JP7053860B2 - スフェロイドを透明化するための組成物、これを使用するスフェロイドを透明化するための方法、およびこれを備えるキット - Google Patents
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Description
関連出願に対する相互参照
この特許出願は、2018年2月5日に出願された韓国特許出願第10-2018-0013747号からの優先権の利益を主張し、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、スフェロイドを透明化するための組成物、これを使用するスフェロイドの透明性方法、およびこれを有するキットに関する。
X線を使用する医療診断技術は、三次元の観察が可能である技術として開発され、CTまたはMRIなどの二次元走査による診断を詳述する。光源の代わりに超音波を使用する三次元画像を実現するための別の技法はまた、診断のために積極的に使用されている。しかしながら、これまでに開発されたほとんどの技法は、ミリリットルのレベルのマクロ解像度を有している。細胞内レベルでの分析を実現することができるマイクロレベルでの三次元測定技法は、完全には確立されていない。よって、細胞分析方法のほとんどは、従来の二次元技法を使用する。
本発明の別の目的は、スフェロイドのための透明性方法を提供することである。
本発明の別の目的は、スフェロイドを透明化するためのキットを提供することである。
本発明の別の側面において、本発明は、以下のステップを含む、スフェロイドの透明性方法を提供する:
糖類を含有する溶液を固定化されたスフェロイドに前処理すること(ステップ1);および
ステップ1で前処理されたスフェロイドを、組成物と接触させることによってこれを透明化すること(ステップ2)。
式1の化合物を含むスフェロイドを透明化するための組成物は、都合良くかつ急速にスフェロイドを透明化することができ、その結果、スフェロイドを画像化するのに有用であり得、並びに、様々な疾患の原因を同定するために、これらを処置するために、および、薬物の有効性および毒性を予測するために有効に使用することができる。加えて、組成物は、様々な医療デバイスに適用することによって使用することができ、および、とりわけ、これをキットとして構成することによって、インビトロ診断デバイスとして使用することができる。
図3に示されるとおり、各細胞の形状および核の形状の解像度は、三次元で明確に確認され得る。
本明細書の以降において、本発明は、詳細に記載される。
本明細書の以降において、スフェロイドを透明化するための組成物は、詳細に説明される。
式A中、
R1およびR2は、独立して直鎖状または分枝のC1-10アルキルであり;および
p、qおよびrは、独立して0~10の整数である。
p、qおよびrは、独立して0~5の整数である。
R1およびR2は、メチルであり;および
p、qおよびrは、整数1である。
スフェロイドを透明化するための組成物は、都合良くおよび急速にスフェロイドを透明化することができ、したがって、様々な疾患の原因を同定するために、これらを処置するために、薬物の有効性および毒性を予測するために有効に使用され得る。加えて、組成物は、様々な医療デバイスに適用することによって使用することができ、および、とりわけ、組成物は、それをキットとして構成することによって、インビトロ診断デバイスとして使用することができる。
スフェロイドについての透明性方法は、固定化されたスフェロイドを、スフェロイドを透明化するための組成物と接触させることによって、これを透明化させるステップを包含する。
より具体的には、スフェロイドの固定化は、これらに常に限定されないが、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒド、ポリアクリルアミドまたはそれらの組み合わせを使用する従来の方法によって実施することができる。
方法は、4℃~50℃の範囲の温度で行われ得る。
糖類を含有する溶液を固定されたスフェロイドに前処理すること(ステップ1);および
ステップ1で前処理されたスフェロイドを、スフェロイドを透明化するための組成物と接触させることによって、これを透明化すること(ステップ2)。
上記スフェロイドは、生体、具体的に言うと、これらに常に限定されないが、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓、および腸から分離された組織に由来する細胞を使用して調製できる。
糖類を含有する(含む)溶液の糖類濃度は、10~70w/v%、20~60w/v%、25~50w/v%、および30~40w/v%の範囲であり得る。
ステップ2は、固定および前処理されたスフェロイドを、スフェロイドを透明化させるための組成物と接触させることにより、スフェロイドを透明化させるステップを包含する。
方法は、4℃~50℃の温度範囲で行われ得る。
しかしながら、以下の例および実験例は、本発明を例示するためのみのものであり、および、本発明の内容は、それらに限定されない。
本発明に従う幹細胞凝集体(スフェロイド)を透明化するための組成物の、スフェロイドを透明化する能力を評価するために、具体的に言うと、透明化がスフェロイドを損傷することなく十分に実施されることを確認するために、以下の実験を実施した。
このステートメントにおいて記載された全ての実験動物は、韓国毒物学研究所動物資源委員会(Committee for Animal Resources, Korea Institute of Toxicology)のガイダンス(承認番号RS17003)に従って実施した。
最初に、母親マウスを、吸入麻酔薬のイソフルラン(1cc/min)で麻酔して、および、15匹の胎仔の心臓を抽出した。抽出した胎仔心臓を、0.2%トリプシン溶液中に配置し、これに続き、細分化した(chopping)。細分化した心臓組織を、酵素溶液中に配置し、および、20分間インキュベートした。心臓細胞は、十分に分離され、および、SpheroidFilm上に噴霧された。次いで、スフェロイドは、細胞インキュベーター中で形成することを可能とされた。
スフェロイドの形成後、細胞質染色のための分子プローブqtracker 525標識化キット(Cat#Q25049) および核染色のためのDAPI(sigma Cat# D 9542) を2時間処理した。細胞質および核を染色した場合、洗浄を、PBSを用いて実施し、および、スフェロイドを、パラホルムアルデヒドを用いて12時間固定した。
スフェロイドの損傷を妨げるため、SpheroidFilmを、45℃の水溶液中の1%低融解アガロースに添加した。SpheroidFilmは、アガロースで充分に湿らせて、および、次いで、室温で硬化させた。通気の場合、気泡をインスリン注射針を使用して除去し、および次いで、フィルムを室温で硬化させた。アガロースで固定したSpheroidFilmは、37℃、100rpmで24~48時間、CHAPS(40w/v%)および尿素(40w/v%)を含有する混合溶液中でインキュベートした。透明化したスフェロイドは、蒸留水で4時間洗浄した。最終的に、試料を、マウント溶液(mounting solution)中に配置して、および、24時間インキュベートした。
図1に示されるとおり、スフェロイドが通常に形成されたことが理解される。
上記結果において示されるとおり、スフェロイドは、本発明のスフェロイドを透明化するための組成物を使用することによって、都合良く同時に調製および透明化できることが確認された。
実験例1において透明化されたスフェロイドの透明化の程度を確認するために、透明化の前後で、スフェロイド中の認識可能な細胞の数および蛍光の明るさを測定した。
透明化前後の、細胞の数の変化を観察し、および、結果を、JuLI生細胞動画分析計を用いて分析し、および、図2に示す。
図2の左図は、JuLI生細胞動画分析計を用いて分析した、透明化の前後の、スフェロイド中の細胞の数の変化を示すグラフである。
図2の左図において示されるとおり、約30%の細胞が、透明化前に認識されたが、JuLI生細胞動画分析計によって認識される細胞は、透明化後に42%まで増大した。一旦透明化されると、細胞様輪郭が出現し、従って、JuLI系において細胞として認識された。
すなわち、本発明の透明化組成物を用いるスフェロイドの透明化後、認識される細胞の数は、有意に増大し、このことは、本発明の透明化組成物が、スフェロイドを透明化する優れた効果を有することを示唆する。
透明化の前後の蛍光の明るさを、一般的な顕微鏡を使用して比較し、および、結果を図2に示す。
図2の右図は、一般的な顕微鏡を用いて分析した、透明化前後の、スフェロイドの蛍光の明るさを示す、一連の画像である。
図2の右図において示されるとおり、一般的な顕微鏡を使用して、透明化前後の、蛍光の明るさを比較する場合、緑色フルオレセイン蛍光は、透明化前にはほとんど観察されなかったが、蛍光の明るさは、透明化後に有意に増大した。DAPIの蛍光はまた、透明化の前よりも後で、有意に増大した。
さらに、DICの結果から、スフェロイドが透明化されたことが視覚的に確認された。
三次元生物学的画像(bioimage)を得るために、緑色蛍光およびDAPIシグナルを、マクロレーザーライトシート照明画像化システム共焦点顕微鏡下、5×対物レンズを使用して確認した。結果を図3に示す。
図3は、顕微鏡を使用して測定された、透明化後のスフェロイドの蛍光の明るさを示す。
図3に示されるとおり、各細胞の形状および核の形状の解像度は、三次元で明確に確認できることが理解され得る。
本発明の式1の化合物を含む、スフェロイドを透明化するための組成物は、スフェロイドを都合良くおよび急速に透明化することができるので、スフェロイドを画像化するのに有用であり得、および、様々な疾患の原因を同定するために、これらを処置するために、および、薬物の有効性および毒性を予測するために、有効に使用され得る。加えて、組成物は、様々な医療デバイスに適用することによって使用することができ、および、とりわけ、それをキットとして構成することにより、インビトロでの診断デバイスとして使用することができる。
Claims (15)
- スフェロイドが、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓または腸に由来する細胞を使用して調製される、請求項1に記載の組成物。
- 固定化されたスフェロイドを、請求項1に記載の組成物と接触させることによって、これを透明化するステップを含む、スフェロイドを透明化するための方法。
- 請求項3に記載のスフェロイドを透明化するための方法であって、スフェロイドの固定化が、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒドおよびポリアクリルアミドからなる群より選択される1以上を使用して実施される、前記方法。
- スフェロイドが、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓または腸に由来する細胞を使用して調製される、請求項3に記載のスフェロイドを透明化するための方法。
- 方法が、4℃~50℃の温度範囲で行われる、請求項3に記載のスフェロイドを透明化するための方法。
- 以下のステップ:
糖類を含有する溶液を固定化されたスフェロイドに前処理すること(ステップ1);および
ステップ1において前処理されたスフェロイドを、請求項1に記載の組成物と接触させて、これを透明化すること(ステップ2)、
を含む、スフェロイドを透明化するための方法。 - 請求項7に記載のスフェロイドを透明化するための方法であって、スフェロイドの固定化が、パラホルムアルデヒド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジプロピレングリコールジグリシジルエーテル、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、グルタルアルデヒドおよびポリアクリルアミドからなる群より選択される1以上を使用して実施される、前記方法。
- 請求項7に記載のスフェロイドを透明化するための方法であって、スフェロイドが、脳、血管、肝臓、肺、腎臓、膵臓、心臓または腸に由来する細胞を使用して調製される、前記方法。
- 方法が、4℃~50℃の温度範囲で行われる、請求項7に記載のスフェロイドを透明化するための方法。
- 糖類が、単糖類、二糖類および多糖類からなる群から選択される1以上である、請求項7に記載のスフェロイドを透明化するための方法。
- 請求項11に記載のスフェロイドを透明化するための方法であって、単糖類は、フルクトース、ガラクトース、グルコースまたはマンノースであり;二糖類は、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノースまたはセロビオースであり;および多糖類は、デキストラン、ジエチルアミノエチル-デキストラン、デキストリン、セルロースまたはβ-グルカンである、前記方法。
- 糖類を含有する溶液は、糖類を含有する水溶液である、請求項7に記載のスフェロイドを透明化するための方法。
- 糖類を含有する溶液の糖類の濃度が、10~70w/v%である、請求項7に記載のスフェロイドを透明化するための方法。
- 糖類溶液を含有するスフェロイド透明化前処理組成物および請求項1に記載のスフェロイドを透明化するための組成物を備える、スフェロイドを透明化するためのキット。
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