DE102006024696A1

DE102006024696A1 - Kollagenbeschichteter Träger und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE102006024696A1
Application number: DE102006024696A
Authority: DE
Inventors: Machiko Kato; Ken Sugo
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2005-05-25
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2006-11-30
Also published as: US20060270037A1; GB0610641D0; FR2886311A1; GB2426519A; FR2886311B1; JP2006325467A

Abstract

Es wird ein kollagenbeschichteter Träger (1) bereitgestellt, der ausgezeichnete Zellhafteigenschaften aufweist und ein ausgezeichnetes Zellwachstum ermöglicht. Ferner wird ein Verfahren angegeben, nach dem ein solcher kollagenbeschichteter Träger effizient und zuverlässig hergestellt werden kann. Der kollagenbeschichtete Träger (1) umfasst ein Grund- oder Trägermaterial (2), das aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht, sowie eine Deckschicht (3), die die Oberfläche des Grundmaterials (2) bedeckt. Die Deckschicht (3) besteht aus einem Kollagen und einem Protein, das eine hohe Affinität gegenüber dem Kollagen aufweist. Die Deckschicht (3), die die Oberfläche des Grundmaterials (2) bedeckt, wird ausgebildet, indem es dem Grundmaterial (2) ermöglicht wird, das Kollagen über das Protein fest zu adsorbieren. Vorzugsweise hat das Protein einen Kollagenrezeptor. Weiterhin enthält das Protein vorzugsweise eine der Substanzen Fibronektin und Integrin als Hauptbestandteil.

Description

Die Erfindung betrifft einen kollagenbeschichteten Träger und ein Verfahren zur Herstellung eines kollagenbeschichteten Trägers.

In den vergangenen Jahren wurde die Zellkulturtechnologie auf verschiedenen Gebieten von Industrie und Forschung, zum Beispiel der Zellgewebetechnik, bei Sicherheitstest von Arzneimitteln, bei der Herstellung von Proteinen zu Behandlungs- und Diagnosezwecken etc. eingesetzt.

Um eine große Zahl an festsitzenden oder sessilen Zellen. d.h. von einer Verankerung abhängigen Zellen, effizient zu kultivieren, wird derzeit die Zellkultivierung nicht mittels einer planen Kultur unter Verwendung einer Kulturflasche, sondern mittels einer dreidimensionalen Kultur hoher dichte (Suspensionskultur) unter Verwendung von Trägern durchgeführt, die als Gerüste dienen, auf denen die Zellen wachsen können.

In einer solchen dreidimensionalen, hochdichten Kultur werden verschiedenartige Träger eingesetzt, zum Beispiel Träger aus Polystyrol, DEAE-Zellulose oder Polyacrylamid, sowie Träger, die aus magnetischen Teilen bestehen.

In den vergangenen Jahren ist die Forschung in der regenerativen Medizin rasch vorangeschritten. Dabei stellt die regenerative Medizin eine neue medizinische Therapie dar, die auf verschiedenartige Gewebe oder Organe im Körper anwendbar ist und die Reparatur und Regeneration eigenen Gewebes oder eigener Organe ermöglicht, indem in einem Körper mittels eines Gerüstes, auf dem die eigenen Zellen wachsen können, eine geeignete Umgebung erzeugt wird.

Um Zellen effizient zu kultivieren, werden beispielsweise Träger, deren Oberflächen mit einer kalziumphosphatbasierten Verbindung hoher biologischer Verträglichkeit beschichtet sind, als Gerüste verwendet (Vgl. z.B. Japanische Patentschrift 2004-313007).

Abhängig von der zu kultivierenden Zellart ist es jedoch möglicherweise schwierig, zuverlässig zu gewährleisten, dass die Zellen auf den Trägern wachsen, da sie nur schlecht an den Trägern haften. Deshalb besteht nunmehr eine Nachfrage nach Trägern, auf denen selbst solche Zellen zuverlässig haften, die auf herkömmlichen Trägern nur schlecht haften.

In diesem Zusammenhang ist Kollagen als ein Material bekannt, das die Anhaftung und das Wachstum von Zellen befördert. Es kann deshalb in Betracht gezogen werden, dass Träger, deren Oberflächen mit Kollagen beschichtet sind, es verschiedenartigen Zellen ermöglichen, auf ihnen zu haften und zu wachsen.

Jedoch ist das Adsorptionsvermögen einer kalziumphosphatbasierten Verbindung gegenüber Kollagen sehr schwach. Deshalb besteht das Problem, dass das Kollagen, das auf einer kalziumphosphatbasierten Verbindung adsorbiert ist, sich leicht von den Trägern löst.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen kollagenbeschichteten Träger anzugeben, der ausgezeichnete Zellhafteigenschaften aufweist und ein ausgezeichnetes Zellwachstum auf dem Träger ermöglicht. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein effizientes und zuverlässiges Verfahren zum Herstellen eines solchen kollagenbeschichteten Trägers anzugeben.

Die Erfindung löst diese Aufgaben durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung ermöglicht es, in effizienter und zuverlässiger Weise einen kollagenbeschichteten Träger zu erhalten, der ausgezeichnete Zellhafteigenschaften aufweist und auf dem ein ausgezeichnetes Zellwachstum möglich ist.

Wird der kollagenbeschichtete Träger nach der Erfindung als Zellkulturträger verwendet, so können die zu kultivierenden Zellen noch effizienter und zuverlässiger als bisher auf dem Zellkulturträger wachsen.

Wird der kollagenbeschichtete Träger nach der Erfindung als Material verwendet, dass zum Füllen einer Knochendefektstelle dient, so bildet der Träger ein Gerüst, auf dem neues Knochengewebe (Osteoblasten) noch effizienter als bisher wachsen können.

Der kollagenbeschichtete Träger und die auf ihm gewachsenen Osteoblasten können in diesem Fall die Knochendefektstelle schneller als bisher reparieren und regenerieren.

Die Erfindung ist auf einen koliagenbeschichteten Träger gerichtet, der ein Träger- oder Grundmaterial (Träger) umfasst, dessen Oberfläche zumindest zu einem Teil aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht, wobei der genannte Teil der Oberfläche des Trägermaterials über ein Protein, dass eine hohe Affinität gegenüber Kollagen aufweist, mit dem Kollagen beschichtet ist.

Die Erfindung ermöglicht es, einen kollagenbeschichteten Träger anzugeben, der ausgezeichnete Zellhafteigenschaften aufweist und ein ausgezeichnetes Zellwachstum auf dem Träger ermöglicht.

Vorzugsweise hat das Protein einen Kollagenrezeptor.

Dies ermöglicht es dem Protein, selektiv eine Bindung mit dem Kollagen einzugehen, so dass das Kollagen fester an dem Träger- oder Grundmaterial adsorbiert wird.

In diesem Fall enthält das Protein vorzugsweise Fibronektin und/oder Integrin als Hauptbestandteil. Dies ermöglicht es dem Kollagen, besonders fest an dem Trägermaterial adsorbiert zu werden, da Fibronektin und Integrin einen Kollagenrezeptor aufweisen, der in ihrem jeweiligen Moleküls selektiv eine Bindung mit dem Kollagen eingeht, und die Eigenschaft haben, eine kalziumphosphatbasierte Verbindung fest zu adsorbieren.

Vorzugsweise enthält das Kollagen ein Kollagen vom Typ I als Hauptbestandteil.

Der Grund hierfür ist, dass unter den verschiedenen Kollagentypen das Kollagen vom Typ I ein Kollagen darstellt, das in verschiedenartigen Geweben (Organen), die einen lebenden Körper bilden, in großer Menge vorhanden ist und ein hohes Adsorptionsvermögen gegenüber verschiedenartigen Zellen aufweist. Außerdem wird Kollagen vom Typ I vergleichsweise leicht denaturiert und weist eine hohe Affinität gegenüber Zellen auf.

Vorzugsweise wird das Kollagen von einem Landtier gewonnen.

Von einem Landtier gewonnenes Kollagen weist eine vergleichsweise hohe Denaturierungstemperatur auf. Es ist deshalb bei Temperaturen, die üblicherweise bei der Zellkultivierung angewandt werden, relativ stabil und löst sich nur schwer von der Oberfläche des Trägermaterials.

Vorzugsweise ist zumindest ein Teil des Kollagens denaturiert.

Dadurch hat das Kollagen eine höhere Affinität gegenüber Zellen, so dass eine große Zahl an Zellen noch fester an dem Kollagen adsorbiert werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung kann das Kollagen in einem Lösungsmittel gelöst werden, dass eine pH-Wert von 6,0 bis 8,0 bei einem Verhältnis von mindestens 100 μg pro Milliliter Lösungsmittel hat.

Dadurch kann das Kollagen ausreichend in dem Lösungsmittel gelöst werden, so dass es bei der Herstellung des kollagenbeschichteten Trägers noch zuverlässiger an der Oberfläche des Trägermaterials haftet. Indem zum Lösen des Kollagens ein solches Lösungsmittel verwendet wird, das nahezu pH-neutral ist, kann verhindert werden, dass sich die kalziumphosphatbasierte Verbindung auflöst.

Vorzugsweise erhält man das Trägermaterial, indem die Oberfläche einer Matrix mit der kalziumphosphatbasierten Verbindung beschichtet wird.

Auf diese Weise kann ein Grund- oder Trägermaterial mit einer vergleichsweise komplizierten Form hergestellt und zugleich die Haftung zwischen der Kalziumphosphat basierten Verbindung (Oberflächenschicht) und einer Deckschicht aufrechterhalten werden, die die Oberfläche des Trägermaterials bedeckt und aus dem Kollagen und dem Protein besteht, dass eine hohe Affinität gegenüber dem Kollagen aufweist.

Vorzugsweise ist das Trägermaterial körnchen-, pellet-, block- oder blattförmig.

Dadurch kann ein kollagenbeschichteter Träger bereitgestellt werden, der körnchen-, pellet-, block- oder blattförmig ist und den Anforderungen, die an Zellkulturträger gestellt werden, genügt. Alternativ können Knochenfüllmaterialien in einer Vielzahl von Formen bereitgestellt werden.

Die Kalziumphosphat basierte Verbindung enthält vorzugsweise Trikalziumphosphat und/Hydroxylapatit als Hauptbestandteil.

Der Grund hierfür ist, dass Trikalziumphosphat und/Hydroxylapatit eine hohe biologische Verträglichkeit aufweisen. Auf diese Weise erhält man ein Träger- oder Grundmaterial, das eine hohe Affinität gegenüber einer großen Zahl an Proteinen aufweist.

Der kollagenbeschichtete Träger nach der Erfindung wird vorteilhaft zur Zellkultivierung eingesetzt.

In diesem Fall können die zu kultivierenden Zellen noch effizienter und zuverlässiger wachsen.

Auch kann der kollagenbeschichtete Träger nach der Erfindung vorzugsweise eingesetzt werden, um eine Knochendefektstelle zu füllen.

In diesem Fall können der kollagenbeschichtete Träger und die gewachsenen Osteoblasten die Knochendefektstelle schneller als bisher reparieren und regenerieren.

Die Erfindung sieht ferner ein Verfahren zum Herstellen eines kollagenbeschichtete Trägers vor, mit folgenden Schritten: Bereitstellen eines Trägermaterials, dessen Oberfläche zumindest zu einem Teil aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht; und Inkontaktbringen des Trägers mit Kollagen und einem Protein, das eine hohe Affinität gegenüber dem Kollagen aufweist, um den genannten Teil der Oberfläche des Trägermaterials über das Protein mit dem Kollagen zu beschichten.

Mit diesem Verfahren ist es möglich, einen kollagenbeschichteten Träger effizient und zuverlässig herzustellen.

Ferner ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen eines kollagenbeschichtete Trägers gerichtet, mit folgenden Schritten:
Bereitstellen eines Trägermaterials, dessen Oberfläche zumindest zu einem Teil aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht;
Inkontaktbringen des Trägers mit einer ersten Behandlungsflüssigkeit, die ein Protein enthält, das eine hohe Affinität gegenüber Kollagenen aufweist, um es dem Protein zu ermöglichen, an dem genannten Teil der Oberfläche des Trägermaterials zu haften;
und Inkontaktbringen des Trägers mit einer zweiten Behandlungsflüssigkeit, die das Kollagen enthält, um den genannten Teil der Oberfläche des Trägermaterials über das Protein mit dem Kollagen zu beschichten.

Mit diesem Verfahren ist es möglich, einen kollagenbeschichteten Träger noch effizienter und zuverlässiger herzustellen.

Vorzugsweise beträgt die Proteinkonzentration in der ersten Behandlungsflüssigkeit 0,1 bis 100 μg/ml.

Dadurch kann das Protein noch effizienter und zuverlässiger an dem Träger- oder Grundmaterial adsorbiert werden.

Vorzugsweise liegt die Temperatur der ersten Behandlungsflüssigkeit bei 4 bis 39°C.

Dies ermöglicht es dem Protein, effizient an dem Trägermaterial adsorbiert zu werden.

Die Zeit, während der das Trägermaterial mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, beträgt vorzugsweise 10 Minuten bis 10 Stunden.

Auch dadurch kann das Protein noch effizienter an dem Trägermaterial adsorbiert werden.

Der pH-Wert der ersten Behandlungsflüssigkeit beträgt vorzugsweise 6,0 bis 8,0.

Dadurch kann zuverlässig verhindert werden, dass das Protein und die kalziumphosphatbasierte Verbindung denaturiert und aufgelöst werden.

Die Kollagenkonzentration in der zweiten Behandlungsflüssigkeit beträgt vorzugsweise 1 bis 1000 μg/ml.

Dadurch kann das Kollagen noch effizienter und zuverlässiger an dem Protein adsorbiert werden, so dass die Deckschicht besonders effizient ausgebildet wird.

Die Temperatur der zweiten Behandlungsflüssigkeit beträgt vorzugsweise 4 bis 39°C. Dadurch kann das Kollagen zuverlässig denaturiert und effizient an dem Protein adsorbiert werden.

Die Zeit, während der das Trägermaterial in Kontakt mit der zweiten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, beträgt vorzugsweise 10 Minuten bis 10 Stunden.

Auch dadurch kann das Kollagen zuverlässig denaturiert und noch effizienter an dem Protein adsorbiert werden.

Vorzugsweise beträgt der pH-Wert der zweiten Behandlungsflüssigkeit 6,0 bis 8,0.

Dadurch kann die Aggregation/Ausfällung des Kollagens in der zweiten Behandlungsflüssigkeit zuverlässig vermieden werden. Außerdem wird verhindert, dass sich die kalziumphosphatbasierte Verbindung auflöst.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
1 einen Querschnitt durch einen kollagenbeschichteten Träger nach einem ersten Ausführungsbeispiel der Erfindung;
2 einen Querschnitt durch einen kollagenbeschichteten Träger nach einem zweiten Ausführungsbeispiel der Erfindung;
3 ein Bild von HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung von Zellkulturträgern kultiviert worden sind, die in Beispiel 1 hergestellt worden sind;
4 ein Bild von HUV-EC-C-Zellen die unter Verwendung von Zellkulturträgern kultiviert worden sind, die in dem Vergleichsbeispiel 1 hergestellt worden sind,
5 ein Bild von HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung von Zellkulturträgern kultiviert worden sind, die in dem Vergleichsbeispiel 2 hergestellt worden sind; und
6 ein Bild von HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung von Zellkulturträgern kultiviert worden sind, die in dem Vergleichsbeispiel 3 hergestellt worden sind.
Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Im Folgenden wird ein kollagenbeschichteter Träger nach der Erfindung anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren im Detail beschrieben.
Erstes Ausführungsbeispiel
Zunächst werden ein erstes Ausführungsbeispiel des kollagenbeschichteten Trägers nach der Erfindung sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung beschrieben.
1 zeigt das erste Ausführungsbeispiel des kollagenbeschichteten Trägers nach der Erfindung in einer Querschnittsansicht. Wie in 1 gezeigt, umfasst ein kollagenbeschichteter Träger 1 ein Grund- oder Trägermaterial (Träger) 2 das aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht, und eine Deckschicht 3, die die Oberfläche des Grundmaterials 2 bedeckt.
Der kollagenbeschichtete Träger 1 dient als Gerüst, das es Zellen ermöglicht, an seiner Oberfläche zu haften und darauf zu wachsen.
Beispiele für Zellen, die unter Verwendung solcher kollagenbeschichteter Träger kultiviert werden, sind verschiedenartige Zellen wie undifferenzierte embryonale Stammzellen, undifferenzierte mesenchymale Stammzellen, Wirtszellen zur Verwendung in der genetischen Rekombination, etc. Die zu verwendenden Zellen sind jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Das Grundmaterial 2 ist so ausgebildet, dass es körnchen-, pellet-, block- oder blattförmig ist. Dementsprechend kann der kollagenbeschichtete Träger 1 körnchen-, pellet-, block- oder blattförmig ausgebildet werden, um den jeweiligen Anforderungen an Zellkulturträger oder Knochenfüllmaterialien unterschiedlicher Form gerecht zu werden.
Der kollagenbeschichtete Träger, der eine Körnchen-, Pellet- oder Blattform aufweist, wird z.B. vorteilhaft als Zellkulturträger verwendet. Indem der kollagenbeschichtete Träger 1 in oben beschriebener Weise geformt ist, können Formschwankungen einzelner Träger verringert werden, so dass der Einfluss der Form der Zellkulturträger auf die Zellkultur möglichst gering ist.
Der kollagenbeschichtete Träger 1, der eine Körnchen- oder Blockform aufweist, wird vorzugsweise z.B. als Knochenfüllmaterial verwendet. Wird ein Knochendefekt mit einem solchen Knochenfüllmaterial gefüllt, so wächst das Knochengewebe (Osteoblaste) noch effizienter auf dem Knochenfüllmaterial. Der Knochendefekt kann so repariert werden.
Insbesondere können kollagenbeschichtete Träger 1, die jeweils eine Körnchenform aufweisen, zuverlässig in eine Knochendefektstelle eingebracht werden, selbst wenn letztere kompliziert geformt ist. Der Knochendefekt kann so noch zuverlässiger repariert werden.
Andererseits kann der kollagenbeschichtete Träger 1, wenn er eine Blockform aufweist, so geformt werden, dass er in eine Knochendefektstelle passt. Ist eine solche Knochendefektstelle vergleichsweise groß, so ist der blockförmige, kollagenbeschichtete Träger 1 besonders geeignet, den Knochendefekt noch zuverlässiger zu reparieren.
Die Deckschicht 3, die die Oberfläche des Grundmaterials 2 bedeckt, besteht aus Kollagen und einem Protein, das eine hohe Affinität gegenüber dem Kollagen aufweist. Die Deckschicht 3 wird ausgebildet, indem es dem Grundmaterial 2 ermöglicht wird, das Kollagen über das Protein fest zu adsorbieren.
Im Folgenden wird die Deckschicht 3 im Detail beschrieben. In der folgenden Beschreibung bezeichnet der Begriff „Protein" ein Protein, das eine hohe Affinität gegenüber Kollagen aufweist.
Der Begriff „Kollagen" bezeichnet ein fasriges Skleroprotein, dass in tierischem Bindegewebe enthalten ist. Ein solches Kollagen weist eine hohe Affinität gegenüber Zellen auf und kann deshalb als Substrat verwendet werden, das die Anhaftung oder Bindung von Zellen an Trägern und das Zellwachstum auf den Trägern befördert.
Ein solches Kollagen kann entsprechend seiner Molekularstruktur in fünf Haupttypen I bis V klassifiziert werden. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kollagen kann aus einem beliebigen dieser Kollagentypen bestehen. Vorzugsweise enthält es jedoch ein Kollagen vom Typ I als Hauptbestandteil. Das Kollagen vom Typ I ist in vielen verschiedenartigen Geweben (Organen) vorhanden, die den lebenden Körper bilden. Unter den verschiedenen Kollagentypen hat das Kollagen vom Typ I ein hohes Adsorptionsvermögen gegenüber verschiedenartigen Zellen. Darüber hinaus kann Kollagen vom Typ I, wie später im Detail beschrieben, vergleichsweise einfach denaturiert werden und weist eine hohe Affinität gegenüber Zellen auf. Aus diesen Gründen ist Kollagen vom Typ I für die vorliegende Erfindung besonders geeignet.
Beispiele für solches Kollagen sind Kollagene, die von Landtieren wie Schwein, Rind, Schaf oder auch dem Menschen gewonnen werden, sowie solche Kollagene, die von Fischen gewonnen werden, z.B. Lachs, Thunfisch, Atka-Makrele, Alaska-Pollack, Plattfisch (einschließlich der linksäugigen Flunder und der rechtsäugigen Flunder) und Hai.
Unter den genannten Kollagenen sind diejenigen, die von Landtieren gewonnen werden, für die vorliegende Erfindung bevorzugt. So hat ein von einem Landtier gewonnenes Kollagen eine vergleichsweise hohe Denaturierungstemperatur. Es ist deshalb vergleichsweise stabil und löst sich bei Temperaturen, die üblicherweise zur Zellkultivierung angewandt werden, nur schwer von der Oberfläche des Grundmaterials 2.
Vorzugsweise ist zumindest ein Teil des Kollagens, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, denaturiert. Dadurch weist das Kollagen ein höhere Afinität gegenüber Zellen auf, so dass eine große Zahl an Zellen besonders fest an dem Kollagen adsorbiert werden können.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Kollagen kann in einem Lösungsmittel gelöst werden, das einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 vorzugsweise bei einem Verhältnis von 100 μg oder mehr pro Milliliter Lösungsmittel, noch besser bei einem Verhältnis von 1000 μg oder mehr pro Milliliter Lösungsmittel aufweist. Dadurch kann das Kollagen in ausreichendem Maße in dem Lösungsmittel gelöst werden, so dass das Kollagen im Prozess zur Herstellung des kollagenbeschichteten Trägers 1 noch zuverlässiger an der Oberfläche des Grundmaterials 2 haften kann. Außerdem kann durch die Verwendung eines solchen zum Lösen des Kollagens bestimmten Lösungsmittels, das einen annähernd neutralen pH-Wert aufweist, verhindert werden, dass sich die kalziumphosphatbasierte Verbindung zersetzt. Beispiele für ein solches Lösungsmittel beinhalten verschiedene Arten von Puffern sowie verschiedene Arten von Wasser, wie später beschrieben wird.
Das Kollagen haftet über das Protein an dem Grundmaterial 2, um letzteres zu bedecken, wie oben beschrieben wurde.
Das in der Erfindung zu verwendende Protein unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, sofern es eine hohe Affinitität gegenüber dem Kollagen aufweist. Vorzugsweise weist es jedoch einen Kollagenrezeptor auf. Ein Kollagenrezeptor ist eine Stelle, die in dem Protein vorhanden ist und Kollagen spezifisch bindet. Ein Protein, das einen Kollagenrezeptor aufweist, ist so imstande, Kollagen selektiv zu binden. Dadurch kann das Grundmaterial 2 das Kollagen noch fester adsorbieren.
Beispiele für ein solches Protein sind Fibronektin, Integrin und Lamenin.
Außerdem weist das in der Erfindung verwendete Protein vorteilhaft ein ausgezeichnetes Haftvermögen gegenüber der kalziumphosphatbasierten Verbindung auf. Dadurch ist das Grundmaterial 2 imstande, das Protein fest zu adsorbieren.
Unter den oben genannten Proteinen enthält das in der Erfindung zu verwendende Protein vorzugsweise mindestens eine der Substanzen Fibronektin und Integrin als Hauptbestandteil. Dadurch kann das Grundmaterial 2 das Protein noch fester adsorbieren, da Fibronektin und Integrin einen Kollagenrezeptor aufweisen, der in dem jeweiligen Molekül selektiv an das Kollagen anbindet, und die Eigenschaft haben, einen kalziumphosphatbasierte Verbindung fest zu adsorbieren.
Vorliegend ist Fibronektin ein Glykoprotein, das auch in der Plasmamembran von Zellen enthalten ist. Fibronektin bindet nicht nur spezifisch an biologische Polymere wie Kollagen an, sondern hat auch die Eigenschaft, eine kalziumphosphatbasierte Verbindung fest zu adsorbieren. Fibronektin weist deshalb ein besonders hohes Adsorptionsvermögen gegenüber dem Grundmaterial 2 und dem Kollagen auf.
Dagegen ist Integrin ein Rezeptor, der spezifisch an Kollagen und dergleichen anbindet und ein besonders hohes Adsorptionsvermögen gegenüber einer kalziumphosphatbasierten Verbindung aufweist. Wie Fibronektin weist auch Integrin ein besonders hohes Adsorptionsvermögen gegenüber dem Grundmaterial 2 und dem Kollagen auf.
Die Menge an Kollagen, die an dem Grund- oder Trägermaterial 2 zu adsorbieren ist, liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwas 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–3 g, noch besser in einem Bereich von etwa 1 × 10^–5 bis 1 × 10^–4 g pro cm² Fläche des Grundmaterials (Träger).
Liegt die Menge des an dem Grundmaterial 2 zu adsorbierenden Kollagens unter dem vorstehend genannten unteren Grenzwert, so ist die Wirkung des Kollagens auf die Zellhaftung nicht ausreichend. Liegt dagegen die Menge des an dem Grundmaterial zu adsorbierenden Kollagens über dem vorstehend genannten oberen Grenzwert, so besteht die Befürchtung, dass sich überschüssiges Kollagen von dem Grundmaterial 2 löst. Selbst wenn die Menge an Deckschicht 3 erhöht wird, um den vorstehend genannten oberen Grenzwert zu vergrößern, kann nicht erwartet werden, dass die Zahl an Zellen, die an der Deckschicht 3 haften, weiter erhöht wird.
Im Hinblick darauf, eine möglichst große Zahl an Zellen in Anhaftung und Wachstum zu bringen, ist es vorteilhaft, wenn die Deckschicht 3 nahezu die gesamte Oberfläche des Grundmaterials 2 bedeckt. Jedoch ist die Erfindung nicht auf eine solche Struktur beschränkt. Insbesondere kann die Deckschicht 3 auch nur einen Teil der Oberfläche des Grundmaterials 2 bedecken. In diesem Fall liegt die Oberfläche des Grundmaterials 2 also teilweise frei.
Das Grund- oder Trägermaterial 2 bildet das Gerüst des kollagenbeschichteten Trägers 1. Wie oben beschrieben, besteht es hauptsächlich aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung.
Beispiele für eine solche kalziumphosphatbasierte Verbindung sind Trikalziumphosphat, Hydroxylapatit und halogenhaltige Apatite wie Fluorapatit. Die in der vorliegenden Erfindung verwendete kalziumphosphatbasierte Verbindung enthält mindestens eine der Substanzen Trikalziumphospaht und Hydroxylapatit als Hauptbestandteil.
Trikalziumphosphat ähnelt in seiner Zusammensetzung und Struktur dem anorganischen Bestandteil menschlichen Knochens und weist eine hohe biologische Verträglichkeit auf. Trikalziumphosphat weist deshalb eine hohe Affinität gegenüber dem oben beschriebenen Protein auf und ist imstande, die Deckschicht 3 noch fester zu adsorbieren.
Hydroxyiapatit hat eine einzigartige kristalline Struktur, die von seiner Apatitstruktur her rührt. Unter den verschiedenartigen kalziumphosphatbasierte Verbindung weist er deshalb eine besonders hohe biologische Verträglichkeit sowie eine hohe Affinität gegenüber verschiedenartigen Proteinen auf.
Im Folgenden wird ein Verfahren zum Herstellen des kollagenbeschichteten Trägers beschrieben.
Der kollagenbeschichtete Träger 1 kann hergestellt werden, indem das Grundmaterial 2 in Kontakt mit dem Kollagen und dem Protein gebracht wird. Nach einem solchen Verfahren ist die effiziente und zuverlässige Herstellung des kollagenbeschichteten Trägers 1 möglich, bei das Grundmaterial 2 mit der Deckschicht 3 bedeckt ist, die ausgebildet wird, indem es dem Kollagen ermöglicht wird, über das Protein an der Oberfläche des Grundmaterials 2 zu haften.
Spezielle Beispiele für ein Verfahren, mit dem das Grundmaterial 2 in Kontakt mit dem Kollagen und dem Protein gebracht wird, sind ein Verfahren, bei dem das Grundmaterial 2 in Kontakt mit einer Behandlungsflüssigkeit gebracht wird, die sowohl das Kollagen als auch das Protein enthält; sowie ein Verfahren, bei dem das Grundmaterial 2 in Kontakt mit einer Behandlungsflüssigkeit gebracht wird, die das Protein enthält (im Folgenden einfach als „erste Behandlungsflüssigkeit" bezeichnet), und das Grundmaterial 2, das in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gebracht worden ist, in Kontakt mit einer Behandlungsflüssigkeit gebracht wird, die das Kollagen enthält (im Folgenden einfach als „zweite Behandlungsflüssigkeit" bezeichnet). Unter diese Verfahren wird das zuletzt genannte Verfahren bevorzugt. Durch Anwenden dieses zuletzt genannten Verfahrens ist es möglich, noch effizienter und zuverlässiger die Deckschicht 3 auszubilden, die fest an den Grundmaterial 2 adsorbiert ist.
Im Folgenden wird das zuletzt genannte Verfahren im Detail beschrieben.

(1) Zunächst wird das Grundmaterial 2 in Kontakt mit einer ersten Behandlungsflüssigkeit gebracht, die ein Protein mit einer hohen Affinität gegenüber Kollagen (im Folgenden einfach als „Protein") enthält, um es dem Protein zu ermöglichen, an der Oberfläche des Grundmaterials 2 zu haften.

Beispiele für ein Verfahren, nach dem das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gebracht wird, sind ein Verfahren, bei dem das Grundmaterial 2 in die erste Behandlungsflüssigkeit getaucht wird (im Folgenden einfach als „Eintauchverfahren") bezeichnet, ein Verfahren, bei dem die erste Behandlungsflüssigkeit auf das Grundmaterial 2 aufgebracht wird (im Folgenden einfach als „Aufbringverfahren" bezeichnet), sowie ein Verfahren, bei dem ein feiner Nebel der ersten Behandlungsflüssigkeit auf das Grundmaterial 2 gesprüht wird (im Folgenden einfach als „Sprühverfahren") bezeichnet. Unter diesen Verfahren kommt vorzugsweise das Eintauchverfahren zur Anwendung. Mit dem Eintauchverfahren ist es möglich, das Grundmaterial 2 in einer großen Zahl gleichmäßig in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit zu bringen.
Bei Anwendung des Eintauchverfahrens wird die erste Behandlungsflüssigkeit vorzugsweise gerührt oder geschüttelt, während das Grundmaterial 2 in großer Zahl in die erste Behandlungsflüssigkeit eingetaucht ist. Auf diese Weise kann das Grundmaterial 2 gleichmäßig und rasch behandelt werden.
Die erste Behandlungsflüssigkeit wird hergestellt, indem das Protein in einem Lösungsmittel (Dispersionsmedium) gelöst wird. Beispiele für ein solches Lösungsmittel sind verschiedenartige Puffer (Flüssigkeit, die ein Puffermittel enthält) wie ein Triethanolaminhydrochlorid-Natriumhydroxid-Puffer, Veronal (Natrium-5,5-diethylbarbiturat)-Salzsäure-Puffer, Tris-Salzsäure-Puffer, Glycylglycin-Natriumhydroxid-Puffer, 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol-Salzsäure-Puffer, Diethanolalmin-Salzsäure-Puffer, Borsäure-Puffer, Natriumborat-Salzsäure-Puffer, Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, Natriumkarbonat-Natriumbikarbonat-Puffer, Natriumborat-Natriumhydroxid-Puffer, Natriumbikarbonat-Natriumhydroxid-Puffer, Phosphorsäure-Puffer, Kaliumphosphat-Dinatriumphosphat-Puffer, Dinatriumphosphat-Natriumhydroxid-Puffer, Briton-Robinson-Puffer, und GTA-Puffer; sowie verschiedene Arten von Wasser wie reines Wasser, höchstreines Wasser und Ionenaustausch-Wasser. Unter diesen Lösungsmitteln ist ein Phospohrsäure-Puffer (PBS) bevorzugt.
Die Porteinkonzentration in der ersten Behandlungsflüssigkeit liegt vorzugsweise in einem Bereich von 0,1 bis 100 μg/ml, noch besser in einem Bereich von 0,5 bis 50 μg/ml. Indem die Proteinkonzentration auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Protein noch effizienter und zuverlässiger an dem Grundmaterial 2 adsorbiert werden. Wird dagegen das Protein der ersten Behandlungsflüssigkeit in einer Menge zugegeben, das die Proteinkonzentration in der ersten Behandlungsflüssigkeit den vorstehend genannten oberen Grenzwert übersteigt, so ist nicht zu erwarten, dass auch die Effizienz der Proteinadsorption weiter erhöht wird.
Die Temperatur der ersten Behandlungsflüssigkeit, die in Kontakt mit dem Grundmaterial 2 zu bringen ist, liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 4 bis 39 °C, noch besser in einem Bereich von etwa 15 bis 38 °C. Indem die Temperatur der ersten Behandlungsflüssigkeit auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Protein effizient an dem Grundmaterial 2 adsorbiert werden. Übersteigt dagegen die Temperatur der ersten Behandlungsflüssigkeit den vorstehend genannten oberen Grenzwert, so besteht die Befürchtung, dass das Protein denaturiert wird.
Die Zeit, während der das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 10 Minuten bis 10 Stunden, noch besser in einem Bereich von etwa 20 Minuten bis etwa 1 Stunde. Indem die Zeit, während der das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Protein noch effizienter an dem Grundmaterial 2 adsorbiert werden. Wird dagegen die Zeit, während der das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, auf einen über dem vorstehend genannten oberen Grenzwert liegenden Wert eingestellt, so ist nicht zu erwarten, dass die Effizienz der Proteinadsorption des Grundmaterials 2 weiter erhöht wird.
Der pH-Wert der ersten Behandlungsflüssigkeit liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 6,0 bis 8,0, noch besser in einem Bereich von etwa 6,8 bis 7,4. Indem der pH-Wert der ersten Behandlungsflüssigkeit auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann sicher vermieden werden, dass das Protein und die kalziumphosphatbasierte Verbindung denaturiert und aufgelöst werden.

(2) Dann wird das Grundmaterial 2, an dem das Protein adsorbiert ist, in Kontakt mit einer zweiten Behandlungsflüssigkeit gebracht, die Kollagen enthält, so dass das Kollagen über das Protein an dem Grundmaterial 2 haftet. Auf diese Weise wird die Deckschicht 3 ausgebildet.

Das Grundmaterial 2 kann wie in Schritt (1) beschrieben in Kontakt mit der zweiten Behandlungsflüssigkeit gebracht werden.
Die zweite Behandlungsflüssigkeit wird zubereitet, indem Kollagen in einem Lösungsmittel (Dispersonsmedium) gelöst wird. Als Lösungsmittel kann das gleiche Mittel verwendet werden, das in dem oben beschriebenen Schritt (1) eingesetzt wird.
Die Kollagenkonzentration in der zweiten Behandlungsflüssigkeit liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 1 bis 1000 μg/ml, noch besser in einem Bereich von 5 bis 500 μg/ml. Indem die Kollagenkonzentration in der zweiten Behandlungsflüssigkeit auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Protein noch effizienter und zuverlässiger an dem Protein adsorbiert werden, so dass die Deckschicht 3 effizient ausgebildet wird. Gibt man der zweiten Behandlungsflüssigkeit Kollagen in einer Menge hinzu, dass die Kollagenkonzentration in der zweiten Behandlungsflüssigkeit den vorstehend genannten oberen Grenzwert übersteigt, so ist nicht zu erwarten, dass die Effizienz zur Ausbildung der Deckschicht 3 weiter erhöht wird.
Die Temperatur der zweiten Behandlungsflüssigkeit, die in Kontakt mit dem Grundmaterial 2 zu bringen ist, liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 4 bis 39 °C, noch besser in einem Bereich von etwa 15 bis 38 °C. Indem die Temperatur der zweiten Behandlungsflüssigkeit auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, ist es möglich, das Kollagen zuverlässig zu denaturieren und es effizient an dem Protein zu adsorbieren.
Die Zeit, während der das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der zweiten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, liegt varzugsweise in einem Bereich von etwa 10 Minuten bis 10 Stunden, noch besser in einem Bereich von etwa 20 Minuten bis 1 Stunde. Indem die Zeit, während der das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der zweiten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Kollagen zuverlässig denaturiert und effizient an den Protein adsorbiert werden. Wird die Zeit, während der das Grundmaterial 2 in Kontakt mit der zweiten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, so eingestellt, dass sie den vorstehend genannten oberen Grenzwert übersteigt, so ist nicht zu erwarten, dass die Effizienz, mit der das Kollagen an dem Protein adsorbiert wird, weiter erhöht wird.
Der pH-Wert der zweiten Behandlungsflüssigkeit liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 6,0 bis 8,0, noch besser in einem Bereich von etwa 6,8 bis 7,4. Indem der pH-Wert der zweiten Behandlungsflüssigkeit auf einen Wert innerhalb des vorstehen genannten Bereichs eingestellt wird, kann eine Aggregation/Ausfällung des Kollagens in der zweiten Behandlungsflüssigkeit sicher vermieden werden. Außerdem kann verhindert werden, dass sich die kalziumphosphatbasierte Verbindung auflöst.
In dem oben beschriebenen Verfahren zum Herstellen des kollagenbeschichteten Trägers kann das Kollagen, bevor oder nachdem es an dem Grundmaterial 2 adsorbiert ist, einer Behandlung zur Denaturierung unterzogen werden.
Diese Behandlung zur Denaturierung des Kollagens kann beispielsweise nach einem Verfahren durchgeführt werden, bei dem die zweite Behandlungsflüssigkeit, die das Kollagen enthält, auf einer vorbestimmten Temperatur gehalten wird.
Bei diesem Verfahren zur Denaturierung des Kollagens Liegt diese vorbestimmte Temperatur vorzugsweise in einem Bereich von etwa 1 bis 80°C, noch besser in einem Bereich von etwa 25 bis 40°C. Indem die vorbestimmte Temperatur auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Kollagen noch zuverlässiger denaturiert werden.
Bei dem Verfahren zur Denaturierung des Kollagens unterliegt die Zeit, während der die zweite Behandlungsflüssigkeit auf der vorbestimmten Temperatur gehalten wird, keiner besonderen Beschränkung. Vorzugsweise liegt sie jedoch in einem Bereich von etwa 10 Minuten bis 10 Stunden, noch besser in einem Bereich von etwa 30 Minuten bis 90 Minuten. Indem die Zeit auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann das Kollagen noch zuverlässiger denaturiert werden. Wird die Zeit so eingestellt, dass sie den vorstehend genannten oberen Grenzwert übersteigt, so ist nicht zu erwarten, dass die Denaturierung des Kollagens weiter voranschreitet.
Bei dem Verfahren zur Denaturierung des Kollagens liegt der pH-Wert der zweiten Behandlungsflüssigkeit vorzugsweise in einem Bereich von etwa 6,0 bis 8,0 noch besser in einem Bereich von etwa 6,8 bis 7,4. Indem der pH-Wert der zweiten Behandlungsflüssigkeit auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann eine Aggregation/Ausfällung des Kollagens in der zweiten Behandlungsflüssigkeit sicher vermieden werden.
Im Hinblick darauf, es einer möglichst großen Zahlen an Zellen zu ermöglichen, an der Oberfläche des kollagenbeschichteten Trägers 1 zu haften und darauf zu wachsen, bedeckt die Deckschicht 3 vorzugsweise die gesamte Oberfläche des Grundmaterials 2. Es ist jedoch ebenso möglich, dass die Deckschicht 3 nur einen Teil der Oberfläche des Grundmaterials 2 bedeckt.
Zweites Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird ein zweites Ausführungsbeispiel des kollagenbeschichteten Trägers nach der Erfindung beschrieben.
2 zeigt das zweite Ausführungsbeispiel des kollagenbeschichteten Trägers nach der Erfindung in einer Querschnittsansicht. In der folgenden Beschreibung des zweiten Ausführungsbeispiels des kollagenbeschichteten Trägers liegt der Schwerpunkt auf den Unterschieden, die zwischen dem ersten und dem zweiten Ausführungsbeispiel vorhanden sind. Übereinstimmende Aspekte werden nicht nochmals beschrieben.
Ein in 2 gezeigter kollagenbeschichteter Träger 1 nach zweitem Ausführungsbeispiel entspricht dem des ersten Ausführungsbeispiels, abgesehen davon, dass ein Grundmaterial 2 eine Matrix 4 und eine Oberflächenschicht 5 umfasst. Die Oberflächenschicht 5 besteht aus kalziumphosphatbasierten Verbindung und bedeckt die Oberfläche der Matrix 4.
Durch eine solche Struktur des Grundmaterials 2 ist es möglich, das Grundmaterial 2 in einer komplizierteren Form herzustellen und zugleich die Haftung zwischen der kalziumphosphatbasierten Verbindung (Oberflächenschicht 5) und der Deckschicht 3 aufrecht zu erhalten.
Als die Matrix 4 bildendes Material können verschiedene Keramikmaterialien und verschiedene Harzmaterialien verwendet werden. Beispiele für Keramikmaterialien sind neben den oben genannten kalziumphosphatbasierten Verbindungen Aluminiumoxid, Zirkonphosphat, Silikatglas und Kohlenstoffverbindungen.
Beispiele für Harzmaterialien sind verschiedene wärmehärtbare Harze und verschiedene thermoplastische Harze. Spezielle Beispiele für thermoplastische Harze sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyimid, Acrylharze und thermoplastisches Polyurethan. Spezielle Beispiele für wärmehärtbare Harze sind Epoxyharze, Phenolharze, Melaninharze, Harnstoffharze, ungesättigte Polyester, Alkydharze, wärmehärtbares Polyurethan und Ebonit. Diese Harze können allein oder in Kombination von zwei oder mehreren Harzen verwendet werden. Die vorstehend genannten Materialien werden häufig als Biomaterialien eingesetzt, da sie ein hohes Maß an Sicherheit für den lebenden Körper gewährleisten. Aus diesem Grunde sind diese Materialien geeignet, die Matrix 4 zu bilden.
Die Matrix 4 kann dicht ausgebildet sein. Vorzugsweise ist sie jedoch porös. Ist die Matrix 4 porös, so ist es der Oberflächenschicht 5 (die später beschrieben wird) leicht möglich, in die Poren der Oberfläche der Matrix 4 einzudringen, wodurch eine Verankerungswirkung erzielt wird. So kann die Haftfestigkeit zwischen der Matrix 4 und der Oberflächenschicht 5 erhöht werden, wodurch das Grundmaterial 2 stabiler wird.
Als kalziumphosphatbasierte Verbindung, die die Oberflächenschicht 5 bildet, können die oben genannten Verbindungen verwendet werden.
Die mittlere Dicke der Oberflächenschicht 5 unterliegt keiner besonderen Beschränkung. Vorzugsweise liegt sie jedoch in einem Bereich von etwa 0,1 bis 5 μm, noch besser in einem Bereich von etwa 0,5 bis 2 μm.
Die Oberfläche der Matrix 4 kann mit der aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung bestehenden Oberflächenschicht 5 beispielsweise nach einem Verfahren bedeckt werden, bei dem Teilchen, die jeweils aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung bestehen, mit der Oberfläche der Matrix 4 in Kollision gebracht werden. Durch dieses Verfahren ist es möglich, die Oberflächenschicht 5 einfach und zuverlässig auszubilden.
Im Hinblick darauf, es einer besonders großen Zahl an Zellen zu ermöglichen, an der Oberfläche des kollagenbeschichteten Trägers 1 zu haften und darauf zu wachsen, ist es von Vorteil, wenn das Grundmaterial 2 eine Struktur aufweist, bei der die gesamte Oberfläche der Matrix 4 mit einer kalziumphosphatbasierten Verbindung bedeckt ist. Jedoch ist die vorliegende Verbindung nicht auf eine solche Struktur beschränkt. So kann das Grundmaterial 2 auch eine Struktur aufweisen, bei der die Oberfläche der Matrix 4 nur zum Teil mit einer kalziumphosphatbasierten Verbindung bedeckt ist. In diesem Fall liegt der verbleibende Teil der Oberfläche 4 der Matrix 4 frei.
Sowohl der kollagenbeschichtete Träger 1 nach erstem Ausführungsbeispiel als auch der kollagenbeschichtete Träger 1 nach zweitem Ausführungsbeispiel sind geeignet, beispielsweise in der Zellkulturtechnologie eingesetzt zu werden, die auf verschiedenen Gebieten zur Anwendung kommt, z.B. in der Zellgewebetechnik, bei Tests von Arzneimitteln auf Sicherheit und bei der Herstellung von Proteinen zu Behandlungs- und Diagnosezwecken. Indem der kollagenbeschichtete Träger 1 nach der Erfindung in der Zellkulturtechnologie verwendet wird, ist ein noch effizienteres und zuverlässigeres Wachstum von zu kultivierenden Zellen möglich.
Der kollagenbeschichtete Träger 1 nach zweitem Ausführungsbeispiel ist insbesondere dann vorteilhaft einzusetzen, wenn bei der Zellkultivierung unter den verschiedenartigen Zellkultivierungstechniken eine Technik zur Anwendung kommt, die mit einer dreidimensionalen hochdichten Kultur (Suspensionskultur) arbeitet.
In diesem Fall haben die kollagenbeschichteten Träger 1 vorzugsweise eine granulare oder körnige Form, d.h. eine weitgehend kugelige Form. Die granularen Träger 1 können noch gleichmäßiger in einem Kulturmedium suspendiert werden, so dass sie entsprechend häufiger Gelegenheit haben, mit Zellen in Kontakt zu kommen. Dadurch können die Zellen noch effizienter an den kollagenbeschichteten Trägern 1 haften.
Die Größe des kollagenbeschichteten Trägers 1 unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Bezeichnet man die maximale Länge einer Zelle, die an dem Träger 1 haften soll, mit L1 (μm) und die Größe des Trägers mit L2 (μm), so liegt L2/L1 vorzugsweise in einem Bereich von etwa 2 bis 100, noch besser in einem Bereich von etwa 5 bis 50.
L2 liegt vorzugsweise in einem Bereich von etwa 10 bis 2000 μm, noch besser in einem Bereich von etwa 50 bis 1000 μm und im besten Fall in einem Bereich von etwa 100 bis 300 μm.
Indem die Größe des kollagenbeschichteten Trägers 1 auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, kann die Oberfläche des Trägers 1 bezogen auf die Größe der Zelle so groß gehalten werden, dass es den Zellen noch einfacher möglich ist, an dem kollagenbeschichteten Träger 1 zu haften und darauf zu wachsen.
Bei der dreidimensionalen hochdichten Zellkultivierung ist es erforderlich, die kollagenbeschichteten Träger 1 besonders gleichmäßig in einem Kulturmedium zu suspendieren. Die Dichte des jeweiligen kollagenbeschichteten Trägers 1 liegt deshalb vorzugsweise in der Nähe der Dichte von Wasser. Vorzugsweise liegt die Dichte des kollagenbeschichteten Trägers 1 in einem Bereich von etwa 1,01 bis 1,5 g/cm³, noch besser in einem Bereich von etwa 1,02 bis 1,2 g/cm³. Indem die Dichte des kollagenbeschichteten Trägers 1 auf einen Wert innerhalb des vorstehend genannten Bereichs eingestellt wird, können die Träger 1 noch gleichmäßiger in einem Kulturmedium suspendiert werden, so dass die Zellen noch effizienter an den Trägern 1 haften können. Die Dichte des Trägers 1 nach zweitem Ausführungsbeispiel kann eingestellt werden, indem beispielsweise Material und Form (z.B. porös oder hohl) der Matrix 4 geeignet gewählt werden. Unter den vorstehend erläuterten Gesichtspunkten ist der kollagenbeschichteten Trägers 1 nach zweitem Ausführungsbeispiel für eine dreidimensionale hochdichte Kultur besonders geeignet.
Form, Größe (z.B. mittlere Teilchengröße), physikalische Eigenschaften (z.B. Dichte) etc. des kollagenbeschichteten Trägers 1 können eingestellt werden, indem Form, Größe, physikalische Eigenschaften etc. des Grundmaterials 2 geeignet gewählt werden.
Andererseits kann der kollagenbeschichteten Trägers 1 auch als Gerüst (Knochenfüllmaterial) verwendet werden, der beispielsweise in eine Knochendefektstelle eingebracht wird, um es Knochenzellen (Osteoblaste) zu ermöglichen, auf ihm zu wachsen. Die kollagenbeschichteten Träger 1 und die darauf gewachsenen Osteoblaste ermöglichen eine besonders schnelle Reparatur und Regeneration des Knochendefektes.
Spezielle Beispiele für die in eine Knochendefektstelle einzubringenden kollagenbeschichteten Trägers 1 sind neben granularen Trägern solche mit einer Blockform wie Schädelplatten, Wirbelbogen-Abstandshalter, Halswirbel-Abstandshalter, künstliche Gehörknöchelchen und künstliche Zahnwurzeln.
Als Knochenfüllmaterial ist der kollagenbeschichteten Träger 1 nach dem ersten Ausführungsbeispiel vorzuziehen.
Der kollagenbeschichteten Trägers 1 kann beispielsweise auch als stationäres Phasenmaterial für die Chromatographie eingesetzt werden.
Der kollagenbeschichteten Träger 1 sowie das Verfahren zu dessen Herstellung sind nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt.
Beispielsweise kann das Verfahren zur Herstellung eines kollagenbeschichteten Trägers einen oder mehrere zusätzliche Schritte für einen beliebigen Zweck vorsehen, falls dies erforderlich ist.
Im Folgenden werden praktische Anwendungsbeispiele für die Erfindung beschrieben.
1. Herstellung des Zellkulturträgers
In jedem der folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in folgender Weise hergestellt
Beispiel 1

<1-1> Zunächst wurde Fibronektin (Protein mit einer hohen Affinität gegenüber Kollagen) dem Lösungsmittel PBS in einer Menge zugegeben, dass die Fibronektinkonzentration in dem PBS 5 μg/ml betrug. Die Substanzen wurden dann miteinander gemischt, um eine Fibronektinlösung (erste Behandlungsflüssigkeit) herzustellen. Der pH-Wert der Fibronektinlösung wurde auf 7,4 eingestellt.
<1-2> Dann wurde ein Kügelchen oder Pellet (Grundmaterial) Hydroxylapatit mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Dicke von 2 mm in 1,5 ml der Fibronektinlösung mit einer Temperatur von 37°C eingetaucht und 30 Minuten lang in der Fibronektinlösung gehalten, die gleichzeitig gerührt wurde. Anschließend wurde das Pellet aus der Fibronektinlösung genommen und mit PBS gewaschen.
<1-3> Anschließend wurde vom Schwein gewonnenes Kollagen vom Typ I dem Lösungsmittel PBS in einer Menge zugegeben, dass die Konzentration des Kollagens vom Typ I in dem PBS 100 μg/ml betrug. Die Substanzen wurden dann gemischt, um eine Kollagenlösung herzustellen (zweite Behandlungsflüssigkeit). Der pH-Wert der Kollagenlösung wurde auf 7,4 eingestellt.
<1-4> Dann wurde das in dem Schritt <1-2> erhaltene Pellet in 1,5 ml der Kollagenlösung eingetaucht, die auf 37°C eingestellt war, um das Kollagen ausreichend zu denaturieren. Das Pellet wurde 30 Minuten lang in der Kollagenlösung belassen, während die Kollagenlösung gerührt wurde.

Anschließend wurde das Pellet aus der Kollagenlösung genommen und dann mit PBS gewaschen, um so einen kollagenbeschichteten Träger (im Folgenden als Zellkulturträger bezeichnet) zu erhalten.
Die obigen Schritte <1-1> bis <1-4> wurden wiederholt durchgeführt, um schließlich zehn kollagenbeschichtete Träger zu erhalten.
Beispiel 2
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass anstelle von Hydroxylapatit Trikalziumphosphat als Grundmaterial verwendet wurde.
Beispiel 3
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass anstelle von Hydroxylapatit eine Mischung aus 50 Gew.-% Hydroxylapatit und 50 Gew.-% Trikalziumphosphat als Grundmaterial verwendet wurde.
Beispiel 4
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass als Grundmaterial anstelle eines Materials, das aus Hydroxylapatit besteht, ein Material verwendet wurde, das man durch Beschichten einer aus einem Polystyrolharz bestehenden Matrix mit einer aus Hydroxylapatit bestehenden Oberflächenschicht erhielt. Die mittlere Dicke der Deckschicht betrug 0,7 μm.
Beispiel 5
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon anstelle von Fibronektin Integrin als Protein verwendet wurde.
Beispiel 6
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass als Protein anstelle von Fibronektin eine Mischung verwendet wurde, die 50 Gew.-% Fibronektin und 50 Gew.-% Integrin enthielt.
Beispiel 7
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass als Kollagen anstelle das Kollagens vom Typ I ein Kollagen vom Typ II verwendet wurde.
Beispiel 8
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass als Kollagen anstelle des vom Schwein gewonnen Kollagens vom Typ I ein vom Lachs gewonnenes Kollagen vom Typ I verwendet wurde.
Beispiel 9
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Konzentration von Fibronektin in der in Schritt <1-1> hergestellten Fibronektinlösung auf 0,1 μg/ml geändert wurde.
Beispiel 10
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Konzentration von Fibronektin in der in Schritt <1-1> hergestellten Fibronektinlösung auf 100 μg/ml geändert wurde.
Beispiel 11
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Konzentration des Kollagens vom Typ I in der in der in Schritt <1-1> hergestellten Kollagenlösung auf 1 μg/ml geändert wurde.
Beispiel 12
Es wurden zehn kollagenbeschichtete Träger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Konzentration des Kollagens vom Typ I in der in der in Schritt <1-1> hergestellten Kollagenlösung auf 1000 μg/ml geändert wurde.
Beispiel 13

<13-1> Zunächst wurden Fibronektin (Protein mit einer hohen Affinität gegenüber Kollagen) und vom Schwein gewonnenes Kollagen vom Typ I dem Lösungsmittel PBS in einer Menge zugegeben, dass in dem PBS die Fibronektinkonzentration 5 μg/ml und die Konzentration des Kollagens vom Typ I 100 μg/ml betrug. Die Substanzen wurden dann gemischt, um eine Mischlösung herzustellen (Behandlungsflüssigkeit). Der pH-Wert dieser Mischlösung wurde auf 7,4 eingestellt.
<13-2> Dann wurde ein Kügelchen oder Pellet (Grundmaterial) Hydroxylapatit mit einem Durchmesser von 5 und einer Dicke von 2 mm in 1,5 ml der Mischlösung mit einer Temperatur von 37 °C eingetaucht und 30 Minuten lang in der Mischlösung gehalten, während diese gerührt wurde. Anschließend wurde das Pellet aus der Mischlösung genommen und mit PBS gewaschen. Die Schritte <13-1> und <13-2> wurden wiederholt durchgeführt, um schließlich 10 Kollagen beschichtete Träger herzustellen.

Vergleichsbeispiel 1
Es wurden zehn Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Schritte <1-1> und <1-2> weggelassen wurden und in Schritt <1-4> in unbehandeltes Pellet aus Hydroxylapatit verwendet wurde.
Vergleichsbeispiel 2
Es wurden zehn Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Schritte <1-3> und <1-4> weggelassen wurden.
Vergleichsbeispiel 3
Es wurden zehn unbehandelte Pellets aus Hydroxylapatit hergestellt und direkt als Zellkulturträger verwendet.
2. Bewertung
2.1 Bewertung des Kollagenadsorptionsvermögens
Es wurden fünf der zehn Zellkulturträger, die in jedem der Beispiele 1 bis 13 und in dem Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurden, mit PBS gewaschen. Das PBS wurde wiedergewonnen, um die Kollagenkonzentration in dem PBS durch Elektrophorese (SDS-PAGE) zu bewerten.
In jedem der Beispiele 1 bis 13 war die Kollagenkonzentration in dem PBS, mit dem die Zellkulturträger gewaschen worden waren, kleiner als in dem Vergleichsbeispiel 1.
Daraus lässt sich ableiten, dass in dem Beispiel 1 bis 13 das Kollagen der Zellkulturträger über das Protein fest an dem Grundmaterial adsorbiert war, so dass sich das Kollagen nicht so leicht von dem Grundmaterial löste, wenn die Zellkulturträger mit PBS gewaschen wurden.
Dagegen war in dem Vergleichsbeispiel 1 die Kollagenkonzentration in dem PBS, mit dem die Zellkulturträger gewaschen worden waren, hoch. Daraus lässt sich ableiten, dass in dem Vergleichsbeispiel 1 das Kollagen der Zellkulturträger nur schwach an dem Grundmaterial adsorbiert war, so dass sich das Kollagen beim Waschen mit PBS von dem Grundmaterial löste.
2.2 Bewertung des Zellwachstums
Es wurde eine Zellkultivierung unter Verwendung der verbleibenden fünf Zellkulturträger, die in dem der Beispiele 1 bis 13 und in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellt worden waren, in folgender Weise durchgeführt.

<2-1> Zunächst wurden normale Nabelschnurvenen-Endothelzellen (im Folgenden einfach als „HUV-EC-C-Zellen" bezeichnet) mit einem Verhältnis von 1,35 × 10⁵ Zellen pro Zellkulturträger angeimpft.
<2-2> Dann wurden die in Schritt <2-1> angeimpften HUV-EC-C-Zellen sieben Tage lang in einem MCDB131-Medium kultiviert, das 10 Gew.-% fötales Kälberserum enthielt.

Anschließend wurden die HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung der in jedem der Beispiele 1 bis 13 und der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 hergestellten Zellkulturträger kultiviert worden waren, mit Kristallviolett gefärbt und dann mittels eines Mikroskops betrachtet.
In den 3 bis 6 sind beispielhaft Bilder der HUV-EC-C-Zellen gezeigt, die unter Verwendung der in dem Beispiel 1 und in dem Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellten Zellkulturträger kultiviert wurden.
In den 3 bis 6 sind die HUV-EC-C-Zellen dunkler gefärbt. Aus 3 wird deutlich, dass die HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung der in Beispiel 1 hergestellten Zellkulturträger kultiviert wurden, an den Zellkulturträgern adsorbiert waren und die Zahl an gewachsenen Zellen größer als in den in den 4 bis 6 gezeigten Fällen war. Aus den 4 bis 6 wird deutlich, dass die Zahl an HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung der in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellten Zellkulturträger kultiviert worden waren, kleiner als in dem in 3 gezeigten Fall war.
Anschließend wurden die HUV-EC-C-Zellen, die unter Verwendung der in jedem der Beispiele 1 bis 13 und der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 hergestellten Zellkulturträger kultiviert worden waren, mittels eines Mikroskops betrachtet, um die Zahl an Zellen pro Flächeneinheit auf der Oberfläche jedes Zellkulturträger zu bestimmen.
Die Zahl an Zellen wurde durch Mittelung der für die fünf Kulturträger ermittelten Zahlen bestimmt und in Form eines relativen Verhältnisses des so erhaltenen Mittelwertes zu dem Mittelwert des Vergleichsbeispiels 3 ausgedrückt (das relative Verhältnis des Vergleichsbeispiels 3 wurde als 1,0 definiert). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, betrug die Zahl an Zellen, die unter Verwendung der in dem Beispiel 1 hergestellten Zellkulturträger kultiviert worden waren, etwa das 1,4- bis 2,5-fache der für jedes der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 ermittelten Zahl. Die Zahl an Zellen, die unter Verwendung der in jedem der Beispiele 2 bis 13 hergestellten Zellkulturträger kultiviert worden waren, betrug das 1,2- bis 2,6-fache der für jedes der Vergleichsbeispiele 1 bis 3 ermittelten Zahl.
Aus diesem Ergebnis lässt sich ableiten, dass die in jedem der Beispiele 1 bis 3 hergestellten kollagenbeschichteten Träger die HUV-EC-C-Zellen fest adsorbierten, so dass sich diese Zellen nicht von den Trägern lösten. Dadurch wurde das Zellwachstum befördert.
Wie oben beschrieben, wies dagegen der in dem Vergleichsbeispiel 1 hergestellte Zellkulturträger kein Protein mit einer hohen Affinität gegenüber Kollagen auf, während der in dem Vergleichsbeispiel 2 hergestellte Zellkulturträger kein Kollagen aufwies und der in dem Vergleichsbeispiel 3 hergestellte Zellkulturträger ein unbehandelter Träger aus Hydroxylapatit war. Daraus kann geschlossen werden, dass sich die HUV-EC-C-Zellen von den in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellten Zellkulturträgern in Folge ihrer schwachen Adsorption an dem Träger leicht lösten, so dass die Träger nicht in ausreichendem Maße wachsen konnten.
3. Knochenfüllmaterial-Implantationstest (künstlicher Knochen)
Zunächst wurden Knochenfüllmaterialien in gleicher Weise wie in den Beispielen 1 bis 13 bzw. in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellt, abgesehen davon, dass jeweils als Grundmaterial ein Kügelchen oder Pellet mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Dicke (Länge) von 10 mm verwendet wurde.
Anschließend wurden japanische weiße Haushasen bereitgestellt. In den Oberschenkelgelenkknorren jedes dieser Hasen wurde dann ein Loch mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Tiefe von 10,5 mm gebohrt. Diese Löcher wurden dann mit den in den Beispielen 1 bis 13 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellten Knochenfüllmaterialien gefüllt.
Nach sechs Wochen wurden die Hasen getötet. Bei jedem der Hasen wurde die Stelle in dem Oberschenkelgelenkknorren, die mit dem Knochenfüllmaterial gefüllt war, HE-gefärbt und dann mittels eines Mikroskops betrachtet.
Es stellte sich heraus, dass in den Knochendefektstellen, die mit den in den Beispielen 1 bis 13 hergestellten Knochenfüllmaterialen gefüllt waren, das regenerierte Knochengewebe und das jeweilige Knochenfüllmaterial trotz der vergleichsweise kurzen Zeit seit der Implantation, nämlich sechs Wochen, gleichsam miteinander verschmolzen waren. Dieses Ergebnis zeigt, dass die in den Beispielen 1 bis 13 hergestellten Knochenfüllmaterialien ihre Funktion ausreichend erfüllten.
Dagegen war in den Knochendefektstellen, die mit den in den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellten Knochenfüllmaterialien gefüllt worden waren, zwischen dem jeweiligen Knochenfüllmaterial und dem neuen Knochengewebe deutlich eine Grenzschicht zu erkennen. Dieses Ergebnis zeigt, dass das neue Knochengewebe und das Knochenfüllmaterial nur schlecht miteinander verschmolzen waren.

Claims

Kollagenbeschichteter Träger (1), umfassend ein Trägermaterial (2) mit einer Oberfläche, die zumindest zu einem Teil aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Teil der Oberfläche des Trägermaterials (2) über ein Protein, das eine hohe Affinität gegenüber einem Kollagen aufweist, mit dem Kollagen beschichtet ist.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein einen Kollagenrezeptor aufweist.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein zumindest eine der Substanzen Fibronektin und Integrin als Hauptbestandteil enthält.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen ein Kollagen vom Typ I als Hauptbestandteil enthält.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen von einem Landtier gewonnen ist.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil des Kollagens denaturiert ist.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Kollagen in einem Lösungsmittel lösbar ist, das einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0 bei einem Verhältnis von mindestens 100 μg pro Milliliter Lösungsmittel hat.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (2) eine Matrix (4) umfasst, deren Oberfläche mit der kalziumphosphatbasierten Verbindung beschichtet ist.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (2) die Form eines Körnchens, eines Pellets, eines Blocks oder eines Blattes hat.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die kalziumphosphatbasierte Verbindung mindestens eine der Substanzen Trikalziumphosphat und Hydroxylapatit als Hauptbestandteil enthält.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er zur Verwendung in der Zellkultivierung bestimmt ist.
Kollagenbeschichteter Träger (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass er zur Verwendung als Füllmaterial beim Füllen einer Knochendefektstelle bestimmt ist.
Verfahren zum Herstellen eines kollagenbeschichteten Trägers (1), mit folgenden Schritten: Bereitstellen eines Trägermaterials (2), dessen Oberfläche zumindest zu einem Teil aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht; und Inkontaktbringen des Trägermaterials (2) mit einem Kollagen und einem Protein, das eine hohe Affinität gegenüber dem Kollagen aufweist, um den genannten Teil der Oberfläche des Trägermaterials (2) über das Protein mit dem Kollagen zu beschichten.
Verfahren zum Herstellen eines kollagenbeschichteten Trägers (1) mit folgenden Schritten: Bereitstellen eines Trägermaterials (2), dessen Oberfläche zumindest zu einem Teil aus einer kalziumphosphatbasierten Verbindung besteht. Inkontaktbringen des Trägermaterials (2) mit einer ersten Behandlungsflüssigkeit, die ein Protein enthält, das eine hohe Affinität gegenüber Kollagen aufweist, um es dem Protein zu ermöglichen, an dem genannten Teil der Oberfläche des Trägermaterials (2) zu haften; und Inkontaktbringen des Trägermaterials (2) mit einer zweiten Behandlungsflüssigkeit, die das Kollagen enthält, um den genannten Teil der Oberfläche des Trägermaterials (2) über das Protein mit dem Kollagen zu beschichten.
Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Proteinkonzentration in der ersten Behandlungsflüssigkeit 0,1 bis 100 μg/ml beträgt.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der ersten Behandlungsflüssigkeit 4 bis 39 °C beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, bei dem die Zeit, während der das Trägermaterial (2) in Kontakt mit der ersten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, 10 Minuten bis 10 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, bei dem der pH-Wert der ersten Behandlungsflüssigkeit 6,0 bis 8,0 beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, bei dem die Kollagenkonzentration in der zweiten Behandlungsflüssigkeit 1 bis 100 μg/ml beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19, bei dem die Temperatur der zweiten Behandlungsflüssigkeit 4 bis 39°C beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, bei dem die Zeit, während das Trägermaterial (2) in Kontakt mit der zweiten Behandlungsflüssigkeit gehalten wird, 10 Minuten bis 10 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21 bei dem der pH-Wert der zweiten Behandlungsflüssigkeit 6,0 bis 8,0 beträgt.