JPH08502166A

JPH08502166A - カプセル化細胞用キトサンマトリックス

Info

Publication number: JPH08502166A
Application number: JP6509162A
Authority: JP
Inventors: パトリックイービッシャー; ベスエイジーリンスキー
Original assignee: ブラウンユニヴァーシティリサーチファンデーション
Priority date: 1992-09-28
Filing date: 1993-09-22
Publication date: 1996-03-12
Also published as: WO1994007999A1; AU687359B2; NO951173D0; DE69331997T2; NO951173L; ATE218614T1; FI951239A0; FI951239A; CA2144059A1; ES2177549T3; EP0663951B1; DE69331997D1; EP0663951A1; KR950703643A; AU4932293A; EP0663951A4; DK0663951T3

Abstract

(57)【要約】個体への埋め込みを行うためにビヒクル内にカプセル化された生育細胞のための、粒子状のキトサン芯マトリックスが述べられている。マトリックスは生育細胞に対して物理的支持を与え、細胞を芯全体に均等に分散させ、この結果細胞の保持、生育、増殖及び分化を行わせる。

Description

【発明の詳細な説明】カプセル化細胞用キトサンマトリックス発明の背景本発明の技術的分野は、個体への埋め込みを行うためにビヒクル内にカプセル化された生育細胞のための、粒子状のキトサン芯マトリックスに関する。細胞をマイクロスフィア及びマイクロカプセル中にカプセル化するための芯物質には様々な物質が用いられてきた。通常、芯物質は細胞が包埋されるゲル内に形成される。ゲル化した芯はさらに埋め込み可能なビヒクルを形成するために半浸透性膜内にカプセル化されてもよい。理想的な芯物質は、細胞を芯全体に均等に分散させる細胞の物理的支持体を与えるものである。もし、細胞が芯内で凝集する傾向があると、凝集の中の細胞は酸素及び他の栄養が奪われ、壊死する可能性がある。芯マトリックスはまた、治療用の物質が芯から拡散して、埋め込まれたビヒクルを受容している組織または血流内に分散するように、細胞から分泌された物質に対して充分に透過性でなければならない。もし、芯内において細胞の増殖又は分化が必要な場合、芯マトリックスはまたこれらの細胞機能を高める物理−化学的環境を与える物でなければならない。通常使用されている芯物質の一つには、アニオン性のポリサッカライドゴムであるアルギン酸ナトリウムがあり、米国特許第４，３５２，８８３号（リム（Ｌｉｍ），Ｆ．）、第４，６８９，２９３号（グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ），Ｍ．Ｆ．Ａ．，他。）、第４，８０６，３５５号（グーセン（Ｇｏｏｓｅｎ），Ｍ．Ｆ．Ａ．，他。）、第４，７８９，５５０号（ホンメル（Ｈｏｍｍｅｌ），Ｍ．，他。）、第４，４０９，３３１号（リム（Ｌｉｍ），Ｆ．）及び第４，９０２，２９５号（ウォルトホール（Ｗａｌｔｈａｌｌ），Ｂ．Ｊ．，他。）に記載されている。他の芯物質としてはコラーゲン（米国特許第４，４９５，２８８号、ジャービス（Ｊａｒｖｉｓ），Ａ．Ｐ．他。）、寒天、アガロース、フィブリノーゲン（米国特許第４，６４７，５３６号、モスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ），Ｋ．他。）並びにフィブロネクチン又はラミニン（米国特許第４，９０２，２９５号、ウォルトホール（Ｗａｌｔｈａｌｌ），Ｂ．Ｊ．他。）が挙げられる。本発明の芯物質はキチン誘導体のキトサンである。キチンはエビ及びカニの甲殻の主成分であり、甲殻工業の副生成物として商業的に生産されている。キチンは２−アセチルアミノ−Ｄ−グルコースを単位とする直鎖状ポリマーである。“キトサン”という用語は、キチンから誘導されるポリマー類であり、選択された酸水溶液系に対して該ポリマーを溶解するのに十分な遊離のアミノ基を与えるように、部分的に脱アセチル化を行ったものを示している（フィラー（Ｆｉｌａｒ），Ｌ．Ｊ．，他。ハーキュレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）リサーチセンターコントリビューションＮｏ．１６９７，ウィルミントン、デラウェア）。キトサンは、７５％以下の範囲で脱アセチル化の度合が異なっているものの商業的な購入が可能である。ある度合で脱アセチル化されているキトサンの溶解度はポリマーの分子量、温度及び酸溶媒の濃度と性質に依存する（フィラー（Ｆｉｌａｒ），Ｌ．Ｊ．，他。同上）。キトサンを硬膜物質の代用品として実験的に用いることが報告されている（ムザレリ（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ），Ｒ．，他。，１９８８バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）９：２４７−２５２）。硬膜は頭蓋骨内で脳を覆うコラーゲン状の結合組織の膜である。この実験例におけるキトサンの成功は、キトサンの構造的な性質が天然に存在する細胞外マトリックスであるグリコサミノグリカン成分と類似していたことに起因する。キトサン存在下、周囲組織の繊維芽細胞及び間葉の脈管細胞は剌激を受け、移動し、増殖し、かつ分化した。これらの細胞活性化物は傷害の治癒及び組織の再構築にとって必要な成分である。キトサンはまた、骨組織再生において効果があり、縫合物質として報告されている（サペリ（Ｓａｐｅｌｌｉ）Ｐ．Ｌ．，他。１９８６，キチンインネイチャーアンドテクノロジー（ＣｈｉｔｉｎｉｎＮａｔｕｒｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｒ．Ａ．Ａ．ムザレリ（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ）、他。編集プレナムプレス（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ）、Ｎ．Ｙ．：Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．，他。１９８６Ｊｐｎ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．，１６：４１８−４２４）。液体キトサンを含有する栄養溶液を生育中のミオサイト培養液に加えて、培養容器中のミオサイトの３次元的な生育を可能にしたことが報告されている（マレット（Ｍａｌｅｔｔｅ），Ｗ．Ｇ．，他。米国特許第４，６０５，６２３号）。キトサン／コラーゲン物質は培養中で細胞基質の接着及び増殖の増進に効果があることが報告されている（ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ），Ｔ．，他。ＥＰ０３１８２８６）。キトサンは、ホルモン、酵素及びタンパク抗原のような医薬活性のある高分子を持続的に徐放するデポー製剤の形成に使用されてきた（カーディナル（Ｃａｒｄｉｎａｌ），Ｊ．Ｒ．，他。米国特許第４，８９５，７２４号）。キトサンを用いて生育細胞をカプセル化する方法が、報告されている（ダリー（Ｄａｌｙ），ＭＭ．，他。米国特許第４，８０８，７０７号、ラー（Ｒｈａ），Ｃ．−Ｋ．，他。米国特許第４，７４４，９３３号、ラー（Ｒｈａ），Ｃ．− Ｋ．，他。米国特許第４，７４９，６２０号、シュローダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ），Ｕ．，米国特許第４，７１３，２４９号、ジャービス（Ｊａｒｖｉｓ），Ａ．Ｐ．，米国特許第４，８０３，１６８号）。これらの方法は、リン酸イオンのようなアニオン種又はアルギネートのようなアニオン性のポリマーと、キトサンのカチオン性の遊離のアミノ基とがイオン結合を介して架橋を行うことに基礎をおいている。“架橋している”、“架橋した”という用語は、ここでは、異なるキトサン鎖間又は単鎖上の異なる領域間におけるイオン結合又は橋かけを示す。ラー（Ｒｈａ）のカプセルはカチオン性のキトサン溶液をアニオン性のアルギネート溶液に加えて形成される。キトサン滴表面上のキトサンポリマーの正電荷を帯びた遊離のアミノ基は、アルギネートポリマーの負電荷を帯びたカルボキシル基に引きつけられ、キトサン滴とアルギネート溶液間の界面で架橋を行う。界面間で架橋を行ったキトサン−アルギネートは液体のキトサン芯を封入する膜を形成する。ダリー（Ｄａｌｙ）は同様に、界面架橋したキトサンを使用しているが、ここではカプセル膜の浸透性を変化させるため、使用しているアルギネート成分に変化を与えている。ジャービス（Ｊａｒｖｉｓ）のマイクロカプセルは、二価又は多価のアニオンを加えて芯キトサンポリマーを架橋し、その後外側の表面で、ポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸のような複数のアニオン性基を有するポリマーに永久的な界面架橋を行うことにより形成する。ジャービスのカプセルの内側の芯は架橋状態で用いられるか、または低分子量カチオンを加えることにより再び液化されて用いられる。これらの全てのケースにおいてキトサンの主な機能は、結果的にカプセル膜又は壁を形成する界面架橋を形作る一対の電荷を帯びたポリマーの一方としての役目をするということである。シュローダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）（上述）のキトサンマトリックスは同様に炭水化物ポリマーを結晶化してポリマー格子を形成することにより形成される。この様に形成されたカプセルは非生命（ｎｏｎ−ｌｉｖｉｎｇ）生理活性物質を伝達するために用いられている。結晶化に用いられる方法は一般的に生育細胞のカプセル化には過酷すぎると考えられる。主要なキトサン生産者であるプロタンラボラトリーズ（ＰｒｏｔａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）はキトサンゲル内に細胞を固定する幾つかの方法を発表した。これらの方法は全て、キトサン／細胞溶液とアニオン種を結合することにより、キトサンを変力性のゲル状物に変化させる方法（例架橋）を伴うものである。上記のアニオン種としては、ポリリン酸塩、アルギネート、カラゲーナン、及びスルフェート基を有する脂肪酸が挙げられる（技術文献：キトサンズフォーセルインモビリゼーション（ＣｈｉｔｏｓａｎｓｆｏｒＣｅｌｌＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ），プロタンラボラトリーズ、レドモンド、ＷＡ）。しかし架橋を行ったキトサンは、生育細胞を熱可塑性ジャケットによりカプセル化するための芯物質としては使用されていない。また、架橋を行っていない粒子状のキトサンについても、生育細胞をカプセル化装置中にカプセル化するための芯物質として使用してはいない。従って、本発明の目的は、カプセル化装置に生育細胞をカプセル化するための、新規な、架橋を行っていない粒子状のキトサン芯マトリックスを提供することである。本発明の別の目的は、カプセル中に、熱可塑性ジャケットを有した粒子状のキトサン芯マトリックスを提供することである。カプセル壁の形成はキトサンマトリックスの存在（界面架橋を通して行われる。）に依存しないので、ジャケット又はマトリックスどちらの性質もお互いの影響に関係なく変化しても良い。本発明の他の目的及び特徴は、以下の詳細な記述と付随した請求項及び図から当業者に明らかであろう。発明の要約浸透性又は半浸透性のジャケットに封入された、粒子状の本質的に架橋されていないキトサン芯マトリックスを有するカプセル化装置が説明される。この装置は、芯マトリックスのキトサン粒子の間に捕捉されている生育細胞の維持、生育、増殖及び分化に有用である。キトサン溶液を調製しその後生育細胞と混合する、カプセル化装置を作製する方法が記載される。キトサン／細胞混合物はその後浸透性又は半浸透性のジャケット内にカプセル化され、組織に埋め込み可能なカプセル化装置を形成する。その後キトサンを沈殿させ、分散した生育細胞と共に粒子状のキトサン芯マトリックスを形成させる。または、カプセル化を行う前に生育細胞を加えることによりキトサンを沈殿させる。本発明中で特に使用されている生育細胞は、神経分泌細胞系、β−細胞由来細胞系、繊維芽細胞、ミオサイト及びグリア細胞からなる群から選択された細胞から成る。図の簡単な説明図１はカニクイザルの脳内へ埋め込みを行った、ＰＣ１２細胞を含有する熱可塑性マクロカプセルの組織学的切断面を表したものである。カプセルは芯マトリックスを含有していない。図２は本発明の粒子状のキトサン芯マトリックス中に包埋されたＰＣ１２細胞を含有する、埋め込みを行った熱可塑性マクロカプセルの組織学的切断面を表したものである。発明の詳細な説明本発明は、キトサンが細胞カプセル化装置に導入するための３次元的な粒子状のマトリックスに形成されるという発見に基づいている。本発明のキトサン芯マトリックスは、粒子間に実質的な架橋又は他の化学的な結合が無い分離したキトサン粒子の使用の結果生じたものである。本発明の沈殿は架橋剤無しに充分に形成され、その結果架橋は実質的に生じていないものであるが、沈殿の表面には遊離の電荷が存在している可能性もあり、適当な条件下では架橋可能な状態であるという点も考えるべきである。“実質的に架橋されていない”、“本質的に架橋されていない”等の用語は本発明の目的に対して、カプセル化装置中のキトサンの全集合に対して用いられる。その様なキトサンは本来粒子状であり、個々のポリマー鎖は共有結合的にもイオン的にも架橋していず、一つ又は複数のゲル状構造を形成していない。本発明のキトサン芯マトリックスは粒子間に細胞を捕捉するが、架橋したゲル構造（カルシウムイオン存在下のアルギネート）内にも捕捉されないように、同様に連続した３次元マトリックス内にも捕捉されない。この様な粒子状のキトサンマトリックスは、架橋剤が実質的に存在しない状態で、可溶性キトサンのｐＨ依存性沈殿により形成されるものである。 “架橋したキトサン”という用語は本発明において、ポリマー鎖間のイオン性の相互作用によって固体又はゲル状の性質を保持する、固体又はゲルを示している。該ゲル中の細胞は、キトサン鎖間の結合により形成される多少連続的な３次元マトリックスに包埋される。架橋キトサンは一般的に架橋剤存在下で、形成される。界面架橋は本発明における主題ではなく、これらの形成は規定されていないが、その存在は一般的に本発明の操作に影響しない。具体的には、粒子間には本質的に架橋がかかっていない架橋したキトサンの微小粒子が粒子状のキトサンマトリックスの形成に使用される。このような粒子は架橋したキトサンゲルを脱水し、それに続いて得られた構造物を直径１００μｍ以下の粒子に、より好ましくは５０μｍ以下、さらに好ましくは捕捉された細胞のサイズよりも小さい粒子に粉砕する（例えば乳鉢と乳棒を用いて。）ことにより得られる。具体的な沈殿による粒子状のキトサンの生産に関して、キトサンの沈殿は適当なｐＨに調整することにより達成される事が好ましい。しかし、キトサンの遊離のアミノ基上の電荷を除去又は遮蔽する方法ならばどれも適している。該方法はしばしばアミノ基と有機化合物の反応を含む。または、生物的に適合する非キトサン活性水溶性ポリマーも沈殿を形成するのに使用されても良い。沈殿は細胞分離を行い、細胞相互作用に必要な電荷を有する表面を与える。芯マトリックスは、培養又は個体への埋め込みに際して、栄養物、不用物及び分泌物の拡散を許容する膜又はジャケット内にカプセル化される。しかしこの膜又はジャケットは免疫隔離を行い、免疫学的拒絶反応への細胞又は分子の影響因子を遮蔽するものが好ましい。芯マトリックスとジャケット間で化学的又は物理的接合又は結合が無いことが好ましい。 “個体”という用語はヒト又は動物を示している。“組織”という用語はヒト又は動物の細胞、細胞の集合、組織又は組織断片を示すものである。キトサンは多数の製造者から入手可能であり、そのロット及び製造者により純度及び脱アセチル化の比率は変動する可能性がある。溶解性に多少の差異はあるが、これらの多くのキトサンは本発明に使用可能である。しかしｐＨ依存性の溶解性については、入手したキトサンの全てのロットについて確かめる必要があることに注意が必要である。例えば、６ｍＭヘプス（ＨＥＰＥＳ）中のフルカのキトサンフレークとプロタンシーキュア（ＰｒｏｔａｎＳｅａｃｕｒｅ）Ｃｌの溶解性を比較した。フルカのキトサンはｐＨ＞6.3で沈殿し、プロタンのキトサンは6.8付近で沈殿した具体例として、キトサンマトリックス形成物質は可溶性の溶液として調製され、細胞含有媒質と混合され、共押し出しプロセスに用いられ、ファイバー又は平面シートのような熱可塑性又は形状保持性のカプセル化装置が形成される。他の具体例としては、キトサン／細胞溶液を予備形成した装置に導入する。本発明のマトリックスはマイクロスフィアの形成並びに予備成形したファイバー及び／又はカプセルの二次生産充填に使用する事も可能である。本発明のキトサンマトリックスは、糖尿病、パーキンソン病及び他の神経的疾患の処置に用いる、埋め込み可能なビヒクルに有用な幾つかの細胞系に適合性がある。加えて、カプセル化された筋原細胞は末梢神経の修復又は再構築を補助する栄養又は発芽因子の源として有用である。 “芯マトリックス”という用語はここでは、細胞増殖及び／又は細胞分化を補助し、かつ増進することも可能な生物的に適合性の３次元構造を示している。本発明のキトサン芯マトリックスは粒子状のキトサンからなり、これは、細胞が自由に生育できる不規則な骨格を与えるか又はこの骨格の役目をするものである。マトリックスは細胞の分割能又は伸長能を制限しない広範な成長領域を供するものである。本発明のマトリックス中で良好に生育する細胞はＣＨＯ細胞、繊維芽細胞、ミオサイト、ＰＣ１２細胞の様な神経分泌細胞、ＮＩＴ及びＲＩＮ細胞系のような膵臓β−細胞及び星状細胞の様なグリア細胞を含む。キトサンマトリックスに適合性の細胞は、遺伝子的に操作して、この適合性細胞には異種の必要物質を分泌させることもできる。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）を分泌するように遺伝子的に操作された繊維芽細胞は本発明のキトサンマトリックスと適合性である。キトサンは多数の遊離のアミノ基を有するポリ−ｎ−グルコサミンとして特徴づけられる。キトサンは遊離のアミノ基の数（脱アセチル化の比率）、純度、分子量分布及び粘度において異なる様々な形態で商業的に入手可能である。本発明を実施する際、好ましいキトサンのタイプは分子量が１０〜１０００ｋｄで、より好ましくは１００〜３００ｋｄである。より低分子量の分布も有用である。好ましくは、キトサンの脱アセチル化の比率は約８０％から約９０％であり、さらに好ましくは８０〜８５％である。脱アセチル化のより高い比率は、正に帯電した遊離のアミノ基の数に関連する。脱アセチル化の比率は、本発明の細胞／生育媒質からｐＨ感受性のキトサンの沈殿を調節するのに重要である。特に、脱アセチル化の比率が５０％未満のキトサンは、ｐＨのより広い範囲（例ｐＨ２から11）に渡って溶解性を示すが、８０％脱アセチル化されたキトサンはｐＨ6.3 で溶解し、ｐＨ6.8で沈殿する。ｐＨ4.0における可溶性１％キトサンの粘度は約２０〜８０ｃｐが好ましい。特定のキトサン調製物又はロット中の様々な非架橋キトサンポリマー鎖の分子量分布は、所定の濃度の溶液の粘度に大きく影響する。加えて、キトサン溶液の実際の濃度と同様にキトサン溶液中の固体（例えば塩や炭水化物）又は共重合体も粘度に大きく影響する。キトサン溶液の粘度はカプセル化装置に内容物を装填する能力及び沈殿の速度に影響を与える。これは装置の製造及び装填に関して多くの実用上の重要性を与えるものである。同時押し出しプロセスの様な機械的なカプセルの製造については米国出願特許第０７／４６１，９９９号に、アエビシャー（Ａｅｂｉｓｈｅｒ）らにより報告されている。シリンジ等を使用して細胞／キトサン溶液を手動により導入を行う工程を含む装置の製造の場合は、粘度についての制約は非常に小さく、１０００ｃｐｓ（〜５から１０％キトサン）程度の大きさでよいが、アエビシャーらの方法では１０〜１５０ｃｐｓ（〜0.5から２％キトサン）の範囲のより低粘度のキトサン溶液を必要とする。本発明の芯マトリックスを形成する方法の具体例としては、始めにキトサンを大体ｐＨ２から４の酸水溶液に溶解する。酸性水溶液を調製するための酸としては、りんご酸、くえん酸、こはく酸、アスコルビン酸、酢酸又は塩酸が挙げられる。キトサンは幾つかの製造元（フルカケミカルコーポレーション等）から入手可能である。好ましいキトサン源はプロタンのシーキュア（ＳｅａＣｕｒｅ）Ｃｌである。キトサンを酸性溶液に溶解後、ｐＨを細胞が耐えうる生理的ｐＨに充分近いが、キトサンの溶解性を維持するのに充分に低いｐＨまで上昇させる。好ましくは、ヘプス（ＨＥＰＥＳ）、トリス又は一塩基性リン酸塩のような生体適合性の緩衝液を用いてキトサン溶液のｐＨを約6.3〜6.5に上げる。表１は本システムで使用可能な様々な生体適合性緩衝液の性質を要約したものである。キトサン溶液が沈殿するｐＨを包含する有用な緩衝範囲を有する、比較的弱い緩衝剤を選択することが適切である。弱い緩衝剤を用いると、キトサンの沈殿を開始するのに必要なｐＨ7.4に調整するのに簡便であり、同時に細胞の生育を保持するのにも都合が良い（細胞をｐＨ7.4以外にすることは最小限に止めるべきである。）。本発明の目的に対して、キトサンの沈殿はｐＨ6.5〜6.8の範囲で起こることが好ましく、正確な値は使用されたキトサンの各ロットのアセチル化率及び対イオンの比率に依存して決まる。そのため、新しいロットのキトサンに対して沈殿を行う正確なｐＨ値を決定しておくことは常に有用である。好ましくはないが、リン酸塩緩衝液を使用する場合は一塩基性のものを使用しなくてはならない。マルチリン酸塩は避けるべきである。というのはトリポリリン酸塩の様な基がキトサンの架橋度を不必要な程度にまで上げてしまうからである。表１好適な緩衝液緩衝液緩衝範囲ＢＥＳ 6.2-7.6 ＢＩＳ−ＴＲＩＳ 5.7-7.1 ＨＥＰＥＳ 6.6-8.0 ＰＩＰＥＳ 6.0-7.4 ＴＡＰＳＯ 6.8-8.0 ＴＥＳ 6.5-7.9 次にキトサン溶液を（約１：１vol/volで）生育媒質中に懸濁した細胞と混合する。望ましくない架橋を最小限にするため、本発明に用いられる全ての生育用媒質は、負の電荷を持ったポリエレクトロライト（例えばアルギネート）や多電荷アニオン（例えばポリリン酸塩）を全く含有しないか含有しても最小限のものとすべきである。生育用媒質中の細胞の存在はまた其自体が緩衝効果を付与するものであるから、キトサンの沈殿を起こす最適の緩衝剤を決定するためには、実験を実施するべきである。可溶化したキトサンと混合した細胞はマイクロスフィア又はマクロカプセルの埋め込み用ビヒクルに取り込まれる。マイクロスフィアはセフトン（Ｓｅｆｔｏｎ）、米国特許第４，３５３，８８８号に記述された方法に従って形成しても良い。マクロカプセルが形成される際の好ましい方法は、アエビシャー（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ）らにより出願中の米国出願特許第０７／４６１，９４４号に記載されている。埋め込み用ビヒクルを、キトサンが沈殿を生ずるｐＨが約7.4である生育用媒質内に置く。沈殿したキトサンはこのようにしてマイクロスフィア又はマクロカプセルの中に、封入された細胞と共に粒子状の３次元マトリックスを形成する。他の具体例では、細胞をカプセルに装填する前に細胞溶液中に固体のキトサンを存在させておく。この例では固体のキトサンの粒子の大きさはカプセルに装填するのに適さなくてはならない。可溶性キトサンを細胞溶液に加え、溶液からキトサンが沈殿を生じるｐＨに調整することにより、一般に羊毛状の沈殿を生ずる。細胞及び沈殿したキトサンは混合又は攪拌して懸濁し、カプセルに直接装填する。カプセル壁の形成及び／又は装置の選択的透過性がキトサンマトリックスの存在に依存しない（例、界面架橋を通して）熱可塑性又は他の装置中でキトサンを使用するという事は、外膜（例、ジャケット）又はマトリックスの性質を他への効果に関係なく変化させてもよいという事を示している。つまり、外側のジャケットの分子量のカットオフについてはキトサン芯物質の補償的な又は同様な変化を伴わずに変更することが可能である。同様に、マトリックス形成に使用するキトサンの同一性及び性質（例、脱アセチル化の比率、粘度、分子量分布）は細胞の機能性及び生育性への効果に基づいて選択することが可能である。装置の膜の性質への効果を同様に確かめる必要性は無い（ラー（Ｒｈａ），米国特許第４，７４４，９３３号におけるマイクロスフィア装置では必要である）。カプセル化されたＰＣ１２細胞は、神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下又は不存在下で生育可能である。どちらの環境においても、キトサンの添加は有利である。本発明に従ってカプセル化されたＰＣ１２細胞はインビボ及びインビトロ両方において８週間後少量の壊死が観察されたのみであり、改良された生育性を示した。インビトロにおいて本発明のキトサンマトリックス内でＮＧＦ存在下生育し、カプセル化されたＰＣ１２細胞は、ポリゴナール細胞型に分化し、多数の神経突起を産する。これは、芯マトリックスの非存在下カプセル化したＰＣ１２細胞が神経突起を全く、又はほとんど伸長せず、回転楕円面状になる傾向があったことと対照的である。我々独自の研究は、トリリン酸塩による約1.5％のキトサン架橋は、熱可塑性カプセル内の細胞の成長を適切に支持するには密度が高すぎる傾向であることを示している。ＰＣ１２細胞の様な多くの細胞は通常培養物の一つの面上に生育する傾向があり、架橋されたキトサンにおいて観察されたように回転楕円面状に凝集することを好まない。ＰＣ１２細胞の分化は、細胞の成長を制限することと同様に、ドーパミンのような望ましい治療用物質の生産にも必要であるかもしれない。繊維芽細胞は、３次元的な生育マトリックス中にカプセル化された、最も良く生存し続けかつ機能するまた別の治療上有用な細胞を構成する。繊維芽細胞は自然に移動しやすく、移動する適当な基体が必要である。さらに増殖するためには、繊維芽細胞は固定させる基体が必要である。繊維芽細胞は神経成長因子（ＮＧＦ）のような、遺伝子工学的に作製されたタンパク質を発現するための簡便な細胞宿主である。ＮＧＦを分泌する繊維芽細胞はアルツハイマー病のような慢性の進行性神経退行症の処置のため、被験体に埋め込むことが可能である。ＮＧＦ分泌繊維芽細胞は本発明のキトサンマトリックスにカプセル化されるとよく生存し続ける。生育性に加えて本発明のキトサン芯マトリックスはＮＧＦ分泌繊維芽細胞の機能維持を促進する。これらの架橋したアルギネートを芯としたカプセル中の繊維芽細胞が１週間後にＮＧＦ分泌能を失うのに対し、本発明のキトサン芯を有するビヒクル中にカプセル化された同じ細胞は４週間の間ＮＧＦ分泌能を維持する。細胞培養の当業者は、本発明のキトサンマトリックスにカプセル化されたとき、分化又は増殖する他の有用な細胞型を確認できるはずである。実施例１キトサン溶液の調製高分子量のキトサン片、２−アミノ−２−デオキシ−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラナン（フルカケミカルコーポレーション（ＦｌｕｋａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．，Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ，ＮＹ））を水中で、無菌状態を確実にするためにオートクレーブ処理を行った。無菌操作の後、６ｇのキトサンをすばやく0.8％食塩水中の１％アスコルビン酸約２５０ｍｌと混合し、工業用強力ウォリング（Ｗａｒｉｎｇ）ＩＭ攪拌機中で高速回転し、最終容量が３００ｍｌとなるようにした。この時点で溶けずに残ったキトサンが少しあったが、最終濃度は 1.5から２％の間となった。５分間の攪拌を２回繰り返した後、６０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸、シグマ）バッファー溶液５０ｍｌを0.8％食塩水中に調製し、キトサンに加えた。この段階で１０ｍＭの最終バッファー容量となった。キトサン溶液の冷蔵はｐＨを6.3に保持するために必要である。実施例２繊維芽細胞のカプセル化Ｒ２０８Ｆコントロール繊維芽細胞は１０％ウシ胎児血清（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）グランドアイランド（ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ）、ＮＹ）及び１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシン／ペニシリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）ＭＯ）を加えたＤＭＥＭ中で培養した。神経成長因子（ＮＧＦ）の配列を暗号化したレトロウィルスベクターを感染させることにより遺伝子工学的に作製されたＲ２０８Ｎ．８繊維芽細胞を、１０％のウシ胎児血清、１ｍｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ，Ｇｉｂｃｏ）及び１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシン／ペニシリンを含有するＤＭＥＭ中に維持した。ジェネテシンは純粋な培養を維持するために非形質転換細胞を優先的に破壊する。約３７℃で水−飽和５％二酸化炭素恒温器内で両方の細胞型が維持された。Ｒ２０８Ｎ．８及びＲ２０８Ｆ細胞系はブレークフィールド（Ｘ．Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ）及びショート（Ｐ．Ｓｈｏｒｔ）より提供された。キトサンのカプセル化を行う前に、コントロール及び遺伝子工学により得られた繊維芽細胞系両方を３分間ＨＢＳＳ中の0.05％トリプシンと培養して得た。８００ｇで遠心分離した後、２ｘ１０⁶細胞／ｍｌの細胞を２００μｌのそれぞれの栄養培地に再懸濁した。細胞懸濁液は実施例１に従って調製した３００μｌのキトサンマトリックス溶液に加え、アエビシャー（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ）らによる米国特許第４，８９２，５３８号に記載の方法に従って、ポリアクリロニトリル／ポリビニルクロライドファイバー（ＰＡＮ／ＰＶＣ−ｆｉｂｅｒ）に注入した。ファイバーは個々の区画に分離し、ファイバーの端は熱封鎖法により封鎖した。カプセルは次に生理的食塩水中に浸透させ、１回約５分の洗浄を何回も繰り返し、キトサンの沈殿を生じさせた。全ての細胞含有キトサンカプセルは生育培地に移動し、そのうちＲ２０８Ｎ．８及びＲ２０８Ｆを３７℃の湿度をもたせた５％二酸化炭素恒温器内で培養した。キトサンの代わりに２％アルギネートを用いて同様のカプセルを調製した。アルギネート溶液はケルコ（ＫｅｌｃｏＨＶ，ＫｅｌｃｏＮ．Ｊ．）から得られ、アエビシャー（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ）ら、１９９１ブレインリサーチ（ＢｒａｉｎＲｅｓｅａｒｃｈ）５６０：４３ −４９に従って調製した。カプセル化された細胞は培養中に４週間維持した。細胞は全時間に渡りキトサン中で増殖し、死んだ細胞は最小限であった。カプセル化された繊維芽細胞について、カプセル化してから２〜４週間後に生物化学的機能性に関する生物活性を以下のように調べた。生物活性はＰＣ１２細胞からＮＧＦの高濃度方向に神経の伸長が起きるという、ＰＣ１２細胞のＮＧＦに対する反応に基づいている。遺伝子工学的に作製した繊維芽細胞Ｒ２０８Ｎ．８がカプセル内に維持される間、ＮＧＦの発現及び分泌を続けるかどうかを試験するため、カプセルはコラーゲンで皮膜した組織培養皿上で生育したカプセル化していないＰＣ１２細胞と共に２週間培養し、ＰＣ１２細胞に対する効果をモニターした。１週間後、キトサンカプセル化Ｒ２０８Ｎ．８細胞及びアルギネートカプセル化Ｒ２０８Ｆ細胞どちらの共培養でも神経成長は顕著であった。カプセル化したキトサン及びアルギネートのどちらのコントロールの繊維芽細胞Ｒ２０８ＦもＰＣ１２細胞の分化に対して効果は無かった。２週間後、キトサンによりカプセル化したＲ２０８Ｎ．８細胞と共培養したＰＣ１２細胞は分化の段階を維持した。それに対して、アルギネートによりカプセル化したＲ２０８Ｎ．８細胞と共培養したＰＣ１２細胞は、神経突起を縮小し、分化していない形態を再獲得した。カプセル化したコントロールの繊維芽細胞は神経栄養学的に不活性なままであった。これは本発明のキトサンマトリックス中にカプセル化されたとき、ＮＧＦを発現するように遺伝子操作された繊維芽細胞は異種タンパクを発現する能力を維持していることを示している。実施例３ＰＣ１２細胞のカプセル化ＰＣ１２細胞は１０％熱不活性化ウマ血清、５％ウシ胎児血清（ハゼルトン（Ｈａｚｅｌｔｏｎ）、レネッサ（Ｌｅｎｅｘａ）、ＫＳ）及び１００ユニットのペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ中で培養された。ＰＣ１２細胞の培養は水−飽和７％二酸化炭素恒温器内の懸濁培養により３７℃で行われた。ＰＣ１２細胞は培地皿から生育培地を穏やかに粉砕することにより、細胞懸濁液として得られた。８００ｇで遠心分離後、２ｘ１０⁶細胞／ｍｌの細胞を５０ μｌのそれぞれの栄養培地に再懸濁した。細胞懸濁液は実施例１に従って調製した２５０μｌのキトサンマトリックス溶液に導入し、実施例２に従いＰＡＮ／ＰＶＣ−ファイバーに注入した。ファイバーは個々の区画に分離し、ファイバーの端は熱封鎖法により封鎖した。カプセルは次に生理的食塩水中で３分間インキュベートしてキトサンの沈殿を生じさせた。細胞含有キトサンカプセルは生育培地に移動し、３７℃の湿度をもたせた７％二酸化炭素恒温器内で維持した。キトサンの代わりに２％アルギネートを用いて同様のカプセルを調製した。カプセル化されたＰＣ１２細胞は４週間培養した。細胞は全時間に渡りキトサンマトリックス中で増殖し、死んだ細胞は最小限であった。カリウム剌激を与えた条件下で４週間後、ＰＣ１２細胞はドーパミンを１から２ナノモル濃度の範囲で放出した。アルギネート芯を有したカプセル中のＰＣ１２細胞は４週間後も生育していた。しかし、アルギネート中で細胞は小さな回転楕円状のクラスターを形成していた。ほとんど又は全く神経突起は観察されなかった。実施例４沈殿キトサンマトリックス存在下にカプセル化されたＰＣ１２細胞のインビボ生育性ＰＣ１２細胞は芯マトリックスの無い状態でカプセル化され、齧歯類又はヒト以外の霊長類の脳に移植されてきた。様々なモデルの系において細胞は生存し、パーキンソン症を改善することができる。しかし、芯マトリックス欠如の状態ではＰＣ１２細胞群は壊死を起こす大きなクラスターを形成して、神経突起を伸長しない。本実験は沈殿キトサン芯マトリックスの存在下又は非存在下で生育したＰＣ１２細胞の行動及び生育特性を比較するために設計されたものである。懸濁培養によりＰＣ１２細胞を生育し、採取、ＲＰＭＩ媒地による洗浄、遠心分離を行い、そして上澄みを静かにデカントした。 4.4ｇのフルカ高分子量（ＦｌｕｋａＨｉｇｈＭＷ）キトサンを７０℃で激しく攪拌しながら１５０ｍｌの無菌の0.85％食塩水中に溶解した。溶液のｐＨは、４５ｍｌの１００ｍＭヘプス（ＨＥＰＥＳ）緩衝塩水（ｐＨ8.0）を用いて6 .2に調整した。溶液は0.22μｍのミリポアフィルターを用いて無菌濾過した。キトサン溶液は同容量のＲＰＭＩと混合し、５ｘ１０⁶細胞／ｍｌの濃度となるように細胞塊を再懸濁するのに使用した。細胞／キトサン溶液（〜１０００μ ｌ）はＰＡＮ／ＰＶＣと共にＰＡＮ／ＰＶＣ半浸透性ファイバー（〜７００μｍＩＤ，〜９５０μｍＯＤ，ＭＷＣＯ〜６０Ｋｄ）に同時押し出しした。ファイバーは適切な大きさ（1.1±0.1ｃｍ）に裁断し、端を止めて加熱して封鎖した。封鎖はその後ＰＡＮ／ＰＶＣ中でキャップをした（１５ｇＰＡＮ／ＰＶＣ：８５ｇＤＭＳＯ）。細胞は移植前に２４から４８時間６μｍのインスリンを加えたＲＰＭＩ中で培養した。コントロールカプセルはキトサンを含有しないヘプス緩衝塩水を使用したという点を除いて、同じ方法を用いて調製した。カプセル化したＰＣ１２細胞をケタミン麻酔をしたカニクイザルの神経節の基底に埋め込んだ。開頭手術は0.9％の無菌食塩水を用いて一定の灌注をしながら行った。注入した組み合わせを下記に示した（中線に対して）。Ｃ１＝21.0mmA x 4.5mmL（14.5mmV）Ｐ１＝23.0mmA x 9.0mmL（14.0mmV）Ｐ２＝19.0mmA x 10.0mmL（12.0mmV）Ｐ３＝15.5mmA x 11.5mmL（13.0mmV）最小のクリアランスを有するカプセルを注入するために特別にデザインされた、閉塞具をつけたテフロン製のカニューレの先端を適当な線条体に設置した。閉塞具を取り除きカプセルをカニューレ中に入れ、線条体中に注入した。カニューレを取り除き、同様にして他の３つのカプセルも隣接した線条領域に注入した。埋め込みの後、硬膜を閉じ頭蓋骨を再び載せて確実に閉め縫合した。埋め込み４週間後、カプセルを回収して組織学的な分析を行った。本発明のキトサン芯マトリックスを含有するこれらのカプセル内で、細胞は生育しカプセルの長さに従って小さなクラスターが分布していた。キトサン芯を入れないカプセルのＰＣ１２細胞は壊死した芯に凝集して大きなクラスターを形成していた。本発明のキトサンマトリックス内でのＰＣ１２細胞の改良された生育性は、図１及び図２の比較において容易に観察される。図１は、芯マトリックスを入れない熱可塑性のカプセルを用いたときの、ＰＣ１２細胞の大クラスターを示している。上部左の細胞クラスター中に幾つかの白色の壊死細胞の芯（いわゆる死細胞）が在ることは明らかである。図２は、本発明の沈殿キトサン芯マトリックス埋め込み物質中に埋め込まれたＰＣ１２細胞を示している。総括して、図２の細胞クラスターは非常に小さく、壊死の兆候は見られない。実施例５カプセル化前の三次元的なＰＣ１２細胞の付着／保持のための沈殿キトサン芯マトリックスの製造 0.5-1 x 10⁶細胞／ｍｌのＰＣ１２細胞８ｍｌをフラスコ内の培養液（ラットの尾から取ったコラーゲン物質で処理したもの）から取り、１５ｍｌのコニカル遠心管に移し、ｐＨ6.4の等張食塩水中の２５ｍＭヘプスの２％キトサン溶液（フルカＨＶ）２ｍｌと混合した。細胞／キトサン溶液は柔毛性の沈殿が現れるまで静かにかき混ぜた。細胞／キトサン溶液を１００ｍｍのペトリ皿にとり、３７℃、７％二酸化炭素存在下のＰＣ１２培地中で静地培養した。細胞が、柔毛性の沈殿したキトサン内にぶどう状に生育した事が観察された。５日間培養後、ＰＣ１２細胞／キトサン構造を、５００ｘｇで遠心分離を行いコニカル遠心管に収集した。これらの条件下で上澄みには単細胞が懸濁し、ＰＣ１２細胞／キトサン複合体はペレット状であった。培地の半分をデカントし、（キトサンの入っていない）新たな培地を加えた。ＰＣ１２細胞／キトサン複合体はこの時点で再培養するか又は懸濁して予め形成したＰＡＮ／ＰＶＣカプセルに５−１０ｘ１０⁶細胞／ｍｌの密度となるように装填した。

Claims

【特許請求の範囲】１．浸透性又は半浸透性ジャケット内に封入された、本質的に非架橋のキトサン芯マトリックスを含む３次元的な粒子を含有する、生育細胞を保持、成長、増殖又は分化させるためのカプセル化装置。２．請求項１に記載のマトリックス内に維持されている細胞培養物。３．細胞が、神経分泌細胞系、β−細胞由来細胞系、繊維芽細胞、ミオサイト及びグリア細胞からなる群から選択された細胞である請求項２に記載の細胞培養物。４．神経分泌細胞系がＰＣ１２細胞であり、β−細胞由来細胞系がＮＩＴ又はＲＩＮ細胞であり、及びグリア細胞が星状細胞である請求項３に記載の細胞培養物。５．ジャケットが熱可塑性材料である請求項１に記載の装置。６．粒子がキトサン溶液の沈殿により形成される請求項１に記載の装置。７．ジャケット内の芯マトリックス中に生育細胞を含む、組織への埋め込み可能なビヒクルを作製する方法であって、次の各段階を含む方法。（ａ）溶解したキトサンを含む溶液を調製する。（ｂ）（ａ）の溶液と生育細胞を混合して、混合物を形成する。（ｃ）（ｂ）の混合物を浸透性又は半浸透性ジャケットによりカプセル化してビヒクルを形成する。（ｄ）ビヒクル中のキトサンを沈殿させ、前述の生育細胞を分散させた粒子状のキトサン芯マトリックスを形成する。８．細胞が、神経分泌細胞系、β−細胞由来細胞系、繊維芽細胞、ミオサイト及びグリア細胞からなる群から選択された細胞である請求項７に記載の方法。９．神経分泌細胞系がＰＣ１２細胞であり、β−細胞由来細胞系がＮＩＴ又はＲＩＮ細胞であり、及びグリア細胞が星状細胞である請求項８に記載の方法。 10．請求項７に記載の方法に従い調製された芯マトリックス内に細胞を含有する埋め込み可能なビヒクル。 11．ジャケット内の芯マトリックス中に含有される生育細胞を含む、組織への埋め込み可能なビヒクルを作製する方法であって、次の各段階を含む方法。（ａ）キトサン水溶液を調製する。（ｂ）（ａ）の溶液と生育細胞を混合し、第１のｐＨを示す混合物を形成する。（ｃ）（ｂ）の混合物を浸透性又は半浸透性ジャケットによりカプセル化してビヒクルを形成する。（ｄ）該第１ｐＨ値を該細胞に対してやはり無毒の、第２のより高いｐＨ値に調整して、ビヒクル中に実質的に非架橋状態のキトサンを沈殿させる。 12．細胞が、神経分泌細胞系、β−細胞由来細胞系、繊維芽細胞、ミオサイト及びグリア細胞からなる群から選択された細胞である請求項11に記載の方法。 13．神経分泌細胞系がＰＣ１２細胞であり、β−細胞由来細胞系がＮＩＴ又はＲＩＮ細胞であり、及びグリア細胞が星状細胞である請求項12に記載の方法。 14．請求項11に記載の方法に従い調製された芯マトリックス内に細胞を含有する埋め込み可能なビヒクル。 15．ジャケット内の芯マトリックス中に生育細胞を含む、組織への埋め込み可能なビヒクルを作製する方法であって、次の各段階を含む方法。（ａ）溶解したキトサンを含む溶液を調製する。（ｂ）（ａ）の溶液と生育細胞を架橋剤の非存在下混合してキトサンを沈殿させ、粒子状のキトサンを含有する混合物を形成する。（ｃ）（ｂ）の混合物を浸透性又は半浸透性ジャケットによりカプセル化してビヒクルを形成する。 16．細胞が、神経分泌細胞系、β−細胞由来細胞系、繊維芽細胞、ミオサイト及びグリア細胞からなる群から選択された細胞である請求項15に記載の方法。 17．神経分泌細胞系がＰＣ１２細胞であり、β−細胞由来細胞系がＮＩＴ又はＲＩＮ細胞であり、及びグリア細胞が星状細胞である請求項16に記載の方法。 18．請求項15に記載の方法に従い調製された芯マトリックス内に細胞を含有する埋め込み可能なビヒクル。 19．下記の物を含有する細胞培養装置。（ａ）多数の生育細胞。（ｂ）実質的に架橋していないキトサン粒子を含有する３次元的なマトリックス。（ｃ）（ａ）及び（ｂ）を封入する浸透性又は半浸透性ジャケット。 20．細胞が、神経分泌細胞系、β−細胞由来細胞系、繊維芽細胞、ミオサイト及びグリア細胞からなる群から選択された細胞である請求項19に記載の細胞培養装置。 21．神経分泌細胞系がＰＣ１２細胞であり、β−細胞由来細胞系がＮＩＴ又はＲＩＮ細胞であり、及びグリア細胞が星状細胞である請求項20に記載の細胞培養装置。 22．下記の工程を含む組織培養物を接種する方法。（ａ）水溶液に所定量のキトサンを溶解する。（ｂ）（ａ）の溶液と生育細胞を架橋剤の非存在下混合する。（ｃ）（ｂ）の混合物を浸透性又は半浸透性膜により封入する。（ｄ）（ｃ）中のキトサンを架橋剤の非存在下沈殿させ、粒子状の実質的に非架橋のキトサン芯を形成する。（ｅ）粒子状のキトサン内で細胞を生育させ、生育細胞含有マトリックスを形成する。（ｆ）（ｅ）の封入細胞含有マトリックスを組織培養物に接種する。 23．下記の工程を含む組織培養物を接種する方法。（ａ）水溶液に所定量のキトサンを溶解する。（ｂ）（ａ）の溶液と生育細胞を架橋剤の非存在下混合し、粒子状のキトサンを含有する混合物を形成する。（ｃ）（ｂ）の混合物を浸透性又は半浸透性膜により封入する。（ｄ）粒子状のキトサン内で細胞を生育させ、生育細胞含有マトリックスを形成する。（ｅ）（ｄ）の封入細胞含有マトリックスを組織培養物に接種する。 24．熱可塑性ジャケット内に封入された、粒子状の本質的に非架橋のキトサン芯マトリックス中に分散した生育ＰＣ１２細胞を含有する、生育細胞を保持、成長又は増殖させるための、固体の３次元的装置。 25．個体に対して生物学的に活性のある物質又は機能を供与する埋め込み可能な免疫隔離されたビヒクルであって、以下のものを含有するビヒクル。（ａ）粒子状の、実質的に架橋していないキトサン芯マトリックス中に分散したＰＣ１２細胞を含有する芯。該細胞は個体に、選択された生物活性物質を分泌するか又は選択された生物活性機能を供与することが可能である。（ｂ）該芯を包含する、該細胞が外側に突き出ていない熱可塑性物質で形成された外側のジャケット。これを通じて個体と芯の間を該生物活性物質又は機能を供与するのに必要な物質が通過する事ができ、該芯と該ジャケットの接触面には結合が存在しない。