DE102005035434A1

DE102005035434A1 - Zellkulturträger, Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern und Verfahren zur Zellkultivierung

Info

Publication number: DE102005035434A1
Application number: DE102005035434A
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi Ishikawa; Ken Sugo
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2004-07-28
Filing date: 2005-07-28
Publication date: 2006-03-23
Also published as: US20060024823A1; GB0515585D0; FR2874219A1; GB2416777A; JP2006034200A

Abstract

Beschrieben sind Zellkulturträger, auf denen Zellen effizient anhaften und wachsen und von denen die gewachsenen Zellen einfach gelöst werden, können, ein Verfahren zum einfachen und zuverlässigen Herstellen solcher Zellkulturträger sowie ein Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung solcher Zellkulturträger. Die Zellkulturträger enthalten jeweils ein körniges Grundmaterial und eine Deckschicht, die die Oberfläche des Grundmaterials abdeckt. Die Deckschicht besteht hauptsächlich aus einem Calciumphosphat-basierten Apatit, bei dem ein Teil des Calciums fehlt. Solche Zellkulturträger werden in Zellkulturen verwendet, in denen die Zellen auf den Oberflächen der Zellkulturträger haften und dort wachsen. Insbesondere werden diese Zellkulturträger in dreidimensionalen Kulturen hoher Dichte (Suspensionskulturen) verwendet. Der Ca-Mangel in dem Calciumphosphat-basierten Apatit liegt vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 30 Mol-%.

Description

Die Erfindung betrifft einen Zellkulturträger, ein Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern sowie ein Verfahren zur Zellkultivierung, insbesondere ein Verfahren zur Zellkultivierung unter Verwendung der genannten Zellkulturträger.

In den vergangenen Jahren ist die Zellkulturtechnologie auf verschiedenen Gebieten der Industrie und Forschung zur Anwendung gekommen, z.B. in der Herstellung von Zellgewebe, in Sicherheitstests von Arzneimitteln, in der Herstellung von Proteinen zu Behandlungs- oder Diagnosezwecken und dergleichen.

Um eine große Zahl von verankerungsabhängigen oder sessilen Zellen effizient zu kultivieren, werden seit kurzem dreidimensionale Kulturen hoher Dichte (Suspensionskulturen) anstelle der üblicherweise eingesetzten Plattenkulturen verwendet. Während bei der Plattenkultivierung mit einer Kulturflasche gearbeitet wird, wird bei der Suspensionskultivierung eine Vielzahl von Trägern verwendet, die gleichsam ein Gerüst bilden, auf dem die Zellen kultiviert werden.

In einer solchen dreidimensionalen Kultur hoher Dichte kommen verschiedenartige Zellkulturträger zur Anwendung, die beispielsweise aus Polystyrol, Diethylaminoethyl-(DEAE)-Cellulose, Polyacrylamid und dergleichen bestehen.

Abhängig von der Art der zu kultivierenden Zelle oder von den Kultivierungsbedingungen kommt es jedoch vor, dass die Zellen an diesen Trägern nur schwer haften oder, wenn sie auf den Trägern haften, auf diesen nur schwer wachsen.

Deshalb wurden kürzlich Zellkulturträger vorgeschlagen, deren Grundmaterial mit Hydroxylapatit überzogen ist (vgl. US-Patentveröffentlichung Nr.2003-162281).

Da Zellen die Eigenschaft haben, an Calcium zu haften, kann so eine effiziente Anhaftung der Zellen an den oben beschriebenen Zellkulturträgern erzielt werden.

Jedoch besteht bei diesen Zellkulturträgern das Problem, dass die Zellen, die auf den Oberflächen der Zellkulturträger gewachsen sind, nur schwer von den Trägern zu lösen sind. Außerdem besteht das Problem, dass die Zellwachstumsgeschwindigkeit vergleichsweise gering ist.

Aufgabe der Erfindung ist es, Zellkulturträger anzugeben, auf denen die Zellen effizient haften und wachsen und von denen die gewachsenen Zellen einfach entfernt oder gelöst werden können. Ferner ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren anzugeben, nach dem die Zellkulturträger einfach und zuverlässig hergestellt werden können. Schließlich ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen unter Verwendung der genannten Zellkulturträger anzugeben.

Die Erfindung löst diese Aufgaben durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung ist gerichtet auf Zellkulturträger, die jeweils eine Oberfläche haben, auf der Zellen anhaften und wachsen, wobei zumindest ein Teil der Oberfläche einschließlich eines oberflächennahen Bereichs hauptsächlich aus einem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit besteht, bei dem ein Teil des Ca fehlt.

Diese Zellkulturträger ermöglichen es, dass Zellen effizient auf ihnen anhaften und dort in ausreichendem Maße wachsen. Auch können die gewachsenen Zellen leicht von den Zellkulturträgern entfernt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Zellkulturträger beträgt der Ca-Mangel des Calciumphosphat-basierten Apatits 1 bis 30 Mol-%.

Dadurch können die Zellen noch effizienter an den Zellkulturträgern haften und dort wachsen. Auch können die gewachsenen Zellen noch leichter von den Zellkulturträgern entfernt werden.

Vorzugsweise liegt die Dichte des Zellkulturträgers im Bereich von 1,01 bis 1,5 g/cm3.

Dadurch können die Zellkulturträger noch gleichmäßiger in einer Kulturlösung suspendiert werden, wodurch die Zellen noch effizienter an den Zellkulturträgern haften können.

Vorzugsweise weisen die Zellkulturträger jeweils Teilchenform auf.

Durch diese Form der Zellkulturträger können die Zellen gleichemäßig auf den Zellkulturträgern haften und noch effizienter auf deren Oberflächen wachsen. Außerdem können die Zellkulturträger mit ihrer körnigen Gestalt noch gleichmäßiger in einer Kulturlösung suspendiert werden. Für die Zellkulturträger stehen deshalb mehr Möglichkeiten zur Verfügung, mit den Zellen in Kontakt zu treten, so dass letztere noch effizienter an den Zellkulturträgern anhaften können.

Vorzugsweise liegt die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger im Bereich von 10 bis 2000 μm.

Da die Oberfläche des jeweiligen Zellkulturträgers bezogen auf die Größe einer einzelnen Zelle ausreichend groß ist, können die Zellen gut an der Oberfläche des Zellkulturträgers anhaften und dort wachsen.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung besteht der Calciumphosphat-basierte, Ca-arme Apatit hauptsächlich aus Hydroxylapatit, dem ein Teil des Ca fehlt.

Da Hydroxylapatit als Biomaterial verwendet wird, können die Zellen ohne eine Gefahr der Schädigung mit hoher Effizienz auf dem Hydroxylapatit anhaften. Da auch Ca-armer Hydroxylapatit diese Eigenschaften aufweist, ist er zur Verwendung als erfindungsgemäßer Calciumphosphat-basierter Apatit, dem ein Teil des Ca fehlt, besonders geeignet.

Vorzugsweise enthält der Zellkulturträger ein Grundmaterial, das eine Oberfläche und eine diese Oberfläche bedeckende Deckschicht hat, die hauptsächlich aus dem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit besteht.

Form, Größe und physikalische Eigenschaften (z.B. Dichte) des Zellkulturträgers können geeignet eingestellt werden, indem Form, Größe und physikalische Eigenschaften des Grundmaterials entsprechend gewählt werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung besteht das Grundmaterial hauptsächlich aus einem Harzmaterial.

Dadurch lassen sich Form, Größe und physikalische Eigenschaften (z.B. spezifisches Gewicht) der Zellkulturträger noch einfacher einstellen.

Vorteilhaft besteht das Harzmaterial hauptsächlich aus Polyamid und/oder Epoxyharz.

Indem ein solches Grundmaterial, das hauptsächlich aus Polyamid und/oder Epoxyharz besteht, verwendet wird, erzielt man folgende Wirkungen. Da die Dichte (spezifisches Gewicht) des vorstehend genannten Materials der Dichte von Wasser nahe kommt, kann entsprechend die Dichte des Zellkulturträgers auf einen Wert eingestellt werden, der der Dichte von Wasser nahe kommt. Ferner können solche Zellkulturträger, deren Dichte der Dichte von Wasser nahe kommt, durch sanftes Rühren gleichmäßig in einer Kulturlösung verteilt werden. Außerdem hat das vorstehend genannte Material ein hohes Haftvermögen gegenüber dem Ca-armen Apatit, so dass die Oberfläche des Grundmaterials zuverlässig mit dem Ca-armen Apatit überzogen werden kann. Außerdem hat obiges Material eine ausgezeichnete Wärmebeständigkeit, so dass man entsprechend Zellkulturträger mit hoher Wärmebeständigkeit erhält. Solche Zellkulturträger können vor Beginn der Zellkultivierung einer Autoklavsterilisation unterzogen werden.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung enthält das Grundmaterial ein magnetisches Material.

Bei dieser Abwandlung können die Zellkulturträger in einer Kulturlösung bewegt werden, wenn an diese ein Magnetfeld angelegt wird. Dadurch kann die Kulturlösung durch die Zellkulturträger selbst gerührt werden. Dieses Rühren der Kulturlösung durch die Zellkulturträger selbst ist gleichmäßiger und sanfter als das Rühren mittels eines Rührankers. Die Zellen können deshalb leicht an den Oberflächen der Zellkulturträger anhaften. Auch wird vermieden, dass sich die Zellen infolge einer Kollision zwischen den Zellkulturträgern von letzteren lösen. Da die Zellen außerdem noch gleichmäßiger mit Nahrung versorgt werden, wachsen sie effizienter.

Die Erfindung ist ferner auf Zellkulturträger gerichtet, die jeweils eine Oberfläche zur Anhaftung von Zellen haben, die auf der Oberfläche wachsen, wobei zumindest ein Teil der Oberfläche einschließlich eines oberflächennahen Bereichs hauptsächlich aus einem Apatit besteht, bei dem ein Teil seines zweiwertigen Elementes fehlt.

Auch diese Zellkulturträger ermöglichen es, dass Zellen effizient an ihnen anhaften und dort in ausreichendem Maße wachsen und dass die gewachsenen Zellen leicht von den Zellkulturträgern entfernt werden können.

Ferner ist die Erfindung gerichtet auf ein Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 1. Dieses Herstellungsverfahren umfasst einen ersten Schritt, in dem eine Masse zubereitet wird, die Calciumphosphat-basierten Apatit und Phosphorsäure enthält; einen zweiten Schritt, in dem die Masse zu Pulver getrocknet wird; und einen dritten Schritt, in dem das Pulver zu einem Sinterpulver gesintert wird, das hauptsächlich aus dem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit besteht, indem der Calciumphosphat-basierte Apatit und die Phosphorsäure in dem Pulver unter Beibehaltung der Apatitstruktur zu dem Ca-armen, Calciumphosphat-basierten Apatit reagieren.

Mit diesem Herstellungsverfahren können einfach und zuverlässig Zellkulturträger hergestellt werden, die eine effiziente Zellanhaftung und ein ausreichendes Zellwachstum ermöglichen und die es zudem gestatten, die gewachsenen Zellen von den Zellkulturträgern zu entfernen.

Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 7 gerichtet. Dieses Herstellungsverfahren umfasst einen ersten Schritt, in dem eine Masse zubereitet wird, die Calciumphosphat-basierten Apatit und Phosphorsäure enthält; einen zweiten Schritt, in dem die Masse zu Pulver getrocknet wird; einen dritten Schritt, in dem das Pulver zu Sinterpulver gesintert wird, das hauptsächlich aus Calciumphosphat-basiertem, Ca-armen Apatit besteht, indem der Calciumphosphat-basierte Apatit und die Phosphorsäure in dem Pulver unter Beibehaltung der Apatitstruktur zu dem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit reagieren, in dem ein Grundmaterial mit dem Sinterpulver überzogen wird.

Dieses Verfahren gestattet es, einfach und zuverlässig Zellkulturträger herzustellen, die eine effiziente Zellanhaftung und ein ausreichendes Zeltwachstum gewährleisten und die es zudem ermöglichen, die auf den Zellkulturträgern gewach senen Zellen einfach zu entfernen. Form, Größe und physikalische Eigenschaften (z.B. Dichte) dieser Zellkulturträger können einfach eingestellt werden, indem Form, Größe und physikalische Eigenschaften des Grundmaterials geeignet gewählt werden.

In dem oben beschriebenen Herstellungsverfahren liegt in dem ersten Schritt das molare Mischverhältnis von Calciumphosphat-basiertem Apatit zu Phosphorsäure vorzugsweise im Bereich von 6:1 bis 1:1.

Dies ermöglicht eine noch effizientere Zellanhaftung und ein noch besseres Zeltwachstum auf den Zellkulturträgern. Außerdem können die gewachsenen Zellen noch einfacher von den Zellkulturträgern entfernt werden.

Vorzugsweise ist in dem oben beschriebenen Herstellungsverfahren die Sintertemperatur in dem dritten Schritt gleich oder kleiner als 1000°C.

Dadurch ist es möglich, das Calciumphosphat-basierte Apatit, in dem ein Teil des Ca fehlt, noch zuverlässiger herzustellen.

Vorzugsweise ist die Sinterzeit in dem dritten Schritt 0,1 bis 10 Stunden.

Auch dadurch kann das Calciumphosphat-basierte Apatit, in dem ein Teil des Ca fehlt, noch zuverlässiger hergestellt werden.

Vorzugsweise wird das Sintern in dem dritten Schritt in atmosphärischer Luft durchgeführt.

Dies gestattet eine effiziente Herstellung des Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatits zu moderaten Herstellungskosten.

Ferner ist die Erfindung auf ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen gerichtet, bei dem die oben beschriebenen Zellkulturträger verwendet werden.

Dieses Zellkultivierungsverfahren ermöglicht es, dass die Zellen effizient auf den Oberflächen der Zellkulturträger wachsen.

Die Erfindung ist ferner auf ein Verfahren zum Kultivieren von Zellen gerichtet, bei dem in einer Kulturlösung, die die oben beschriebenen Zellkulturträger sowie Zellen enthält, die Zellen in Kontakt mit den Zellkulturträgern gebracht werden, so dass die Zellen an den Oberflächen der Zellkulturträger anhaften und dort wachsen.

Bei diesem Zellkultivierungsverfahren können die Zellen effizient auf den Oberflächen der Zellkulturträger wachsen.

Außerdem können bei diesem Zellkultivierungsverfahren die auf den Zellkulturträgern gewachsenen Zellen leicht entfernt und zu verschiedenen Zwecken genutzt werden.

Die Erfindung wird im Folgenden an Hand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
1 einen Querschnitt eines ersten Ausführungsbeispiels eines Zellkulturträgers nach der Erfindung,
2 einen Querschnitt eines zweiten Ausführungsbeispiels des Zellkulturträgers nach der Erfindung,
3 einen Graphen, der das Röntgenbeugungsmuster eines bei 700° C gesinterten Sinterpulvers zeigt,
4 einen Graphen, der das Röntgenbeugungsmuster eines bei 1100° C gesinterten Sinterpulvers zeigt,
5 einen Graphen, der das Röntgenbeugungsmuster eines bei 1200° C gesinterten Sinterpulvers zeigt, und
6 eine schematische, perspektivische Darstellung einer Zellkultivierungseinrichtung nach der Erfindung.
Im Folgenden werden Zellkulturträger, ein Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern sowie ein Verfahren zur Zellkultivierung nach der Erfindung an Hand von bevorzugten Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben.
Erstes Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird zunächst ein erstes Ausführungsbeispiel der Zellkulturträger nach der Erfindung beschrieben.
1 zeigt einen Querschnitt des ersten Ausführungsbeispiels des Zellkulturträgers nach der Erfindung.
Der in 1 mit 1 bezeichnete Zellkulturträger enthält ein Grund- oder Trägermaterial 2, das hauptsächlich aus einem Harzmaterial besteht, und eine Deckschicht 3, die die Oberfläche des Grundmaterials 2 bedeckt. Die Deckschicht 3 besteht hauptsächlich aus Calciumphosphat-basiertem Apatit, in dem ein Teil des Calciums fehlt (im Folgenden als „Ca-armes Apatit" bezeichnet).
Der Zellkulturträger 1 wird in einer Zellkultur verwendet, in der es Zellen ermöglicht wird, auf den Oberflächen des Zellkulturträgers 1 zu haften und dort zu wachsen, insbesondere in einer dreidimensionalen Kultur hoher Dichte (Suspensionskultur).
Beispiele für solche dreidimensionalen Kulturen hoher Dichte sind Mikroträgerkulturen, Schleuderkulturen, Rundschüttlerkulturen, Rotationskulturen und dergleichen. Von diesen Verfahren ist es die Mikroträgerkultur, in der der Zellkulturträger 1 vorzugsweise eingesetzt wird. So ermöglicht es die Mikroträgerkultur, eine große Menge an Zellen höchst effizient zu kultivieren.
Der Zellkulturträger 1 weist eine körnige (im Wesentlichen sphärische) Form auf, da auch sein Basismaterial 2 eine körnige (nach 1 im Wesentlichen sphärische) Form hat. Der so geformte Zellkulturträger 1 ermöglicht es, dass Zellen gleichmäßig auf seiner Oberfläche haften und dort noch effizienter als bisher haften. Die körnigen Zellkulturträger können auch noch gleichmäßiger in einer Kulturlösung suspendiert werden. Dadurch nehmen die Kontaktmöglichkeiten zwischen den Zellkulturträgern 1 und den Zellen zu, so dass die Zellen noch effizienter auf den Zellkulturträgern 1 wachsen.
Die Größe des Zellkulturträgers 1 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Setzt man die maximale Länge einer Zelle, die an dem Zellkulturträger 1 haften soll, mit L1 (μm) und die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1 mit L2 (μm) an, so liegt L2/L1 vorzugsweise im Bereich von etwa 2 bis 100, insbesondere bei etwa 5 bis 50.
L2 liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 2000 μm, vorzugsweise im Bereich von etwa 50 bis 1000 μm und noch besser im Bereich von etwa 100 bis 300 μm.
Indem L2/L1 auf einen Wert innerhalb des oben genannten Bereichs eingestellt wird, kann die Oberfläche des jeweiligen Zellkulturträgers 1 bezogen auf die Größe der Zelle ausreichend groß gehalten werden, wodurch die Zellen noch leichter an den Oberflächen der Zellkulturträger 1 haften und dort wachsen. Ist die mittlere Größe der Zellkulturträger 1 zu klein, so besteht die Tendenz, dass nicht nur die Zellen nicht effizient genug an den Zellkulturträgern 1 haften, sondern dass zudem zwischen den Zellkulturträgern 1 eine Agglutination oder Verklumpung auftritt. Ist dagegen die mittlere Teilchengröße der Zellkulturträger 1 zu groß, so wird die Sinkgeschwindigkeit der Zellkulturträger 1 in einer Kulturlösung so hoch, dass die Rührgeschwindigkeit während der Zellkultivierung entsprechend erhöht werden muss. In diesem Fall besteht die Gefahr, dass die Zellkulturträger 1 miteinander kollidieren. Demzufolge können die Zellen, die an den Oberflächen der Zellkulturträger 1 haften, beschädigt werden.
Vorzugsweise liegt die Dichte des jeweiligen Zellkulturträgers 1 in der Nähe der von Wasser, um die Zellkulturträger 1 gleichmäßiger in einer Kulturlösung suspendieren zu können. Vorzugsweise liegt die Dichte des jeweiligen Zellkulturträgers 1 im Bereich von etwa 1,01 bis 1,5 g/cm3, noch besser im Bereich von etwa 1,02 bis 1,2 g/cm3. Indem die Dichte der Zellkulturträger 1 auf einen Wert innerhalb des oben genannten Bereichs eingestellt wird, ist es möglich, die Zellkulturträger 1 gleichmäßiger in einer Kulturlösung zu suspendieren, wodurch die Zellen noch effizienter an den Zellkulturträgern 1 haften können.
Form, Größe (mittlere Teilchengröße oder dergleichen) sowie physikalische Eigenschaften (Dichte und dergleichen) des Zellkulturträgers 1 können festgelegt werden, indem Form, Größe und physikalische Eigenschaften des Grundmaterials 2 geeignet eingestellt werden.
Beispielsweise kann die Dichte des Zellkulturträgers 1 eingestellt werden, indem das Material, das das Grundmaterial 2 bildet, und dessen Form (z.B. porös, hohl und dergleichen) geeignet gewählt werden.
Das Grundmaterial 2 besteht hauptsächlich aus einem Harzmaterial. Dies erleichtert es, Form, Größe und Eigenschaften (z.B. spezifisches Gewicht) des Zellkulturträgers 1 einzustellen.
Beim Fertigen der Zellkulturträger 1, die die oben genannte mittlere Teilchengröße aufweisen, liegt die mittlere Teilchengröße des Grundmaterials 2 vorzugsweise im Bereich von etwa 10 bis 2000 μm, besser im Bereich von etwa 50 bis 500 μm und noch besser im Bereich von etwa 100 bis 300 μm.
Beim Herstellen der Zellkulturträger 1 mit der oben genannten Dichte liegt die Dichte des Grundmaterials 2 vorzugsweise im Bereich von 1,01 bis 1,5 g/cm3 und noch besser im Bereich von etwa 1,02 bis 1,2 g/cm3.
Als Harzmaterial, das in dem Grundmaterial 2 verwendet wird, kommen verschiedene wärmehärtbare Harze und verschiedene thermoplastische Harze in Betracht.
Beispiele für thermoplastische Harze sind Polyamid, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polyimid, ein Acrylharz und thermoplastisches Polyurethan. Beispiele für wärmehärtbare Harze sind Epoxyharz, Phenolharz, Melaminharz, Harnstoffharz, ungesättigtes Polyester, Alkydharz, wärmehärtbares Polyurethan und Ebonit. Diese Harzmaterialien können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Harzen eingesetzt werden. Von diesen Harzmaterialien ist ein Material, das hauptsächlich aus Polyamid- und/oder Epoxyharz besteht, besonders geeignet. Indem ein solches Material als Grundmaterial 2 verwendet wird, erreicht man folgende Wirkung.
Da die Dichte (spezifisches Gewicht) des oben beschriebenen Materials nahe der von Wasser kommt, kann auch die Dichte (spezifisches Gewicht) des jeweiligen Zellkulturträgers 1 auf einen Wert eingestellt werden, der in der Nähe der Dichte von Wasser liegt. Die so aufgebauten Zellkulturträger 1 können durch sanftes Rühren gleichmäßig in einer Kulturlösung verteilt werden.
Das oben beschriebene Material weist hohe Haftfähigkeit gegenüber Ca-armem Apatit auf. Demnach kann die Oberfläche des Grundmaterials 2 zuverlässig mit Ca-armem Apatit überzogen werden.
Da das oben beschriebene Material ferner eine ausgezeichnete Wärmebeständigkeit aufweist, können Zellkulturträger 1 mit hoher Wärmebeständigkeit erzeugt werden. Diese Zellkulturträger 1 können vor der Zellkultivierung einer Autoklavbehandlung zur Sterilisation unterzogen werden.
Das Harzmaterial kann ferner mit einem organischen Pigment, einem anorganischen Pigment, einem sauren Farbstoff, einem basischen Farbstoff oder dergleichen gefärbt sein.
Die Deckschicht 3 dient dazu, im Wesentlichen die gesamte Oberfläche des Grundmaterials 2 abzudecken. Wie oben erwähnt, besteht die Deckschicht 3 hauptsächlich aus Ca-armem Apatit, d.h. einem Calciumphosphat-basierten Apatit, in dem ein Teil des Calciums fehlt.
Das Calciumphosphat-basierte Apatit hat eine hexagonale Kristallstruktur, die durch die Strukturformel Ca₁₀(PO₄)₆X₂ dargestellt ist, und das Ca-arme Apatit ist ein Apatit, in dem die Menge an Ca gegenüber dem durch die vorstehende Strukturformel dargestellten Calciumphosphat-basierten Apatit verringert ist.
Der Ca-arme Apatit ist beispielsweise ein Apatit, bei dem die relative Menge an Ca dadurch verringert ist, dass dem durch die vorstehende Strukturformel dargestellten Calciumphosphat-basierten Apatit PO₄ und X zugegeben wird. Ferner ist der Ca-arme Apatit beispielsweise ein Apatit, bei dem die relative Menge an Ca dadurch verringert ist, dass aus dem durch die vorstehende Strukturformel dargestellten Calciumphosphat-basierten Apatit Ca entfernt wird.
In einer Kulturlösung sind Proteine vorhanden, die am Zellwachstum beteiligt sind. Normalerweise haften diese Proteine zuerst an den Zellkulturträgern 1 an (werden also adsorbiert), worauf dann die Zellen durch diese Proteine an den Zellkulturträgern 1 anhaften. Ein solches Protein hat eine negative elektrische Ladung und haftet deshalb an Ca, da dieses eine positive elektrische Ladung hat. Deshalb können verschiedenartige Calciumphosphat-basierte Verbindungen dieses Protein gut adsorbieren, so dass die Zellen effizient an diesen Verbindungen haften.
Der Erfinder hat herausgefunden, dass unter den verschiedenartigen Calciumphosphat-basierten Verbindungen eine Verbindung mit Apatit-Struktur (nämlich ein Calciumphosphat-basierter Apatit) eine besonders hohe Adsorptionsfähigkeit gegenüber Protein hat. Dies bedeutet, dass diese Verbindung infolge ihrer einzigartigen Kristallstruktur eine hohe Adsorptionsfähigkeit gegenüber Zellen aufweist.
In der vorliegenden Erfindung wird Ca-armer Apatit verwendet, der gegenüber Calciumphosphat-basiertem Apatit (im Folgenden einfach als Apatit bezeichnet) eine verringerte Menge an Ca aufweist. Infolge seiner Apatitstruktur hat der Caarme Apatit eine hohe Adsorptionsfähigkeit gegenüber dem Protein. Der Zellkulturträger 1, der eine Oberfläche und einen oberflächennahen Bereich bestehend aus einem solchen Ca-armen Apatit hat (d.h. in diesem Ausführungsbeispiel die Deckschicht 3), ermöglicht eine hocheffiziente Zellanhaftung.
Diese Zellkulturträger 1 lassen die Zellen, die einmal auf ihren Oberflächen haften, effizienter wachsen und die gewachsenen Zellen einfacher lösen als Zellkulturträger, die eine Deckschicht 3 haben, die aus Apatit (Calciumphosphatbasiertem Apatit ohne signifikantem Ca-Mangel) besteht. Diese Wirkungen der erfindungsgemäßen Zellkulturträger 1 beruhen offenbar auf folgenden Faktoren.
Die auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 wachsenden Zellen nutzen die Proteine als Marker. Ist jedoch zu viel Ca auf den Oberflächen der Zellkulturträger vorhanden (wie im Falle des Apatits), so besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür, dass die Zellen direkt (d.h. nicht spezifisch) an Ca haften, wodurch das Wachstum der Zellen gestört wird. Demgegenüber weist der Ca-arme Apatit eine gegenüber dem Apatit eine verringerte Menge an Ca auf, wodurch die Wahrscheinlichkeit herabgesetzt ist, dass die Zellen direkt an Ca haften. Dadurch kann das Zellwachstum beschleunigt werden.
Ferner ist im Allgemeinen die Bindungskraft (Anhaftung), mit der die Zellen an Ca haften, stark. Jedoch kann bei dem Zellkulturträger 1, der die Beschichtung aus Ca-armem Apatit aufweist, die Wahrscheinlichkeit herabgesetzt werden, dass die Zellen direkt (d.h. nicht spezifisch) an Ca haften. Darin könnte der Grund dafür liegen, dass sich bei dem Zellkulturträger 1, der die Beschichtung aus Ca-armem Apatit hat, die gewachsenen Zellen leichter lösen oder entfernen lassen.
Wie oben beschrieben, ermöglichen es die Zellkulturträger 1 nach der Erfindung, dass die Zellen effizient auf den Zellkulturträgern 1 haften, dort dann effizient wachsen und schließlich die gewachsenen Zellen einfach lösbar sind.
In dem Ca-armen Apatit variiert der Ca-Mangel geringfügig in Abhängigkeit des Apatittyps und ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt der Ca-Mangelwert im Bereich von 1 bis 30 Mol-%, noch besser im Bereich von etwa 5 bis 25 Mol-% und am besten im Bereich von etwa 8 bis 20 Mol-%. Ist der Ca-Mangel zu gering, so besteht die Gefahr, dass die Zellen nicht effizient genug auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 wachsen, d.h. dass die Geschwindigkeit, mit der Zellen auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 wachsen, herabgesetzt ist. Außerdem besteht die Gefahr, dass sich die gewachsenen Zellen nicht effizient genug von den Oberflächen der Zellkulturträger 1 lösen lassen, d.h. die Lösbarkeit der gewachsenen Zellen herabgesetzt ist. Ist dagegen der Ca-Mangel zu hoch, so besteht die Gefahr, dass die Zellen nicht effizient genug auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 haften, d.h. die Anhaftung der Zellen auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 beeinträchtigt ist.
Beispiele für Ca-armen Apatit sind verschiedene Apatitarten wie Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆Cl oder dergleichen, in denen ein Teil des Ca fehlt. Die vorstehend genannten Verbindungen können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Verbindungen eingesetzt werden.
Als Ca-armer Apatit ist ein Apatit besonders geeignet, der als Hauptbestandteil Hydroxylapatit enthält, in dem ein Teil des Ca fehlt (Ca_10-x-3y(PO₄)_6-2y(OH)_2-2x, worin x ≤ 1, y ≤ 3). Hydroxylapatit wird als Biomaterial eingesetzt, so dass die Zellen mit hoher Effizienz an ihm haften können und die Gefahr, dass die Zellen geschädigt werden, besonders gering ist. Auch der Ca-arme Hydroxylapatit hat diese Eigenschaften.
Als Ca-armer Apatit kann halogenhaltiger Apatit eingesetzt werden, z.B. Fluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂) oder Chlorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂), in dem ein Teil des Ca fehlt.
Der Ca-arme Apatit kann auch eine Substanz, die aus der Synthese übrig bleibt (Rohmaterial oder dergleichen), und/oder ein sekundäres Reaktionsprodukt enthalten, das im Laufe der Synthese erzeugt wird.
Die Deckschicht 3 kann hergestellt werden, indem man den Ca-armen Apatit auf die Oberfläche des Grundmaterials 2 aufbringt. Vorzugsweise wird jedoch, wie in 1 gezeigt, die Deckschicht 3 aus feinen Teilchen 31 hergestellt, die den Ca- armen Apatit als Hauptbestandteil enthalten (im Folgenden einfach als Teilchen 31 bezeichnet) und zum Teil in die Oberfläche einschließlich des oberflächennahen Bereichs des Grundmaterials 2 eingebettet sind. Dadurch wird verhindert, dass sich die Deckschicht 3 von der Oberfläche des Grundmaterials 2 löst. So können die Zellkulturträger 1 mit der nötigen Festigkeit versehen werden.
Die Deckschicht 3 kann dicht oder porös sein.
Die mittlere Dicke der Deckschicht 3 ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt sie im Bereich von etwa 0,1 bis 5 μm, noch besser im Bereich von etwa 0,5 bis 2 μm. Ist die mittlere Dicke der Deckschicht 3 kleiner als der vorstehend genannte untere Grenzwert, so besteht die Möglichkeit, dass die Oberfläche des in dem Zellkulturträger 1 vorgesehenen Grundmaterials 2 zum Teil frei liegt. Übersteigt dagegen die mittlere Dicke der Deckschicht 3 den oberen Grenzwert, so wird es schwierig, die Dichte des Zellkulturträgers 1 geeignet einzustellen.
Um eine größere Zahl an Zellen auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 anhaften und dort wachsen zu lassen, ist vorzugsweise im Wesentlichen die gesamte Oberfläche des Grundmaterials 2 entsprechend dem vorliegenden Ausführungsbeispiel von der Deckschicht 3 bedeckt. Jedoch kann der jeweilige Zellkulturträger 1 auch so aufgebaut sein, dass in Abhängigkeit z.B. der auf dem Zellkulturträger 1 zu kultivierenden Zellart oder der Art des das Grundmaterial 2 bildenden Materials nur ein Teil der Oberfläche des Grundmaterials 2 von der Deckschicht 3 bedeckt ist (d.h. eine Struktur vorliegt, in der ein Teil der Oberfläche des Grundmaterials 2 durch in der Deckschicht 3 vorhandene Lücken frei liegt).
Im Folgenden wird ein Zellkultivierungsverfahren unter Verwendung der oben beschriebenen Zellkulturträger 1 nach der Erfindung beschrieben.

<1> Zunächst werden die Zellkulturträger 1 einer Sterilisationsbehandlung unterzogen. Dadurch können auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 vorhandene Mikroorganismen oder Schimmelpilze vollständig abgetötet oder zumindest in ihrer Zahl verringert werden. Die Gefahr, dass Mikroorganismen oder Schimmelpilze die Zellen schädigen, wird dadurch beseitigt oder zumindest verringert. Dies ermöglicht ein effizientes Zellwachstum.

Beispiele für die Sterilisationsbehandlung sind ein Verfahren, in dem die Zellkulturträger 1 in Kontakt mit einer Sterilisationslösung gebracht werden, eine Autoklavsterilisation, eine Gassterilisation, eine Strahlungssterilisation und dergleichen. Von diesen Verfahren ist die Autoklavsterilisation besonders geeignet. Durch dieses Verfahren kann eine große Zahl an Zellkulturträgern 1 besonders effizient sterilisiert werden.

<2> Nach Abschluss des oben beschriebenen Prozesses <1> wird eine Kulturlösung bereitgestellt, die die Zellkulturträger 1 sowie Zellen enthält, die an den Zellkulturträgern 1 haften sollen.

Beispiele für diese Zellen sind Tierzellen, Pflanzenzellen, Bakterien, Viren und dergleichen.
Die Kulturlösung wird in Abhängigkeit der verwendeten Zellart geeignet ausgewählt. Sie ist nicht auf eine bestimmte Lösung beschränkt. Beispiele für eine geeignete Kulturlösung sind Dulbecco's MEM, BME, MCDB-104 medium und dergleichen.
Diese Kulturlösungen können nach Bedarf z.B. Serum, Serumprotein wie Albumin sowie Zusätze wie verschiedene Vitamine, Aminosäuren und Salze enthalten.
Anschließend wird die bereitgestellte Kulturlösung gerührt. Durch Rühren der Kulturlösung kommen die Zellen in Kontakt mit den Zellkulturträgern 1 und haften an deren Oberflächen an. Unter diesen Bedingungen wachsen die Zellen auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 mit der Zeit, d.h. es erfolgt die Zellkultivierung. Durch Rühren der Kulturlösung während der Zellkultivierung kann die Effizienz, mit der die Zellen wachsen, gesteigert werden.
Die Geschwindigkeit, mit der die Kulturlösung gerührt wird, ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt sie im Bereich von etwa 5 bis 100 U/min, noch besser im Bereich von etwa 10 bis 50 U/min. Ist die Rührgeschwindigkeit zu gering, so kann es abhängig von Dichte und mittlerer Teilchengröße der Zellkulturträger 1 vorkommen, dass die Zellkulturträger 1 nicht gleichmäßig in der Kulturlösung verteilt werden. Unter diesen Umständen ist es für die Zellen schwierig, in ausreichendem Maße auf den Oberflächen der Zellkulturträger 1 zu wachsen. Ist dagegen die Rührgeschwindigkeit zu hoch, so werden die Zellkulturträger 1 zu stark gerührt, so dass letztere miteinander kollidieren und die an ihnen haftenden Zellen beschädigt werden können.
Die Kultivierungstemperatur, d.h. die Temperatur der Kulturlösung, wird in Abhängigkeit der zu kultivierenden Zellart geeignet festgelegt. Sie ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Üblicherweise liegt die Temperatur jedoch in einem Bereich von 4 bis 40°C, noch besser in einem Bereich von etwa 25 bis 37°C.

<3> Anschließend werden die Zellen, die sich an den Oberflächen der Zellkulturträger 1 angehaftet haben und dort gewachsen sind, von den Zellkulturträgern 1 gelöst und gesammelt. Zunächst werden die Zellkulturträger 1 mit einer Abtrennlösung in Kontakt gebracht, wodurch die Zellen von den Oberflächen der Zellkulturträger 1 gelöst und dann in die Abtrennlösung freigesetzt werden.

Beispiele für die Abtrennlösung sind eine Trypsinlösung, eine EDTA-Lösung, eine hypotonische Lösung und dergleichen.
Die Temperatur der Abtrennlösung ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt sie im Bereich von etwa 4 bis 40°C, noch besser im Bereich von etwa 25 bis 37°C.
Auch ist die Zeit, während der die Zellkulturträger 1 in Kontakt mit der Abtrennlösung sind, nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt diese Zeit im Bereich von etwa 1 bis 30 Minuten, noch besser im Bereich von etwa 5 bis 15 Minuten.
Während die Zellkulturträger 1 in Kontakt mit der Abtrennlösung sind, kann letztere gerührt, in Schwingung versetzt oder geschüttelt werden. Dadurch kann die Rate, mit der die Zellen in der Abtrennlösung gesammelt werden, gesteigert werden.
Die Geschwindigkeit, mit der Abtrennlösung gerührt wird, ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt diese Geschwindigkeit im Bereich von etwa 5 bis 100 U/min, noch besser im Bereich von etwa 10 bis 50 U/min.
Anschließend wird die die Zellen enthaltende Abtrennlösung durch einen Filter, eine Säule oder dergleichen geführt, um die Zellen zu sammeln.
Die gesammelten Zellen werden in verschiedenen Experimenten und Untersuchungen sowie in der Herstellung von Proteinen und dergleichen verwendet.
Die Zellkulturträger 1 können beispielsweise nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
Im Folgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zum Herstellen des in 1 gezeigten Zellkulturträgers 1 nach der Erfindung beschrieben.
Das Verfahren zum Herstellen des in 1 gezeigten Zellkulturträgers 1 umfasst folgende Schritte: Bereitstellen einer breiigen Masse (Schlämme), die Apatit und Phosphorsäure enthält; Trocknen der Masse zu einem Pulver; Sintern des getrockneten Pulvers zu einem Sinterpulver; und Beschichten der Oberfläche eines Grundmaterials mit dem Sinterpulver. Nachfolgend werden die einzelnen Verfahrensschritte nacheinander beschrieben.
[A] Zubereitung der breiigen Masse (erster Schritt)
Zunächst wird eine breiige Masse zubereitet, die Apatit und Phosphorsäure enthält.
Dies erfolgt beispielsweise nach einem Verfahren, in dem einer Apatit-Dispersionslösung (breiige Masse) Phosphorsäure zugesetzt wird, einem Verfahren, in dem einer Phosphorsäurelösung Apatit zugesetzt wird, einem Verfahren, in dem eine Apatit-Dispersionslösung und eine Phosphorsäurelösung miteinander vermischt werden, oder einem Verfahren, in dem Apatit und Phosphorsäure miteinander vermischt werden und dann eine Flüssigkeit (Dispersionsmedium) zugegeben wird.
Der Apatit kann nach einem wohlbekannten Verfahren synthetisiert werden, z.B. einem Nasssyntheseverfahren, einem Trockensyntheseverfahren oder dergleichen.
Das Mischverhältnis zwischen Apatit und Phosphorsäure ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise liegt das Molverhältnis im Bereich von 6:1 bis 1:1, noch besser im Bereich von 6:3 bis 6:5. Ist die Zugabemenge an Phosphorsäure zu gering, so wird der in dem später beschriebenen Schritt [C] in dem Sinterpulver zu erzeugende Ca-Mangel zu klein, was dazu führt, dass die Zellen nicht ausreichend auf den hergestellten Zellkulturträgern 1 wachsen und von diesen auch nicht gelöst werden können. Ist dagegen die Menge an Phosphorsäure zu groß, so wird der zu erzeugende Ca-Mangel in dem Sinterpulver unnötigerweise hoch, was dazu führen kann, dass die Zellen nicht ausreichend an den hergestellten Zellkulturträgern 1 haften.
[B] Zubereitung des Pulvers (zweiter Schritt)
Als nächstes wird die in dem oben beschriebenen Schritt [A] hergestellte breiige Masse zu einem Pulver getrocknet.
Beispiele für ein Verfahren zum Trocknen der breiigen Masse sind Heisslufttrocknen, Gefriertrocknen, Vakuumtrocknen, Sprühtrocknen und dergleichen.
Wird die breiige Masse zum Trocknen mit Wärme beaufschlagt, so liegt die Heiztemperatur vorzugsweise im Bereich von etwa 40 bis 300°C, noch besser im Bereich von etwa 80 bis 250°C.
Wird die breiige Masse wie beispielsweise in dem Sprühtrocknungsverfahren zu einem Pulver (körnige Masse) getrocknet, so kann die getrocknete Masse in Form des Pulvers direkt dem nächsten Schritt [C] zugeführt werden. Wird dagegen die breiige Masse zu einer Blockform getrocknet, so wird vor dem nächsten Schritt [C] der entstandene Block zunächst gemahlen.
Die mittlere Teilchengröße des Pulvers ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Sie ist vorzugsweise gleich oder kleiner als 30 μm. Vorzugsweise liegt die mittlere Teilchengröße des Pulvers im Bereich von etwa 1 bis 50 % des Durchmessers des Grundmaterials, noch besser im Bereich von etwa 10 bis 25 %. Dadurch ist es möglich, die Deckschicht 3 in einfacher Weise in der gewünschten Dicke auszubilden.
[C] Sintern des getrockneten Pulvers (dritter Schritt)
Als nächstes wird das in dem oben beschriebenen Schritt [B] hergestellte Pulver zu einem Sinterpulver gesintert.
Die Erfindung sieht vor, das Sintern des getrockneten Pulvers bei einer Temperatur durchzuführen, bei der gewährleistet ist, dass das Pulver seine Apatitstruktur behält. Durch die Reaktion zwischen dem Apatit und der Phosphorsäure in dem Pulver wird Ca-armer Apatit erzeugt, so dass das erhaltene Sinterpulver hauptsächlich aus Ca-armem Apatit besteht.
Wird das Pulver bei einer Temperatur gesintert, die höher als die Temperatur ist, bei der die Apatitstruktur erhalten bleibt, so tritt eine chemische Reaktion auf, die durch folgende chemische Formel angegeben ist.
3Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 2H₃(PO₄) → 10Ca₃(PO₄)₂ + 6H₂O (I) Dabei wird Apatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) in Tricalciumphosphat (Ca₃(PO₄)₂:TCP) umgesetzt.
In dem so erhaltenen Sinterpulver ist der Gehalt an Ca-armem Apatit verringert, so dass die Zellen nicht effizient an den Oberflächen der letztendlich erhaltenen Zellkulturträger 1 haften und dort wachsen können.
Obige chemische Formel (I) bezieht sich auf den Fall, dass Hydroxylapatit eingesetzt wird. Das gleiche Ergebnis erhält man jedoch auch, wenn eine andere Art von Apatit verwendet wird.
Die Sintertemperatur variiert geringfügig in Abhängigkeit der Apatitart und ist nicht auf einen bestimmten Wert beschränkt. Vorzugsweise ist die Sintertemperatur gleich oder kleiner als 1000°C, noch besser liegt sie im Bereich von etwa 400 bis 750°C. Das Sintern des Pulvers im oben angegebenen Temperaturbereich ermöglicht es, zuverlässig den Ca-armen Apatit herzustellen.
Die Sinterzeit liegt vorzugsweise im Bereich von etwa 0,1 bis 10 Stunden, noch besser im Bereich von etwa 2 bis 4 Stunden. Ist die Sinterzeit zu kurz, so wird es schwierig, eine ausreichende Menge an Ca-armem Apatit herzustellen. Übersteigt dagegen die Sinterzeit die vorstehend genannte obere Grenze, so ist ein weiteres Fortschreiten der chemischen Reaktion nicht zu erwarten, und es kommt lediglich zu einer unnötigen Verlängerung der gesamten Herstellungszeit.
Die Sinteratmosphäre ist nicht auf eine bestimmte Atmosphäre beschränkt. Beispielsweise können eine Sauerstoff enthaltende Atmosphäre wie atmosphärische Luft oder eine reine Sauerstoffatmosphäre, eine Argon enthaltende Atmosphäre, eine Stickstoff enthaltende Atmosphäre und dergleichen angewandt werden. Bevorzugt wird jedoch atmosphärische Luft. Auf diese Weise kann unter Einsparung von Fertigungskosten der calciumarme Apatit effizient hergestellt werden.
[D] Beschichten des Grundmaterials (vierter Schritt)
Anschließend wird die Oberfläche des Grundmaterials 2 mit dem in dem obigen Schritt [C] hergestellten Sinterpulver beschichtet, um die Deckschicht 3 auszubilden.
Zum Herstellen des in 1 gezeigten Zellkulturträgers 1, insbesondere zum Ausbilden der Deckschicht 3 derart, dass Teilchen 31 zum Teil in die Oberfläche des Grundmaterials 2 eingebettet werden, kann das Sinterpulver in Kollision mit der Oberfläche des Grundmaterials 2 gebracht werden. Nach diesem Verfahren ist es möglich, die Deckschicht 3 einfach und zuverlässig in gleichmäßiger Dicke herzustellen.
Die Kollision zwischen dem Grundmaterial 2 und dem Sinterpulver kann in trockenem Zustand unter Verwendung einer unter der Bezeichnung „MECHANOFUSION" (Marke der Hosokawa Micron Co., Ltd.) vertriebenen mechanischen Einrichtung herbeigeführt werden. In diesem Fall erfolgt die Kollision unter der Bedingung, dass das Mischverhältnis zwischen Grundmaterial 2 und Sinterpulver bei etwa 400:1 bis 10:1 (Gewichtsverhältnis) liegt und die Temperatur in der Einrichtung gleich oder kleiner als die Erweichungstemperatur des Harzmaterials ist, aus dem das Grundmaterial 2 hauptsächlich besteht (normalerweise gleich oder kleiner als 80°C). Diese Werte sind nur beispielhaft zu verstehen. Auch ist das Verfahren zum Herstellen der Deckschicht 3 nicht auf das vorstehend beschriebene Verfahren beschränkt.
Die Zellkulturträger 1 erhält man durch die oben beschriebenen Verfahrensschritte.
In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass das oben beschriebene Sinterprodukt so wie es ist die Zellkulturträger 1 bilden kann. In diesem Fall wird der Schritt [D] weggelassen.
Zweites Ausführungsbeispiel
Im Folgenden wird ein zweites Ausführungsbeispiel der Zellkulturträger nach der Erfindung beschrieben.
In der nachfolgenden Beschreibung liegt der Schwerpunkt auf den Unterschieden zwischen den Zellkulturträgern des ersten Ausführungsbeispiels und denen des zweiten Ausführungsbeispiels. Übereinstimmende Punkte werden nicht nochmals beschrieben.
2 zeigt einen Querschnitt eines Zellkulturträgers 1 nach zweitem Ausführungsbeispiel.
Der in 2 gezeigte Zellkulturträger 1 und der Zellkulturträger 1 nach erstem Ausführungsbeispiel haben mit Ausnahme des Grundmaterials 2 den gleichen Aufbau.
Das in 2 gezeigte Grundmaterial 2 enthält magnetisches Material 22 innerhalb des Harzmaterials 21, das den Hauptbestandteil des Grundmaterials 2 bildet. Der Zellkulturträger 1 ist deshalb als Ganzes magnetisch.
Infolge des oben beschriebenen Aufbaus kann der Zellkulturträger 1 in einer Kulturlösung bewegt werden, wenn an diese ein Magnetfeld angelegt wird. Durch die Bewegung der Zellkulturträger 1 kann die Kulturlösung gerührt werden. Damit kann verhindert werden, dass den Zellkulturträgern 1 mechanische Stöße zugefügt werden, die bei der herkömmlichen Zellkultivierung unter Verwendung einer Schleuderflasche durch die Kollision zwischen einem Rühranker und den Zellkulturträgern auftreten. So kann verhindert werden, dass sich die an den Zellkulturträgern 1 haftenden Zellen von deren Oberflächen lösen. Außerdem kann eine Schädigung der Zellen vermieden werden.
Das Rühren der Kulturlösung durch die Zellkulturträger 1 in oben beschriebener Weise erlaubt es, die Kulturlösung gleichmäßiger und sanfter als mittels eines Rührankers zu rühren. Die Zellen haften deshalb leicht an den Oberflächen der Zellkulturträger 1 an und werden gleichmäßig genährt. Die Zellkulturträger 1 stellen so gute Gerüste für das Zellwachstum dar.
Das Grundmaterial 2 kann insgesamt aus einem magnetischen Material bestehen. Vorzugsweise ist jedoch das Grundmaterial 2 aus einem zusammengesetzten Teilchen gebildet, das aus dem Harzmaterial 21 und dem magnetischen Material 22 zusammengesetzt ist. Durch diesen Aufbau ist es möglich, die Dichte (spezifisches Gewicht) des Grundmaterials 2 und damit des Zellkulturträgers 1 in einfacher Weise einzustellen, indem das Mischverhältnis zwischen Harzmaterial 21 und magnetischem Material 22 geeignet eingestellt wird. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass Form und Größe (z.B. mittlere Teilchengröße) der Zellkulturträger 1 leicht eingestellt werden können.
Wie in 2 gezeigt, ist das zusammengesetzte (magnetische) Teilchen vorzugsweise so aufgebaut, dass das magnetische Material (magnetisches Pulver) 22 in dem Harzmaterial 21 verteilt ist. Das so ausgebildete Grundmaterial 2 kann vergleichsweise einfach hergestellt werden, indem das geschmolzene Harzmaterial 21, dem das magnetische Material 22 zugemischt worden ist, geformt oder granuliert wird. Dieses zusammengesetzte Teilchen kann so ausgebildet sein, dass das magnetische Material 22 nur in dem Teil des Harzmaterials 21, der sich in der Nähe der Oberfläche des Harzmaterials 21 befindet, verteilt ist.
Beispiele für das magnetische Material 22 sind eine ferromagnetische Legierung, die Eisenoxid, Fe, Ni, Co oder dergleichen als Hauptkomponente, Ferrit, Bariumferrit, Strontiumferrit und dergleichen enthält. Diese magnetischen Materialien können allein oder in Kombination von zwei oder mehr Materialien eingesetzt werden.
Durch die Zellkulturträger 1 des zweiten Ausführungsbeispiels werden die gleichen technischen Wirkungen wie durch die Zellkulturträger des ersten Ausführungsbeispiels erzielt.
Außerdem können die Zellkulturträger 1 des zweiten Ausführungsbeispiels in gleicher Weise wie die des ersten Ausführungsbeispiels hergestellt werden.
In jedem der oben beschriebenen Ausführungsbeispiele besteht die Oberfläche des Zellkulturträgers 1 einschließlich des oberflächennahen Bereichs (d.h. die Deckschicht 3) hauptsächlich aus dem Calciumphosphat-basierten Apatit, bei dem ein Teil des Ca fehlt. Die erfindungsgemäße Oberfläche des Zellkulturträgers 1 einschließlich des oberflächennahen Bereichs kann jedoch auch aus einem Apatit bestehen, bei dem ein Teil seines zweiwertigen Elementes fehlt.
Beispiele für einen solchen Apatit sind Mg₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Cd₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Si₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Pb₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ba₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Mg₁₀(SO₄)₆(OH)₂ und dergleichen.
Die Erfindung ist nicht auf die oben beschriebenen Zellkulturträger und das zum Herstellen dieser Zellkulturträger bestimmte Verfahren gemäß obiger Beschreibung beschränkt.
Beispielsweise ist der jeweilige Zellkulturträger nicht auf eine Teilchenform beschränkt, sondern kann verschiedene andere Formen annehmen, z.B. die Form eines Blocks, eines Pellets, einer Folie oder dergleichen.
Außerdem kann der Zellkulturträger als Ganzes aus einer Calciumphosphatbasierten Verbindung bestehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen der Zellkulturträger kann nach Bedarf zusätzlich zu den oben beschriebenen Schritten einen oder mehrere zusätzliche Schritte für beliebige Zwecke umfassen.
Beispiele
Im Folgenden werden praktische Beispiele der Erfindung beschrieben.
1. Untersuchung der für das Pulver vorgesehenen Sintertemperatur
1-1. Herstellung des Sinterpulvers
Experimentelles Beispiel 1

<1> Zunächst wurde Hydroxylapatit nach einem Nasssyntheseverfahren synthetisiert.
<2> Anschließend wurde Dispersionswasser mit 10 Gew.-% Hydroxylapatit zubereitet.
<3> Dann wurden 15 g einer 10 Gew.-%-igen Phosphorsäurelösung einem Liter des Hydroxylapatit-Dispersionswassers zugegeben, um eine breiige Masse herzustellen.
<4> Dann wurde die breiige Masse bei einer Temperatur von 200°C zwei Stunden lang getrocknet und anschließend in einem Mörser gemahlen, um ein Pulver mit einer mittleren Teilchengröße von 20 μm zu erhalten.
<5> Anschließend wurde das erhaltene Pulver bei einer Temperatur von 700°C zwei Stunden lang gesintert, um ein Sinterpulver zu erhalten.

Experimentelles Beispiel 2
Es wurden Zellkulturträger in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die für das Pulver vorgesehene Sintertemperatur in dem oben angegebenen Schritt <5> auf 1100°C geändert wurde.
Experimentelles Beispiel 3
Es wurden Zellkulturträger in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die für das Pulver vorgesehene Sintertemperatur in dem oben angegebenen Schritt <5> auf 1200°C geändert wurde.
Experimentelles Beispiel 4
Es wurden Zellkulturträger in gleicher Weise in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die dem Hydroxylapatit-Dispersionswasser zugegebene Menge an Phosphorsäurelösung in dem oben angegebenen Schritt <3> auf 45°C geändert wurde.
Experimentelles Beispiel 5
Es wurden Zellkulturträger in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 4 hergestellt, abgesehen davon, dass die für das Pulver vorgesehene Sintertemperatur in dem oben angegebenen Schritt <5> auf 1100°C geändert wurde.
Experimentelles Beispiel 6
Es wurden Zellkulturträger in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 4 hergestellt, abgesehen davon, dass die für das Pulver vorgesehene Sintertemperatur in dem oben angegebenen Schritt <5> auf 1200°C geändert wurde.
1.2 Kristallstrukturanalyse des Sinterpulvers
An dem in den jeweiligen experimentellen Beispielen hergestellten Sinterpulver wurde jeweils eine Kristallstrukturanalyse nach dem Verfahren der Röntgenbeugung vorgenommen.
Die Ergebnisse dieser Analyse sind in den 3 bis 5 dargestellt.
Wie aus 3 hervorgeht, wurde bei einer Sintertemperatur von 700°C (experimentelle Beispiele 1 und 4) eine große, von Apatit verursachte Spitze (Peak) beobachtet, während eine von TCP (Tricalciumphosphat) verursachte Spitze nicht erfasst wurde.
Wurde dagegen die Sintertemperatur auf 1100°C eingestellt, so wurde eine von β-TCP verursachte Spitze beobachtet, wie 4 zeigt. Wurde die Sintertemperatur auf 1200°C eingestellt (experimentelle Beispiele 3 und 6), so wurde eine von α-TCP verursachte Spitze beobachtet.
In den in den experimentellen Beispielen 5 und 6 hergestellten Sinterpulvern, in denen die Zugabemenge an Phosphorsäure bezogen auf Hydroxylapatit erhöht wurde, wurden die größten Spitzen für β-TCP bzw. α-TCP beobachtet, während eine Spitze für Apatit nur kaum zu erkennen war.
Diese Analyseergebnisse zeigen, dass die Sintertemperatur geeignet eingestellt werden muss, um den Ca-armen Hydroxylapatit zu erzeugen.
2. Bewertung des Zellkulturträgers
2-1. Herstellung des Zellkulturträgers
Beispiel 1
Zunächst wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt. Ferner wurde der Ca-Mangel mittels Röntgenbeugung gemessen. Es ergab sich hierfür ein Wert von 3 Mol-%. (In den folgenden Beispielen wurde das gleiche Verfahren angewandt).
Die Messung des Ca-Mangels wurde in folgender Weise vorgenommen.
Zunächst wurde eine Hauptspitzenintensität sowohl für einfachen Hydroxylapatit als auch für einfaches Tricalciumphosphat (β-TCP) bei einer Temperatur von 1100°C mittels Röntgenbeugung gemessen, um einen Referenzwert zu ermitteln.
Für den einfachen Hydroxylapatit ergaben sich 5000 Zählimpulse und für das einfache β-TCP 3500 Zählimpulse.
Dann wurde der in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellte Ca-arme Hydroxylapatit (Sinterpulver) bei einer Temperatur von 1100°C gesintert und anschließend einer Röntgenbeugungsmessung unterzogen.
So wurde ein Röntgenbeugungsmuster ermittelt, das Spitzen sowohl für den Hydroxylapatit als auch für das β-TCP enthielt.
Die in der Hauptspitze ermittelte Zahl an Zählimpulsen betrug für den Hydroxylapatit 3500 und für das β-TCP 1050.
Es ist darauf hinzuweisen, dass das Sintern bei einer Temperatur von 1100°C durchgeführt wurde, um die Kristallinität des jeweiligen Sinterpulvers zu verbessern und einen Phasenübergang von Ca-armem Hydroxylapatit in β-TCP zu veranlassen.
Anschließend wurde der Ca-Mangel an Hand des ermittelten Referenzwertes und an Hand der Zahl der Zählimpulse berechnet, die beim Vermessen des Ca-armen Hydroxylapatits ermittelt wurde.
Die Strukturformel des Ca-armen Apatits ergibt sich aus der Summe von 3500/5000 (Ca₁₀PO₄)₆(OH)₂) = Ca₇(PO₄)_4.2(OH)_1.4 und 1050/3500 (Ca₉(PO₄)₆) – Ca_2.7(PO₄)_1.8, nämlich Ca_9.7(PO₄)₆(OH)_1.4. Normalerweise enthält Hydroxylapatit 10 Mol Calcium. Dagegen enthält der Caarme Hydroxylapatit (Sinterpulver) nur 9,7 Mol Calcium. Dies bedeutet, dass der Ca-Mangel 3 Mol-% beträgt.
In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, dass β-TCP normalerweise durch die Strukturformel Ca₃(PO₄)₂ angegeben wird. Um die Berechnung einfa cher zu gestalten, wurde es in obiger Strukturformel dagegen mit Ca₉(PO₄)₆ angegeben.
Ferner wurden Nylonteilchen (Grundmaterial) mit einer mittleren Teilchengröße von 150 μm und einer Dichte von 1,02 g/cm3 bereitgestellt.
Anschließend wurden 3 g Sinterpulver und 300 g Nylonteilchen in ein mit „MECHANOFUSION SYSTEM AMS-LAB" bezeichnetes System (vertrieben von Hosokawa Micron Co., Ltd.) eingebracht. Dieses System wurde dann mit 2650 U/min bei 45°C 70 Minuten lang betrieben. Auf diese Weise wurden die in 1 gezeigten Zellkulturträger 1 hergestellt.
Die so hergestellten Zellkulturträger 1 hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschicht betrug 1 μm) und eine Dichte von 1,03 g/cm3.
Beispiel 2
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Menge von Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 30 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 5 Mol-%. Anschließend wurden unter Verwendung dieses Sinterpulvers Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 3
Zunächst wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 4 hergestellt. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 11 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 4
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 50 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 15 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 5
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 55 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 19 Mol-%. Dann wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 6
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 60 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 23 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 7
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 65 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 29 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 8
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 4 hergestellt, abgesehen davon, dass Fluorapatit anstelle von Hydroxylapatit verwendet wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 12 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 9
Es wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 4 hergestellt, abgesehen davon, dass Chlorapatit anstelle von Hydroxylapatit verwendet wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 10 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Beispiel 10
Es wurden Zellkulturträgern nach 2 in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass aus Ferrit und Nylon zusammengesetzte Teilchen als Grundmaterial anstelle von Nylonteilchen verwendet wurden.
Die so erhaltenen Zellkulturteilchen hatten eine mittlere Teilchengröße von 151 μm (die mittlere Dicke der Deckschicht betrug 1,0 μm) und eine Dichte von 1,23 g/cm³.
Vergleichsbeispiel 1
Zunächst wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 0 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 0 Mol-%. Anschließend wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturteilchen in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Vergleichsbeispiel 2
Zunächst wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass Fluorapatit anstelle von Hydroxylapatit verwendet und die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 0 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 0 Mol-%. Dann wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturträger in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
Vergleichsbeispiel 3
Zunächst wurde ein Sinterpulver in gleicher Weise wie in dem experimentellen Beispiel 1 hergestellt, abgesehen davon, dass Chlorapatit anstelle von Hydroxylapatit verwendet und die Menge an Phosphorsäurelösung, die der Wasserdispersion zugegeben wurde, auf 0 g geändert wurde. In diesem Beispiel betrug der Ca-Mangel 0 Mol-%. Dann wurden mit diesem Sinterpulver Zellkulturteilchen in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
2-2. Zellkultur
<1> Unter Verwendung der in den Beispielen 1 bis 9 und den Vergleichsbeispielen 1 bis 3 hergestellten Zellkulturträger wurden Zellkultivierungen in folgender Weise vorgenommen.
Zunächst wurden die in den Beispielen und in den Vergleichsbeispielen hergestellten Zellkulturträger jeweils einer Autoklavsterilisation unterzogen.
Anschließend wurden 1 g Zellkulturträger und eine Suspension, die 2 × 10⁵ Verozellen je Milliliter (/mL), abgeleitet aus Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze, enthielt, einer Menge von 100 mL der Substanz MEM medium (Kulturlösung) zugegeben.
Diese Kulturlösung wurde in eine Schleuderflasche eingebracht, und die Zellen wurden mit einer Drehgeschwindigkeit von 30 U/min, bei einer Temperatur der Kulturlösung von 37°C und einer Kultivierungsdauer von drei Tagen kultiviert.
<2> Die Zellkultivierung wurde mittels einer Zellkultivierungseinrichtung nach 6 unter Verwendung der in Beispiel 10 hergestellten Zellkulturträger in folgender Weise durchgeführt.
Im Folgenden wird der Aufbau der Zellkultivierungseinrichtung 100 beschrieben.
Die in 6 mit 100 bezeichnete Zellkultivierungseinrichtung hat ein Kulturgefäß 110, einen Magnetfeldgenerator 120, eine Steuerung 130 und eine Heizvorrichtung 150. Ist die Steuerung 130 an eine Stromquelle angeschlossen, so wird die für den Betrieb der einzelnen Komponenten der Zellkultivierungseinrichtung 100 erforderliche elektrische Energie geliefert.
Das Kulturgefäß 110 dient der Aufnahme der Kulturlösung. Das Kulturgefäß 110 hat in seinem oberen Teil eine Öffnung 111, durch die die Kulturlösung eingebracht und entnommen wird. Die Öffnung 111 wird mit einem Stöpsel 112 verschlossen, um die Luftdichtigkeit innerhalb des Kulturgefäßes 110 sicherzustellen.
Der Magnetfeldgenerator 120 dient der Erzeugung eines Magnetfeldes, durch das die Zellkulturträger 1 in der Kulturlösung bewegt werden. Der Magnetfeldgenerator 120 hat einen Elektromagneten 121, der die Außenfläche des Kulturgefäßes 110 umgibt.
Der Elektromagnet 121 besteht aus einem metallischen Ringkern 122 und einem Leiter 123, der spiralig um die Außenfläche des Ringkerns 122 gewunden ist. Indem elektrischer Strom durch den Leiter 123 fließt, wird in dessen Nähe ein Magnetfeld erzeugt.
Wird durch den Magnetfeldgenerator 120 ein Magnetfeld erzeugt, so werden die Zellkulturträger 1 zu dem Magnetfeldgenerator 120 hin angezogen, so dass die Zellkulturträger 1 in der Kulturlösung aufsteigen. Wird dann das Magnetfeld abgeschaltet, so sinken die zu dem Magnetfeldgenerator 120 hin angezogenen Zellkulturträger 1 unter ihrem Eigengewicht wieder nach unten. Indem diese vertikale Bewegung der Zellkulturträger 1 wiederholt veranlasst wird, wird in der Kulturlösung eine turbulente Strömung erzeugt, durch die die Kulturlösung gleichmäßig und sanft gerührt wird.
Die Heizvorrichtung 150 ist elektrisch an die Steuerung 130 angeschlossen, um die Kulturlösung unter der Kontrolle der Steuerung 130 zu erwärmen.
Im Folgenden wird das Zellkultivierungsverfahren beschrieben.
Zunächst wurden die Zellkulturträger nach Beispiel 10 einer Autoklavsterilisation unterzogen.
Anschließend wurden 1 g Zellkulturträger und eine Suspension, die je Milliliter (/mL) 2 × 10⁵ Verozellen, abgeleitet aus Nierenzellen der afrikanischen Grünen Meerkatze, enthielt, einer Menge von 100 mL der Substanz MEM medium (Kulturlösung) zugegeben.
Diese Kulturlösung wurde in das Kulturgefäß 110 eingebracht und auf eine Temperatur von 37°C erwärmt.
In diesem Zustand wurde die Zellkultivierung drei Tage lang durchgeführt, indem der Magnetfeldgenerator 120 so eingestellt wurde, dass er in regelmäßigen Abständen das Magnetfeld intermittierend erzeugte. Die Stärke des erzeugten Magnetfeldes betrug 0,5 Wb/m².
Eine solche Zellkultivierung wurde 10 Mal in jedem der Beispiele und in jedem der Vergleichsbeispiele ausgeführt.
In 5 von 10 Fällen wurden die Zellkulturträger, die drei Tage lang kultiviert worden waren, aus der Kulturlösung entnommen. Anschließend wurde die Stoffwechselaktivität der Zellen nach dem Verfahren der Alamar-Blau-Reduktion gemessen.
In den verbleibenden 5 Fällen wurden die Zellkulturträger, die drei Tage lang kultiviert worden waren, aus der Kulturlösung entnommen und dann fünf Minuten lang in 2 mL Trypsinlösung (Sammellösung) eingebracht, um die Zellen von den Zellkulturträgern 1 zu lösen.
Anschließend wurden die Zellkulturträger aus der Trypsinlösung entnommen, und es wurde die Stoffwechselaktivität der Zellen nach dem Verfahren der Alamar-Blau-Reduktion gemessen.
Die einzelnen in Tabelle 1 angegebenen, auf die zelluläre Stoffwechselaktivität bezogenen Werte sind Werte, die auf den Wert 100 bezogen sind, der definitionsgemäß die zelluläre Stoffwechselaktivität in dem Vergleichsbeispiel 1 vor Ablösen der Zellen von den Zellkulturträgern angibt.
Ferner ist jeder Wert ein aus fünf Werten gebildeter Mittelwert.
Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, war in jedem der Beispiele die Stoffwechselaktivität der Zellkulturträger nach drei Tagen seit Beginn der Zellkultivierung (d.h. bevor die Zellen von den Zellkulturträgern gelöst wurden) offensichtlich höher als die Stoffwechselaktivität in den Vergleichsbeispielen. Außerdem zeigen die Ergebnisse, dass in jedem der Beispiele die Stoffwechselaktivität der Zellkulturträger drei Tage nach Beginn der Zellkultivierung (d.h. bevor die Zellen von den Zellkulturträgern gelöst wurden) durch geeignetes Einstellen des Ca-Mangels erhöht wurde.
Außerdem nahm in jedem der Beispiele die Stoffwechselaktivität der Zellkulturträger offensichtlich dadurch ab, dass die Zellen von den Zellkulturträgern gelöst wurden. Dagegen zeigte die Stoffwechselaktivität in den Vergleichsbeispielen auch nach Lösen der Zellen von den Zellkulturträgern keine starke Veränderung.
Wie diese Ergebnisse zeigen, ermöglichen es die Zellkulturträger nach der Erfindung, dass Zellen effizient an ihnen haften und ausreichend auf ihnen wachsen. Außerdem können die gewachsenen Zellen leicht von den Zellkulturträgern gelöst werden.
Ferner hat sich herausgestellt, dass die Zellkulturträger nach der Erfindung ein schnelleres, d.h. effizienteres Zellwachstum und eine verbesserte Lösbarkeit der gewachsenen Zellen von den Zellkulturträgern ermöglichen, indem der Ca-Mangel geeignet eingestellt wird.

Claims

Zellkulturträger mit einer Oberfläche zum Anhaften von Zellen, die auf der Oberfläche wachsen, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil der Oberfläche einschließlich eines oberflächennahen Bereichs hauptsächlich aus einem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit besteht, bei dem ein Teil des Ca fehlt.
Zellkulturträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Ca-Mangel des Calciumphosphat-basierten Apatits 1 bis 30 Mol-% beträgt.
Zellkulturträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass seine Dichte im Bereich von 1,01 bis 1,5 g/cm3 liegt.
Zellkulturträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Teilchenform aufweist.
Zellkulturträger nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass seine mittlere Teilchengröße im Bereich von 10 bis 2000 μm liegt.
Zellkulturträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Calciumphosphat-basierte, Ca-arme Apatit hauptsächlich aus Hydroxylapatit besteht, in dem ein Teil des Ca fehlt.
Zellkulturträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Grundmaterial, das eine Oberfläche und eine diese Oberfläche bedeckende Deckschicht hat, die hauptsächlich aus dem Calciumphosphatbasierten, Ca-armen Apatit besteht.
Zellkulturträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Grundmaterial hauptsächlich aus einem Harzmaterial besteht.
Zellkulturträger nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Harzmaterial hauptsächlich aus Polyamid und/oder Epoxyharz besteht.
Zellkulturträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Grundmaterial ein magnetisches Material enthält.
Zellkulturträger mit einer Oberfläche zur Anhaftung von Zellen, die auf der Oberfläche wachsen, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest ein Teil der Oberfläche einschließlich eines oberflächennahen Bereichs hauptsächlich aus einem Apatit besteht, bei dem ein Teil seines zweiwertigen Elementes fehlt.
Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 1, umfassend: einen ersten Schritt, in dem eine Masse zubereitet wird, die Calciumphosphat-basierten Apatit und Phosphorsäure enthält; einen zweiten Schritt, in dem die Masse zu Pulver getrocknet wird; und einen dritten Schritt, in dem das Pulver zu einem Sinterpulver gesintert wird, das hauptsächlich aus dem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit besteht, indem der Calciumphosphat-basierte Apatit und die Phosphorsäure in dem Pulver unter Beibehaltung der Apatitstruktur zu dem Ca-armen, Calciumphosphat-basierten Apatit reagieren.
Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 7, umfassend: einen ersten Schritt, in dem eine Masse zubereitet wird, die Calciumphosphat-basierten Apatit und Phosphorsäure enthält; einen zweiten Schritt, in dem die Masse zu Pulver getrocknet wird; einen dritten Schritt, in dem das Pulver zu Sinterpulver gesintert wird, das hauptsächlich aus dem Calciumphosphat-basierten, Ca-armen Apatit besteht, indem der Calciumphosphat-basierte Apatit und die Phosphorsäure in dem Pulver unter Beibehaltung der Apatitstruktur zu dem Calciumphosphatbasierten, Ca-armen Apatit reagieren; und einen vierten Schritt, in dem ein Grundmaterial mit dem Sinterpulver überzogen wird.
Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in dem ersten Schritt das molare Mischverhältnis von Calciumphosphat-basiertem Apatit zu Phosphorsäure im Bereich von 6:1 bis 1:1 liegt.
Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in dem dritten Schritt die Sintertemperatur gleich oder kleiner als 1000°C ist.
Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in dem dritten Schritt die Sinterzeit 0,1 bis 10 Stunden ist.
Verfahren zum Herstellen von Zellkulturträgern nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in dem dritten Schritt das Sintern in atmosphärischer Luft durchgeführt wird.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren unter Verwendung der Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 11 durchgeführt wird.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Kulturlösung, die die Zellkulturträger nach einem der Ansprüche 1 bis 11 sowie Zellen enthält, die Zellen in Kontakt mit den Zellkulturträgern gebracht werden, so dass die Zellen an die Oberflächen der Zellkulturträger anhaften und dort wachsen.
Verfahren zum Kultivieren von Zellen nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die auf den Zellkulturträgern gewachsenen Zellen von den Zellkulturträgern gelöst werden.