ES2353116T3

ES2353116T3 - Composiciones para disoluciones de quitosano citocompatibles, inyectables, autogelificantes para encapsular y administrar células vivas o factores biológicamente activos.

Info

Publication number: ES2353116T3
Application number: ES03763548T
Authority: ES
Inventors: Abdellatif Chenite; Jun Sun; Michael Buschmann; Alessio Serriqi; Caroline Hoemann
Original assignee: Biosyntech Canada Inc; Piramal Healthcare Canada Ltd
Current assignee: Biosyntech Canada Inc; Piramal Healthcare Canada Ltd
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2011-02-25
Anticipated expiration: 2023-07-16
Also published as: ATE481110T1; WO2004006961A1; CA2493083A1; US20090202430A1; DE60334224D1; JP2012092137A; JP2005536496A; CA2493083C; JP5614913B2; JP5670872B2; EP1536837A1; US20060127873A1; EP1536837B1; AU2003249805A1

Abstract

Composición para inmovilizar y encapsular células funcionales y viables o sustancias bioactivas que comprende: a) una disolución de polisacárido líquida de quitosano neutro isotónico; y b) una disolución reticulante que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en un medio fisiológico.

Description

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a una composición y a un procedimiento de aplicación para encapsular células vivas con una disolución de gel de quitosano isotónica neutra que puede solidificarse in situ con la ayuda de un agente reticulante citocompatible que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en un medio fisiológico para ayudar a la regeneración de tejidos o la cicatrización de heridas.

Descripción de la técnica anterior

1) Disoluciones líquidas de quitosano

El quitosano con un grado de desacetilación (DDA) de entre el 50% de DDA y el 100% de DDA puede solubilizarse completamente en disoluciones acuosas ácidas que presentan un pH por debajo del pKa aparente del quitosano (de pH 2,5 a pH 6,0). Tales disoluciones de quitosano son incompatibles con la viabilidad celular. Los intentos de elevar el pH hasta niveles citocompatibles con la mayoría de los tampones provocarán que la disolución precipite, a menos que, tal como mostró anteriormente el solicitante, el tampón utilizado sea una sal dibásica de poliol-fosfato (fosfato de glicerol, GP) (publicación de patente de Chenite WO 99/07416). Disoluciones líquidas de quitosano/GP de pH de 6,8 a 7,2 son citocompatibles y termogelificantes. Sin embargo, las disoluciones de quitosano/GP que pueden gelificar a temperaturas próximas a la temperatura corporal contienen concentraciones salinas bastante más allá de los límites citocompatibles (8% de disodio-GP es -360 nM, o 1080 mOsm). La temperatura de termogelificación es inversamente proporcional a la concentración de GP, de manera que la disminución de la concentración de GP hasta niveles isotónicos de sal (3% de disodio-GP, -126 mM, 378 mOsm) da como resultado una disolución que es termogelificante a temperaturas no fisiológicas, por encima de 65ºC. Por tanto, pueden generarse disoluciones de quitosano líquidas citocompatibles utilizando quitosano solubilizado con ácido que se ha llevado hasta una tonicidad y un pH citocompatibles con GP, sin embargo, estas disoluciones no pueden gelificarse en una placa Petri o una cavidad corporal abierta. 2) Geles reticulados a partir de disoluciones de quitosano líquidas

Se han propuesto muchos agentes reticulantes químicos para formar geles sólidos a partir de quitosano líquido, incluyendo glioxal (Freeman, documento USP 5.489.401, 1996), glutaraldehído (Hsien T-Y y Rorrer GL Ind Eng Chem Res. 36:3631-3638, 1997; Oyrton AC Montiero Jr y Airoldi C. Internat. J. Biological Macromolecules. 26:119-128, 1999; Kumbar, SG, et al., J. Microencapsulation 19:173-180, 2002; y Mi, F-L, et al., Biomaterials. 23:181-191, 2002), escuarato (DeAngelis AA, et al., Macromolecules 31:1595-1601, 1998), oligo(óxido de etileno) (Rogovina SZ et al., Polymer Science, 43: 265-268, 2001), tetrametoxipropano (Capitani D, et al., Carbohydrate Polymers 45:245252, 2001) y genepina (Mi, F-L, et al., Biomaterials. 23:181-191, 2002). Una invención anterior ha enseñado también que puede inducirse la gelificación de disoluciones de quitosano neutras utilizando disoluciones de glioxal de entre el 0,01% y el 10% en peso de glioxal u otro agente reticulante bifuncional (Chenite et al. documento WO02/40070). Sin embargo, estas concentraciones de glioxal son tóxicas para las células.

Se ha inventado anteriormente un procedimiento para atrapar células vivas en un gel de quitosano utilizando precipitación dependiente del pH y agentes reticulantes no covalentes, en contraposición a un agente reticulante químico (Aebischer et al., patente US nº 5.871.985). Sin embargo, este mecanismo de gelificación dependiente del pH conduce a una forma de pasta de quitosano que carece de las propiedades adhesivas y mecánicas de los geles de quitosano descritos en la presente memoria, y presentarían una utilización limitada en el campo de aplicaciones de reparación de cartílago en las que el gel ha de aplicarse a una superficie de tejido en una cavidad corporal abierta tal como la articulación sinovial.

En una invención anterior (documento WO02/00272), se propuso una disolución líquida de quitosano-GP citocompatible para su utilización en la encapsulación de células para la regeneración o reparación de tejidos basándose en las propiedades termogelificantes de la disolución de quitosano-GP líquida. Se describió la retención de células viables en un gel de quitosano sólido con una composición de quitosano-GP, glucosamina e hidroxietilcelulosa. En una publicación separada (Li y Xu, J. pharm. Sci 91(7): 1669-1677, 2002), se propuso la hidroxietilcelulosa como agente reticulante citocompatible de geles de quitosano-GP neutros para la encapsulación de células a través de un mecanismo propuesto de puentes de hidrógeno. La presente invención se diferencia completamente de estas descripciones previas, al enseñar un procedimiento y una composición para encapsular células vivas utilizando un mecanismo de reticulación a base de glioxal de disoluciones de quitosano-GP que da como resultado la retención de células viables en geles solidificados.

Resumiendo la técnica anterior, se han reticulado disoluciones de ácido-quitosano con una serie de agentes reticulantes bifuncionales sin pruebas de que estas disoluciones gelificantes puedan mantener la viabilidad celular. Por tanto, existe actualmente una falta de pruebas referentes a la encapsulación de células viables en geles de quitosano químicamente reticulados.

Sería sumamente deseable proporcionar una nueva composición para su utilización en contextos médicos de regeneración y reparación de tejidos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una disolución líquida polimérica biocompatible cargada con células o factores biológicamente activos, que puede solidificarse y formar un implante o una película con células o factores atrapados o inmovilizados. La disolución puede formar por tanto un armazón sólido biocompatible que mantiene la viabilidad celular, u ofrece la liberación controlada de moléculas bioactivas en el sitio de inyección. Tras la inyección, el implante puede proporcionar un efecto terapéutico a partir de las células, hormonas, fármacos, ADN o agente de carga administrados.

Según la presente invención, se proporciona una composición para inmovilizar y encapsular sustancias bioactivas o células funcionales y viables que comprende:

a) una disolución de polisacárido líquida de quitosano neutro isotónico; y b) una disolución de reticulación que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal, disuelta en medios fisiológicos.

La disolución de reticulación consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en medios fisiológicos.

El agente reticulante químico se disuelve preferentemente en medios fisiológicos que albergan uno o más nutrientes celulares incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa, vitaminas, aminoácidos y agentes tamponantes tal como se encuentran en medios de

cultivo celular típicos.

La composición de la presente invención puede comprender por ejemplo:

a) del 0,5 al 5,0% en peso de quitosano; y

b) el 0,0001 -3% de glioxal, y

c) del 0,01 al 5,0% en peso de hidroxietilcelulosa tratada con glioxal; y

en la que dicha disolución forma un gel entre temperaturas de 4ºC y 42ºC, y más preferentemente entre 20ºC y 42ºC, proporcionando dicho gel un entorno fisiológico para mantener la viabilidad de las células.

La composición forma un gel, preferentemente en el plazo de segundos a varias horas tras mezclar (a) y (b), y (c).

El quitosano se disuelve preferentemente en ácido diluido y se mezcla con del 1,0 al 2,5% en peso de una sal de poliol que consiste en sal dibásica de monofosfato, tal como sal dibásica de monofosfato de glicerol como sal dibásica de glicerol-2-fosfato, sal dibásica de sn-glicerol-3-fosfato y sal dibásica de L-glicerol-3-fosfato, o sal de monosulfato.

El quitosano puede mezclarse además con sal y tampón fosfato.

En una realización de la invención, la composición comprende además un factor biológicamente activo. Tal factor puede seleccionarse por ejemplo de entre el grupo constituido por células, una hormona, un fármaco, ADN, un agente de carga, un factor de crecimiento, un ADN, complejos ADN-polímero, liposomas, un agente farmacológico, un factor metabólico, un anticuerpo, un factor nutritivo, un factor angiogénico y un radioisótopo.

En una realización de la invención, la composición está cargada con células y más preferentemente células vivas. Las células pueden ser del núcleo pulposo, anillos fibrosos

: o una mezcla de las mismas. Alternativamente, las células pueden ser células madre embrionarias no humanas o células madre derivadas de un tejido seleccionado de entre el grupo constituido por médula ósea, tejido adiposo, músculo, cerebro, piel, hígado, músculo liso vascular, endotelio, sangre o placenta. De hecho, las células también pueden ser células primarias, células diferenciadas, células genéticamente modificadas, hibridomas, células inmortalizadas, células transformadas, células de fragmentos de tejido, orgánulos,

: o una mezcla de las mismas, células nucleadas, células enucleadas, células germinales, células plaquetarias, vesículas matriciales, vesículas celulares, pasta ósea desmineralizada, astillas de hueso, fragmentos de cartílago, o fragmentos de células o fragmentos de tejido, así como células autólogas, células alogénicas o células xenogénicas.

En una realización de la invención, el factor biológicamente activo es un factor de unión celular seleccionado de entre el grupo constituido por fibrinógeno, fibrina, fibronectina, ácido hialurónico, heparina, colágeno, polilisina, poliornitina, péptido cíclico de unión a receptores y proteína de unión a receptores.

El factor biológicamente activo puede ser también una enzima, un factor de crecimiento o una sustancia inmovilizada por factor de crecimiento, así como un ADN de plásmido en forma de liposomas, un complejo lipídico, un complejo de quitosano, un complejo de polilisina, un complejo de DEAE dextrano.

En una realización preferida, el factor biológicamente activo es una vacuna, para inmunización o bien pasiva o bien activa. Por tanto, la vacuna puede comprender una partícula viral infecciosa.

El factor biológicamente activo puede ser también un factor metabólico o nutritivo tal como un lípido, aminoácidos y un cofactor seleccionado de entre el grupo constituido por colesterol, glutamina, glucosamina, ácido ascórbico, piruvato y lactato.

El factor biológicamente activo puede ser además por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo constituido por sangre periférica, sangre del hueso, sangre del cordón umbilical, un producto sanguíneo, células transportadas por la sangre, suero, plaquetas, plasma rico en plaquetas, fibrinógeno, un factor de coagulación y una enzima transportada por la sangre.

En una realización de la invención, el factor biológicamente activo es una sustancia osteogénica tal como un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas seleccionado de entre el grupo constituido por TGF-β1, BMP-2, BMP-6, BMP-7 o una mezcla de las mismas.

Todavía según la presente invención, se proporciona la utilización de la composición de la presente invención para la reparación de tejidos blandos, para la administración específica de sitio de dicho factor biológicamente activo, para la reparación ósea, para reparar o resuperficializar cartílago dañado o para reparar el menisco. Según la presente invención, también se proporciona la utilización de la composición de la presente invención para la preparación de un medicamento para las diversas utilizaciones mencionadas en la presente memoria.

Por supuesto, un experto en la materia al que se le proporciona la composición de la presente invención, y al que se le dice que la composición puede utilizarse para las diversas utilizaciones mencionadas en la presente memoria, no tendrá ninguna dificultad para utilizar la composición en un método de tratamiento. Por consiguiente, estos métodos se incluyen también en la presente invención.

En la presente solicitud, la expresión “factores biológicamente activos” pretende incluir sin limitación cualquier componente biológicamente activo, célula que presente un efecto terapéutico, hormona, fármaco, ADN, agente de carga, factor de crecimiento, ADN, complejo de ADN-polímero, liposoma, agente farmacológico, factor metabólico, anticuerpo, factor nutritivo, factor angiogénico o radioisótopo, etc.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1A ilustra el procedimiento utilizado para generar un agente reticulante citocompatible reticulando hidroxietilcelulosa con glioxal;

la figura 1B ilustra un ejemplo de un mecanismo de gelificación mediante la mezcla de hidroxietilcelulosa reticulada con glioxal con quitosano;

la figura 1C ilustra diversos procedimientos para preparar el agente reticulante citocompatible;

las figuras 2A a 2C ilustran la caracterización espectral del agente reticulante activo e inactivo preparado mediante el procedimiento ilustrado en la figura 1C;

las figuras 2D a 2G demuestran la gelificación a lo largo de seis minutos tras el mezclado;

la figura 3 ilustra la evolución de G’ y G’’ con el tiempo a temperatura ambiente (25ºC) para una formulación reticulada típica que comprende la mezcla sucesiva de 0,12 g de quitosano (76% de DDA) disueltos en 9 ml de disolución de HCl 67 mM, 0,41 g de fosfato de b-glicerol disueltos en 1 ml de ddH2O y de 3 a 30 mg de hidroxietilcelulosa de calidad para reactivo Spectrum soluble en agua disueltos en 2 ml de solución de lactato de Ringer tamponada;

la figura 4A ilustra la viabilidad de células mantenidas en hidroxietilcelulosa, o

agente reticulante de glioxal durante más de una hora;

la figura 4B muestra la viabilidad de células (ensayo MTT para determinar el metabolismo de células vivas) y la proliferación celular (ensayo de ADN de Hoechst para reflejar la densidad celular) en geles de quitosano reticulados con glioxal o hidroxietilcelulosa-glioxal;

las figuras 5A y 5B ilustran la viabilidad de diversos tipos de células en gel de quitosano reticulado con hidroxietilcelulosa/aldehído (figura 5A), o glioxal (figura 5B);

la figura 5C ilustra la viabilidad comparable en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2%;

la figura 6 muestra ejemplos de composiciones típicas de geles de quitosano citocompatibles reticulados utilizando hidroxietilcelulosa-glioxal, o glioxal, utilizados para encapsular células viables, según la presente invención;

las figuras 7A a 7C muestran ejemplos de aplicaciones de administración celular en la reparación de cartílago utilizando geles de quitosano reticulados neutros utilizando hidroxietilcelulosa-glioxal o glioxal, dependiendo de la aplicación;

las figuras 8A y 8B muestran la persistencia del gel de quitosano reticulado in vivo, en defectos osteocondrales o articulares de conejo desde 1 día hasta 30 días tras la inyección; y

las figuras 9A y 9B muestran la formación de tejido de neocartílago in vitro (figura 9A) e in vivo (figura 9B) cuando se encapsulan condrocitos primarios en gel de quitosano reticulado utilizando hidroxietilcelulosa-glioxal como portador de células.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA REALIZACIÓN PREFERIDA

Según la presente invención, se proporciona un nuevo procedimiento de inmovilización de células en una matriz polimérica de quitosano soluble en ácido que se lleva a pH fisiológico con sal de fosfato de glicerol, y luego se reticula con hidroxietilcelulosa tratada con glioxal. El dialdehído bifuncional está presente como un producto intermedio de hemiacetal conjugado con hidroxietilcelulosa. Esta composición mantiene altos niveles de viabilidad celular, siempre que la disolución de quitosano sea estéril, y esté en disolución líquida a pH isotónico y aproximadamente neutro. Para este fin, puede esterilizarse quitosano soluble en ácido mediante autoclave, o esterilizarse la forma de sal en polvo cristalina de quitosano mediante exposición a luz UV antes de disolverse en agua. La masa molecular del quitosano puede variarse mediante hidrólisis dependiente de autoclave dando como resultado una pérdida de viscosidad reproducible, antes de ajustar a pH neutro con sal de fosfato de glicerol. En otra realización, pueden utilizarse otros tampones fosfato que aumentan la disolución de quitosano hasta pH 6,5 6,8, sin dar como resultado la precipitación del quitosano. La sal de fosfato de glicerol o el tampón fosfato añadidos lleva la osmolaridad final dentro de límites fisiológicamente tolerados, o entre 200 y 460 mOsm.

La dependencia del pH de la reticulación del quitosano está estrictamente relacionada con el porcentaje de grupos amina neutra libres disponibles para participar en el mecanismo de reticulación. Una proporción de este tipo de grupos amina neutra con respecto a amina protonada se ve afectada por el nivel de desacetilación del quitosano utilizado. El quitosano desacetilado al 95% puede reticularse a pH 5,0, mientras que el quitosano desacetilado al 80% sólo puede reticularse a un pH superior, por encima de 6,0. El pH más favorable utilizado para reticular el quitosano y simultáneamente retener la viabilidad celular está generalmente por encima de pH 6,5 a temperatura ambiente.

Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para encapsular y administrar células vivas a una placa petri de cultivo celular, tejido ex vivo,o in vivo dentro de un implante, herida, espacio orgánico o defecto. Además, se proporciona un procedimiento para la gelificación conjunta y la liberación sostenida de proteínas mezcladas, tales como IGF-1.

Las células se inmovilizan en una disolución líquida de quitosano neutro con la ayuda de un reactivo de reticulación. En la presente realización, el agente reticulante consiste en glioxal mezclado con un polímero que alberga grupos hidroxilo reactivos, tal como hidroxietil éter. La combinación glioxal-hidroxietilcelulosa presenta una toxicidad muy reducida para las células, porque la presencia de hidroxietilcelulosa dificulta que los grupos aldehído del glioxal reaccionen con la superficie celular. Los grupos amina del quitosano atacarán preferentemente los grupos hidroxilo reactivos del glioxal, dando como resultado una estructura reticular de grupos amina del quitosano unidos a glioxal con hidroxietilcelulosa intercalada a lo largo de la misma.

El medio fisiológico preferido utilizado para suspender el agente reticulante es un medio de nutrientes adecuado para cultivo celular, en contraposición a soluciones salinas no tamponadas o tamponadas sencillas.

Para inmovilizar células de manera homogénea, se resuspende completamente un

sedimento celular en una disolución acuosa de hidroxietilcelulosa que alberga glioxal,

luego se mezcla con una disolución de quitosano neutro. La mezcla resultante puede verterse o inyectarse en el molde o defecto apropiado, tras lo cual se produce la solidificación. El gel resultante presenta viscoelasticidad, adhesividad y dureza variables, dependiendo de las cantidades relativas de quitosano, glioxal e hidroxietilcelulosa presentes en la mezcla.

La disolución inyectable puede utilizarse también como agente de carga o sellante de tejidos.

La presente invención también incluye, pero no se limita a, el ejemplo de reparación de cartílago articular, en el que la administración de condrocitos primarios y/o transferidos con dicha mezcla a un defecto de cartílago articular mantendrá la viabilidad celular, y permitirá una diferenciación celular apropiada y la síntesis y el ensamblaje de una matriz extracelular de cartílago articular mecánicamente funcional densa in situ. La invención incluye la reparación de discos intervertebrales, en la que se administra gel reticulado, o gel reticulado cargado con células que producen matriz, al disco dañado.

La disolución inyectable también puede mezclarse previamente con factores de crecimiento, ADN, complejos de ADN-polímero, liposomas, agentes farmacológicos, factores metabólicos, anticuerpos, factores nutritivos, factores angiogénicos o radioisótopos. Para llevar a cabo esto, estos factores pueden mezclarse o bien con la disolución de quitosano neutro, o bien con la disolución de glioxal-hidroxietilcelulosa reticulante, antes de combinar el quitosano y el agente reticulante.

En otra realización, las células pueden suspenderse en una disolución de quitosano neutro, mezclarse luego en disolución neutra de hidroxietilcelulosa, con una gama de volúmenes proporcionales de quitosano/hidroxietilcelulosa/agente reticulante.

La hidroxietilcelulosa tratada con glioxal necesaria para reticular el quitosano se obtiene preferentemente mediante uno de varios procedimientos a partir de hidroxietilcelulosa de calidad no farmacéutica de viscosidad media comercialmente disponible. En el procesamiento industrial de rutina, se trata la superficie de la hidroxietilcelulosa con glioxal para inducir reticulaciones. La hidroxietilcelulosa reticulada se disuelve lentamente en agua, y por tanto presenta una formación de grumos reducida. Es en estas preparaciones en las que puede obtenerse agente reticulante de quitosano activo. La hidroxietilcelulosa de calidad farmacéutica, que se ha tratado para eliminar el glioxal, no puede utilizarse para preparar agente reticulante de quitosano activo.

Pueden utilizarse varios procedimientos para preparar agente reticulante

citocompatible. Mediante un procedimiento, ciertos tipos de hidroxietilcelulosa de viscosidad media (Fluka) pueden disolverse completamente a 25 mg/ml en disolución acuosa a pH fisiológico. En un procedimiento (procedimiento 4), se diluye una disolución de glioxal al 40% (8,76 M) hasta 750 µM en medio fisiológico. La disolución resultante puede utilizarse como agente reticulante activo mezclando 1 parte con 4 partes de quitosano neutro, esterilizándose luego mediante filtración a través de un filtro de 0,22 mm (procedimiento 1, figura 1C). La figura 1C ilustra el procedimiento 1, en el que hidroxietilcelulosa de viscosidad media (3.400 cPa), de calidad no farmacéutica, de Fluka que presenta un tiempo de disolución lento en agua, se ha reticulado con glioxal para retrasar la velocidad de hidratación y minimizar la formación de grumos. Si se disuelve completamente a de 12,5 mg/ml a 25 mg/ml en medio fisiológico, la disolución resultante puede esterilizarse por filtración a través de un filtro de 0,22 µm, y utilizarse como agente reticulante activo mezclando 1 parte de hidroxietilcelulosa filtrada con 4 partes de quitosano neutro al 1,5%.

Mediante otro procedimiento, se trata la superficie de hidroxietilcelulosa de calidad farmacéutica con glioxal y se seca antes de disolverla en medios fisiológicos y esterilizarse por filtración (procedimiento 2, figura 1C). En el procedimiento 2 ilustrado en la figura 1C, se combina hidroxietilcelulosa de viscosidad media o baja (calidad farmacéutica: por debajo de 500 ppm de glioxal o sin glioxal), con de 2500 ppm a 3500 ppm de glioxal en un disolvente polar, y se seca para generar hidroxietilcelulosa con la superficie tratada con glioxal. El polvo resultante puede disolverse a 25 mg/ml en medio fisiológico, esterilizarse por filtración y utilizarse como agente reticulante activo tal como se describió para el procedimiento 1 anteriormente. Mediante otro procedimiento, se mezcla hidroxietilcelulosa a 25 mg/ml con ddH2O durante 15 minutos a temperatura ambiente, cuando las partículas son resistentes a la solubilización en agua.

En el procedimiento 3 de la figura 1C, hidroxietilcelulosa de viscosidad media, de calidad no farmacéutica, de Spectrum o Fluka, presentan ambas un tiempo de disolución lento en agua. Se recupera la fracción de hidroxietilcelulosa soluble en agua, se liofiliza y el sólido resultante se resuspende en disolución acuosa, que es fisiológica en cuanto a pH y osmolaridad (procedimiento 3, figura 1C). Si se mezcla la hidroxietilcelulosa durante 15 minutos en agua, la fase acuosa que contiene hidroxietilcelulosa de bajo peso molecular y además glioxal reactivo puede recuperarse eliminando por centrifugación los compuestos insolubles y filtrando a través de un filtro de 0,22 µm. La disolución resultante puede concentrarse y utilizarse para reticular quitosano neutro mezclando 1 parte (de 1 mg/ml a 30 mg/ml) de hidroxietilcelulosa soluble en agua con 4 partes de quitosano neutro.

Alternativamente, también puede diluirse glioxal hasta la concentración presente en hidroxietilcelulosa con superficie tratada (próxima al 0,001%) en medio fisiológico y esterilizarse por filtración (procedimiento 4, figura 1D). En el procedimiento 4 de la figura 1C, se diluye una disolución de glioxal al 40% (8,76 M) hasta 750 µM en medio fisiológico. La disolución resultante puede utilizarse como agente reticulante activo mezclando 1 parte con 4 partes de quitosano neutro. Algunos polvos de hidroxietilcelulosa comerciales formarán un gel cuando se disuelven completamente a 25 mg/ml (Spectrum, Hercules). En este caso, sólo puede obtenerse agente reticulante reactivo si la hidroxietilcelulosa se ha reticulado con glioxal, u otro reactivo similar, y si el material soluble en agua (que contiene hidroxietilcelulosa reticulada de bajo peso molecular) puede extraerse a partir de partículas que se disuelven lentamente. Independientemente del procedimiento utilizado para preparar la disolución de hidroxietilcelulosa, una vez hidratada, la disolución deberá protegerse de la hidrólisis o de cambios conformacionales mediante almacenamiento en congelación.

El agente reticulante activo puede purificarse a partir de una fracción de bajo peso molecular (por debajo de 1000 Da) de hidroxietilcelulosa soluble en agua de Spectrum. Sin embargo, cuanto más se purifica el agente reticulante, más tóxico es el efecto que presenta sobre las células. Por tanto, las condiciones de reticulación óptimas para la viabilidad celular son aquellas que utilizan un agente de reticulación en presencia de un polímero alternativo con el que el agente reticulante puede reaccionar, pero que presenta menos afinidad por el agente reticulante que por los grupos amina neutra del quitosano. Cuando el efecto tóxico aparente se debe a la purificación conjunta de contaminantes a partir de la preparación de hidroxietilo inicial, esta toxicidad puede evitarse parcialmente utilizando glioxal puro a concentraciones sumamente diluidas en medios.

La disolución de hidroxietilcelulosa utilizada para reticular la disolución de quitosano-fosfato de glicerol es preferentemente del 0,5% al 98% de la masa aparente de quitosano presente en la disolución líquida. La disolución se esteriliza preferentemente mediante filtración a través de un filtro de 0,22 mm. Para los expertos en la materia, resulta obvio que cualquier compuesto reactivo multifuncional que pueda formar reticulaciones reversibles con un portador polimérico adecuado podrá utilizarse como agente reticulante citocompatible, de toxicidad reducida para cualquier polímero que contenga amina, para atrapar células o moléculas bioactivas que son sensibles a la incubación con el compuesto multifuncional solo.

Una vez preparada, la hidroxietilcelulosa soluble en agua concentrada se suspende en una disolución tamponada fisiológica, tal como solución salina tamponada con fosfato, lactato tamponado de Ringer, medio de cultivo celular tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco, solución salina al 0,9% estéril, u otras preparaciones de medios nutritivos citocompatibles utilizados en cultivo celular. Para la administración de algunas sustancias bioactivas, productos químicos, liposomas, radioisótopos o agentes farmacéuticos, la hidroxietilcelulosa puede suspenderse en agua u otras condiciones con el fin de combinarse completamente con estos materiales antes de mezclarse con el quitosano. Para casos tales como este, el quitosano no necesita llevarse necesariamente a pH fisiológico, sino que en su lugar puede disolverse quitosano desacetilado al 95% en una cantidad mínima de ácido, y utilizarse a un pH de 4,0 a 5,5.

La presente invención demuestra que el mecanismo de gelificación de disoluciones de quitosano neutro utilizando agente reticulante de hidroxietilcelulosa sólo puede producirse cuando la disolución de hidroxietilcelulosa se ha combinado previamente con glioxal en un tratamiento de superficie durante la preparación industrial a gran escala rutinaria. La presente invención demuestra además que la actividad de reticulación de la hidroxietilcelulosa se pierde cuando se elimina el glioxal mediante diálisis, o mediante otros tratamientos específicos utilizados para eliminar el glioxal para generar un producto de calidad farmacéutica. Se muestra en la presente invención que a bajas concentraciones (por debajo del 0,01%), puede utilizarse glioxal para reticular disoluciones de quitosano neutro mientras que se mantiene la viabilidad celular, sin embargo, el metabolismo celular inicial (como índice de viabilidad celular) de células encapsuladas en tales geles reticulados con glioxal es inferior al de células encapsuladas con hidroxietilcelulosa-glioxal. La cinética de la gelificación mostrada en los ejemplos de esta invención es compatible con la utilización clínica, desde segundos hasta una hora, y permite la gelificación y retención del gel con o sin células y/o agentes médicamente activos en una cavidad corporal, placa Petri o herida abierta.

En las figuras 2A a 2G, la actividad de reticulación se correlaciona con aquellas fracciones de hidroxietilcelulosa que contienen picos de 1H-RMN de tipo aldehído (pico a 8,3 ppm) y picos de hemiacetal (3,8 ppm). Se preparó el agente reticulante según el procedimiento 3 en la figura 1C, y posteriormente se fraccionó mediante ultrafiltración para recoger fracciones por encima y por debajo de 1000 Da. Se sometió cada fracción a análisis por RMN (paneles superiores). Se suspendió cada una de las fracciones a 7,5 mg/ml en ddH2O, y se mezcló con quitosano neutro a 1 parte de fracción de hidroxietilcelulosa, 5 partes de disolución de quitosano neutro al 1,5%. Se depositaron las muestras sobre una placa Petri de plástico, y se inclinaron a intervalos calculados para demostrar la gelificación (paneles inferiores). Sin fraccionar, y la fracción de baja masa molecular (por debajo de 1000 Da) indujeron una rápida gelificación del quitosano en el plazo de 5 minutos. La hidroxietilcelulosa dializada no pudo gelificar el quitosano, indicando que la hidroxietilcelulosa no es suficiente para reticular el quitosano en las condiciones de prueba. Ambas muestras de agente reticulante activo albergan picos consecuentes con la presencia de un aldehído (8,3 ppm) y un hemiacetal (3,8 ppm).

En la figura 3, t=0 se produce 1,6 minutos tras el mezclado. Los resultados muestran una dependencia de la dosis entre el tiempo de gelificación y la concentración de hidroxietilcelulosa-glioxal.

En la figura 4A, se mantiene una alta viabilidad tras la encapsulación en quitosano reticulado con glioxal, o hidroxietilcelulosa-glioxal. La figura 4A ilustra que el agente reticulante de hidroxietilcelulosa activo es citocompatible. Se incubaron las células hasta 72 horas en agente reticulante activo, permaneciendo viables más del 95%. Células incubadas en peróxido al 0,3% durante el mismo periodo de tiempo son el 100% no viables. Tras mezclar con quitosano e inyectar a través de una jeringuilla con una aguja de calibre 26, las células encapsuladas en un gel sólido permanecieron más del 95% viables. Tras mezclarlas con quitosano y verterlas en una placa Petri, las células encapsuladas en un gel sólido permanecieron más del 95% viables tras 1 día de cultivo.

En la figura 4B, tal como se muestra mediante el ensayo MTT en células encapsuladas en el día 1, la hidroxietilcelulosa ofrece protección adicional a las células inmediatamente tras la encapsulación. Las células encapsuladas en gel de quitosano utilizando o bien glioxal o bien hidroxietilcelulosa-glioxal son viables tras la encapsulación y proliferan en el gel. Las células muestran una mayor viabilidad tal como se mide mediante un ensayo MTT metabólico, en el día 1 tras la encapsulación cuando el agente reticulante activo es hidroxietilcelulosa-glioxal, en comparación con agente reticulante de glioxal.

En las figuras 5A a 5C, el color verde es indicativo de células vivas y el color rojo es indicativo de células muertas. Tal como puede observarse, la figura 5A muestra la persistencia de una gama de tipos celulares viables incluidos en geles de quitosano reticulados con hidroxietilcelulosa-glioxal, incluyendo líneas celulares de fibroblastos Rat-1, COS, condrocitos primarios bovinos y condrocitos transferidos bovinos en la inclusión y tras el cultivo. La figura 5B muestra la persistencia de células COS y la viabilidad celular de condrocitos bovinos transferidos en geles de quitosano reticulados con glioxal. La

5 figura 5C muestra una viabilidad comparable de condrocitos bovinos primarios y transferidos incluidos en agarosa de bajo punto de fusión al 2%.

Aunque la invención se ha descrito en relación a formas de realización específicas

de la misma, se entenderá que pueden hacerse modificaciones adicionales y esta solicitud

pretende cubrir cualquier variación, utilización o adaptación de la invención que siga, en

10 general, los principios de la invención y que incluya desviaciones de la presente descripción tales que se encuentren dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que se refiere la invención y que puedan aplicarse a las características esenciales expuestas anteriormente en la presente memoria, y tal como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

-15

1. Composición para inmovilizar y encapsular células funcionales y viables o

sustancias bioactivas que comprende: a) una disolución de polisacárido líquida de quitosano neutro isotónico; y b) una disolución reticulante que consiste en hidroxietilcelulosa tratada con glioxal disuelta en un medio fisiológico.
2. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición comprende: a) del 0,5 al 5,0% en peso de quitosano; y b) del 0,01 al 5,0% en peso de hidroxietilcelulosa tratada con glioxal, en la que dicha disolución forma un gel entre temperaturas de 4ºC y 42ºC,

proporcionando dicho gel un entorno fisiológico para mantener la viabilidad de las células.
3. Composición según la reivindicación 2, que comprende además: c) el 0,0001-3% de glioxal.
4.

Composición según la reivindicación 2, en la que la composición forma un gel en un periodo comprendido entre segundos y varias horas tras mezclar (a) y (b).
5.

Composición según la reivindicación 3, en la que la composición forma un gel en un periodo comprendido entre segundos y varias horas tras mezclar (a), (b) y (c).
6.

Composición según la reivindicación 2, en la que la disolución forma un gel entre temperaturas de 20ºC y 42ºC.
7.

Composición según la reivindicación 1, en la que el quitosano se disuelve en ácido diluido y se mezcla con entre el 1,0 y el 2,5% en peso de una sal de poliol que consiste en sal dibásica de monofosfato, o sal de monosulfato.
8.

Composición según la reivindicación 7, en la que dicha sal dibásica de monofosfato es sal dibásica de monofosfato de glicerol.
9.

Composición según la reivindicación 7, en la que la sal dibásica de monofosfato de glicerol se selecciona de entre el grupo constituido por sal dibásica de glicerol-2-fosfato, sal dibásica de sn-glicerol-3-fosfato y sal dibásica de L-glicerol-3-fosfato.
10.

Composición según la reivindicación 1, en la que el quitosano se mezcla además con sal y tampón fosfato.
11.

Composición según la reivindicación 1, que comprende además un factor biológicamente activo.
12.

Composición según la reivindicación 11, en la que el factor biológicamente activo se selecciona de entre el grupo constituido por células, una hormona, un fármaco, ADN, un agente de carga, un factor de crecimiento, un ADN, complejo ADN-polímero, liposomas, un agente farmacológico, un factor metabólico, un anticuerpo, un factor nutritivo, un factor angiogénico y un radioisótopo.
13.

Composición según la reivindicación 12, en la que dichas células son células vivas.
14.

Composición según la reivindicación 12, en la que la que las células son del núcleo pulposo, anillos fibrosos o una mezcla de las mismas.
15.

Composición según la reivindicación 12, en la que las células son células madre embrionarias no humanas o células madre derivadas de un tejido seleccionado de entre el grupo constituido por médula ósea, tejido adiposo, músculo, cerebro, piel, hígado, músculo liso vascular, endotelio, sangre o placenta.
16.

Composición según la reivindicación 12, en la que las células son células primarias, células diferenciadas, células genéticamente modificadas, hibridomas, células inmortalizadas, células transformadas, células de fragmentos de tejido, orgánulos, o una mezcla de las mismas, células nucleadas, células enucleadas, células germinales, células plaquetarias, vesículas matriciales, vesículas celulares, pasta ósea desmineralizada, astillas de hueso, fragmentos de cartílago, o fragmentos de células o fragmentos de tejido.
17.

Composición según la reivindicación 12, en la que las células son células autólogas, células alogénicas o células xenogénicas.
18.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es un factor de unión celular seleccionado de entre el grupo constituido por fibrinógeno, fibrina, fibronectina, ácido hialurónico, heparina, colágeno, polilisina, poliornitina, péptido cíclico de unión a receptores, proteína de unión a receptores.
19.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es una enzima, un factor de crecimiento o una sustancia inmovilizada por factor de crecimiento.
20.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es un ADN de plásmido en forma de liposomas, un complejo lipídico, un complejo de quitosano, un complejo de polilisina, un complejo de DEAE dextrano.
21.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es una vacuna.
22.

Composición según la reivindicación 21, en la que la vacuna comprende una partícula viral infecciosa.
23.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es un factor metabólico o nutritivo.
24.

Composición según la reivindicación 23, en la que el factor metabólico o nutritivo es un lípido, aminoácidos y un cofactor seleccionado de entre el grupo constituido por colesterol, glutamina, glucosamina, ácido ascórbico, piruvato y lactato.
25.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es por lo menos un elemento seleccionado de entre el grupo constituido por sangre periférica, sangre del hueso, sangre del cordón umbilical, un producto sanguíneo, células

transportadas por la sangre, suero, plaquetas, plasma rico en plaquetas, fibrinógeno, un factor de coagulación y una enzima transportada por la sangre.
26.

Composición según la reivindicación 12, en la que el factor biológicamente activo es una sustancia osteogénica.
27.

Composición según la reivindicación 26, en la que la sustancia osteogénica es un miembro de la familia de proteínas morfogenéticas óseas seleccionado de entre el grupo constituido por TGF-β1, BMP-2, BMP-6, BMP-7 o una mezcla de las mismas.
28.

Composición según la reivindicación 1, en la que el polímero que contiene hidroxilo es poli(alcohol vinílico), dextrano, unido con un aldehído reactivo bifuncional.
29.

Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a la reparación de tejidos blandos.
30.

Utilización de la composición según la reivindicación 12 ó 13 para la preparación de un medicamento destinado a la administración específica de sitio de dicho factor biológicamente activo.
31.

Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a la reparación ósea.
32.

Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento destinado a reparar o resuperficializar el cartílago dañado.
33.

Utilización de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28 para la preparación de un medicamento para reparar el menisco.
34.

Composición según la reivindicación 1, en la que el medio fisiológico comprende nutrientes celulares seleccionados de entre el grupo constituido por glucosa, aminoácidos y vitaminas, o una combinación de los mismos, a pH neutro e isotónico.