CZ289981B6

CZ289981B6 - Prostředek stimulující tvrdou tkáň

Info

Publication number: CZ289981B6
Application number: CZ1997140A
Authority: CZ
Inventors: Hans-Arne Hansson; GUNILLA JOHANSSON-RUDéN; Olle Larm
Original assignee: Astra Aktiebolag
Priority date: 1994-07-19
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 2002-05-15
Also published as: CA2194462C; FI970202A; BR9508322A; AU3089595A; DE69527203T2; PL318326A1; NZ290219A; CZ14097A3; JP3492377B2; WO1996002259A1; JPH10502664A; HU220770B1; HUT77607A; SE9402528D0; NO970215D0; CN1081923C; HU9700160D0; DE69527203D1; RU2153877C2; EP0771206A1

Abstract

Pou it chitosanu a k n mu imobilizovan ho polysacharidu zvolen ho ze skupiny zahrnuj c heparin, heparansulf t, chondroitinsulf ty a dextransulf t pro v²robu prost°edku schopn ho zajistit stimulovanou regeneraci tvrd tk n ve spojitosti s implant ty v tvrd tk ni.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových technik pro stimulaci nebo akceleraci regenerace tvrdé tkáně ve spojitosti stak zvanou osseointegrací, například s účinkem požadovaným při implantaci cizích implantátů do tvrdé tkáně, zejména kostní tkáně. Vynález se také týká způsobu provádění takové osseointegrace použitím nové techniky podle vynálezu. Dále se vynález týká tvorby nové kosti ve spojitosti s defekty v kostní tkáni nebo ve spojitosti s jinou potřebou kostní tkáně.

Dosavadní stav

Implantáty určené k zakotvení do tvrdé tkáně, zejména do kostní tkáně, se používaly ve stále větší míře v odontologii, ortopedii, neurochirurgii, chirurgii ruky jakož i v plastické a rekonstrukční chirurgii. Zakotvení implantátů do kosti na dlouhou dobu bylo prováděno pomocí titanu a lze mít za to, že materiály na bázi titanu budou i v budoucnu používány v širokém rozsahu jako materiál volby pro implantáty a protézy.

Klinickým problémem v souvislosti s tak zvanou osseointegrací je skutečnost, že implantát nemůže být vystaven zatížení před dosažením dostatečného zakotvení kosti, což může trvat 6 až 9 měsíců. Je proto z klinického hlediska nejvýše důležité urychlit vhojení zajištěním stimulované tvorby kosti ve spojitosti s implantáty. Je také zapotřebí regenerovat kost, aby se překlenuly defekty nebo úseky, kde došlo k resorpci kosti, například v bezzubých částech čelisti, nebo kde došlo ke ztrátě kostní tkáně v důsledku traumatu, tumoru nebo chirurgického výkonu.

Podstata vynálezu

Hlavním účelem vynálezu je stimulace růstu buněk v tvrdé tkáni, například v kostních buňkách, tak aby se zvětšil objem tvrdé tkáně.

Jiným účelem vynálezu je poskytnout prostředky, kterými se dosáhne tvorby regenerované kostní tkáně převážně lamelámího, kompaktního typu, zatímco rozsah tvorby jizevnaté tkáně je minimalizován.

Dalším účelem vynálezu je poskytnout nový prostředek schopný ve spojitosti s implantáty v tvrdé tkáni stimulovat regeneraci tvrdé tkáně, například kostní tkáně.

Dalším účelem vynálezu je poskytnout způsob zdokonalené osseointegrace v souvislosti s implantací cizích implantátů do tvrdé tkáně, například do kostní tkáně.

Použitím podle vynálezu lze získat implantáty upravené prostředkem stimulujícím regeneraci tvrdé tkáně.

V souladu s tím vynález popisuje použití chitosanu a k němu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou nebo/a akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni, například v kostní tkáni.

Místo termínu „vázaný“ (ve spojení „chitosan a k němu vázaný polysacharid“) se v oboru užívá též termín „imobilizovaný“. V souvislosti s touto obvyklou terminologií v oboru je v příkladech rovněž užíván termín „imobilizovaný“.

-1 CZ 289981 B6

Polysacharid může být vázán (imobilizován) na chitosanový základ různými způsoby, například iontovými vazbami, kovalentní vazbou, buď vícebodovou vazbou, nebo vazbou na koncový bod, nebo mechanickou fixací v chitosanovém základu ve spojitosti s vysrážením chitosanu z roztoku. Výhodné jsou imobilizační formy na základě iontových a kovalentních vazeb.

Prostředek stimulující tvrdou tkáň podle vynálezu může být v různých fyzikálních formách, například jako membrána, prášek, gel, kuličky nebo roztok. Pokud má být prostředek aplikován na implantát, může být na tu část implantátu, která má být integrována do tvrdé tkáně, prostředek aplikován namočením této části implantátu. Prostředek může být samozřejmě aplikován i na 10 samotnou tvrdou tkáň, například do dutiny vytvořené v kostní tkáni.

Výhodným materiálem pro implantáty je titan, mohou však být použity i jiné implantační materiály.

Chitosan je lineární polysacharid vázaný v poloze 1,4 a vytvořený z beta-D-glukosaminových jednotek. Chitosan se vyrábí N-deacetylací chitinu, což je polymer, který vytváří krunýř mimo jiné hmyzu a korýšů. Průmyslově se chinin vyrábí z krunýřů krabů a granátů, které představují odpady z rybářského průmyslu. Regulací alkalické úpravy chininů je možno připravit chitosany o různém stupni N-acetylace. Působí—li se na chitin různě koncentrovanou alkálií, obvykle hydroxidem sodným, dojde k N-deacetylaci, tj. acetamidové skupiny se přemění na aminoskupiny, čímž se vytvoří chitosan.

Fyzikální vlastnosti chitosanu, ovlivňující jeho užitečnost, závisí na jeho stupni N-acetylace, na jeho molekulární hmotnosti a homogenitě. Chitosanu je biologicky degradovatelný, a to jak 25 chitinasou v trávicí soustavě, tak také lysozymem a jinými enzymy v těle.

Pro použití podle vynálezu je výhodné, aby chitosan měl stupeň N-acetylace nejvýše asi 90 % a s výhodou nejvýše asi 50 %. Zejméně výhodné je, pokud je stupeň N-acetylace nižší než asi 25 %.

Výhodný polysacharid pro navázání (imobilizaci) na chitosanový podklad je heparin nebo heparansulfát. Speciální technika pro kovalentní vazbu heparinu s podklady obsahujícími aminoskupiny je popsána v patentu US 4 613 665.

Vynález se rovněž týká použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitisulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou a/nebo akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně, například v souvislosti s takzvanou osseointegrací. Tento prostředek se před implantací nanese v množství vhodném pro stimulaci na implantát nebo/a tvrdou tkáň. Osseointegrace je optimální forma pro dlouhodobé zakotvení implantátu z neautologních a různých cizích materiálů do tvrdé tkáně, zejména do kostní tkáně.

Prostředek se pro tento účel může aplikovat ve formě prášku, roztoku, gelu, kuliček, filmu nebo membrány. Tento prostředek může být rovněž aplikován ponořením té části implantátu, která má 45 být integrována do tvrdé tkáně, do roztoku chitosanu a k němu vázaného polysacharidu.

Vynález tedy lze využít k úpravě implantátů určených k integraci do tvrdé tkáně, zejména kostní tkáně. U takových implantátů se ta část implantátu, která má být integrována, opatří povlakem prostředku stimulujícího regeneraci tvrdé tkáně, tvořeného chitosanem a kněmu vázaným 50 polysacharidem vybraným ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát. Zejména výhodné je, pokud implantát obsahuje titan.

-2CZ 289981 B6

Příklady provedení vynálezu

Vynález bude dále ilustrován příklady, které vynález nikterak neomezují. V následujících příkladech uvedené díly znamenají díly hmotnostní, pokud není uvedeno jinak.

Příklad 1

Povlékání titanového šroubu chitosanem

Titanové šrouby se ponoří do roztoku chitosanu (1 % hmotnost/objem) v 2 % roztoku kyseliny octové a v uvedeném roztoku se ponechají 15 minut. Chitosanem je Sea Cure 313, pronova Biopolymer, 15 % N-acetylace. Upravené titanové šrouby se suší v sušárně 16 hodin při 70 °C a pak se zneutralizují v 1M hydroxidu sodném a opakovaně se promyjí destilovanou vodou a znovu vysuší v sušárně. Šrouby se zabalí do balíku typu „peel open“ a sterilizují se ethylenoxidem.

Příklad 2

Titanové šrouby s iontově vázaným heparinem

Šrouby opatřené povlakem chitosanu podle příkladu 1 se přenesou do roztoku sestávajícího ze 125 mg heparinu (Pig Mucosa, Kabivitrum) v 500 ml destilované vody, kde se ponechají asi 16 hodin, načež se propláchnou v destilované vodě a vysuší při teplotě místnosti. Šrouby se zabalí do balíku typu „peel open“ a sterilizují se ethylenoxidem. Množství imobilizovaného heparinu činí asi 2 pg/cm².

Příklad 3

Titanové šrouby s kovalentně vázaným heparinem (připojení ke koncovému bodu)

Heparin se rozpustí ve vodě (300 ml). Roztok se ochladí na 0 °C v ledové vodě a udržuje se studený. K roztoku se přidá za současného míchání nejprve 10 mg NaNO₃ a pak 2 ml kyseliny octové. Reakční směs se udržuje po 2 hodiny na 0 °C, dialyzuje se a lyofílizuje. Výtěžek je 0,7 g.

Titanové šrouby opatřené povlakem chitosanu podle příkladu 1 se přenesou do roztoku obsahujícího 125 mg shora uvedeného dusitanem degradovaného heparinu a 15 mg NaCNBH₃v 500 ml destilované vody a pH se upraví pomocí 0,lM HC1 na hodnotu 3,9. Reakční směs se udržuje po dobu asi 16 hodin při teplotě místnosti. Šrouby se pak propláchnou v destilované vodě a vysuší se při teplotě místnosti. Upravené titanové šrouby se sbalí do balíku typu „peel open“ a sterilizují se ethylenoxidem. Množství imobilizovaného heparinu je asi 1,5 pg/cm².

Příklad 4

Titanové šrouby s kovalentně vázaným heparinem (vícebodové připojení)

Roztok jodičnanem sodným oxidovaného natriumheparinu se připraví následujícím způsobem: Jeden gram jodičnanu sodného se rozpustí v 200 ml destilované vody. K tomuto roztoku se přidá deset gramů natriumheparinu a roztok se míchá přes noc ve tmě. Výsledný roztok se po přidání 10 ml glycerinu a míchání po dobu dvou hodin dialyzuje proti vodě. Voda se vyměňuje každou

-3CZ 289981 B6 druhou hodinu. Získá se tak roztok obsahující jodičnanem oxidovaný heparin v koncentraci asi 19 mg/ml.

Titanové šrouby opatřené povlakem chitosanu podle příkladu 1 se přenesou do roztoku obsahujícího 125 mg shora uvedeného jodičnanem oxidovaného heparinu a 15 mg NaCNBH₃v 500 ml destilované vody. Reakce se pak provede přesně, jak popsáno v příkladu 3.

Příklad 5

Výroba chitosanového filmu g hydrochloridové soli chitosanu (50 % stupeň acetylace, Pronova) se rozpustí v destilované vodě (0,5 1, 1% objem/hmotnost). 10 ml získaného roztoku se převede do Petriho misky a vytvoří se film z chitosanu odpařováním a vysoušením v sušárně při 70 °C po dobu 24 hodin. Získaný film se pak zneutralizuje přídavkem fosforečnanu sodného jako pufru, 0,2M, pH 9. Film se ponechá v tomto pufru při teplotě místnosti po dobu 2 až 4 hodin, pak se promyje 3 až 4krát vodou a nechá se vysušit.

Příklad 6

Film s kovalentně vázaným heparinem (připojení na koncový bod)

K neutralizovanému chitosanovému filmu připravenému podle příkladu 1 se přidá 20 ml roztoku obsahujícího 125 mg dusitanem degradovaného heparinu, připraveného jako v příkladu 3, rozpouštěného v 0,5 1 vody a obsahujícího 4,4 g chloridu sodného. K tomuto roztoku se přidá 15 mg kyanoborohydridu sodného. pH tohoto roztoku se upraví na hodnotu 3,9 za použití 0,5M kyseliny chlorovodíkové nebo jiné kyseliny. Roztok obsahující chitosanový film se nechá stát

14 hodin při teplotě místnosti a upravený film se pak promyje 3 až 4krát vodou a nechá se vysušit.

Příklad 7

Filmy s iontově vázaným heparinem

K zneutralizovanému chitosanovému filmu, vyrobenému podle příkladu 1, se přidá 20 ml roztoku obsahujícího 125 mg heparinu rozpouštěného v 0,5 1 vody obsahující 4,4 g chloridu sodného.

Roztok obsahující chitosanový film se nechá stát 14 hodin při teplotě místnosti a upravený film se pak promyje 3 až 4krát vodou a nechá se vysušit, vytvořený film se může rozemlít na prášek pro použití při osseointegraci podle vynálezu.

Příklad 8

Biologický test

Jako testovaná zvířata se použijí dospělí králíci, kteří se anestezují a připraví pro operaci za 50 sterilních podmínek, přičemž se odstraní chlupy v oblasti kolene králíka.

Provede se incize kůže v distální oblasti kolenního kloubu v délce 35 až 40 mm nad proximální částí tibiální epifyzámí chrupavky. Protne se okostice a za současného chlazení pomocí kontinuálně přiváděného sterilního pufrovaného fyziologického roztoku se vyvrtá při nízké 55 rotační rychlosti za použití vrtáku 3,5 mm otvor do morkové dutiny. Pak se všroubuje 4 mm

-4CZ 289981 B6 dlouhý titanový šroub, který má hexagonální hlavu, a ve vzdálenosti 6 mm další šroub, oba o průměru 3,5 mm. Proťatá fascie a kůže se sešijí jednotlivými stehy. Při pokusech jsou použity kromě titanových šroubů upravených podle příkladů 1 až 3 také neupravené titanové šrouby.

Po 4 a 12 týdnech se králíci opět anestezují. Ostřihnou se chlupy v oblasti kolene a provede se incize distálně od kolenního kloubu směrem k tibii. Šrouby se zpřístupní a identifikují a je určena doba pro vynětí proximálních šroubů. Distální šrouby jsou připraveny pro mikroskopické vyšetření s implantátem, který zůstává v kosti in šitu.

Příklad 9

Titanový prášek s nebo bez heparinového povlaku

Povlékání titanového prášku chitosanem se provádí v podstatě, jak popsáno v příkladu 1, a immobilizace se provádí, jak popsáno v příkladu 3.

Fibula na každé zadní noze se zpřístupní a přilehlá svalová tkáň se oddělí podélně přibližně v rozsahu 10 mm na střední ose. 6 mm dlouhý segment obnažené fibuly se vytne včetně okostice a vzniklý defekt se vyplní titanovým práškem. Aby se zabránilo pronikání granulační tkáně do prostoru defektu, obalí se defekt membránovým filtrem vyrobeným z poly(tetrafluorethylenu). Na jedné straně je uložen titanový prášek potažený heparinem a na druhé straně titanový prášek neopatřený povlakem. Rány se pak uzavřou. Krysám se dovolí pohybovat se bez omezení během 3 týdnů před druhým vyšetřením a uhubením. Při vyšetření defektů ve fibule na každé straně se zjišťuje, že oba defekty jsou přemostěny mřížovitě a lamelámě uspořádanou nově vytvořenou kostní tkání. K nejvýraznější tvorbě kostní tkáně však dochází na a podél heparinizovaného titanového prášku. Mimo to lamelámější, tj. lépe organizovaná kost, se nachází mezi heparinizovaným titanovým práškem.

Titanový prášek opatřený povlakem heparinu, popsaný shora, stimuluje tedy novou tvorbu kosti i v nepřítomnosti okostice.

Příklad 10

Osteogenní aktivita iontově heparinizované chitosanové membrány zjišťovaná technikou přemostění otvoru ve fibule

Fibula na každé zadní noze anestezovaných rys se zpřístupní a přilehlá svalová tkáň se oddělí podélně přibližně v rozsahu 10 mm na střední ose. 6 mm dlouhý segment obnažené fibuly se vytne včetně okostice a vzniklý defekt se vyplní chitosanovým filmem.

Na levé straně se umístí chitosanová membrána připravená jako v příkladu 5 (chitosan s 15 % acetylací) a na pravé straně je defekt fibuly vyplněn membránou z heparinizovaného chitosanu připravenou jako v příkladu 7 (chitosan s 15 % acetylací).

Aby se trubice vytvořená membránami k přemostění 6 mm dlouhého defektu mezi oběma konci kosti nezbortila, uloží se podél defektu malé kostěnné fragmenty.

Při vyšetření po třech týdnech je možno prokázat významnější tvorbu kostního základu u obou zvířat na pravé straně, tj. na straně s heparinizovaným chitosanovým filmem.

-5CZ 289981 B6

Příklad 11

Osteogenní aktivita heparinizované chitosanové membrány stanovená tvorbou kosti v defektu 5 lebky

Je dobře známo, že když se v kosti vytvoří defekty přesahující určité rozměry, tyto defekty se hojí tvorbou jizevnaté vazivové membrány překrývající kostní defekt, Kritický rozměr pro defekty v lebce u dospělých krys je 8 mm, to znamená, že defekty 8 mm dlouhé nebo o velkém 10 průměru se neuzavřou kostní tkání.

U krys se provede paramediální incize kůže od nesofrontální oblasti k vnější okcipitální protuberanci. Kůže a pod ní ležící tkáně většiny spánkového svalu na každé straně se oddělí. K vytvoření 8 mm otvoru bilaterálně do lebky se použije speciálně vyrobený trepanační přístroj.

Postupuje se neobyčejně opatrně, aby se předešlo poškození mozkových blan a mozku.

Na pravé straně je na důra mater uložena chitosanova membrána s iontově vázaným heparinem připravená jako v příkladu 9, na membráně je uložen větší počet kostních zlomků a na lebce je uložena další identická membrána. Pak se na levou stranu umístí neheparinizovaná membrána 20 připravená jako v příkladu 5 stejným způsobem s rozloženými kostními zlomky. Potom se galea a kůže uzavřou.

Po třech týdnech se krysy anestezují a lebka se vyšetří. Zjišťuje se, že více nové tkáně kryje defekt na pravé straně ve srovnání s levou stranou. Kromě toho je na heparinizovaných 25 chitosanových membránách méně výrazně zánětlivé reakce.

Příklad 12

Příprava chitosanových kuliček opatřených povlakem dextransulfátu nebo heparinu nebo chondroitin-4-sulfátu

K roztoku dextrasulfátu nebo heparinu nebo chondroitin-4-sulfátu (0,1% hmotnost/objem) tripolyfosfátovém pufru se připraví po kapkách injekční stříkačkou vodný roztok chitosanu (2 % 35 hmotnost/objem, 18% acetylováno). Výsledné kuličky se získají filtrací přes skleněný filtr, promyjí se vodou (1 litr) a vysuší přes noc při 30 °C.

Příklad 13

Osteogenní aktivita chitosanových kuliček stanovená tvorbou kosti po subperiostálním uložení na lebce

Uložení sloučeniny, která má být testována na osterogenní aktivitu pod periostem lebky, je dobře 45 zavedenou metodou.

Kuličky vyrobené z chitosanu a heparinu, z chitosanu opatřeného povlakem dextransulfátu azchitosan opatřeného povlakem chondroitin-4-sulfátu, připravené jak popsáno v příkladu 12, se umístí subperiostálně na frontální kost dospělých krys. Jedna taková kulička je umístěna na 50 každé straně. Tvorba kosti je pozorována za tři týdny.

Chitosan-heparinové kuličky jsou osteogenní, jak dokazuje tvorba osteoidní kostní tkáně na frontální kosti. Také chitosanové kuličky opatřené povlakem chondroitinsulfátu anebo povlakem dextransulfátui vykazují osteogenní aktivitu. V různém, obvykle nízkém rozsahu bylo možno též 55 zjistit zánětlivé buňky.

-6CZ 289981 B6

Tyto pokusy prokazují, že chitosan vykazuje ve spojitosti s určitými polysacharidy osteogenní aktivitu.

Ještě lepší stimulace hojivých vlastností je možno pravděpodobně dosáhnout kombinaci vynálezu a růstovými faktory.

Pokusy in vitro s poly(tetrafluorethylenem), značeným jodem 125 (kyselý Fibroblast Growth Factor, Bacgen Califomia), vykazuje významně vyšší specifickou vazbu růstového faktoru na heparinizovaný šroub než na neheparinizovaný šroub. I když vynález není omezen na žádnou určitou teorii, zdá se pravděpodobné, že endogenní růstové faktory jsou obohaceny na styku mezi implantátem a okolní kostí, když je šroub opatřen povlakem chitossan-heparinu, což má za následek stimulovanou regeneraci kosti.

Vynález není omezen na popsané příklady provedení, je však použitelný na všechny formy implantátů určené k integraci do tvrdých tkání, zejména do kostní tkáně. Vynález je tedy použitelný ve všech oblastech, například v odontologii, ortopedii, neurochirurgii, chirurgii ruky, jakož i v plastické a rekonstrukční chirurgii. Také pro dentální aplikace je vynález docela užitečný.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Použití chitosanu a k němu vázaného polysachridu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou nebo/a akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

2. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni, kde touto tvrdou tkání je kostní tkáň.

3. Použití chitosanu a kněmu iontovými vazbami vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitisulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

4. Použití chitosanu a kněmu kovalentními vazbami vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

5. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin a heparansulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

6. Použití chitosanu a k němu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku ve formě nebo roztoku, schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

-7CZ 289981 B6

7. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfát a dextransulfát pro výrobu prostředku ve formě gelu, schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

8. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextrasulfát pro výrobu prostředku ve formě kuliček, schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

9. Použití chitosanu, který má stupeň N-acetylace nejvýše asi 90 % a s výhodou nejvýše asi 50 %, a k němu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

10. Použití chitosanu, který má stupeň N-acetylace méně než asi 25 %, a k němu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni.

11. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou regeneraci tvrdé tkáně ve spojitosti s implantáty obsahujícími titan ve tvrdé tkáni.

12. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou a/nebo akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně.

13. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou a/nebo akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně, která souvisí s osseointegrací.

14. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou a/nebo akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně, která souvisí s osseointegrací prováděnou ve spojitosti s implantáty ve tvrdé tkáni, jako v kostní tkáni.

15. Použití chitosanu a kněmu vázaného polysacharidu vybraného ze skupiny zahrnující heparin, heparansulfát, chondroitinsulfáty a dextransulfát pro výrobu prostředku schopného zajistit stimulovanou a/nebo akcelerovanou regeneraci tvrdé tkáně, která souvisí s osseointegrací, přičemž tento prostředek je ve formě roztoku chitosanu a polysacharidu, do kterého se ponoří ta část implantátu, která má být integrována do tvrdé tkáně.