的二个骨表面之间的该部位，该可生物分解磷酸钙载体包含至少一个用以施用于该部位的植入棒，该植入棒在该上脊椎骨及该下脊椎骨之间纵向延伸。
12.一种脊椎融合装置，其含有如权利要求4的可生物分解组合物；及一个脊椎融合器，其中该脊椎融合器被配置用以容置该可生物分解磷酸钙载体。
13.如权利要求4的可生物分解组合物在制备促进一对象的脊椎中产生骨质以融合二个相邻脊椎骨体的药物中的用途，其包含：准备用于产生该骨质的该可生物分解组合物，及将该组合物引入该二个相邻脊椎骨体之间的位置，该组合物含有如权利要求1的同型二聚体蛋白，该同型二聚体蛋白均匀地容置在一缓释型可生物分解载体内，该可生物分解载体供该同型二聚体蛋白流入该可生物分解载体于该对象体内时不渗漏，从而使所形成骨质限制于该缓释型可生物分解载体的体积内，随着该可生物分解载体降解，所容置的该同型二聚体蛋白于该可生物分解载体位置逐渐暴露，且其中该同型二聚体蛋白的量为该位置0.2mg/部位至10.5mg/部位。
14.一种用于填补骨孔隙的可模制组合物，其包含：含有90wt％至99.5wt％的可模制组合物的可模制基质；及如权利要求1的同型二聚体蛋白，于植入后1、24、48、72、168、240或336小时，从该可模制组合物释出少于25％的该同型二聚体蛋白。
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