IT201600111352A1 - Materiale poroso per l’inclusione di preparati citologici, procedimento per l’ottenimento dello stesso e suo uso - Google Patents

Materiale poroso per l’inclusione di preparati citologici, procedimento per l’ottenimento dello stesso e suo uso

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IT201600111352A1
IT201600111352A1 IT102016000111352A IT201600111352A IT201600111352A1 IT 201600111352 A1 IT201600111352 A1 IT 201600111352A1 IT 102016000111352 A IT102016000111352 A IT 102016000111352A IT 201600111352 A IT201600111352 A IT 201600111352A IT 201600111352 A1 IT201600111352 A1 IT 201600111352A1
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Anna Crescenzi
Marcella Trombetta
Chiara Taffon
Alberto Rainer
Pamela Mozetic
Marco Costantini
Antonio Santoro
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Univ Campus Bio Medico Di Roma
Ucs Diagnostic S R L
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Description

MATERIALE POROSO PER L’INCLUSIONE DI PREPARATI CITOLOGICI, PROCE¬
DIMENTO PER L’OTTENIMENTO DELLO STESSO E SUO USO
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un materiale poroso destinato all’Inclusione di preparati citologici quali ad es. il materiale bioptico da procedure di ago aspirato con elevato grado di efficienza.
Il materiale oggetto della presente invenzione ha un’elevata affinità per il materiale cellulare, che viene trattenuto all’interno delle maglie del medesimo, massimizzando la resa. Il materiale, caricato con l’infiltrato cellulare, può essere sottoposto alle convenzionali procedure di fissazione con aldeidi, e il processo di fissazione aumenta la stabilità del preparato in analogia a un tessuto biologico. Il preparato si dimostra compatibile con tutte le tecniche istologiche applicabili a tessuti fissati, nonché con le più avanzate analisi che prevedono il recupero di materiale genetico dalle fettine istologiche.
Stato della tecnica
Le domanda di brevetto US 5817032 A ( Means and method for harvesting and handling tissue samples for biopsy analysis) e US 8383067 B2 ( Biopsy support with sectionable resilient cellular material) svelano un materiale poroso a struttura cellulare e compatibile con la microtomia per facilitare il posizionamento e il mantenimento di un campione di tessuto all’interno della “cassetta”.
La domanda di brevetto WO 2010030358 A1 ( Scaffold for tissue sample orìentatiorì) svela materiali con caratteristiche di idrogel che permettano l’orientazione di campioni di tessuto e la loro inclusione a fini istologici.
La letteratura riporta notevoli esempi in cui biomateriali porosi a base chitosano, prodotti con diversi metodi (schiume, fibre, etc.) sono impiegati per scopi di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa [1] i.e. allo scopo di seminare cellule viventi e permetterne la crescita, stimolando la morfogenesi di un neo-tessuto, o come sistemi a rilasci di farmaco [2-3],
In particolare, schiume di chitosano possono essere prodotte con svariate tecniche di schiumatura, che includono anche approcci microfluidici [4]
La domanda di brevetto EP 2394670 A1 ( Chitosan-based biomimetic scaffolds and methods for preparing thè same ) svela un metodo per la preparazione di scaffold in chitosano ad almeno 2 layer, di cui almeno uno composto da fibre e almeno uno a struttura porosa di supporto.
Mayall FG et al ( J din Pathol 2011, 64, 818-819) descrivono un metodo per effettuare inclusioni di materiale citologico da campioni sierosi utilizzando una schiuma di gelatina; il processo prevede la centrifugazione del liquido sieroso e la rimozione del sovranatante, con l’ottenimento di un deposito di cellule che viene fatto assorbire su uno strato di schiuma di gelatina, seguito da fissazione in alcool o formalina.
La domanda di brevetto UK GB2499665A svela un dispositivo che comprende un alloggiamento e un materiale per inclusione, in cui un’estremità dell’alloggiamento può essere collegato a un ago, mentre il materiale da inclusione è contenuto almeno in parte in detto alloggiamento, realizzando una connessione fluidica con detto ago. In questo modo, l’invenzione svela un processo per l’infiltrazione di materiale citologico nel materiale da inclusione durante la procedura di ago aspirato.
Questa tecnica tuttavia si è mostrata poco efficiente sia nel catturare il materiale aspirato durante la manovra, sia nel trattenere tale materiale durante le procedure di fissazione ed inclusione in paraffina. La cattura del materiale è infatti limitata dalla presenza di interconnessioni random tra le celle del supporto poroso che talora risultano non comunicanti ed arrestano la progressione del materiale aspirato dentro il supporto. Il materiale non entrato nel supporto si deposita sulla superficie e viene perso per distacco durante l’immersione in formalina o i successivi passaggio di processazione. Ne risulta un supporto di buona consistenza al taglio in paraffina ma contenente una quota troppo scarsa di cellule.
L’analisi citologica è un esame largamente diffuso, economico ed affidabile per la diagnosi patologica, ha tuttavia lo svantaggio di non conservare a lungo il campione biologico per successive analisi quali la caratterizzazione immunoistochimica e i test molecolari che sono invece diventati parte integrante del referto in molte aree di patologia. Per questo motivo, sono stati introdotti sul mercato idrogeli destinati a includere un “pellet” di cellule (ottenuto mediante centrifugazione), che possano essere processati mediante tecniche istologiche, che prevedono la realizzazione di un “blocchetto” di materiale di inclusione contenente il campione, il quale può essere conservato, analogamente ai tessuti istologici, fissato in formalina, incluso in paraffina e sottoposto ad operazioni di taglio successive, al fine di ricavare fettine su cui effettuare le indagini microscopiche. Il materiale così lavorato prende in nome di citoincluso o cell-block.
Dal momento che questa tecnica è laboriosa, sono stati recentemente sviluppati supporti porosi destinati ad essere direttamente infiltrati con sospensioni cellulari, al fine di ottenere un preparato istologico da materiale citologico.
Detti supporti, però, presentano numerose limitazioni in quanto il substrato polimerico impiegato ha caratteristiche dissimili da un tessuto e mal si adatta alle tecniche istologiche tradizionali. Inoltre, i preparati sono caratterizzati da bassa cellularità e scarsa affinità dell'infiltrato cellulare per il substrato.
È stato sorprendentemente trovato che una struttura porosa a base di chitosano aumenta l'efficacia del processo di trattenimento di sospensioni cellulari dispensate su di essa. Formano pertanto oggetto della presente invenzione un materiale poroso a base di chitosano, procedimenti per la sua produzione e il suo impiego come supporto per l’inclusione di cellule eucariote o procariote ai fini del loro processamento con tecniche di inclusione istologiche. Il materiale poroso secondo l’invenzione mostra sorprendentemente un’elevata affinità per il materiale cellulare, che viene trattenuto all’interno delle maglie del medesimo, massimizzando la resa. Il materiale oggetto della presente invenzione è processabile con tecniche istologiche standard in analogia ai tessuti biologici.
Breve descrizione delle figure
Alla presente invenzione sono allegate quattro figure che mostrano
Figura 1 (A,B) Confronto tra un substrato commerciale e Figura 1(C,D) il materiale oggetto della presente invenzione.
A) Limitata penetrazione e adesione del materiale cellulare in seguito a infiltrazione del substrato commerciale. B) Aspecificità di una colorazione nucleare su fettine istologiche ottenute a partire dal substrato commerciale. C) Aumentata penetrazione e adesione delle cellule sul materiale oggetto della presente invenzione. D) Ottima specificità della colorazione nucleare su fettine istologiche del materiale oggetto della presente invenzione in seguito a inclusione e taglio. Nella Figurai si riporta, a titolo di esempio, un confronto tra un supporto commerciale CytoFoam (di cui alla domanda di brevetto UK GB2499665A) e i supporti porosi oggetto della presente invenzione.
Il supporto commerciale mostra una bassa cellularizzazione e scarsa adesione del materiale cellulare al substrato polimerico (Fig. 1 A). Inoltre, la difficoltà nel processamento del materiale è dimostrata dalla forte aspecificità della colorazione nucleare effettuata mediante tecniche immunoistochimiche (Fig. 1B). Contrariamente al materiale commerciale, le proprietà del materiale oggetto della presente invenzione aumentano la penetrazione della sospensione cellulare e garantiscono un’ottima adesione del materiale cellulare al substrato poroso (Fig. 1C). Questo si riflette in un miglior esito delle procedure istologiche, come è osservabile dalla forte specificità di una colorazione nucleare effettuata mediante immunoistochimica (Fig. 1D).
Descrizione dettagliata dell’Invenzione
La presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione di un materiale poroso destinato all’inclusione di preparati citologici; il materiale poroso sostanzialmente comprende schiume in chitosano e/o derivati del chitosano a vario grado di derivatizzazione.
Il materiale poroso secondo l’invenzione è ottenuto a partire da una soluzione di chitosano e,o di un suo derivato lattosilato oppure di un derivato vinilico del chitosano (da solo o in miscela con un derivato solfidrico), aventi un peso molecolare tra 50 e 200 kDa, essendo 100 kDa il peso molecolare preferito. Detto chitosano o i suoi derivati lattosilato o vinilico da solo o in miscela con un derivato solfidrico vengono disciolti ad una percentuale tra lo 0.1 e il 4% peso/volume, essendo 2% peso/volume la concentrazione preferita, in una soluzione acida in un range di pH 2-6, costituita da un acido inorganico polare o da un acido organico polare; vantaggiosamente l’acido lattico al 2% peso/volume è il solvente preferito. In una variante dell’invenzione come solvente del chitosano può essere impiegato acido 2-(N-morfolino) etansolfonico.
Come derivato lattosilato del chitosano può essere citato il Chitlac, ottenuto mediante formazione di una base di Schifi tra un gruppo amminico primario presente lungo la catena del chitosano e il gruppo aldeidico presente nella forma aperta dell’estremità riducente del lattosio, con grado di derivazione 5-70%; come derivato vinilico del chitosano può essere citato il chitosano metacrilato, ottenuto mediante reazione di metacrilazione con anidride metacrilica, con grado di derivazione 5-40%; idonei derivati solfidrilici possono essere preparati mediante reazione delle ammine primarie del chitosano con acidi mercaptanici, quale ad esempio l’acido mercaptoetanoico, l’acido mercaptopropanoico, ecc., catalizzati da carbodiimidi/succinimmide, con grado di derivatizzazione 5-40%. Nel secondo passaggio del procedimento secondo l’invenzione (operazione b, gelificazione), nel caso di una soluzione di chitosano o di un suo derivato lattosilato, la soluzione viene gelificata utilizzando un agente reticolante, che può essere costituito da una dialdeide ad una concentrazione di 0.03 - 0.05 %(peso/volume sul totale), vantaggiosamente glutaraldeide allo 0.04%. Vantaggiosamente la gelificazione ha luogo all’Interno di stampi, in una realizzazione preferita di forma parallelepipeda a base quadrata. In un’altra realizzazione preferita, detti stampi hanno forma cilindrica. In un’altra variante gli stampi hanno la forma finale dell’oggetto da ottenere. Il materiale poroso può essere conformato in strutture porose di grandi dimensioni, quali lastre o blocchi, da cui ricavare i supporti per inclusione nella forma finale mediante operazioni di taglio
Nel caso di una soluzione di un derivato vinilico del chitosano (da solo o in miscela con un derivato solfidrico), la gelificazione viene realizzata per fotopolimerizzazione mediante aggiunta di un fotoiniziatore ed esposizione ad una sorgente UV. Vantaggiosamente detto fotoiniziatore è Irgacure 2959 in concentrazione di 0.5 - 2.0% in peso e l’esposizione a detta sorgente UV avviene ad una lunghezza d’onda di 250 - 405 nm e a una dose tra 0.1 e 20 J/cm<2>.
La gelificazione - nel caso di un derivato vinilico del chitosano (da solo o in miscela con un derivato solfidrilico) - può altresì avvenire per polimerizzazione radicalica mediante riscaldamento a temperature comprese tra 30 e 70 °C, essendo 50 °C la tempe ratura preferita, in presenza di un catalizzatore radicalico, essendo ammonio persolfato alla concentrazione di 0.2 - 1.5% in peso il catalizzatore preferito.
Al termine della operazione b), in tutte le varianti del procedimento sopra descritte si ottiene un idrogel.
Per l'ottenimento del materiale poroso secondo l'invenzione si procede ad una operazione di liofilizzazione - secondo tecniche note nella tecnica - dell’idrogel ottenuto. La liofilizzazione può essere eventualmente preceduta da una serie lavaggi dell’idrogel in acqua o soluzioni tampone a pH neutro, allo scopo di neutralizzarne l’acidità.
Per meglio regolare gli effetti della liofilizzazione sulla porosità del materiale ottenuto, nel procedimento dell’invenzione si possono seguire le seguenti varianti che formano oggetto anch’esse della presente invenzione.
Secondo una prima variante, per la regolazione della struttura porosa prima della operazione di gelificazione all’interno di soluzione di chitosano e, o suoi derivati viene aggiunto un surfattante ionico o nonionico ad una concentrazione tra lo 0.01% e il 2% e viene insufflato gas inerte, ad esempio azoto.
Secondo una ulteriore variante, prima della operazione di gelificazione all’interno di della soluzione di chitosano e,o suoi derivati viene aggiunto sotto agitazione un surfattante ionico o non ionico ad una concentrazione tra lo 0.01% e il 2% e un liquido non polare, vantaggiosamente cicloesano puro producendo un’emulsione olio-in-acqua comprendente come fase continua la soluzione e come fase dispersa il liquido non polare. La fase dispersa viene estratta dopo la gelificazione della fase continua mediante alcoli alchilici inferiori, vantaggiosamente etanolo. Il surfattante ionico o nonionico (quale ad es. tyloxapol aggiunto ad una concentrazione tra lo 0.01% e il 2%) svolge la funzione di stabilizzante della schiuma/emulsione.
Il materiale poroso ottenibile dal procedimento secondo l’invenzione presenta pori interconnessi di dimensione tra i 5 e i 700 pm e una porosità totale (frazione volumetrica) tra 40 e 90%.
Il materiale oggetto dell’invenzione trova impiego per l’inclusione di preparati citologici per tecniche di diagnosi istologica come tale o a seguito di inclusione in paraffina, resine acriliche, poliuretaniche, epossidiche, mezzi di inclusione a freddo. Come conseguenza, le procedure sopra riportate possono essere impiegate per la produzione di supporti per inclusione direttamente della forma desiderata, utilizzando stampi di dimensioni opportune. Possono, altresì essere prodotte strutture porose di grandi dimensioni (lastre o blocchi) da cui ricavare i supporti per inclusione nella forma finale mediante operazioni di taglio.
I supporti per inclusione così ottenuti vengono irrorati con cellule ottenute da una procedura di ago aspirato, seguita da fissazione con un idoneo agente di fissazione, quale paraformaldeide (dall’1 al 4%) o glutaraldeide (dallo 0.1 al 5%). Va sottolineato che, nel caso della presente invenzione, il supporto poroso partecipa alla reazione di fissazione creando dei legami (cross-link) tra le cellule e il materiale stesso, e questo si riflette in una aumentata stabilità del preparato istologico che mostra caratteristiche di processabilità simili a un tessuto biologico. Il preparato fissato può dunque essere processato con le consuete tecniche istologiche di stato dell’arte per tessuti biologici che includono: inclusione in paraffina, resine acriliche, poliuretaniche, epossidiche, mezzi di inclusione a freddo (come ad esempio Shandon Cryomatrix) e in seguito sottoposti alle consuete analisi istologiche che includono: colorazioni istologiche (non limitatamente a ematossilina, eosina, tricromica di Masson, von Kossa, safranina O, blu di toluidina, AdipoRed, etc.), immunoistochimica, immunofluorescenza, immunogold, microscopia SEM e TEM.
II materiale poroso secondo l’invenzione può essere contenuto all’interno di alloggiamenti (“cassette”) dedicati all’utilizzo in combinazione con sistemi automatizzati di processamento.
Esempi
Vengono forniti a titolo esemplificativo e non limitante tre applicazioni del materiale oggetto della presente invenzione.
CARATTERIZZAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI NODULI TIROIDEI
Il semplice agoaspirato della lesione nodulare, ha infatti il limite di non riuscire a differenziare proliferazioni follicolari benigne da quelle maligne, motivo per il quale la letteratura propone l’uso di un panel di anticorpi che aumenta sensibilità e specificità dell’esame. Trattandosi di più anticorpi da valutare, si rende necessaria la disponibilità di sezioni in paraffina multiple del materiale agoaspirato e le linee guida internazionali dichiarano testualmente che è necessaria la disponibilità di un citoincluso [5],
Il materiale oggetto della presente invenzione viene irrorato con il materiale da ago aspirato, dopodiché viene sottoposto a fissazione mediante immersione in formalina 4% o altro fissativo per citologia per 8-12 ore.
Per la preparazione dei vetrini, il supporto fissato viene sottoposto a disidratazione mediante serie crescente degli alcoli (etanolo al 30%, 50%, 70%, 95% 2x 100%, 20 minuti ciascuno) e xilene (2x 30 minuti), prima di essere infiltrato in paraffina fusa a 56 °C. Il supporto viene in seguito sottoposto a inclusione in blocchetto di paraffina sezionato al microtomo (spessore 4-5 pm). Le fettine vengono recuperate e adagiate su un vetrino secondo metodica convenzionale, sparaffinate e portate all’acqua mediante serie decrescenti degli alcoli.
Vengono effettuate le seguenti colorazioni:
- ematossilina/eosina (secondo protocollo del fornitore) per rivelare la morfologia del preparato.
- marker nucleare TTF1 mediante anticorpo di topo anti-TTF1 umano(30 minuti a temperatura a temperatura ambiente) e anticorpo secondario anti-mouse coniugato con sistema a polimero.
-marker citoplasmatico Gal3 mediante anticorpo di topo anti-Gal3 umana (30 min a RT) e anticorpo secondario anti-mouse coniugato con sistema a polimero.
CARATTERIZZAZIONE IMMUNOISTOCHIMICA DI NODULI POLMONARI
La patologia neoplastica del polmone necessita di una accurata caratterizzazione delle cellule neoplastiche, che assume carattere irrinunciabile nei tumori non operabili dove la scelta terapeutica si basa sul profilo dell’istotipo e dell’assetto mutazionale valutato nel materiale aspirato [6],
Si ripete il protocollo di preparazione riportato in precedenza fino all’ottenimento delle sezioni su vetrino, su cui vengono effettuate le seguenti colorazioni: ematossilina/eosina e immunoistochimica per TTFI, p40, CK7 e CD56 utilizzando anticorpi di topo anti-uomo.
CATTURA DI CELLULE DA SEDIMENTO DI LAVAGGI PERITONEALI
Un altro importante ambito di applicazione è l’uso del supporto, oggetto del brevetto, per la cattura delle cellule da sedimento di lavaggi peritoneali. Tale procedura che il chirurgo esegue in corso di interventi per neoplasie addominali, necessita di una valutazione accurata perché la presenza di cellule neoplastiche, anche se in quota minima, cambia in senso peggiorativo la stadiazione del paziente [7]. La citologia tradizionale ha una sensibilità molto bassa nell’individuare poche ed isolate cellule neoplastiche nei lavaggi peritoneali.
Il liquido proveniente dal lavaggio viene centrifugato a 1800 giri/min per 15 minuti. Dopo aver eliminato il sovranatante, una goccia di sedimento viene depositata sul supporto. Si segue la preparativa riportata in precedenza per la preparazione dei vetrini, che vengono utilizzati per le seguenti colorazioni: ematossilina/eosina e immunoistochimica per CEA, calretinina, BerEP4 utilizzando anticorpi di topo anti-uomo.
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7. Sobin LH, Gospodarowicz M, Wittekind C. TNM Classification of Malignant Tumours. Wiley-Blackwell; 2009.

Claims (15)

  1. Rivendicazioni 1. Procedimento per la produzione di un materiale poroso destinato all'inclusione di preparati citologici comprendente le operazioni seguenti a. predisposizione di una soluzione di chitosano e/o chitosano lattosilato oppure di un derivato vinilico di chitosano, detto derivato vinilico essendo da solo o in miscela con un derivato solfidrilico del chitosano, tutti i composti aventi un peso molecolare tra 50 e 200 kDa e disciolti in una soluzione acida di acido inorganico o di acido organico polare; b. gelificazione di detta soluzione con ottenimento di un idrogel, e c. liofilizzazione di detto idrogel con ottenimento di un materiale poroso.
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui in detta soluzione il chitosano e/o chitosano lattosilato oppure il derivato vinilico di chitosano, detto derivato vinilico essendo da solo o in miscela con il derivato solfidrilico, sono presenti ad una concentrazione tra lo 0.1 e il 4% peso/volume e detta soluzione acida è a un pH tra 4 e 6.
  3. 3. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 1 a 2, in cui detta gelificazione viene realizzata mediante aggiunta di un agente reticolante, vantaggiosamente una dialdeide, in una quantità di 0.03 - 0.05% peso/volume, a detta soluzione di chitosano e/o chitosano lattosilato.
  4. 4. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 1 a 2, in cui detta gelificazione viene realizzata per fotopolimerizzazione mediante aggiunta a detta soluzione di un derivato vinilico di chitosano, detto derivato vinilico essendo da solo o in miscela con un derivato solfidrilico di chitosano, di un fotoiniziatore ed esposizione ad una sorgente UV.
  5. 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, in cui detto derivato vinilico di chitosano è chitosano metacrilato, detto fotoiniziatore è Irgacure 2959 in concentrazione di 0.5 - 2.0% in peso e l’esposizione a detta sorgente UV avviene ad una lunghezza d’onda di 250 - 405 nm e a una dose tra 0.1 e 20 J/cm<2>.
  6. 6. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 1 a 2, in cui detta gelificazione viene realizzata mediante polimerizzazione radicalica attraverso riscaldamento di detta soluzione di un derivato vinilico di chitosano, da solo o in miscela con un derivato solfidrilico di chitosano, a temperature comprese tra 30 e 70 °C, in presenza di un catalizzatore radicalico, vantaggiosamente ammonio persolfato, alla concentrazione di 0.2 - 1.5 %in peso.
  7. 7. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui prima di detta gelificazione all'interno di detta soluzione viene aggiunto un surfattante ionico o non ionico ad una concentrazione tra lo 0.01% e il 2% e vi viene insufflato gas inerte.
  8. 8. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui a. prima di detta gelificazione all'interno di detta soluzione viene aggiunto un surfattante ionico o nonionico ad una concentrazione tra lo 0.01% e il 2% e un liquido non polare, vantaggiosamente cicloesano, producendo un’emulsione olio-in-acqua comprendente come fase continua detta soluzione e come fase dispersa detto liquido non polare, e b. detta fase dispersa viene estratta dopo la gelificazione della fase continua mediante alcoli alchilici inferiori.
  9. 9. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui prima di detta operazione di liofilizzazione detto idrogel viene neutralizzato mediante risciacquo in acqua o in tampone a pH neutro.
  10. 10. Procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni precedenti, in cui detta operazione di gelificazione viene realizzata in stampi aventi la forma finale dell’oggetto da ottenere.
  11. 11. Materiale poroso ottenibile dal procedimento secondo almeno una delle rivendicazioni da 1 a 10 avente pori interconnessi di dimensione tra i 5 e i 700 pm e una porosità totale, come frazione volumetrica, tra 40 e 90%.
  12. 12. Materiale poroso secondo la rivendicazione 11, conformato in strutture porose di grandi dimensioni, quali lastre o blocchi, da cui ricavare i supporti per inclusione nella forma finale mediante operazioni di taglio.
  13. 13. Materiale poroso secondo le rivendicazioni 11 o 12 contenuto all’interno di alloggiamenti dedicati all’utilizzo in combinazione con sistemi automatizzati di processamento.
  14. 14. Uso del materiale secondo la rivendicazione 11 per l’inclusione di preparati citologici per tecniche di diagnosi istologica come tale o a seguito di inclusione in paraffina, resine acriliche, poliuretaniche, epossidiche, mezzi di inclusione a freddo.
  15. 15. Uso secondo la rivendicazione 14, in cui dette diagnosi istologiche includono colorazioni, immunoistochimica, immunofluorescenza, immunogold, microscopia SEM e TEM.
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