CN110665060A - 一种骨修复材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于含活性蛋白的生物医学材料领域和再生医学领域，具体地，本申请涉及一种含贻贝粘蛋白、rhBMP‑2和含钙基质的骨修复材料。该材料可用于骨损伤的修复。一种骨修复材料，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：含钙基质60‑95%，贻贝粘蛋白0.5‑5.0%，rhBMP‑20.01‑5.0%。该骨修复材料采用贻贝粘蛋白，可能获得对BMP‑2的长期缓释性能，配合羟基磷灰石等含钙基质后也达到了适合的机械强度。在体外释放实验和动物实验中均取得了显著优于现有类似材料的效果。

Description

一种骨修复材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于含活性蛋白的生物医学材料领域和再生医学领域，具体地，本申请涉及一种含贻贝粘蛋白、rhBMP-2和含钙基质的骨修复材料。该材料可用于骨损伤的修复。

背景技术

骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2、BMP-2)是1965年由Marshall R.Urist进行成骨实验时发现的促进骨生成的关键因子。BMP-2属于TGF-α家族，其由成骨细胞分泌,并作用于成骨细胞,BMP-2为细胞分化成矿物质沉积成骨细胞的主要信号分子，起到诱导成骨细胞分化的作用。在肢体生长、软骨内骨化、骨折时表达,在骨骼生长发育和再生修复起重要作用。由于BMP-2有显著的刺激新骨形成的作用,其被认为是治疗骨折、骨缺损等疾病的有前景的活性成分，在脊柱融合和关节融合等情况下，还可以作为骨移植的替代医疗方案(此类应用已经经过FDA批准)。

BMP-2的主要缺点在于其半衰期短,静脉注射后的t1/2仅6-7min，并且容易因新陈代谢过程、生理环境变化，或与酶的作用而变性。因此注射、口服等给药途径即使大剂量持续给药也往往不能提供给靶部位持续有效的浓度，对于需要长时间生长和恢复的骨骼来说无法提供良好的治疗效果，并且容易引起患者成骨质量低、炎症反应以及其他潜在的风险。因此，选择适合的递送方式，例如将BMP-2置于骨修复材料中是实现BMP-2广泛应用，并提高其疗效的关键。

贻贝粘蛋白(mussel adhesive protein，MAP)为贻贝足部分泌腺分泌出的一种蛋白复合物，其超强的粘性是贻贝可以牢固附着于礁石上不怕海浪冲击的关键。贻贝粘蛋白具有粘合范围广，强度高，防水性好，生物亲和性和降解性好等优点，被认为是良好的生物粘合剂。将贻贝粘蛋白粘合剂负载上BMP-2，利用其强粘合特性和BMP-2促骨生长功能治疗骨折等疾病，特别是粉碎性骨折等固定困难的情况，是一类有前景的药剂。

申请人申请中国发明专利(申请号：2019107933661)涉及一种粘合剂试剂盒，其包括独立包装的修饰的贻贝粘蛋白、Tween表面活性剂、BMP以及5％醋酸溶液。该粘合剂用于固定断骨治疗骨折时粘合强度和骨骼恢复的效果明显优于现有类似粘合剂产品。但是该专利没有涉及将贻贝粘蛋白直接应用于骨修复材料。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种骨修复材料，该骨修复材料采用贻贝粘蛋白，可能获得对BMP-2的长期缓释性能，配合羟基磷灰石等含钙基质后也达到了适合的机械强度。在体外释放实验和动物实验中均取得了显著优于现有类似材料的效果。

为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：

一种骨修复材料，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：

含钙基质 60-95％

贻贝粘蛋白 0.5-5.0％

rhBMP-2 0.01-5.0％。

作为优选，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：

含钙基质 80-92％

贻贝粘蛋白 1.0-4.0％

rhBMP-2 0.05-2.0％。

作为优选，钙基质选自羟基磷灰石、磷酸钙、硫酸钙中一种或多种。

作为优选，该骨修复材料还包括Tween表面活性剂，按重量百分比计Tween表面活性剂为1.0-10.0％。

作为优选，该骨修复材料还包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，按重量百分比计磷酸氢二钠0.5％-2.5％，磷酸二氢钠0.5％-2.5％。

作为优选，所述的贻贝粘蛋白为糖基化修饰。

进一步，所述的修饰的贻贝粘蛋白为D-氨基半乳糖糖基化修饰。

再进一步，所述的修饰的贻贝粘蛋白的制备过程为：将贻贝粘蛋白配制为0.5％浓度的悬液，向悬液中加入贻贝粘蛋白质量5倍D-氨基半乳糖以及20U/g贻贝粘蛋白的谷氨酰胺转氨酶，调pH至7.0，在40℃下反应4h，80℃下灭活酶5min，透析24h除去多余的D-氨基半乳糖，冻干得修饰的贻贝粘蛋白。

本申请中的贻贝粘蛋白可以选用贻贝足部提取的贻贝粘蛋白产品，如市售贻贝粘蛋白成品BD Bioscience的CELL-TAK，或者自行以现有技术记载的方法或者在此基础上改进的方法提取的各种类贻贝的贻贝粘蛋白；也可以在粘度等特性允许的情况下选用基因工程方法制备的各种Mefp蛋白，包括但不限于Mefp-1至Mefp-6。

上述贻贝包括但不限于紫贻贝、厚壳贻贝、翡翠贻贝等。

本申请中的rH-BMP2可以为各种来源的，具有骨形成活性的rH-BMP2蛋白，蛋白突变体，蛋白活性片段；来源其可以从天然产物中提取或者以基因工程方法从各种宿主菌种表达获得(基因序列可以从Genbank、EMBL等途径获得)；rH-BMP2可以由实施主体自行提取/表达获得，也可以是购自市场的成品。

优选，所述的rH-BMP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，编辑该氨基酸序列的基因序列为SEQ ID NO.1；或者，rH-BMP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，编辑该氨基酸序列的基因序列为SEQ ID NO.3。

本申请还公开了一种制备所述的骨修复材料的方法，该方法包括以下的步骤：

将含钙基质磨均匀，混合，灌装，辐照灭菌制成A瓶；

将贻贝粘蛋白溶解在磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲溶液中，加入rhBMP-2，混合搅拌均匀，灌装，辐照灭菌制成B瓶；

将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配置成5％-15％水溶液，灌装，高温蒸汽灭菌制成C瓶；

临用前将A、B、C瓶在无菌容器内混匀，制成所需形状使用或制成注射剂形态，注射使用。

本申请还公开了所述的骨修复材料在修复骨损伤中的应用。进一步，其中骨损伤为骨缺损、骨不连、骨愈合延迟。除各种严重程度和形式的骨折外，本申请的粘合剂还可以用于其他各种骨损伤、治疗性骨矫形修复、美容性矫形修复、脊柱融合、关节融合等需要促进骨生长的情形。

附图说明

图1实施例1产品埋植实验完成后0、4、8、12周后大耳白兔X光放射学检查照片。

图2实施例2产品埋植实验完成后0、4、8、12周后大耳白兔X光放射学检查照片。

图3改性壳聚糖骨修复材料埋植实验完成后0、4、8、12周后大耳白兔X光放射学检查照片。

图4不做任何处理0、4、8、12周后大耳白兔X光放射学检查照片。

具体实施方式

主要试剂和仪器

CELL-TAK天然贻贝粘蛋白提取物产品：BD Bioscience生产，标明为紫贻贝产品，含Mefp-2、Mefp-2、Mefp-3；

BMP-2由企业自行生产，具体生产过程参照申请人CN201910030649.0号中国专利申请中的生产方法(大肠杆菌中表达，离子交换层析纯化，检测大肠杆菌宿主残留蛋白<0.005％)，抑菌圈法检测抗生素残留<0.1ppm；

D-氨基半乳糖、谷氨酰胺转氨酶/TGase、Tween 80购自SIGMA/MERCK；

纤维蛋白胶(FG)由广州倍绣生物技术有限公司生产；

大肠杆菌宿主残留蛋白检测试剂盒由上海澄绍生物科技有限公司生产；

CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒由大连美仑生物科技有限公司生产；

人BMP-2 ELISA检测试剂盒由天津安诺瑞康生物技术有限公司生产；

MC-949B-KD力学试验机由广州名弛科技有限公司生产；

部分化学修饰操作委托上海开拓者化学研究管理有限公司进行；

部分动物实验委托北京中医药大学科研实验中心/实验动物中心进行；

其余试剂(多为分析纯)和仪器均为国产常规品牌和型号。

实施例1修饰的贻贝粘蛋白的制备

使用双蒸水将CELL-TAK天然贻贝粘蛋白贻贝配制为0.5％浓度的悬液，向悬液中加入贻贝粘蛋白质量5倍D-氨基半乳糖和20U/g贻贝粘蛋白的谷氨酰胺转氨酶，加入NaOH1M调pH至7.0/直接反应(某些批次下悬液pH已接近7)，在40℃水浴中反应4h；随后80℃水浴中灭活谷氨酰胺转氨酶5min；使用1000Da的膜对双蒸水透析24h除去多余的D-氨基半乳糖(换液3次)；冻干得修饰的贻贝粘蛋白。

实施例2

一种骨修复材料，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：

所述的骨修复材料的方法，该方法包括以下的步骤：

1)将含钙基质磨均匀，混合，灌装，辐照灭菌制成A瓶；

2)将修饰贻贝粘蛋白溶解在磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲溶液中，加入rhBMP-2，混合搅拌均匀，灌装，辐照灭菌制成B瓶；

3)将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配置成5％-15％水溶液，灌装，高温蒸汽灭菌制成C瓶；

4)临用前将A、B、C瓶在无菌容器内混匀，制成所需形状，真空干燥使用。

按照试剂盒说明书(CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒，大连美仑生物科技有限公司)进行的CCK-8细胞增殖毒性实验显示该骨修复材料的细胞毒性为CTS 0-I级，初步证实了其安全性。

实施例3

一种骨修复材料，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：

所述的骨修复材料的方法，该方法包括以下的步骤：

1)将含钙基质磨均匀，混合，灌装，辐照灭菌制成A瓶；

2)将修饰贻贝粘蛋白溶解在磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲溶液中，加入rhBMP-2，混合搅拌均匀，灌装，辐照灭菌制成B瓶；

3)将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配置成5％-15％水溶液，灌装，高温蒸汽灭菌制成C瓶；

4)临用前将A、B、C瓶在无菌容器内混匀，制成注射剂使用。

按照试剂盒说明书(CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒，大连美仑生物科技有限公司)进行的CCK-8细胞增殖毒性实验显示该骨修复材料的细胞毒性为CTS 0-I级，初步证实了其安全性。

实施例4材料的rH-BMP2体外释放实验

按照实施例2和3的方法配制骨修复材料和对照骨修复材料各3g(含rH-BMP2142mg)，将其置于透析袋中，透析袋置于20ml含0.2％叠氮化钠的，pH7.0的PBS缓冲液中。静置于37℃下，在12h、24h、120h、168h、336h、504h、672h、840h分别取样1ml(随后补充含0.2％叠氮化钠的，pH7.0的PBS缓冲液1ml)，按照试剂盒的说明以ELISA法测定rH-BMP2浓度，换算计算累计释放百分数。结果如下表所示。

表1，rH-BMP2累计释放百分数

对照材料中的rH-BMP2在168h内基本释放完成(同时材料中的壳聚糖和胶原基本消失)，而改性壳聚糖材料的药物释放时间延长至672(4周)左右，基本与骨修复中的生长初期相对应，不亚于现有文献中提供的很多聚合物微球类材料，并且可以避免聚合物微球降解时的酸性环境和过敏问题。加入tween 80促进贻贝粘蛋白球形片层等微观结构的形成对rhBMP-2白起到了一定的缓释作用，对糖贻贝粘蛋白的糖基化修饰进一步增强了这种缓释作用(机理可能在于糖基化后巯基含量的降低导致的交联性能变化，有更多的微观结构形成或者与BMP接连的位置的保留)，延长至30日以上的BMP-2释放能力应可以更有效的支持骨折骨损处的修复(人骨折后主要修复期一般认为在60日以上)。

实施例4骨修复的兔骨折模型试验

兔骨折模型的制备

选取2.5kg左右的雄性新西兰大耳白兔12只，平均分为4组(粘合剂1、对照粘合剂1、对照粘合剂2、空白)。使用10mg/kg的盐酸氯胺酮耳缘静脉注射麻醉后固定，左前肢脱毛并消毒。

左前肢尺骨侧中段做2cm切口，分离其他组织后，以电锯垂直锯断尺骨造成骨折型破坏。兔骨折模型的处理

生理盐水冲洗骨折处和伤口后，在骨折断裂端之间植入实施例1制备的骨修复材料，注射实施例2所述的骨修复材料，改性壳聚糖骨修复材料(中国发明专利公开号：CN109276761A)，或者不做任何处理，随后加压骨折断裂两端180s后缝合伤口以医用胶带固定伤处。

手术后给予三日抗生素(青霉素100万单位)治疗。

埋植实验完成后0、4、8、12周后，将大耳白兔进行放射学检查(X光)，查看大耳白兔后肢是否出现骨组织，实施例1产品如图1，实施例2产品如图2所示，改性壳聚糖骨修复材料如图3所示，不做任何处理如图4所示。

实施例中使用较为昂贵的CELL-TAK贻贝粘蛋白成品主要原因在于市面上缺少其他优质天然提取贻贝粘蛋白。虽然申请人使用自行提取的贻贝粘蛋白也多能获得类似的效果，但由于贻贝种类/季节原因尚无法提供效果稳定的贻贝粘蛋白来源，不便于研究。因此实验中申请人一直使用CELL-TAK贻贝粘蛋白成品，推向市场时可以考虑进一步稳定并优化粘蛋白提取和修饰过程，使用自提取的贻贝粘蛋白。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 浙江瑞谷生物科技有限公司

<120> 一种骨修复材料及其制备方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2)

<400> 1

atgcaggcga aacacaaaca gcgtaaacgt ctgaaaagca gctgcaaacg tcacccgctg 60

tacgttgatt tcagcgatgt tggctggaac gattggatcg ttgcgccgcc gggctaccac 120

gcgttctact gccacggtga atgcccgttc ccgctggcgg atcacctgaa cagcaccaac 180

cacgcgatcg ttcagaccct ggttaacagc gttaacagca aaatcccgaa agcgtgctgc 240

gttccgaccg aactgtctgc gatcagcatg ctgtaccttg atgaaaacga gaaagtagtg 300

ctgaaaaact atcaagacat ggtggtggaa ggctgtggct gccgttaa 348

<210> 2

<211> 115

<212> PRT

<213> 骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2)

<400> 2

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn

85 90 95

Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys

100 105 110

Gly Cys Arg

115

<210> 3

<211> 348

<212> DNA

<213> 骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2)

<400> 3

atgggtgcaa aacagaaaca acgtaaacgc ctgaagtcct cttgcaagcg tcacccgctg 60

tacgtggatt tttctgacgt tggttggaac gactggattg tggctcctcc gggctatcac 120

gcattctact gtcacggcga gtgcccgttc ccgctggccg atcatctgaa cagcaccaac 180

cacgcgatcg tccagactct ggttaactct gttaactcca aaatcccgaa agcttgttgt 240

gtgccaaccg aactgtccgc gatcagcatg ctgtacctgg acgaaaatga aaaagtagta 300

ctgaaaaact atcaggatat ggttgttgaa ggctgcggtt gccgttaa 348

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2)

<400> 4

Met Gly Ala Lys Gln Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn

85 90 95

Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys

100 105 110

Gly Cys Arg

115

Claims (10)

1.一种骨修复材料，其特征在于，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：

含钙基质 50-95%

贻贝粘蛋白 0.5-5.0%

rhBMP-2 0.01-5.0%。

2.根据权利要求1所述的一种骨修复材料，其特征在于，该骨修复材料按重量百分比计该骨修复材料包括以下组分：

含钙基质 60-92%

贻贝粘蛋白 1.0-4.0%

rhBMP-2 0.05-2.0%。

3.根据权利要求1或2所述的一种骨修复材料，其特征在于，钙基质选自羟基磷灰石、磷酸钙、硫酸钙中一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的一种骨修复材料，其特征在于，该骨修复材料还包括Tween表面活性剂，按重量百分比计Tween表面活性剂为1.0-10.0%。

5.根据权利要求1或2所述的一种骨修复材料，其特征在于，该骨修复材料还包括磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，按重量百分比计磷酸氢二钠0.5%-2.5%，磷酸二氢钠0.5%-2.5%。

6.根据权利要求1或2所述的一种骨修复材料，其特征在于，所述的贻贝粘蛋白为糖基化修饰；优选，修饰的贻贝粘蛋白为D-氨基半乳糖糖基化修饰；再优选，修饰的贻贝粘蛋白的制备过程为：将贻贝粘蛋白配制为0.5%浓度的悬液，向悬液中加入贻贝粘蛋白质量5倍D-氨基半乳糖以及20U/g贻贝粘蛋白的谷氨酰胺转氨酶，调pH至7.0，在40℃下反应4h，80℃下灭活酶5min，透析24h除去多余的D-氨基半乳糖，冻干得修饰的贻贝粘蛋白。

7.根据权利要求1或2所述的一种骨修复材料，其特征在于，rH-BMP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，编辑该氨基酸序列的基因序列为SEQ ID NO.1；或者，rH-BMP2的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，编辑该氨基酸序列的基因序列为SEQ ID NO.3。

8.一种制备权利要求1-7任意一项权利要求所述的骨修复材料的方法，其特征在于，该方法包括以下的步骤：

将含钙基质磨均匀，混合，灌装，辐照灭菌制成A瓶；

将贻贝粘蛋白溶解在磷酸氢二钠和磷酸二氢钠缓冲溶液中，加入rhBMP-2，混合搅拌均匀，灌装，辐照灭菌制成B瓶；

将磷酸氢二钠与磷酸二氢钠配置成5%-15%水溶液，灌装，高温蒸汽灭菌制成C瓶；

临用前将A、B、C瓶在无菌容器内混匀，制成所需形状使用或制成注射剂形态，注射使用。

9.权利要求1-7任一项的骨修复材料在修复骨损伤中的应用。

10.权利要求9的应用，其中骨损伤为骨缺损、骨不连、骨愈合延迟。

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