CN110693912A - 干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。本发明首先提供了干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。进一步提供了促进创面愈合的产品。本发明干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟、保存方便，将其贴附压疮皮肤，可降低创面组织中肌成胶原纤维含量、I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白和/或HMGB1和/或TGF‑β表达量，进而促进创面愈合。本发明使用外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞治疗的局限性，且能达到相应治疗效果。

Description

干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。

背景技术

干细胞疗法在再生医学和创面管理方面开辟了一个新的观点，尽管干细胞在再生医学和组织工程方面取得了重要进展，但在伤口愈合仍然是一个具有挑战性的临床问题，而且应用有一些局限性。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)。应用间充质干细胞可以改善疾病，而旁分泌、免疫调节途径是其体内效应的主要机制，大量研究展示了外泌体作为干细胞治疗的治疗载体的潜力。外泌体可被细胞用作向其他细胞传递信号的信使和载体，改变它们在正常生理状态和疾病状态下的功能，而且可以从培养细胞中分离，一旦外泌体特性和生物学被更好地描述出来，治疗应用的潜力就会被更好地用于治疗疾病。外泌体是由高尔基体和内质网生成的内囊泡运输到细胞膜后释放出大小不等的小泡，电镜下可见外泌体直径在30到150nm之间，具有典型的杯状外观。干细胞外泌体含有膜蛋白(可以协助运输和靶向定位)的磷脂双层包裹。包含有Alix和TSG101；ERMS，Ezrin/Radisin/moesin蛋白；Flot 1，Ftillin 1；HSP，热休克蛋白；MHC，主要组织相容性复合体；Rab GDI，Rab GDP解离抑制剂；RAP 1b，RAP相关蛋白1b等等，无细胞治疗在医学和伤口管理方面开辟了一个新的观点，尽管它有一些局限性，但通过外泌体来消除细胞治疗的局限性是有希望的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何避免干细胞在创面愈合治疗中的局限性。

为解决上述技术问题，本发明提供了干细胞外泌体的应用。

本发明干细胞外泌体的应用主要包括以下几点：

干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。

干细胞外泌体在制备促进创面组织中肌成胶原纤维含量降低的产品中的应用。

干细胞外泌体在制备促进创面组织中I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白表达量降低的产品中的应用。

干细胞外泌体在制备促进创面组织中HMGB1和/或TGF-β表达量降低的产品中的应用。

上述应用中，所述干细胞外泌体可来源于离体的脐带间充质干细胞。

上述应用中，所述创面为表皮和/或真皮部分或全部缺失的创面，包括但不限于擦伤、割伤、烧伤(II-III度)、压疮等。

在本发明具体的实施方式中，所述创面为压疮。

本发明还提供了一种促进创面愈合的产品。

本发明促进创面愈合的产品包含干细胞外泌体。

活性成分为干细胞外泌体的促进创面愈合的产品也在本发明的保护范围之内。

上述产品中，还包括医用海绵。

上述产品中，产品的剂型为贴剂。

上述产品的制备方法为将干细胞外泌体滴加到医用海绵中，用医用胶布贴附即得到所述产品。

上文中，所述干细胞外泌体可来源于离体的脐带间充质干细胞。

在本发明具体的实施方式中，所述干细胞外泌体是利用脐带间充质干细胞培养基培养脐带间充质干细胞至P5-P10代后进行离心得到的上清过滤得到的。

本发明干细胞外泌体利用Western Blot检测标志性抗体CD9、CD63、CD81为阳性，在电镜下呈双凹圆饼形，NTA检测其粒径范围是110-130nm。

上文中，所述产品可为制剂，如贴剂。

本发明干细胞外泌体无免疫原性、无致瘤性，提取方法成熟、保存方便，将其贴附压疮皮肤，可降低创面组织中肌成胶原纤维含量、I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白和/或HMGB1和/或TGF-β表达量，进而促进创面愈合。本发明使用外泌体替代因免疫原性、致瘤性原因导致临床使用严格的干细胞，消除干细胞治疗的局限性，且能达到相应治疗效果。

附图说明

图1为脐带间充质干细胞流式细胞仪检测结果。

图2为脐带间充质干细胞外泌体的Western Blot结果。

图3为脐带间充质干细胞外泌体的透射电镜观察结果。

图4为脐带间充质干细胞外泌体的NTA检测结果。

图5为实施例1中三组小鼠第1、3、7和14天的创面愈合情况。

图6为实施例1中三组小鼠的创面收缩率比较结果。

图7为实施例1中三组小鼠创面皮肤的HE染色结果和α-SMA免疫组化结果。

图8为实施例1中三组小鼠创面组织的RT-qPCR检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1脐带间充质干细胞(huc-MSCs)外泌体在创面愈合上的应用

一、脐带间充质干细胞(huc-MSCs)外泌体提取与鉴定

1、脐带间充质干细胞的制备

新生儿脐带由产科做剖腹产时提供(胎龄37-40周)，获得的脐带用生理盐水清洗，去脐带残留血液，分段剪成5cm，将每一段沿静脉腔剪开，平铺后剔除静脉，再深入剪开并剔除2根动脉，取血管之间、血管与外膜之间的胶状物并剪切成1mm及以下小块，再以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0.2％胶原酶溶液中，置于37℃水浴箱中17h进行组织块消化，呈黏稠状时，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，使含胎牛血清在整个体系中的浓度达到20％，分装于培养瓶，置37℃、5％二氧化碳培养箱，得到第2代脐带间充质干细胞。

取扩增传第2代脐带胶间充质干细胞，弃培养基，PBS轻洗2遍，用0.125％胰蛋白酶消化，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化后用磷酸盐缓冲液洗涤、重悬，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL单细胞悬液，取lmL/管，共6管，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD73、CD105、CD166、CD45、CD34、CD14各20L，充分混匀，避光室温孵育30min，PBS洗2遍(250×g离心10rain)，重新制成细胞悬液0.5mL，流式细胞仪检测并鉴定HUMSC脐带血来源人MSC细胞人脐带血间充质干细胞。结果如图1所示，显示：脐带间充质干细胞表面标志的表达情况为CD73(99.3％)，CD105(95.9％)，CD166(97.2％)，CD45(0.34％)，CD34(0.06％)，CD14(0.6％)，即脐带间充质干细胞检测高表达脐带间充质干细胞抗原CD73、CD105、CD166而不表达造血干细胞抗原CD45、CD34和CD14。在适当的培养基中诱导后，为验证hucMSC脐带血来源，将人MSC细胞人脐带血间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞，从而鉴定间充质干细胞的成脂和成骨性。

2、外泌体的制备

鉴定后为脐带间充质干细胞的细胞贴壁后更换STEM CELL的脐带间充质干细胞培养基MesenCult^TM-ACF PLUS Medium(Human)，在培养基中加辅助干细胞生长添加物(MesenCult^TM-ACF PLUS 500X Supplement)，以后每隔2～3d换液一次，细胞贴壁融合后传代培养，置于37℃、5％CO₂的恒温培养箱，以1∶3比例进行传代培养，每2～3d传代一次，培养至P4代后，以1∶2比例进行传代，长至90％时收集细胞上清。大量培养脐带间充质干细胞PS-P10代，收集大量细胞培养基，4℃、400g离心10min，4℃、2000g离心30min，4℃、10000g离心60min，去除细胞及细胞碎片，通过0.22μm滤膜过滤后200000g离心120min，离心2次后得到外泌体用PBS重悬，于-80℃保存。

3、外泌体的检测

将得到的外泌体进行Western Blot、透射电镜观察、NTA检测。

Western Blot采用BCA蛋白浓度检测法测定huMSC-Exos蛋白浓度，Westernblotting检测外泌体特征性标志物CD9、CD63、CD81和阴性标记物Cainexin，内参为GAPDH。

步骤如下：①总蛋白的提取：将收集到的外泌体超声波作用5s后冰上静置10s，如此反复10次以充分破解外泌体。4℃条件下，14000g离心15min，转移上清至新EP管中；②总蛋白的定量：采用BCA蛋白浓度检测法测定蛋白浓度：试剂A与试剂B按50∶1的比例配置BCA工作液，充分混匀。取2mg/mL BSA标准品进行连续倍比稀释，制成浓度依次为2000、1500、1000、750、500、250、125、25μg/mL的标准液。各稀释浓度蛋白质标准品与待测蛋白质样品均取25μL加入到96孔板中(各蛋白浓度做3复孔)，接着向各孔加入200μL工作液，充分混匀，37℃条件下孵育30min后在酶标仪上检测562nm波长时的吸光度值。绘制标准曲线，计算样品的浓度；③配胶：组装好玻璃板，加入配置好的10％的分离胶后，异丙醇液封。待分离胶凝固后，弃去异丙醇，滤纸吸干残留液体，接着加入5％浓缩胶，插入梳子，待胶凝固。④电泳与转膜：取30μg蛋白质与5×上样缓冲液以4∶1的比例混匀，95℃蛋白变性5min，冷却后依次加样。按80V的浓缩胶和120V的分离胶进行电泳。当溴酚蓝指示线跑至与分离胶底部相距2cm处停止电泳。取出并切除四周无效凝胶，从阳极到阴极依次按海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵的顺序组装转膜架。按200mA的条件进行恒流转膜1h。(注意事项：转膜前滤纸需在转移缓冲液中浸泡，PVDF膜在分析纯甲醇中活化2min)；⑤封闭及抗体孵育：RT，PVDF膜于10％脱脂奶粉封闭液中封闭1h。随后将膜置于一抗溶液(CD9 1∶500，CD63 1∶1000，CD81 1∶1000，Cainexin 1∶1000，GAPDH 1∶1000)中，4℃冰箱孵育过夜。次日，TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次15min。将膜置于HRP标记的II抗(IgG 1∶3000)中，摇床上孵育1h后，TBST缓冲液再次漂洗PVDF膜3次，每次15min；⑥显影及成像：将Thermo Fisher化学发光试剂A液与B液混合成工作液，滴在PVDF膜上，化学发光成像分析仪上观察条带显影并拍照。

结果如图2所示，从图中可以看出脐带间充质干细胞外泌体标志性抗体CD9、CD63、CD81为阳性，因此通过上述步骤获得了脐带间充质干细胞外泌体。

透射电镜观察：将孔径为2nm的载样铜网固定于支架上，滴加20μL的外泌体悬液于铜网正面，室温静置60s；利用干燥滤纸从铜网侧缘吸干液体，滴加2％醋酸双氧铀溶液20μL，室温负染60s；经干燥滤纸自铜网侧缘吸干负染液；将载样铜网烘干10min；将载样铜网置于TEM样品小室内，观察SMSC-Exos的形态，摄电镜照片。

结果如图3所示，从图中可以看出脐带间充质干细胞外泌体在电镜下呈双凹圆饼形。

NTA检测：参照仪器说明书要求，调整Nano Sizer的各项参数；向比色皿中加入2μL1∶1000稀释的外泌体样品；测定粒子数和粒子浓度；PBS清洗比色皿，样品重复测定6次；进行数据分析，导出分析报告。

结果如图4所示，从图中可以看出脐带间充质干细胞外泌体粒径范围是110-130nm。

二、脐带间充质干细胞外泌体敷贴制备

使用高吸附性医用海绵，裁剪为创面大小，将外泌体(外泌体使用前解冻)滴入医用海绵，滴入海绵后用医用胶布贴附，制备得到外泌体敷贴；其中，平均2cm²的创面使用100ug外泌体。

三、脐带间充质干细胞外泌体敷贴应用于创面愈合

压疮小鼠模型：选取健康成年雄性Balb/c小鼠30只制作压疮缺血-再灌注损伤模型，每只Balb/c小鼠的背部制作2个直径和面积相近的圆形压疮，具体步骤如下：

将每只Balb/c小鼠的背部固定两个相同的造模装置，即直径10毫米、厚度为5毫米和4000高斯的圆形永磁体；每个循环12小时缺血期，12小时再灌注期，交替进行。持续3个I/R循环，Balb/c小鼠发生皮肤组织和肌肉的损伤，皮肤表面由红色转为紫红，或有水泡，表皮和真皮部分皮肤丢失，达到II期压力性溃疡，最终得到压疮小鼠模型24只。

将24只压疮小鼠模型平均随机分为三组，每组8只：外泌体组，在创面上粘附步骤二得到的外泌体敷贴；空白组，创面上不粘附任何物质；PBS组，创面上粘附PBS敷贴(制备方法同步骤二，将外泌体替换为PBS)。

每天观察创面愈合情况，第1、3、7和14天的创面愈合情况结果如图5所示，EXO组外泌体组(图中以“EXO”表示)的压疮小鼠模型较空白组和PBS组的创面愈合瘢痕较小。

每天测量创面愈合面积，计算第1、3、7和14天的创面收缩率(使用GraphPad采用One Way Anova检验进行统计分析)。按公式(创面收缩率＝原始创面面积-实际测量创面面积)/原始创面面积×100％)计算创面收缩率。

结果6所示：第1、3、7和14天，外泌体组(图中以“EXO”表示)的压疮小鼠模型创面收缩率分别为8％、27％、58％、98％，空白组的压疮小鼠模型创面收缩率分别为8％、23％、45％、72％，PBS组的压疮小鼠模型创面收缩率分别为6％、19％、45％、78％；经过GraphPad采用One Way Anova检验进行统计分析表明，外泌体组(图中以“EXO”表示)的压疮小鼠模型创面收缩率与空白组的压疮小鼠模型创面收缩率存在显著性的差异(P＜0.05)；外泌体组(图中以“EXO”表示)的压疮小鼠模型创面收缩率与PBS组的压疮小鼠模型创面收缩率存在极显著性的差异(P＜0.01)。

两周后取三组小鼠的创面皮肤进行HE染色，具体HE染色步骤简述如下：①组织切片插入染色缸内，常规脱蜡入水，流水漂洗3次；②苏木素染液5min，1％盐酸酒精分色，流水漂洗3次；③氨水中10-20s，促蓝，流水漂洗3次；④伊红染色3min，流水漂洗3次；⑤常规脱水、透明、中性树胶封固。结果如图7所示，显示外泌体组(图中以“EXO”表示)的压疮小鼠创面瘢痕区域小，表皮及真皮结构规整，毛细血管含量多。创面毗邻的健康表皮由3-4层细胞组成，真皮乳头层胶原纤维致密，平行表皮排列，创面上皮化，近端浅层创面再生表皮与正常皮肤相同，无皮脂腺、汗腺、毛囊等附属器。空白组HE染色和PBS组HE染色结果示：压疮小鼠创面瘢痕增生，表皮及真皮结构欠规整，毛细血管少量真皮乳头层胶原纤维致密不规则，创面上皮瘢痕化明显，近端浅层创面再生表皮与正常皮肤相同，亦无皮脂腺、汗腺、毛囊等附属器。

两周后取三组小鼠的创面皮肤进行α-SMA免疫组化，结果如图7所示，显示外泌体组(图中以“EXO”表示)的压疮小鼠创面较空白组和PBS组的肌成胶原纤维降低，且网状排列。

两周后取三组小鼠的创面组织进行qRT-PCR检测，取约50mg创面组织放于玻璃器皿内，加入0.1ml的Trizol溶液，研磨组织后倒入EP管中，经过分离沉淀洗脱、再溶解RNA后进行使用SSIII逆转录酶进行逆转录，聚合酶链式反应进行扩增，然后再琼脂糖电泳鉴定抽样检测RNA浓度。

结果如图8所示：对于I型胶原蛋白(Collagen I)，外泌体组(图中以“EXO”表示)压疮小鼠模型创面组织中I型胶原蛋白的CT值为27.86791，空白组压疮小鼠模型创面组织中I型胶原蛋白的CT值为29.57843，PBS组压疮小鼠模型创面组织中I型胶原蛋白的CT值为31.54765，表明外泌体组压疮小鼠模型创面组织中较空白组和PBS组的I型胶原蛋白的表达量降低。

对于III型胶原蛋白(Collagen III)，外泌体组(图中以“EXO”表示)压疮小鼠模型创面组织中III型胶原蛋白的CT值为28.27765，空白组压疮小鼠模型创面组织中III型胶原蛋白的CT值为28.56438，PBS组压疮小鼠模型创面组织中III型胶原蛋白的CT值为32.34981，表明外泌体组压疮小鼠模型创面组织中较空白组和PBS组的III型胶原蛋白的表达量降低。

对于TGF-β，外泌体组(图中以“EXO”表示)压疮小鼠模型创面组织中TGF-β的CT值为20.50018，空白组压疮小鼠模型创面组织中TGF-β的CT值为33.76744，PBS组压疮小鼠模型创面组织中TGF-β的CT值为34.98591，表明外泌体组压疮小鼠模型创面组织中较空白组和PBS组的TGF-β的表达量降低。

对于HMGB1，外泌体组(图中以“EXO”表示)压疮小鼠模型创面组织中HMGB1的CT值为21.63013，空白组压疮小鼠模型创面组织中HMGB1的CT值为27.34236，PBS组压疮小鼠模型创面组织中HMGB1的CT值为28.44576，表明外泌体组压疮小鼠模型创面组织中较空白组和PBS组的HMGB1的表达量降低。

综上，外泌体组压疮小鼠模型相比于空白组和PBS组，创面胶原(I型胶原蛋白和III型胶原蛋白)堆积减少，炎症因子(TGF-β和HMGB1)减少，创面收缩率升高，因此，脐带间充质干细胞外泌体对创面治疗具有明显效果。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.干细胞外泌体在制备促进创面愈合的产品中的应用。

2.干细胞外泌体在制备促进创面组织中肌成胶原纤维含量降低的产品中的应用。

3.干细胞外泌体在制备促进创面组织中I型胶原蛋白和/或III型胶原蛋白表达量降低的产品中的应用。

4.干细胞外泌体在制备促进创面组织中HMGB1和/或TGF-β表达量降低的产品中的应用。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：所述创面为压疮、擦伤、割伤或烧伤。

6.一种促进创面愈合的产品，其特征在于：所述产品包含干细胞外泌体。

7.一种促进创面愈合的产品，其特征在于：所述产品的活性成分为干细胞外泌体。

8.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于：所述产品为贴剂。

9.根据权利要求6或7所述的产品，其特征在于：所述产品还包括医用海绵。

10.根据权利要求1-5所述的应用，或，权利要求6-9所述的产品，其特征在于：所述干细胞外泌体来源于离体的脐带间充质干细胞。

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