DE10020125A1 - Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von Knochentumoren - Google Patents
Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von KnochentumorenInfo
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Abstract
Aufgabe ist es, ein Agens für den postoperativen Einsatz, d. h. nach der Entfernung von primären oder metastatischen Knochentumoren, herzustellen, welches eine erfolgreiche Knochenregeneration unterstützt und lediglich eine für den Patienten minimal erforderliche Operation gestattet, ohne dass die Gefahr eine Tumor-Neumetastasierung an dem behandelten Knochen gegeben ist. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird das Agens aus einer Nukleinsäure hergestellt, indem eine an sich bekannte Sequenz zur Knochenwachstumsförderung und ein an sich bekannter Proteinaseinhibitor durch ein variables Spacermolekül verknüpft werden. Durch diese Verknüpfung kommt es zu einem neuartigen bifunktionellen Wirkstoff der beide Eigenschaften in einem biologischen Molekül vereinigt. DOLLAR A Die Erfindung findet Anwendung im medizinischen Bereich, insbesondere im Fachgebiet der Orthopädie.
Description
Die Erfindung betrifft ein Agens für den postoperativen Einsatz nach Entfernung von
primären oder metastatischen Knochentumoren. Das Agens findet Anwendung im
medizinischen Bereich, insbesondere im Fachgebiet der Orthopädie.
Die Prognose der malignen Knochentumoren hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen
entscheidenden Wandel erfahren. Während 1970 die 5-Jahres-Überlebensrate noch unter
20% lag, überleben heute fast 80% der Patienten. Diese Erfolge sind auf neuere
Therapieansätze mit prä- oder postoperativer Chemotherapie bzw. Bestrahlung, sowie die
Erweiterung der diagnostischen und operativen Möglichkeiten zurückzuführen, die ein
nach Entität, Tumorausdehnung und Grading differenziertes operatives Vorgehen
ermöglichen. Ziel der operativen Therapie ist, von Ausnahmen abgesehen, die vollständige
Entfernung des Tumors. Es bestehen unterschiedliche Möglichkeiten für das Vorgehen bei
der Entfernung des Tumors:
- 1. Erhalt der Extremität in der ursprünglichen Form mit Überbrückung eines entstehenden knöchernen Defektes ("limb salvage")
- 2. Segmentamputationen
- 3. Amputationen,
wobei in Hinsicht auf die Lebensqualität des Patienten die Methode (1) bevorzugt wird.
In der nachstehenden Tabelle sind die unterschiedlichen Resektionsgrenzen mit ihren
pathologischen Ergebnissen aufgeführt:
Aus den pathologischen Ergebnissen wird ersichtlich, welche Gefahren die
extremitätenerhaltenden Operationen in sich bergen, da es bei inadäquater Resektion zu
einem Verbleib einzelner Tumorreste kommen kann. Diese können die Prognose für den
Patienten erheblich verschlechtern (Ozaki T., Hillmann A., Lindner N., Blasius S.,
Winkelmann W.: Chondrosarcoma of the pelvis. Clin. Orthop, 337,1997,226-39). Bei
malignen Knochen- und Weichteilsarkomen muß grundsätzlich die weite oder radikale
Resektion angestrebt werden (Toma S., Venturino A., Sogno G., Formica C., Bignotti B.,
Bonassi S., Palumbo R.:. Metastatic bone tumors. Nonsurgical treatment. Outcome and
survival. Clin. Orthop. 295, 1993, 246-51). Ansonsten ist bei marginalen Resektionen von
einer Lokalrezidivrate von 60-90% auszugehen.
Eine prä- bzw. postoperative Behandlung von Knochentumoren mittels Chemo- oder
Strahlentherapie stellt eine Minimierung des Rezidivproblems dar. Neben den bekannten
Nebenwirkungen dieser Therapie machen sich jedoch außerdem bei einem gewissen
Prozentsatz der Patienten immer wieder erneute operative Eingriffe erforderlich.
Außerdem sprechen nicht alle Tumoren identisch auf dieselben Therapiestrategien an.
Die hohe Rückfallrate bei marginaler Resektion lässt in vielen Fällen eine weite bzw.
radikale Resektion als bevorzugte operative Methode erscheinen. Allerdings ist die Folge
einer solchen Operation meist, dass die Rekonstruktion des Knochens sich als kompliziert
erweist. Für die Rekonstruktion des Knochens stehen unterschiedliche Möglichkeiten zur
Verfügung:
- - die autologe Rekonstruktion,
- - die Endoprothetik und
- - allogene Implantate.
Die autologe Rekonstruktion nutzt Knochenmaterial des Patienten, welches an Stelle des
entfernten Knochens eingesetzt wird. Hier ist die mögliche Materialentnahme begrenzt, so
dass nur kleinere Resektionen wieder aufgefüllt werden können. Die Endoprothetik besteht
im Ersatz des fehlenden Knochens durch Prothesen aus bioverträglichen Materialien.
Dieser Knochenersatz ist in seiner Herstellung zum Teil sehr aufwendig und
kostenintensiv. Insbesondere bei der Behandlung von jungen Patienten tritt das Problem
auf, dass die Prothesen sich nicht dem Wachstum des Patienten anpassen, so dass
Folgeoperationen notwendig werden. Allogene Implantate setzen eine funktionierende
Knochenbank voraus. Die Komplikation beim allogenen Knochen- und Gelenkersatz im
klassischen Sinne ohne Gefäßanschluss sind hoch. Die Frakturrate im Verlauf von Jahren
liegt bei diaphysären Implantaten der unteren Extremität bei über 50%, die Infektionsrate
wird mit ca. 10-30% angegeben.
Neuere Therapieansätze beruhen auf der Implantation von bioabbaubaren Materialien, die
mit rekombinanten Wachstumsfaktoren beschichtet werden (Kirker-Head C. A., Gerhart
T. N., Schelling S. H., Hennig G. E., Wang E., Holtrop M. E.: Long-term healing of bone
using recombinant human bone morphogenetic protein 2. Clin. Orthop. 318, 1995, 222-230).
Erste Versuche mit rekombinanten Wachstumsfaktoren wurden bereits an
Tiermodellen durchgeführt. (Übersichtsartikel: Groeneveld E. H. and Burger E. H.: Bone
morphogenetic proteins in human bone regeneration, Eur. J. Endocrinol. 142(1), 2000,
9-21). Verfahren zur Herstellung und Anwendung solcher rekombinanter Wachstumsfakto
ren sind ebenfalls bekannt (US 4 472 840, US 4 563 489, US 4 596 574, US 4 789 732,
US 4 795 804, US 5 318 898, US 5 393 739, US 5 618 924, EP 0 409 472, DE 197 48 734).
Diese Wachstumsfaktoren dienen der besseren Ausheilung von Knochendefekten, da sie
das natürliche Knochenwachstum stimulieren. Allerdings haben diese Faktoren keinerlei
Einfluss auf die Persistenz und mögliche Ausbreitung von postoperativ noch vorhandenen
Tumorzellen.
Ebenfalls bekannt ist die Steigerung der Proliferation von Osteoblasten sowie die
Hemmung der Knochenresorption der Osteoklasten, durch ein Fragment des als Cystein
proteaseinhibitor bekannten HMW (high molecular weight) Kininogen (US 5 885 964).
Der Einsatz dieses Fragments ist bei der altersbedingten Verminderung der
Knochenbildung durch die Osteoblasten und der gleichzeitig vermehrten Knochen
resorption durch die Osteoklasten sinnvoll.
Ferner sind Arbeiten zu Untersuchungen der an der Tumormetastasierung bzw. der
Knochenresorption beteiligten Proteasen bekannt (Haeckel, C. et al.: Protease expression
in dedifferentiated parosteal osteosarcoma, Arch. Pathol. Lab. Med., 123, 1999, 213-21;
Bjornland, K. et al.: S1000A4 involvement in metastasis: deregulation of matrix
metalloproteinases and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in osteosarcoma cells
transfected with an anti-S1000A4 ribozyme, Cancer Res. 59, 1999, 4702-8). Die wichtigsten
an diesem Prozess beteiligten Enzyme sind Cysteinproteinasen (Cathepsine L, B)
Matrixmetalloproteinasen (MMP-2, MMP-9) und die Serinproteinase uPA. Desweiteren ist
bekannt, dass das Cathepsin K, eine Cysteinproteinase der Osteoklasten, an der
Knochenresorption beteiligt ist (Garnero, P. et al.: The collagenolytic activity of cathepsin
K is unique among mammalian proteinases, J. Biol. Chem. 273, 1998, 32347-52).
Wachstumsfaktoren der TGF-β Superfamilie, wie die BMF's (bone morphogenetic protein),
sind in der Lage, Knochenneubildung zu induzieren. Beispielhaft sei das BMP-2 genannt,
welches in den folgenden Arbeiten beschrieben wird: Itoh, H. et al.: Experimental spinal
fusion with use of recombinant human bone morphogenetic protein 2, Spine 24, 1999,
1402-5; Yoshida, K. et al.: Enhancement by recombinant human bone morphogenetic
protein-2 of bone formation by means of porous hydroxyapatite in mandibular bone
defects, J. Dent. Res. 78, 1999, 1505-10. Desweiteren sind andere BMPs beschrieben in:
Wozney, J. M. et al.: Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities, Science 242, 1988, 1528-34; Oida, 5. et al.: Cloning and sequence of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) from a human placental cDNA library, DNA Seq. 5, 1995, 273-5; Celeste, A. J. et al.: Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, 9843-7; Ozkaynak, E. et al.: OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family, EMBO J. 9, 1990, 2085-93; Ozkaynak, E. et al.: Osteogenic protein-2, A new member of the transforming growth factor beta superfamily expressed early in embryogenesis, J. Biol. Chem. 267, 1992, 25220-7; Hino, J. et al.: cDNA cloning and genomic structure of human bone morphogenetic protein-3B (BMP-3b), Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 1996, 304-10.
Wozney, J. M. et al.: Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities, Science 242, 1988, 1528-34; Oida, 5. et al.: Cloning and sequence of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) from a human placental cDNA library, DNA Seq. 5, 1995, 273-5; Celeste, A. J. et al.: Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, 9843-7; Ozkaynak, E. et al.: OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family, EMBO J. 9, 1990, 2085-93; Ozkaynak, E. et al.: Osteogenic protein-2, A new member of the transforming growth factor beta superfamily expressed early in embryogenesis, J. Biol. Chem. 267, 1992, 25220-7; Hino, J. et al.: cDNA cloning and genomic structure of human bone morphogenetic protein-3B (BMP-3b), Biochem. Biophys. Res. Commun. 223, 1996, 304-10.
Endogene Proteinaseinhibitoren sind ebenfalls bekannt. Die Sequenz für das humane
Cystatin C wurde von Abrahamson, M. et al.: Molecular eloning and sequence analysis of
cDNA coding for the precursor of the human cysteine proteinase inhibitor cystatin, C.
FEBS Lett. 216, 1987, 229-33, die des TIMP-2 von Stetler-Stevenson, W. G. et al.: Tissue
inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2) mRNA expression in tumor cell lines and
human tumor tissues, J. Biol. Chem. 265, 1990, 13933-8 und die des PAI-2 von Ye, R. D.,
et al.: cDNA cloning and expression in Escherichia coli of a plasminogen activator
inhibitor from human placenta, J. Biol. Chem. 262, 1987, 3718-25 beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, ein Agens für den postoperativen Einsatz,
d. h. nach der Entfernung von primären oder metastatischen Knochentumoren, zu schaffen,
welches eine erfolgreiche Knochenregeneration unterstützt und eine für den Patienten
weniger belastende Operation erforderlich macht, ohne dass die Gefahr einer Tumor-
Neumetastasierung an dem behandelten Knochen gegeben ist. Die Lebensqualität des
Patienten soll durch diese Art der Knochenresektion bei wirksamer und dauerhafter
Tumorbekämpfung gehoben werden, wobei nicht nur der operative Eingriff zur
Knochenresektion an sich, sondern auch dessen Folgen zu berücksichtigen sind.
Erfindungsgemäß wird ein Agens aus einer Nukleinsäure hergestellt, indem eine an sich
bekannte Sequenz zur Knochenwachstumsförderung und ein an sich bekannter
Proteinaseinhibitor durch ein variables Spacermolekül, beispielsweise ein Oligonukleotid,
verknüpft werden. Durch diese Verknüpfung kommt es zu einem neuartigen Wirkstoff, der
zwei Funktionen besitzt.
Bei Anwendung dieses bifunktionellen Agens für den postoperativen Einsatz nach der
Entfernung von Knochentumoren wird einerseits das Knochenwachstum unterstützt und
anderseits eine Metastasierung (durch im Operationsgebiet verbliebene Tumorzellen) in
den Randzonen der Knochenprothese gehemmt.
In Abhängigkeit von der biologischen Aktivität des Tumors ist in jedem Fall damit zu
rechnen, daß Mikrometastasierungen stattfinden, die zu lokalen Rezidiven führen. Hier soll
neben dem günstigen Effekt auf die Rekonstitution des Knochens, die Gefahr einer
eventuellen Metastasierung weitgehend minimiert werden. Im Gegensatz zur Praxis soll
auf eine radikale Resektion verzichtet werden, die das Ziel hat, soviel Knochenmaterial zu
entfernen, dass die Resektionsgrenzen mit Sicherheit tumorfrei sind, um den Tumor
wirksam zu bekämpfen. Stattdessen braucht lediglich ein Minimum an Knochenmaterial
resektiert zu werden, wobei die Gefahr einer weiteren Metastasierung vom Resektionsrand
aus verringert wird. Auf Grund der minimalen Eingriffs erhöht sich die Lebensqualität des
Patienten, nicht nur bezüglich der Operation und ihrer unmittelbaren, sondern auch
hinsichtlich späterer Folgen. Durch den Einfluß des bifunktionellen Agens kommt es auch
zu einem besseren Einwachsen der Prothese, was unter anderem kürzere Genesungszeiten
und einen stabileren Einbau der Prothese bewirkt. Dadurch sollen Folgeoperationen
vermieden werden.
Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben. Diese
steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA. Das Agens wird
im weiteren als bifunktionelles Protein beschrieben und wird mit Hilfe bekannter
Verfahren der Gentechnologie hergestellt. Grundlage des bifunktionellen Proteins können
zwei unabhängig voneinander natürlich vorkommende Proteine oder Domänen von
Proteinen sein, die mittels eines Spacermoleküls (nicht zu den natürlichen Proteindomänen
gehörendes Peptid zwischen den funktionellen Domänen) miteinander verknüpft werden.
Die Erfindung umfasst die Kopplung zweier cDNAs mittels eines Oligonukleotides zu
einer neuen cDNA. Die Erfindung umfaßt auch Derivate dieser neuen cDNA, die durch
Austausch, Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide entsteht, wobei die
Aktivität des kodierten Genprodukts erhalten bleibt. Gegenstand der Erfindung ist
ebenfalls die rekombinante Expression des bifunktionellen Proteins in Prokaryonten, wie
beispielsweise E.coli Stämme. Dazu werden Vektoren verwendet, welche die Expression
in Prokaryonten ermöglichen. Diese Vektoren enthalten geeignete und an sich bekannte
Regulationssignale für die Genexpression, wie Promotoren und Ribosomenbindungs
stellen. Als Promotoren werden zum Beispiel der T7-Promotor, der tac-Promotor oder der
tet-Promotor verwendet. Die Vektoren kodieren ebenfalls für Antibiotika-Resistenzen und
den Replikationsursprung.
Die cDNA des bifunktionellen Proteins wird zur Transfektion von geeigneten Zellkulturen,
wie Zellen mesenchymalen Ursprungs, in vitro und in vivo verwendet. Unter Transfektion
wird die Einführung von Nukleinsäure-Konstrukten in Zellen oder Gewebe verstanden.
Dazu werden Vektoren verwendet, die an sich bekannte, geeignete Regulationssignale für
die Genexpression enthalten. Diese umfassen Transkriptionssignale, wie Promotoren,
Enhancer, Polyadenylierungsstellen sowie Transkriptionssignale, wie Ribosomenbindungs
stellen. Als Promotoren werden eukaryotische Promotoren viralen und zellulären
Ursprungs, wie zum Beispiel der CMV-Promotor, der RSV-Promotor oder der β-Aktin-
Promotor, verwendet. Als Polyadenylierungssignal können alle bekannten Polyadenylie
rungssignale eingesetzt werden, wie zum Beispiel dasjenige des SV40. Diese Vektoren
können außerdem noch genetische Marker, wie Antibiotika-Resistenzgene enthalten. Des
weiteren eignen sich virale Vektoren für eine Transfektion von Zellen.
DNA-Konstrukte für die prokaryotische und eukaryotische Expression werden durch an
sich bekannte Methoden der Gentechnologie wie PCR und Klonierung erzeugt.
Die Erfindung soll anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen
näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 Bei der PCR verwendete Primer
Fig. 2 Expressionsplasmid für das Fusionsprotein aus Cystatin C und BMP-2
Fig. 3 Beispiele für mögliche Oligonukleotide zur Verknüpfung der Fusionspartner
Fig. 4 Expressionsplasmid für das Fusionsprotein aus Cystatin C und BMP-2 in
einem Plasmid mit dem Maltose bindenden Protein (MBP)
Die cDNA von humanem Cystatin C wurde mittels der in Fig. 1 dargestellten Primer A
und B für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus einem Plasmid (Abrahamson, M. et
al.: Molecular cloning and sequence analysis of cDNA coding for the precursor of the
human cysteine proteinase inhibitor cystatin C, FEBS Lett. 216, 1987, 229-33)
amplifiziert. Die cDNA eines reifen humanen BMP-2 wurde aus dem Plasmid pBF008 (B.
Fahnert, HKI Jena), durch Restriktionsverdau mit den Restriktionsendonukleasen Eco47III
und HindIII erhalten. Beide cDNAs wurden im Leserahmen hintereinander in das
Expressionsplasmid pASK75 (Biometra) kloniert. Dazu wurde zunächst das PCR-Produkt
des humanen Cystatin C in den Vektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kloniert und
anschließend mit dem LICOR-System die Korrektheit des PCR-Produkts überprüft. Die
cDNA des humanen Cystatin C wurde durch Restriktionsverdau mit den Enzymen XbaI
und Eco47III herausgeschnitten und in den mit denselben Restriktionsenzymen
geschnittenen Vektor pASK75 ligiert. Das erhaltene Konstrukt (pASKcC) wurde mit den
Restriktionsenzymen Eco47III und HindIII geschnitten. Die mit denselben
Restriktionsenzymen aus dem Plasmid pBF008 herausgeschnittene cDNA des reifen
humanen BMP-2 wurde in das geschnittene Plasmid pASK75cC ligiert. An der cDNA des
reifen humanen BMP-2 befand sich N-terminal ein aus 6 Histidinen (SEQ ID NO: 1)
bestehendes Peptid, welches durch die beschriebene Klonierungsstrategie als ein möglicher
Abstandhalter (siehe auch SEQ ID NO: 2-5) zwischen den beiden cDNAs dient. Die
Basenabfolge in dem interessierenden Bereichen des DNA-Konstrukts wurde mittels
DNA-Sequenzierung mit dem LICOR-System kontrolliert. Es konnte verifiziert werden,
dass das Leseraster korrekt ist. Das erhaltene Expressionsplasmid (pASKcCHBMP-2) ist
in Fig. 2 dargestellt. Fig. 3 zeigt Beispiele für mögliche Oligonukleotide zur Verknüpfung
der Fusionspartner. Beispielhaft sind Cystatin C als Inhibitor bzw. BMP-2 als
Wachstumsfaktor genannt. Als Proteinaseinhibitor können beispielhaft auch der PAI-2 für
Serinproteinasen oder der TIMP-2 als Inhibitor für Metalloproteinasen verwendet werden.
Weitere verwendbare Wachstumsfaktoren wären BMP-3, BMP-4, BMP-7 und andere
Vertreter der TGF-β Superfamilie.
Durch PCR mit Primern C, D und wahlweise D' (Fig. 1) wurde die cDNA des
bifunktionellen Proteins (cCHBMP-2) amplifiziert und in das Plasmid pMALc2 (New
England BioLabs) inseriert. Dazu wurde das PCR-Produkt cCHBMP-2 in den Vektor
pCR2.1-TOPO kloniert und mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII
herausgeschnitten. Das Plasmid pMALc2 wurde mit denselben Restriktionsenzymen
verdaut. Beide cDNAs wurden miteinander ligiert. Das entstandene Expressionsplasmid
wurde in dem interessierenden Bereich sequenziert. Dieses Expressionsplasmid
(pMALc2cCHBMP-2, Fig. 4) diente zur Expression des bifunktionellen Proteins als
Fusionsprotein mit einem weiteren Protein, dem MBP (Maltose bindendes Protein). Das
MBP dient der affinitätschromatografischen Reinigung von rekombinanten Proteinen. Es
kann nach der Reinigung mittels Faktor Xa-Spaltung wieder entfernt werden, so dass der
authentische N-Terminus des Cystatin C erhalten wird.
Zum Zwecke der Expression wurden die im Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen
Expressionsplasmide, pASKcCHBMP-2 (Fig. 2) und pMALc2cCHBMP-2 (Fig. 4), in den
Bakterienstamm BL21 (DE3) (Novagen) transformiert. Die Transformation wurde nach
bekannten Methoden für chemisch kompetente Zellen durchgeführt.
Die Expression wurde wie folgt durchgeführt. 200 ml Terrific broth (TB) Medium mit
100 µg/ml Ampicillin wurden mit einem Einzelklon angeimpft und kultiviert. Die
Expression wurde induziert durch die Zugabe von 100 mg/l Anhydrotetracyclin im Falle
des Plasmids pASKcCHBMP-2 und durch 1 mM IPTG im Falle des Plasmids
pMALc2cCHBMP-2.
Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet und nach bekannten Methoden mit
Lysepuffer und Ultraschall aufgeschlossen. Dieses Material wurde mit einer
Chromatografie an Ni-NTA resin unter denaturierenden Bedingungen gereinigt.
Die Faltung und Dimerisierung erfolgt in einem Dimerisierungspuffer bei 25°C über
mehrere Tage.
Neben der, hier beispielhaft dargestellten, Expression in Bakterien ist auch eine Expression
in anderen bekannten Expressionssystemen wie Hefe, Insektenzellen oder Säugerzellen
möglich.
Claims (12)
1. Agens für den postoperativen Einsatz nach der Entfernung von Knochentumoren,
bestehend aus einer Nukleinsäure, enthaltend eine Sequenz, die für einen
Wachstumsfaktor, insbesondere der TGF-β Superfamilie, kodiert und die durch ein
Oligonukleotid mit einer Nukleinsäure verknüpft ist, welche eine Sequenz enthält, die für
einen Proteinaseinhibitor kodiert.
2. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den
Wachstumsfaktor kodiert, aus einer Sequenz für ein an sich bekanntes BMP (bone
morphogenetic protein) gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion,
Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
3. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den
Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Cystein
proteinaseinhibitor gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion,
Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
4. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den
Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Serinproteinase
gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion
von Nukleotiden erhalten wurde.
5. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den
Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Inhibitor der
Metalloproteinasen gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion,
Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
6. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für den
Proteinaseinhibitor kodiert, aus einer Sequenz für einen an sich bekannten Aspartat
proteinaseinhibitor gebildet wird oder aus einer solchen Sequenz mittels Insertion,
Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten wurde.
7. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligo
nukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 1 gebildet wird oder aus einer
solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten
wurde.
8. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligo
nukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 2 gebildet wird oder aus einer
solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten
wurde.
9. Agens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das Oligo
nukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 3 gebildet wird oder aus einer
solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten
wurde.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, die für das
Oligonukleotid kodiert, aus einer Sequenz nach SEQ ID NO: 4 gebildet wird oder aus einer
solchen Sequenz mittels Insertion, Austausch oder Deletion von Nukleotiden erhalten
wurde.
11. Verfahren zur Herstellung des Agens gemäß Ansprüchen 1 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, dass auf an sich bekannte Weise ein Vektorkonstrukt, geeignet zur
Expression in einem Wirtsorganismus, hergestellt wird, dass eine Transformante an sich
bekannter Art, die mit dem Vektorkonstrukt transformiert ist, hergestellt wird, dass die
Transformante unter geeigneten Bedingungen kultiviert sowie aus der Kultur ein
Polypeptid gewonnen, feingereinigt und einer Dimerisierung in einem geeigneten Puffer
unterworfen wird und dass das Polypeptid anschließend immobilisiert wird.
12. Einschleusen eines geeigneten Vektorkonstruktes nach Anspruch 11 in eine Zielzelle
mit der Absicht, die so veränderte Zelle dem Spenderorganismus wieder zuzuführen.
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