TWI403326B

TWI403326B - 促進硬骨分化之方法及其組合物，以及硬骨植入物及其製造方法

Info

Publication number: TWI403326B
Application number: TW99116018A
Authority: TW
Inventors: Yu Hui Tsai; Li Hsuan Chiu; Wen Fu Lai; Shih Ching Chen
Original assignee: Univ Taipei Medical
Priority date: 2010-04-22
Filing date: 2010-05-19
Publication date: 2013-08-01
Also published as: TW201136595A

Description

促進硬骨分化之方法及其組合物，以及硬骨植入物及其製造方法

本發明是有關於骨再生與骨科修復之領域，特別是關於促進硬骨分化之方法及其組合物，以及硬骨植入物及其製造方法。

骨骼是一種由細胞和細胞外間質(ECMs)所組成的硬化結締組織。有別於其他結締組織，骨組織間質是為鈣化之間質。在人體中，其係一種提供身體壓力支撐及保護，且具有極大硬度的組織。當骨組織無法以正常速度自行修復，或由於受傷或疾病而發生骨損失，其均可能導致人體之無法活動，以及大量時間與金錢的浪費。骨生成(osteogenesis)係意指新骨組織的生長，為涉及骨母細胞和中胚層幹細胞(MSC)活化之正常癒合過程的一部份。對於老年人，經歷疾病或嚴重創傷後的骨生成係為相當慢的過程。因此，可在創傷和骨科或牙科程序後促進骨生成及加速癒合過程在此領域是為一相當重要的課題。

軟骨內骨化係為骨生成及胎兒骨骼發育期間的兩個必要過程之一。不同於支配顱骨初步形成之膜內骨化機制，軟骨組織係存在於軟骨內骨化過程的時候。軟骨內骨化係發生在胚胎長骨發展及骨折自然癒合期間的必要過程，其係為一高度協調、多步驟的過程。簡言之，參與此發展過程的一系列事件包括中胚層幹細胞的凝聚、軟骨細胞的分化/成熟/過度生長、軟骨模板鈣化及骨前驅細胞的侵入和分化。細胞外間質亦在協調中胚層幹細胞分化上扮演關鍵性的角色。此交互作用促始了骨前驅細胞的分化，且使組織鈣化為成熟的骨結構。

對於由於骨折、創傷或病理原因所造成的骨損傷，骨植入手術可有其必要性。植入物已普遍用於醫療界以取代或加固已受傷或不健全的硬骨。此外，已有很多材料或物質用於骨組織的修復以再生缺損的骨組織。已有很多研究致力於在需要骨組織替換的位置活化骨質的形成。眾所周知，第一型膠原蛋白可促進人類中胚層幹細胞及骨母細胞的骨化分化，當這些細胞貼附於塗佈有第一型膠原蛋白的表面時，可經由ERK1/2訊息傳導途徑刺激此些細胞的骨化分化。因此第一型膠原蛋白目前的應用多為將其與磷酸鈣混合後製成支架(scaffold)，以做為骨填補材料。然而，並無報導已經指出第二型膠原蛋白在促進骨生成的調節作用。第二型膠原蛋白主要存在軟骨組織及生長中的骨組織中，且在過去的研究中多被認為是一種軟骨性的細胞外間質。因此，第二型膠原蛋白鮮少被討論其在骨生成過程中之機制及重要性，也未被應用於促進骨形成。

本發明一方面是在提供一種促進硬骨分化之方法，包括將第二型膠原蛋白添加到包含幹細胞、前驅細胞或骨母細胞之組織細胞中之步驟，以促進組織細胞的硬骨分化。其中，幹細胞及前驅細胞具有硬骨分化的自發趨向。此方法可應用於組織工程領域，例如骨細胞的體外培養及幹細胞的骨分化誘導(osteo-induction)。

本發明的另一方面係提供一種促進硬骨分化之組合物，其包括於骨化培養液中之第二型膠原蛋白以及包含幹細胞、前驅細胞或骨母細胞之組織細胞。此骨化培養液係由包含有10^-10-10^-7 M地塞米松(dexamethason)、5-50 mM β-磷酸甘油及10-200 μg/ml抗壞血酸之DMEM-LG培養基所製成。其中，幹細胞及前驅細胞係具有硬骨分化的自發趨向。

本發明另一方面係提供一種硬骨植入物之製造方法，其包括將第二型膠原蛋白塗佈或混合於至少一孔狀骨材料之步驟。其中，此孔狀骨材料是由選自由金屬、生物陶瓷、天然生物高分子及合成高分子所組成的群組中之材料所製得。此方法可選擇性搭配不同的骨材料，而使其應用範圍可包括骨細胞的體外培養、自體和異體移植、以及骨組織重建工程。

根據本發明的又一方面，係提供一種藉由上述製造方法所製得之硬骨植入物。此硬骨植入物包括第二型膠原蛋白及至少一孔狀骨材料，其中第二型膠原蛋白係塗佈於孔狀骨材料的表面或與孔狀骨材料混合。

本發明的又一方面，係提供一種硬骨植入物之製造方法，其包括步驟：將與至少一孔狀骨材料結合或未結合的第二型膠原蛋白承載於一容器中；以及冷凍乾燥第二型膠原蛋白以產生一結合或未結合有孔狀骨材料之第二型膠原蛋白海綿結構，其中第二型膠原蛋白的濃度係在2至20 μg/ml的範圍。

本發明可具有一或多個下述優點：

(1)為了促進骨組織的修復與再生，本發明之第二型膠原蛋白的使用方式係可單獨使用、塗佈於骨材料的表面、與骨材料混合、與幹細胞、前驅細胞或骨母細胞混合或將其組合，以達成所期望的效果。

(2)本發明之第二型膠原蛋白可活化ERK1/2和JNK訊息傳導途徑，因而加速具有硬骨分化趨向的幹細胞之骨質沉積，或進一步提高鹼性磷酸酶(ALP)的活性。相較於已知的第一型膠原蛋白，包括第二型膠原蛋白的組合物或硬骨植入物不僅可加速鈣沉積，亦可快速增加骨沉積的量以達到快速骨再生的目的。因此，本發明具有應用於臨床上之硬骨組織修復，或用於現有的骨材料之表面塗佈開發的潛力。

(3)本發明所製備所得之硬骨植入物，於植入需要骨組織替換之位置後，可促進硬骨分化，並明顯提升骨沉積的程度。

(4)在癒合過程期間，所添加的第二型膠原蛋白可刺激某些細胞群形成新骨組織，以用來替代損失或損傷之骨組織。因此，第二型膠原蛋白可用於需要骨組織再生以回復正常功能的臨床狀況上，例如用於骨創傷或牙周缺損的修補。再者，此第二型膠原蛋白可提高或促進骨組織向各種不同的義肢裝置及孔狀骨材料，例如自體移植物或異體移植物、經處理過的異體骨碎片或其類似物的內部生長。

(5)本發明之第二型膠原蛋白可塗佈於由不同骨材料所製成之支架(scaffold)上，或直接與不同的骨材料混合。其中，骨材料可為金屬，例如鈦或鈦合金；生物陶瓷，例如氫氧磷灰石(HA)、氧化鋁、氧化鋯、硫酸鈣、磷酸鈣、三鈣磷酸鹽、氫氧磷灰石-三鈣磷酸鹽(HA-TCP)或其組合；天然生物高分子，例如褐藻酸鹽、甲殼素或其組合；以及合成高分子，例如聚乳酸(PLA)、聚甘醇酸(PGA)或聚乳酸-甘醇酸(PLGA)。此外，本發明可應用的領域相當廣泛。

(6)本發明所需的第二型膠原蛋白係易於取得的。例如，第二型膠原蛋白可藉由基因重組之第二型膠原蛋白基因，或從包括家禽、家畜及魚類的動物之軟骨組織中萃取純化而獲得。

第1圖係為U2OS骨母細胞分別在骨化培養液中之不同ECM組成物上培養7天後之ALP活性測試結果，其中此圖式中之ECM組成物包括纖連蛋白(FN)、第二型膠原蛋白(CII)和第一型膠原蛋白(CI)，係與未經塗佈表面(Control)作比較；第2圖係為MG63骨母細胞分別在骨化培養液中之不同ECM組成物上培養7天後之ALP活性測試結果，其中此圖式中之ECM組成物包括纖連蛋白(FN)、第二型膠原蛋白(CII)和第一型膠原蛋白(CI)，係與未經塗佈表面(Control)作比較；第3圖係為中胚層幹細胞分別在骨化培養液中之未經塗佈 (Control)、第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)和第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)的表面上培養7、14和21天後之鈣沉積染色照片；第4圖係為中胚層幹細胞分別在骨化培養液中之(B)未經塗佈、(C)第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)和(D)第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)的氫氧磷灰石-三鈣磷酸鹽(HA-TCP)支架上培養21天後之三維培養之SEM照片，而(A)係為不具細胞之空白HA-TCP支架在骨化培養液中培養21天後之SEM照片；第5圖係為中胚層幹細胞分別在骨化培養液中之(B)未經塗佈、(C)第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)和(D)第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)的氫氧磷灰石-三鈣磷酸鹽(HA-TCP)支架上培養42天後之三維培養之SEM照片，而(A)係為不具細胞之空白HA-TCP支架在骨化培養液中培養42天後之SEM照片；第6圖係為(A)第一型膠原蛋白海綿支架和(B)第二型膠原蛋白海綿支架在種入中胚層幹細胞且培養在骨化培養液中14天後的蘇木紫-伊紅(H&E)切片染色照片；以及第7圖係為中胚層幹細胞分別在骨化培養液中之未經塗佈(Non-coated)、第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)、第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)和1比1比例之第一型/第二型膠原蛋白混合物塗佈(CI+CII-coated)的聚乳酸(PLA)支架上培養42天後之鈣沉積結果。

本發明之示範實施例將可從以下詳細的描述，及本發明不同實施例所伴隨的圖式，而得到更完整的了解。然而，其並非用以限定本發明至特定的實施例，而僅用於說明與理解。

本文中所提及的”第二型膠原蛋白”一詞不僅是意指第二型膠原蛋白本身，亦可指其生物活性片段及類似物。

本文中所提及的骨組織修復和再生過程包括細胞增殖、細胞分化、間質重組和血管新生。

本發明提供一種促進硬骨分化之方法，其包括添加第二型膠原蛋白至選自由幹細胞、前驅細胞及骨母細胞所組成的群組中之組織細胞之步驟，以促進組織細胞的硬骨分化。例如，可將第二型膠原蛋白直接塗於骨折位置以刺激鄰近地區之骨母細胞、中胚層幹細胞(MSCs)及中胚層前驅細胞(MPCs)的硬骨分化，且促使傷口處的骨組織修復與再生。

本發明亦提供一種促進硬骨分化之組合物，其包括在骨化培養液中之第二型膠原蛋白以及選自由幹細胞、前驅細胞及骨母細胞所組成的群組中之組織細胞，此骨化培養液係由包含有10^-10-10^-7 M地塞米松(dexamethason)、5-50 mM β-磷酸甘油及10-200 μg/ml抗壞血酸之DMEM-LG培養基所製成。

其中，幹細胞及前驅細胞具有硬骨分化的趨向。最好地是，幹細胞可為取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層幹細胞、取自乳牙或恆牙的幹細胞、或胚胎幹細胞；前驅細胞可為取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層前驅細胞。第二型膠原蛋白塗佈在組織細胞所貼附的表面之濃度約為5至1000 μg/ml，較佳為20至200 μg/ml，而用於包含在細胞分化培養內的濃度則為 100至600 μg/ml，且其可藉由基因重組之第二型膠原蛋白基因，或從包括家禽(例如雞和鴨)、家畜(例如豬、牛和羊)及魚類的動物之軟骨組織中萃取純化而獲得。

選擇性地，為了促進細胞的硬骨分化，可進一步添加生長因子作為骨組織修復及再生的調節器，例如骨形成蛋白(BMP)、轉化生長因子-β(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF-I)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)或血小板衍生性生長因子(PDGF)。

本發明進一步提供一種硬骨植入物之製造方法，其包括將第二型膠原蛋白塗佈於至少一孔狀骨材料，或將該第二型膠原蛋白與該至少一孔狀骨材料混合之步驟，其中孔狀骨材料是由選自由金屬、生物陶瓷、天然生物高分子及合成高分子所組成的群組中之材料所製得。因此，包括第二型膠原蛋白及孔狀骨材料之硬骨植入物可藉由此製造方法取得。第二型膠原蛋白用於塗佈現成植入物(也就是孔狀骨材料)的濃度約為5至1000 μg/ml，較佳為20至200 μg/ml，而用於與其他孔狀骨材料混合以產生硬骨植入物的濃度則為2至20 μg/ml。第二型膠原蛋白可藉由基因重組之第二型膠原蛋白基因，或從包括家禽、家畜及魚類的動物之軟骨組織中萃取純化而獲得。

較佳地，金屬包括鈦或鈦合金；生物陶瓷包括氫氧磷灰石(HA)、氧化鋁、氧化鋯、硫酸鈣、磷酸鈣、三鈣磷酸鹽、氫氧磷灰石-三鈣磷酸鹽(HA-TCP)或其組合；天然生物高分子包括褐藻酸鹽、甲殼素、膠原蛋白、瓊脂糖、天然細胞外間質組成物或其組合；以及合成高分子包括聚乳酸(PLA)、聚甘醇酸(PGA)、聚乳酸-甘醇酸(PLGA)或其組合。

本發明又進一步提供一種硬骨植入物之製造方法，其包括將第二型膠原蛋白承載於一容器中，將其冷凍乾燥後，以產生第二型膠原蛋白海綿結構等步驟，其中第二型膠原蛋白的濃度為2至20 μg/ml，較佳為4至10 μg/ml。

此外，作為骨組織修復及再生的調節器之生長因子，例如骨形成蛋白(BMP)、轉化生長因子-β(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF-I)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)或血小板衍生性生長因子(PDGF)係可選擇性地加入硬骨植入物。較佳地是，骨形成蛋白係為骨形成蛋白-2，而轉化生長因子-β係為轉化生長因子-β1。幹細胞、前驅細胞及骨母細胞亦可選擇性地加入硬骨植入物中。

本發明之各種實施例

藉由參考下述實施例將可更瞭解本發明，且其係提供作為本發明之示範實施例，而非限制之。

實施例1：第二型膠原蛋白對骨母細胞株之鹼性磷酸酶(ALP)活性的正調節

在此實施例中，係檢測第二型膠原蛋白(CII)、第一型膠原蛋白(CI)及纖連蛋白(FN)對兩種不同的骨母細胞株(U2OS和MG63)之ALP酵素活性的調節作用。

培養皿塗佈：

將蓋玻片或組織培養皿塗佈經純化且濃度為5至1000 μg/ml，較佳為20至200 μg/ml的ECM組成物(第二型膠原蛋白、第一型膠原蛋白或纖連蛋白)或聚離胺酸(使用蓋玻片，作為實驗中的控制組(Control))並置於室溫下2小時。之後，將殘餘的ECM溶液移除，再進一步以磷酸緩衝鹽(PBS)清洗培養皿或蓋玻片，接著以於PBS中濃度為5%牛血清蛋白(BSA)培養30分鐘。此經塗佈後的培養皿再以紫外線殺菌後儲存於4℃中備用。

ALP活性檢驗：

將U2OS和MG63骨母細胞覆蓋於塗佈有不同ECM組成物之培養皿上7天後，使這些細胞進行ALP酵素活性檢驗。將細胞以pH 10.5的50 mM甘胺酸緩衝液清洗後，偵測所培養的骨母細胞之ALP酵素活性。接著於37℃下，將細胞培養於溶解在pH 10.5且含有1 mM氯化銀之甘胺酸緩衝液中之1 mg/ml對硝基苯磷酸(pNPP)中3小時。ALP係將pNPP轉換成一黃色產物，且係以分光光度計在405 nm波長吸收值測定其相對酵素活性。

第1圖和第2圖是分別為不同ECM組成物對U2OS骨母細胞和MG63骨母細胞之ALP活性之作用。如圖所示，在骨化培養液培養7天後，各ECM組成物均顯示促進U2OS細胞之ALP活性。相較於培養於未塗佈ECM組成物的培養皿上之細胞的ALP活性(Control)，第二型膠原蛋白塗佈的培養皿對於上述二細胞株均顯示提高ALP活性達1.4至2倍的程度。此實施例，尤其是在MG63細胞，係說明了第一型膠原蛋白(CI)和第二型膠原蛋白(CII)對於ALP活性的活化均較纖連蛋白(FN)具有更大的誘導能力。

實施例2：第二型膠原蛋白對中胚層幹細胞(MSC)骨生成的作用

在此實施例中，係檢測第二型膠原蛋白(CII)和第一型膠原蛋白(CI)對中胚層幹細胞(MSC)骨生成之調節作用。

中胚層幹細胞之分離、培養及儲存：

骨髓吸出物(aspirates)可從接受股骨或髂骨手術的捐贈者(18至65歲)處無菌取得，係使用10毫升的針筒抽吸骨髓。將所取得的吸出物立即與肝素鈉混合，並使用五倍體積的磷酸緩衝鹽(PBS)稀釋。接著將此細胞懸浮液置於Percoll梯度(40%初始密度，Pharmacia公司)上進行分餾與離心。收集富含有MSC的接口部分，並將其培養於包含具有1 mg/ml葡萄糖、10%胎牛血清和1倍盤尼西林/鏈黴素/防治黴之10 ml DMEM(DMEM/LG,Sigma D5523)於10公分培養皿內。每四天更換一次培養液。當細胞長到八成滿時，則將其胰蛋白脢化且遷移至新的10公分培養皿內，細胞密度為5x10⁵ cells/dish。將細胞繼代培養到第二代(P2)。一些第三代(P3)則儲存備用。

表面塗佈：

將組織培養皿塗佈經純化且濃度為5至1000 μg/ml，較佳為20至200 μg/ml的ECM組成物(第二型膠原蛋白、第一型膠原蛋白或纖連蛋白)並置於室溫下2小時。之後，將殘餘的ECM溶液移除，再進一步以PBS清洗培養皿。此經塗佈後的培養皿再以紫外線殺菌後儲存於4℃中備用。

利用茜素紅染色法之鈣沉積檢驗：

將中胚層幹細胞分別培養於第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)、第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)或未經塗佈(Control)的培養皿中。待細胞貼附後，將其培養在由包含有10^-8 M地塞米松(dexamethason)、10 mM β-磷酸甘油及50 μg/ml抗壞血酸之低濃度葡萄糖DMEM(DMEM-LG)所製成之骨化培養液中。分別於培養7、14和21天後收集細胞並將其進行茜素紅染色。為了偵測已分化MSC的細胞層上之鈣沉積，利用蒸餾水快速清洗細胞。接著，添加pH 4.2的1 ml茜素紅溶液以覆蓋細胞表面五分鐘，再以蒸餾水沖洗。鈣沉積會在細胞表面呈現橘紅色，並利用照相或顯微鏡紀錄。更可在10%氯化鯨蠟吡啶(CPC)中將染色萃取出，並將其在560 nm下進行分光光度計檢測以定量出正染色的程度。

第3圖顯示在培養皿上鈣沉積的照片，以說明第二型膠原蛋白(CII)和第一型膠原蛋白(CI)對中胚層幹細胞的作用。圖中，單層MSC係分別在骨化培養液中之第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)、第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)和未經塗佈(Control)的培養皿上培養7、14和21天。然後將細胞固定並進行茜素紅染色以偵測鈣沉積。第二型膠原蛋白塗佈的群組其細胞均較第一型膠原蛋白塗佈的群組其細胞或控制群組的細胞更易於鈣化，也就是說第二型膠原蛋白促進MSC骨生成的速度較第一型膠原蛋白來的快。此結果指出第二型膠原蛋白塗佈表面可加速骨化培養液中之MSC的鈣沉積。因此，第二型膠原蛋白除可以促進骨母細胞的成熟化，亦可加速MSC分化。

實施例3：第二型膠原蛋白塗佈的現成骨材料或植入物之促進骨化作用

在此實施例中，係檢測第一型膠原蛋白(CI)或第二型膠原蛋白(CII)塗佈對氫氧磷灰石-三鈣磷酸鹽(HA-TCP)支架/植入物之骨化作用。

三維表面塗佈：

將三維市售HA-TCP骨支架(此處係指孔狀骨材料)塗佈經純化且濃度為5至1000 μg/ml，較佳為50至100 μg/ml，更佳為100 μg/ml的ECM蛋白質(第一型膠原蛋白或第二型膠原蛋白)或5 mM醋酸(膠原蛋白溶劑，做為未經塗佈的控制組)並置於室溫下2小時。之後，將殘餘的ECM溶液移除，再進一步用PBS清洗此些不同的骨支架。然後將此些支架在培養櫃晾乾後儲存於4℃中備用。

中胚層幹細胞之播種(seeding)：

將每一細胞數為1x10⁵的中胚層幹細胞懸浮於175 μl之如實施例2中所示的培養液中，再將其種入上述表面塗佈有膠原蛋白或未經塗佈之HA-TCP骨支架內。在37℃的二氧化碳培養槽中細胞貼附兩小時後，接著將承載有細胞的HA-TCP結構(在此係指本發明之硬骨植入物)轉移至24 well的盤子中，並在前述所提適合骨化的條件下進一步培養不同的時間間隔。待所設計的時間間隔到後，對上述承載有細胞的HA-TCP結構進行SEM分析。

第4圖顯示中胚層幹細胞分別在骨化培養液中之未經塗佈(第4(B)圖)、第一型膠原蛋白塗佈(第4(C)圖)和第二型膠原蛋白塗佈(第4(D)圖)的骨支架上培養21天後之三維培養之SEM照片，而(第4(A)圖)係為不具細胞之空白骨支架在骨化培養液中培養21天後之SEM照片。圖中，細胞於第21天固定並進行SEM分析，以偵測表面骨化。每一照片中右上角之插入圖像係為其框框所指區域經放大後的鈣沉積表面。如圖所示，第二型膠原蛋白塗佈的群組(第4(D)圖)顯示較其他群組具有更大量的鈣化結晶沉積在結構表面上。此結果說明相較於第一型膠原蛋白塗佈，第二型膠原蛋白塗佈對MSC在三維骨支架上具有更好的促進鈣化作用。

第5圖顯示中胚層幹細胞分別在骨化培養液中之未經塗佈(第5(B)圖)、第一型膠原蛋白塗佈(第5(C)圖)和第二型膠原蛋白塗佈(第5(D)圖)的骨支架上培養42天後之三維培養之SEM照片，而(第5(A)圖)係為不具細胞之空白骨支架在骨化培養液中培養42天後之SEM照片。在培養42天後，將細胞固定並進行SEM分析，以偵測表面骨化。圖中，白色箭頭處係指出具有礦物結晶沉積在植入物表面之鈣化區域。如第5(B)圖所示，未塗佈膠原蛋白之HA-TCP結構的表面與不具細胞之空白骨支架(第5(A)圖)的表面僅顯示些微的差異。對於第一型膠原蛋白塗佈，可發現HA-TCP結構表面有明顯的侵蝕且輕微程度的鈣化(第5(C)圖)，而對於第二型膠原蛋白塗佈，則可明顯發現有大量的礦物結晶沉積在經侵蝕的HA-TCP結構表面(第5(D)圖)。此些結果說明第二型膠原蛋白對於培養在骨材料/植入物的MSC之鈣沉積具有促進效果。因此，第二型膠原蛋白不管對於培養在單層或三維的培養條件下之MSC的鈣沉積均具有促進效果。

實施例4：作為硬骨植入物之經第二型膠原蛋白塗佈之第一型膠原蛋白支架之骨生成作用

在此實施例中，係檢測經第二型膠原蛋白塗佈之第一型膠原蛋白支架對中胚層幹細胞(MSC)分化之骨化促進作用。

三維膠原蛋白支架之製造：

將置於96 well盤子內且濃度為2-20 mg/ml的膠原蛋白冷凍乾燥。簡言之，係將300 μl第一型膠原蛋白(CI)承載於96 well盤子內並以冷凍乾燥機進行冷凍乾燥，以製得類似圓柱狀的海綿膠原蛋白支架作為骨材料。冷凍乾燥後，進一步將上述製得之支架塗佈濃度為5至1000 μg/ml，較佳為20至200 μg/ml之第二型膠原蛋白(CII)或5 mM醋酸(膠原蛋白溶劑，做為控制組)並置於室溫下2小時。培養後移除殘餘的溶液。然後進一步用PBS清洗此些支架並在培養櫃中以紫外光照射晾乾。

中胚層幹細胞之播種(seeding)：

將每一細胞數為5x10⁵-1x10⁶的人類中胚層幹細胞懸浮於20 μl培養液中並將其分別種入上述支架內。在37℃的二氧化碳培養槽中細胞貼附兩小時後，於盤子內加入新鮮的培養液進一步培養。於隔天將承載有細胞的膠原蛋白支架轉移至24 well的盤子內，並維持在所設計的培養條件下14天。

如第6圖所示，第一型膠原蛋白海綿支架(第6(A)圖)的基質顯示較淡且較稀的H&E染色，其意指此群組中的鈣化程度低。對於有進一步第二型膠原蛋白塗佈之第一型膠原蛋白海綿支架(第6(B)圖)，可發現其具有較重且較濃的H&E染色，意指其基質具有較大量的鈣化細纖維。每一照片中的左上角插入圖像係分別為MSC承載於其膠原蛋白海綿支架14天後之外觀照片。因此，MSC在經第二型膠原蛋白塗佈之第一型膠原蛋白海綿支架上係較在僅由第一型膠原蛋白製造的海綿支架上具有更大的鈣化作用。

實施例5：第二型膠原蛋白塗佈的現成骨材料或植入物之促進骨化作用

在此實施例中，係檢測第一型膠原蛋白或第二型膠原蛋白塗佈對聚乳酸(PLA)支架/植入物之骨化作用。

三維表面塗佈：

將三維PLA骨支架(此處係指孔狀骨材料)塗佈經純化且濃度為5至1000 μg/ml，較佳為50至100 μg/ml的ECM蛋白質(第一型膠原蛋白或第二型膠原蛋白)或5 mM醋酸(膠原蛋白溶劑，做為未經塗佈的控制組)並置於室溫下2小時。之後，將殘餘的ECM溶液移除，再進一步用PBS清洗此些不同的骨支架。然後將此些支架在培養櫃以紫外光照射下晾乾，再儲存於4℃中備用。

中胚層幹細胞之播種(seeding)：

將細胞數為1x10⁵且懸浮於175 μl培養液中的中胚層幹細胞種入上述表面塗佈有膠原蛋白或未經塗佈之PLA骨支架內。在37℃的二氧化碳培養槽中細胞貼附兩小時後，將承載有細胞的PLA結構(在此係指本發明之硬骨植入物)轉移至24 well的盤子中，並在前述所提適合骨化的條件下進一步培養不同的時間間隔。待所設計的時間間隔到後，對上述承載有細胞的PLA結構進行SEM分析。

第7圖顯示MSC在骨化培養液中之PLA支架培養42小時後之鈣沉積程度。圖中，細胞係分別培養在第一型膠原蛋白塗佈(CI-coated)、第二型膠原蛋白塗佈(CII-coated)、1比1比例之第一型/第二型膠原蛋白混合物塗佈(CI+CII-coated)和未經塗佈(Non-coated)的聚乳酸(PLA)支架。待培養42小時後，將所有支架上的細胞固定並進行茜素紅染色。之後，利用10%氯化鯨蠟吡啶(CPC)將染色萃取出，並將其在560 nm下進行分光光度計檢測。第二型膠原蛋白塗佈的群組其MSC細胞均較第一型膠原蛋白塗佈的群組、控制群組及第一型/第二型膠原蛋白混合物塗佈的群組的細胞具有更高的鈣沉積程度。此結果說明第二型膠原蛋白塗佈的PLA支架相較於市售的PLA支架對於培養在骨化培養液中之MSC更具有加速鈣沉積的效果。

相較於第一型膠原蛋白塗佈的表面或材料，本發明所提供的第二型膠原蛋白塗佈的表面或材料可使鈣沉積更早發生且鈣沉積量更多。因此，第二型膠原蛋白不僅本身可發展為新型的骨修復材料，含有第二型膠原蛋白的支架亦可使用作為更好的骨再生植入物，或者也可將其塗佈於現成骨材料，以製得具有更好效果的新型硬骨植入物。因此，將第二型膠原蛋白應用於各式各樣地生物材料，對於骨再生之工程，尤其是較大的骨缺損修復治療，可為一新的治療策略。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims

一種於體外促進硬骨分化之方法，其包括提供作為基質塗層之第二型膠原蛋白至選自由分離自人體之幹細胞、前驅細胞及骨母細胞所組成的群組中之組織細胞，以促進該組織細胞之硬骨分化之步驟，其中該幹細胞及該前驅細胞係具有硬骨分化的趨向。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二型膠原蛋白係藉由基因重組之第二型膠原蛋白基因，或從包括家禽、家畜及魚類的動物之軟骨組織中萃取純化而獲得。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該幹細胞包括取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層幹細胞、取自乳牙或恆牙的幹細胞、或胚胎幹細胞；該前驅細胞包括取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層前驅細胞。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二型膠原蛋白的濃度係在5至1000微克/毫升的範圍。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該第二型膠原蛋白的濃度係在20至200微克/毫升的範圍。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包括添加生長因子作為硬骨組織修復及再生的調節因子之步驟，其中該生長因子包括骨形成蛋白(BMP)、轉化生長因子-β(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF-I)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)或血小板衍生性生長因子(PDGF)。
一種促進硬骨分化之組合物，其包括：一第二型膠原蛋白，其塗佈於一基質之表面；組織細胞，其選自由幹細胞、前驅細胞及骨母細胞所組成的群組，其中該幹細胞及該前驅細胞係具有硬骨分化的趨向；以及骨化培養液，其係由包含有10^-10-10^-7 M地塞米松(dexamethason)、5-50 mM β-磷酸甘油及10-200 μg/ml抗壞血酸之DMEM-LG培養基所製成。
如申請專利範圍第7項所述之組合物，其中該第二型膠原蛋白係藉由基因重組之第二型膠原蛋白基因，或從包括家禽、家畜及魚類的動物之軟骨組織中萃取純化而獲得。
如申請專利範圍第7項所述之組合物，其中該幹細胞包括取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層幹細胞、取自乳牙或恆牙的幹細胞、或胚胎幹細胞；該前驅細胞包括取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層前驅細胞。
如申請專利範圍第7項所述之組合物，其中該第二型膠原蛋白的濃度係在5至1000微克/毫升的範圍。
如申請專利範圍第7項所述之組合物，其中該第二型膠原蛋白的濃度係在20至200 μg/ml的範圍。
如申請專利範圍第7項所述之組合物，其進一步包括添加生長因子以作為硬骨組織修復及再生之調節因子，其中該生長因子包括骨形成蛋白(BMP)、轉化生長因子-β(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF-I)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)或血小板衍生性生長因子(PDGF)。
一種硬骨植入物之製造方法，其包括將第二型膠原蛋白塗佈於至少一孔狀骨材料，或將該第二型膠原蛋白與該至少一孔狀骨材料混合之步驟，其中該孔狀骨材料是由選自由金屬、生物陶瓷、天然生物高分子及合成高分子所組成的群組中之材料所製得；其中用於塗佈之該第二型膠原蛋白的濃度為5至1000微克/毫升；其中用於混合之該第二型膠原蛋白的濃度2至20微克/毫升。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中該金屬包括鈦或鈦合金；該生物陶瓷包括氫氧磷灰石(HA)、氧化鋁、氧化鋯、硫酸鈣、磷酸鈣、三鈣磷酸鹽、氫氧磷灰石-三鈣磷酸鹽(HA-TCP)或其組合；該天然生物高分子包括褐藻酸鹽、甲殼素、膠原蛋白、瓊脂糖、天然細胞外間質組成物或其組合；以及該合成高分子包括聚乳酸(PLA)、聚甘醇酸(PGA)或聚乳酸-甘醇酸(PLGA)。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中該第二型膠原蛋白係藉由基因重組之第二型膠原蛋白基因，或從包括家禽、家畜及魚類的動物之軟骨組織中萃取純化而獲得。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中用於塗佈之該第二型膠原蛋白的濃度係在20至200微克/毫升的範圍。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其進一步包括添加選自由幹細胞、前驅細胞及骨母細胞所組成的群組中之組織細胞之步驟，其中該幹細胞及該前驅細胞係具有硬骨分化的趨向，以及該組織細胞係培養在由包含有10^-10-10^-7 M地塞米松(dexamethason)、5-50 mM β-磷酸甘油及10-200 μg/ml抗壞血酸之DMEM-LG培養基所製成之骨化培養液中。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中該幹細胞包括取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層幹細胞、取自乳牙或恆牙的幹細胞、或胚胎幹細胞；該前驅細胞包括取自骨髓、臍帶血或其他體細胞組織的中胚層前驅細胞。
如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中進一步包括添加生長因子作為硬骨組織修復及再生之調節因子之步驟，其中該生長因子包括骨形成蛋白(BMP)、轉化生長因子-β(TGF-β)、纖維母細胞生長因子(FGF)、類胰島素生長因子(IGF-I)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)或血小板衍生性生長因子(PDGF)。
一種取自如申請專利範圍第13項之製造方法之硬骨植入物，其包括該第二型膠原蛋白及該至少一孔狀骨材料，其中該第二型膠原蛋白係塗佈於該孔狀骨材料的表面或與該孔狀骨材料混合。
一種硬骨植入物之製造方法，其包括步驟：將與至少一孔狀骨材料結合或未結合的第二型膠原蛋白承載於一容器中；以及冷凍乾燥該第二型膠原蛋白以產生一結合或未結合該孔狀骨材料之第二型膠原蛋白海綿結構，其中該第二型膠原蛋白的濃度係在2至20微克/毫升的範圍。