CN109125289A - 一种半天然纳米囊泡、制备方法及在制备治疗肝脏疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域,具体涉及一种半天然纳米囊泡、制备方法及其在制备药物上的用途。本发明公开了一种半天然纳米囊泡、制备方法及在制备治疗肝脏疾病药物中的应用。本发明公开了一种半天然纳米囊泡的制备方法。药理学实验表明,本发明的一种半天然纳米囊泡具有治疗急慢性肝病和由此引起的肝脏损伤的作用,具有开发治疗急慢性肝病和由此引起的肝脏损伤药物的价值。本发明的一种半天然纳米囊泡还具有促进部分切除肝脏再生修复的作用,具有开发促进手术切除肝脏再生药物的价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域,具体涉及一种半天然纳米囊泡、制备方法及其用途。
背景技术
肝脏在经历各种急慢性损伤之后将会启动一个自我修复的过程,该修复过程最重要的一个方面就是通过细胞的再生机制补充因为损伤而坏死的肝脏细胞,这个过程又称为肝再生。肝脏的这种再生能力很大程度上决定了肝脏能否度过急慢性损伤并且恢复其基本功能。如果不能通过再生等过程度过急慢性损伤并且恢复其基本功能,肝脏将会进入急慢性肝衰竭、肝纤维化和肝硬化;如果能够通过再生等过程度过急慢性损伤,将会恢复其基本功能。目前修复肝损伤以及促进肝脏再生的主要方法为通过化学药物或者传统草药的方式,但到目前为止没有既有较好的效果,毒性又比较小的药物。
本发明通过一套技术方法制备了肝脏来源的一种纳米囊泡,该囊泡在体内外都体现出较好的促进肝脏细胞增殖、促进肝脏再生的能力,有望用于各类肝脏损伤的治疗和一些手术术后的肝脏再生。
发明内容
本发明公开了一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心所制备的纳米囊泡(NVs)。更进一步的,所制备的纳米囊泡具有囊状结构,平均泡囊直径为141.2nm,表面电荷为-20mV,含有表面标志物蛋白,如CD9和CD63,还含有蛋白Sphk2。
本发明公开了一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心制备纳米囊泡的方法。更进一步的,首先,通过使用孔径为10μm,5μm,最终为1μm的聚碳酸酯膜对肝脏细胞进行连续挤压。然后,使用由10%和50%的碘克沙醇组成梯度密度离心,收集50%和10%碘克沙醇层的交界面的半天然纳米囊泡得到纯化的纳米囊泡(NVs)。所制备的纳米囊泡具有囊状结构,平均泡囊直径为141.2nm,表面电荷为-20mV,含有表面标志物蛋白,如CD9和CD63,还含有蛋白Sphk2,Sphk2在肝再生中起重要作用。
本发明公开了一种纳米囊泡对原代肝实质细胞的增殖具有促进作用,以及对部分切除肝脏的再生恢复具有促进作用,可以用于制备治疗各种急慢性肝病及其引起的肝脏损伤以及手术切除肝脏的再生修复的药物或者制剂。
本发明公开了一种半天然纳米囊泡即NVs可以用于制备向肝脏细胞递送物质的材料和制剂。
本发明公开了一种半天然纳米囊泡,该半天然纳米囊泡可以将鞘氨醇激酶2递送至受体肝细胞,可以用于制备向受体肝细胞递送鞘氨醇激酶2的制剂。
本发明公开了一种半天然纳米囊泡,该半天然纳米囊泡即NVs可以上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞和肝脏中AKT和ERK的磷酸化,可以用于制备上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞和肝脏中AKT和ERK的磷酸化以及提高了细胞周期蛋白D1表达的制剂。
本发明具有如下的有益效果:
1、所制备的纳米囊泡来源于肝脏,虽然制备过程涉及人工,但来源天然。
2、制备纳米囊泡的方法简单可靠,制备获得的产量非常大。
3、所制备的纳米囊泡除了含有CD9和CD63,竟然还含有鞘氨醇激酶2即Sphk2,这是我们所预料不到的。
4、所制备的纳米囊泡具有多个功能,不仅在体外能够促进肝细胞增殖和再生,在体内同样体现了非常好的促进肝脏再生的能力,这些结果使得所制备的纳米囊泡能够用于急慢性肝病、以及由急慢性肝病引起的肝脏损伤、以及肝脏手术切除之后的肝再生和修复,是非常好的天然制剂。
5、所制备的纳米囊泡由于在纳米这个尺度,所以属于纳米天然材料的范畴,所以具有纳米材料的属性,因此该半天然纳米囊泡可以将鞘氨醇激酶2递送至受体肝细胞,因此,在体内可以起到被动靶向肝脏的效应并体现出促进肝脏再生的效应。
6、所制备的纳米囊泡通过向靶细胞递送鞘氨醇激酶2,可以上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞和肝脏中AKT和ERK的磷酸化,可以用于制备上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞和肝脏中AKT和ERK的磷酸化的制剂。
附图说明:
图1.原代肝细胞制备半天然纳米囊泡的示意图。
图2.原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡的特征。(A)半天然纳米囊泡代表性TEM图像。比例尺:200和50nm。(B)(C)由Zetasizer Nano ZS90仪器检测的半天然纳米囊泡的尺寸和表面电荷分布。(D)用蛋白印迹法检测半天然纳米囊泡的表面标志物(CD9,CD63)。(E)用蛋白印迹法检测在肝脏再生中起重要作用的Sphk2蛋白在半天然的纳米囊泡的表达水平。
图3.原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡在体外诱导肝细胞增殖。(A)用不同浓度的半天然纳米囊泡处理原代肝细胞24小时,用MTT法测定细胞活力。(B)用不同浓度的半天然纳米囊泡处理原代肝细胞48h,用MTT法测定细胞活力。NS,无差异;*P<0.05;**P<0.01。
图4.原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡对体内肝脏再生的影响。(A)70%肝切除术后,立即和24小时后,通过尾静脉注射PBS(对照)或100μg的半天然纳米囊泡,通过计算肝重/体重比率确定肝再生速度。(B)用PBS和半天然纳米囊泡处理后,肝切除术后48小时后的肝脏,表明肝脏大小不同。(C,D)70%肝切除术后用PBS(对照)或100μg的半天然纳米囊泡处理的小鼠血清中AST和ALT水平。(E)70%肝切除术后用PBS(对照)或100μg的半天然纳米囊泡处理的小鼠肝脏的Ki67染色的典型图像。NS;无差异;*P<0.05;**P<0.01。
图5.原代肝细胞摄取原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡。将标记有PKH67(绿色)的半天然纳米囊泡加入原代肝细胞培养24小时。DAPI染细胞核(蓝色),如前所述,用荧光显微镜检测细胞。上一排图为肝细胞的低倍镜图像(比例尺:200μm)和下一排为高倍镜图像(比例尺:20μm),显示半天然纳米囊泡被内化到原代肝细胞。
图6.半天然纳米囊泡可以在体外和体内将Sphk2递送到受体细胞。(A)原代肝细胞用100μg/ml的半天然纳米囊泡处理48小时(100μg/ml NV组),用蛋白印迹法测定原代肝细胞中Sphk2的水平;PBS用作为空白对照(对照组)。(B)70%肝切除术后,立即和24小时后,通过尾静脉注射PBS(对照)或100μg的半天然纳米囊泡(对照组和100μg NVs组),2天后,通过蛋白质印迹检测肝脏中Sphk2的水平。(C)原代肝细胞用100μg/ml的半天然纳米囊泡处理48小时(100μg/ml NV组),PBS作为对照,用ELISA测定原代肝细胞内S1P的水平。(D)通过蛋白印迹法测定来自野生型小鼠或SphK2-/-小鼠原代肝细胞中的Sphk2水平。(E)通过蛋白印迹检测来自野生型小鼠或来自Sphk2-/-小鼠的原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡中的Sphk2水平。(F)用来自野生型小鼠或Sphk2-/-小鼠来源的原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡处理肝原代细胞,终浓度为100μg/ml,48小时后,用MTT检测细胞增殖情况。(G)70%肝切除术后,立即和24小时后,尾静脉注射来自野生型小鼠或Sphk2-/-小鼠的原代肝细胞制备的100μg半天然纳米囊泡,2天后,通过肝脏重量和体重来计算肝重/体重比。
图7.半天然纳米囊泡可以激活肝细胞和肝脏中的AKT和ERK磷酸化。(A)用终浓度为100μg/ml 100μg/ml的WTNV或Sphk2-/-NV处理原代肝细胞48小时,PBS作为对照。然后,通过蛋白印迹检测原代肝细胞中p-AKT,p-ERK和细胞周期蛋白D1的水平。(B)70%肝切除术后,立即和24小时后,尾静脉注射PBS(对照),100μg WTNV或100μg Sphk2-/-NV,通过Western印迹评价肝脏中的并将p-AKT,p-ERK和细胞周期蛋白D1的表达水平。
具体实施方式
实施例1半天然纳米囊泡的制备
一、方法
1、原代肝实质细胞的制备
肝原代细胞根据N.Sakai等人研究的灌流方法(N.Sakai,H.L.Van Sweringen,R.C.Quillin,R.Schuster,J.Blanchard,J.M.Burns,A.D.Tevar,M.J.Edwards andA.B.Lentsch,Hepatology,2012,56,1468-1478.)进行制备分离。肝细胞培养于含有10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(Gibco,Gaithersburg,MD)中,并培养于37℃,5%CO 2的培养箱中。
2、半天然纳米囊泡的制备
通过刮擦将粘附贴壁的原代肝细胞分离并重悬于PBS中。使用挤出器(AvantiPolar Lipids)将细胞悬浮液(5×106个细胞/ml)分别通过10μm,5μm和1μm聚碳酸酯膜(Nuclepore,Whatman,Inc.,Clifton,NJ)连续挤压5次。为了进行密度梯度超速离心,分别将50%碘克沙醇(1ml,Axis-Shield PoC AS,奥斯陆,挪威),10%碘克沙醇(2ml)和样品(7ml)置于超离心管,从底部到顶部依次为50%碘克沙醇,10%碘克沙醇)和样品,然后在4℃下以100,000g超速离心2小时。从50%和10%碘克沙醇层的交界面获得半天然纳米囊泡(简称NVs),然后用PBS洗涤3次。将半天然纳米囊泡再次悬浮于PBS中。将半天然纳米囊泡通过0.45μm过滤器过滤并储存在-80℃直到使用。通过BCA蛋白测定试剂盒(ThermoScientific,USA)测定半天然纳米囊泡的蛋白质含量。
3、半天然纳米囊泡的表征
通过透射电子显微镜(TEM)和Zetasizer Nano ZS90仪器测量大小和表面电荷,半天然纳米囊泡(总蛋白为10μg)滴于铜网格栅(北京中兴科技有限公司),并用2%磷钨酸负染色。使用JEM-2100透射电子显微镜(Jeol,Japan)获得TEM图像。对于颗粒大小和表面电荷的检测,将半天然纳米囊泡重新悬浮于PBS(总蛋白5μg)中,并用Zetasizer Nano ZS90仪器(Malvern,UK)测量半天然纳米囊泡的大小和表面电荷。
二、结果与结论
从原代肝细胞制备半天然纳米囊泡(NVs)的过程如图1所示。首先,通过使用孔径为10μm,5μm,最终为1μm的聚碳酸酯膜进行连续挤压制备NVs。然后,我们使用由10%和50%的碘克沙醇组成梯度密度离心得到纯化的NVs。通过TEM检测NVs,结果显示,NVs具有囊状结构(图2A)。使用Zetasizer Nano ZS90测量半天然纳米囊泡的大小和表面电荷分布,结果显示平均泡囊直径为141.2nm(图2B),其与用TEM测量的平均直径相似。此外,半天然纳米囊泡的表面电荷为-20mV(图2C)。我们使用蛋白免疫印迹来检测半天然纳米囊泡表面标志物,结果显示NVs含有常见的表面标志物蛋白,如CD9和CD63(图2D)。更重要的、令人意想不到的是,半天然纳米囊泡含有蛋白Sphk2(图2E)。
通过本实施例成果制备了一种半天然纳米囊泡,该纳米囊泡的大小在100多纳米,具有典型的纳米材料的特点。同时该纳米囊泡还含有蛋白Sphk2,这一点是我们所预想不到的。以上属性使得我们能够将该半天然纳米囊泡应用到一些纳米尺度要求的场合,纳米尺度具有天然的肝脏被动靶向属性,而且所含有的蛋白Sphk2,也许会有一些应用场景。
实施例2半天然纳米囊泡对小鼠原代肝实质细胞的增殖促进实验和对小鼠部分切除肝脏的再生恢复的促进实验
一、方法
1、小鼠原代肝实质细胞的增殖促进实验
通过MTT法检测小鼠原代干细胞的增殖情况。将肝细胞以浓度为5×103个细胞/孔种植在96孔板上,用或不用半天然纳米囊泡处理24或48小时。向96孔板中加入MTT溶液(5mg/ml,20μL/孔)。孵育4小时后,加入150μL DMSO溶解不溶性晶体。通过分光光度计在490nm处测量吸光度值。所有实验都进行了3次重复。
2、小鼠部分切除肝脏的再生恢复的促进实验
雄性C57Bl/6小鼠购自南京大学模型动物研究中心,Sphk2敲除小鼠购自JacksonLaboratory。用于实验的所有动物是6-8周龄的雄性小鼠。所有动物实验均经南京大学动物管理委员会审查批准,并依照动物委员会的指导原则进行。70%肝切除术实验均在8和12am进行。尾静脉注射半天然纳米囊泡(如果特别说明,NVs代表来自野生型小鼠来源的原代肝细胞制备的NVs)或PBS(载体对照)。70%肝切除后小鼠死亡率小于5%。在预计的时间点,处死小鼠取得残余肝脏和血清进行检测。
3、免疫组化分析
将肝组织固定在4%多聚甲醛中至少24小时,然后包埋在石蜡中。将切片进行抗Ki67免疫组织化学染色。为了检测肝细胞增殖情况,分析了每张切片中的6个高倍镜视野下,Ki67阳性的细胞数,以获得Ki67阳性细胞的平均数。
4、半天然纳米囊泡被原代肝实质细胞摄取实验
使用先前研究所述的通用细胞膜标记物PKH67绿色荧光细胞试剂盒(Sigma-Aldrich)对半天然纳米囊泡(20μg)进行标记。将PKH67标记的NVs加入到肝细胞中,并在37℃,5%CO2中孵育12小时。孵育后,用PBS洗涤细胞两次,用4%甲醛固定15分钟,再次用PBS洗涤两次。在用ProLong Gold Antifade Reagents淬灭剂前,用DAPI对细胞进行染色细胞核。用共聚焦荧光显微镜检测肝细胞摄取半天然纳米囊泡的情况。
5、ELISA检测S1P
根据试剂盒的说明书,使用鞘氨醇-1-磷酸测定试剂盒(S1P-ELISA,DEIA-XYZ5,Creative Diagnostics,NY,USA),通过ELISA对细胞裂解物中的鞘氨醇1-磷酸(S1P)进行定量,在450nm处检测光密度值(OD)。
6、Western blotting检测几个相关蛋白
通过SDS-PAGE(8-12%分离胶)分离半天然纳米囊泡蛋白、肝细胞和肝脏蛋白,转膜到PVDF膜上,用抗CD9(Cell Signaling Technology),抗CD63,抗Sphk2(Abcam Inc.),抗p-ERK(Cell Signaling Technology),抗p-AKT(Cell Signaling Technology)和抗细胞周期蛋白D1(Cell Signaling Technology)等特异性抗体进行孵育过夜,并与荧光二抗进行孵育2小时。然后,用ECL化学发光液(Millipore,Switzerland),并使用Tanon 5200成像系统(Tanon,China)进行成像。
7、ALT and AST酶的检测
根据试剂盒说明书,使用ALT和AST检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,南京,中国)测定肝功能的标志物血清中ALT和AST的水平。
8、统计分析
所有结果表示为平均值±标准偏差(SD)。数据用学生t检验进行分析。当P<0.05时,数据被认为是显著差异的。
二、结果与结论
1.半天然纳米囊泡可以在体外诱导肝细胞增殖
为了研究NVs在原代肝细胞增殖中的作用,我们在原代肝细胞中加入不同浓度的半天然纳米囊泡培养24,48小时后,测定了细胞活力。我们发现,以100μg/ml半天然纳米囊泡处理原代肝细胞,24小时后的处理组可以促进肝细胞增殖(图3A),并且48小时后,加入50μg/ml的半天然纳米囊泡就可以明显增加肝细胞增殖(图3B)。结果显示来自原代肝细胞的半天然纳米囊泡具有有效促进肝细胞增殖的活性。
以上结果提示半天然纳米囊泡即NVs可以用于制备促进肝脏细胞增殖再生的制剂,而且由于肝脏细胞的增殖再生对于急慢性肝病及其引起的肝损伤的治疗具有决定性作用,因此,半天然纳米囊泡即NVs可以用于制备急慢性肝病及其引起的肝损伤的治疗制剂。
2.半天然纳米囊泡在体内促进肝脏再生修复
为了检测半天然纳米囊泡是否可以促进肝脏再生修复,我们使用了70%小鼠肝切除模型,肝切除术后,立即尾静脉注射NVs或PBS(作为空白对照),24小时后再次注射。在部分肝切除术后2天处死小鼠,检测肝脏重量、血清中ALT和AST和肝细胞中ki67表达情况,以此来研究NVs对体内肝再生的影响。结果显示,与对照组相比,NV组肝重/体重比明显增加(图4A),部分肝切除术后2天,NV组肝脏水平均较对照组大,这结果证明半天然纳米囊泡在肝损伤中年可以促进肝脏再生(图4B)。血清标记物ALT和AST的水平可以反映肝损伤严重程度和肝功能状态,其在手术后立即增加。我们检测部分肝切除术后2天小鼠血清中ALT和AST的水平。结果显示,在NVs治疗的小鼠中,ALT比对照组小鼠更快地恢复到几乎正常的水平(图4C)。然而,用NVs处理的小鼠和用PBS处理的对照小鼠血清AST的水平没有差异(图4D)。此外,我们发现通过Ki67免疫组化染色检测体内肝细胞增殖水平,结果显示,在用100μgNVs处理后显著增加ki67阳性细胞的数目,表面细胞增殖水平提高(图4E)。这些结果表明,半天然纳米囊泡可有效促进部分肝切除后肝细胞增殖和肝脏恢复,进而显著促进体内肝脏再生。
以上结果提示半天然纳米囊泡即NVs可以用于制备促进体内肝脏细胞增殖和肝脏再生的制剂,而且由于体内肝脏细胞增殖和肝脏的再生对于急慢性肝病及其引起的肝损伤的治疗具有决定性作用,因此,半天然纳米囊泡即NVs可以用于制备急慢性肝病及其引起的肝损伤的治疗制剂。
3.半天然纳米囊泡可以被原代肝细胞摄取
为了验证来自原代肝细胞的半天然纳米囊泡是否可以被原代肝细胞摄取,将标记有PKH67(细胞膜标记)的NVs加入到原代肝细胞中共培养。24小时后,用共聚焦显微镜检测原代肝细胞摄取PKH67标记的NVs。结果表明,以PKH67标记的NVs可以被原代肝细胞有效地吸收(图5)。
以上结果提示半天然纳米囊泡即NVs可以用于制备向肝脏细胞递送物质的材料和制剂。
4.半天然纳米囊泡可以将鞘氨醇激酶2递送至受体肝细胞。
SphK2主要是在细胞核中,是可以产生S1P的SphK异构体。前面的研究发现来自原代肝细胞的半天然纳米囊泡竟然也含有Sphk2(图2E),为了确定来自原代肝细胞的NVs是否可以传递和增加受体细胞或肝脏中的Sphk2含量,我们首先检测了经过原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡处理组中肝细胞和肝脏中Sphk2表达水平。数据显示,用100μg/ml NVs处理可使受体原代肝细胞中的Sphk2水平升高(图6A)。另外,NVs处理组治疗后也增加了部分肝切除术后2天肝脏中Sphk2的表达水平(图6B)。Sphk2蛋白水平明显的上调证实,来自原代肝细胞制备的半天然纳米囊泡可以通过将Sphk2递送到受体细胞和肝脏,在体内外促进肝细胞增殖和肝再生,增加受体细胞和肝脏中的Sphk2的表达水平。许多研究已经证实SphK可以形成S1P,SphK2产生的S1P被认为是细胞增殖的重要调控因子。为了检测原代肝细胞来源的半天然纳米囊泡中的Sphk2是否能够增加受体细胞中的S1P水平,我们通过ELISA测量受体细胞内的S1P水平。数据显示,用100μg/ml NVs处理后,受体原代肝细胞中S1P的细胞内水平明显升高(图6C)。所有这些数据证实,来自原代肝细胞的半天然纳米囊泡可以将Sphk2递送至受体细胞以产生细胞内S1P,导致细胞增殖加快。
为了进一步研究Sphk2在肝细胞增殖中的作用,我们比较了来源于野生型(简称WTNV或NV)和Sphk2敲除(Sphk2-/-NV)小鼠原代肝细胞的半天然纳米囊泡对促进肝细胞增殖和肝脏再生的影响,以确认Sphk2是否是肝脏修复过程中的关键因子。数据显示,Sphk2-/-小鼠的原代肝细胞不含Sphk2(图6D),来自Sphk2-/-小鼠衍生的原代肝细胞的NV(Sphk2-/-NVs)也不含Sphk2(6E)。
此外,结果表明,当我们在体内和体外使用Sphk2-/-NV代替WTNV时,对肝细胞增殖和肝再生的促进作用将消失(图6F,G)。这些结果表明,半天然纳米囊泡递送Sphk2至受体细胞可以提高细胞内S1P的水平,调节肝细胞的增殖和肝脏再生。
以上结果显示一种半天然纳米囊泡即NVs可以将鞘氨醇激酶2递送至受体肝细胞,可以用于制备向受体肝细胞递送鞘氨醇激酶2的制剂。以上结果还显示一种半天然纳米囊泡即NVs可以上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平,可以用于制备上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平的制剂。
5.半天然纳米囊泡上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平后可以激活AKT和ERK磷酸化。
先前研究已经表面AKT和ERK在调节细胞增殖中起重要作用。已确认S1P可调节ERK1/2和AKT的磷酸化。因此我们检测了用WTNV,Sphk2-/-NV或PBS空白对照组处理后原代肝细胞中的p-ERK1/2和p-AKT水平。数据显示,WTNVs上调SphK2/S1P的水平激活了AKT和ERK1/2的磷酸化(图7A)。然而,当用Sphk2-/-NVs处理肝细胞时,与用WTNV处理的肝细胞相比,AKT和ERK没有明显的磷酸化。为了研究半天然纳米囊泡是否在调节细胞周期中发挥重要作用,我们测定了细胞周期蛋白D1的蛋白质水平,细胞周期蛋白D1是关键的细胞周期调控因子。结果表明,用WTNV处理增加细胞周期蛋白D1的水平,而Sphk2-/-NVs的治疗未增加细胞周期蛋白D1的水平(图7A)。我们还检测了在部分肝切除术后用WTNVs,Sphk2-/-NV或PBS空白对照处理后,小鼠肝脏中的p-ERK1/2和p-AKT水平,观察到类似的现象(图7B)。细胞周期蛋白D1的蛋白水平,用WTNVs处理可以稍微增加细胞周期蛋白D1的水平,用Sphk2-/-NVs处理没有影响(图7B)。
总之,这些结果表明,半天然纳米囊泡递送Sphk2至细胞内,促进S1P的形成,进而促进AKT和ERK的磷酸化,提高了细胞周期蛋白D1的表达,促进了肝损伤后肝细胞增殖和肝脏再生。
以上结果显示一种半天然纳米囊泡即NVs可以上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞和肝脏中AKT和ERK的磷酸化,可以用于制备上调肝细胞和肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞和肝脏中AKT和ERK的磷酸化以及提高了细胞周期蛋白D1表达的制剂。
Claims (14)
1.一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心所制备的纳米囊泡即NVs。
2.如权利要求1所述的一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心所制备的纳米囊泡即NVs,其特征为所述挤压和密度梯度离心步骤如下:
首先,先后通过使用孔径为10μm、5μm、最终为1μm的聚碳酸酯膜对肝脏细胞进行连续挤压;
然后,使用由10%和50%的碘克沙醇组成梯度密度离心,收集50%和10%碘克沙醇层的交界面的半天然纳米囊泡得到纯化的纳米囊泡即NVs。
3.如权利要求2所述的一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心所制备的纳米囊泡即NVs,其特征为所述纳米囊泡具有囊状结构,平均泡囊直径为141.2nm,表面电荷为-20mV,含有表面标志物蛋白CD9和CD63,还含有蛋白Sphk2。
4.一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心制备纳米囊泡即NVs的方法。
5.如权利要求4所述的一种由肝脏细胞通过挤压和密度梯度离心制备纳米囊泡即NVs的方法,其特征为详细步骤如下:
首先,先后通过使用孔径为10μm、5μm、最终为1μm的聚碳酸酯膜对肝脏细胞进行连续挤压;
然后,使用由10%和50%的碘克沙醇组成梯度密度离心,收集50%和10%碘克沙醇层的交界面的半天然纳米囊泡得到纯化的纳米囊泡即NVs;
所制备的纳米囊泡具有囊状结构,平均泡囊直径为141.2nm,表面电荷为-20mV,含有表面标志物蛋白CD9和CD63,还含有蛋白Sphk2。
6.一种纳米囊泡即NVs在制备促进肝细胞增殖药物或者制剂中的应用。
7.一种纳米囊泡即NVs在制备促进部分切除肝脏再生恢复药物或者制剂中的应用。
8.一种纳米囊泡即NVs在制备治疗各种急慢性肝病或者急慢性肝病引起的肝脏损伤药物或者制剂中的应用。
9.一种纳米囊泡即NVs在制备手术切除肝脏再生修复药物或者制剂中的应用。
10.一种纳米囊泡即NVs作为载体在制备向肝脏细胞递送物质的制剂中的应用。
11.一种纳米囊泡即NVs在制备向受体肝细胞递送鞘氨醇激酶2即SphK2的制剂中的应用。
12.一种纳米囊泡即NVs在制备上调肝细胞或者肝脏中SphK2/S1P水平药物或者制剂中的应用。
13.一种纳米囊泡即NVs在制备上调肝细胞或者肝脏中SphK2/S1P水平并激活肝细胞或者肝脏中AKT和ERK的磷酸化的制剂中的应用。
14.一种纳米囊泡即NVs在制备上调肝细胞或者肝脏中SphK2/S1P水平并提高肝细胞或者肝脏中细胞周期蛋白D1表达的制剂中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190104 |
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