JPH10502664A - 硬組織刺激剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 硬組織の再生を剌激することができる作用剤を製造するための、キトサンと、それに固定された、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびデキストラン硫酸から選ばれる多糖の使用；いわゆるオセオインテグレーションとの関連において硬組織の再生を剌激する方法；並びに、硬組織（特に骨組織）への組み込みを意図したインプラント。

Description

【発明の詳細な説明】 硬組織剌激剤技術分野 本発明は、いわゆるオセオインテグレーション(osseointegration)と関連した 硬組織の再生を剌激または促進するための新規な技法に関し、例えば、その効果 は硬組織（特に骨組織）内への異種インプラントの移植において求められている 。本発明はまた、本発明による新規技法を用いてこのようなオセオインテグレー ションを行う方法に関する。さらに、本発明は、骨組織の欠損または骨組織の要 求と関連した新たな骨の形成に関する。発明の背景 硬組織（特に骨組織）内に固定することを目的としたインプラントは歯科、整 形外科、神経外科、形成外科および再建手術などにおいて次第に使用されるよう になってきている。骨内にインプラントを長期にわたって固定することはチタン を用いて行われており、将来もチタンをベースとした材料がインプラントや補て つ物の最良の材料として大いに使用されると予想される。 いわゆるオセオインテグレーションを扱うときの臨床上の問題は、十分な骨固 定（６〜９ヵ月を要するかもしれない）が達成される前にはインプラントに圧力 をかけられないということである。したがって、インプラントに関連して骨形成 を剌激することにより治癒過程を促進することが臨床的に最も重要となる。また 、例えばあごの歯のない部分で骨吸収が生じたり、例えば外傷、腫瘍、外科手術 などにより骨組織が失われたりした欠損部を橋架けするために骨を再生させる必 要性もある。発明の概要 本発明の主な目的は、硬組織の体積が増加するように、硬組織の細胞（例えば 骨細胞）の増殖を刺激することである。 本発明のもう一つの目的は、主に層板状の緻密な型の骨組織を再生させるが、 瘢痕組織の形成を最小限度に抑える手段を提供することである。 本発明の更なる目的は、硬組織内のインプラントに関連して、硬組織（例えば 骨組織）の再生を剌激することができる新規な作用剤を提供することである。 本発明の他の目的は、硬組織の再生を剌激しつつ硬組織内への異種インプラン トの移植に関連したオセオインテグレーションの改良方法を提供することである 。 本発明の他の目的は、硬組織の再生を刺激する作用剤により処理されたインプ ラントを提供することである。 これらおよび他の目的は以下の説明から明らかになるだろうが、こうした目的 のために、キトサンと、これに固定された、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロ イチン硫酸およびデキストラン硫酸から選ばれる多糖と、の新規な使用が本発明 により提供される。この新規な使用は硬組織の再生を刺激することができる作用 剤の製造に関係する。こうした硬組織再生の刺激は、例えば、骨組織のような硬 組織内のインプラントとの関連において提供される。 多糖はいくつかの方法で、例えばイオン結合により、共有結合（マルチポイン ト結合かエンドポイント結合のいずれか）により、または溶液からのキトサンの 沈殿と関連したキトサンマトリックス内への機械的固定により、キトサンマトリ ックスに固定することができる。イオン結合と共有結合が好ましい固定化形態で ある。 本発明による硬組織刺激剤はさまざまな物理的形態で存在することができ、例 えば膜、粉末、ゲル、ビーズまたは溶液として存在し得る。インプラントを予定 している場合には、硬組織内に組み込まれるインプラントの部分を浸漬して、イ ンプラントに作用剤を塗布することができる。もちろん、作用剤を硬組織そのも のに、例えば骨組織にできた空洞に、供給することも可能である。 移植に適した材料はチタンであるが、他のインプラント材料も同様に使用する ことができる。 キトサンはβ-D-グルコースアミン単位から構成された直鎖状の1,4-結合多糖 である。キトサンは、特に昆虫や甲殻類の外殻を形成するポリマーであるキチン のN-脱アセチル化により製造される。商業的には、キチンは水産物業界からの廃 棄物であるカニとエビの殻から回収されている。キチンのアルカリ処理を制御す ることにより、さまざまな程度にN-アセチル化されたキトサンが得られる。キチ ンを濃アルカリ（通常は水酸化ナトリウム）で処理すると、N-脱アセチル化が起 こり、すなわち、アセトアミド基がアミノ基に変換されてキトサンを生成する。 キトサンの有用性に影響を及ぼすキトサンの物理的性質は、N-アセチル化度、 分子量および均一性によって決まる。キトサンは生物分解性であって、消化系の キチナーゼによっても、体液中のリゾチームや他の酵素によっても分解される。 本発明の使用に関連して、キトサンは多くても約９０％、好ましくは多くても 約５０％のN-アセチル化度をもつことが有利である。特に、N-アセチル化度は約 ２５％より低いことが好適である。 キトサンマトリックスに固定するのに適した多糖はヘパリンまたはヘパラン硫 酸である。アミノ基を含むマトリックスにヘパリンを共有結合させる方法は米国 特許第4,613,665 号に記載されている。 本発明はまた、例えばいわゆるオセオインテグレーションとの関連において、 硬組織の再生を剌激および／または促進する方法を提供する。この方法は、移植 の前に、キトサンとそれに固定されたヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン 硫酸およびデキストラン硫酸から選ばれる多糖から製造された作用剤を、刺激に 適した量で、インプラントおよび／または硬組織に適用することを特徴としてい る。オセオインテグレーションは種々の非自己異種材料製のインプラントを硬組 織（特に骨組織）内に長期間固定するのに最も適した形態である。 この方法を実施するにあたって、作用剤は粉末、溶液、ゲル、ビーズ、フィル ムまたは膜の形で適用することができる。また、硬組織に組み込むべきインプラ ントの部分を、適当な成分キトサンおよびそれに固定される多糖の溶液中に浸漬 することで作用剤を適用してもよい。 本発明はまた、硬組織（特に骨組織）内への組み込みを意図したインプラント を包含する。こうしたインプラントでは、インプラントの組み込まれる部分が、 キトサンとキトサンに固定されたヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸 およびデキストラン硫酸から選ばれる多糖とからなる、硬組織の再生を刺激する 作用剤でコーティングされる。インプラントはチタンで構成されることが好まし い。好適な実施態様の例 非限定的な例を用いて本発明を以下に例示することにする。これらの例におい て、パーセントおよび部は特に指定しないかぎり重量基準である。例１ チタンねじのキトサン被覆 チタンねじをキトサン(1%w/v)の2%酢酸溶液に浸漬し、この溶液中に15分間入 れておいた。キトサンはSea Cure 313（Pronova Biopolymer，N-アセチル化度15 %）であった。次に、処理したチタンねじを70℃の加熱キャビネットに入れて16 時間乾燥させ、その後1M NaOH で中和し、蒸留水で繰り返し洗い、再度加熱キャ ビネットで乾燥させた。このねじを「ピールオープン(peel open)」型のパッケ ージに入れてエチレンオキシドで滅菌した。例２ ヘパリンをイオン結合させたチタンねじ 例１にしたがってキトサンを被覆したねじを、蒸留水500mL 中にヘパリン(Pig Mucosa，Kabivitrum)125mg を溶解した溶液に移し、ねじをその中に16時間入れ ておき、その後蒸留水で洗って室温で乾燥させた。このねじを「ピールオープン 」型のパッケージに入れ、エチレンオキシドで滅菌した。固定化されたヘパリン の量は約２μg/cm²であった。例３ ヘパリンを共有結合させたチタンねじ（エンドポイント結合） ヘパリンを水(300mL)に溶解した。この溶液を氷水中で０℃に冷し、低温に維 持した。最初に亜硝酸ナトリウム(NaNO₂，10mg)を加えた。次に、この溶液に攪 拌しながら酢酸(2mL)を加えた。反応混合物を０℃に２時間維持し、透析し、凍 結乾燥させた。収量は0.7gであった。 例１にしたがってキトサンを被覆したねじを、蒸留水500mL 中に上記の亜硝酸 分解ヘパリン 125mgおよびNaCNBH₃15mgを含む溶液に移し、pHを0.1M HClで3.9に 調整した。この反応混合物を室温に約16時間維持した。次に、ねじを蒸留水で洗 って室温で乾燥させた。処理したねじを「ピールオープン」型のパッケージに入 れ、エチレンオキシドで滅菌した。固定化されたヘパリンの量は約1.5 μg/cm² であった。例４ ヘパリンを共有結合させたチタンねじ（マルチポイント結合） 過ヨウ素酸ナトリウムで酸化したヘパリンナトリウムの溶液を次の方法で調製 した。過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO₄)1gを蒸留水200mLに溶解した。過ヨウ素酸ナ トリウムの溶液にヘパリンナトリウム10g を加え、暗室で一夜攪拌した。得られ た溶液を、グリセロール10mLを添加して２時間攪拌した後に、水に対して透析し た。水を１時間ごとに交換した。これにより、過ヨウ素酸−酸化ヘパリンを約19 mg/mLの濃度で含む溶液が得られた。 例１にしたがってキトサンを被覆したねじを、蒸留水500mL 中に上記の過ヨウ 素酸−酸化ヘパリン 125mgおよびNaCNBH₃15mgを含む溶液に移した。その後例３ に記載したとおりに反応させた。例５ キトサンフィルムの製造 キトサン(アセチル化度 50%；Pronova)の塩酸塩5gを蒸留水(0.5L，1%v/w)に溶 解した。得られた溶液10mLをペトリ皿に移し、蒸発させ、70℃の加熱キャビネッ トに入れて24時間乾燥させてキトサンのフィルムを形成させた。次に、得られた フィルムをリン酸ナトリウム緩衝液，0.2M，pH9.0 の添加により中和した。フィ ルムはペトリ皿中の上記緩衝液に入れたままで室温に２〜４時間保持し、その後 水で３，４回洗い、乾燥させた。例６ ヘパリンを共有結合させたフィルム（エンドポイント結合） 例５にしたがって製造した中和キトサンフィルムに、水0.5Lに溶解した、例３ のようにして製造した亜硝酸分解ヘパリン125mg およびNaCl 4.4g を含む溶液20 mLを添加した。この溶液に水素化シアノホウ素ナトリウム15mgを加えた。この溶 液のpHを0.5M塩酸または他の酸を用いて3.9 に調整した。キトサンフィルムを含 む溶液を室温に14時間放置した後、フィルムを水で３，４回洗い、乾燥させた。例７ ヘパリンを共有結合させたフィルム 例５にしたがって製造した中和キトサンフィルムに、NaCl 4.4g を含む水0.5L に溶解したヘパリン125mg を含む溶液を添加した。キトサンフィルムを含む溶液 を室温に14時間放置した後、フィルムを水で３，４回洗い、乾燥させた。製造し たフィルムは、本発明にしたがってオセオインテグレーションに使用するため、 粉砕することができる。例８ 生物学的試験 実験動物として成熟ウサギを使用したが、ウサギに麻酔をかけて無菌条件下で 手術の準備をした。ウサギの膝部分の毛を取り除いた。 膝関節において骨端軟骨領域の脛骨近位部分に対して35〜40mmの長さを有する 遠位皮膚切開を行った。骨膜を横に切り開き、無菌の緩衝塩溶液の連続供給によ り冷却しながら、3.5mm のドリルを使って低回転速度で、緻密な脚から骨髄腔ま での穴をあけた。次に、六角形の頭部をもつ長さ４mmのチタンねじを近位に、６ mmの別のチタンねじを遠位に入れた（両方のねじの直径は3.5mm）。関節面と皮 膚の傷を一本の糸を用いて縫い合わせた。この実験では、例１〜３にしたがって 処理したチタンねじに加えて未処理のチタンねじも使用した。 ４週間および12週間後にそれぞれ、ウサギに再度麻酔をかけた。膝領域の毛を 切り取り、膝関節から遠位に脛骨の方へ皮膚を切開した。解剖してねじを確認し 、 近位ねじの脱ねじモーメント(dethreading moment)を測定した。遠位ねじは、骨 内に存在するインプラントに関する光学顕微鏡検査のために調製した。例９ ヘパリン被覆を有するまたは有しないチタン粉末 チタン粉末のキトサン被覆は本質的に例１に記載したとおりに行い、固定化は 例３に記載したとおりに行った。 それぞれの後脚の腓骨を露出させ、その筋組織を中幹上で約10mmの長さに沿っ てはぎ取った。露出した腓骨の６mm部分を切除し（骨とその骨膜の両方）、骨端 間の欠損部にチタン粉末を充填した。欠損部を橋架けし、かつその領域に肉芽組 織が侵入するのを防ぐために、PTFE製の膜フィルターを巻きつけた。一方の側に ヘパリン被覆チタン粉末を、他方の側に非被覆チタン粉末を配置した。その後傷 を縫い合わせた。ラットは２回目の検査に先立って３週間無制限に運動させ、そ の後犠牲にした。それぞれの側の腓骨の欠損部を検査したところ、両方の欠損部 を橋架けする格子状および層板状の骨が確認できた。しかしながら、最も広範囲 の骨形成はヘパリン化チタン粉末の部位に沿って見られた。さらに、より層板状 、すなわち明確に組織化された骨がヘパリン化チタン粉末に混じって検出された 。 したがって、上記のようなヘパリン被覆チタン粉末は、骨膜の不在下でさえも 骨の新たな形成を剌激する。例１０ 腓骨間隙架橋技術により評価した、イオン的にヘパリン化したキトサン膜の骨形 成活性 麻酔したラットのそれぞれの後脚の腓骨を露出させ、その筋組織を中幹上で約 10mmの長さに沿ってはぎ取った。露出した腓骨の６mm部分を切除し（骨とその骨 膜の両方）、骨端間の欠損部にキトサンフィルムを巻きつけた。左側には例５の ようにして製造したキトサン膜（アセチル化度 15%）を、右側の腓骨欠損部には 例７のようにして製造したキトサン膜（アセチル化度 15%）を配置した。 骨端間の６mmの間隙を橋架けする膜で作られたチューブが潰れるのを防ぐため に、小さな骨片を間隙に沿って配置した。 ３週間後の検査で、骨マトリックスと骨のより顕著な形成が両動物において右 側に、つまりヘパリン化キトサンフィルムを使用した側に観察された。例１１ 頭蓋冠における穴の骨形成により評価した、ヘパリン化キトサン膜の骨形成活性 ある寸法を超えた欠損部が骨内に作られると、こうした欠損部はその欠損部を 橋架けする繊維性瘢痕組織の膜の形成を伴って治癒することがよく知られている 。成熟ラットでは、頭蓋冠における穴の上限寸法は８mmであり、８mm以上の直径 の穴を骨組織で閉じることはできないだろう。 ラットにおいて、鼻前頭部から外後頭隆起までの傍正中皮膚切開を行った。皮 膚とその下の組織（両側にある大部分の側頭筋を含む）を取り去った。特別に作 製したトレフィンを使って、頭蓋に８mmの穴を両側に開けた。髄膜と脳に損傷を 与えないように細心の注意を払った。 右側には、例９のようにして製造した、ヘパリンをイオン結合させたキトサン 膜を硬膜上に置き、そのキトサン膜上に複数の骨片を置き、さらに頭蓋上に同一 の膜を置いた。その後、左側に、例５のとおりに製造した非ヘパリン化キトサン 膜を、骨片を間隔をおいて配置するとともに、右側と同様に配置した。その後、 帽状腱膜および皮膚を閉じた。 ３週間後、ラットを麻酔し、頭蓋を検査した。より骨状の、新しい骨組織が、 左側と比べて右側の欠損部を覆っていることが実証された。さらに、ヘパリン化 キトサン膜においては炎症反応があまり目立たなかった。例１２ デキストラン硫酸またはヘパリンまたはコンドロイチン-4-硫酸を被覆したキト サンビーズの製造 キトサンの水溶液（2%w/v,アセチル化度 18%）を、トリポリリン酸塩緩衝液中 に溶解したデキストラン硫酸またはヘパリンまたはコンドロイチン-4-硫酸(0.1% w/v)の溶液にシリンジを使って滴下した。得られたビーズをガラスフィル ター上に回収し、水(1L)で洗い、30℃で一夜乾燥させた。例１３ 頭蓋上の骨膜下沈着後の骨形成により評価したキトサンビーズの骨形成活性 頭蓋の骨膜下の骨形成活性について試験しようとする化合物の位置づけは十分 に確立された方法である。 例１２に記載したように、キトサンとヘパリン、デキストラン硫酸を被覆した キトサン、およびコンドロイチン-4-硫酸を被覆したキトサンから作製したビー ズを成熟ラットの前頭骨の骨膜下に配置した。この種のビーズ１個を両側に配置 し、３週間後に骨の形成を評価した。 キトサン−ヘパリンビーズは、前頭骨にある骨状の骨組織の形成により明らか なように、骨形成性であった。コンドロイチン硫酸被覆キトサンビーズおよびデ キストラン硫酸被覆キトサンビーズも骨形成活性を示した。炎症細胞もさまざま な程度（通常は低い）に認められた。これらの実験から、ある種の多糖と組み合 わせたキトサンは骨形成活性を示すことが明らかである。 本発明を増殖因子と組み合わせることにより、治癒の質がより一層高まるであ ろう。ヨウ素125 で標識したaFGF(酸性繊維芽細胞増殖因子，Bachem California )を用いたin vitro実験では、非ヘパリン化ねじと比べて、ヘパリン化ねじに対 する増殖因子の著しく高い特異的結合が示された。本発明はいかなる特定の理論 によっても制限されないが、ねじにキトサン−ヘパリンをコーティングすると、 インプラントと周囲の骨との界面で内因性増殖因子が富化されて、骨再生が剌激 されるようである。 本発明は記載した実施態様に限定されるものではなく、硬組織（特に骨組織） への組み込みを意図したインプラントのあらゆる形態に応用可能である。したが って、本発明はあらゆる分野、例えば歯科、整形外科、神経外科、形成外科およ び再建手術などにおいて使用可能である。また、本発明は歯科用途に関して特に 有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．硬組織の再生を剌激することができる作用剤を製造するための、キトサンと 、それに固定された、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびデキ ストラン硫酸から選ばれる多糖の使用。 ２．硬組織の再生が骨組織のような硬組織内のインプラントとの関連において刺 激される、請求項１に記載の使用。 ３．多糖がイオン結合によってキトサンに固定される、請求項１または２に記載 の使用。 ４．多糖が共有結合によってキトサンに固定される、請求項１または２に記載の 使用。 ５．多糖がヘパリンまたはヘパラン硫酸である、請求項１〜４のいずれか１つに 記載の使用。 ６．作用剤が粉末または溶液の形である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の 使用。 ７．作用剤がゲルの形である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用。 ８．作用剤がビーズの形である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用。 ９．キトサンが多くても約９０％、好ましくは多くても約５０％のN-アセチル化 度を有する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の使用。 10．キトサンが約２５％より低いN-アセチル化度を有する、請求項９に記載の使 用。 11．インプラントがチタンから構成される、請求項2〜10のいずれか１つに記載 の使用。 12．キトサンと、それに固定された、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン 硫酸およびデキストラン硫酸から選ばれる多糖と、からなる作用剤を、剌激有効 量で適当な部位に適用することを特徴とする、硬組織の再生を剌激および／また は促進する方法。 13．再生がオセオインテグレーション(osseointegration)に関連している、請求 項12に記載の方法。 14．オセオインテグレーションが骨組織のような硬組織内のインプラントとの関 連において行われる、請求項13に記載の方法。 15．作用剤が粉末の形で適用される、請求項12〜14のいずれか１つに記載の方法 。 16．作用剤がゲルの形で適用される、請求項12〜14のいずれか１つに記載の方法 。 17．多糖がヘパリンまたはヘパラン硫酸により構成される、請求項12〜16のいず れか１つに記載の方法。 18．作用剤が、硬組織に組み込もうとするインプラントの部分をキトサンと多糖 の溶液中に浸漬することにより適用される、請求項13、14または17に記載の方法 。 19．インプラントの少なくとも組み込もうとする部分が、キトサンと、それに固 定された、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸およびデキストラン硫 酸から選ばれる多糖とからなる、硬組織の再生を刺激する作用剤でコーティング されていることを特徴とする、硬組織内への組み込みを意図したインプラント。 20．チタンから構成されている、請求項19に記載のインプラント。