CN114344569B - 一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物及其制备方法。本发明所述制备方法包括如下步骤：(1)不同浓度胶原蛋白液的制备；(2)变性胶原制备；(3)筛选生物陶瓷；(4)真空灌注；(5)透析胶原蛋白液的制备；(6)混合物料的制备；(7)灌装冻干；(8)真空干燥。本发明所制备的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物既具有多孔结构及良好的机械性能，又促进了多孔骨植入物的生物活性、降解性和生物相容性，在生物医用材料骨组织工程领域具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物以用材料骨组织工程技术领域，尤其涉及一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物及其制备方法。
背景技术
我国作为人口大国，随着人口老龄化的进程，每年因肿瘤切除、感染、外伤及先天性疾病等造成的骨缺损患者日益增多。对于机体来说，若骨缺损较小可以通过骨组织再生进行自我修复，而上述原因造成的骨缺损一般较大，则需要借助骨移植或者骨替代材料的植入来修复。
理想的骨修复材料应具备如下生化性能：良好的生物相容性，可避免植入物在机体内产生炎症或毒性反应；良好的骨诱导性，可诱导间充质细胞分化以此激发骨的生成；良好的骨传导性，可诱导骨组织在其表面或内部附着生长；可降解性，可为新生骨的爬行提供营养与位置；三维多孔性，连通的微孔结构便于营养物的输入和代谢产物的输出，高孔隙率便于细胞的黏附生长、血管和神经的长入；力学性能，可为新生组织提供支撑；其他，如易于加工、消毒、贮存等。
目前骨修复材料种类繁多，但从单一的无机或有机材料来看，均无法同时满足植入材料的所有要求，因此，通过特定工艺将有机和无机材料复合，制备出可以发挥综合优势的复合骨修复材料成为现今的研究热点和发展趋势。无机材料中以羟基磷灰石、磷酸三钙为代表的生物陶瓷因与骨的化学成分相近，又可成为骨组织再生阶段的钙磷离子供应源，而成为广泛应用的骨组织替代材料。单就羟基磷灰石与磷酸三钙而言，两者物理、化学性能、生物相容性等均相似，在临床上多以颗粒或小块形式用于骨缺损的修复填充，但也存在诸多问题，如植骨时能否完全匹配骨缺损处形状，能否避免颗粒或小块状生物陶瓷被体液或血液循环时带走，植骨效果能否有所提升。有机材料中胶原蛋白即为骨有机质的主要成分，具有止血、促进组织愈合、促进骨的矿化等作用，但也存在一些问题，如植骨后降解过快导致骨缺损再现，材料强度太差不能应用于承重部位的骨缺损等。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物及其制备方法。本发明从仿生学的角度出发，选取羟基磷灰石、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙中一种或至少两种的组合和胶原蛋白进行复合，模拟骨组织的无机和有机成分，以期综合两者的优势获得更优质的骨修复材料。
本发明的一个目的在于：提供一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，该骨植入物结合具备三螺旋结构的胶原蛋白和高孔隙率、连通率的生物陶瓷颗粒这两种骨材料的优势，能够保证并提升骨植入物的生物活性、降解性和生物相容性，加快骨缺损的修复。
本发明的另一个目的在于：提供一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)不同浓度胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白溶于水分别配制低浓度胶原蛋白液和高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原蛋白液的制备：取步骤(1)制备的低浓度胶原蛋白液热反应后，离心取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷；将生物陶瓷颗粒过筛得到筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷混合，第一次抽真空后，恢复常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，加入步骤(1)制备的低浓度胶原蛋白液，第二次抽真空后，恢复常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次加入步骤(1)制备的高浓度胶原蛋白液，第三次抽真空后，恢复常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：配制胶原蛋白液，将胶原蛋白液经紫外线照射后，搅拌均匀，离心收集沉淀，加水配制透析液进行透析，即得透析胶原蛋白液，备用；
(6)混合物料的制备：配制胶原蛋白液，将配制的胶原蛋白液与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液混合得到混合胶原蛋白液，加入步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，冻干得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品进行真空干燥，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
进一步地，在步骤(1)中，所述胶原蛋白为具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品；所述低浓度胶原蛋白液中胶原蛋白的质量浓度为2.5～5.0mg/g；
进一步地，所述胶原蛋白溶于水时的溶解温度为10～15℃；控制溶解温度的目的是便于保证天然胶原蛋白的三螺旋结构。
所述高浓度胶原蛋白液中胶原蛋白的质量浓度为7.0～12.0mg/g。
进一步地，步骤(2)中，所述热反应的温度为105～115℃，时间为1～2h；所述离心的速度为4000～5000r/min，时间为10～15min。
进一步地，步骤(3)中，所述生物陶瓷为羟基磷灰石、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙中的一种或多种；所述生物陶瓷为多孔型，气孔率为65％～75％，粒径为0.4～5.0mm；所述筛的目数为4～35目。
进一步地，步骤(4)中，所述步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60～140：100；所述第一次抽真空的具体过程为：首先设定真空交联箱的温度为30～35℃，真空度≥-15Kpa，持续真空负压维持3～4h；所述低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的干物质质量比为60～140：100；所述第二次抽真空的具体过程为：真空交联箱温度维持30～35℃，真空度≥-15Kpa，持续真空负压维持3～4h，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至真空度≥-15Kpa，并升温至40～45℃，保温1～2h后，真空交联箱继续升温至105～115℃，负压维持16～24h；所述高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60～140：100；所述第三次抽真空的具体过程为：真空交联箱温度维持30～35℃，真空度≥-15Kpa，持续真空负压维持4～6h，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至真空度≥-15Kpa，并升温至40～45℃，保温1～2h后，真空交联箱继续升温至105～115℃，负压维持16～24h。
步骤(4)中，第一次添加步骤(2)中变性胶原，以便于抽真空时变性胶原通过生物陶瓷孔洞进入内腔，干燥后铺展在生物陶瓷内壁上，且未堵塞生物陶瓷多孔结构；所述第二次添加步骤(1)中低浓度胶原蛋白液，以便于抽真空时胶原蛋白在生物陶瓷颗粒表面分散和部分通过生物陶瓷孔洞伸入内腔，高温热处理后便于生物陶瓷颗粒表面胶原蛋白交联且与内腔胶原紧密结合；所述第三次添加步骤(1)中高浓度胶原蛋白液，以便于抽真空时胶原蛋白在生物陶瓷颗粒表面分散，且未堵塞生物陶瓷多孔结构，高温热处理后便于加固生物陶瓷颗粒表面的胶原蛋白交联层。
进一步地，步骤(5)中，所述胶原蛋白液是将胶原蛋白冻干品溶于水中，在10～15℃下搅拌得到，所述胶原蛋白液的质量浓度为2.0～5.0mg/g的胶原蛋白液，然后用0.1M氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0；所述紫外线的波长为254nm；所述紫外线照射的距离为30～50cm，时间为12～16h，温度为30～35℃；所述离心的速度为4000～5000r/min，时间为10～15min；所述透析液的具体制备方法为：按每升2.0～5.0mg/g胶原蛋白原液所得沉淀添加蒸馏水至10.0～20.0mg/g，搅拌均匀；所述透析袋的截留分子量≥3500Da
进一步地，步骤(5)中，所述透析的具体过程为：将透析液装入透析袋，两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量10～12倍体积量的蒸馏水，维持温度为10～15℃，透析48～72h，中间换水8～12次。
步骤(5)中，胶原蛋白液溶解过程调节pH值是为了使胶原蛋白液接近胶原蛋白的等电点，以便于后续紫外照射效果的提升；透析过程是为了便于胶原蛋白液达到适宜浓度，且随着钠离子的跑出，使得胶原纤维重新融入液体中；胶原蛋白液经紫外照射处理后变为均匀的白色固化物，以便于胶原蛋白自组装成胶原纤维，增强胶原蛋白的韧性。
进一步地，步骤(6)中，所述胶原蛋白液是将胶原蛋白冻干品溶于水中，在10～15℃下搅拌得到，所述胶原蛋白液的质量浓度为10.0～20.0mg/g的胶原蛋白液；所述胶原蛋白液与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液质量比为1:1～2:1；所述混合胶原蛋白液中胶原蛋白的质量浓度为10.0～20.0mg/g；所述混合胶原蛋白液与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料混合的干物质质量比为1:4～1:14。
进一步地，步骤(7)中，所述冻干的具体过程为：首先冻干机板温预冻至-40～-30℃，保持2～4h；然后将板温升至0～10℃，保持2～4h；继续加热板温至20～30℃，保持8～10h。预冻阶段迅速降温，以避免冻干品内形成大块冰晶，保证冻干品的的细腻度；升华阶段分两次升华，以便于保证生物陶瓷颗粒间胶原网状结构的网孔均匀度。
进一步地，步骤(8)中，所述真空干燥的具体过程为：首先设定真空干燥箱的温度为60～70℃，真空度≥-30Kpa，维持1～2h；然后升温至105～115℃，负压维持36～48h。初次升温是为了便于表观水分散失，实现初次脱水交联；所述再次升温，以便于胶原蛋白间进行热交联。
一种上述制备方法制备的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
本发明从仿生学的角度出发，将生物陶瓷与胶原蛋白两种骨修复材料结合起来，在保留生物陶瓷多孔结构的条件下，使胶原蛋白在生物陶瓷颗粒间形成三维网状结构，从而提升骨缺损处的修复能力。胶原蛋白的引入还使得多孔骨植入物具备塑形能力，提升材料与骨缺损处形状的匹配度，而生物陶瓷经真空灌注处理后，使生物陶瓷颗粒与胶原蛋白紧密结合，避免生物陶瓷颗粒在骨缺损处被体液或血液带走引发炎症反应；生物陶瓷的加入还可避免骨缺损再现，同时部分胶原蛋白液经紫外照射处理及多孔骨植入物经交联处理后，提升了胶原蛋白的韧性，也延长了胶原蛋白的降解时间，此外生物陶瓷也可增强多孔骨植入物的强度，使其能够应用于一定承重部位的骨缺损。
本发明有益的技术效果在于：
1.本发明提供了一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，基于仿生学的角度，选用具有三螺旋结构的天然胶原蛋白和高孔隙率、连通率的生物陶瓷颗粒，综合这两种骨修复材料的优势，既保证了多孔骨植入物的强度和多孔结构，又促进了多孔骨植入物的生物活性、降解性和生物相容性，在生物医用材料骨组织工程领域具有巨大的应用前景，尤其是骨组织缺损不易自我修复的情况下，多孔骨植入物可为骨细胞攀生、血管或神经长入提供三维结构，也可在降解过程为细胞生长提供营养，从而促进骨组织的再生修复。
2.本发明提供的一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，通过调整胶原蛋白液和生物陶瓷颗粒的干物质质量比，可以获得不同机械强度和降解速率的骨植入物，即本发明可依据骨缺损大小和部位来选择不同配比的多孔骨植入物。
3.本发明提供的一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的制备方法，将生物陶瓷颗粒真空灌注，胶原蛋白液紫外照射，冻干多孔骨植入物热交联处理等，均为物理处理方式，保证了多孔骨植入物的清洁安全。其中通过三次抽真空稳固了胶原蛋白在生物陶瓷颗粒表面形成交联层，且通过冻干与颗粒间胶原蛋白结合，未堵塞生物陶瓷颗粒的多孔结构，保证了其良好的骨传导性、骨诱导性和促血管化能力，也避免了多孔植入物在骨缺损处被体液或血液循环带走导致炎症反应。而紫外照射提高了胶原蛋白的纤维化，与未经处理的胶原蛋白液混合，在保证了胶原蛋白的生物活性的同时，提升了胶原蛋白的韧性，再与灌注后生物陶瓷颗粒混合冻干，在生物陶瓷颗粒间形成均匀的珊瑚状三维网络结构，便于多孔植入物根据骨缺损处形状进行裁剪，提高与缺损处的匹配度，且少有生物陶瓷颗粒脱落；再经交联处理提高了胶原蛋白的交联度，形成了具有一定韧性、弹性和强度的可塑形的骨修复材料，使得多孔骨植入物可浸润塑形成相应形状，且能够用于一定承重部位的骨缺损。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的实物图。
图中：A、多孔骨植入物干品的实物图；B、多孔骨植入物经生理盐水浸润后的实物图；C、多孔骨植入物塑形后的实物图；D、多孔骨植入物回弹恢复原状的实物图。
图2为本发明的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的制备流程图。
图3为本发明实施例1制备的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的光学显微镜照片。
图中：A、生物陶瓷颗粒的光学显微镜×4照片；B、生物陶瓷颗粒真空灌注后内腔的光学显微镜×4照片；C、生物陶瓷颗粒真空灌注后表面的光学显微镜×4照片；D、透析胶原蛋白液的光学显微镜×4照片；E、多孔骨植入物内生物陶瓷颗粒的光学显微镜×4照片；F、多孔骨植入物内胶原蛋白光学显微镜×4照片。
图4为本发明实施例1的生物陶瓷颗粒经步骤(4)真空灌注处理后的SEM图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤(图2为本发明的制备流程图)：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为10℃，分别得到200mL的2.5mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的7.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的2.5mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至105℃，热反应1h后，4000r/min离心10min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为65％的多孔β-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过28目，35目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为0.4～0.6mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比60:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的2.5mg/g低浓度胶原蛋白液混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持30℃，持续真空负压维持3h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的7.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60:100，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持4h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到2.0mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.5，放置在距离波长254nm的紫外线灯30cm处，照射处理12h，温度维持30℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，4000r/min离心10min收集沉淀，按照每升2.0mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至10.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量10倍体积量的蒸馏水，维持温度10℃，透析48h，中间换水8次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在10℃下搅拌至完全溶解，得到10.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比1:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为10.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:4混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-40℃，保持4h，一次升华设置10℃，保持4h，二次升华设置30℃，保持10h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度70℃，真空度-30Kpa，维持2h，然后逐渐升温至115℃，负压维持48h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
图1为本实施例的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的实物图。
图中：A、多孔骨植入物干品的实物图；B、多孔骨植入物经生理盐水浸润后的实物图；C、多孔骨植入物塑形后的实物图；D、多孔骨植入物回弹恢复原状的实物图。
由图1A可知生物陶瓷颗粒在多孔骨植入物内均匀分散；由图1B可知将多孔骨植入物放入生理盐水中浸润，待多孔骨植入物完全吸满生理盐水后，骨植入物尺寸未发生明显变化；由图1C可知浸润后的多孔骨植入物可揉捏成特定形状，在揉捏时基本无陶瓷颗粒脱落；由图1D可知将揉捏后的多孔骨植入物再次放入生理盐水中，可回弹至原状。
图3为本实施例的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的光学显微镜照片。
图中：A、生物陶瓷颗粒的光学显微镜×4照片；B、生物陶瓷颗粒真空灌注后内腔的光学显微镜×4照片；C、生物陶瓷颗粒真空灌注后表面的光学显微镜×4照片；D、透析胶原蛋白液的光学显微镜×4照片；E、多孔植入物内生物陶瓷颗粒的光学显微镜×4照片；F、多孔骨植入物内胶原蛋白光学显微镜×4照片。
由图3A可知生物陶瓷颗粒未经真空灌注处理时内腔光滑；由图3B、3C可知生物陶瓷颗粒经真空灌注处理后内腔有胶原铺展，外表面有胶原存在，且未堵塞陶瓷多孔结构；由图3D可知胶原蛋白液经紫外照射处理后形成胶原纤维；由图3E可知陶瓷颗粒间通过胶原三维网状结构结合；由图3F可知陶瓷颗粒间形成均匀的珊瑚状三维网络结构。
图4为本实施例的生物陶瓷颗粒经步骤(4)真空灌注处理后的SEM图。
由图4可知生物陶瓷颗粒经真空灌注处理后表面有胶原蛋白覆盖，且粘连一些陶瓷碎片。
实施例2：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为10℃，分别得到200mL的低浓度3.0mg/g胶原蛋白液和100mL的8.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的3.0mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至105℃，热反应1h后，4000r/min离心10min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为65％的多孔α-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过18目，30目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为0.5～0.9mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比80:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的3.0mg/g低浓度胶原蛋白液，混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为80：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持30℃，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1.5h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的8.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为80:100，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1.5h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到2.5mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.5，放置在距离波长254nm的紫外线灯30cm处，照射处理12h，温度维持30℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，4000r/min离心10min收集沉淀，按照每升2.5mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至12.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量10倍体积量的蒸馏水，维持温度10℃，透析48h，中间换水8次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在10℃下搅拌至完全溶解，得到12.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比1:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为12.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:4混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-40℃，保持4h，一次升华设置10℃，保持4h，二次升华设置30℃，保持10h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度70℃，真空度-30Kpa，维持2h，然后逐渐升温至115℃，负压维持48h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
实施例3：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为12℃，分别得到200mL的3.5mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的9.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的3.5mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至110℃，热反应1.5h后，4500r/min离心10min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为70％的多孔羟基磷灰石生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过14目，24目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为0.7～1.2mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比80:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度32℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的3.5mg/g低浓度胶原蛋白液，混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为80：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持32℃，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至42℃，维持1.5h后，交联箱升温至110℃，负压维持18h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的9.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为80:100，设置交联箱温度32℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至42℃，维持1.5h后，交联箱升温至110℃，负压维持18h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到3.0mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.7，放置在距离波长254nm的紫外线灯35cm处，照射处理14h，温度维持32℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，4500r/min离心10min收集沉淀，按照每升3.0mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至14.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量11倍体积量的蒸馏水，维持温度12℃，透析52h，中间换水8次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在12℃下搅拌至完全溶解，得到14.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比1.5:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为14.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:6混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-35℃，保持3h，一次升华设置5℃，保持3h，二次升华设置30℃，保持9h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度65℃，真空度-30Kpa，维持2h，然后逐渐升温至110℃，负压维持48h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
实施例4：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为12℃，分别得到200mL的4.0mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的10.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的4.0mg/g胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至110℃，热反应1.5h后，4500r/min离心10min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为70％的多孔羟基磷灰石、β-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过8目，16目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为1.0～2.4mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比100:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度32℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的4.0mg/g低浓度胶原蛋白液，混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为100：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持32℃，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至42℃，维持1.5h后，交联箱升温至110℃，负压维持18h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的10.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为100:100，设置交联箱温度32℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至42℃，维持1.5h后，交联箱升温至110℃，负压维持18h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到3.5mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.7，放置在距离波长254nm的紫外线灯35cm处，照射处理14h，温度维持32℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，4500r/min离心10min收集沉淀，按照每升3.5mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至16.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量11倍体积量的蒸馏水，维持温度12℃，透析58h，中间换水9次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在12℃下搅拌至完全溶解，得到16.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比1.5:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为16.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:8混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-35℃，保持3h，一次升华设置5℃，保持3h，二次升华设置25℃，保持9h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度65℃，真空度-30Kpa，维持1.5h，然后逐渐升温至110℃，负压维持42h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
实施例5：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为15℃，分别得到200mL的4.5mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的11.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的4.5mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至115℃，热反应1.5h后，4500r/min离心12min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为70％的多孔羟基磷灰石、α-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过6目，12目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为1.4～3.3mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比120:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度35℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的4.5mg/g低浓度胶原蛋白液，混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为120：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持35℃，持续真空负压维持3.5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至45℃，维持1.5h后，交联箱升温至115℃，负压维持20h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的11.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为120:100，设置交联箱温度35℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至45℃，维持1.5h后，交联箱升温至115℃，负压维持20h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到4.0mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至7.7，放置在距离波长254nm的紫外线灯35cm处，照射处理16h，温度维持35℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，4500r/min离心12min收集沉淀，按照每升4.0mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至18.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量12倍体积量的蒸馏水，维持温度15℃，透析64h，中间换水10次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在15℃下搅拌至完全溶解，得到18.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比2:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为18.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:10混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-35℃，保持3h，一次升华设置5℃，保持3h，二次升华设置25℃，保持9h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度65℃，真空度-30Kpa，维持1.5h，然后逐渐升温至110℃，负压维持42h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
实施例6：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为15℃，分别得到200mL的4.5mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的12.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的4.5mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至115℃，热反应2h后，4500r/min离心15min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为75％的多孔β-磷酸三钙、α-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过5目，10目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为1.7～4.0mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比120:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度35℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持4h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的4.5mg/g低浓度胶原蛋白液，混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为120：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持35℃，持续真空负压维持4h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至45℃，维持2h后，交联箱升温至115℃，负压维持20h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的12.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为120:100，设置交联箱温度35℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持5h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至45℃，维持2h后，交联箱升温至115℃，负压维持20h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到4.0mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至8.0，放置在距离波长254nm的紫外线灯45cm处，照射处理16h，温度维持35℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，4500r/min离心15min收集沉淀，按照每升4.0mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至18.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量12倍体积量的蒸馏水，维持温度15℃，透析64h，中间换水10次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在15℃下搅拌至完全溶解，得到18.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比2:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为18.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:12混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-30℃，保持2h，一次升华设置0℃，保持2h，二次升华设置20℃，保持8h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度60℃，真空度-30Kpa，维持1h，然后逐渐升温至105℃，负压维持36h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
实施例7：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为15℃，分别得到200mL的5.0mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的12.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的5.0mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至115℃，热反应2h后，5000r/min离心15min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为75％的多孔羟基磷灰石、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过4目，8目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为2.4～5.0mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比140:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度35℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持4h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的5.0mg/g低浓度胶原蛋白液，混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为140：100；继续抽真空至-15Kpa，温度维持35℃，持续真空负压维持4h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至45℃，维持2h后，交联箱升温至115℃，负压维持24h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的12.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为140:100，设置交联箱温度35℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持6h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至45℃，维持2h后，交联箱升温至115℃，负压维持24h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中得到5.0mg/g胶原蛋白液，且使用0.1M氢氧化钠溶液调节pH至8.0，放置在距离波长254nm的紫外线灯50cm处，照射处理16h，温度维持35℃，待胶原蛋白液变为均匀的白色固化物，搅拌均匀，5000r/min离心15min收集沉淀，按照每升5.0mg/g胶原蛋白液所得沉淀添加蒸馏水至20.0mg/g，搅拌均匀，装入透析袋两端夹紧，放入透析水箱，并加入灌装量12倍体积量的蒸馏水，维持温度15℃，透析72h，中间换水12次，直至胶原完全透明，取出透析胶原蛋白液备用；
(6)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在15℃下搅拌至完全溶解，得到20.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液按照质量比2:1混合得到混合胶原蛋白液，控制混合胶原蛋白液浓度为20.0mg/g，搅拌均匀后，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:14混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-30℃，保持2h，一次升华设置0℃，保持2h，二次升华设置20℃，保持8h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度60℃，真空度-30Kpa，维持1h，然后逐渐升温至105℃，负压维持36h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
对比例1：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为10℃，得到100mL的2.5mg/g胶原蛋白液；
(2)筛选生物陶瓷：取孔隙率为65％的多孔β-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过28目，35目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为0.4～0.6mm的作为筛选的生物陶瓷；
(3)真空灌注：将步骤(1)制备的胶原蛋白液与步骤(2)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比60:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(4)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在10℃下搅拌至完全溶解，得到10.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(3)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:4混合，得到混合料液；
(5)灌装冻干：将步骤(4)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-40℃，保持4h，一次升华设置10℃，保持4h，二次升华设置30℃，保持10h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(6)真空干燥：将步骤(5)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度70℃，真空度-30Kpa，维持2h，然后逐渐升温至115℃，负压维持48h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
本对比例制备的多孔骨植入材料与实施例1制备的相比，浸润后揉捏时有更多的陶瓷颗粒脱落，韧性也不足，塑形时多孔骨植入物发生断裂。
对比例2：
一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，其制备方法包括如下步骤：
(1)胶原蛋白液制备：将具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，溶解温度为10℃，分别得到200mL的2.5mg/g低浓度胶原蛋白液和100mL的7.0mg/g高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原制备：将步骤(1)中100mL的2.5mg/g低浓度胶原蛋白液置于烘箱内，设置温度至105℃，热反应1h后，4000r/min离心10min取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：取孔隙率为65％的多孔β-磷酸三钙生物陶瓷，用不锈钢标准筛筛取过28目，35目截留的生物陶瓷颗粒，粒径为0.4～0.6mm的作为筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的100g生物陶瓷颗粒按照质量比60:100混合后，置于真空交联箱，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持3h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的2.5mg/g低浓度胶原蛋白液混合均匀，低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60：100，继续抽真空至-15Kpa，温度维持30℃，持续真空负压维持3h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压；向生物陶瓷中加入步骤(1)制备的7.0mg/g高浓度胶原蛋白液，混合均匀，高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60:100，设置交联箱温度30℃，真空度-15Kpa，持续真空负压维持4h后，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至-15Kpa，并逐渐升温至40℃，维持1h后，交联箱升温至105℃，负压维持16h，恢复至常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)混合物料的制备：将胶原蛋白冻干品溶于蒸馏水中，在10℃下搅拌至完全溶解，得到10.0mg/g胶原蛋白液，与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料按照干物质质量比1:4混合，得到混合料液；
(6)灌装冻干：将步骤(5)制备的混合料液倒入模具，放入冻干机，预冻设置-40℃，保持4h，一次升华设置10℃，保持4h，二次升华设置30℃，保持10h，得到多孔骨植入物的冻干品；
(7)真空干燥：将步骤(6)制备的冻干品放入真空干燥箱，设置温度70℃，真空度-30Kpa，维持2h，然后逐渐升温至115℃，负压维持48h，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
本对比例1-2制备的多孔骨植入材料与实施例1制备的相比，韧性不足，浸润后揉捏塑形时多孔骨植入物发生断裂。
综上所述，本发明提供了一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物，基于仿生学的角度，选用有机质胶原蛋白和无机质生物陶瓷颗粒，使得多孔骨植入物具有较好的生物相容性和生物活性。本发明经真空灌注、紫外照射、混到、冻干、真空干燥后，一部分胶原蛋白在生物陶瓷颗粒表面形成交联层，一部分胶原蛋白在生物陶瓷颗粒间形成三维纤维网状结构，且不堵塞生物陶瓷颗粒孔隙，便于骨细胞的攀生，及血管、神经的长入，也利于多孔骨植入物的裁剪或浸润塑形。
本发明将生物陶瓷经三次真空灌注处理后，使得生物陶瓷颗粒内腔铺展部分变性胶原，表面包裹两层胶原蛋白交联层，延长了胶原蛋白的降解时间，且未堵塞生物陶瓷颗粒的多孔结构，较好的保留了生物陶瓷的三维多孔性，同时也便于生物陶瓷颗粒间通过胶原蛋白的三维网状结构紧密结合，避免了生物陶瓷颗粒在植入骨缺损前裁剪或浸润塑形时脱落；本发明所述方法将部分胶原蛋白液经紫外照射处理后，使得胶原纤维形成，利于多孔骨植入物中胶原蛋白的韧性提高，也便于骨植入物的塑形；本发明所述方法将胶原蛋白和生物陶瓷的混合物料经冻干处理后，使得胶原蛋白在生物陶瓷颗粒间形成均匀的三维胶原纤维网状结构，并成为支架结构支撑生物陶瓷颗粒均匀分散其中，且未堵塞生物陶瓷颗粒的多孔结构，较好的保留了多孔骨植入物的生物活性；本发明所述方法将多孔植入物的冻干品经真空干燥处理后，增强了胶原蛋白间的交联度，延长了胶原蛋白在骨缺损处的存在时间，避免过早出现骨缺损再现，同时可利用生物陶瓷颗粒间胶原进行特定形状裁剪或浸润塑形，可避免多孔骨植入物中的生物陶瓷颗粒在骨缺损处被体液或血液循环带走引发炎症反应。
以上所述仅为本发明的实施例而非限制，凡是利用本发明提出的技术思路，在技术方案基础上做出的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)不同浓度胶原蛋白液的制备：将胶原蛋白溶于水分别配制低浓度胶原蛋白液和高浓度胶原蛋白液；
(2)变性胶原蛋白液的制备：取步骤(1)制备的低浓度胶原蛋白液热反应后，离心取上清，得到变性胶原蛋白液；
(3)筛选生物陶瓷：将生物陶瓷颗粒过筛得到筛选的生物陶瓷；
(4)真空灌注：将步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷混合，第一次抽真空后，恢复常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，加入步骤(1)制备的低浓度胶原蛋白液，第二次抽真空后，恢复常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次加入步骤(1)制备的高浓度胶原蛋白液，第三次抽真空后，恢复常压，得到真空灌注的生物陶瓷材料；
(5)透析胶原蛋白液的制备：配制胶原蛋白液，将胶原蛋白液经紫外线照射后，搅拌均匀，离心收集沉淀，加水配制透析液进行透析，即得透析胶原蛋白液，备用；
(6)混合物料的制备：配制胶原蛋白液，将配制的胶原蛋白液与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液混合得到混合胶原蛋白液，加入步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料混合，得到混合料液；
(7)灌装冻干：将步骤(6)制备的混合料液倒入模具，冻干得到多孔骨植入物的冻干品；
(8)真空干燥：将步骤(7)制备的冻干品进行真空干燥，得到胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物；
步骤(1)中，所述胶原蛋白为具有三螺旋结构的天然胶原蛋白冻干品；所述低浓度胶原蛋白液中胶原蛋白的质量浓度为2.5～5.0mg/g；所述高浓度胶原蛋白液中胶原蛋白的质量浓度为7.0～12.0mg/g；
步骤(3)中，所述生物陶瓷为羟基磷灰石、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙中的一种或多种；所述生物陶瓷为多孔型，气孔率为65％～75％，粒径为0.4～5.0mm；所述筛的目数为4～35目；
步骤(4)中，所述步骤(2)制备的变性胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60～140：100；所述第一次抽真空的具体过程为：首先设定真空交联箱的温度为30～35℃，真空度≥-15Kpa，持续真空负压维持3～4h；所述低浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60～140：100；所述第二次抽真空的具体过程为：真空交联箱温度维持30～35℃，真空度≥-15Kpa，持续真空负压维持3～4h，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至真空度≥-15Kpa，并升温至40～45℃，保温1～2h后，继续升温至105～115℃，负压维持16～24h；所述高浓度胶原蛋白液与步骤(3)筛选的生物陶瓷的质量比为60～140：100；所述第三次抽真空的具体过程为：真空交联箱温度维持30～35℃，真空度≥-15Kpa，持续真空负压维持4～6h，恢复至常压，上下翻动生物陶瓷颗粒，再次抽真空至真空度≥-15Kpa，并升温至40～45℃，保温1～2h后，真空交联箱继续升温至105～115℃，负压维持16～24h；
步骤(5)中，所述胶原蛋白液是将胶原蛋白冻干品溶于水中，在10～15℃下搅拌得到；所述胶原蛋白液的质量浓度为2.0～5.0mg/g的胶原蛋白液，然后用0.1M氢氧化钠溶液调节pH值至7.5～8.0；所述紫外线的波长为254nm；所述紫外线照射的距离为30～50cm，时间为12～16h，温度为30～35℃；所述离心的速度为4000～5000r/min，时间为10～15min；所述透析液的中胶原蛋白的质量浓度为10～20mg/g；所述透析袋的截留分子量为≥3500Da，所述透析的时间为48～72h；
步骤(6)中，所述胶原蛋白液是将胶原蛋白冻干品溶于水中，在10～15℃下搅拌得到，所述胶原蛋白液质量浓度为10.0～20.0mg/g的胶原蛋白液；所述胶原蛋白液与步骤(5)制备的透析胶原蛋白液质量比为1:1～2:1；所述混合胶原蛋白液中胶原蛋白的质量浓度为10.0～20.0mg/g；所述混合胶原蛋白液与步骤(4)制备的真空灌注的生物陶瓷材料混合的干物质质量比为1:4～1:14。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述热反应的温度为105～115℃，时间为1～2h；所述离心的速度为4000～5000r/min，时间为10～15min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述冻干的具体过程为：首先冻干机板温预冻至-40～-30℃，保持2～4h；然后将板温升至0～10℃，保持2～4h；继续加热板温至20～30℃，保持8～10h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，所述真空干燥的具体过程为：首先设定真空干燥箱的温度为60～70℃，真空度≥-30Kpa，维持1～2h；然后升温至105～115℃，负压维持36～48h。
5.一种权利要求1-4任一项所述制备方法制备的胶原蛋白/生物陶瓷多孔骨植入物。
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