Hintergrund der Erfindung
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Das technische Gebiet dieser Erfindung ist eine partikuläre Chitosan-Kernmatrix für
lebensfähige Zellen, welche in Vehikel zur Implantation in eine Person eingekapselt
werden sollen.
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Viele Substanzen wurden als Kernmaterial zur Einkapselung von Zellen in
Mikrosphären und Makrokapseln verwendet. Gewöhnlich wird das Kernmaterial in ein
Gel geformt, in das die Zellen eingebettet sind. Der Gel-artige Kern kann dann weiter
in eine semipermeable Membran eingebettet werden, um ein implantierbares Vehikel
zu bilden.
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Das ideale Kernmaterial würde einen physikalischen Träger für die Zellen
bereitstellen, um sie gleichmäßig im Kern verteilt zu halten. Wenn Zellen dazu
neigen, innerhalb des Kerns zu verklumpen, können die Zellen in der Mitte des
Klumpens von Sauerstoff und anderen Nährstoffen abgeschlossen werden und
absterben. Die Kernmatrix sollte auch ausreichend durchlässig gegenüber
Substanzen sein, die von den Zellen sekretiert werden, so dass eine therapeutische
Substanz aus dem Kern und in das Gewebe oder den Blutstrom des Empfängers des
implantierten Vehikels diffundieren kann. Wenn Proliferation oder Differenzierung der
Zellen innerhalb des Kerns erwünscht ist, sollte die Kernmatrix auch eine
physiochemische Umgebung bereitstellen, die solche zellulären Funktionen fördert.
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Ein gemeinhin verwendetes Kernmaterial ist der anionische Polysaccharid-Gummi
Natriumalginat, wie es in den U.S.-Patenten Nr. 4,352,883 (Lim, F.), 4,689,293
(Goosen, M. F. A., et al.), 4,806,355 (Goosen, M. F. A., et al.), 4,789,550 (Hommel,
M., et al.), 4,409,331 (Lim, F.) und 4,902,295 (Walthall, B. J., et al.) offenbart ist.
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Andere Kernmaterialien schließen Collagen (U.S.-Patent Nr. 4,495,288, Jarvis, A. P.,
et al.), Agar, Agarose, Fibrinogen (U.S.-Patent Nr. 4,647,536, Mosbach, K., et al.)
und Fibronectin oder Laminin ein (U.S. Patent Nr. 4,902,295, Walthall, B. J., et al.).
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Das Kernmaterial der vorliegenden Erfindung ist Chitosan, welches ein Derivat von
Chitin ist. Chitin ist die Hauptkomponente von Garnelen- und Krebsschalen und wird
kommerziell als Nebenprodukt der Schalentier-Industrie hergestellt.
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Chitin ist ein lineares Polymer bestehend aus 2-Acetylamino-D-Glucose-Einheiten.
Der Ausdruck "Chitosan" bezieht sich auf eine von Chitin abgeleitete Polymer-
Familie, die teilweise deacetyliert worden ist, um ausreichend freie Aminogruppen
bereitzustellen, um das Polymer in ausgewählten wässrigen sauren Systemen löslich
zu machen (Filar, L. J., et al., Hercules Research Center Contribution Nr. 1697,
Wilmington, Delaware). Chitosan ist in variierenden Deacetylierungs-Graden
kommerziell erhältlich, ausgehend von weniger als 75% aufwärts reichend. Der Grad
der Löslichkeit von Chitosan mit einem gegebenen Deacetylierungs-Grad hängt vom
Polymer-Molekulargewicht, der Temperatur und Konzentration und Natur des sauren
Lösungsmittels ab (Filar, L. J., et al. supra).
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Chitosan wurde wie beschrieben experimentell als ein Dura mater-Substitut
verwendet (Muzzarelli, R., et al., 1988 Biomaterials 9: 247-252). Die Dura mater ist
die Schicht kollagenen Bindegewebes, die das Gehirn innerhalb des Schädels
einschließt. Der Erfolg des Chitosans in diesem experimentellen Paradigma wurde
der Tatsache zugeschrieben, dass seine strukturellen Eigenschaften ähnlich denen
der Glycosaminoglycan-Komponenten natürlich vorkommender extrazellulärer Matrix
sind. In Gegenwart von Chitosan wurden Fibroblasten und mesenchymale vaskuläre
Zellen im umgebenden Gewebe stimuliert, zu migrieren, proliferieren und
differenzieren. Diese zellulären Aktivitäten sind essentielle Komponenten der
Wundheilung und des Gewebe-Wiederaufbaus. Von Chitosan wurde auch berichtet,
dass es bei der Knochen-Reparatur und als ein Sutara-Material wirksam ist (Sapelli,
P. L., et al. 1986 in Chitin in Nature and Technology, Eds. R. A. A. Muzzarelli, et al.,
Plenum Press, N. Y.: Nakajuma, M., et al. 1986 Jpn. J. Surg. 16: 418-424).
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Eine Nährlösung, die flüssiges Chitosan enthält, wurde zu wachsenden Myozyten-
Kulturen gegeben und ermöglichte beschriebenerweise ein dreidimensionales
Wachstum der Myozyten in Kulturplatten (Malette, W. G., et al., U.S. Patent Nr.
4,605,623. Ein Chitosan/Collagen-Material war beschriebenerweise wirksam bei der
Förderung der Zellsubstrat-Adhäsion und Proliferation in Kultur (Miyata, T. et al. EP
0318286).
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Chitosan wurde dazu verwendet, ein Depot für die anhaltende Freisetzung von
pharmakologisch aktiven Makromolekülen wie Hormonen, Enzymen und Protein-
Antigenen zu bilden (Cardinal, J. R., et al., U.S. Patent Nr. 4,895,724).
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Es wurden Verfahren zur Verwendung von Chitosan zur Einkapselung lebender
Zellen beschrieben (Daly, M. M., et al., U.S. Patent Nr. 4,808,707; Rha, C.-K., et al.,
U.S. Patent Nr. 4,744,933, Rha, C.-K., et al., U.S. Patent Nr. 4,749,620; Schroder,
U., U.S. Patent Nr. 4,713,249; Jarvis, A. P., U.S. Patent Nr. 4,803,168). Diese
Verfahren basieren auf dem Vernetzen kationischer freier Aminogruppen von
Chitosan über ionische Bindungen mit anionischen Spezies wie Phosphationen oder
anionischen Polymeren wie Alginat. Der Ausdruck "Vernetzen" und "vernetzt", etc.
wie es hierin definiert ist, steht für ionische Bindungen oder Brücken zwischen
verschiedenen Chitosan-Ketten oder zwischen verschiedenen Bereichen einer
einzelnen Kette.
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Die Kapseln von Rha werden gebildet, indem eine kationische Chitosan-Lösung in
eine anionische Alginat-Lösung getropft wird. Die positiv geladenen freien
Aminogruppen der Chitosan-Polymere an der Oberfläche des Chitosan-Tropfens
werden von den negativ geladenen Carboxylatgruppen der Alginat-Polymere
angezogen, wobei Vernetzungen an der Grenzfläche zwischen dem Chitosan-
Tropfen und der Alginat-Lösung gebildet werden. Das grenzflächig vernetzte
Chitosan-Alginat bildet eine Membran, die einen flüssigen Chitosan-Kern einschließt.
Daly verwendet ähnlich grenzflächig vernetztes Chitosan, in dem die
Zusammensetzung des verwendeten Alginats variiert wird, um die Permeabifitäts-
Eigenschaften der Kapselmembran zu ändern. Die Mikrokapseln von Jarvis werden
durch Vernetzung der Kern-Chitosan-Polymere gebildet, indem divalente und
multivalente Anionen zugegeben werden, und dann permanente grenzflächige
Vernetzungen an der äußeren Fläche zu einem Polymer mit mehreren anionischen
Gruppen, wie Polyasparagin- oder Polyglutaminsäure, gebildet werden. Der
Innenkern der Jarvis-Kapseln kann in dem vernetzten Zustand verwendet werden
oder kann durch Zugabe von Kationen mit niedrigem Molekulargewicht wieder
verflüssigt werden. In allen diesen Fällen ist die prinzipielle Funktion des Chitosans,
als eine Hälfte eines Paars geladener Polymere zu dienen, die grenzflächige
Vernetzungen bilden, was zu einer Bildung der Kapselmembran oder -wand führt.
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Die Chitosan-Matrices von Schroder, supra, werden durch Kristallisation des
Kohlenwasserstoff-Polymers gebildet, um ein Polymergitter zu bilden. Die so
gebildeten Kapseln werden zur Lieferung nicht-lebender biologisch aktiver
Substanzen verwendet. Die zur Kristallisation verwendeten Verfahren werden im
Allgemeinen als zu scharf für die Einkapselung lebender Zellen betrachtet.
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Ein kommerzieller Haupthersteller von Chitosan, Protan Laboratories, hat mehrere
Protokolle für die Immobilisierung von Zellen innerhalb von Chitosan-Gelen
veröffentlicht. Bei all diesen Verfahren wird inotrope Gelierung (d. h. Vernetzung) von
Chitosan verwendet, indem die Chitosan/Zell-Lösung mit anionischen Spezies
kombiniert wird. Vorgeschlagene Anionen schließen Polyphosphate, Alginat,
Carrageen und Fettsäuren mit Sulfateinheiten ein. (Technisches Bulletin: Chitosans
for Cell Immobilization, Protan Laboratories, Redmond, WA). Vernetztes Chitosan
wurde jedoch nicht als eine Kernmatrix für die Einkapselung lebensfähiger Zellen in
Kapseln mit thermoplastischen Hüllen verwendet. Noch wurde nicht-vernetztes
partikuläres Chitosan jemals als eine Kernmatrix für die Einkapselung lebender
Zellen in Einkapselungs-Vorrichtungen verwendet.
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Ein Gegenstand der Erfindung ist daher, eine neue nicht-vernetzte partikuläre
Chitosan-Kernmatrix für die Einkapselung lebender Zellen in Einkapselungs-
Vorrichtungen bereitzustellen.
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Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist, eine partikuläre Chitosan-Kernmatrix in
Kapseln mit thermoplastischen Hüllen bereitzustellen, wobei die Bildung der
Kapselwand nicht von dem Vorhandensein der Chitosan-Matrix abhängig ist (z. B.
durch grenzflächige Vernetzung), so dass die Eigenschaften sowohl der Hülle als
auch der Matrix ohne Bedenken im Hinblick auf Auswirkungen aufeinander variiert
werden können.
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Weitere Gegenstände und Merkmale der Erfindung werden dem Fachmann aus der
folgenden detaillierten Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen zusammen
mit den Figuren offensichtlich sein.
Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines in Gewebe
implantierbaren makrokapsulären Vehikels, umfassend lebensfähige Zellen, die in
einer Kernmatrix dispergiert sind, welche in einer semipermeablen thermoplastischen
Membran eingeschlossen ist, bereitgestellt, wobei dieses Verfahren die Schritte
umfasst:
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(a) Herstellen einer Lösung, in der Chitosan gelöst wurde, gemischt mit den
lebensfähigen Zellen zur Bildung einer Mischung, die einen ersten pH-Wert aufweist,
der einem physiologischen pH-Wert nahe genug ist, dass er von den Zellen toleriert
wird, der aber niedrig genug ist, um die Löslichkeit des Chitosans zu halten;
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(b) Einführen der Lösung aus Schritt (a) in eine makrokapsuläre Vehikel-Hülle mit
einer semipermeablen thermoplastischen Membran;
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(c) Verschließen der thermoplastischen Membran aus Schritt (b); und
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(d) Präzipitieren des Chitosans innerhalb des verschlossenen Vehikels durch
Einstellen des ersten pH-Wertes auf einen zweiten pH-Wert, der höher ist, als der
erste pH-Wert, und welcher pH-Wert auch untoxisch für die Zellen ist, zur Bildung
einer partikulären präzipitierten Chitosan-Kernmatrix, die nicht kovalent verbunden
oder ionisch vernetzt ist mit den darin dispergierten lebensfähigen Zellen,
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wobei die Grenzfläche der Matrix und der Membran frei von Verknüpfungen ist, und
wobei die Zellen zwischen Teilchen, aber nicht innerhalb einer kontinuierlichen
dreidimensionalen Matrix, wie es innerhalb einer vernetzten Gel-Struktur der Fall ist,
eingeschlossen sind.
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Die gemäß der Erfindung hergestellte Vorrichtung umfasst vorteilhafterweise eine
partikuläre im Wesentlichen nicht-vernetzte Chitosan-Kernmatrix, eingeschlossen in
einer permeablen oder semipermeablen Hülle. Die Vorrichtung ist nützlich zur
Erhaltung, für das Wachstum, die Proliferation und die Differenzierung lebensfähiger
Zellen, die zwischen den Chitosan-Partikeln der Kernmatrix eingeschlossen sind.
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Die lebensfähigen Zellen, die besondere Verwendung in dieser Erfindung finden,
umfassen Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus neurosekretorischen
Zellinien, von β-Zellen abgeleiteten Zellinien, Fibroblasten, Myozyten und Gliazellen.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Fig. 1 stellt einen histologischen Schnitt einer thermoplastischen Makrokapsel dar,
die PC12-Zellen enthält, implantiert in das Gehirn eines cynomologen Affen. Die
Kapsel enthält keine Kernmatrix.
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Fig. 2 stellt einen histologischen Schnitt einer implantierten thermoplastischen
Makrokapsel dar, die PC12-Zellen enthält, eingebettet in die partikuläre Chitosan-
Kernmatrix der vorliegenden Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, dass Chitosan in eine
dreidimensionale partikuläre Matrix zur Inkorporation in Zell-Einkapselungs-
Vorrichtungen geformt werden kann. Die Chitosan-Kernmatrix resultiert aus der
Verwendung eines einzelnen Chitosan-Partikels ohne wesentliche Vernetzung oder
andere chemische Verknüpfungen zwischen Partikeln. Während das Präzipitat im
Wesentlichen in Abwesenheit von Vernetzungsmitteln gebildet wird, und im
Wesentlichen unvernetzt ist, sollte in Erinnerung gerufen werden, dass es
wahrscheinlich freie Ladungen auf der Präzipitat-Oberfläche gibt, die unter den
geeigneten Bedingungen für die Vernetzung verfügbar bleiben. Die Ausdrücke "ohne
wesentliche Vernetzung" oder "im Wesentlichen nicht vernetzt", etc. beziehen sich
für die Zwecke dieser Erfindung auf die gesamte Ansammlung des Chitosans
innerhalb einer Einkapselungs-Vorrichtung, so dass das Chitosan von partikulärer
Natur ist, und die einzelnen Polymerketten nicht zu einer einzelnen oder zu einigen
Gel-artigen Strukturen kovalent verbunden oder ionisch vernetzt sind.
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Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Chitosan-Kernmatrices
schließen Zellen zwischen Partikeln, aber nicht innerhalb einer kontinuierlichen
dreidimensionalen Matrix, wie es innerhalb einer vernetzten Gel-Struktur (z. B. Alginat
in Gegenwart von ionischem Calcium) der Fall ist, ein. Solche partikulären Chitosan-
Matrices können durch eine pH-Wert-abhängige Präzipitation von löslichem Chitosan
im Wesentlichen in Abwesenheit von Vernetzungsmitteln hergestellt werden.
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Der Ausdruck "vernetzte Chitosane" für die Zwecke dieser Erfindung bezieht sich auf
Feststoffe oder Gele, die von ionischen Wechselwirkungen zwischen Polymerketten
abhängen, um ihren festen oder Gel-artigen Charakter beizubehalten. Zellen in
solchen Gelen sind innerhalb einer mehr oder weniger kontinuierlichen
dreidimensionalen Matrix eingebettet, die durch die Verbindung von Chitosan-Ketten
gebildet wird. Vernetzte Chitosane werden im Allgemeinen in Gegenwart von
Vernetzungsmitteln gebildet.
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Grenzflächige Vernetzungen sind nicht der Gegenstand der gegenwärtigen
Erfindung, und während ihre Bildung nicht beschrieben ist, wird ihr Vorhandensein im
Allgemeinen nicht die Durchführung dieser Erfindung beeinflussen. In weiteren
Ausführungsformen können kleinste Partikel vernetzten Chitosans mit im
Wesentlichen keinen Vernetzungen zwischen Partikeln dazu verwendet werden, eine
partikuläre Chitosan-Matrix herzustellen. Solche Partikel werden durch Dehydratation
von vernetzten Chitosan-Gelen und anschließender Pulverisierung (z. B. mit Mörser
und Pistill) der resultierenden Struktur zu Partikeln mit einem Durchmesser von
weniger als 100 um, vorzugsweise weniger als 50 um, und am meisten bevorzugt
weniger als die Größe der Zellen, die durch sie eingeschlossen werden sollen,
gebildet.
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Die Chitosan-Präzipitation wird erreicht, indem auf den geeigneten pH-Wert
eingestellt wird. Jedoch sollte praktisch jedes Verfahren, durch das die Ladung an
den freien Aminogruppen des Chitosans entfernt oder maskiert wird, geeignet sein.
Solche Verfahren werden am häufigsten die Reaktion der Aminogruppen mit
organischen Substanzen involvieren. Alternativ können biokompatible
nicht-Chitosanreaktive wasserlösliche Polymere zur Induzierung der Präzipitation verwendet
werden. Das Präzipitat stellt Zell-Separierung und eine geladene Oberfläche für Zell-
Wechselwirkung bereit. Die Kernmatrix wird dann innerhalb einer Membran oder
einer Hülle eingekapselt, die, bei Kultivierung oder Implantierung in eine Person, die
Diffusion von Nährstoffen, Abfallmaterial und sekretierten Produkten erlauben wird,
welche aber vorzugsweise immunoisolatorisch ist und die zellulären und molekularen
Effektoren immunologischer Abstoßung blockiert. Es besteht keine Art von
chemischer oder physikalischer Vernetzung oder Bindung zwischen der Kernmatrix
und der Hülle.
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Wie es hierin definiert ist, bezieht sich der Ausdruck "Person" auf einen Menschen
oder ein Tier. Der Ausdruck "Gewebe", wie er hierin definiert ist, bezieht sich auf
Zellen, Zellaggregate, Gewebe oder Gewebefragmente von Tieren oder Menschen.
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Chitosan ist von einer Vielzahl von Herstellern erhältlich und kann in seiner Reinheit
und dem Deacetylierungs-%-Anteil sowohl von Charge zu Charge als auch von
Hersteller zu Hersteller variieren. Trotz der leichten Unterschiede in den Löslichkeits-
Eigenschaften, werden viele dieser Chitosane in der vorliegenden Erfindung
zweckmäßig sein. Jedoch sollte man sich daran erinnern, dass die pH-Wert-
abhängigen Löslichkeits-Eigenschaften für jede gegebene Chitosan-Charge geprüft
werden sollte. Zum Beispiel wurden die Löslichkeits-Eigenschaften von Fluka
Chitosan-Flocken in 6 mM HEPES und Protan Seacure Cl verglichen. Das Fluka
Chitosan präzipitiert bei pH > 6,3, wohingegen das Protan Chitosan nahe pH 6,8
präzipitiert.
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In einer Ausführungsform wird das Chitosan-Matrix-bildende Material als eine lösliche
Lösung, gemischt mit Zell-enthaltendem Medium, hergestellt und dann in einem
Coextrusions-Verfahren verwendet, um thermoplastische oder Form-beibehaltende
Einkapselungs-Vorrichtungen wie Fasern oder flache Schichten zu bilden. In
weiteren Ausführungsformen wird die Chitosan/Zell-Lösung in vorgeformte
Vorrichtungen eingeführt. Die Matrices der Erfindung können auch bei der Bildung
von Mikrosphären und zur Befüllung von vorgeformten Fasern und/oder Kapseln
nach der Herstellung verwendet werden.
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Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Chitosan-Matrix ist mit mehreren
Zell-Typen kompatibel, die in implantierbaren Vehikeln zur Behandlung von
Krankheiten wie Diabetes, Parkinsonscher Krankheit und anderer neurologischer
Störungen zweckmäßig sind. Außerdem können eingekapselte Myoblasten als
Quellen für trophische oder keimende Faktoren zur Unterstützung peripherer
Nervenreparatur oder -regenerierung nützlich sein.
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Hierin bezieht sich der Ausdruck "Kernmatrix" auf eine biokompatible
dreidimensionale Struktur, die die Zell-Proliferation und/oder Zell-Differenzierung
unterstützt und steigern kann.
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Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Chitosan-Kernmatrix besteht aus
partikulärem Chitosan, das ein unregelmäßiges Gerüst bereitstellt oder als ein
solches fungiert, in welchem Zellen wachsen können. Die Matrix stellt einen großen
Wachstumsbereich bereit, die die Fähigkeit der Zellen, sich zu teilen oder
auszudehnen, nicht einschränkt.
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Zellen, die in der Matrix gut wachsen, schließen CHO-Zellen, Fibroblasten,
Myozyten, neurosekretorische Zellen wie PC12-Zellen, Pankreas-β-Zellen wie NIT-
oder RIN-Zellinien und Gliazellen wie Astrozyten ein. Zellen, die mit der Chitosan-
Matrix kompatibel sind, können genetisch verändert sein, so dass sie eine
gewünschte Substanz sekretieren, die zur der kompatiblen Zelle heterolog ist. Zum
Beispiel sind Fibroblasten, die genetisch verändert wurden, damit sie einen
Nervenwachstumsfaktor (NGF = nerve-growth factor) sekretieren, kompatibel mit der
vorliegenden Chitosan-Matrix.
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Chitosan wird als ein Poly-n-glucosamin gekennzeichnet, mit einer großen Anzahl
freier Aminogruppen. Chitosan ist in einer Vielzahl von Formen kommerziell
erhältlich, die sich in ihrer Anzahl der freien Aminogruppen (% Deacetylierung), dem
Reinheitsgrad, der Molekulargewichtsverteilung und der Viskosität unterscheiden. Bei
der Durchführung der Erfindung weist ein bevorzugter Chitosan-Typ ein
Molekulargewicht im Bereich von 10-1000 kd, vorzugsweise 100-300 kd auf.
Niedrigere Molekulargewichtsverteilungen können auch zweckmäßig sein.
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Vorzugsweise weist das Chitosan einen Deacetylierungsgrad von ungefähr 80% bis
ungefähr 90%, vorzugsweise 80-85% auf. Einer höherer Deacetylierungsgrad
korreliert mit einer größeren Anzahl freier Aminogruppen, die positiv geladen sind.
Der Prozentanteil der Deacetylierung ist wichtig bei der Regulierung der pH-Wert-
sensitiven Präzipitation von Chitosan aus dem ZelllWachstumsmedium der
gegenwärtigen Erfindung. Insbesondere zeigen Chitosane mit einem
Deacetylierungsgrad von < 50% eine Löslichkeit über einen weiteren pH-Bereich (z. B.
pH 2 bis 11), wohingegen zu 80% deacetyliertes Chitosan (Seacure Cl Protan) bei
pH 6,3 löslich ist und bei pH 6,8 präzipitiert.
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Viskositäten für lösliches 1%-Chitosan bei pH 4,0 von ungefähr 20-80 cp sind
bevorzugt. Die Molekulargewichtsverteilung der verschiedenen unvernetzten
Chitosan-Polymerketten innerhalb einer spezifischen Chitosan-Zubereitung oder
Charge beeinflusst die Viskosität einer Lösung mit gegebener Konzentration
wesentlich. Außerdem werden in der Chitosan-Lösung vorhandene Feststoffe (z. B.
Salze, Kohlenwasserstoffe) oder Copolymere, sowie die tatsächliche Konzentration
der Chitosan-Lösung selbst wesentliche Auswirkungen auf die Viskosität haben.
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Die Viskosität der Chitosan-Lösung beeinflusst die Fähigkeit, Einkapselungs-
Vorrichtungen zu beladen, und die Geschwindigkeit der Präzipitation. Dies hat eine
Vielzahl praktischer Konsequenzen für die Herstellung und Beladung der
Vorrichtung. Eine mechanisierte Kapsel-Herstellung, wie das Coextrusions-
Verfahren, das in dem erteilten U.S. Patent 07/461,999, Aebischer et al.,
beschrieben ist, erfordert Chitosan-Lösungen geringerer Viskosität im Bereich von
10-150 cps (~0,5-2% Chitosan), verglichen mit der Herstellung einer Vorrichtung, die
das Einführen der Zell/Chitosan-Lösung von Hand über Spritzen etc. involviert, wobei
die Viskosität eine weit weniger kritische Beschränkung darstellt und 1000 cps groß
(~5-10% Chitosan) sein kann.
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In einer Ausführungsform wird das Chitosan, um die Kernmatrix der Erfindung
herzustellen, erst in einer wässrigen sauren Lösung, ungefähr pH 2-pH 4, gelöst.
Eine Vielzahl von Säuren wie Maleinsäure, Zitronensäure, Succinsäure,
Ascorbinsäure, Essigsäure oder Chlorwasserstoffsäure kann verwendet werden, um
die wässrige saure Lösung herzustellen. Chitosan ist von verschiedenen Quellen
erhältlich (Fluka Chemical Corp., etc.). Eine bevorzugte Quelle für Chitosan ist
SeaCure Cl von Protan.
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Auf das Lösen des Chitosans in der angesäuerten Lösung folgend wird der pH-Wert
auf ein Level erhöht, der einem physiologischen pH-Wert nahe genug ist, dass er von
Zellen toleriert wird, der aber immer noch niedrig genug ist, um die Löslichkeit des
Chitosans zu halten. Vorzugsweise wird die Chitosan-Lösung unter Verwendung
eines biokompatiblen Puffers wie HEPES, TRIS oder einbasigen Phosphats, auf
ungefähr pH 6,3-6,5 gebracht. Tabelle 1 fasst die Eigenschaften einer Vielzahl
biologisch kompatibler Puffer zusammen, die in diesem System verwendet werden
können. Es ist ratsam, einen relativ schwachen Puffer mit einem zweckmäßigen
Pufferbereich, der den Präzipitations-pH-Wert der Chitosan-Lösung umfasst,
auszuwählen. Die Verwendung eines schwachen Puffers erleichtert die Einstellung
des pH-Werts auf 7,4, der notwendig ist, um die Chitosan-Präzipitation zu initiieren
sowie die Zell-Lebensfähigkeit zu erhalten (die Zellen pH-Werten auszusetzen, die
von 7,4 verschieden sind, sollte minimiert werden). Zu Zwecken dieser Erfindung tritt
die Chitosan-Präzipitation vorzugsweise in dem Bereich von pH 6,5-6,8 auf, der
genaue Wert wird abhängig von dem Acetylierungsgrad und den vorhandenen
Gegenionen der bestimmten verwendeten Chitosan-Charge variieren. Daher ist es
immer nützlich, die genauen pH-Bedingungen für die Präzipitation mit einer neuen
Chitosan-Charge zu charakterisieren. Ob wohl es nicht bevorzugt ist, sollten, wenn
Phosphatpuffer verwendet werden, diese einbasig sein. Multi-Phosphate sollte
vermieden werden, da Gruppen wie Tripolyphosphat zu unerwünschten Chitosan-
Vernetzungs-Graden führen.
Tabelle I
Geeignete Puffer
Puffer Pufferbereich
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BES 6,2-7,6
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BIS-TRIS 5,7-7,1
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HEPES 6,6-8,0
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PIPES 6,0-7,4
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TAPSO 6,8-8,0
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TES 6,5-7,9
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Die Chitosan-Lösung wird dann (ungefähr 1 : 1 Vol/Vol) mit in ihrem
Wachstumsmedium suspendierten Zellen gemischt. Um unerwünschtes Vernetzen
zu minimieren, sollte in allen in dieser Erfindung verwendeten Wachstumsmedien
eine minimale Anzahl oder keine negativ geladenen Polyelektrolyten (z. B. Alginat)
oder mehrwertigen Anionen (z. B. Polyphosphat) vorhanden sein. Das Vorliegen von
Zellen innerhalb des Wachstumsmediums wird zusätzliche Pufferwirkung beisteuern,
daher sollten empirische Tests durchgeführt werden, um die optimale Pufferung, die
für die Präzipitation des Chitosans erforderlich ist, festzulegen.
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Die mit dem aufgelösten Chitosan gemischten Zellen werden dann in Implantations-
Vehikel, welche entweder Mikrosphären oder Makrokapseln sind, eingeschlossen.
Mikrosphären können nach jedem der Verfahren von Sefton, US 4,353,888, gebildet
werden. Wenn Makrokapseln gebildet werden sollen, sind die bevorzugten Verfahren
die, die in der co-anhängigen U.S.-Anmeldung von Aebischer et al., der
zugelassenen U.S.-Anmeldung 07/461,944, offenbart sind.
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Das Implantations-Vehikel wird dann in Wachstums-Medium mit einem pH-Wert von
ungefähr 7,4 gebracht, was zu einer Präzipitation des Chitosans führt. Das
präzipitierte Chitosan bildet so innerhalb der Mikrosphäre oder Makrokapsel eine
partikuläre dreidimensionale Matrix, wobei die Zellen darin eingebettet sind.
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In einer weiteren Ausführungsform ist vor dem Einbringen der Zellen in die Kapsel
festes Chitosan in der Zell-Lösung vorhanden. In dieser Ausführungsform muss die
Partikel-Größe des festen Chitosans kompatibel mit dem Einbringen in die Kapsel
sein. Die Zugabe von löslichem Chitosan in die Zell-Lösung und das Einstellen des
pH-Wertes, so dass das Chitosan aus der Lösung präzipitiert, führt im Allgemeinen
zu einem flockenartigen Präzipitat. Die Zellen und das präzipitierte Chitosan können
dann zu einer Suspension gemischt oder gerührt und direkt in die Kapseln
eingebracht werden.
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Die Verwendung von Chitosan in thermoplastischen oder anderen Vorrichtungen, wo
die Bildung der Kapselwand und/oder permselektiver Eigenschaften der Vorrichtung
nicht von dem Vorhandensein der Chitosan-Matrix abhängt (z. B. durch
grenzflächiges Vernetzen), bedeutet, dass entweder die Eigenschaften der
Außenmembran (d. h. Hülle) oder auch die der Matrix ohne Bedenken im Hinblick auf
Auswirkungen aufeinander variiert werden können. So kann die Molekulargewichts-
Grenze der äußeren Hülle ohne ausgleichende oder ähnliche Änderungen des
Chitosan-Kernmaterials modifiziert werden. Genauso können die Art und
Eigenschaften (z. B. prozentuale Deacetylierung, Viskosität,
Molekulargewichtsverteilung) des zur Bildung der Matrix verwendeten Chitosans basierend auf seinen
Auswirkungen auf die Zell-Funktionalität und -Lebensfähigkeit alleine ausgewählt
werden. Es ist nicht notwendig, auf ähnliche Weise seine Auswirkungen auf die
Eigenschaften der Vorrichtungs-Membran zu überprüfen (d. h. wie es bei den
Mikrosphären-Vorrichtungen von Rha im U.S. Patent Nr. 4,744,933 notwendig wäre).
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Eingekapselte PC12-Zellen können mit oder ohne vorhandenem
Nervenwachstumsfaktor (NGF) gezüchtet werden. In jedem Fall ist die Zugabe von
Chitosan förderlich. Gemäß der vorliegenden Erfindung eingekapselte PC12-Zellen
zeigen eine verbesserte Lebensfähigkeit mit nur geringer Nekrose, beobachtet nach
8 Wochen sowohl in vivo als auch in vitro. Eingekapselte PC12-Zellen, die in vitro
gezüchtet wurden, in Chitosan-Matrices der vorliegenden Erfindung und in
Anwesenheit von NGF, differenzieren zu polygonalen Zell-Typen und entwickeln
umfangreiche Neuriten. Dies steht im Gegensatz zu PC12-Zellen, die in Abwesenheit
jeglicher Kernmatrix eingekapselt wurden, die dazu neigen, ein sphäroides Aussehen
zu haben, mit, wenn überhaupt, wenig neuritischen Ausdehnungen. Unsere eigenen
Studien haben auch gezeigt, dass zu ungefähr 1,5% mit Triphosphat vernetztes
Chitosan dazu neigt, zu dicht zu sein, um ausreichend das Wachstum der Zellen
innerhalb der thermoplastischen Kapsel zu unterstützen. Viele Zellen, z. B. PC12-
Zellen, neigen im Allgemeinen dazu, in Kultur auf einer einzelnen Fläche zu
wachsen, und bevorzugen nicht sphäroidale Aggregationen, wie es mit vernetztem
Chitosan beobachtet wurde. Die Differenzierung von PC12-Zellen kann für die
Herstellung mancher gewünschter therapeutischer Substanzen wie Dopamin, sowie
zur Einschränkung von Zellwachstum, notwendig sein.
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Fibroblasten stellen einen weiteren therapeutisch nützlichen Zell-Typ dar, der am
besten eingekapselt in einer dreidimensionalen Wachstums-Matrix überlebt und
funktioniert. Fibroblasten sind von migratorischer Natur, und sie erfordern ein
geeignetes Substrat, auf dem sie sich bewegen können. Außerdem erfordern
Fibroblasten ein Substrat, auf dem sie verankert werden können, um zu proliferieren.
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Fibroblasten sind ein herkömmlicher Zell-Wirt für die Expression bestimmter
genetisch veränderter Proteine, wie der Nervenwachstumsfaktor (NGF).
Fibroblasten, die NGF sekretieren, können in eine Person implantiert werden, um
chronische fortschreitende neurodegenerative Bedingungen, wie die Alzheimer-
Krankheit, zu behandeln.
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NGF-sekretierende Fibroblasten überleben gut, wenn sie in die Chitosan-Matrix der
vorliegenden Erfindung eingekapselt sind. Zusätzlich zur Lebensfähigkeit, fördert die
Chitosan-Kernmatrix der vorliegenden Erfindung die Erhaltung der Funktion von
NGF-sekretierenden Fibroblasten. Während diese Fibroblasten in Kapseln mit einem
vernetzten Alginat-Kern ihre Fähigkeit, NGF zu sekretieren, nach 1 Woche verlieren,
behalten die gleichen Zellen, die in das vorliegende Chitosan-Kern-Vehikel
eingekapselt sind, ihre Fähigkeit, NGF zu sekretieren, für vier Wochen.
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Ein Fachmann für Zellkulturen wird dazu in der Lage sein, weitere nützliche Zelltypen
zu identifizieren, welche differenzieren oder proliferieren können, wenn sie in die
Chitosan-Matrix der vorliegenden Erfindung eingekapselt sind.
BEISPIEL 1
Herstellung der Chitosan-Lösung
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Hochmolekulare Chitosan-Flocken, ein 2-Amino-2-deoxy-(1 → 4)-β-D-glucopyranan
(Fluka Chemikal Corp., Ronkonkoma, NY), wurden unter Wasser autoklaviert, um die
Sterilität sicherzustellen. Nach der Sterilisation wurden 6 g Chitosan sofort mit
ungefähr 250 ml 1%iger Ascorbinsäure in 0,8%iger Saline zusammengebracht,
wobei die Komponenten bei hoher Geschwindigkeit in einem industriellen
Kraftmischer Waring 1 M gewirbelt wurden, um ein Endvolumen von 300 ml zu
ergeben. An dieser Stelle verblieb manches Chitosan unlöslich, wobei eine
Endkonzentration zwischen 1,5 und 2% erreicht wurde. Nach Fertigstellung von zwei
fünfminütigen Wirbelzeitdauern, wurden 50 ml einer 60 mM HEPES (N-2-
Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, Sigma)-Pufferlösung in 0,8%iger
Saline hergestellt und dem Chitosan zugegeben. Dieser Schritt führte zu einer End-
Pufferkapazität von 10 nM. Das Kühlen der Chitosan-Lösung war notwendig, um
einen pH-Wert von 6,3 zu halten.
BEISPIEL 2
Einkapselung von Fibroblasten
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R208F Kontroll-Fibroblasten wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum
(Gibco, Grand Island, NY) und 100 Einheiten/ml Streptomycin/Penicillin (Sigma, St.
Louis, MO) kultiviert. R208N.8 Fibroblasten, die durch Infektion mit einem retroviralen
Vektor, der mit der Sequenz für den Nervenwachstumsfaktor (NGF) kodiert ist,
genetisch verändert sind, wurden in DMEM, das 10% fötales Kälberserum, 1 mg/ml
Geneticin (Gibco) und 100 Einheiten/ml Streptomycin/Penicillin enthält, gehalten.
Geneticin zerstört bevorzugt nicht-transfizierte Zellen, um eine reine Kultur zu halten.
Beide Zelltypen wurden bei ungefähr 37ºC in einem Wasser-gesättigten 5% CO&sub2;-
Inkubator gehalten. Die R208N.8- und R208F-Zellinien waren eine Schenkung von
Breakefield und P. Short.
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Vor der Einkapselung mit Chitosan wurden sowohl die Kontroll- als auch die
veränderten Fibroblasten-Zellinien erhalten, indem mit 0,05% Trypsin in HBSS für 3
Minuten inkubiert wurde. Nach der Zentrifugation bei 800 g, wurden 2 · 10&sup6; Zellen/ml
Zellen in 200 ul ihres jeweiligen Nährmediums resuspendiert. Die Zell-Suspensionen
wurden in 300 ul der Chitosan-Matrix-Lösung, die gemäß Beispiel 1 hergestellt
wurde, eingebracht und in eine Polyacrylnitril/Polyvinylchlorid-Faser (PAN/PVC-
Faser) nach dem von Aebischer et al. im U.S. Patent Nr. 4,892,538 beschriebenen
Verfahren infundiert. Die Faser wurde in einzelne Teile geteilt, und die Enden der
Faser wurden unter Verwendung eines Heißsiegelverfahrens versiegelt. Die Kapseln
wurden dann in physiologischer Saline für eine Vielzahl von Waschgängen mit
jeweils ungefähr 5minütiger Dauer inkubiert, was zur Präzipitation von Chitosan
führte. Alle Zell-enthaltenden Chitosan-Kapseln wurden einem Wachstumsmedium
zugeführt, wovon R208N.8 und R208F in einem befeuchteten 5% CO&sub2;-Inkubator bei
37ºC gehalten wurden. Ähnliche Kapseln wurden unter Verwendung von 2% Alginat
anstelle von Chitosan hergestellt. Die Alginat-Lösung wurde von Kelco HV, Kelco N.
J. erhalten und wurde gemäß Aebischer et al., 1991 Brain Research 560: 43-49
hergestellt.
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Die eingekapselten Zellen wurden für 4 Wochen in Kultur gehalten. Die Zellen
proliferierten während des ganzen Zeitverlaufs innerhalb des Chitosans und der
Zelltod war minimal.
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Die eingekapselten Fibroblasten wurden wie folgt auf die biochemische Funktionalität
bei 2-4 Wochen der Einkapselung biochemisch untersucht. Der Bioassay basiert auf
der Reaktion von PC12-Zellen auf NGF, der verursacht, dass Neuriten-
Ausdehnungen aus den PC12-Zellen in Richtung einer größeren NGF-Konzentration
herauswachsen. Um zu testen, ob die genetisch veränderten Fibroblasten, R208N.8,
weiterhin NGF exprimieren und sekretieren, während sie in den Kapseln gehalten
werden, wurden die Kapseln für 2 Wochen mit nicht eingekapselten PC12-Zellen, die
auf Kollagen-beschichteten Gewebekulturplatten gewachsen sind, co-kultiviert, und
ihre Auswirkung auf die PC12-Zellen wurde beobachtet.
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Nach einer Woche waren neuritische Ausdehnungen in beiden Co-Kulturen der
Chitosaneingekapselten R208N.8 und Alginat-eingekapselten R208N.8 auffällig. Die
eingekapselten Kontroll-Fibroblasten, R208F, sowohl Chitosan- als auch Alginat-
Kontrollen, hatten keine Auswirkung auf die Differenzierung der PC12-Zellen.
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Nach zwei Wochen behielten die PC12-Zellen in Co-Kultur mit
Chitosaneingekapselten R208N.8-Zellen ihren differenzierten Zustand. Dahingegen hatten die
PC12-Zellen in Co-Kultur mit Alginat-eingekapselten R208 N.8-Zellen ihre Neuriten
zurückgezogen und wieder ihre undifferenzierte Morphologie angenommen. Die
eingekapselten Kontroll-Fibroblasten blieben neurotrophisch inaktiv.
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Dies zeigt, das Fibroblasten, die verändert wurden, um NGF zu exprimieren, ihre
Fähigkeit, das heterologe Protein zu exprimieren, beibehalten, wenn sie in eine
Chitosan-Matrix der vorliegenden Erfindung eingekapselt gehalten werden.
Beispiel 3
Einkapselung von PC12-Zellen
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PC12-Zellen wurden in RPMI, ergänzt mit 10% Wärme-inaktiviertem Pferdeserum,
5% fötalem Kälberserum (Hazelton, Lenexa, KS) und 100 Einheiten
Penicillin/Streptomycin kultiviert. PC12-Zellkulturen wurden in einer Suspensions-
Kultur bei 37ºC in einem Wasser-gesättigten 7% CO&sub2;-Inkubator gezüchtet.
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PC12-Zellen wurden durch leichte Trituration des Wachstumsmediums von der
Kulturschale erhalten, um eine Zell-Suspension zu erzeugen. Nach der Zentrifugation
bei 800 g wurden 2 · 10&sup6; Zellen/ml Zellen in 50 ul ihres jeweiligen Nährmediums
resuspendiert. Die Zell-Suspensionen wurden in 250 ul der Chitosan-Matrix-Lösung,
die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, eingebracht und wie in Beispiel 2 in eine
PAN/PVC-Faser infundiert. Die Faser wurde in einzelne Teile geteilt, und die Enden
der Faser wurden unter Verwendung eines Heißsiegelverfahrens versiegelt. Die
Kapseln wurden dann in physiologischer Saline für 3 Minuten inkubiert, was zur
Präzipitation von Chitosan führte. Zell-enthaltende Chitosan-Kapseln wurden einem
Wachstumsmedium zugeführt und in einem befeuchteten 7% CO&sub2;-Inkubator bei 37
ºC gehalten. Ähnliche Kapseln wurden unter Verwendung von 2% Alginat anstelle
von Chitosan hergestellt.
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Die eingekapselten PC12-Zellen wurden für 4 Wochen in Kultur gehalten, wobei die
Zellen während dieser Zeit innerhalb der Chitosan-Matrix proliferierten, und der
Zelltod war minimal. Unter Kalium-stimulierten Bedingungen setzten PC12-Zellen im
Bereich von 1-2 nanomolaren Konzentrationen Dopamin in 4 Wochen frei. PC12 in
Kapseln mit Alginat-Kernen waren nach 4 Wochen auch lebensfähig. Jedoch traten
Zellen in kleinen sphäroiden Clustern innerhalb des Alginats auf. Wenig oder keine
neuritischen Extrone waren sichtbar.
BEISPIEL 4
In vivo-Lebensfähigkeit von PC12-Zellen, eingekapselt in Anwesenheit einer
präzipitierten Chitosan-Matrix
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PC12-Zellen wurden kürzlich in Abwesenheit einer Kernmatrix eingekapselt und in
die Gehirne von Nagetieren und nicht-humanen Primaten implantiert. Zellen
überleben und können Parkinsonsche Symptome in einer Vielzahl von Model-
Systemen verbessern. Jedoch klumpen die PC12-Zellen in Abwesenheit von Kern-
Matrices unter Bildung großer Cluster zusammen, welche nekrotische Kerne
ausbilden und wesentliche neuritische Prozesse nicht ausdehnen. Die vorliegenden
Experimente wurden gestaltet, um die Verhaltens- und Wachstums-Eigenschaften
von PC12-Zellen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von präzipitierten Chitosan-
Kernmatrices gewachsen sind, zu vergleichen.
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PC12-Zellen wurden in Suspensions-Kulturen gezüchtet, gesammelt, mit RPMI-
Medium gewaschen, zentrifugiert, und der Überstand wurde abdekantiert.
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4,4 g hochmolekul. Chitosan von Fluka wurden in 150 ml einer sterilen 0,85%igen
Saline bei 70ºC unter heftigem Rühren gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit
45 ml einer 100 nM HEPES-gepufferten Saline (pH 8,0) auf 6,2 eingestellt. Die
Lösung wurde steril durch einen 0,22 um Millipor-Filter filtriert.
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Die Chitosan-Lösung wurde mit einem gleichen Volumen RPMI gemischt und dazu
verwendet, um das Zell-Pellet auf eine Konzentration von 5 · 10&sup6; Zellen/ml zu
resuspendieren. Die Zell/Chitosan-Lösung (1000 ul) wurde mit PAN/PVC in eine
semipermeable PAN/PVC-Faser (700 um ID, ~950 um OD, MWCO ~60 kd)
coextrudiert. Die Fasern wurden in geeignete Größen geschnitten (1,1 ± 0,1 cm) und
durch Zusammendrücken der Enden verschlossen, und es wurde zum Schließen
Wärme angewendet. Die Verschlüsse wurden dann mit PAN/PVC bedeckt (15 g
PAN/PVC: 85 g DMSO). Die Zellen wurden vor der Implantation in RPMI plus 6 um
Insulin für 24-48 Stunden in Kultur gehalten.
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Kontroll-Kapseln wurden unter Verwendung der gleichen Prozedur hergestellt, mit
der Ausnahme, das HEPES-gepufferte Saline ohne Chitosan verwendet wurde.
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Eingekapselte PC12-Zellen wurden in die Basalganglien von Ketamin-betäubten
cynomologen Affen implantiert. Eine Kraniotomie wurde durchgeführt, indem eine
konstante Irrigation mit 0,9% steriler Saline durchgeführt wurde. Die Injektions-
Koordinaten waren (bezogen auf die Mittellinie)
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C1 = 21,0 mmA · 4,5 mml (14,5 mmV)
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P1 = 23,0 mmA · 9,0 mml (14,0 mmV)
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P2 = 19,0 mmA · 10,0 mml (12,0 mmV)
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P3 = 15,5 mmA · 11,5 mml (13,0 mmV)
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Die Spitze einer Teflon-Kanüle, die speziell dafür gestaltet ist, eine Kapsel mit
minimalem Zwischenraum aufzunehmen, enthaltend einen Opturator, wurde mit den
geeigneten Koordinaten in dem Striatum angeordnet. Der Opturator wurde entfernt,
und die Kapsel wurde in die Kanüle gebracht und in dem Striatum abgesetzt. Die
Kanüle wurde dann entfernt, drei zusätzliche Kapseln wurden entsprechend in
benachbarten striatalen Bereiche platziert. Nach der Implantation wurde die Dura
geschlossen und der Schädellappen eingesetzt und befestigt und verschlossen.
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Vier Wochen nach der Implantation wurden die Kapseln entnommen, und es wurde
eine histologische Analyse durchgeführt. In solchen Kapseln mit der Chitosan-
Kernmatrix der vorliegenden Erfindung waren die Zellen lebensfähig und kleine
Cluster waren über die Länge der Kapsel verteilt. In Kapseln ohne Chitosan-Kerne
waren PC12-Zellen zu großen Clustern mit nekrotischen Kernen aggregiert.
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Die verbesserte Lebensfähigkeit von PC12-Zellen in der Chitosan-Matrix der
vorliegenden Erfindung kann leicht bei einem Vergleich der Fig. 1 und Fig. 2
gesehen werden. Fig. 1 zeigt sehr große Cluster aus PC12-Zellen aus einem
thermoplastischen Kapsel-Implantat ohne eine Kernmatrix. Mehrere weiße
nekrotische Zell-Kerne (d. h. tote Zellen) sind in den Zell-Clustern im oberen linken
Teil eindeutig sichtbar. Fig. 2 zeigt die PC12-Zellen, eingebettet in dem präzipitierten
Chitosan-Kernmatrix-Implantat der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen sind die
Zell-Cluster in Fig. 2 viel kleiner, und es gibt kein Anzeichen für Nekrose.
BEISPIEL 5
Herstellung präzipitierter Chitosan-Kernmatrices für dreidimensionale PC12-Zellen
Adhäsions/Beibehaltung Voreinkapselung
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Es wurden 8 ml bei 0,5-1 · 10&sup6; Zellen/ml PC12-Zellen von Gefäßkulturen genommen
(zerrieben aus einem Rattenschwanz-Kollagen-Substrat), in einem kegelförmigen 15
ml Zentrifugenröhrchen platziert und mit 2 ml einer 2% Chitosan-Lösung (Fluka HV)
in 25 nM HEPES in isotonischer Saline mit pH 6,4 gemischt. Die Zell/Chitosan-
Lösung wurde durch leichtes Umdrehen gemischt, bis ein flockenartiges Präzipitat
beobachtet wurde.
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Die Zell/Chitosan-Lösung wurde dann in eine 100 mm Petrischale gebracht und in
statischer Kultur bei 37ºC, 7% CO&sub2; in PC12-Medium gezüchtet. Es wurde
beobachtet, dass Zellen innerhalb des geflockten präzipitierten Chitosans in
traubenartigen Clustern wachsen.
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Nach 5 Tagen in Kultur wurde das PC12-Zellen/Chitosan-Gerüst durch Zentrifugation
bei 500 · g in kegelförmigen Zentrifugenröhrchen gesammelt. Unter diesen
Bedingungen blieben einzelne Zellen in dem Überstand suspendiert, und der PC12-
Zellen/Chitosan-Komplex pelletisierte. Die Hälfte des Mediums wurde dann
dekantiert und durch frisches Medium ersetzt (ohne Chitosan). Der PC12-
Zellen/Chitosan-Komplex wurde an dieser Stelle entweder wieder auf die Platte
gebracht oder suspendiert und bei einer Dichte von 5-10 · 10&sup6; Zellen/ml in
vorgeformte PAN/PVC-Kapseln geladen.