WO2010098421A1 - 改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質 - Google Patents

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recombinant human
hydrochloric acid
morphogenetic protein
bone morphogenetic
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昌宏 長屋
和茂 洲鎌
ウォルター ジーバルト
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株式会社オステオファーマ
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    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant human bone morphogenetic protein having improved storage stability.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical preparation or kit containing the above recombinant human bone morphogenetic protein.
  • BMP Bone Morphogenetic Protein
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • Several members of BMP are known, all of which are highly conserved cysteine residues that form three disulfide bonds (called “cysteine knots”) and one intermolecular disulfide bond.
  • cyste knots highly conserved cysteine residues that form three disulfide bonds
  • BMP is composed of one cysteine knot, one ⁇ -helix, and at least four ⁇ -sheets per molecule, which allows monomers to form dimers. That is, BMP takes the form of a homodimer consisting of a single BMP member or a heterodimer consisting of two different BMP members as an active form.
  • BMP is synthesized as prepro-BMP, which is a precursor in the cell, then transported to the cell membrane, processed and secreted outside the cell in the form of a mature protein. This secreted protein binds to the receptor as a ligand of the BMP type I or type II receptor, whereby a BMP signal is transmitted into the cell.
  • BMP In order to produce BMP, general gene recombination technology is used. A DNA encoding BMP can be introduced into a prokaryotic or eukaryotic cell via a vector, and the DNA can be expressed and translated in the cell to obtain a recombinant BMP (Patent Documents 1, 2 and 3, non-patent documents). Patent Document 1). As described above, BMP needs to form a dimer structure in order to become active, and at this time, it must be folded into the correct configuration along with the formation of a correct disulfide bond (Patent Document 4).
  • the produced recombinant protein does not have sugar chains, unlike when using eukaryotic cells.
  • Many BMP members are known to retain biological activity even without sugar chains, but because BMP is a relatively hydrophobic protein, recombinant BMP without sugar chains causes aggregation. It has the disadvantages that it is easy and has poor solubility in weakly acidic to alkaline water. In addition, as described above, in order for BMP to have activity, it must form a correctly folded dimer. Therefore, when prokaryotic cells are used to produce recombinant BMP, the steps of producing BMP and In the process of formulating pharmaceutical products, how to stabilize proteins is an issue.
  • Patent Document 5 describes that a buffer is used to control the pH of a BMP solution to about 2.5 to about 4.5, trehalose is added, and lyophilized.
  • bone substitutes made of calcium phosphate such as hydroxyapatite, ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP), ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) are impregnated with BMP solution.
  • Treatment such as implantation in a bone disease site (Patent Document 6). This makes it possible to regenerate or treat bone at a fracture site or a bone defect site.
  • recombinant human BMP produced in prokaryotic cells has the disadvantage that it is prone to aggregate and has very low solubility in water or buffer in the neutral pH range. It has become an obstacle for the transformation.
  • such a recombinant human BMP does not contain a sugar chain, and thus has an advantage that it can be produced by using prokaryotic cells that are easy to culture and excellent in proliferation ability.
  • Another advantage is that there is no need to consider the negative effects on the human body of carbohydrates that are different from human-type sugar chains, as seen in recombinant human BMP made in heterologous eukaryotic cells.
  • an object of the present invention is to provide a method for solving the problems of aggregation, solubility, and storage stability of recombinant BMP at one time among the above problems.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant human BMP produced by the above method and practical, a pharmaceutical preparation containing the same, and a bone regeneration or treatment kit.
  • the present invention includes the following features.
  • the present invention in the first aspect, comprises a step of dissolving a recombinant human bone morphogenetic protein (BMP) produced in a prokaryote in a hydrochloric acid solution having a concentration range of 0.01 mM to 330 mM.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the present invention provides the above method, wherein the hydrochloric acid solution has a pH range of 0.2 to 4.6.
  • a suitable hydrochloric acid solution has a pH range of 3.7 or more and 4.6 or less.
  • the present invention further provides, in another embodiment, the above method wherein the prokaryote is E. coli.
  • the present invention further provides, in another embodiment, the above method wherein the BMP is recombinant BMP-2.
  • the present invention further provides, in another embodiment, the above method, further comprising drying a hydrochloric acid solution of BMP.
  • the preferred drying is freeze drying.
  • the present invention also provides a recombinant human bone morphogenetic protein (BMP) produced by the above method and having improved storage stability.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the present invention provides the above recombinant human BMP, wherein the recombinant BMP is BMP-2.
  • the present invention provides the recombinant human BM in which the protein is lyophilized.
  • the present invention provides the recombinant human BMP having a pH range of 3.7 to 4.6 when the protein is redissolved with water.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation containing the recombinant human BMP defined above.
  • the present invention further provides, in another embodiment, the above pharmaceutical preparation which is a lyophilized preparation.
  • the present invention further provides, in another embodiment, the above pharmaceutical preparation used for bone regeneration or treatment.
  • the present invention provides a bone regeneration or treatment kit comprising the recombinant human BMP and the calcium phosphate bone substitute material in separate containers.
  • the calcium phosphate bone filling material is hydroxyapatite, ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP), or ⁇ -TCP.
  • the term “recombinant human BMP” refers to a human BMP produced by genetic engineering techniques, wherein the recombinant is produced as a mature protein using prokaryotic cells, Thereafter, the protein is refolded and purified as an active dimer.
  • the present invention simultaneously solves the problems of aggregation, solubility and storage stability of recombinant human bone morphogenetic protein (BMP) produced by prokaryotic cells. This allows the recombinant human BPM to be used for bone regeneration and treatment.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • This figure shows 5 mg / ml BMP-2 solution prepared by dissolving E. coli cell-produced recombinant human BMP-2 in 0.5 mM or 1 mM hydrochloric acid aqueous solution, or freeze-thaw once or twice (-80 ° C freezing) SDS-PAGE for confirming protein stability when each of the prepared BMP-2 solutions was stored at 5 ° C at the start and for 3 months, or when stored at 40 ° C for 3 months
  • Each lane at the start (FIG. 1A) and after 3 months (FIG. 1B) shows the results of the next sample.
  • Lane 1 1 mM hydrochloric acid, 40 ° C; Lane 2, 0.5 mM hydrochloric acid, 40 ° C; Lane 3, 1 mM hydrochloric acid, 5 ° C; Lane 4, 0.5 mM hydrochloric acid, 5 ° C; Lane 5, 1 mM hydrochloric acid, freeze thawed Once; Lane 6, 0.5 mM hydrochloric acid, frozen and thawed once.
  • Lane M shows molecular weight markers. This figure shows the reverse of 5 mg / ml BMP-2 solution prepared by dissolving E. coli cell-produced recombinant human BMP-2 in 0.5 mM aqueous hydrochloric acid solution once or twice (-80 ° C freezing). The result analyzed by phase HPLC is shown. 2A and 2B are chromatograms when frozen and thawed once or twice, respectively.
  • the present invention is characterized in that it comprises a step of dissolving a recombinant human bone morphogenetic protein (BMP) produced in a prokaryote in a hydrochloric acid solution having a concentration range of 0.01 mM to 330 mM.
  • BMP bone morphogenetic protein
  • the recombinant human bone morphogenetic protein (hereinafter also referred to as “BMP”) as a raw material used in the method of the present invention belongs to the BMP family or GDF family, and has the ability to induce bone formation, or bone regeneration and repair. All members with abilities are included.
  • BMP of the present invention include BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (also referred to as OP-1), BMP-8b (also referred to as OP-2), and BMP-9.
  • BMP family members such as BMP-10, BMP-11 and BMP-15, GDF family member GDF-5 and the like are included.
  • preferred human BMP family members and human GDF family members are BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8b and GDF-5, and more preferred members are BMP-2.
  • BMP-4, BMP-6 and BMP-7 and a more preferred member is BMP-2.
  • the BMP generally has a highly conserved cysteine residue that forms three disulfide bonds called cysteine knots and one intermolecular disulfide bond. .
  • BMP is composed of one cysteine knot, one ⁇ -helix, and at least four ⁇ -sheets per molecule, which allows monomers to form dimers.
  • a dimer is an active form of BMP, either a homodimer consisting of a single BMP member or a heterodimer consisting of two different BMP members.
  • BMPs that form homodimers are BMP-2, BMP-4, and BMP-7
  • BMPs that form heterodimers are BMP-6.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of the pre-pro body of the above-mentioned human BMP family member and human GDF family member are registered in GenBank (NCBI, USA) and have the following registration numbers (Accession Number).
  • Human BMP-2 NM_001200 (SEQ ID NO: 1 and 2) Human BMP-4: D30751 (SEQ ID NOs: 3 and 4) Human BMP-6: NM_001718 (SEQ ID NO: 5 and 6) Human BMP-7: NM_001719 (SEQ ID NOs: 7 and 8) Human BMP-8b: NM_001720 (SEQ ID NOs: 9 and 10) Human GDF-5: NM_000557 (SEQ ID NOS: 11 and 12) Human BMP-9: AF188285 Human BMP-10: NM_14482 Human BMP-11: AF100907 Human BMP-15: NM_005448
  • the term recombinant human “BMP” as used in the present invention shall refer to any of natural human BMP, variants thereof, and derivatives thereof.
  • the mature region of human BMP consists of about 110 to about 140 residues on the C-terminal side in the amino acid sequence of the above-mentioned prepro form.
  • the mature amino acid sequences of human BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8b and GDF-5 are as follows.
  • Human BMP-2 (residues 283-396 of SEQ ID NO: 2) (114 amino acids) Human BMP-4 (residues 293 to 408 of SEQ ID NO: 4) (116 amino acids) Human BMP-6 (residues 375 to 513 of SEQ ID NO: 6) (139 amino acids) Human BMP-7 (residues 293 to 431 of SEQ ID NO: 8) (139 amino acids) Human BMP-8b (residues 264 to 402 of SEQ ID NO: 10) (139 amino acids) Human GDF-5 (residues 382 to 501 of SEQ ID NO: 12) (120 amino acids)
  • the mutant is obtained by adding, substituting, inserting, or deleting one or more, preferably one or several amino acids in the mature amino acid sequences of the natural human BMP family member and the natural human GDF family member.
  • the mutant is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 92% or more, 93% or more, 95% or more with each mature amino acid sequence of the natural human BMP family member or natural human GDF family member. As described above, it has a sequence identity of 97% or more, 98% or more, or 99% or more, and has the same biological activity (osteoinductive activity) as natural BMP.
  • Human BMP substantially retains its original biological activity (osteoinduction) and does not substantially alter the conformation formed by multiple disulfide bonds, adding, substituting, inserting or deleting amino acids Is possible.
  • amino acid substitution is preferably conservative amino acid substitution, and substitution between amino acid groups having similar chemical or physical properties such as structural, electrical, and hydrophobic / hydrophilic properties is desirable.
  • conservative amino acid groups are known.
  • the basic amino acid group includes arginine, lysine and histidine
  • the acidic amino acid group includes aspartic acid and glutamic acid
  • the aromatic amino acid group includes phenylalanine, tyrosine, tryptophan and histidine.
  • the amino acid group includes valine, leucine and isoleucine
  • the hydrophobic amino acid group includes valine, alanine, leucine, isoleucine, methionine, proline and the like
  • the polar amino acid group includes serine, threonine, glycine, glutamine and asparagine. , Cysteine, tyrosine and the like.
  • human BMP mutants modified so as to improve heparin binding ability are also included in the mutants of the present invention (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-086319, Japanese Patent Laid-Open No. 2009-011323, Japanese Patent No. 4155711).
  • identity refers to an amino acid with or without a gap so that the homology of corresponding amino acids is maximized between two related amino acid sequences. Means the percentage (%) of the same number of amino acids with respect to the total number of amino acids including the number of gaps.
  • identity can be determined using known algorithms such as BLAST and FASTA, and also by accessing a gene bank such as GenBank (NCBI, USA) and using the same algorithm. You can also search for proteins.
  • Related references that can be used include, for example, SF Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), J. Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984).
  • Recombinant human BMP that can be used in the present invention includes natural BMP and its derivatives.
  • Derivatives can be obtained by chemical modification of proteins.
  • the modification can be performed by linking a modifying group other than a sugar chain, for example, polyethylene glycol (PEG) to a protein.
  • PEG polyethylene glycol
  • the molecular weight of PEG is not particularly limited, but is, for example, about 4,000 or more and about 100,000 or less, preferably about 5,000 or more and about 50,000 or less.
  • the coupling of the modifying group can be performed at a site other than the cysteine residue, for example, the ⁇ -amino group of the lysine residue of the protein, or the amino terminus or carboxyl terminus of the protein so as not to prevent the dimerization of the monomer. .
  • the recombinant human BMP used in the present invention can be prepared using a gene-mediated gene recombination technique.
  • the vector can contain a control sequence, a selectable marker sequence, and the like.
  • Control sequences include, for example, promoters, enhancers, terminators, replication origins, Shine-Dalgarno (SD) sequences, and the like.
  • promoters include phage-derived T3 promoter, T5 promoter, T7 promoter, SP6 promoter, PL promoter, PR promoter and the like, bacteria-derived lac promoter, trp promoter, alkaline protease promoter, ⁇ -amylase promoter, and the like.
  • selection markers include, for example, drug resistance genes (ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, etc.) and the like.
  • Vectors include, for example, plasmids, phages and the like, and more specifically are pBR systems, pUC systems, pBluescripts, bacteriophages, and the like.
  • a host cell for transformation with a vector containing a DNA encoding the recombinant human BMP of the present invention or a variant thereof is a prokaryotic cell, and includes, for example, bacteria such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas bacteria, Preferably, E. coli is included.
  • Prokaryotic cells can be cultured under known culture conditions such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Pseudomonas bacteria. Culturing is performed in a liquid medium having an optimum pH containing a carbon source, a nitrogen source, trace elements and the like at a culture temperature and a culture time suitable for the cells.
  • a carbon source include starch, bran, glucose, lactose, sucrose, and the like.
  • the nitrogen source includes, for example, yeast extract, peptone, fish meat extract, urea, ammonium salt, amino acids and the like.
  • Inorganic salts and trace elements include, for example, metal ions such as iron ions, copper ions, zinc ions, magnesium ions, potassium ions, sodium ions, manganese ions, and calcium ions.
  • the culture temperature is usually in the range of 20 ° C to 40 ° C.
  • the recombinant human BMP of the present invention or a mutant thereof can be recovered from a solution obtained by destroying and extracting transformed host cells.
  • the target protein is recovered from the medium.
  • the recovered protein is refolded and subjected to purification. Purification can be performed using affinity chromatography such as heparin affinity chromatography, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, HPLC, salting out, dialysis, ultrafiltration, electrophoresis, isoelectric focusing, etc. it can.
  • the method of the present invention comprises dissolving recombinant human BMP in a hydrochloric acid solution having a concentration range of 0.01 mM to 330 mM.
  • the hydrochloric acid solution in the above concentration range can be prepared by diluting pharmaceutically acceptable hydrochloric acid with sterilized water.
  • the pH range of the hydrochloric acid solution in the above concentration range varies somewhat depending on the measurement environment (for example, equipment, water, temperature, etc.), but when measured at 25 ° C., it is about 0.2 to about 5.1, preferably 0.2 to 4.6. More preferably, it is 3.7 or more and 4.6 or less.
  • the concentration of recombinant human BMP is not particularly limited as long as it does not cause precipitation and can be dissolved, but it is usually 1 mg / ml to 20 mg / ml, preferably 3 mg / ml to 15 mg / ml, more preferably 5 mg / ml. ⁇ 10mg / ml.
  • the temperature of the hydrochloric acid solution is about 0 ° C. to about 30 ° C., preferably about 4 ° C. to about 20 ° C., more preferably about 4 ° C. to about 10 ° C.
  • the hydrochloric acid solution of recombinant human BMP produced by the above method can be stably stored for 3 months or longer by refrigerated storage (for example, 5 ° C.).
  • “stable” means that protein degradation is not substantially observed by electrophoretic measurement (see Examples below), and / or BMP by Biacore measurement (GE Healthcare; see Examples below). It means that the binding ability to the receptor activine type II receptor (ACTRII) is substantially retained.
  • stability can be confirmed by reverse phase HPLC (eg, C4 column; mobile phase A, 0.1% TFA; mobile phase B, 100% acetonitrile; flow rate, 1ml / min; gradient, 0% A to 100% B, 20min. ).
  • a drying step for removing water from the hydrochloric acid solution of recombinant human BMP can be added.
  • Drying includes water evaporation under reduced pressure, freeze drying, and the like.
  • the temperature of the recombinant human BMP hydrochloric acid solution should be 30 ° C. or lower, preferably 20 ° C. or lower, more preferably 10 ° C. or lower in order to suppress protein degradation.
  • a preferred drying is lyophilization. This approach involves freezing the BMP hydrochloric acid solution and then evaporating the water under vacuum.
  • the BMP activity is not substantially impaired.
  • stabilizers such as sugars, proteins, surfactants and amino acids.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2008-231091 it is described about protein damage when a protein is freeze-dried, and it is recommended that trehalose be added as a stabilizer to BMP protein.
  • the method of the invention is surprising because it is very simple and can stably produce proteins without the addition of such stabilizers.
  • the solution or solid form of recombinant human BMP produced by the method of the present invention can be stably stored for 3 months or more at a low temperature of 10 ° C. or lower, preferably 4 ° C. or 5 ° C.
  • Recombinant human BMP retains substantially complete activity even when frozen and thawed, and has a residual activity of 50% or more, usually 60% or more when stored at 40 ° C.
  • a recombinant human BMP produced in a prokaryotic cell preferably E. coli
  • a prokaryotic cell preferably E. coli
  • a eukaryotic cell such as a Chinese hamster ovary (CHO) cell
  • CHO Chinese hamster ovary
  • Recombinant human BMP Recombinant human BMP produced by the above method has improved storage stability.
  • the form of the protein may be either a hydrochloric acid solution within the above concentration or pH range or a dry solid, preferably a lyophilized solid.
  • the recombinant human BMP of the present invention is BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 (also referred to as OP-1), BMP-8b (also referred to as OP-2).
  • preferred members are BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8b and GDF-5
  • more preferred members are BMP-2, BMP-4 BMP-6 and BMP-7
  • a more preferred member is BMP-2.
  • the recombinant human BMP of the present invention is a protein containing no sugar chain because it is produced in prokaryotic cells, preferably Escherichia coli.
  • the recombinant human BMP of the present invention obtained by treating the protein with the above hydrochloric acid solution can be stored refrigerated (5 ° C) for 3 months in the form of a hydrochloric acid solution or a lyophilized solid, or stored frozen. , Virtually inactive.
  • the pH range when redissolved with water is preferably 3.7 or more and 4.6 or less.
  • the recombinant human BMP of the present invention is also characterized in that it is stable without the addition of substances such as saccharides, proteins, surfactants, stabilizers such as amino acids, or buffers such as glycine buffer. Have.
  • a basic amino acid residue or N-terminal amino group reacts with hydrochloric acid to form a quaternary salt.
  • the recombinant human BMP produced by the method of the present invention is substantially less susceptible to aggregation and has a higher storage stability than untreated recombinant BMP.
  • the present invention further provides a pharmaceutical preparation or kit containing recombinant human BMP produced by the above method.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention may be in the form of a BMP hydrochloric acid solution, or may be in the form of a solid obtained by drying a BMP hydrochloric acid solution.
  • a preferred form is a lyophilized form.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention has bone inducing activity, it can be used for bone regeneration, repair or treatment.
  • scaffolds include synthetic polymers such as polylactic acid (PLA), polylactyglycolate (PLGA), PLA-PEG, PLGA-PEG (where PEG represents polyethylene glycol), hyaluronic acid, collagen, atelocollagen, etc.
  • PVA polylactic acid
  • PLA polylactyglycolate
  • PLA-PEG PLA-PEG
  • PLGA-PEG where PEG represents polyethylene glycol
  • hyaluronic acid collagen
  • collagen atelocollagen
  • Natural phosphate hydroxyapatite
  • calcium phosphate such as ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP), ⁇ -TCP, and the like.
  • a porous scaffold eg, in the form of granules, sponges, blocks, gels, etc.
  • a BMP solution solvent: eg, sterile water or saline
  • affected bones eg, fracture sites
  • BMP solution solvent: eg, sterile water or saline
  • the size of the particle size passes through a 3-5 mm mesh screen when used in orthopedics, while the size of particle size passes through a 0.5-1.5 mm mesh screen when used in dentistry.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention includes a form in which BMP and scaffold are mixed, a form in which BMP is applied to the scaffold, a form in which BMP is adsorbed on the scaffold, and the like.
  • the human clinical dose (single implant or infusion) of the stabilized recombinant human BMP obtained by the method of the present invention is the dose site, the size of the defect, the combined scaffold (collagen, bone grafting material, high optimum amount is different depending on the molecular gel, etc.), generally a bone filling volume 1 cm 3 per 0.2 to about 3 mg (the weight of the dimer), for example if the compensation volume of the site of about 0.5 ⁇ 20cm 3, 0.1 ⁇ 60mg / patient Range.
  • the dosage can vary depending on various conditions such as the sex, age, weight, and severity of the patient.
  • the pharmaceutical preparation of the present invention can be used for regeneration and compensation of bone defects, early healing of fractures, regeneration and treatment of damaged sites of bone such as cartilage, tendon, ligament, intervertebral disc, meniscus, and alveolar bone. Since BMP has the advantages of high osteoinductive ability, low invasiveness, and stable quality control and supply, it is expected to be used for medical applications as described above.
  • the present invention provides a kit for bone regeneration or treatment comprising recombinant human BMP and calcium phosphate bone substitute material in separate containers.
  • Calcium phosphate bone substitutes include, but are not limited to, bone substitutes such as hydroxyapatite, ⁇ -TCP, and ⁇ -TCP.
  • the kit may further include instructions for use, a syringe containing water for injection, a sterilized tray, a sterilized spatula, and the like.
  • a syringe containing water for injection dissolve BMP in a syringe, sprinkle evenly on the calcium phosphate bone filling material (granules) in the tray, and mix with a spatula.
  • Such a kit is intended to reconstitute or redissolve BMP just prior to treatment.
  • BMP was added to each lane so as to have a concentration of 5 ⁇ g, and electrophoresis was performed at a constant voltage of 200 V for 45 minutes. Then, it was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) and observed for degradation of BMP detected around 13 kDa. As a result, from 1 mM to 100 mM, no change was observed even after 120 hours. On the other hand, with 1M hydrochloric acid concentration, some decomposition was observed by 120 hours, and with 12M so-called concentrated hydrochloric acid, BMP decomposition was observed from the 0th hour, and most of BMP was decomposed after 48 hours.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • BMP produced using E. coli prepared by the present inventors is that it is neatly dissolved in hydrochloric acid so that the pH is 4.6 to 0.2, and is converted to ActRIIB at a temperature of 5 ° C or lower. It was concluded that this is a BMP preparation that can be stably stored without losing its binding ability.
  • a recombinant human BMP produced with prokaryotic cells such as Escherichia coli can be used for medical purposes. Since BMP is a useful protein for bone regeneration and treatment, it is expected to play a role in the medical field.

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Abstract

　この発明は、原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えヒトBMPを製造する方法、上記方法で製造された組換えヒトBMP、並びに、この組換えヒトBMPを含有する医薬製剤及びキットを提供する。

Description

改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質
　本発明は、改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質に関する。
　本発明はまた、上記組換えヒト骨形成蛋白質を含有する医薬製剤又はキットに関する。
　骨形成蛋白質(Bone Morphogenetic Protein; BMP)は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーに属する蛋白質であり、骨の形成、器官の形成（歯、心臓、目、軟骨などの形成）などの重要な生物学的役割を担っている。BMPにはいくつかのメンバーが知られており、いずれのメンバーも、3個のジスルフィド結合（「システインノット」と呼ばれる）と1個の分子間ジスルフィド結合を形成する、高度に保存されたシステイン残基をもつ。BMPは、1分子あたり1個のシステインノット、1個のα-ヘリックス、少なくとも4個のβ-シートで構成され、これによってモノマーはダイマーを形成することができる。すなわち、BMPは、活性型として、単一のBMPメンバーからなるホモダイマー、又は2つの異なるBMPメンバーからなるヘテロダイマー、の形態をとる。
　BMPは、細胞内で前駆体であるプレプロBMPとして合成されたのち、細胞膜に輸送され、プロセシングされて成熟蛋白質の形態で細胞外に分泌される。この分泌蛋白質は、BMPのI型又はII型受容体のリガンドとして該受容体に結合し、これによって細胞内にBMPシグナルが伝達される。
　BMPを製造するためには、一般的な遺伝子組換え技術が使用される。ベクターを介してBMPをコードするDNAを原核又は真核生物細胞に導入し、該細胞中で該DNAを発現、翻訳して組換えBMPを得ることができる（特許文献1、2及び3、非特許文献1）。前述したように、BMPは、活性型となるために、ダイマー構造を形成する必要があるが、このとき正しいジスルフィド結合の形成とともに正しい立体配置にフォールディングされねばならない（特許文献4）。
　組換えBMPを、原核生物細胞を使用して製造するときには、真核生物細胞を使用するときと異なり、生成される組換え蛋白質は糖鎖をもたない。BMPメンバーの多くはたとえ糖鎖がなくても生物活性を保持することが知られているが、BMPは比較的疎水性の高い蛋白質であるため、糖鎖のない組換えBMPは、凝集を起こし易く、また、弱酸性からアルカリ性域の水に対する溶解性が悪いという欠点をもつ。また、前述したように、BMPは、活性をもつためには、正しくフォールディングされたダイマーを形成されねばならないので、原核生物細胞を使用して組換えBMPを製造するときには、BMPを製造する工程及び医薬品に製剤化する工程において、蛋白質をいかに安定化するかが課題となっている。
　一般に蛋白質の安定化のために、糖類、アミノ酸類、蛋白質類、界面活性剤などを蛋白質と並存させることが知られており、その効果の程度は蛋白質の種類ごとに異なる。組換えBMPについても、例えばトレハロースが安定化剤として使用可能であることが報告されている（特許文献5）。具体的に、この特許文献は、緩衝剤を使用してBMP溶液のpHを約2.5～約4.5に制御するとともにトレハロースを添加し、凍結乾燥することを記載している。
　BMPを医療で使用するときには、ヒドロキシアパタイト、β-リン酸三カルシウム（β-TCP）、α-リン酸三カルシウム（α-TCP）などのリン酸カルシウムからなる骨補填材をBMP溶液で含浸させ、これを骨疾患部位に埋め込むなどの処置を行う（特許文献6）。これによって骨折部位や骨欠損部位での骨の再生又は治療が可能になる。
特表2004-514,441号公報 国際公開WO 2006/125,868号パンフレット 国際公開WO 1999/18,196号パンフレット 欧州特許第433,225号 特開2008-231,091号公報 特表2005-509,494号公報
R. Ruppert et al., Eur. J. Biochem. 237:295-302 (1996)
　上記背景技術の欄で述べたように、原核生物細胞で産生された組換えヒトBMPは、凝集し易くかつ中性領域のpHの水又はバッファーに対する溶解性が非常に低いという欠点があり、実用化のための1つの障害になっている。その反面、そのような組換えヒトBMPは、糖鎖を含まないために、培養自体が容易であるとともに増殖能に優れた原核生物細胞を使用することによって製造することができるという利点がある。また、異種真核生物細胞で作られた組換えヒトBMPの場合にみられるようなヒト型糖鎖と異なる炭水化物が、人体に及ぼすネガティブな影響を考慮する必要がないという利点もある。しかし、糖鎖を含まない組換えヒトBMPは、凝集性や溶解性の課題に加えて、貯蔵時の活性低下及び沈殿形成を含めた貯蔵安定性や、生体内で骨の再生や修復という持続的効能に関して解決すべき課題が多く存在している。
　したがって、本発明は、上記課題のなかで特に組換えBMPの凝集性、溶解性及び貯蔵安定性の課題を一度に解決する方法を提供することを目的とする。
　本発明はまた、上記方法で製造された、かつ実用可能な組換えヒトBMP、それを含む医薬製剤、及び骨の再生又は治療用キットを提供することを目的とする。
　本発明は、要約すると、以下の特徴を含む。
　本発明は、第1の態様において、原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えBMPを製造する方法を提供する。
　本発明は、その実施形態において、塩酸溶液のpH範囲が0.2以上4.6以下である上記方法を提供する。
　本発明では、上記方法で、好適な塩酸溶液のpH範囲が3.7以上4.6以下である。
　本発明はさらに、別の実施形態において、原核生物が大腸菌である上記方法を提供する。
　本発明はさらに、別の実施形態において、BMPが組換えBMP-2である上記方法を提供する。
　本発明はさらに、別の実施形態において、BMPの塩酸溶液を乾燥することをさらに含む上記方法を提供する。
　本発明の上記方法では、好適な乾燥が凍結乾燥である。
　本発明はまた、第2の態様において、上記の方法で製造された、改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を提供する。
　本発明は、その実施形態において、組換えBMPがBMP-2である上記組換えヒトBMPを提供する。
　本発明は、別の実施形態において、上記蛋白質が凍結乾燥されている上記組換えヒトBMを提供する。
　本発明は、別の実施形態において、上記蛋白質を水で再溶解したときのpH範囲が3.7以上4.6以下である上記組換えヒトBMPを提供する。
　本発明は、第3の態様において、上記定義の組換えヒトBMPを含有する医薬製剤を提供する。
　本発明はさらに、別の実施形態において、凍結乾燥製剤である上記医薬製剤を提供する。
　本発明はさらに、別の実施形態において、骨の再生又は治療に使用される上記医薬製剤を提供する。
　本発明は、第3の態様において、上記組換えヒトBMP及びリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキットを提供する。
　本発明の上記キットでは、リン酸カルシウム系骨補填材がヒドロキシアパタイト、β-リン酸三カルシウム（β-TCP）又はα-TCPである。
　本明細書で使用される「組換えヒトBMP」という用語は、遺伝子組換え技術によって製造されたヒトBMPを指し、このとき組換え体は、原核生物細胞を用いて成熟型蛋白質として生成され、その後、活性を有するダイマーとしてリフォールディングされ、及び精製された蛋白質をいう。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-047176号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明により、原核生物細胞により製造された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)の凝集性、溶解性及び保存安定性の課題が同時に解決される。これによって、該組換えヒトBPMが骨の再生及び治療のために使用可能になる。
この図は、大腸菌細胞産生組換えヒトBMP-2を0.5mM又は1mM塩酸水溶液に溶解して作製された5mg/mlのBMP-2溶液、或いは1回又は2回凍結融解（-80℃冷凍）したBMP-2溶液、のそれぞれを5℃にて開始時及び3ヶ月間にわたって保存したとき、或いは40℃にて3ヶ月間にわたって保存したとき、の蛋白質の安定性を確認するためのSDS-PAGEによる電気泳動図である。開始時（図1A）及び3ヵ月後（図1B）の各レーンは、次のサンプルの結果を示す。開始時：レーン1、1mM塩酸、5℃；レーン2、1mM塩酸、凍結融解1回；レーン3、1mM塩酸、凍結融解2回；レーン4、0.5mM塩酸、5℃；レーン5、0.5mM塩酸、凍結融解1回；レーン6、0.5mM塩酸、凍結融解2回。3ヵ月後：レーン1、1mM塩酸、40℃；レーン2、0.5mM塩酸、40℃；レーン3、1mM塩酸、5℃；レーン4、0.5mM塩酸、5℃；レーン5、1mM塩酸、凍結融解1回；レーン6、0.5mM塩酸、凍結融解1回。レーンMは、分子量マーカーを示す。 この図は、大腸菌細胞産生組換えヒトBMP-2を0.5mM塩酸水溶液に溶解して作製された5mg/mlのBMP-2溶液を1回又は2回凍結融解（-80℃冷凍）したのち逆相HPLCで分析した結果を示す。図2A及び図2Bはそれぞれ、1回又は2回凍結融解したときのクロマトグラムである。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
　上記のとおり、本発明は、原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えヒトBMPを製造する方法を提供する。
（組換えヒト骨形成蛋白質）
　本発明の方法で使用する原料としての組換えヒト骨形成蛋白質(以下、「BMP」とも称する)には、BMPファミリー又はGDFファミリーに属し、かつ骨形成を誘導する能力、或いは骨の再生及び修復能力、を有するすべてのメンバーが包含される。本発明のBMPには、例えば、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7（OP-1とも呼ばれる）、BMP-8b（OP-2とも呼ばれる）、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15などのBMPファミリーメンバー、GDFファミリーメンバーのGDF-5などが含まれる。
　本発明において、好ましいヒトBMPファミリーメンバー及びヒトGDFファミリーメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8b及びGDF-5であり、より好ましいメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6及びBMP-7であり、さらに好ましいメンバーは、BMP-2である。
　上記BMPは、上記背景技術の欄で述べたように、一般に、システインノットと呼ばれる3個のジスルフィド結合と、1個の分子間ジスルフィド結合とを形成する、高度に保存されたシステイン残基をもつ。BMPは、1分子あたり1個のシステインノット、1個のα-ヘリックス、少なくとも4個のβ-シートで構成され、これによってモノマーはダイマーを形成することができる。ダイマーは、BMPの活性型であり、単一のBMPメンバーからなるホモダイマー又は2つの異なるBMPメンバーからなるヘテロダイマーのいずれかである。例えば、ホモダイマーを形成するBMPは、BMP-2、BMP-4及びBMP-7であり、ヘテロダイマーを形成するBMPは、BMP-6である。
　上記のヒトBMPファミリーメンバー及びヒトGDFファミリーメンバーのプレプロ体のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、GenBank(NCBI、米国)に登録されており、以下の登録番号(Accession Number)を有している。
　ヒトBMP-2: NM_001200（配列番号1及び2）
　ヒトBMP-4: D30751（配列番号3及び4）
　ヒトBMP-6: NM_001718（配列番号5及び6）
　ヒトBMP-7: NM_001719（配列番号7及び8）
　ヒトBMP-8b: NM_001720（配列番号9及び10）
　ヒトGDF-5: NM_000557（配列番号11及び12）
　ヒトBMP-9： AF188285
　ヒトBMP-10： NM_14482
　ヒトBMP-11： AF100907
　ヒトBMP-15： NM_005448
　本発明で使用される用語組換えヒト「BMP」は、天然型ヒトBMP、その変異体、及びその誘導体のいずれかを指すものとする。
　ヒトBMPの成熟型領域は、上記プレプロ体のアミノ酸配列中のC末端側の約110～約140残基からなり、生体内では、プレプロ体のRX1X2R(R=Arg； X1, X2=任意アミノ酸)配列のC末側で切断されて成熟型となる。ヒトBMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7, BMP-8b及びGDF-5の成熟型アミノ酸配列は以下の通りである。
　ヒトBMP-2 (配列番号2の残基283～396) (114アミノ酸)
　ヒトBMP-4 (配列番号4の残基293～408) (116アミノ酸)
　ヒトBMP-6 (配列番号6の残基375～513) (139アミノ酸)
　ヒトBMP-7 (配列番号8の残基293～431) (139アミノ酸)
　ヒトBMP-8b (配列番号10の残基264～402) (139アミノ酸)
　ヒトGDF-5 (配列番号12の残基382～501) (120アミノ酸)
　変異体は、上記天然型ヒトBMPファミリーメンバー及び天然型ヒトGDFファミリーメンバーの成熟型アミノ酸配列において、1若しくは複数、好ましくは1若しくは数個、のアミノ酸が付加、置換、挿入又は欠失によって得られる蛋白質であって、対応の天然型ヒトBMPがもつ生物学的活性を有する蛋白質である。アミノ末端にはメチオニン(M)残基が結合していてもよいし、結合していなくてもよい。ここで、数個とは、2～10、好ましくは2～5の範囲の整数を指す。或いは、変異体は、上記天然型ヒトBMPファミリーメンバー又は天然型ヒトGDFファミリーメンバーの各成熟型アミノ酸配列と85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは92％以上、93％以上、95％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の配列同一性を有し、かつ、天然型BMPと同様の生物学的活性（骨誘導活性）を有する。
　ヒトBMPは、本来の生物学的活性(骨誘導)を実質的に保持し、かつ複数のジスルフィド結合によって形成される立体構造を実質的に変化させない範囲でアミノ酸の付加、置換、挿入又は欠失が可能である。特にアミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、構造的、電気的、疎水性/親水性などの化学的又は物理的性質が同類のアミノ酸群間での置換が望ましい。そのような保存的アミノ酸群は公知である。例えば、塩基性アミノ酸群にはアルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ、酸性アミノ酸群にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、芳香族アミノ酸群にはフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びヒスチジンが含まれ、分枝状アミノ酸群には、バリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれ、疎水性アミノ酸群にはバリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリンなどが含まれ、極性アミノ酸群にはセリン、トレオニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、システイン、チロシンなどが含まれる。
　或いは、ヘパリン結合能を改善するように改変されたヒトBMP変異体も本発明の変異体に包含される(特開2008-086319、特開2009-011323、特許第4155711号)。
　本明細書で使用される配列に関する「同一性」という用語は、2つの関連するアミノ酸配列について、対応するアミノ酸の相同率が最大となるように、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないでアミノ酸を整列させるとき、ギャップの数も含めた総アミノ酸数に対する同一アミノ酸数の百分率(％)を意味する。このような同一性は、BLASTやFASTAなどの公知のアルゴリズムを使用して決定することができるし、また、GenBank(NCBI、米国)などの遺伝子バンクにアクセスし、同アルゴリズムを使用することによって相同な蛋白質を検索することもできる。利用しうる関連の文献として、例えば、S.F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)、J. Devereux、J. et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984)、などを挙げることができる。
　本発明で使用可能な組換えヒトBMPは、天然型BMP及びその変異体の誘導体も含む。誘導体は、蛋白質の化学修飾によって得ることができる。修飾は、糖鎖以外の修飾基、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)の蛋白質への結合によって行うことができる。PEGの分子量は、特に限定されないが、例えば約4,000以上約100,000以下、好ましくは約5,000以上約50,000以下である。修飾基の結合は、モノマーの二量体化を妨げないようにシステイン残基以外の部位、例えば蛋白質のリジン残基のε-アミノ基、或いは、蛋白質のアミノ末端又はカルボキシル末端で行うことができる。
　本発明で使用される組換えヒトBMPは、ベクターを介する遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。ベクターには、ヒトBMP又はその変異体をコードするDNAの他に、制御配列、選択マーカー配列などを含ませることができる。制御配列には、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、複製開始点、シャイン－ダルガルノ(SD)配列などが含まれる。プロモーターの例は、ファージ由来のT3プロモーター、T5プロモーター、T7プロモーター、SP6プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなど、細菌由来のlacプロモーター、trpプロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、α-アミラーゼプロモーターなどを含む。また、選択マーカーには、例えば薬剤耐性遺伝子（アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等）などが含まれる。
　ベクターは、例えばプラスミド、ファージなどを含み、より具体的にはpBR系、pUC系、pBluescript、バクテリオファージなどである。
　本発明の組換えヒトBMP又はその変異体をコードするDNAを含むベクターで形質転換するための宿主細胞は、原核生物細胞であり、これには例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などの細菌、好ましくは大腸菌が含まれる。
　原核生物細胞の培養は、大腸菌、枯草菌、シュードモナス属細菌などの公知の培養条件で行うことができる。炭素源、窒素源、微量元素などを含む最適pHの液体培地中、細胞に適した培養温度及び培養時間にて培養を行う。炭素源には、例えばデンプン、ふすま、グルコース、ラクトース、スクロースなどが含まれる。また、窒素源には、例えば酵母エキス、ペプトン、魚肉エキス、尿素、アンモニウム塩、アミノ酸類などが含まれる。無機塩及び微量元素には、例えば鉄イオン、銅イオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンなどが含まれる。培養温度は、通常、20℃から40℃の範囲内である。
　本発明の組換えヒトBMP又はその変異体は、形質転換宿主細胞を破壊し抽出した液から回収することができる。細胞外に組換え蛋白質を分泌可能に遺伝子操作した場合には、培地から目的の蛋白質を回収する。回収した蛋白質をリフォールディングし精製処理にかける。精製は、ヘパリン親和性クロマトグラフィーなどのアフィニティクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、HPLC、塩析、透析、限外ろ過、電気泳動、等電点電気泳動などを用いて行うことができる。
（組換えヒトBMPの安定化）
　本発明の方法は、組換えヒトBMPを、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解することを含む。
　上記濃度範囲の塩酸溶液は、製薬上許容可能な塩酸を、滅菌水で希釈することによって作製することができる。上記濃度範囲の塩酸溶液のpH範囲は、測定環境(例えば装置、水、温度など)によって幾分変動はあるが、25℃で測定したとき、約0.2以上約5.1以下、好ましくは0.2以上4.6以下であり、より好ましくは、3.7以上4.6以下である。
　組換えヒトBMPの濃度は、沈殿を生じず溶解可能な範囲であれば特に制限されないが、通常、1mg/ml～20mg/ml、好ましくは3mg/ml～15mg/ml、より好ましくは5mg/ml～10mg/mlである。
　上記濃度又はpH範囲に調整された塩酸溶液を攪拌しながら、これに組換えヒトBMPを少量ずつ加えてBMP溶液を作製する。このとき、塩酸溶液の温度は、約0℃～約30℃、好ましくは約4℃～約20℃、より好ましくは約4℃～約10℃である。
　上記の手法で作製された組換えヒトBMPの塩酸溶液は、そのまま冷蔵保存(例えば5℃)することによって3ヶ月以上安定に保存することが可能である。ここで「安定に」とは、電気泳動測定(後述の実施例参照)により蛋白質の分解が実質的に認められないこと、及び/又は、Biacore測定（GE Healthcare;後述の実施例参照）によりBMPレセプターであるactivine type II receptor (ACTRII)への結合能が実質的に保持されることを意味する。或いは、安定性の確認は、逆相HPLC（例えば、C4カラム；移動相A, 0.1% TFA；移動相B, 100%アセトニトリル；流速, 1ml/min；グラジエント, 0%Aから100%B, 20min）によって行うことも可能である。
　上記溶解工程に続いて、組換えヒトBMPの塩酸溶液から水を除去する乾燥工程を付加することができる。
　乾燥は、減圧下での水分蒸発、凍結乾燥などを含む。水分蒸発の場合には、蛋白質の分解を抑制するために、組換えヒトBMPの塩酸溶液の温度が30℃以下、好ましくは20℃以下、より好ましくは10℃以下であるべきである。好ましい乾燥は、凍結乾燥である。この手法は、BMP塩酸溶液を凍結したのち、真空下で水分を蒸発させることを含む。
　本発明の方法では、糖類、蛋白質、界面活性剤、アミノ酸などの安定化剤を添加することなく凍結乾燥しても、実質的にBMP活性を損なうことがない。特開2008-231091号公報によれば、蛋白質を凍結乾燥するときの蛋白質の損傷について記載されており、BMP蛋白質に安定化剤としてトレハロースを添加することが推奨されていることに鑑みれば、本発明の方法は、非常に簡易であり、また、かような安定化剤を添加することなく蛋白質を安定に製造することができる点で驚くべきことである。
　本発明の方法で製造された溶液又は固体形態の組換えヒトBMPは、10℃以下、好ましくは4℃又は5℃の低温下で3ヶ月以上にわたって安定に保存することができる。組換えヒトBMPは、たとえ凍結融解しても実質的に完全に活性を保持するし、また、40℃での保存では50％以上、通常60％以上の残存活性を有する。
　本発明の方法では、原核生物細胞、好ましくは大腸菌、で製造された組換えヒトBMPが使用されるが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの真核生物細胞で製造される場合と比べて、大量生産が可能であるという利点を有する一方、糖鎖のない組換え蛋白質であるために、凝集性、溶解性、保存安定性など解決すべき課題があり、実用化がなされていなかった。本発明は、これらの課題を同時に解決することを可能にする。
（組換えヒトBMP）
　上記の方法で作製された組換えヒトBMPは、改善された保存安定性を有する。蛋白質の形態は、上記濃度又はpH範囲内の塩酸溶液又は乾燥固体のいずれでもよく、好ましくは凍結乾燥固体である。
　本発明の組換えヒトBMPは、上記のとおり、BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7（OP-1とも呼ばれる）、BMP-8b（OP-2とも呼ばれる）、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-15などのヒトBMPファミリーメンバー、ヒトGDFファミリーメンバーのGDF-5など、並びに、これらのメンバーの実質的に同等の生物学的活性をもつ変異体及び誘導体が含まれ、好ましいメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、BMP-8b及びGDF-5であり、より好ましいメンバーは、BMP-2、BMP-4、BMP-6及びBMP-7であり、さらに好ましいメンバーは、BMP-2である。これらの天然型ヒトBMP蛋白質、変異体及び誘導体については、上記組換えヒト骨形成蛋白質の欄で説明したとおりである。
　本発明の組換えヒトBMPは、原核生物細胞、好ましくは大腸菌、で製造されるため、糖鎖を含まない蛋白質である。該蛋白質を上記塩酸溶液で処理することによって得られる本発明の組換えヒトBMPは、塩酸溶液又は凍結乾燥固体の形態で3ヶ月間冷蔵(5℃)保存しても、又は冷凍保存しても、実質的に失活しない。また、水で再溶解したときのpH範囲が、好ましくは3.7以上4.6以下であるという特徴も有している。さらにまた、本発明の組換えヒトBMPには、糖類、蛋白質、界面活性剤、アミノ酸などの安定化剤、或いはグリシンバッファなどの緩衝剤、などの物質を敢えて加えなくとも安定であるという特徴も有する。また、本発明の組換えヒトBMPでは、塩基性アミノ酸残基やN末端アミノ基と塩酸とが反応して四級塩を形成している。総じて、本発明の方法で製造された組換えヒトBMPは、実質的に凝集を起こし難く、未処理の組換えBMPと比べて高い保存安定性を有する。
(医薬製剤又はキット)
　本発明はさらに上記の方法で製造された組換えヒトBMPを含有する医薬製剤又はキットを提供する。
　本発明の医薬製剤は、BMPの塩酸溶液の形態であってもよいし、或いはBMPの塩酸溶液を乾燥した固体の形態でもよい。好ましい形態は、凍結乾燥形態である。医薬製剤に安定化剤を添加することは可能であるが、安定化剤が不在であっても冷蔵下で保存されるならば長期間にわたって安定に存在しうる。それゆえ、凍結乾燥製剤であれば、賦形剤、担体、添加剤などは実質的に不要であり、そのまま医療用途に使用可能である。本発明の製剤には、しかしながら必要に応じて、製薬上許容される、賦形剤、担体、添加剤、他の骨誘導活性を有する薬剤、骨疾患治療剤などの物質を加えることも可能である。
　本発明の医薬製剤は、骨の誘導活性を有するため、骨の再生、修復又は治療に使用されうる。
　骨の再生のためには、骨形成蛋白質(BMP)、幹細胞及び足場が必要である。足場としては、例えばポリ乳酸(PLA)、ポリラクチルグリコレート(PLGA)、PLA-PEG、PLGA-PEG（ここでPEGは、ポリエチレングリコールを表す）などの合成ポリマー、ヒアルロン酸、コラーゲン、アテロコラーゲンなどの天然高分子、ヒドロキシアパタイト、β-リン酸三カルシウム(β-TCP)、α-TCPなどのリン酸カルシウムなどが挙げられる。実際には、多孔性の足場（例えば、顆粒、スポンジ、ブロック、ゲルなどの形態をもつ）とBMP溶液(溶媒：例えば滅菌水又は生理食塩水)を混ぜて、骨の患部、例えば骨折部位、欠損部位、障害部位などに埋め込むことによって、内在性幹細胞の作用によって骨組織が再生されると考えられる。足場が顆粒の場合には、整形外科で使用するとき3～5mmメッシュの篩を通過する粒径サイズのもの、一方、歯科で使用するとき0.5～1.5mmメッシュの篩を通過する粒径サイズのものが、一般に使用される。本発明の医薬製剤には、BMPと足場を混合した形態、足場にBMPを塗布した形態、足場にBMPを吸着させた形態などが含まれる。
　本発明の方法によって得られた安定化組換えヒトBMPのヒトでの臨床投与量（単回の埋植または注入）は、投与部位や欠損の大きさ、組み合わせる足場（コラーゲン、骨補填材、高分子ゲル等）によって至適量は異なるが、一般に骨補填体積1cm3あたり0.2～3mg程度（ダイマーとしての重量）であり、例えば補填体積が0.5～20cm3程度の部位の場合、0.1～60mg/患者の範囲である。しかし、投与量は、患者の性別、年齢、体重、重篤度などの諸条件によって変化可能である。
　本発明の医薬製剤は、骨欠損の再生や補填、骨折の早期治癒、軟骨、腱、靭帯、椎間板、半月板、歯槽骨などの骨の障害部位の再生及び治療などのために使用できる。BMPは、骨誘導能が高く、低侵襲性であり、品質管理や供給が安定するという利点があるため、上記のような医療用途での使用が期待される。
　本発明は、組換えヒトBMP及びリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキットを提供する。
　リン酸カルシウム系骨補填材は、例えばヒドロキシアパタイト、β-TCP及びα-TCPなどの骨補填材を含むが、これらに限定されない。
　キットにはさらに、使用説明書、注射用水を含むシリンジ、滅菌済みトレー、滅菌済みスパチュラなどを含んでもよい。この場合、シリンジのなかでBMPを溶解し、トレー内のリン酸カルシウム系骨補填材(顆粒)にまんべんなくふりかけ、スパチュラで混ぜ合わせる。このようなキットは、治療の直前にBMPを再構成又は再溶解することを意図したものである。
(実施例)
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
BMPの安定化のための塩酸溶液の最適濃度及びpH範囲の決定
　大腸菌BL-21を利用して、N末端領域に特徴的な配列を含むヒト骨形成タンパク質（BMP）2遺伝子の成熟型領域（配列番号2の283位～396位のアミノ酸配列）を含む遺伝子を発現させ、既知の方法を用いて封入体の回収、リフォールディング、二量体の回収を行った。最終精製後の組換えヒトBMP溶液は、適当な濃度の塩酸溶液に置換することによって、最終産物とした。この大腸菌で新たに生産されたBMP溶液の酸安定性と温度安定性を中心的に、生化学的手法によりその特徴付けを試みた。
　BMP溶液は、最終的に塩酸溶液で置換するため、まず塩酸に対するBMPの安定性の確認を行った。その方法として、BMP溶液の最終濃度が5mg/mlになるように、1mM、10mM、100mM、1M、4M、12Mの塩酸で溶解した。各BMP溶液から、0時間後、24時間後、48時間後、120時間後に採取し、２－メルカプトエタノールを含む還元条件でSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）用試料を作成した。SDS-PAGEは、各レーンにBMPが5μgとなるように添加し、200Vの定電圧で45分間泳動した。その後、クマシーブリリアントブルー（CBB）で染色し、13kDa付近に検出されるBMPの分解等を観察した。その結果、1mMから100mMでは、120時間後でも全く変化が観察されなかった。一方1Mの塩酸濃度では、120時間後までに若干の分解が観察され、12Mのいわゆる濃塩酸では、0時間目からBMPの分解が観察され、48時間以降はほとんどのBMPが分解された。
　SDS-PAGEの結果から、BMPは塩酸に対して比較的強そうであることが示唆されたが、見た目の変化がなくても活性が失活している可能性もあることから、BMP受容体の1つであるアクチビン受容体II型B（ActRIIB）（ドイツ国Wuerzburg Universityより入手）をリガンドしたBiacore分析を行った（BMC Structural Biology 2007 Feb 12;7:6., A silent H-bond can be mutationally activated for high-affinity interaction of BMP-2 and activin type IIB receptor, Weber D, Kotzsch A, Nickel J, Harth S, Seher A, Mueller U, Sebald W, and Mueller TD）。その結果、SDS-PAGEの結果と同様に、1mMから100mMでは、全くActRIIBへの結合能が変化しなかったのに対して、1Mでは、80％程度の結合能、4Mでは70％（0時間）から50％（120時間後）、12Mでは50％（0時間）から0％（120時間後）へ結合能が減少することがわかった(表1)。これらの結果から、BMP溶液の溶媒置換に、100mM以下の塩酸がまったく問題ないことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記のこれらの実験において、１M以上の塩酸による溶媒置換では、白濁して一部のBMPが沈殿してしまう現象が生じた。そこで次にBMPの白濁を伴わない塩酸の溶解限界濃度の検索を行った。その結果、5mg/mlの条件下では330mM以下の塩酸濃度では白濁が生じないことが判明した。この際のpHが0.2であったことから、塩酸で置換されたBMP溶液のpHが、0.2～4.6の範囲となることが重要であることが分かった。
BMPの安定性の分析
　これまでBMPのようなタンパク質の安定的な保存には、-80℃で冷凍保存することが常識であった。多くのタンパク質は、上記の温度で安定に保存できる一方で、使用による繰り返しの凍結融解によって、その機能が失われることがたびたび問題となることがあった。また、長期の安定保存のために凍結乾燥が行われることもよくあるが、同作業もタンパク質には多大な悪影響を与える場合があるために、血清アルブミンなどの保護タンパク質や何らかの賦形剤を入れることが一般的であった。これらの一般的常識をふまえ、BMPが、様々な温度による保存、凍結融解の繰り返し、および凍結乾燥に対して、どのような特性を有しているのか分析した。
　最終濃度が5mg/mlになるように、0.5mMと1mMの塩酸で組換えヒトBMP-2（実施例1参照）の溶液を作成し、-80℃による冷凍保存、5℃による冷蔵保存および40℃の定温装置にBMP溶液を保存した。各BMP溶液から、0日後、1週間後、2週間後、3週間後、4週間後、2ヶ月後および3ヶ月後に採取し、2－メルカプトエタノールを含む還元条件でSDS-PAGE用試料を作成した。SDS-PAGEは、各レーンにBMPが5μgとなるように添加し、200Vの定電圧で45分間泳動した。その後、CBBで染色し、13kDa付近に検出されるBMPの分解等を観察した。-80℃での冷凍保存と凍結融解の繰り返し、および5℃による冷蔵保存は、3ヶ月後でも全く変化がないことが分かった。40℃による高温保存では、ある程度の分解が進んでいることが確認された(図1)。
　さらに詳しく分析するために、C4カラム(Grace Vydac 214TP54;5μmポア)を用いた逆相のHPLC分析をおこなった。移動相Aには、0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）入りの精製水、移動相Bには100％アセトニトリルを使用した。流速は1ml/minで、試料の添加後に移動相Aで15分間洗浄し、20分で0％Bから100％Bになるようなグラジエント溶出を行い、278nmでその溶出液を検出した。添加試料は、100ugのBMPを5mlの移動相Aで希釈し、その全量をカラムに添加した。その結果、SDA-PAGEの結果ど同様に主要ピークの保持時間・ピーク面積に顕著な差異は検出されなかった(図2)。
　そこでBiacore分析によりActRIIBへの結合を測定したところ、SDS-PAGE/HPLCの結果と同様、-80℃および5℃で3ヶ月間保存したBMP溶液の活性がまったく同等であり、-80℃という特別な環境でなくとも、一般的な冷蔵庫で十分に安定保存できるという驚くべき特徴を有していることが判明した。一方、40℃の保存でも、60～70％程度のActRIIBへの結合活性を保持していた。(表2)
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　凍結乾燥によるBMPへの影響を調べるために、最終精製後0.5mMの塩酸で置換したBMP溶液を、5mg/mlとなるように等量ずつ分注し、一度も凍結乾燥しない試料、1回の凍結乾燥をした試料、および1回目の凍結乾燥後に0.5ｍMの塩酸で再溶解し、さらに2回目の凍結乾燥した試料を用いて、Biacore分析によるActRIIBへの結合活性を測定した。その結果、BSAなどの保護タンパク質および賦形剤の添加がなくても、凍結乾燥による受容体への結合活性に影響が全くないことが判明した(表3)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上の結果から、本発明者らが作製した大腸菌を利用し生産したBMPの最大の特徴としては、pHが4.6から0.2となるように塩酸で綺麗に溶解し、5℃以下の温度でActRIIBへの結合能を失うことなく、安定に保存できるBMP製剤であると結論付けられた。
　本発明により、大腸菌などの原核生物細胞で製造された組換えヒトBMPを医療目的に使用可能になった。BMPは骨の再生及び治療のために有用な蛋白質であるので、医療分野においての役割が期待される。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (16)

  1. 　原核生物で産生された組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を、0.01mM以上から330mM以下の濃度範囲の塩酸溶液に溶解する工程を含むことを特徴とする、改善された保存安定性を有する組換えBMPを製造する方法。
  2. 　塩酸溶液のpH範囲が0.2以上4.6以下である、請求項1に記載の方法。
  3. 　塩酸溶液のpH範囲が3.7以上4.6以下である、請求項2に記載の方法。
  4. 　原核生物が大腸菌である、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　BMPが組換えBMP-2である、請求項1～4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 　BMPの塩酸溶液を乾燥することをさらに含む、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 　乾燥が凍結乾燥である、請求項6に記載の方法。
  8. 　請求項1～7のいずれか1項に記載の方法で製造された、改善された保存安定性を有する組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)。
  9. 　組換えBMPがBMP-2である、請求項8に記載の組換えヒト骨形成蛋白質。
  10. 　凍結乾燥されている、請求項8又は9に記載の組換えヒト骨形成蛋白質。
  11. 　水で再溶解したときのpH範囲が3.7以上4.6以下である、請求項8～10のいずれか1項に記載の組換えヒト骨形成蛋白質。
  12. 　請求項8～11のいずれか1項に記載の組換えヒト骨形成蛋白質(BMP)を含有する医薬製剤。
  13. 　凍結乾燥製剤である、請求項12に記載の医薬製剤。
  14. 　骨の再生又は治療に使用される、請求項12又は13に記載の医薬製剤。
  15. 　請求項8～11のいずれか1項に記載の組換えヒト骨形成蛋白質及びリン酸カルシウム系骨補填材をそれぞれ別個の容器に含んでなる、骨の再生又は治療のためのキット。
  16. 　リン酸カルシウム系骨補填材がヒドロキシアパタイト、β-TCP又はα-TCPである、請求項15に記載のキット。
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