JPH03503649A - 硬骨および軟骨誘導組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 硬骨および軟骨誘導組成物 この発明は、ＢＭＰ−３蛋白質と称する新しい群の精製蛋白質およびそれらを得 る方法に関するものである。それらの組成物は、硬骨および／または軟骨形成の 誘導並びに傷の治癒および組織修復に使用され得る。

この発明は、実質的に他のは乳類蛋白質を含まない、軟骨および／または硬骨形 成を刺激、促進または誘導し得る蛋白質を提供する。

この発明のひとＢＭＰ−３蛋白質は、第■表に記載されたアミノ酸配列の少なく ともアミノ酸番号３７７からアミノ酸番号４７２までを含むことを特徴とする。

これらの蛋白質は、軟骨および／または硬骨形成を誘導することができる。

ひとＢＭＰ−３蛋白質は、実質的に第■表に示されたＤＮＡ配列により形質転換 された細胞を培養し、その培養培地から実質的に第■表に示されたアミノ酸番号 ３７７からアミノ酸番号４７２までの９６アミノ酸配列を含む蛋白質を回収する ことにより生成される。

さらにＢＭＰ−３蛋白質料の構成員は、後記ラット骨形成検定において軟骨およ び／または硬骨形成活性を示す能力を特徴とし得る。

好ましい具体例において、この発明の蛋白質は、このラット骨形成検定において 骨１グラム当たり、５μｇ−１００μ９の濃度で活性を示す。さらに好ましい具 体例で、これらの蛋白質は、この検定において骨１グラム当たりｌμｇ−５０μ ９の濃度で活性を示す。さらに詳しくは、これらの蛋白質は、ラット骨形成検定 において１μ９の蛋白質で少なくとも＋２の評価が得られることを特徴とし得る 。

この発明の別の態様は、医薬的に許容し得る賦形剤または担体と混合した形で治 療有効量のＢＭＰ−３蛋白質を含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、 硬骨および／または軟骨形成に使用され得、創傷治癒および組織修復にも使用さ れ得る。さらに、この発明の組成物は、他の治療上有用な成分、例えばＰＣＴ公 開ＷＯ３８１００２０５に開示されたＢＭＰ蛋白質ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２Ａお よびＢＭＰ−２Ｂを含み得る。他の治療上有用な成分には、成長因子、例えば表 皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＰＧＦ）および腫よう増殖因子（ ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）がある。それらの組成物はまた、例えば組成物を 支持し、硬骨および／または軟骨成長のための表面を提供する適当なマトリック スを含み得る。

これらの組成物は、幾つかの骨欠損および歯周病および様々なタイプの傷を処置 する方法において使用され得る。この発明によると、これらの方法は、上記の硬 骨および／または軟骨形成、創傷治癒または組織修復を必要とする叡者にこの発 明の新規ＢＭＰ−３蛋白質の有効量を投与することを必要とする。これらの方法 はまた、ＰＣＴ公開ＷＯ８８１０Ｏ２０５に開示された少なくとも１種の新規Ｂ ＭＰ蛋白質と組み合わせてこの発明のＢＭＰ−３蛋白質を投与することを必要と し得る。さらに、これらの方法はまた、他の成長因子と共にＢＭＰ−３を投与す ることを含み得る。

さらに、この発明の別の態様は、ＢＭＰ−３蛋白質の発現をコードするＤＮＡ配 列に関するものである。それらの配列は、第ｒＡおよびＩＢおよび■表に示され た５゛−３°方向でのヌクレオチド配列または厳密な条件下で第１ＡおよびＩＢ および■表のＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列を含み、軟骨 および／または硬骨形成誘導能力を有する蛋白質をコードする。それらの蛋白質 は、さらに後記ラット骨形成検定において軟骨および／または硬骨形成活性を示 す能力を特徴とすることが好ましい。好ましい具体例において、この発明の蛋白 質は、このラット骨形成検定において骨１グラム当たり、５μ９−１００μ９の 濃度で活性を示す。さらに好ましい具体例では、これらの蛋白質は、この検定に おいて骨１グラム当たり１μｇ−５０μ９の濃度で活性を示す。さらに特定すれ ば、これらの蛋白質は、ラット骨形成検定において蛋白質１μ９で少なくとも＋ ２の評価が得られることを特徴とし得る。最後に、第１ＡおよびＩＢおよび■表 の配列の対立遺伝子または他の変異型はまた、それらのヌクレオチド改編の結果 ペプチド配列が変化しようと否と、この発明に包含される。

さらに、この発明の別の態様は、発現制御配列と機能し得るように結合された上 記ＤＮＡ配列を含むベクターである。このベクターは、発現制御配列と機能し得 るように結合されたＢＭＰ−３蛋白質の発現をコードするＤＮＡ配列により形質 転換されたセルラインを適当な培養培地で培養し、そこからＢＭＰ−３蛋白質を 単離および精製する、この発明のＢＭＰ−３蛋白質の新規製造方法において使用 され得る。この主張された方法は、ポリペプチドの発現を目的とする宿主細胞と して幾つかの既知の原核生物および真核生物の両細胞を使用し得る。

後述の詳細な記載およびその好ましい実施態様を熟慮すれば、この発明の他の態 様および利点は明白である。

発明の詳細な記載 、この発明の精製ＢＭＰ−３蛋白質は、実質的に第■表で示されたヌクレオチド 番号３２１ないしヌクレオチド番号１７３６を含むＤＮＡ配列またはその一部分 により形質転換された宿主細胞を培養することにより生成され、培養培地から回 収される。回収されたＢＭＰ−３蛋白質は、第■表に示されたアミノ酸番号３７ ７ないしアミノ酸番号４７２と実質的に相同性の配列の９６アミノ酸配列を特徴 とする。さらにこれらの蛋白質は、後記ラット骨形成検定において軟骨および／ まｆコは硬骨形成活性を示す能力を特徴とし得る。好ましい実施態様で、それら はこのラット骨形成検定において骨１グラム当たり、５μ９−１００μ９の濃度 で活性を示す。さらに好ましい実施態様で、これらの蛋白質は、この検定におい て骨１グラム当たりｌμｇ−５０μ９の濃度で活性を示す。さらに特定すれば、 これらの蛋白質は、ラット骨形成検定において蛋白質ｌμ９で少なくとも＋２の 評価を得る能力を特徴とし得る。２量体および単量体の前駆体および成熟形態の 両方を含む多数の変異形態は、この発明のＢＭＰ−３科の蛋白質に包含される。

この明細書で規定するＢＭＰ−３蛋白質はまた、第１ＡおよびＩＢおよび■表の 配列と似ているが、天然になされて（例、ポリペプチドにおいてアミノ酸変化を 生じさせ得るヌクレオチド配列における対立遺伝子変異型）または故意に操作さ れて修飾が加えられた配列によりコードされる蛋白質を含む。例えば、合成ポリ ペプチドは、第１ＡおよびＩＢおよび■表のアミノ酸残基の連続配列を全体的ま たは部分的に複製し得る。これらの配列は、第１ＡおよびＩＢお上び■表のＢＭ Ｐ−３蛋白質と一次、二次または三次構造的および立体配座的特性を共存するこ とにより、それらと共通した生物学的特性を有し得る。すなわち、それらは、治 療プロセスにおいて天然ＢＭＰ−３ポリペプチドに代わる生物学的活性代用物と して使用され得る。

この明細書に記載されているＢＭＰ−３の配列の他の特異的な突然変異には、グ リコジル化部位の修飾が含まれる。グリコジル化が存在しないか、または部分的 にしか存在しないという状態は、第１ＡおよびＩＢおよび■表に示されたＢＭＰ −３の配列に存在するアスパラギン結合グリコジル化認識部位の一方または両方 におけるアミノ酸置換または欠失により生じる。アスパラギン結合グリコジル化 認識部位は、適当な細胞性グリコジル化酵素により特異的に認識されるトリペプ チド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニン またはアスパラギン−Ｘ−セリン（ただし、Ｘは普通任意のアミノ酸である）で ある。グリコジル化認識部位の第一または第三アミノ酸位置の一方または両方に おける様々なアミノ酸置換または欠失（および／または第三位におけるアミノ酸 欠失）の結果、修飾されたトリペプチド配列において非グリコジル化が生じる。

この発明はまた、他の蛋白質物質をコードするＤＮＡ配列の随伴がなく、ＢＭＰ −３蛋白質に関する発現をコードする新規ＤＮＡ配列を含む。これらのＤＮＡ配 列は、５’−３”方向で第１ＡおよびＩＢおよび■表に描かれた配列並びにスト リンジェントなハイブリダイゼーション条件［Ｔ、マニアチス等、「モレキュラ ー・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）」、コールド・スプリング ・ノ＼−バー・ラボラトリ−（１９８２）、３８７−３８９頁参照］下で第１Ａ およびＩＢおよび■表のＤＮＡ配列とノ＼イブリダイゼーションする配列を含み 、軟骨および／または硬骨形成活性を示す。上述のストリンジェントなハイブリ ダイゼーション条件の一例は、６５℃、４ＸＳＳＣでのハイブリダイゼーション 、次いで１時間６５℃、０゜ｌＸ５ＳＣ中での洗浄である。別法として、具体例 としての厳密なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド中、４ＸＳ Ｃ０１４２℃である。

同様に、第１ＡおよびＩＢおよび■表の配列によりコードされるＢＭＰ−３ポリ ペプチドをコードするが、遺伝子コードの同義性または対立遺伝子変異（アミノ 酸変化を生じる場合も生じない場合もあり得る種集団における天然塩基変化）に よりコドン配列が異なるＤＮＡ配列もまた、この明細書に記載されている新規成 長因子をコードする。点突然変異またはコードされるポリペプチドの活性、半減 期または生産性を高めるべく誘導された修飾（挿入、欠失および置換を含む）に より誘発される第１ＡおよびＩＢおよび■表のＤＮＡ配列の変形もまた、この発 明に包含される。

この発明の別の態様は、ＢＭＰ−３蛋白質の新規製造方法を提供する。この発明 の方法では、既知調節配列の制御下、この発明のＢＭＰ−３ポリペプチドの発現 をコードするＤＮＡ配列により形質転換された適当な細胞またはセルラインを培 養し、培養培地から蛋白質を回収および精製する。適当な細胞ま１こはセルライ ンは、は乳類細胞、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であり 得る。適当なは乳類宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニン グおよび生成物の製造および精製の方法は、当業界では公知である。例えば、ゲ シングおよびサムプルツク、「ネイチャー」、２９３：６２０−６２５（１９８ １）またはカウフマン等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、、５（７）：１７ ５０−１７５９（１９８５）またはノ１ウレイ等、アメリカ合衆国特許４４１９ ４４６参照。添付の実施例に記載されている別の適当なは乳類セルラインは、さ るＣ０９−１セルラインである。または乳類セルラインＣＶ−１も有用であり得 る。

また細菌細胞も適当な宿主であり得る。例えば、エンエリヒア・コリの様々な株 （例、ＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１）は、ノ（イオテクノロジー分野における宿主 細胞としてよく知られている。）くチルス・スブチリス（枯草菌）の様々な株、 シュードモナス、他のかん菌などもこの方法で使用され得る。

また、当業界の熟練者に知られている酵母細胞の多くの株は、この発明のポリペ プチドの発現を目的とする宿主細胞として利用可能であり得る。さらに、所望な らば、昆虫細胞はこの発明の方法における宿主細胞として利用され得る。例えば 、ミラー等、「ジェネティック、エンノニアリングＪ、８：２７７−２９８（プ レナム・プレス＋９８６）およびそこに引用されている参考文献参照。

この発明の別の態様は、これらの新規ＢＭＰ−３ポリペプチドの発現方法で使用 されるベクターを提供する。好ましくは、前記ベクターは、この発明の新規ＢＭ Ｐ−３因子をコードする完全な上記新規ＤＮＡ配列を含む。さらに、前記ベクタ ーはまた、ＢＭＰ−３蛋白質配列の発現を可能にする適当な発現制御配列を含む 。別法として、上述の修飾配列を組み入れたベクターはまた、この発明の実施態 様であり、ＢＭＰ−３蛋白質の製造に有用である。前記ベクターは、セルライン の形質転換方法で使用され得、選択された宿主細胞においてその複製および発現 を誘導し得るこの発明のＤＮＡ暗号化配列を機能し得るように随伴する選択され た調節配列を含み得る。

前記ベクターのための有用な調節配列は、当業界の熟練者に周知であり、選択さ れた宿主細胞に従い選択され得る。この選択は常用の手順によるものであり、こ の発明の一部を形成するものではない。

この発明のＢＭＰ−３蛋白質の製造において使用される前記ベクターにより形質 転換された宿主細胞およびその子孫はまた、この発明により提供される。さらに 、この発明の蛋白質は、他のｒＢＭＰＪ蛋白質、例えばＷｏ　８８１０　Ｏ２０ ５に開示された蛋白質と共に発現され得る。

この発明の蛋白質は、骨が通常形成されない環境において軟骨および／または硬 骨の成長を誘導することから、ひとおよび他の動物の骨折および軟骨欠損の治療 における適用性を有する。上述のＢＭＰ−３蛋白質を用いた製剤は、閉鎖および 複雑骨折の整復並びに人工関節の固定化改善において予防的用途を有し得る。こ の発明のＢＭＰ−３製剤はまた、オステオポローシスの処置に有用であり得る。

骨形成（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）剤により誘導される新たな骨形成は、先天的外 傷または腫よう切除による頭蓋および顔面欠損の修復を助け、また美容形成外科 において有用である。この発明のＢＭＰ−３蛋白質は、歯周病および他の歯修復 プロセスの処置において貴重であり得る。

上記薬剤は、骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、または骨形成細 胞の原種の分化を誘導する環境を提供し得る。多様な骨形成性軟骨誘導および硬 骨誘導因子が記載されている。それらの検討については、例えばヨーロッパ特許 出願１４８１５５および１６９０１６参照。

この発明の蛋白質はまた、ひとおよび他の動物の創傷治癒および組織修復におい て使用され得る。傷のタイプには火傷、切り傷および潰ようがあるが、これらに 限定されるわけではない。（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ３４１０１１０６参照）。

勿論、この発明の蛋白質は他の治療用途を有し得る。

、この発明のさらに別の態様は、骨折および軟骨および／または硬骨欠損に関連 した他の状態または歯周病を修復するための治療方法および組成物である。さら に、この発明は、創傷治癒および組織修復を目的とする治療方法および組成物を 含む。上記組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはマトリックスと混 合した形で治療有効量のＢＭＰ−３蛋白質を含む。ＢＭＰ−３蛋白質は、他の関 連蛋白質および成長因子と協調または恐らくは共同して作用し得ることが予想さ れる。この発明は、ＢＭＰ−３蛋白質を他の関連蛋白質または成長因子と組み合 わせて含む治療方法および組成物を包含する。従って、この発明の治療方法およ び組成物は、治療有効量のＢＭＰ−３蛋白質を、ＰＣＴ公開ＷＯｇ　８１００２ ０５に開示された他のｒＢＭＰＪ蛋白質の少なくとも１種の治療有効量と共に含 み得る。それらの組み合わせ剤は、ｒＢＭＰＪ蛋白質の別々の分子または異なる ｒＢＭＰｊ蛋白質部分から成るヘテロ分子を含み得る。例えば、この発明の方法 および組成物は、ＢＭＰ−３蛋白質および別の上記ｒＢＭＰＪ蛋白質を含むジス ルフィド結合２量体を含み得る。さらに、この発明のＢＭＰ−３蛋白質を、問題 の軟骨および／または硬骨欠損、傷または組織の処置に存益な他の薬剤と組み合 わせることができる。これらの薬剤には、様々な成長因子、例えば表皮成長因子 （ＥＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、腫よう増殖因子（Ｔ　Ｇ　Ｆ　 −αおよびＴＧＦ−β）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ’）および線維芽細 胞成長因子（ＦＧＦ）がある。ｐＨ１等張性、安定性などを充分考慮すると、そ れらの生理学的に許容し得る蛋白質組成物の製造および処方は当業界の専門技術 に含まれる。現在この発明の治療組成物はまた、ＢＭＰ蛋白質が種特異的でない ため、獣医学適用性についても貴重である。ひとに加えて特に家畜および純血馬 は、ＢＭＰ−３蛋白質による処置にとって望ましい患者である。

この治療方法は、インブラントまたは装置として局所的、全身的または局部的な 組成物投与を含む。勿論、投与時、この発明で使用される治療組成物は、発熱物 質不含有の生理学的に許容し得る形態を呈する。さらに、この組成物は、望まし くは硬骨、軟骨または組織損傷部位への送達を目的とする粘ちゅう性形態で封入 または注射され得る。局所投与は、創傷治癒および関連組織修復に好適であり得 る。好ましくは、硬骨および／または軟骨形成の場合、骨成長誘導因子組成物は 、硬骨および／または軟骨損傷部位へ骨誘導因子を送達し、発生する硬骨および ／または軟骨のための表面および支持構造を提供し得、最適に体内へ吸収され得 るマトリックスを含む。

それらのマトリックスは、現在地の移植医学適用に関して使用されている材料に より形成され得る。

マトリックス材料の選択は、例えば生物学的適合性、生物分解性、機械特性、美 容的外見および界面特性に基づく。ＢＭＰ−３組成物の特別な適用性により、適 当な処方が決定される。組成物に使用され得るマトリックスは、生物分解性で化 学的に定義されたもの、例えば硫酸カルシウム、燐酸三カルシウム、ヒドロキシ アパタイト、ポリ酪酸およびポリ無水物であり得る。他の可能な材料は、生物分 解性で生物学的に充分定義されたもの、例えば骨または皮膚コラーゲンである。

さらに別のマトリックスは、純粋蛋白質または細胞外マトリックス成分により構 成される。他の可能なマトリックスは、非生物分解性で化学的に定義されたもの 、例えば半融ヒドロキシアパタイト、生体ガラス、アルミン酸塩または他のセラ ミックである。

マトリックスは、上記タイプの材料のいずれかの組み合わせ、例えばポリ酪酸お よびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよび燐酸三カルシウムにより構成 され得る。また、生体セラミックは、組成物、例えばカルシウム−アルミネート −ホスフェート中で部分的に変えられ得、例えば孔サイズ、粒子サイズ、粒子形 状および生物分解性を変えるべく処理され得る。

投与方法は、ＢＭＰ−蛋白質の作用を修飾する様々な因子、例えば形成が望まれ る骨の重量、骨損傷部位、損傷を受けた骨の状態、傷の大きさ、損傷組織のタイ プ、患者の年令、性別および食餌療法、感染の激しさ、投与時間並びに他の臨床 的因子を考慮する担当医師により決定される。用量は、再構成で使用されるマト リックスのタイプおよび組成物中のＢＭＰ蛋白質のタイプにより変化し得る。ま た、最終組成物への他の既知晟長因子、例えばＩＧＦ−１（インシュリン様成長 因子■）の追加は、用量に影響を与え得る。

一般に、軟骨および／または硬骨形成を目的とする用量規制は、所望される骨重 量１グラム当たり、蛋白質的ＩＯ〜１０’ナノグラムの範囲とすべきである。例 えば、Ｘ線、組織形態計測学的測定法およびテトラサイクリン標識を用いて、骨 の成長および／または修復を定期的に評価することにより、経過をモニターする ことができる。

以下、実施例により、うしＢＭＰ−３蛋白質を回収および特性検定し、それを用 いて対応するひとＢＭＰ−３蛋白質を回収し、さらに遺伝子組換え技術によりＢ ＭＰ−３蛋白質を発現させる場合におけるこの発明の実践方法を説明する。

実施例１ うし骨誘導因子の単離 Ｍ、Ｒ，ウリスト等、「プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー」、７０：３５１１（ １９７３）の方法に従い、粉砕した牛骨粉（２０−１２０メツシユ、へりドレッ クス）を製造するが、ただし、下記に示すように幾つかの抽出段階は削除する。

粉砕した粉末１０ｋｇを、激しい攪はん下４８時間かけて４℃で０．６ＮのＭＣ Ｉを連続交換しながら脱塩する。生成した懸濁液を、１６時間４℃で５０リツト ルの２モルＣａＣ１ｔおよび１０ｍＭエチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）に より抽出し、次に５０リツトルの０．５モルＥＤＴＡ中で４時間抽出する。残留 物を蒸留水で３回洗浄した後、ｒｃｌｉｎ、　０ｒｔｈ。

ｐ、　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、Ｊ、１７１：２１３（１９８２）の記載に従い、２０ リツトルの４Ｍグアニジン塩酸塩［ＧｕＣＩ］、２０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４） 、１ミリモルＮ−エチルマレイミド、１ｍＭヨードアセトアミド、１ｍＭフェニ ルメチルスルホニルふっ素に再懸濁する。１６〜２０時間後、上清を除去し、別 の１０リツトルのＧｕＣ１緩衝液と交換する。

残留物をさらに２４時間抽出する。

粗ＧｕＣ１抽出物を合わせ、１００００分子量カットオフ膜を備えたペリコン装 置で約２０倍に濃縮し、次に５０ｍＭトリス、０．１モルＮａＣＬ　６モル尿素 （ｐＨ７、２）、第１カラムの出発緩衝液中で透析する。充分透析した後、蛋白 質を４リツトルＤＥＡＥセルロース・カラムに詰め、非結合フラクションを集め る。

非結合フラクションを濃縮し、６モル尿素中５０ミリモルＮ　ａＡ　ｃ。

５０ミリモルＮａＣ１（ｐＨ４、６）に対して透析する。非結合フラクションを カルボキシメチルセルロース・カラムに適用する。出発緩衝液で充分洗浄するこ とにより、カラムに結合しなかった蛋白質を除去し、ローゼジー修飾サンバスー レディ・ラット骨形成検定（下記実施例３に記載されている）により測定される 硬骨および／または軟骨形成活性を有する蛋白質を含む物質を、５０ミリモルＮ ａＡｃ、０゜２５ミリモルＮａＣ１，６モル尿素（ｐＨ４、６）によりカラムか ら脱着させる。この段階的溶離から得られた蛋白質を２０〜４０倍に濃縮し、次 いで８０ミリモルＫＰＯ，，６モル尿素（ｐＨ６，０）により５倍に希釈する。

溶液のｐＨを５００ミリモルに、ＨＰＯ，により６．０に調節する。８０ミリモ ルＫＰＯ４，６モル尿素（ｐＨ６、０）中で平衡状態にしたヒドロキシルアパタ イト・カラム（ＬＫＢ）に試料を適用し、同緩衝液でカラムを洗浄することによ り非結合蛋白質を全て除去する。ラット骨形成検定により測定される硬骨および ／または軟骨形成活性を有する蛋白質を、１００ミリモルＫＰＯ，（ｐＨ７，４ ）および６モル尿素により溶離する。

蛋白質を約１０倍濃縮し、固体ＮａＣｌを加えて０．１５モルの最終濃度にする 。この物質を、５０ミリモルＫＰＯ，，１５０ミリモルＮａＣＬ　６モル尿素（ ｐＨ７，４）中で平衡状態にしたヘパリン−セファロース・カラムに適用する。

出発緩衝液でカラムを充分に洗浄した後、硬骨および／または軟骨形成活性を有 する蛋白質を、５０ミリモルＫＰＯ，，７００ミリモルＮａＣｌ、６モル尿素（ ｐＨ７，４）により溶離する。このフラクションを最小体積に濃縮し、０．４ｍ ρアリコートを、４モルＧｕＣ１，２０ｍＭトリス（ｐＨ７、２）で平衡状態に した、スパローズ６およびスパローズ１２カラムを連結したものに適用し、カラ ムを０．２５ｘＱ１分の流速で展開する。硬骨および／または軟骨誘導活性を示 す蛋白質は、約２８０００〜３００００ダルトン蛋白質に対応する５ＤＳ−ＰＡ ＧＥでの相対移動性を有する。

、スパローズ・カラムから得られた上記フラクションを貯蔵し、５０ミリモルＮ ａＡｃ、６モル尿素（ｐＨ４、６）に対して透析し、ファーマシア・モノＳ　Ｈ Ｒカラムに適用する。このカラムを、１．０モルＮａＣＬ５０ミリモルＮａＡｃ 、６モル尿素（ｐＨ４，６）への勾配により展開する。活性フラクションを貯蔵 し、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によりｐ）１３　、０にする。この物質 を、０．１％ＴＦＡ中０゜４６Ｘ２５ｃｍバイダック０４カラムに適用し、カラ ムを９０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡへの勾配（１分出たり１ｘＱ、６０ 分で３１．５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ〜４９．５％アセトニトリル、 ０．１％ＴＩ”Ａ）により展開する。活性硬骨および／または軟骨形成物質を約 ４０−４４％アセトニトリルで溶離する。適当な活性フラクションのアリコート を、次の方法の一つによりヨウ素化する。

すなわち、Ｐ、Ｊ、マツコナヘイ等、「インターナショナル・アーカイブス・オ フ・アラ−ジー」、２９：１８５−１８９（１９６６）、Ａ２Ｂ、ポルトン等、 「バイオケミカル・ジャーナル」、１３３：５２９（１９７３）、およびり、Ｆ 、ボーウェンーポープ、「ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミストリー」 、２３７：５１６１（１９８２）。これらのフラクションに存在するヨウ素化蛋 白質を、ＳＤＳゲル電気泳動および尿素トリトンＸ１００等電点電気泳動により 分析する。

この段階で、骨誘導因子は、約１０−５０％純度であると評価される。

実施例２ Ａ０分子量 実施例１で得られた約２０μ９の蛋白質を凍結乾燥し、ｌＸ５ＤＳ試料緩衝液に 再溶解する。３７９Ｃで１５分加熱後、試料をＩ５％ＳＤＳポリアクリルアミド ゲルに適用し、次いで冷却しながら電気泳動させる。予め染色した分子量標準（ ベゼスダ・リサーチ・ラプス）に対応させて分子量を測定する。完了直後、硬骨 および／または軟骨形成物質を含むゲル・レーンを０　、３　ｃｙｎ片に切断す る。各月をマツシュし、１．４ｏ２の０．１％ＳＤＳを加える。試料を室温で一 夜穏やかに振り混ぜることにより、蛋白質を溶離する。各ゲル薄片を脱塩するこ とにより、生物学的検定における干渉を防ぐ。各試料から得られた上清を１０％ ＴＦＡによりｐＨ３、０に酸性化し、０゜４５ミクロンの膜によりろ過し、０． ４６ｆＪＸ　５ｃｊｌＣ４バイダツク・カラムに仕込み、ｏ、ｉ％ＴＦＡ〜０１ ％ＴＦＡ、９０％ＣＨ３ＣＮの勾配で展開する。適当な硬骨および／または軟骨 誘導蛋白質含有フラクションをプールし、２０Ｍ９のラット・マトリックスによ り再構成し、検定する。このゲル・システムでは、硬骨および／または軟骨形成 フラクションの大多数は、約２８０００−３００００ダルトンの分子量を有する 蛋白質の運動性を有する。

Ｂ１等電点電気泳動 硬骨および／または軟骨形成活性を有する蛋白質の等電点を、変性等電点電気泳 動システムにおいて測定する。トリトンＸ１００尿素ゲル・システム（ホーファ ー・サイエンティフィック）を次の要領で修飾する。１）使用される両性電解質 の４０％はサーバライト３／１０であり、６０％はサーバライト７−９である。

モして２）使用されるカッライト（ｃａｔｈｏｌｙｔｅ）は４０ミリモルＮａＯ Ｈである。実施例１から得られた蛋白質的２０μ９を凍結乾燥し、試料緩衝液に 溶かし、等電点電気泳動ゲルに適用する。ゲルを、２０ワツト、１０℃で約３時 間移動させる。完了時、硬骨および／または軟骨誘導因子を含むレーンを０５ｃ ｍ片に切断する。各月を１．０１１２６Ｍ尿素、５ｍＭ）リス（ｐＨ７、８）中 でマツシュし、試料を室温で攪はんする。

上記と同様に、試料を酸性化し、ろ過し、脱塩し、検定する。ローゼン修飾サン バスーレディ検定により測定したところ、活性の大部分は、約８．１１ｋｇ、２ のｌ）Ｉと一致する形で移動する。

Ｃサブユニット特性検定 また、単離された牛骨蛋白質のサブユニット組成を測定する。純粋な骨誘導因子 を、上記と同様にプレバラティブ１５％ＳＤＳゲルから単離する。次いで、試料 の一部分を、試料緩衝液中５ミリモルＤＴＴにより還元し、１５％ＳＤＳゲルに おいて再電気泳動させる。

約２８−３０ｋｄ蛋白質は、約１８−２０ｋｄおよび約１６−１８ｋｄにおける ２つの大きな帯並びに約２８−３０ｋｄにおける小さな帯を生じる。２つの帯の 幅は、恐らくグリコジル化、他の翻訳後修飾、蛋白質加水分解的減成またはカル バミル化が原因と思われる不均一性を示す。

実施例３ ０−ゼン修飾サンバス−レディ検定 サンパスおよびレディ、「ブロシーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデ ミ−・オフ・サイエンシーズ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー」、８０：６５９１ −６５９５（１９８３）に記載されたラット骨形成検定の修飾バージョンを用い て、実施例１で得られた牛蛋白質およびこの発明のＢＭＰ−１蛋白質の硬骨およ び／または軟骨活性を評価する。この明細書では、この修飾検定をローゼン修飾 サンバスーレディ検定と呼ぶ。サンパス−レディ方法のエタノール沈澱段階を、 水に対して検定されるフラクションの透析（組成物が溶液である場合）またはジ アフィルトレーンヨン（組成物が懸濁液である場合）と置き換える。次に、溶液 または懸濁液を０．１％ＴＦＡに再溶解し、生成した溶液を２０１９のラット・ マトリックスに加える。蛋白質で処理しなかった模擬ラット・マトリックス試料 を対照として用いる。この物質を冷凍し、凍結乾燥し、生成した粉末を＃５ゼラ チン・カプセルに封入する。カプセルを、２＋−４９日令雄ロング・エバンス・ ラットの腹部胸部領域に皮下内植する。７−１４日後インブラントを除去する。

各インブラントの半分をアルカリ性ホスファターゼ分析に使用する［Ａ、Ｈ，レ ディ等、「ブロン−ディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ イエンシーズ」、６９：１６０１（１９７２）参照コ。

各インブラントの残り半分を固定し、組織分析に使用する。１μＩのグリコメタ クリレート部分をボン・コッサおよび酸性ツクシンで染色することにより、各イ ンブラントに存在する誘導された硬骨および軟骨形成の量を評点する。＋１ない し＋５という語は、新しい硬骨および／または軟骨細胞およびマトリックスによ り占められるインブラントの各組織部分の領域を表す。＋５の点数は、インブラ ントの５０％を越える部分が、インブラントにおいて蛋白質の直接的結果として 生成された新しい硬骨および／または軟骨であることを示す。＋４、＋３、＋２ および＋１の点数は、インブラントの各々４０％、３０％、２０％および１０％ を越える部分が新しい軟骨および／または硬骨を含むことを示す。

実施例１で得られた２００ｎｇの蛋白質を含むラット・マトリックス試料は、組 織研究用に切断したインブラント領域の２０％を越える部分を占める硬骨および ／または軟骨形成を誘導する。従って、この蛋白質は、ローイン修飾サンパスー レディ検定において少なくとも＋２を記録する。マトリックス試料の用量応答は 、形成された硬骨および／または軟骨の量が試料中の蛋白質の量に従い増加する ことを示す。対照試料は、硬骨および／または軟骨形成を全く誘導しなかった。

検定された蛋白質の純度は約１０−１５％の純度である。

形成された硬骨および／または軟骨は、マトリックスが占める空間へ物理的に閉 じ込められる。また、上記と同様、５ＤＳ−ゲル電気泳動および等電点電気泳動 、次いでオートラジオグラフィーにより試料を分析する。分析の結果、２８−３ ０ｋｄにおける蛋白質帯による活性および約８．８−９．２のｐｌの相関関係が 示される。特定フラクションにおける蛋白質の純度を評価するため、ＩＯＤ／１ １ｇ−ｃｘの消衰係数を蛋白質に関する評価として使用し、蛋白質を５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにおいて移動させ、次いで銀染色または放射性ヨウ素化およびオートラジ オグラフィーを行う。

実施例４ うしＢＭＰ−３ 分子量２８−３０ｋｄの実施例２Ａの蛋白質組成物をその場で還元し、トリプシ ンで消化する。下記アミノ酸配列を有する８つのトリプシン消化フラグメントが 標準的方法により単離される。

フラグメント１：　　ＡＡＦＬＧＤＩＡＬＤＥＥＤＬＧフラグメント２：　　Ａ ＦＱＶＱＱＡＡＤＬフラグメント３：　　ＮＹＱＤＭＶＶＥＧ−ｙ−ｙブラント ４：　　５ＴＰＡＱＤＶＳＲフラグメント５：　　ＮＱＥＡＬＲ フラグメント６：　　ＬＳＥＰＤＰＳＨＴＬＥＥフラグメント７：　　ＦＤＡＹ Ｙ フラグメント８：　　ＬＫＰＳＮ？ＡＴＩＱＳＩＶＥ実施例Ｉの記載と似た精製 計画に従い、うじの骨から得られた蛋白質の純度があまり高くない調製物を製造 する。この精製は、基本的にはＤＥ−５２カラム、０Ｍセルロース・カラムおよ びモノＳカラムの省略並びにヒドロキシルアパタイトおよびヘパリン・セファロ ース・カラムの順序の逆転という点で前述の方法とは異なる。簡単に述べると、 濃縮した粗４Ｍ抽出物を、４度エタノールリ８５％最終濃度にする。次いで、混 合物を遠心分離し、沈澱物を５０ｍＭトリス、０．１５モルＮａＣ１，６，０モ ル尿素に再溶解する。次いで、この物質を上記ヘパリン・セファロースにより分 画する。ヘパリン結合物質を上記ヒドロキシアパタイトにより分画する。活性フ ラクションをプールし、濃縮し、高度分離ゲルろ過（６Ｍグアニジニウムクロリ ド、５０ｍＭ）リス、ｐＨ７、２中ＴＳＫ３００００）により分画する。活性フ ラクションをプールし、０．１％ＴＦＡに対して透析し、次いで上記Ｃ４バイダ ック逆相カラムにより分画する。少量のＩｔＪ標識対照物をこの段階で試料と混 合し、調製物全体を還元し、Ｓ　Ｄ　Ｓ　（＋）ｌｏｙａｃｒｙｌａｎｉｄｅ） ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動させる［レムリ、Ｕ、に、、「ネイチ ャー」、影７７：６８０−６８５（１９７０）］。湿式ゲル・オートラジオグラ フィーを用いて１６−１８ｋｄ帯に対応する蛋白質を局在させ、標準的方法を用 いてメタノール−酢酸−水により固定化し、水で簡単に洗浄し、次いで０゜１モ ル重炭酸アンモニウムにより中和する。剃刀の刃でゲル薄片をさいの目切りにし た後、０．２μ９のＴＰＣＫ処理トリプシン（ワ−ンントン）を加え、ゲルを３ ７℃で１６時間インキユベーンヨンすることにより、蛋白質をゲル・マトリック スから消化する。次いで、生成した消化物を、Ｃ４バイダツクＲＰＨＰＬＣカラ ムおよびＯ１１％ＴＦＡ−水０．１％ＴＦＡ水−アセトニトリル勾配を用いたＲ ＰＨＰＬＣにかける。生じたペプチド・ピークを２１４および２８０ｎｍでのＵ Ｖ吸光度によりモニターし、アプライド・バイオシステムズ・ガス・フェーズ・ シーケネーター（モデル４７０Ａ）を用いた直接アミノ末端アミノ酸配列分析に かけた。下記アミノ酸配列を有するトリプシン消化フラグメントが単離される。

フラグメント　９：　　５ＬＫＰＳＮＨＡＴＩＱＳ？Ｖフラグメント１０：　　 ５ＦＤＡＹＹＣ６？Ａフラグメント１１：　　ＶＹＰＮＭＴＶＥＳＣＡフラグメ ント１２：　　ＶＤＦＡＤＩ’：’Ｗトリプシン消化フラグメント７および８は 、各々実質的にフラグメント１０および９と同じであることが示されている。

Ｒ，シーズ、「ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー」、ｌ８３（＋ ）：１−１２（１９８５）の方法に従い、トリプシン消化フラグメント９（プロ ーブ＃３）、１０（プローブ＃２）および１１（ブロー−７’＃ｉ）のアミノ酸 配列に基づいて、オリゴヌクレオチド（または特有のオリゴヌクレオチド）のプ ールにより構成されるプローブを設計し、自動式ＤＮＡシンセサイザーにおいて 合成し、次いでプローブをポリヌクレオチド・キナーゼおよび”Ｐ−ＡＴＰによ り放射性標識する。

プローブ＃　１　：　ＡＣＮＧＴＣＡＴ［Ａ／Ｇ］ＴＴＮＧＧ［Ａ／Ｇ］ＴＡプ ローブ＃　２　：　ＣＡ［Ａ／Ｇ］ＴＡ［Ａ／Ｇ］ＴＡＮＧＣ［Ａ／Ｇ］ＴＣ［ Ａ／Ｇ］ＡＡプローブ＃　３　：　ＴＧ［Ａ／Ｇ／Ｔ］ＡＴＮＧＴＮＧＣ［Ａ／ Ｇ］ＴＧ［Ａ／Ｇ］ＴＴ上記プローブにおける標準ヌクレオチド記号は次の通り である。

Ａ１アデノシン；Ｃ１シトシン：Ｇ１グアニン；Ｔ１チミン；Ｎ１アデノシンま たはシトシンまたはグアニンまたはチミン。

遺伝子コードは同義性であるため（複数のコドンが同じアミノ酸をコードし得る ）、プローブ・プールにおけるオリゴヌクレオチドの数は、真核生物におけるコ ドン使用の頻度、ＧＥＴ：塩基対の相対的安定性および真核生物暗号化配列にお けるジヌクレオチドＣｐＧの相対的希少性に基づいて減らされる［ツール等、「 ネイチャー」、３１２：３４２−３４７（１９８４）参照］。

組換えうしゲノム・ライブラリーは次の要領で構築される。うし肝臓ＤＮＡを制 限エンドヌクレアーゼ酵素５ａｕ３Ａにより部分的に消化し、しよ糖勾配により 沈澱させる。次いで、１５−３０ｋｂの範囲でサイズ分画されたＤＮＡを、バク テリオファージＢａｍＨＩベクターＥＭＢＬ３にライゲーションする［フリンヤ ウフ等、「ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー」、１７０：８２７ −８４２（１９８３）］。■プレート当たり組換え体８０００の割合でライブラ リーを培養する。プラークのデュプリケイトのニトロセルロース複製を作成し、 ウー等、「プロシーデインダス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サ イエンシーズ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー」、７５・３６８８−９１（１９７ ８）の方法の修正法に従い増幅する。３２ｐで標識したプローブ＃ｌによるデュ プリケイトにおいて４０００００の組換え体をスクリーニングする。これらのプ ローブを、４８℃で３Ｍテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、０． １モル燐酸ナトリウムｐＨ６、５，１ミリモルＥＤＴＡ、５Ｘデンハーツ、０． ６％ＳＤＳ、１００μ９／ｌ（ｌさけ精液ＤＮＡ中でハイブリダイゼーションし 、５０℃で３モルＴＭＡＣ，５０ｍＭトリスｐＨ８，０中で洗浄する。これらの 条件は、１７量体プローブ、プールに対する誤対合の検出を最少限にする［ウッ ド等、［プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイ エンシーズ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー］、８２：１５８５−１５８８（１９ ８５）参照］。このプローブにハイブリダイゼーションした組換え体を全て２次 培養用に再培養する。トリプリケイトのニトロセルロース複製を２次培養から作 成し、上記と同様に増幅する。３セツトのフィルターを再びＴＭＡＣ条件下でプ ローブ＃１、＃２および＃３にハイブリダイゼーションさせる。！クローン、ラ ムダｂＰ−８１９は、３プローブ全てにハイブリダイゼーションする。これをプ ラーク精製し、培養リゼイトからＤＮＡを単離する。バクテリオファージ・ラム ダｂＰ−８１９は、１９８７年６４１６日、アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（１２３０１パークローン・ドライブ、ロックランド、メリーラン ド、アメリカ合衆国）（以後、ＡＴＣＣ）に受入番号４０３４４で寄託された。

この寄託は、特許手続きを目的とする微生物寄託の国際的承認に基づくブダペス ト条約およびその下の規則の必要条件を満たす。このｂＰ−８１９クローンは、 我々がＢＭＰ−３またはｂＢＭＰ−３と命名したうし蛋白質の少なくとも一部を コードする。

プローブ＃２にハイブリダイゼーションするｂＰ−８１９の領域を局在させ、配 列決定する。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を第ｎＡ表 に示す。トリプシン消化フラグメントｌＯおよび１２に対応するアミノ酸配列は 下線部である。１番目の下線を引いた配列はフラグメント１２に対応し、２番目 の配列はフラグメント１０に対応する。従って、プローブ＃２にハイブリダイゼ ーションするｂＰ−８１９のこの領域は、少なくとも１１１アミノ酸をコードす る。このアミノ酸配列は、ヌクレオチド＃４４１４から＃７４６のＤＮＡ配列に よりコードされる。

第１Ａ表 プローブ＃ｌにハイブリダイゼーションするｂＰ−８１９のこの領域を局在させ 、配列決定する。この領域の部分的ＤＮＡおよび誘導されたアミノ酸配列を第１ ＩＢ表に示す。トリプシン消化フラグメント９および１１に対応するアミノ酸配 列は下線部である。１番目の下線部配列はフラグメントリに対応し、２番目の下 線部配列はフラグメント１１に対応する。プローブ＃ｌおよび＃３に／’％イブ リダイゼーションするｂＰ−８１９のこの領域のペプチド配列は、第ｎＢ表のヌ クレオチド＃３０５から＃４９３によりコードされる６４アミノ酸長である。Ａ ＧＡ３文字コドンによりコードされるアルギニン残基は、それに隣接する停止コ ドン（ＴＡＡ）の存在に基づき蛋白質のカルボキシ末端であると予測される。２ 文字コドンＴＣ（３０５−３０６位）に先行する核酸配列は、共通受容配列の存 在（すなわち、ピリミジンに富む伸長範囲、ＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣ ＣＴ、次いでＡＧ）および誘導されたアミノ酸配列の適当な位置における塩基性 残基以外の停止コドンの存在に基づきイントロン（非暗号化配列）であると考え られる。

従って、ｂＢＭＰ−３は、第１Ａ表および第１Ｂ表のＤＮＡおよびアミノ酸配列 を特徴とする。このクローンのペプチド配列は、１７５アミノ酸長であり、第１ Ａ表のヌクレオチド＃４Ｉ４からヌクレオチド＃７４６および第１Ｂ表のヌクレ オチド＃３０５からヌクレオチド＃４９３までのＤＮＡ配列によりコードされる 。

第７Ｂ表 ｍｗコｒα℃Ｑｕウコ？！ 実施例５ ひとＢＭＰ　−３ うしおよびひとＢＭＰ−３遺伝子は、顕著に相同性であると考えられるため、上 記うしＢＭＰ−３配列により合成された２つのオリゴヌクレオチド・プローブに より、ひとゲノム・ライブラリーをスクリーニングする。オリゴヌクレオチドは 次の通りである。

１１：　　　ａｃ入入ＴＴＣＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴ ｒＣＴｒＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＴ）＃２＋　　ｄ（ＴＴＣＧ Ｃ’！’ＣＣＡＧＣＣＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＴＭＧＧＴＡ ＣＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣ）自動式シンセサイザーにおいてオリゴヌクレオチドを 合成し、ポリヌクレオチド・キナーゼおよび３！ｐ−Ａ　Ｔ　Ｐにより放射能標 識する。

ひとゲノム・ライブラリー（ツール等、前出）をプレート培養する。

１００００００組換え体に対応するライブラリーのデュブリケイトのニトロセル ロース・フィルター複製を作成し、５ＸＳＳＣ，５ｘデンハーツ、１００μ９／ πＱの変性さけ精液ＤＮＡ、０．１％５ＤＳ（標準ハイブリダイゼーション溶液 ）中摂氏５０度で約１４時間ニック翻訳プローブにハイブリダイゼーションする 。次いで、フィルターを１ｘＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中５０℃中性０し、オート ラジオグラフィーに付す。１０のデュプリケイト陽性を単離し、プラーク精製す る。配列分析は、これらの陽性がひとＢＭＰ−３遺伝子を含むことを示す。

第１Ａ表におけるうしＤＮＡ配列残基４０８−７２７から成る領域をプラスミド ｐｓｐｓｓにサブクローニングし［Ｄ、Ａ、メルトン等、「ヌクレイツク・アシ ッズ・リサーチ」、１２ニア０３５−７０５６（１９８４）参照］、標準技術に より増幅する。次に、このプラスミドの挿入領域を取り出し、ニック翻訳により ３２ｐで標識する。

ブライマーとして配列ｄ（ＡＡＴＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＡＧＣＡＡＴＴＣのオリ ゴヌクレオチドを用いることにより、ひと原生細胞癌セルライン８１２８（ＡＴ ＣＣ＃ＨＴＢ　ｌ　２０）から、プライマー伸長ｃＤＮＡライブラリーを作成す る。このオリゴヌクレオチドは、ひとＢＭＰ−３遺伝子の３′非翻訳領域のＤＮ Ａ配列に基づいて合成された。このライブラリーからの３７５０００の組換え体 を、標準方法によリュック翻訳プローブでスクリーニングする。ライブラリーか らの組換え体を、６５℃で標準ハイブリダイゼーション溶液中においてプローブ とハイブリダイゼーションし、０．２ＸＳＳｃ、０゜１％ＳＤＳ中６５℃中性５ する。１７の陽性が得られる。これらのうちの１つ、λＨ１２８−４は、１９８ ８年３月３１日に受入番号４０４３７としてＡＴＣＣへ寄託された。この寄託は 、特許手続きを目的とする微生物客死の国際的承認に基づくブダペスト条約およ びその下の規則の必要条件を満たす。Ｈ１２８−４の挿入体の全ヌクレオチド配 列および誘導されたアミノ酸配列を第■表に示す。このクローンは、全ＢＭＰ− ３蛋白質をコードするのに必要なヌクレオチド配列の全てを含むと予想される。

第■表のアミノ酸配列は、開裂することにより成熟蛋白質（複数も可）を生成し 得る１次翻訳産物を表すと考えられる。ヌクレオチド＃ｌ〜＃３２０は、５°非 翻訳領域を表し、ヌクレオチド＃］７３６〜＃ｌ７９４は３°非翻訳領域を表す 。前駆体蛋白質は、アミノ酸＃３６０および４３６１間の蛋白質分解的プロセシ ング部位で開裂され得る。第■表によりコードされるＢＭＰ−３蛋白質は、アミ ノ酸＃３７７からアミノ酸＃４７２までの９６アミノ酸配列またはそれと実質的 に相同性である配列を含むものと考えられる。トリプシン消化フラグメント９− １２に対応する配列は第■表の下線部である。このＤＮＡ配列は、ひとＢＭＰ− ３前駆体蛋白質が、実施例２ｃの約１６〜＋８ｋｄサブユニツトに対応すること を示す。

第１ＡおよびＩＢおよびＨ表に示されたＢＭＰ−３の配列は、インヒビンのベー タ（Ｂ）およびベータ（Ａ）サブユニットと顕著な相同性を有する。インヒビン は、現在避妊用として研究されているホルモンの１種である。ＡＪ、メゾン等、 「ネイチャー」、３１８：６５９−６６３（１９８５）参照。程度は劣るが、そ れらはまた、雄胎児の発生初期中にミューラー管を退化させる精巣糖蛋白質のミ ューラー管抑制物質（ＭＩＳ）および細胞の生長を阻害または刺激またはそれら の分化を誘発し得るベータ腫よう増殖因子（Ｔ　Ｇ　Ｆ　−ｂ）とも相同性を示 す。ＢＭＰ−３はまた、Ｖｇｌとの配列類似性を示す。ＶｇｌｍＲＮＡは、ツメ ガエル卵母細胞の植物性半球に局在していたものである。発生初期の間それは内 胚葉全体に分布しているが、胞胚形成が行なわれた後、ｍＲＮＡは検出され得な い。Ｖｇｌ蛋白質は、外胚葉細胞が初期中胚葉となる過程に関与するうえで内胚 葉細胞により使用されるシグナルであり得る。ＢＭＰ−３はまた、ＰＣＴ公開Ｗ Ｏ３８１００２０５に開示された骨誘導蛋白質ＢＭＰ−２Ａとの幾つかの配列類 似性を共有する。

実〜ＵΣ土工 肩−に１ａロＣＴαズαスπＥ　ＡＣＣＣＴＣ島π℃χ℃λマ、ＡＡＣａ込Ｎπ 鍬０℃工ｌｅ　Ｇｌｎ工１ａ　Ａｓｐ　Ｘｅｘ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　’Ｉ ｈｒ　Ｌｘ；ｒｕ　’Ｄｙｓ　Ｉ’ｈａ　Ｓａｒ　ｋ７）ｓｎ　Ｇ撃氏@Ｓａｒ 　Ｇｉｎシ犯 ９８０　　　　　　　　　　　　　９９５　　　　　　　　　　　　１０１０　 　　　　　　　　　　　　：ＬＯ２５α込ＴＩＴ　ＭＣＡＴＴ　ＡＣＧ　’Ｊｍ 　ＭＧ　ＧＧＡ　ＣＧＣＣＡＧ　Ｃ１℃α：ＡＭＧ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　’ｆｆｉ 　ＣＣＴ　’ｆｆ堰@αｎ ２０　Ｇｌｙ　Ｔｈｅ　Ａｓｎ　ｎａ　’ｎｗ　Ｓｅｒ　聯Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇ ｌｎ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　’Ｄｐ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　シ蕩Ｐｒ潤@Ｐｈａ　Ｐｒ。

１１ｏＯｕ１５　　　　　　　　　　　　ｕ３０３５　ＴＴＧ　ｃｒＧαＩＴ　 ＣＴＧ　Ｑ’ｉＧＭＣＡＡＣＧＡＧ　ＣＩＴ　ＣＣＩ’　ＧＧＧα：Ａ　ＧＡＡ 　πＣ（％　’ｗＭＡＡＡＧ@ｃｕ ＬＡＩＬａｕ　Ｐｒｏ　Ｌｉ；ｍ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｉｇｕ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ@Ｄｙ、　Ｄｙ、　 Ａｓｐ １２６５　　　　　　　　　　　ル８ｏ　　　　　　　　　　　　１２９５　　 　　　　　　　　　１３１０実施例６ ＢＭＰ−３の発現 うし、ひとまたは他のは乳類前誘導因子を製造するためには、慣用的遺伝子工学 技術により、それをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに移し、は乳類細胞 または他の好ましい真核生物もしくは原核生物宿主へ導入する。しかしながら、 現在生物学的活性組換えひと骨誘導因子に関して好ましい発現系は、安定した形 で形質転換されたは乳類細胞である。

当業界の熟練者であれば、第１ＡおよびＩＢおよび■表の配列または他の修飾さ れた配列および既知ベクター、例えばｐＣＤ［岡山等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ、、２：］］６ｌ−１７０＋９８２）コおよびｐ、ＪＬ３、ｐＪ　ｔ、　 ４　［ガフ等、ＥＭＢＯジャーナル、４゜６４５−６５３（＋　９８５）］を用 いることにより、は乳類発現ベクターを構築することができる。これらのベクタ ーを適当な宿主細胞へ形質転換することにより、ＢＭＰ−３蛋白質を発現させる ことができる。当業界の熟練者であれば、暗号化配列に近接するは乳類調節配列 を排除または細菌配列と置換することにより第１ＡおよびＩＢおよび■表の配列 を操作して、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌性ベクターを作成 することができる。例えば、これらの暗号化配列はさらに操作され得る（例えば 、他の既知技術により、他の既知リンカ−へライゲーションまたはそこから非暗 号化配列を削除もしくはそこに存在するヌクレオチドを改編することにより修飾 され得る）。次いで、修飾されたＢＭＰ−３暗号化配列は、例えば呑口等、［プ ロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンシーズ ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー」、７７：５２３０−５２３３（１９８０）に記 載された方法を用いて既知細菌ベクターへ挿入され得る。次に、この具体例とし ての細菌性ベクターは、細菌宿主細胞へ形質転換されることにより、ＢＭＰ−３ を発現させ得る。細菌細胞におけるＢＭＰ−３の細胞外発現を生じさせる戦略に ついては、例えばヨーロッパ特許出願ＥＰＡＩ７７３４３参照。

昆虫細胞での発現を目的とする昆虫ベクターの構築についても似た操作が行なわ れ得る［例、公開されたヨーロッパ特許出願＋５５４７６に記載され１こ方法を 参照］。また、酵母調節配列を用いることにより、酵母細胞によるこの発明の因 子の細胞内または細胞外発現を目的とする酵母ベクターも構築され得る［例えば 、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６１００６３９およびヨーロッパ特許出願ＥＰＡ １２３２８９参照］。

は乳類細胞から高レベルのこの発明のＢＭＰ−３蛋白質因子を製造する方法は、 異種ＢＭＰ−３遺伝子の多数のコピーを含む細胞の構築を必要とする。異種遺伝 子は、増幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）遺伝子に ライゲーションされ得、カウフマンおよびシャープ、「ジャーナル・オフ・モレ キュラー・バイオロジー」、１５９：６０１−６２９（１９８２）の方法に従っ て、大量の遺伝子コピーを含む細胞が、増大濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ） 中での伸長について選択され得る。この方法は、若干の異なる細胞タイプにより 使用され得る。例えば、発現を可能にする他のプラスミド配列を機能し得るよう に随伴したこの発明のＢＭＰ−３蛋白質に関するＤＮＡ配列を含むプラスミドお よびＤＨＰＲ発現プラスミドｐＡｄＡ　２６　Ｓ　Ｖ（Ａ）３　［カウフマンお よびシャープ、Ｍｏｌ　。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、２：１３０４（１９８２）コは、燐酸カルシウム共沈澱 およびトランスフェクション、電気操作またはプロトプラスト融合により、ＤＨ ＰＲ欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−１３１Ｉへ共に導入され得る。ＤＨＰＲ発現形 質転換体を、透析した牛胎児血清を含むアルファ培地での生長について選択し、 続いてカウフマン等、Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、５：１７５０（１９８３）の記載に従い増大濃度のＭＴ Ｘ（０，０２，０２，１，０および５マイクロモルＭＴＸでの連続段階）での生 長による増幅について選択する。形質転換体をクローニングし、実施例３記載の ラット骨形成検定法により、生物学的活性ＢＭＰ−３発現をモニターする。ＢＭ Ｐ−３発現は、ＭＴＸ耐性レベルの増加に従い増加すべきである。他のＢＭＰ− ３科の蛋白質の製造についても、似た方法が使用され得る。

Ａ、ＣＯＳ細胞発現 実施例５のＢＭＰ−３蛋白質製造の一具体例として、Ｋｐｎｌで消化し、Ｔ４ポ リメラーゼでプラント化し、ＥｃｏＲＩアダプター上でライゲージタンし、次い で５ａＩＩで消化することにより、Ｈ１２８−４の挿入部分をベクター・アーム から放出させる。この挿入部分を、は乳類発現ベクター、ｐＭＴ２ＣＸＭのＥｃ ｏＲＩおよびＸｈｏＩクローニング部位へサブクローニングする。ＤＥＡＥ−デ キストラン方法により［ソンパイラックおよびダナ、ＰＮＡＳ、７Ｂニア５７５ −７５７８（１，９８１）、ルスマンおよびマグヌッソン、「ヌクレイツク・ア ンッズ・リサーチ」、Ｉ　１：１２９５−１３０８（１９８３）コ、このサブク ローンからのプラスミドＤＮＡをＣｏｓ細胞へトランスフェクションし、細胞を 培養する。トランスフェクションの４０−７０時間後に開始して細胞から血清不 含有２４時間条件培地を集める。

は乳類発現ベクターｐＭＴ２　ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂＸウォング等、「サ イエンス」、２２８：８１０−８１５．１９８５）の誘導体であり、前者はテト ラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、さらにｃＤ ＮＡクローンを挿入するためのｘｈｏ１部位を含む点が後者とは異なる。りＭＴ ２　　ＣＸＭの機能的成分は既に記載されており（カウフマン、Ｒ，Ｊ、、１９ ８５．プロシーディンゲス・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ ンシーズ・オフ・ザ・ニー・ニス・ニー、８２：６８９−６９３）、アデノウィ ルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐエンハンサ−を含むＳＶ４０複製開始点、５゛スプラ イス位を含むアデノウィルス主後期プロモーターおよびアデノウィルス後期ｍＲ ＮＡ上に存在するアデノウィルス・トリパータイト（ｔｒｉｐａｒｔｆｔｅ）・ リーダー配列の大部分、３゛スプライス受容位、ＤＨＰＲ挿入体、ＳＶ４０初期 ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）並びにエシェリヒア・コリにおける伸長に必要 とされるｐＢＲ３２２配列を含む。

プラスミドｐＭＴ２　　ＣＸＭは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（ロックビル、メリーランド、アメリカ合衆国）（ＡＴＣＣ）に受入番号６ ７１２２として寄託された、ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化により得られる 。ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ２−ｖＷＦに存在するｃＤＮＡ挿入部分を取り出 すと、Ｉ）ＭＴ２が線形で得られ、これをライゲーションして用いることにより 、エシェリヒア・コリＨＢ　Ｉ　０１またはＤＨ−５がアンピシリン耐性に形質 転換され得る。プラスミドｐＭＴ２　　ＤＮＡは慣用的方法により製造され得る 。次に、ループアウト／イン突然変異を用いて、ｐＭＴ２ＣＸＭを構築する（森 永等、「バイオテクノロジー」、８４：６３６（１９８４））。これは、ＳＶ４ ０複製開始点付近のＨｉｎｄｌ１１部位からの出発に対して塩基１０７５〜１１ ４５およびｐＭＴ２のエンハンサ−配列を除去する。さらに、それはヌクレオチ ド１１４５に次の配列＝５”ＰＯ−ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧ−３′を挿 入する。この配列は、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を含み、ＢＭ Ｐ−３挿入部分における５ａＩＩ部位と適合し得る。

プラスミドｌ）ＭＴ２　　ＣＸＭ　ＤＮＡは、常法により製造され得る。

Ｂ、ＣＨＯ細胞発現 実施例５のＢＭＰ−３蛋白質は、Ｋｐｎｒで消化し、Ｔ４ポリメラーゼでプラン ト化し、ＥｃｏＲＩアダプター上でライゲーションし、次いで５ａｌｌでｉｎ化 することによりＨ１２８−４の挿入部分をベクター・アームから放出させること により、ＣＨＯ細胞において発現され得る。この挿入部分を、は乳類発現ベクタ ー、Ｉ）ＭＴ２ＣＸＭのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩクローニング部位へサブクロ ーニングする。

このサブクローンからのプラスミドＤＮＡを、エレクトロポレーションによりＣ ＨＯ細胞へトランスフェクションする［ノイマン等、ＥＭＢＯジャーナル、１： ８４１−８４５（１９１１１２）コ。２日後、ｌＯ％透析牛脂児血清を含み、ヌ クレオシドを欠く選択培地に細胞をスイッチする。１０−１４日後ＤＨＰＲを発 現するコロニーを計数する。個々のコロニーまたはコロニーのプールを伸張し、 標準的方法を用いてＢＭＰ−３ＲＮＡおよび蛋白質の発現について分析し、続い て増大する濃度のＭＴＸでの生長による増幅について選択する。

ＥｃｏＲＩおよび／またはＸｈｏ１部位へ挿入されたｃＤＮＡ遺伝子は、第２位 におけるＤＨＰＲとのビ（２）シストロンｍＲＮＡとして発現される。この立体 配置では、上流（ＢＭＰ−３）転写解読枠の翻訳は、下流（ＤＨＰＲ）ｃＤＮＡ 遺伝子よりも効率が高いＵカウフマン等、ＥＭＢＯジャーナル、６：１８７−１ ９３（１９８７）コ。それにも拘わらず、発現されるＤＨＰＲ蛋白質の量は、安 定したＣＨＯセルラインの選択に充分である。

［３５Ｓ］メチオニンによるパルス標識およびポリアクリルアミドゲル電気泳動 によるＢＭＰ−３ポリペプチドの特性検定は、ＢＭＰ−３蛋白質の多数の分子サ イズ形態が安定しｆコＣＨＯラインから発現および分泌されていることを示す。

実施例７ 発現されたＢＭＰ−３の生物学的活性 上記実施例６で得られた発現され？：ＢＭＰ−３の生物学的活性を測定するため 、ＢＭＰ−３をヘパリン・セファロース・カラムにおいて部分的に精製する。１ つの１００ｉｘ皿から集められたトランスフェクション後の条件培地上清４ｍρ をＹＭＩＯ膜での限外ろ過により約１０倍に濃縮し、次いで２０ｍＭトリス、０ ．１５モルＮａＣＩ、ｐＨ７，４（出発緩衝液）に対して透析する。次に、この 物質を出発緩衝液中１　、　］　ｘ（ｌヘパリン・セファロース・カラムに適用 する。非結合蛋白質を出発緩衝液の８Ｍａ洗浄液により除去し、ＢＭＰ−３を含 む結合蛋白質を、２０　ｍＭ　）リス、２．０モルＮａＣ１、ｐＨ７，４の３− ４ｚ（ｌ洗浄液により脱着させる。

ヘパリン・カラムにより結合した蛋白質をセントリコンｌＯにおいて約１０倍濃 縮し、塩を、０．１％トリフルオロ酢酸を用いたシアフィルトレージョンにより 還元する。この溶液の適量を２０ｍ９のラット・マトリックスと混合し、次いで ローイン修飾サンバスーレディ検定法により硬骨および／または軟骨形成活性に ついてインビボ検定する。模擬トランスフェクション上滑分画をＣＯ８発現蛋白 質に関する対照として使用し、ＣＴ（Ｏ発現蛋白質については、ＢＭＰ−３不含 有ＣＨＯ細胞条件培地分画を使用する。７日後、特定量のひとＢＭＩ’−３が加 えられたラット・マトリックスを含むインブラントをラットから摘出し、組織評 価用に処理する。各インブラントから得られた代表的部分は、新しい骨鉱質の存 在についてはフォノ・コツプおよび酸性ツクシン？こより染色され、軟骨特異的 マトリックス形成の存在についてはトルイジン・ブルーを用いて染色される。

上記部分内に存在する細胞のタイプおよびこれらの細胞が表現型を示す範囲を実 施例３の記載と同様に評価し、数える。

ひとＢＭＰ−３をマトリックス物質に加えると、内植後５日目に軟骨様小節が形 成される。形状および異染性マトリックスの発現により軟骨閉型細胞が認識され 得た。この検定結果は、ＢＭＰ−３蛋白質が、ラット骨形成検定において蛋白質 １μ９で少なくとも＋２の評価を得る能力を有する点を特徴とし得ることを示す 。ひとＢＭＰ−３について観察された活性の量は、それが、マトリックス試料に 加えられたＢＭＰ−３蛋白質の量により異なり得ることを示す。

上記方法を用いて、うしＢＭＰ−３またはひとＢＭＰ−３因子をプローブ供給源 として利用することにより、興味深い他の関連ＢＭＰ−３因子を単離することが できる。それらの他のＢＭＰ−３蛋白質は、特に骨折修復、創傷治癒および組織 修復において似た用途を有し得る。

以上、この発明の現在好ましい実施態様について詳しく記載した。

それを実践する場合、当業界の熟練者には、これらの記載事項を考慮した上で多 くの修正および変形が想到されるものと予想される。

それらの修正および変形は、後記請求の範囲内に包含されると考えられる。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 工、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０１４６４ ２、発明の名称 硬骨および軟骨誘導組成物 ３、特許出願人 名称　ジェネティックス・インスティテユート・インコーホレイテッド４、代理 人 住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見２丁目１番６１号ツイン２１ＭＩＤタ ワー内　電話（０６）９４９−１２６１１９９０年４月１３日 ６、添付書類の目録 （１）　　補正書の翻訳文　　　　　　　　　　　１　通請求の範囲 （ａ）実質的に第■表に示されたｃＤＮＡにより形質転換された細胞を培養し、 （ｂ）上記培養培地から、実質的に第■表中アミノ酸＃３７７〜アミノ酸＃４７ ２で示された９６アミノ酸配列を含む蛋白質を回収する 段階により製造されるｍ象、ｘＢＭＰ−３蛋白質。

（２）さらに、軟骨および／または硬骨形成誘導能力を特徴とする請求項ｌ記載 の蛋白質。

（３）さらに、ローイン修飾サンバスーレディ検定において蛋白質１μ９で少な くともＣ＋２の評価が得られることを特徴とする請求項ｌ記載の蛋白質。

（４）請求項２記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列。

（５）請求項４記載のｃＤＮＡにより形質転換された宿主細胞。

（ａ）適当な培養培地で請求項５記載の形質転換された宿主細胞を培養し、 （ｂ）ｉＲ記培養培地からＢＭＰ−３を単離および精製する段階を含む方法。

（７）医薬的に許容し得る賦形剤と混合した形で請求項１記載の蛋白質の有効量 を含む医薬組成物。

（８）医薬的に許容し得る賦形剤中に請求項２記載の蛋白質の有効量を含む、硬 骨および／または軟骨形成用医薬製剤。

（９）さらに、上記組成物を支持するマトリックスを含み、硬骨および／または 軟骨成長用の表面を特徴する請求項８記載の組成物。

（１０）マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸および 燐酸三カルシウムから成る群から選ばれた物質を含む、請求項９記載の組成物。

（１１）請求項８記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、処置を必 要とする患者における硬骨および／または軟骨形成誘導方法。

（１２）医薬的に許容し得る賦形剤中請求項１記載の蛋白質の有効量を含有する 、創傷治癒および組織修復用医薬組成物。

（１３）請求項１２記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、処置を 必要とする患者における創傷および／または組織修復処置方法。　　。

（１４）ＢＭＰ　−３蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列であって、実質 的に、 （ａ）ヌクレオチド＃３２１ないしヌクレオチド＃ｌ　７３６（ｂＸｌ）ストリ ンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記配列にハイブリダイゼーショ ンし、 （２）軟骨および／または硬骨形成誘導能力を特徴とする蛋白質をコードする 配列 から成る群から選ばれたヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡ配列。

（１５）さらに、ローイン修飾サンバスーレディ検定において蛋白質ｌμ２で少 なくとも＋２の評価を得る能力を存し得ることを特徴とする請求項１４記載のＤ ＮＡ配列。

（１６）発現制御配列を機能し得る形で随伴した請求項１４記載のＤＮＡ配列を 含むベクター。

（１７）請求項１４記載のＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞。

（１８）ＢＭＰ−３蛋白質の製造方法であって、（ａ）適当な培養培地中、請求 項１７記載の形質転換宿主細胞を培養し、 （ｂ）培養培地からＢＭＰ−３を単離および精製する段階を含む方法。

国際調査報告 ｌＡｍＡ°１゛″１ＭＩＡｏｊＭ＋１１ｖｔ８６ｐｃ、、Ｕｓ８９，０１４６４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１） （ａ）実質的に第ＩＩ表に示されたｃＤＮＡにより形質転換された細胞を培養し 、 （ｂ）上記培養培地から、実質的に第ＩＩ表中アミノ酸＃３７７〜アミノ酸＃４ ７２で示された９６アミノ酸配列を含む蛋白質を回収する 段階により製造される精製ＢＭＰ−３蛋白質。 （２）さらに、軟骨および／または硬骨形成誘導能力を特徴とする、請求項１記 載の蛋白質。 （３）さらに、ローゼン修飾サンパス−レディ検定において蛋白質１μｇで少な くともＣ＋２の評価が得られることを特徴とする、請求項１記載の蛋白質。 （４）請求項２記載の蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列。 （５）請求項４記載のｃＤＮＡにより形質転換された宿主細胞。 （６）精製ＢＭＰ−３蛋白質の製造方法であって、（ａ）適当な培養培地で請求 項５記載の形質転換された宿主細胞を培養し、 （ｂ）前記培養培地からＢＭＰ−３を単離および精製する段階を含む方法。 （７）医薬的に許容し得る賦形剤と混合した形で請求項１記載の蛋白質の有効量 を含む医薬組成物。 （８）医薬的に許容し得る賦形剤中に請求項２記載の蛋白質の有効量を含む、硬 骨および／または軟骨形成用医薬製剤。 （９）さらに、上記組成物を支持するマトリックスを含み、硬骨および／または 軟骨成長用の表面を提供する、請求項８記載の組成物。 （１０）マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸および 燐酸三カルシウムから成る群から選ばれた物質を含む、請求項９記載の組成物。 （１１）請求項８記載の組成物の有効量を患者に投与することを含む、処置を必 要とする患者における硬骨および／または軟骨形成誘導方法。 （１２）医薬的に許容し得る賦形剤中請求項１記載の蛋白質の有効量を含有する 、創傷治癒および組織修復用医薬組成物。 （１３）請求項１２記載の組成物の有効量を愚者に投与することを含む、処置を 必要とする患者における創傷および／または組織修復処置方法。 （１４）ＢＭＰ−３蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列であって、実質的 に、 （ａ）ヌクレオチド＃３２１ないしヌクレオチド＃１７３６（ｂ）（１）ストリ ンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記配列にハイブリダイゼーショ ンし、 （２）軟骨および／または硬骨形成誘導能力を特徴とする蛋白質をコードする 配列 から成る群から選ばれたヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡ配列。 （１５）さらに、ローゼン修飾サンパス−レディ検定において蛋白質１μｇで少 なくとも＋２の評価を得る能力を有し得ることを特徴とする、請求項１４記載の ＤＮＡ配列。 （１６）発現制御配列を機能し得る形で随伴した請求項１４記載のＤＮＡ配列を 含むベクター。 （１７）請求項１４記載のＤＮＡ配列により形質転換された宿主細胞。 （１８）ＢＭＰ−３蛋白質の製造方法であって、（ａ）適当な培養培地中、請求 項１７記載の形質転換宿主細胞を培養し、 （ｂ）培養培地からＢＭＰ−３を単離および精製する段階を含む方法。