KR100395724B1 - 경조직자극제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경조직의 자극된 재생을 제공할 수 있는 자극제를 제조하기 위한 키토산, 및 그에 고정되고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 및 덱스트란 술페이트로 이루어진 군으로 부터 선택되는 폴리사카라이드의 용도, 소위 골융합화와 관련하여 경조직의 자극된 재생 방법, 및 경조직, 특히 골조직에 융합될 이식물에 관한 것이다.

Description

경조직 자극제{Hard Tissue Stimulating Agent}

경조직, 특히 골조직에 고정하기 위한 이식물의 사용이 치학, 정형 외과학, 신경 외과학, 수(手) 외과학, 재건 외과학 및 성형 외과학에서 계속해서 증가하고 있다. 뼈에서 이식물의 장기간 고정은 티타늄을 사용하여 이루어져 왔고, 티타늄을 기재로한 물질도 미래에 이식물 및 이식 기관의 대체물로서 널리 사용될 수 있으리라 예상된다.

소위 골 융합화를 다루는데 있어서 임상적 문제는 6 내지 9개월을 요할 수 있는 충분한 골 고정이 이루어지기 전에는 이식물에 부하가 가해질 수 없다는 것이다. 그러므로, 이식물과 관련하여 골 형성을 자극함으로써 치료 방법을 증진시키는 것이 임상적으로 가장 중요하다. 또한 골 재흡수가 일어나는 곳, 예를 들어 턱에서 치아가 없는 부위 또는, 외상, 종양 또는 외과 시술에 의해 골조직을 상실한 결손 부위 또는 절단 영역을 브릿지하기 위하여 골을 재생할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명의 주 목적은 경조직의 부피를 증가시키기 위하여 경조직 세포, 예를 들어 골 세포의 증식을 자극시키는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 반흔 (scar)의 형성도를 최소화하는 반면, 주로 적층, 밀집형인 재생된 골조직을 형성하는 수단을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 경조직에서의 이식물과 관련하여 경조직, 예를 들어 골조직의 재생을 자극할 수 있는 신규 자극제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 조직의 재생을 자극시키면서 경조직에서 외부 이식물을 이식하는 것과 관련하여 자극된 골 융합화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 경조직의 재생 자극제로 처리된 이식물을 제공하는 것이다.

하기에 기재된 바에 의해 명백해질 이러한 목적 및 다른 목적을 위하여, 본 발명은 키토산, 및 그에 고정되고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트 및 덱스트란 술페이트로 이루어진 군으로 부터 선택되는 폴리사카라이드의 신규한 용도를 제공한다. 이 신규한 용도는 경조직의 재생을 자극할 수 있는 자극제의 제조에 관련된 것이다. 이러한 자극된 재생은 경조직, 예를 들어, 골조직에서의 이식물과 관련되어 제공될 수 있다.

폴리사카라이드는 여러가지 방법, 예를 들어 이온 결합, 다중점 또는 종말점결합에 의한 공유 결합에 의해, 또는 용액으로부터 키토산의 침전화와 관련되어 키토산 매트릭스 내에 기계적으로 고정됨으로써 키토산 매트릭스에 고정될 수 있다. 이온 결합 및 공유 결합이 바람직한 고정 형태이다.

본 발명의 경조직 자극제는 상이한 물리적 형태, 예를 들어 막, 분말, 겔, 구슬 또는 용액으로 존재할 수 있다. 이식하려는 곳에서, 이식물 위에 자극제가 도포될 수 있도록 경조직에서 융합될 이식물 부위를 침지시킬 수 있다. 물론 자극제가 경조직 그 자체에 예를 들어, 골조직 중의 구멍 중에 공급될 수 있다.

이식하기에 바람직한 물질은 티타늄이나, 다른 이식 물질도 사용될 수 있다.

키토산은 β-D-글루코스 아민 단위로부터 구성된 선형의 1,4-결합 폴리사카라이드이다. 키토산은 키틴, 즉 곤충 및 조개류의 껍질을 형성하는 중합체를 N-탈아세틸화시킴으로써 제작된다. 상업적으로 키틴은 어류 산업의 폐기물을 구성하는 게 및 새우 껍질로부터 회수된다. 키틴의 알칼리 처리를 조절함으로써, N-아세틸화도가 다양한 키토산을 얻을 수 있다. 키틴을 진한 알칼리, 통상적으로 수산화나트륨으로 처리할 때, N-탈아세틸화가 일어난다. 즉, 아세트아미노기가 아미노기로 전환되어 키토산을 형성한다.

키토산의 유용성에 영향을 미치는 물리적 특성은 N-아세틸화, 분자량 및 균질성 정도에 좌우된다. 키토산은 소화계에서 키티나 및 체내의 라이소자임 및 다른 효소 모두에 의해 생분해될 수 있다.

본 발명의 용도와 관련되어 키토산은 N-아세틸화도가 최대 약 90%이고, 바람직하게는 최대 약 50%이다. 특히 바람직하게는 N-아세틸화도는 약 25% 미만이다.

키토산 매트릭스에 대한 고정을 위해 바람직한 폴리사카라이드는 헤파린 또는 헤파란 술페이트이다. 헤파린을 아미노기를 함유하는 매트릭스에 공유 커플링시키기 위한 특정 기술은 미국 특허 제4,613,665호에 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 예를 들어, 소위 골 융합화와 관련하여 경조직의 재생을 자극 및(또는) 촉진하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 이식하기 전에 이식물 및(또는) 경조직에 키토산, 및 그에 고정되고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴술페이트 및 덱스트란 술페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리사카라이드로부터 제조된 특정 자극제를 자극에 적절한 정량만큼 도포하는 것을 특징으로 한다. 골융합화는 자가조직이 아닌 각종의 외부 물질로된 이식물을 경조직, 특히 골조직에 장기간 고정하기 위한 최적의 형태이다.

이 방법을 수행하는데 있어서, 자극제를 분말, 용액, 겔, 구슬, 필름 또는 막의 형태로 도포할 수 있다. 별법으로 경조직에 융합될 이식물의 부위를 키토산 및 그에 고정된 폴리사카라이드의 적절한 구성체의 용액에 침지시킴으로써 자극제를 도포시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 경조직, 특히 골조직에 융합될 이식물을 포함한다. 이러한 이식물에 있어서, 융합될 이식물 부위를, 키토산 및 그에 고정되고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴술페이트 및 덱스트란 술페이트로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리사카라이드로 이루어진 경조직의 재생을 자극시키는 자극제로 코팅한다. 이식물은 티타늄을 포함하는 것이 특히 바람직하다.

바람직한 실시 태양의 실시예

본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 설명될 것이다. 여기서 백분율 및 부는 다른 언급이 없는 한 중량 단위이다.

〈실시예 1〉

키토산에 의한 티타튬 나사의 코팅

티타늄 스크류를 키토산 1 %(w/v)를 함유하는 2% 아세트산 용액에 함침시키고, 상기 용액에 15분 동안 방치하였다. 키토산은 씨 큐어 (Sea Cure) 313 (프로노바 바이오폴리머, 15% N-아세틸화)였다. 처리된 티타늄 나사를 열 캐비넷에서 16시간 동안 70℃에서 건조시킨 후, 1M NaOH로 중화시키고, 증류수로 반복하여 세척하고, 다시 열 캐비넷에서 건조시켰다. 나사를 "필 오픈" (peel open) 형 포장지에 넣고, 에틸렌옥사이드로 멸균하였다.

〈실시예 2〉

헤파린과 이온 결합된 티타튬 나사

실시예 1에 따른 키토산으로 코팅된 나사를 증류수 500 ml 중 헤파린 (Pig Mucosa, Kabivitrum) 125 mg으로 이루어진 용액으로 옮기고, 약 16시간 동안 방치하고, 증류수로 세척한 후 실온에서 건조시켰다. 나사를 "필 오픈"형 포장지에 넣고 에틸렌옥사이드로 멸균하였다. 고정된 헤파린의 양은 약 2 ㎍/㎝²이었다.

〈실시예 3〉

헤파린과 공유 결합된 티타튬 나사 (종말점 결합)

헤파린을 물 300 ml에 용해시켰다. 용액을 빙수에서 0℃로 냉각시키고, 냉하게 유지하였다. 먼저, 아질산나트륨 (NaNO₃) 10 mg을 가한 후, 아세트산 2 ml을 교반 하에 용액에 가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 유지시키고, 투석하고, 동결건조하였다. 수율은 0.7 g이었다.

실시예 1에 따른 키토산으로 코팅된 티타늄 나사를 증류수 500 ml 중 상기 아질산염이 제거된 헤파린 125 mg, NaCNBH₃15 mg을 함유하는 용액으로 옮기고, 0.1M HCl로 pH를 3.9로 조정하였다. 반응 혼합물을 약 16시간 동안 실온으로 유지시켰다. 이어서, 나사를 증류수로 세척하고, 실온에서 건조시켰다. 처리된 티타늄 나사를 "필 오픈"형 포장지에 넣고, 에틸렌옥사이드로 멸균하였다. 고정된 헤파린의 양은 약 1.5 ㎍/㎝²이었다.

〈실시예 4〉

헤파린과 공유 결합된 티타튬 나사 (다중점 결합)

과요오드화나트륨-산화된 소듐 헤파린의 용액을 NaIO₄1 g을 증류수 200 ml에 용해시킴으로써 제조하였다. 소듐헤파린 10 g을 용액에 가하고, 용액을 밤새 암실에서 교반하였다. 글리세롤 10 ml를 첨가하고, 2시간 동안 교반한 후, 생성된 용액을 물에 대해 투석하였다. 물을 1시간 마다 교환하였다. 과요오드화-산화된 헤파린을 약 19 mg/ml의 농도로 함유하는 용액이 형성되었다.

실시예 1에 따른 키토산으로 코팅된 티타늄 나사를 증류수 500 ml 중 상기 과요오드화-산화된 헤파린 125 mg, NaCNBH₃15 mg을 함유하는 용액으로 옮겼다. 이어서, 반응을 실시예 3에 기재된 바에 따라 수행하였다.

〈실시예 5〉

키토산 필름의 제조

키토산의 히드로클로라이드 염 5 g (50%의 아세틸화도, 프로노바사)를 증류수 0.5ℓ에 용해시켰다 (1 %(v/w)). 얻은 용액 10 ml을 페트리 접시에 옮기고, 키토산 필름을 70℃의 열 캐비넷에서 24시간 동안 증발 및 건조시켜 형성하였다. 이어서, 얻은 필름을 0.2 M, pH 9.0 인산나트륨 완충액을 첨가하여 중화시켰다. 필름을 실온에서 이 완충액 중 페트리 접시에 2-4시간 동안 방치한 후, 물로 3-4번 세척하고, 건조되도록 방치하였다.

〈실시예 6〉

헤파린과 공유적으로 결합된 필름 (종말점 결합)

실시예 1에 따라 제조된 중화된 키토산 필름에 NaCl 4.4 g을 함유하는 증류수 0.5 ℓ에 용해된 실시예 3에서 제조된 아질산염이 제거된 헤파린 125 mg을 함유하는 용액 20 ml을 가하였다. 이 용액에 소듐 시아노보로히드라이드 15 mg을 가하였다. 0.5 M 염산 또는 다른 산을 사용하여 용액의 pH를 3.9로 조정하였다. 키토산 필름을 함유하는 용액을 실온에서 14시간 동안 방치하고, 처리된 필름을 물로 3-4번 세척하고, 건조되도록 방치하였다.

〈실시예 7〉

헤파린과 이온 결합된 필름

실시예 1에 따라 제조된 중화된 키토산 필름에 NaCl 4.4 g을 함유하는 증류수 0.5 ℓ에 용해된 헤파린 125 mg을 함유하는 용액 20 ml을 가하였다. 키토산 필름을 함유하는 용액을 실온에서 14시간 동안 방치한 후, 처리된 필름을 물로 3-4번 세척하고, 건조되도록 방치하였다. 제조된 필름을 본 발명에 따른 골융합화에 사용할 목적으로 분말로 분쇄할 수 있다.

〈실시예 8〉

생물학적 시험

시험 동물로서 마취된 토끼 성체를 사용하고, 멸균 조건 하에서 작동시키기 위해 토끼의 무릎 부위의 털을 제거하여 준비하였다.

골단 연골 영역의 경골 인접 부위에 대해 35-40 mm 길이로 무릎 관절의 피부 말단을 절단하였다. 골막을 횡단면으로 자르고, 연속적으로 멸균 완충 염수액을 공급함으로써 냉각 하에 3.5 mm 드릴을 이용해 저 회전 속도로 고밀도의 다리를 통해 골수 공동을 관통하는 구멍을 기부에 냈다. 이어서, 이 구멍에 육각형의 나사머리를 갖는 4 mm 길이의 티타늄 나사 및 6 mm 길이의 다른 티타늄 나사 (두 티타늄 나사의 직경은 모두 3.5 mm)를 끼웠다. 상처난 근막 및 피부를 단일 봉합사를 사용하여 봉합하였다. 본 실험에서 실시예 1-3에 따라 처리된 티타늄 나사 외에 비처리된 티타늄 나사도 사용하였다.

4주 후 그리고 12주 후에 각각 토끼를 다시 마취하였다. 털을 무릎 부위에서 잘라내고, 경골을 향한 무릎 관절의 말단에서 피부를 절개하였다. 나사를 절개하고 확인하였고, 기부의 나사에 대한 탈착 모먼트를 측정하였다. 뼈 내에 잔류하는 이식물에 대해 원 거리에 위치한 나사를 광현미경 용으로 제조하였다.

〈실시예 9〉

헤파린 코팅되거나 되지 않은 티타늄 분말

키토산에 의한 티타늄 분말의 코팅을 기본적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하고, 고정을 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.

한 쪽 뒷 다리 상의 비골을 노출시키고, 그의 근육 조직을 중간 간 (shaft) 상에서 약 10 mm의 길이를 따라 분리하였다. 노출된 비골의 6 mm 길이의 단편을 제거하고, 뼈 및 그의 골막, 및 골 말단간의 결손 부분을 티타늄 분말로 충전하였다. PTFE로 제조된 막 여과지로 결손 부분 주위를 감싸서 이 부분을 브릿지하고 육아 조직이 영역을 침범하지 않도록 하였다. 한면에는 헤파린으로 코팅된 티타늄 분말을 위치시키고, 다른 한면에는 코팅되지 않은 티타늄 분말을 위치시켰다. 그런 후에 상처를 봉합하였다. 두번째 실험 전에 3주 동안 이 쥐를 구속하지 않고 움직이도록 방치하고 희생시켰다. 한 쪽 면에서 비골 중 결손 부위를 관찰한 결과 망상 조직 및 다층 구조의 뼈가 양 결손 부위에 브릿지를 형성하는 것이 증명되었다. 그러나, 가장 광대한 골은 헤파린화된 티타늄 분말에서, 그리고 이 분말에 나란하게 형성되었다. 부가적으로 보다 잘 적층된 즉, 잘 구성된 뼈가 헤파린화 티타늄 분말 중에서 검출되었다.

따라서, 상기된 헤파린으로 코팅된 티타늄 분말은 골막의 부재 하에서도 새로운 골 형성을 자극하였다.

〈실시예 10〉

비골의 틈을 브릿징하는 기술에 의해 측정된 이온적으로 헤파린화된 키토산막의 골형성 활성

마취된 쥐에서 한 쪽 뒷 다리 상의 비골을 노출시켰고, 그의 근육 조직을 중간 간 상에서 약 10 mm 길이로 분리하였다. 노출된 비골의 6 mm 길이의 단편을 제거하고, 뼈 및 그의 골막, 및 골 말단 간의 결손 부위를 키토산 필름으로 피복하였다.

좌측면에 실시예 5에서 제조된 키토산 (15% 아세틸화된 키토산) 막을 위치시키고, 오른쪽 비골 결손 부위 상에 실시예 7에서 제조된 헤파린화된 키토산 막 (15% 아세틸화된 키토산)을 위치시켰다.

막에 의해, 그리고 골 말단 간의 6 mm의 틈을 브릿징하는 것에 의해 생성되는 튜브가 붕괴되는 것을 피하기 위하여, 소골 단편들을 틈을 따라 위치시켰다.

3주 후에 2 마리의 동물 모두의 우측면 (즉, 헤파린화된 키토산 필름을 지닌 면)에서 골 매트릭스 및 뼈가 더욱 현저하게 형성됨이 판명되었다.

〈실시예 11〉

두개관 틈에서 골 형성에 의해 측정된 헤파린화된 키토산막의 골형성 활성도

뼈에서 특정 크기를 초과하는 결손이 생긴다면, 뼈에서 결손 부위를 브릿징하는 섬유상 반흔 막을 형성함으로써 이러한 결손을 치유하는 것은 공지되어 있다. 쥐 성체의 두개관 내 구멍의 임계적 크기는 8 mm이다. 즉, 직경 8 mm 이상의 구멍은 골 조직에 의해 봉합되지 않을 것이다.

쥐의 비액 영역으로부터 외부 후두 돌출부까지 피부를 절개하였다. 피부 및 하부 조직 (한쪽면의 측두 근육 대부분을 포함)을 분리하였다. 특별 제작된 천공기를 사용하여 두골 양쪽에 8 mm의 구멍을 만들었다. 수막 및 뇌에 손상을 주지 않도록 극히 주의한다.

우측면 상에서, 실시예 9에서와 같이 제조된 헤파린과 이온적으로 결합된 키토산 막을 경막 상에 위치시키고, 다중 골 단편을 막 상에 위치시키고, 추가의 동일 막을 두골 상에 위치시켰다. 그런 후에, 좌측 면 상에서, 실시예 5에서와 같이 제조된 비헤파린화된 키토산 막을 골 단편과 일정 간격으로 유지하면서 동일한 방법으로 위치시켰다. 그런 후에, 모상건막과 피부를 봉합하였다.

3주 후에 쥐를 마취시키고, 두골을 관찰하였다. 유골 및 새로운 골조직이 좌측면에 비해 우측면 상의 결손 부위를 피복하는 것을 증명할 수 있었다. 이 외에 헤파린화된 키토산 막에서는 염증성 반응이 덜하였다.

〈실시예 12〉

덱스트란술페이트 또는 헤파린 또는 콘드로이틴-4-술페이트로 피복된 키토산 구슬의 제조

키토산의 2 % (w/v) 수용액 (18% 아세틸화됨)을 주사기로 트리폴리포스페이트 완충액 중 덱스트란술페이트 또는 헤파린 또는 콘드로이틴-4-술페이트의 0.1 % (w/v) 용액에 적가하였다. 생성된 구슬을 유리 여과지 상에서 회수하고, 물 1ℓ로 세척하고, 30℃에서 밤새 건조시켰다.

〈실시예 13〉

두골 상에서 하부 골막 퇴적 후 골 형성에 의해 측정된 키토산 구슬의 골형성 활성도

두골의 골막 하에 골 형성 활성도에 대해 시험될 자극제를 위치시키는 것은 공지된 방법이다.

키토산 및 헤파린, 실시예 12에서 기재된 바와 같이 제조된 덱스트란 술페이트로 코팅된 키토산 및 콘드로이틴-4-술페이트로 코팅된 키토산으로 제조된 구슬을 쥐 성체의 전두 골 상에서 하부 골막에 위치시켰다. 이러한 구슬 하나를 한쪽면 상에 위치시켰다. 골 형성도를 3주 후에 측정하였다.

키토산-헤파린 구슬은 전두 골 상에서 유골 및 골조직을 형성하는 것을 통해 드러나는 바와 같이 골을 형성한다. 콘드로이틴술페이트로 코팅된 키토산 구슬 및 덱스트란술페이트로 코팅된 키토산 구슬도 또한 골 형성 활성도를 보였다. 염증 세포를 다양하게, 일반적으로 낮은 정도로 검출할 수 있었다.

이 실험들은 특정 폴리사카라이드와 결합된 키토산이 골 형성 활성을 보이는 것을 증명하였다.

치유 효능의 보다 나은 자극은 본 발명의 자극제와 성장 인자를 결합시킴으로써 얻어질 수 있다. 요오드 125로 표지된 aFGF (산성 섬유아 성장 인자, 바켐사, 캘리포니아주 소재)를 사용한 시험관 내에서의 실험은 비헤파린화된 나사에 비하여 헤파린화된 나사에 대한 성장 인자의 높은 특이적 결합을 보였다. 본 발명이 어떠한 특정 이론에 의해 제한되지 않으나, 다만 나사가 키토산-헤파린으로 코팅되어 자극된 골 재생을 초래하는 한, 내인성 성장 인자가 이식물과 주변 골 간의 계면에 풍부해질 것으로 예상된다.

본 발명은 기재된 실시 태양에 의해 한정되지 않으나, 경조직, 특히 골조직에 융합될 모든 형태의 이식물에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 모든 분야, 예를 들어, 치학, 정형 외과학, 신경 외과학, 수 외과학, 성형 외과학 및 재건 외과학에 에 적용될 수 있다. 또한, 치아에 사용하는 것에 관하여, 본 발명은 상당히 유용하다.

본 발명은 소위 골 융합화, 예를 들어 외부 이식물을 경조직, 특히 골조직에 이식하는데 요구되는 효능과 관련하여, 경조직의 재생을 자극 또는 촉진하는 신규 기술에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 신규 기술을 적용하여 이러한 골 융합화를 수행하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 골조직의 결손 또는 그 이외의 골조직에 대한 필요성과 관련하여 새로운 뼈를 생성하는 것에 관한 것이다.

Claims (15)

1. 키토산, 및 그에 고정되고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴술페이트 및 덱스트란 술페이트로 이루어진 군으로 부터 선택되는 폴리사카라이드를 포함하는(comprising), 골조직 재생용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 골조직의 재생이 골조직에서의 이식물과 관련되어 재생되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제1항 또는 2항에 있어서, 폴리사카라이드가 이온 결합에 의해 키토산에 고정되는 것을 특징으로하는 조성물.
4. 제1항 또는 2항에 있어서, 폴리사카라이드가 공유 결합에 의해 키토산에 고정되는 것을 특징으로하는 조성물
5. 제1항 또는 2항에 있어서, 폴리사카라이드가 헤파린 또는 헤파란 술페이트인 것을 특징으로하는 조성물.
6. 제1항 또는 2항에 있어서, 분말 또는 용액 형태인 것을 특징으로하는 조성물.
7. 제1항 또는 2항에 있어서, 겔 형태인 것을 특징으로하는 조성물.
8. 제1항 또는 2항에 있어서, 자극제가 구슬 형태인 것을 특징으로하는 조성물.
9. 제1항 또는 2항에 있어서, 키토산의 N-아세틸화도가 최대 90%인 것을 특징으로하는 조성물.
10. 제9항에 있어서, 키토산의 N-아세틸화도가 25% 미만인 것을 특징으로하는 조성물.
11. 제2항에 있어서, 이식물이 티타늄을 포함하는 것을 특징으로하는 조성물.
12. 제1항에 있어서, 재생이 골융합화와 관련된 조성물.
13. 적어도 융합될 이식물 부위가, 키토산 및 그에 고정되고 헤파린, 헤파란 술페이트, 콘드로이틴술페이트 및 덱스트란 술페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리사카라이드로 구성된, 경조직 재생용 조성물로 코팅된 것을 특징으로하는 경조직 융합용 이식물.
14. 제13항에 있어서, 티타늄을 포함하는 것을 특징으로하는 이식물.
15. 제9항에 있어서, 키토산의 N-아세틸화도가 최대 50%인 것을 특징으로하는 조성물.