JPH06296677A - 骨形成用移植体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 各種の骨や軟骨の損傷などの治療に有用な、
抗原性の低い骨形成用移植体を提供する。 【構成】 コラーゲン担体が、ヒト由来の他のタンパク
質を実質的に含有しないヒト骨誘導因子（ｒｈＢＭＰ）
を担持する。 【効果】 ヒトに移植しても免疫学的副作用がなく、安
全で、起炎性が低く、生体適合性に優れ、新生骨と生体
内既存骨との連続性も良好で、生体内で分解し、骨形成
後に移植体の除去手術を行う必要がない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、各種の骨（軟骨を含
む）の損傷、欠損あるいは形成不全などの治療に有用
な、生体分解性の骨形成用移植体に関する。詳しくは、
遺伝子組換え技術により製造される組換えヒト骨誘導因
子（ｒｈＢＭＰ）とコラーゲン担体とからなる、生体分
解性の骨形成用移植体に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨誘導因子（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇ
ｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ）は、皮下組織
又は筋組織内の未分化間葉系細胞に作用して、これを軟
骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させ、軟骨又は骨を形成さ
せる活性タンパク質である。ＢＭＰは、ウシ脱灰骨基質
中に存在する異所性骨誘導活性を示す物質として発見さ
れたが、純粋に単離されず、具体的な構造は未解明のま
まであった。しかし、遺伝子工学の技術により、ヒトＢ
ＭＰをコードする遺伝子がクローニングされ、アミノ酸
配列が明らかになった。また、ヒトＢＭＰは、アミノ酸
配列が相同性を有する複数の近縁タンパク質からなる一
群のファミリーを構成することも判明し、数種類の組換
えヒト骨誘導因子（ｒｈＢＭＰ）が創製されてきた〔Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２４２，ｐｐ．１５２８−１５
３４（１９８８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８７，ｐｐ．２２２０−２２２
４（１９９０）；Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，ｐ
ｐ．２６７−２８０（１９８９）；特表平２−５００２
４１号、特表平３−５０３６４９号、特表平３−５０５
０９８号、ＷＯ９１／１８０９８、ＷＯ９２／０５１９
９の各公報〕。また、形質転換体による生産も行われて
いる。

【０００３】前記のＢＭＰを利用して、骨又は軟骨の損
傷、欠損あるいは形成不全などの治療を行う方法は、そ
のＢＭＰの構造が未解明であった頃から、種々提案され
ていた。例えば、ＢＭＰとコラーゲンとの組合せからな
る移植体や組成物を治療部位に加えたり、移植する技術
が、多くの特許公報に記載されている（例えば、特開昭
６０−２５３４５５号、特開昭６２−１６４２１号、特
開昭６２−１３５４３１号、特開平１−１５８９６４
号、特開平２−１８２２６０号及び特表平３−５００６
５５号の各公報、並びに米国特許第４，３９４，３７０
号明細書）。

【０００４】しかし、これらの特許公報に記載されてい
るＢＭＰは、骨肉腫細胞やヒト以外の動物（例えば、ウ
シ）の骨組織から抽出して精製処理して得た粗製ＢＭＰ
であり、複数種のＢＭＰを含むことが知られている。ま
た、同様に骨組織中からの抽出成分としてＢＭＰ以外の
各種の骨形成関連タンパク質、例えば、形質転換生長因
子（ＴＧＦ−β：ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗ
ｔｈ ｆａｃｔｏｒβ）、骨形成誘導因子（ＯＩＦ：ｏ
ｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ）、インス
リン様生長因子（ＩＧＦ：ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｅｒｉｖ
ｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）又は骨由来生長因
子（ＰＤＧＦ：ｐｌａｔｌｅｔ ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒ
ｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）などが知られており、従来公
知の抽出粗製ＢＭＰは、実質的にこれらのタンパク質が
含有された混合物である可能性も示唆されている〔Ｐｒ
ｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２６７−２８０
（１９８９）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２６
４，Ｎｏ．３２，ｐｐ．２０８０５−２０８１０（１９
８９）；日本骨代謝学会雑誌７（３）ｐ１９６（１９８
９）〕。

【０００５】従って、前記の技術をヒトに適用すると、
免疫性の問題があるだけでなく、複数のタンパク質とコ
ラーゲンとの相互作用、あるいはそれらの組合せに起因
する副作用の有無なども不明であり、ヒトに対する臨床
的な使用には多くの問題があった。更に、前記の粗製Ｂ
ＭＰは、その原料に由来する前記以外の多くの不純物を
含むので、ヒトに用いる際には免疫性や安全性の点でも
満足のできるものではなかった。また、微量抽出物であ
るため一定の規格を有する成分を大量に生産することが
困難であり、工業的生産が難しく、実用化には多くの問
題があった。

【０００６】一方、ｒｈＢＭＰを利用する技術として
は、不活性化された同種由来脱ミネラル骨マトリックス
（ＩＡＤＢＭ：ｉｎａｃｔｉｖｅ ａｌｌｏｇｅｎｉｃ
Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｔｒｉ
ｘ）粒子を担体として用いたものが報告されている〔Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．
８７，ｐｐ２２２０−２２２４（１９９０）；Ｊ．Ｂｏ
ｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．，ｖｏｌ．７４−Ａ，ｐ
ｐ６５９−６７１（１９９２）；Ａｒｃｈ．Ｏｔｏｌａ
ｒｙｎｇｏｌ．Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇ．，ｖｏｌ．１１
７，ｐｐ１１０１−１１１２（１９９１）〕。このＩＡ
ＤＢＭ粒子は、同種由来の脱ミネラル骨から活性因子を
含むタンパク質成分を除去して調製した粒子であり、骨
形成に適するコラーゲン様骨マトリックスをそのまま残
留して含んでいる。従って、抗原性もなく、従来より実
験室レベルの粗製ＢＭＰなどの骨形成用担体として繁用
されているものである。前記のｒｈＢＭＰを担持したＩ
ＡＤＢＭ粒子の実験では良好な骨又は軟骨形成が観察さ
れている。

【０００７】前記のｒｈＢＭＰは、ＢＭＰ以外の各種の
骨形成関連タンパク質（例えば、ＴＧＦ−βやＯＩＦ）
を含まない単一成分であり、しかもヒト由来であるので
ヒトに適用しても免疫性や安全性の点では優れたもので
あった。しかし、ヒトへの臨床的な使用に際して同種由
来の脱ミネラル骨マトリックス（ＩＡＤＢＭ）を用いる
ためには、人骨を確保する必要があり、事実上困難であ
る。また、異種由来の脱ミネラル骨マトリックスを用い
ると、抗原性や病原体の感染などの免疫学的な問題が生
じる。更に、粒子状であるので、適用部位や適用量など
が制限されるなどの多くの欠点があった。

【０００８】更に、ｒｈＢＭＰの別の利用法としては、
前記ｒｈＢＭＰと多孔性生体内分解性合成ポリマーと自
家血とからなる組成物が知られている（米国特許第５，
１７１，５７９号明細書）。しかし、この組成物は患者
の自家血を必須成分とするので、使用する際には常に患
者から採血する必要があり、更に、組成物の調製工程が
煩雑であるなど、なお難点があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、ｒｈＢ
ＭＰを用いる従来法にも、主に担体に起因する多くの欠
点があるが、ｒｈＢＭＰは免疫性の点に問題がなく、臨
床上安定した薬理作用の発現や安全性が期待でき、実用
性の高いものである。従って、ｒｈＢＭＰに適する担体
の開発が望まれていた。また、天然物より抽出された粗
製ＢＭＰと種々の担体の組合せが知られていたが、前記
のように、その中に含まれている複数のタンパク質の相
互作用は解明されておらず、これらの生体内における骨
又は軟骨形成のメカニズムは未だ充分には解明されてい
ない。事実、それら複数のタンパク質の相互作用によ
り、骨又は軟骨形成が増強されるとの報告もある〔前出
のＰｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ
ｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２６７−２
８０（１９８９）；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２
６４，Ｎｏ．３２，ｐｐ．２０８０５−２０８１０（１
９８９）〕。従って、これらの担体を評価する際には、
その中に含まれている複数のタンパク質の相互作用、並
びにそれら複数のタンパク質と担体との相互作用の影響
を考慮する必要があった。一方、ｒｈＢＭＰの場合は単
独で使用するので、天然の状態とは異なり、複数のタン
パク質による骨又は軟骨形成の相互作用を期待すること
ができず、生体内における作用発現の環境が粗製ＢＭＰ
の場合とは異なることが予想された。また、ｒｈＢＭＰ
は担体の物理的及び化学的状態に対して感受性が高く、
担体の性質がその骨又は軟骨誘導作用に大きく影響す
る。従って、粗製ＢＭＰに関する技術をそのままｒｈＢ
ＭＰに適用することはできず、別途ｒｈＢＭＰに適用す
ることのできる担体を開発する必要があった。

【００１０】ところが、驚くべきことに、本発明者は、
生体内移植物質として既に広く用いられ、その安全性が
確認されているコラーゲンを、ｒｈＢＭＰの担体として
用いると、ｒｈＢＭＰによる骨又は軟骨誘導作用を有効
に発現させることのできる生体適用可能な実用性の高い
骨形成用移植体が得られることを見出した。従って、本
発明は、特に担体に起因する免疫性や調製煩雑性の問題
を回避することに成功したものである。本発明はこうし
た知見に基づくものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、コラ
ーゲン抗体が、ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含
有しないヒト骨誘導因子を担持することを特徴とする、
骨形成用移植体に関する。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
移植体は、単体又は集合体として一定の形状を有し、生
体に移植して適用することのできる成形体であって、例
えば、多孔質体、ゲル状体、粘土状体、粒状体あるいは
それらの組合せであることができる。本発明の移植体
は、従来の同種の移植体と同様に、主に生体内で骨（軟
骨を含む）を形成すべき部位に移植して使用する。生体
内に移植すると、移植体内部に未分化細胞が取り込ま
れ、ｒｈＢＭＰの作用によって骨形成過程が進行する。
従って、本発明の移植体は、移植の初期段階において骨
形成を行う場を提供する。続いて、骨形成過程の進行に
伴い、コラーゲン担体が徐々に分解されて消失し、新た
に形成された骨（又は軟骨）と徐々に置き換わる。最後
に、骨形成の完了と共に、あるいは完了後に、移植体そ
れ自体は完全に分解されて消失し、移植当初に移植体が
占めていた空間にほぼ相当する空間は、新たに形成され
た骨（又は軟骨）で完全に置換される。従って、生体へ
の移植手術を１回だけ行えば充分であり、骨形成後の移
植体除去手術を行う必要はない。

【００１３】本発明で使用することのできるヒト骨誘導
因子（ヒトＢＭＰ）は、ヒト由来の他のタンパク質を実
質的に含有しないヒト骨誘導因子であり、遺伝子組換え
技術により製造されたヒトＢＭＰであればいずれでも良
い。すなわち、ヒト骨誘導因子をコードする塩基配列を
含む組換えＤＮＡを含有する形質転換体（細胞又は微生
物）を培養し、それら形質転換体によって産生された組
換えヒト骨誘導因子を単離、精製して調製した組換えヒ
ト骨誘導因子（ｒｈＢＭＰ）である。これらのヒト骨誘
導因子（ｒｈＢＭＰ）としては、例えば、ｒｈＢＭＰ−
２、ｒｈＢＭＰ−１、ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ−４
（ｒｈＢＭＰ−２Ｂともいう）、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈ
ＢＭＰ−６、ｒｈＢＭＰ−７、ｒｈＢＭＰ−８又はこれ
ら以外の組換えヒトＢＭＰ−２様タンパク質を単独で又
は２種以上の混合物として用いることができる。これら
のｒｈＢＭＰは、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細
胞）、微生物（例えば、大腸菌）又は酵母細胞などで発
現したものであることができる。既に大量生産法及び精
製法が確立しているｒｈＢＭＰとしてはｒｈＢＭＰ−２
があるが、その他のｒｈＢＭＰを同様に製造・精製して
用いることはなんらさしつかえない〔Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．２６７−２８０（１９８
９）〕。既に知られている精製ｒｈＢＭＰ−２は、Ｎ末
端アミノ酸配列が異なる複数の単量体からなる成熟ペプ
チド分子量であって、約３０，０００の二量体タンパク
質である。それぞれの単量体は、Ａｓｎ⁵⁶残基にハイ・
マンノース型の糖鎖を有している〔Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｓｉｘｔｈ Ｉｎｔｅｒｒａｃｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９２）〕。

【００１４】本発明で用いるコラーゲン担体は、以下の
（ａ）〜（ｄ）の条件を満たしているものであることが
好ましい。 （ａ）実質的に抗原性の除去されたアテロコラーゲン由
来である。 （ｂ）生体内に移植された際に、生体内の細胞が入り込
める程度の空隙を有する多孔質体である。 （ｃ）本発明の移植体を移植する、骨又は軟骨を形成す
べき部位において、骨又は軟骨形成を生じさせるのに十
分な期間、ｒｈＢＭＰを保持することができる。 （ｄ）新生した骨又は軟骨と置換し、それ自体は消失す
るのに十分な程度の生体内分解性を有する。

【００１５】前記のコラーゲンとしては、抗原性の除去
されたアテロコラーゲン（すなわち、ウシ又はブタな
ど、ヒト以外の動物組織由来のコラーゲンから抗原性の
あるテロペプチドを除去した非抗原性のもの）由来のも
のを用いるのが好ましい。コラーゲン担体が抗原性を有
すると、適用部位に異物反応が生じ、ｒｈＢＭＰによる
骨形成が阻害されることがある。更に好ましくは、可溶
化コラーゲン由来の再構成コラーゲンであって、線維状
又は架橋化線維状コラーゲンからなるコラーゲン担体で
ある。これらは、可溶化処理によって抗原性を除去した
後、再構成され生体内に存在する形に近い線維状に復元
されていることより、生体適合性に優れ、また、ｒｈＢ
ＭＰとの適合性も良好である。

【００１６】移植された移植体における生体内での骨又
は軟骨形成の進行過程は複雑な多段階工程であり、具体
的には、担体への未分化間葉細胞の浸潤、ｒｈＢＭＰと
未分化間葉細胞との接触、担体へのフィブリン及びフィ
ブロネクチンの結合、細胞の移動、繊維芽細胞の増殖、
軟骨細胞への分化、軟骨形成、血管の進入、骨形成など
が多段階的に関与すると言われている。従って、本発明
による移植体においても、これらの各段階に必要な一定
期間、骨又は軟骨形成部位にｒｈＢＭＰを存在させ、し
かもこれらの各段階が好適に進行するための場を提供す
ることが担体の重要な役割である。その骨形成の場とし
ての担体は多孔質状に成形され、多数の空隙を有するの
が好ましい。空隙の大きさは、好ましくは約１μｍ〜１
０００μｍ、より好ましくは約５μｍ〜５００μｍであ
る。空隙の大きさが前記の範囲内にあると、移植体を生
体内に移植した際に、当該担体内部に未分化間葉細胞が
良好に浸潤することができる。前記の多孔質状担体とし
ては、線維構造体、フォーム状体、あるいは粒子連結体
などの担体を挙げることができる。粒子連結体は、粒子
が流動しないように生体分解性の粘着物などで接着する
か、あるいは生体分解性の膜などのカバーで覆って固定
することが必要である。

【００１７】担体中に保持されたｒｈＢＭＰは、生体内
の移植部位において、徐々に放出されてもよいが、少な
くともその一部が、担体上に一定期間保持され、骨形成
の作用を発現することが必要である。また、ｒｈＢＭＰ
による骨又は軟骨の形成作用は、その形成の場を提供す
る担体に沿って発現することが、本発明者の研究によっ
て判明しており、従って、ｒｈＢＭＰを担持した担体が
生体内で移植部位から流動してしまうと、骨又は軟骨が
望ましくない部位や、あるいは望ましくない形状で形成
される恐れがある。従って、本発明による移植体は、骨
又は軟骨形成が期待される部位及び形状で、担体がｒｈ
ＢＭＰを保持することが必要である。好ましくは、本発
明の移植体は、生体内に移植された際に、当該適用部位
において骨又は軟骨形成を生じさせるのに十分な期間、
ｒｈＢＭＰを一定形状に保持できるように成形されたも
のである。また、上記条件を満たす範囲において、生体
の動きに適応して担体が一定の柔軟性又は可撓性を有す
ることは適用部位への密着性の点で有利である。

【００１８】上記の骨又は軟骨形成を生じさせるのに十
分な期間とは、前述の様にｒｈＢＭＰが関与する骨又は
軟骨形成の工程が進行するのに必要とされる期間であっ
て、その適用部位、形成を必要とする骨又は軟骨の種
類、その量、形状などにより異なるが、ｒｈＢＭＰ、特
にｒｈＢＭＰ−２の作用を十分に発現させる期間は数日
〜数週間である。

【００１９】骨又は軟骨を形成すべき部位に移植された
移植体は、ｒｈＢＭＰによって誘導された骨又は軟骨形
成の進行と共に、形成された骨又は軟骨と置き換わるよ
うに生体内で徐々に分解・吸収されて消失し、最終的に
は新生の骨又は軟骨と全体的に置換されることが好まし
い。すなわち、本発明の移植体は、目的の部位に骨又は
軟骨が形成される迄の一時的な足場として作用し、生体
内で徐々に分解・吸収される。この分解の速度は骨又は
軟骨形成の速度との関連で決められる。ｒｈＢＭＰ、特
にｒｈＢＭＰ−２の場合、移植体が完全に分解・吸収さ
れるまでの期間は、好ましくは少なくとも１週間以上、
更に好ましくは２週間以上である。分解が早すぎると好
ましい骨又は軟骨形成が十分に達成されない恐れがあ
る。一方、分解が遅すぎると骨又は軟骨形成が遅れる可
能性がある。

【００２０】一般に使用されているコラーゲンは生体内
分解速度が比較的早く、１週間程度で分解されるものが
多い。本発明に用いるコラーゲンとしては、適応部位に
よっては、これらの一般的なコラーゲンを用いることも
できるが、好ましくは更に生体分解性を遅らせたもので
ある。移植体として１週間以上、更に好ましくは２週間
以上に渡り生体内に骨形成の足場として残存し、徐々に
分解・吸収されるものが好ましい。コラーゲン担体とし
て、可溶化コラーゲンから線維状に再構成したコラーゲ
ンを用いる場合は、線維の太さを調整することにより前
記の分解速度を遅らせ、また、その線維状コラーゲンに
架橋を導入することにより、分解速度を更に遅らせるこ
とができ、ｒｈＢＭＰに適する分解速度を有する好適な
担体を得ることができる。例えば、本発明の一態様であ
るｒｈＢＭＰ−２とコラーゲン膜からなる歯周疾患によ
る歯槽骨の欠損の再生用移植体の場合では、数日から数
週間程度、好ましくは２〜５週間程度で徐々に分解吸収
される再構成線維状コラーゲン又は架橋化再構成線維状
コラーゲンを担体として用いるのが好ましい。

【００２１】本発明では、上記条件を満たすものであれ
ばいずれのコラーゲン担体を用いることもでき、これら
のコラーゲン担体は当業者に公知の方法によって製造す
ることができる。コラーゲン担体の形状は特に限定され
ない。上記条件を満たす範囲で任意の形状に成形するこ
とができる。好ましい形状としては、フィルム又はシー
ト状、布状、綿状、スポンジ状、板状、棒状、粒子状あ
るいはこれらの組み合わせが挙げられる。他の生体適合
性成分と組み合わせて粘土状あるいはゲル状にすること
もできる。例えば、再構成線維状又は架橋化再構成線維
状コラーゲンを、適宜当業者に公知の方法によって上記
の形状に加工して用いることができる。例えば、前記の
架橋化再構成線維状コラーゲン膜は、日本歯周病学会会
誌第３３巻４号第８６４−８７１頁又は特開平２−１５
６９５４号公報等に記載の方法によって調製することが
できる。

【００２２】本発明による骨形成用移植体は、例えば、
コラーゲン担体へｒｈＢＭＰを添加することによって調
製することができる。この添加方法に特に制限はなく、
例えば、ｒｈＢＭＰ含有液による浸漬、含浸、噴霧、塗
布、滴下などの方法を用いることができるが、ｒｈＢＭ
Ｐの活性を失わせることなく、担体にほぼ均一に分散さ
せることができる方法が好ましい。例えば、各種の乾燥
されたコラーゲン担体に、適当な液体に溶解あるいは懸
濁されたｒｈＢＭＰ溶液（又は懸濁液）を添加し、続い
て乾燥（好ましくは凍結乾燥）して、所望の移植体を得
ることができる。

【００２３】また、移植体の使用時に、コラーゲン担体
にｒｈＢＭＰ溶液（又は懸濁液）を添加し、そのまま移
植に用いることもできる。この場合、生体適用可能な溶
媒を用いることが必要である。また、コラーゲン担体か
らｒｈＢＭＰ含有液が容易に流れ出ることは好ましくな
いので、例えば、粘性又は接着性を有する生体適合性の
補助剤を用いてｒｈＢＭＰを担体中に適度に吸着させ
て、担持を強化し、ｒｈＢＭＰを保持するのが好まし
い。また、コラーゲン担体を製造する任意の工程で、コ
ラーゲン材料にｒｈＢＭＰを添加し、ｒｈＢＭＰ含有コ
ラーゲン材料から所望の移植体を成形することもでき
る。好ましくは、成形過程のコラーゲン担体に一定量の
ｒｈＢＭＰを添加し、凍結乾燥などの乾燥方法で乾燥し
て所望の移植体を得る。

【００２４】コラーゲン担体へのｒｈＢＭＰの担持量
は、コラーゲン担体の形状、適用部位、適用量、好まし
い骨形成の速度などの種々の要因を考慮して適宜決定す
ることができる。例えば、本発明の一態様であるｒｈＢ
ＭＰ−２とコラーゲン膜からなる歯周疾患による歯槽骨
の欠損の再生用移植体の場合では、ｒｈＢＭＰ−２の量
は、０．０１〜１０００μｇ／１ｍｇコラーゲン担体
（乾燥時）、好ましくは１〜１００μｇ／１ｍｇ程度で
ある。本発明の移植体は、ｒｈＢＭＰとコラーゲン担体
以外の成分を含んでいることができる。それらの所望成
分としては、具体的には、安定化剤、保存剤、増粘剤、
可溶化剤などを挙げることができる。また、骨又は軟骨
形成に有用な追加成分、例えば、リン酸カルシウム、ヒ
ドロキシアパタイトなどのミネラル成分、骨又は軟骨形
成補助因子などの作用促進成分、フィブロネクチン、オ
ステオネクチン、非抗原性のＩＢＭ（不溶性骨マトリッ
クス）などを含むこともできる。

【００２５】こうして製造された移植体は、適用部位に
合わせて適当な形状に切断され、骨又は軟骨形成が必要
とされる部位に移植される。適用部位に合わせて担体を
適当な形状に成形又は切断した後にｒｈＢＭＰを添加し
てもよい。粒子状のコラーゲン担体にｒｈＢＭＰを吸着
させた移植体の場合には、その適量を患部に移植し、そ
れらの周りにコラーゲン膜などのカバーを施して使用す
るのが好ましい。本発明の移植体は、形成すべき骨又は
軟骨の形状にほぼ相当する形状に成形して、目的の部位
に移植するのが特に好ましい。また、本発明の好適な一
態様である歯科領域用移植体においては、歯槽骨あるい
はセメント質の破壊された部分に適用しやすいフィルム
又はシート状、スポンジ状あるいは粒状担体を膜で覆っ
た形状の移植体などが好ましい。

【００２６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものでは
ない。実施例１ （１）コラーゲン膜の調製 ウシ真皮由来コラーゲンをペプシンで処理し、凍結乾燥
して調製したアテロコラーゲンを、０．１Ｍ酢酸溶液に
溶解して０．３％溶液とし、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて中
性透析を行った。更に、０．０２ＭＮａ₂ ＨＰＯ₄ （＞
ｐＨ８）によるアルカリ透析を行い、遠沈によりアルカ
リ可溶性成分を除去した。エタノールを加え、吸引濾過
器にてテフロン膜上に線維を圧縮固定し、エタノールを
加えて完全に脱水した。１０％ヘキサメチレンジイソシ
アネート（ＨＭＤＩＣ）エタノール溶液中に浸潤し、室
温で２時間以上放置して架橋を導入した後、エタノール
及び水で洗浄し、凍結乾燥した。

【００２７】（２）ｒｈＢＭＰ−２を配合した骨形成用
移植体の製造 ｒｈＢＭＰ−２〔Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，ｐ
ｐ．２６７−２８０（１９８９）に記載の方法で製造；
山之内製薬（株）製〕１２．５μｇをＰＢＳ２５μｌに
溶解し、上記（１）で調製したコラーゲン膜〔０．５ｍ
ｍ×４．０ｍｍに切断したもの（平均重量０．１３ｍ
ｇ）〕上にオートマイクロピペットを用いて（ａ）５μ
ｌ（ｒｈＢＭＰ−２＝２．５μｇ）、又は（ｂ）１０μ
ｌ（ｒｈＢＭＰ−２＝５．０μｇ）を滴下し、凍結乾燥
した。こうして得られた移植体は、使用直前まで−７０
℃にて保管した。

【００２８】実施例２ （１）コラーゲン膜の調製 ウシ真皮由来コラーゲンをペプシンで処理し、凍結乾燥
して調製したアテロコラーゲンを、０．１Ｍ酢酸溶液に
溶解して０．３％溶液とし、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて中
性透析を行った。冷却下に中性緩衝液を添加してコラー
ゲン溶液を１／１００に希釈した後、穏やかに撹拌し、
十分均一にした。その後３７℃で１日放置した。吸引濾
過器に１００ｍｅｓｈステンレス網をセットしてコラー
ゲン線維を膜上に凝集させた。ＮａＢＨ₄ （コラーゲン
量の１／３０以上）を少量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミドに溶解した溶液を、前記の膜状コラーゲンに添加し
て架橋させた後、水で洗浄し、凍結乾燥した。 （２）ｒｈＢＭＰ−２を配合した骨形成用移植体の製造 前記の実施例２（１）で調製した架橋化コラーゲン膜を
用いること以外は、前記実施例１（２）と同様にして、
ｒｈＢＭＰ−２を配合した移植体を得た。

【００２９】薬理試験例：骨形成用移植体の移植による
骨形成 （１）試験方法 １２週令のＷｉｓｔｅｒ系雄性ラット（平均体重４００
ｇ）の口蓋部の粘膜骨膜弁を、全身麻酔下〔ネンブター
ル（大日本製薬（株）製）注２．５ｇ／Ｖ〕にて剥離
し、翻転して口蓋部を露出させた後、各群３匹のラット
に対して以下の処理を行った。 （ａ）右側の口蓋溝部に何も移植しない（コントロール
−１）； （ｂ）右側の口蓋溝部に実施例１（１）で調製したコラ
ーゲン膜（ｒｈＢＭＰ−２不含）を移植（コントロール
−２）； （ｃ）左側の口蓋溝部に実施例１（２）（ａ）で調製し
た移植体（ｒｈＢＭＰ−２を２．５μｇ配合）を移植； （ｄ）左側の口蓋溝部に実施例１（２）（ｂ）で調製し
た移植体（ｒｈＢＭＰ−２を５．０μｇ配合）を移植。 なお、上記のコラーゲン膜としては、全て、平均重量が
０．１３ｍｇで、大きさが０．５ｍｍ×４．０ｍｍのも
のを使用した。移植後、弁を戻して縫合した。３週間後
に屠殺し、１０％中性（ｐＨ７．２）リン酸緩衝（０．
１Ｍ）ホルマリン液にて固定した後、脱灰処理（Ｐｌａ
ｎｋ−Ｒｙｃｈｌｏ法）した。パラフィン包埋を行った
後、４μｍに薄切し、ヘマトキシリン−エオジン重染色
を行ってから、光学顕微鏡にて観察した。

【００３０】（２）結果 （ａ）何も移植しなかった部位（コントロール−１）：
骨の変化はなく、動静脈及び神経にも変化はなかった。 （ｂ）ｒｈＢＭＰ−２を含まないコラーゲン膜のみを移
植した部位（コントロール−２）： 骨の変化はなく、膜の周囲より著明な細胞浸潤が見ら
れ、それに伴うコラーゲン線維の吸収が担体の周囲に認
められたが、中心部にコラーゲン線維は残存していた。 （ｃ）ｒｈＢＭＰ−２（２．５μｇ）配合コラーゲン膜
を移植した部位：標本３例中の１例で、コラーゲン膜の
周囲に骨の形成が認められ、動静脈及び神経が外側に押
し出されるように転移していた。また、形成された骨の
一部は母床骨と連続していることが認められ、更に、残
存する担体のコラーゲン線維に連続するように骨形成が
生じていることも認められた。また、残存したコラーゲ
ン線維間への細胞の浸潤は少なく、多核巨細胞、リンパ
球、白血球などの炎症性細胞はあまり認められなかっ
た。 （ｄ）ｒｈＢＭＰ−２（５．０μｇ）配合コラーゲン膜
を移植した部位：標本全部（３例中３例）に骨の形成が
認められた。コラーゲン線維は残存しており、一部に前
記（ｃ）と同様に線維に連続するように骨が形成してい
ることが認められた。前記（ｃ）に比べ新生した骨の量
は多く、母床骨と連続し、膜を囲むような骨の形成が認
められた。炎症反応は前記（ｃ）と同様に低かった。

【００３１】これらの結果より、ｒｈＢＭＰ−２を配合
したコラーゲン膜は起炎性が低く（炎症性の細胞の浸潤
が殆ど認められない）、生体親和性が非常に高いことが
分かる。また、口蓋部骨膜下において骨形成を誘導する
作用を有することが確認された。更に、ｒｈＢＭＰ−２
の骨形成作用は濃度に依存して増加することも分かる。

【００３２】

【発明の効果】本発明の移植体は、外傷、疾病又は先天
性の欠陥などによって引き起こされた各種の骨又は軟骨
の欠損を修復するために、当該分野に知られた方法で患
部に適用することができる。本発明移植体は生体内に移
植された際に、起炎性が低く生体適合性に優れている。
また、新生される骨と生体内の既存の骨との連続性も良
好であり、自然に近い状態で骨又は軟骨の修復が可能に
なる。更に、生体内で分解され、新生される骨と移植体
それ自体が置き換わるので、移植体の除去手術を行う必
要がない。本発明移植体は、各種の分野に適用すること
ができ、例えば、骨折などの外傷、腫瘍などの疾患に伴
う骨又は軟骨の欠損部位の修復、各種骨折の治癒促進、
人工関節、人工骨などの人工材料周囲への骨の再生、成
形外科分野における骨の補填、軟骨の再生、関節の再建
などの他、特に歯科領域での骨又は軟骨の修復に好適で
ある。例えば、歯周疾患、抜歯やその他の事故などによ
って破壊あるいは縮退した歯周組織、歯槽骨、セメント
質、歯根膜などの修復、吸収された顎堤の再建、歯科イ
ンプラント周囲での骨の再生、歯内療法における根管充
填剤としての使用、直接歯髄覆髄法への使用などを挙げ
ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪ 8314−4Ｃ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コラーゲン担体が、ヒト由来の他のタン
   パク質を実質的に含有しないヒト骨誘導因子を担持する
   ことを特徴とする、骨形成用移植体。
2. 【請求項２】 コラーゲン担体がアテロコラーゲンから
   なる請求項１記載の骨形成用移植体。
3. 【請求項３】 コラーゲン担体が可溶化コラーゲンの再
   構成コラーゲンからなる請求項２に記載の骨形成用移植
   体。
4. 【請求項４】 コラーゲン担体が可溶化コラーゲンの架
   橋化再構成線維状コラーゲンからなる請求項３記載の骨
   形成用移植体。
5. 【請求項５】 生体内に移植された際に、生体内の細胞
   が入り込める空隙を有する請求項１〜４のいずれか一項
   に記載の骨形成用移植体。
6. 【請求項６】 生体内の移植部位において骨形成を生じ
   させるのに十分な期間、一定形状を保持して前記のヒト
   骨誘導因子を担持する請求項１〜５のいずれか一項に記
   載の骨形成用移植体。
7. 【請求項７】 ヒト由来の他のタンパク質を実質的に含
   有しないヒト骨誘導因子が、ヒト骨誘導因子をコードす
   る塩基配列を含む組換えＤＮＡを含有する形質転換体に
   よって産生された組換えヒト骨誘導因子（ｒｈＢＭＰ）
   である請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨形成用移
   植体。
8. 【請求項８】 前記の組換えヒト骨誘導因子（ｒｈＢＭ
   Ｐ）が、ｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ
   −４、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈＢＭＰ−６、ｒｈＢＭＰ−
   ７、ｒｈＢＭＰ−８及びこれら以外の組換えヒトＢＭＰ
   −２様タンパク質からなる群から選んだ１種又は２種以
   上のｒｈＢＭＰである請求項７記載の骨形成用移植体。
9. 【請求項９】 前記のｒｈＢＭＰがｒｈＢＭＰ−２であ
   る請求項８記載の骨形成用移植体。
10. 【請求項１０】 歯科用である請求項１〜９のいずれか
    一項に記載の骨形成用移植体。
11. 【請求項１１】 歯槽骨又はセメント質の修復用である
    請求項１０記載の骨形成用移植体。