DE10020125A1 - Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von Knochentumoren - Google Patents

Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von Knochentumoren

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Abstract

Aufgabe ist es, ein Agens für den postoperativen Einsatz, d. h. nach der Entfernung von primären oder metastatischen Knochentumoren, herzustellen, welches eine erfolgreiche Knochenregeneration unterstützt und lediglich eine für den Patienten minimal erforderliche Operation gestattet, ohne dass die Gefahr eine Tumor-Neumetastasierung an dem behandelten Knochen gegeben ist. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird das Agens aus einer Nukleinsäure hergestellt, indem eine an sich bekannte Sequenz zur Knochenwachstumsförderung und ein an sich bekannter Proteinaseinhibitor durch ein variables Spacermolekül verknüpft werden. Durch diese Verknüpfung kommt es zu einem neuartigen bifunktionellen Wirkstoff der beide Eigenschaften in einem biologischen Molekül vereinigt. DOLLAR A Die Erfindung findet Anwendung im medizinischen Bereich, insbesondere im Fachgebiet der Orthopädie.

Description

Die Erfindung betrifft ein Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von primären oder metastatischen Knochentumoren. Das Agens findet Anwendung im medizinischen Bereich, insbesondere im Fachgebiet der Orthopädie.
Die Prognose der malignen Knochentumoren hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen entscheidenden Wandel erfahren. Während 1970 die 5-Jahres-Überlebensrate noch unter 20% lag, überleben heute fast 80% der Patienten. Diese Erfolge sind auf neuere Therapieansätze mit prä- oder postoperativer Chemotherapie bzw. Bestrahlung, sowie die Erweiterung der diagnostischen und operativen Möglichkeiten zurückzuführen, die ein nach Entität, Tumorausdehnung und Grading differenziertes operatives Vorgehen ermöglichen. Ziel der operativen Therapie ist, von Ausnahmen abgesehen, die vollständige Entfernung des Tumors. Es bestehen unterschiedliche Möglichkeiten für das Vorgehen bei der Entfernung des Tumors:
  • 1. Erhalt der Extremität in der ursprünglichen Form mit Überbrückung eines entstehenden knöchernen Defektes ("limb salvage")
  • 2. Segmentamputationen
  • 3. Amputationen,
wobei in Hinsicht auf die Lebensqualität des Patienten die Methode (1) bevorzugt wird. In der nachstehenden Tabelle sind die unterschiedlichen Resektionsgrenzen mit ihren pathologischen Ergebnissen aufgeführt:
Aus den pathologischen Ergebnissen wird ersichtlich, welche Gefahren die extremitätenerhaltenden Operationen in sich bergen, da es bei inadäquater Resektion zu einem Verbleib einzelner Tumorreste kommen kann. Diese können die Prognose für den Patienten erheblich verschlechtern (Ozaki T., Hillmann A., Lindner N., Blasius S., Winkelmann W.: Chondrosarcoma of the pelvis. Clin. Orthop, 337,1997,226-39). Bei malignen Knochen- und Weichteilsarkomen muß grundsätzlich die weite oder radikale Resektion angestrebt werden (Toma S., Venturino A., Sogno G., Formica C., Bignotti B., Bonassi S., Palumbo R.:. Metastatic bone tumors. Nonsurgical treatment. Outcome and survival. Clin. Orthop. 295, 1993, 246-51). Ansonsten ist bei marginalen Resektionen von einer Lokalrezidivrate von 60-90% auszugehen.
Eine prä- bzw. postoperative Behandlung von Knochentumoren mittels Chemo- oder Strahlentherapie stellt eine Minimierung des Rezidivproblems dar. Neben den bekannten Nebenwirkungen dieser Therapie machen sich jedoch außerdem bei einem gewissen Prozentsatz der Patienten immer wieder erneute operative Eingriffe erforderlich. Außerdem sprechen nicht alle Tumoren identisch auf dieselben Therapiestrategien an. Die hohe Rückfallrate bei marginaler Resektion lässt in vielen Fällen eine weite bzw. radikale Resektion als bevorzugte operative Methode erscheinen. Allerdings ist die Folge einer solchen Operation meist, dass die Rekonstruktion des Knochens sich als kompliziert erweist. Für die Rekonstruktion des Knochens stehen unterschiedliche Möglichkeiten zur Verfügung:
  • - die autologe Rekonstruktion,
  • - die Endoprothetik und
  • - allogene Implantate.
Die autologe Rekonstruktion nutzt Knochenmaterial des Patienten, welches an Stelle des entfernten Knochens eingesetzt wird. Hier ist die mögliche Materialentnahme begrenzt, so dass nur kleinere Resektionen wieder aufgefüllt werden können. Die Endoprothetik besteht im Ersatz des fehlenden Knochens durch Prothesen aus bioverträglichen Materialien. Dieser Knochenersatz ist in seiner Herstellung zum Teil sehr aufwendig und kostenintensiv. Insbesondere bei der Behandlung von jungen Patienten tritt das Problem auf, dass die Prothesen sich nicht dem Wachstum des Patienten anpassen, so dass Folgeoperationen notwendig werden. Allogene Implantate setzen eine funktionierende Knochenbank voraus. Die Komplikation beim allogenen Knochen- und Gelenkersatz im klassischen Sinne ohne Gefäßanschluss sind hoch. Die Frakturrate im Verlauf von Jahren liegt bei diaphysären Implantaten der unteren Extremität bei über 50%, die Infektionsrate wird mit ca. 10-30% angegeben.
Neuere Therapieansätze beruhen auf der Implantation von bioabbaubaren Materialien, die mit rekombinanten Wachstumsfaktoren beschichtet werden (Kirker-Head C. A., Gerhart T. N., Schelling S. H., Hennig G. E., Wang E., Holtrop M. E.: Long-term healing of bone using recombinant human bone morphogenetic protein 2. Clin. Orthop. 318, 1995, 222-230). Erste Versuche mit rekombinanten Wachstumsfaktoren wurden bereits an Tiermodellen durchgeführt. (Übersichtsartikel: Groeneveld E. H. and Burger E. H.: Bone morphogenetic proteins in human bone regeneration, Eur. J. Endocrinol. 142(1), 2000, 9-21). Verfahren zur Herstellung und Anwendung solcher rekombinanter Wachstumsfakto­ ren sind ebenfalls bekannt (US 4 472 840, US 4 563 489, US 4 596 574, US 4 789 732, US 4 795 804, US 5 318 898, US 5 393 739, US 5 618 924, EP 0 409 472, DE 197 48 734).
Diese Wachstumsfaktoren dienen der besseren Ausheilung von Knochendefekten, da sie das natürliche Knochenwachstum stimulieren. Allerdings haben diese Faktoren keinerlei Einfluss auf die Persistenz und mögliche Ausbreitung von postoperativ noch vorhandenen Tumorzellen.
Ebenfalls bekannt ist die Steigerung der Proliferation von Osteoblasten sowie die Hemmung der Knochenresorption der Osteoklasten, durch ein Fragment des als Cystein­ proteaseinhibitor bekannten HMW (high molecular weight) Kininogen (US 5 885 964). Der Einsatz dieses Fragments ist bei der altersbedingten Verminderung der Knochenbildung durch die Osteoblasten und der gleichzeitig vermehrten Knochen­ resorption durch die Osteoklasten sinnvoll.
Ferner sind Arbeiten zu Untersuchungen der an der Tumormetastasierung bzw. der Knochenresorption beteiligten Proteasen bekannt (Haeckel, C. et al.: Protease expression in dedifferentiated parosteal osteosarcoma, Arch. Pathol. Lab. Med., 123, 1999, 213-21; Bjornland, K. et al.: S1000A4 involvement in metastasis: deregulation of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in osteosarcoma cells transfected with an anti-S1000A4 ribozyme, Cancer Res. 59, 1999, 4702-8). Die wichtigsten an diesem Prozess beteiligten Enzyme sind Cysteinproteinasen (Cathepsine L, B) Matrixmetalloproteinasen (MMP-2, MMP-9) und die Serinproteinase uPA. Desweiteren ist bekannt, dass das Cathepsin K, eine Cysteinproteinase der Osteoklasten, an der Knochenresorption beteiligt ist (Garnero, P. et al.: The collagenolytic activity of cathepsin K is unique among mammalian proteinases, J. Biol. Chem. 273, 1998, 32347-52).
Wachstumsfaktoren der TGF-β Superfamilie, wie die BMF's (bone morphogenetic protein), sind in der Lage, Knochenneubildung zu induzieren. Beispielhaft sei das BMP-2 genannt, welches in den folgenden Arbeiten beschrieben wird: Itoh, H. et al.: Experimental spinal fusion with use of recombinant human bone morphogenetic protein 2, Spine 24, 1999, 1402-5; Yoshida, K. et al.: Enhancement by recombinant human bone morphogenetic protein-2 of bone formation by means of porous hydroxyapatite in mandibular bone defects, J. Dent. Res. 78, 1999, 1505-10. Desweiteren sind andere BMPs beschrieben in:
Wozney, J. M. et al.: Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities, Science 242, 1988, 1528-34; Oida, 5. et al.: Cloning and sequence of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) from a human placental cDNA library, DNA Seq. 5, 1995, 273-5; Celeste, A. J. et al.: Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, 9843-7; Ozkaynak, E. et al.: OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family, EMBO J. 9, 1990, 2085-93; Ozkaynak, E. et al.: Osteogenic protein-2, A new member of the transforming growth factor beta superfamily expressed early in embryogenesis, J. Biol. Chem. 267, 1992, 25220-7; Hino, J. et al.: cDNA cloning and genomic structure of human bone morphogenetic protein-3B (BMP-3b), Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 1996, 304-10.
Endogene Proteinaseinhibitoren sind ebenfalls bekannt. Die Sequenz für das humane Cystatin C wurde von Abrahamson, M. et al.: Molecular eloning and sequence analysis of cDNA coding for the precursor of the human cysteine proteinase inhibitor cystatin, C. FEBS Lett. 216, 1987, 229-33, die des TIMP-2 von Stetler-Stevenson, W. G. et al.: Tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2) mRNA expression in tumor cell lines and human tumor tissues, J. Biol. Chem. 265, 1990, 13933-8 und die des PAI-2 von Ye, R. D., et al.: cDNA cloning and expression in Escherichia coli of a plasminogen activator inhibitor from human placenta, J. Biol. Chem. 262, 1987, 3718-25 beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Agens für den postoperativen Einsatz, d. h. nach der Entfernung von primären oder metastatischen Knochentumoren, zu schaffen, welches eine erfolgreiche Knochenregeneration unterstützt und eine für den Patienten weniger belastende Operation erforderlich macht, ohne dass die Gefahr einer Tumor- Neumetastasierung an dem behandelten Knochen gegeben ist. Die Lebensqualität des Patienten soll durch diese Art der Knochenresektion bei wirksamer und dauerhafter Tumorbekämpfung gehoben werden, wobei nicht nur der operative Eingriff zur Knochenresektion an sich, sondern auch dessen Folgen zu berücksichtigen sind.
Erfindungsgemäß wird ein Agens aus einer Nukleinsäure hergestellt, indem eine an sich bekannte Sequenz zur Knochenwachstumsförderung und ein an sich bekannter Proteinaseinhibitor durch ein variables Spacermolekül, beispielsweise ein Oligonukleotid, verknüpft werden. Durch diese Verknüpfung kommt es zu einem neuartigen Wirkstoff, der zwei Funktionen besitzt.
Bei Anwendung dieses bifunktionellen Agens für den postoperativen Einsatz nach der Entfernung von Knochentumoren wird einerseits das Knochenwachstum unterstützt und anderseits eine Metastasierung (durch im Operationsgebiet verbliebene Tumorzellen) in den Randzonen der Knochenprothese gehemmt.
In Abhängigkeit von der biologischen Aktivität des Tumors ist in jedem Fall damit zu rechnen, daß Mikrometastasierungen stattfinden, die zu lokalen Rezidiven führen. Hier soll neben dem günstigen Effekt auf die Rekonstitution des Knochens, die Gefahr einer eventuellen Metastasierung weitgehend minimiert werden. Im Gegensatz zur Praxis soll auf eine radikale Resektion verzichtet werden, die das Ziel hat, soviel Knochenmaterial zu entfernen, dass die Resektionsgrenzen mit Sicherheit tumorfrei sind, um den Tumor wirksam zu bekämpfen. Stattdessen braucht lediglich ein Minimum an Knochenmaterial resektiert zu werden, wobei die Gefahr einer weiteren Metastasierung vom Resektionsrand aus verringert wird. Auf Grund der minimalen Eingriffs erhöht sich die Lebensqualität des Patienten, nicht nur bezüglich der Operation und ihrer unmittelbaren, sondern auch hinsichtlich späterer Folgen. Durch den Einfluß des bifunktionellen Agens kommt es auch zu einem besseren Einwachsen der Prothese, was unter anderem kürzere Genesungszeiten und einen stabileren Einbau der Prothese bewirkt. Dadurch sollen Folgeoperationen vermieden werden.
Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben. Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA. Das Agens wird im weiteren als bifunktionelles Protein beschrieben und wird mit Hilfe bekannter Verfahren der Gentechnologie hergestellt. Grundlage des bifunktionellen Proteins können zwei unabhängig voneinander natürlich vorkommende Proteine oder Domänen von Proteinen sein, die mittels eines Spacermoleküls (nicht zu den natürlichen Proteindomänen gehörendes Peptid zwischen den funktionellen Domänen) miteinander verknüpft werden.
Die Erfindung umfasst die Kopplung zweier cDNAs mittels eines Oligonukleotides zu einer neuen cDNA. Die Erfindung umfaßt auch Derivate dieser neuen cDNA, die durch Austausch, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide entsteht, wobei die Aktivität des kodierten Genprodukts erhalten bleibt. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die rekombinante Expression des bifunktionellen Proteins in Prokaryonten, wie beispielsweise E.coli Stämme. Dazu werden Vektoren verwendet, welche die Expression in Prokaryonten ermöglichen. Diese Vektoren enthalten geeignete und an sich bekannte Regulationssignale für die Genexpression, wie Promotoren und Ribosomenbindungs­ stellen. Als Promotoren werden zum Beispiel der T7-Promotor, der tac-Promotor oder der tet-Promotor verwendet. Die Vektoren kodieren ebenfalls für Antibiotika-Resistenzen und den Replikationsursprung.
Die cDNA des bifunktionellen Proteins wird zur Transfektion von geeigneten Zellkulturen, wie Zellen mesenchymalen Ursprungs, in vitro und in vivo verwendet. Unter Transfektion wird die Einführung von Nukleinsäure-Konstrukten in Zellen oder Gewebe verstanden. Dazu werden Vektoren verwendet, die an sich bekannte, geeignete Regulationssignale für die Genexpression enthalten. Diese umfassen Transkriptionssignale, wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungsstellen sowie Transkriptionssignale, wie Ribosomenbindungs­ stellen. Als Promotoren werden eukaryotische Promotoren viralen und zellulären Ursprungs, wie zum Beispiel der CMV-Promotor, der RSV-Promotor oder der β-Aktin- Promotor, verwendet. Als Polyadenylierungssignal können alle bekannten Polyadenylie­ rungssignale eingesetzt werden, wie zum Beispiel dasjenige des SV40. Diese Vektoren können außerdem noch genetische Marker, wie Antibiotika-Resistenzgene enthalten. Des weiteren eignen sich virale Vektoren für eine Transfektion von Zellen.
DNA-Konstrukte für die prokaryotische und eukaryotische Expression werden durch an sich bekannte Methoden der Gentechnologie wie PCR und Klonierung erzeugt.
Die Erfindung soll anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 Bei der PCR verwendete Primer
Fig. 2 Expressionsplasmid für das Fusionsprotein aus Cystatin C und BMP-2
Fig. 3 Beispiele für mögliche Oligonukleotide zur Verknüpfung der Fusionspartner
Fig. 4 Expressionsplasmid für das Fusionsprotein aus Cystatin C und BMP-2 in einem Plasmid mit dem Maltose bindenden Protein (MBP)
Ausführungsbeispiel 1 Herstellung des prokaryonten Expressionsplasmids
Die cDNA von humanem Cystatin C wurde mittels der in Fig. 1 dargestellten Primer A und B für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einem Plasmid (Abrahamson, M. et al.: Molecular cloning and sequence analysis of cDNA coding for the precursor of the human cysteine proteinase inhibitor cystatin C, FEBS Lett. 216, 1987, 229-33) amplifiziert. Die cDNA eines reifen humanen BMP-2 wurde aus dem Plasmid pBF008 (B. Fahnert, HKI Jena), durch Restriktionsverdau mit den Restriktionsendonukleasen Eco47III und HindIII erhalten. Beide cDNAs wurden im Leserahmen hintereinander in das Expressionsplasmid pASK75 (Biometra) kloniert. Dazu wurde zunächst das PCR-Produkt des humanen Cystatin C in den Vektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kloniert und anschließend mit dem LICOR-System die Korrektheit des PCR-Produkts überprüft. Die cDNA des humanen Cystatin C wurde durch Restriktionsverdau mit den Enzymen XbaI und Eco47III herausgeschnitten und in den mit denselben Restriktionsenzymen geschnittenen Vektor pASK75 ligiert. Das erhaltene Konstrukt (pASKcC) wurde mit den Restriktionsenzymen Eco47III und HindIII geschnitten. Die mit denselben Restriktionsenzymen aus dem Plasmid pBF008 herausgeschnittene cDNA des reifen humanen BMP-2 wurde in das geschnittene Plasmid pASK75cC ligiert. An der cDNA des reifen humanen BMP-2 befand sich N-terminal ein aus 6 Histidinen (SEQ ID NO: 1) bestehendes Peptid, welches durch die beschriebene Klonierungsstrategie als ein möglicher Abstandhalter (siehe auch SEQ ID NO: 2-5) zwischen den beiden cDNAs dient. Die Basenabfolge in dem interessierenden Bereichen des DNA-Konstrukts wurde mittels DNA-Sequenzierung mit dem LICOR-System kontrolliert. Es konnte verifiziert werden, dass das Leseraster korrekt ist. Das erhaltene Expressionsplasmid (pASKcCHBMP-2) ist in Fig. 2 dargestellt. Fig. 3 zeigt Beispiele für mögliche Oligonukleotide zur Verknüpfung der Fusionspartner. Beispielhaft sind Cystatin C als Inhibitor bzw. BMP-2 als Wachstumsfaktor genannt. Als Proteinaseinhibitor können beispielhaft auch der PAI-2 für Serinproteinasen oder der TIMP-2 als Inhibitor für Metalloproteinasen verwendet werden. Weitere verwendbare Wachstumsfaktoren wären BMP-3, BMP-4, BMP-7 und andere Vertreter der TGF-β Superfamilie.
Durch PCR mit Primern C, D und wahlweise D' (Fig. 1) wurde die cDNA des bifunktionellen Proteins (cCHBMP-2) amplifiziert und in das Plasmid pMALc2 (New England BioLabs) inseriert. Dazu wurde das PCR-Produkt cCHBMP-2 in den Vektor pCR2.1-TOPO kloniert und mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII herausgeschnitten. Das Plasmid pMALc2 wurde mit denselben Restriktionsenzymen verdaut. Beide cDNAs wurden miteinander ligiert. Das entstandene Expressionsplasmid wurde in dem interessierenden Bereich sequenziert. Dieses Expressionsplasmid (pMALc2cCHBMP-2, Fig. 4) diente zur Expression des bifunktionellen Proteins als Fusionsprotein mit einem weiteren Protein, dem MBP (Maltose bindendes Protein). Das MBP dient der affinitätschromatografischen Reinigung von rekombinanten Proteinen. Es kann nach der Reinigung mittels Faktor Xa-Spaltung wieder entfernt werden, so dass der authentische N-Terminus des Cystatin C erhalten wird.
Ausführungsbeispiel 2 Expression des bifunktionellen Proteins in E coli (BL21 (DE3))
Zum Zwecke der Expression wurden die im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmide, pASKcCHBMP-2 (Fig. 2) und pMALc2cCHBMP-2 (Fig. 4), in den Bakterienstamm BL21 (DE3) (Novagen) transformiert. Die Transformation wurde nach bekannten Methoden für chemisch kompetente Zellen durchgeführt.
Die Expression wurde wie folgt durchgeführt. 200 ml Terrific broth (TB) Medium mit 100 µg/ml Ampicillin wurden mit einem Einzelklon angeimpft und kultiviert. Die Expression wurde induziert durch die Zugabe von 100 mg/l Anhydrotetracyclin im Falle des Plasmids pASKcCHBMP-2 und durch 1 mM IPTG im Falle des Plasmids pMALc2cCHBMP-2.
Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet und nach bekannten Methoden mit Lysepuffer und Ultraschall aufgeschlossen. Dieses Material wurde mit einer Chromatografie an Ni-NTA resin unter denaturierenden Bedingungen gereinigt.
Die Faltung und Dimerisierung erfolgt in einem Dimerisierungspuffer bei 25°C über mehrere Tage.
Neben der, hier beispielhaft dargestellten, Expression in Bakterien ist auch eine Expression in anderen bekannten Expressionssystemen wie Hefe, Insektenzellen oder Säugerzellen möglich.

Claims (12)

1. Agens für den postoperativen Einsatz nach der Entfernung von Knochentumoren, bestehend aus einer Nukleinsäure, enthaltend eine Sequenz, die für einen Wachstumsfaktor, insbesondere der TGF-β Superfamilie, kodiert und die durch ein Oligonukleotid mit einer Nukleinsäure verknüpft ist, welche eine Sequenz enthält, die für einen Proteinaseinhibitor kodiert.
2. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den Wachstumsfaktor kodiert, aus einer Sequenz für ein an sich bekanntes BMP (bone morphogenetic protein) gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
3. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Cystein­ proteinaseinhibitor gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
4. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Serinproteinase gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
5. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Inhibitor der Metalloproteinasen gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
6. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Aspartat­ proteinaseinhibitor gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
7. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligo­ nukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
8. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligo­ nukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 2 gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
9. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligo­ nukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 3 gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligonukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 4 gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
11. Verfahren zur Herstellung des Agens gemäß Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass auf an sich bekannte Weise ein Vektorkonstrukt, geeignet zur Expression in einem Wirtsorganismus, hergestellt wird, dass eine Transformante an sich bekannter Art, die mit dem Vektorkonstrukt transformiert ist, hergestellt wird, dass die Transformante unter geeigneten Bedingungen kultiviert sowie aus der Kultur ein Polypeptid gewonnen, feingereinigt und einer Dimerisierung in einem geeigneten Puffer unterworfen wird und dass das Polypeptid anschließend immobilisiert wird.
12. Einschleusen eines geeigneten Vektorkonstruktes nach Anspruch 11 in eine Zielzelle mit der Absicht, die so veränderte Zelle dem Spenderorganismus wieder zuzuführen.
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