DE112016001386B4

DE112016001386B4 - Kohlenstoffpartikel und Komposite derselben für die Regeneration von Skelettmuskelgewebe und Weichgewebe

Info

Publication number: DE112016001386B4
Application number: DE112016001386.8T
Authority: DE
Inventors: Stephen Miller; Nora Strong; Joel White
Original assignee: Wichita State University
Current assignee: Wichita State University
Priority date: 2015-03-25
Filing date: 2016-03-23
Publication date: 2018-10-25
Anticipated expiration: 2036-03-24
Also published as: WO2016154289A1; DE112016001386T5; US20180104380A1

Abstract

Zusammensetzung für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen, wobei die Zusammensetzung eine Vielzahl von kohlenstoffartigen Partikeln und mindestens ein osteopromotives und/oder therapeutisches Mittel umfasst, wobei die kohlenstoffartigen Partikel nicht-makroporöse, granulöse Körper sind, die in einer Trägermatrix dispergiert oder in einen biokompatiblen Netzbehälter eingeschlossen sind.

Description

HINTERGRUND
Regenerative Medizin, bei der Therapeutika, Vorrichtungen, und Reparaturzellen verabreicht werden, damit der Körper sich selbst heilt, ist gegenwärtig eines der am schnellsten wachsenden Gebiete in der medizinischen Praxis. Die klinische Bedeutung dieser neuen Ansätze wurde jedoch bislang wegen des Fehlens von Materialien und geeigneten Geometrien, welche die Erfordernisse von Sicherheit, Wirksamkeit, Anwenderfreundlichkeit und Kosteneffektivität erfüllen, beschränkt.
Knochen ist ein regeneratives Gewebe, das manchmal einen Frakturschaden und kleine Löcher wirksam reparieren kann, wobei jedoch Traumata, die zum Verlust eines großen Knochensegments führen, die Verwendung eines Füllmaterials für Knochendefekte erforderlich machen, um die Lücke zwischen den Knochensegmenten zu überbrücken. Füllmaterialien für Knochendefekte sind natürliche oder synthetische Materialien, die in den Knochendefekt eingebracht werden, um bei der Regeneration des Knochens zu helfen und eine dreidimensionale Struktur bereitzustellen, an die Knochengewebe und Zellen sich anlagern können oder transplantiert werden können, um wieder anzuwachsen und beschädigte Knochensegmente zu reparieren. Zu diesem Zweck können autologe, allogene oder xenogene Knochentransplantate verwendet werden. Bei einer großen traumatischen Verletzung jedoch steht zu wenig autologer Knochen zur Verfügung, als dass Füllmaterial vermieden werden könnte. Darüber hinaus verursacht der Erhalt von Transplantat von der Donor-Stelle zur Bereitstellung des Knochen-Autotransplantats für den Patienten ein sekundäres Trauma. Dies wird durch die Verwendung von Allotransplantaten und Xenotransplantaten verhindert, wobei diese Knochentransplantate jedoch Krankheitserreger übertragen und abträgliche Immunantworten auslösen können, und wobei ihre Wirksamkeit durch klinische Daten der Evidenzklasse I nicht gestützt ist.
Allogene und synthetische Knochenfüllmaterialien, wie beispielsweise demineralisierte Knochenmatrix, keramische Körnchen oder Polymethyl-Methacrylat sind ebenfalls klinisch verwendet worden. Diese Knochenfüllmaterialien werden im Allgemeinen zur Verwendung lediglich in Lücken vorgesehen, die für die Stabilität der Knochenstruktur nicht von Bedeutung sind, da die meisten kommerziell erhältlichen Materialien eine unzureichende Stärke aufweisen, um den in einer bestimmten anatomischen Umgebung wirkenden Kompression- und Zugkräften zu widerstehen. Implantate, die für Knochendefekte verwendet werden, welche für die strukturelle Stabilität des Knochens wichtig sind, umfassen oftmals permanente Implantationsmaterialien, die aus Metall, Polymeren oder Kompositen hergestellt sind. Diese Arten von Implantaten weisen den Nachteil auf, dass sie zu Korrosion oder Auslaugen neigen. Darüber hinaus sind alle Metalle, die als orthopädische Implantate verwendet werden, die meisten keramischen Materialien und zahlreiche Polymere nicht bioresorbierbar, und sie können daher durch den eigenen Knochen des Patienten nicht ersetzt werden. Somit besteht ein Bedürfnis im Stand der Technik nach einem temporären Füllmaterial für Knochendefekte, dass eine Matrize für die Remodellierung des Knochens und für osteogene Signale bereitstellt, und sich darüber hinaus über die Zeit abbaut, resorbiert wird und durch Knochengewebe ersetzt wird bis die Bildung/Regeneration des Knochens vollständig ist.
Die Praxis der orthopädischen Medizin wird gegenwärtig durch das Fehlen von geeigneten Knochentransplantationsmaterialien, welche diese stringenten Kriterien erfüllen, entscheidend aufgehalten. Unter diesen limitierenden Faktoren sind Morbiditäten an der Entnahmestelle (für autologe Knochentransplantate), der Mangel an geeigneten Donoren und gesundem Gewebe (Allotransplantate), das Fehlen von klinischen Hinweisen für die Induktion von neuem Knochen (synthetische Glasmaterialien und keramische Materialien), und die kürzliche Entdeckung von wichtigen off-Target-Wirkungen bei dem gegenwärtig bedeutendsten Knochentransplantatersatzmaterial, dass auf der Verabreichung von wirksamen Zytokinen (BMP-2) auf einem Kollagenschwamm beruht (In-Fuse, Medtronic, Inc.).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben zuvor ausführliche Machbarkeitsstudien in Bezug auf Knochenregeneration unter Verwendung von monolithischen, porösen glasartigen Kohlenstoff-Implantationsmaterialien, wie sie in US 2012/0185047 A1 und US 2012/0095558 A1 beschrieben werden, die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind, durchgeführt. Es gibt auch weiterhin unbefriedigte Bedürfnisse nach Knochentransplantationsverfahren, die außerhalb der besonderen klinischen Erfordernisse einer Reparatur von Röhrenknochen-Defekten und einer Spinalfusion liegen. Diese umfassen spezialisierte Verfahren, wie beispielsweise die Stabilisierung von Wirbelbrüchen, Reparatur von widerspenstigen Nicht-Vereinigungen, oral-maxillofaziale und dentale Reparatur, Wiederherstellung von Entnahmestellen im Beckenkamm, Wiederherstellung der Röhrenknochen-Anatomie nach intensiver Resektion nach Tumorentfernung sowie auch Weichgewebe-Reparatur. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erhebliche Bemühungen unternommen, um den Bereich der klinischen Anwendungen, in denen Materialien aus glasartigem Kohlenstoffschaum (vitreous carbon foam; VCF) verwendet werden können, zu erweitern, wobei eine besondere Betonung auf orthopädischen Anwendungen liegt, wobei jedoch auch gleichermaßen eine Anwendung bei der Weichgewebe-Reparatur, die vaskuläre, epidermale, hepatische und kardiäre Gewebe umfasst, möglich ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft im weitesten Sinne Zusammensetzungen für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen, die eine Vielzahl von kohlenstoffartigen Partikeln und mindestens ein osteopromotives und/oder therapeutisches Mittel umfasst, wobei die kohlenstoffartigen Partikel nicht-makroporöse, granulöse Körper sind, die in einer Trägermatrix dispergiert oder in einen biokompatiblen Netzbehälter eingeschlossen sind. Die kohlenstoffartigen Partikel haben vorzugsweise eine maximale Oberfläche-zu-Oberfläche-Ausdehnung von weniger als etwa 1000 µm, und in einigen Ausführungsformen leiten sich die kohlenstoffartigen Partikel von Kohlenstoffschaum ab. Dies bedeutet, dass die Körner des Kohlenstoffschaums eine intrinsische Mikroporosität aufweisen können (10-20 µm, bis in den Bereich von Nanometern), wobei jedoch die makroporöse Struktur nicht länger intakt ist. Die Partikel können in einer Trägermatrix dispergiert sein. Das mindestens eine osteopromotive und/oder therapeutische Mittel kann einzeln in der Trägermatrix dispergiert sein, kann jedoch auch/alternativ dazu als Teil einer Beschichtung der kohlenstoffartigen Partikel in der Zusammensetzung vorhanden sein.
Ebenfalls beschrieben werden vorliegend Implantate für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen. In einem Aspekt kann das Implantat eine Zusammensetzung gemäß der zahlreichen, vorliegend offenbarten Ausführungsformen umfassen sowie einen biokompatiblen Netzbehälter, der die Zusammensetzung einschließt. In einem Aspekt kann das Implantat eine Zusammensetzung nach einer der zahlreichen, vorliegend offenbarten Ausführungsformen und ein biokompatibles Gerüst (z.B. ein Kollagen-Schwamm, eine Polymer-Lage, usw.), in der die Zusammensetzung eingebettet ist, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden ferner für die Verwendung in einem Verfahren für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen in einem Subjekt, das dieser bedarf, beschrieben. Das Verfahren umfasst im allgemeinen die Bereitstellung einer Zusammensetzung gemäß der zahlreichen, vorliegend offenbarten Ausführungsformen und die Implantation der Zusammensetzung in das Subjekt an einer Implantationsstelle, die einen Knochendefekt oder einen Gewebeschaden aufweist. Als Teil der Implantation kann die Zusammensetzung in die gewünschte Form gegossen oder gebogen werden, sodass sie sich an die Konturen der Implantationsstelle anpasst und eine genaue Schnittstelle mit dem umliegenden gesunden Knochen oder Gewebe bereitstellt. Die Implantation kann ferner bewerkstelligt werden, indem man die Zusammensetzung mit einer Spritze gezielt an der Implantationsstelle verteilt.
Kits für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen in einem Subjekt, das diese benötigt, werden ebenfalls beschrieben. Die Kits umfassen im allgemeinen eine Zusammensetzung gemäß der zahlreichen, vorliegend offenbarten Ausführungsformen und Instruktionen für die Implantation derselben in ein Subjekt an einer Implantationsstelle, die einen Knochendefekt oder einen Gewebeschaden aufweist. Geeignete Werkzeuge können ebenfalls in den Kit eingebracht werden, einschließlich einer Spritze zum Verteilen der Zusammensetzung (die wahlweise mit der Zusammensetzung vorgefüllt sein kann), Werkzeuge für das Ausformen und das Gießen der Zusammensetzung, Fixierungsmittel für das Sichern der Zusammensetzung/des Implantats an der Implantationsstelle, und Ähnliches.
Figurenliste
Das Patent oder die Anmeldung enthält mindestens eine Zeichnung, die farbig ausgestaltet ist. Kopien der Veröffentlichung dieses Patents oder dieser Patentanmeldung mit farbiger Zeichnung oder farbigen Zeichnungen wird das Amt auf Nachfrage und gegen Zahlung der erforderlichen Gebühr bereitstellen.

Figur (Fig.) 1A ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von netzartigem, glasartigem Kohlenstoff (reticulated vitreous carbon, RVC)-Schaum mit Markierungen, um die Knoten, Ligamente und Zellen zu verdeutlichen, welche die Matrix-Mikrostruktur aufbauen;
1B ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 45 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden;
1C ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 80 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden bei 25-facher Vergrößerung;
1D ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 80 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden bei 50-facher Vergrößerung;
1E ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 80 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden bei 75-facher Vergrößerung;
1F ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 100 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden bei 23-facher Vergrößerung;
1G ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 100 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden bei 50-facher Vergrößerung;
1H ist ein rasterelektronenmikroskopisches Bild von 100 ppi RVC, der fragmentiert wurde, um die Ligamente und Knoten aufzubrechen und von Kohlenstoffschaum abgeleitete Partikel zu bilden bei 200-facher Vergrößerung;
2 ist eine Abbildung des BMP-2 Adsorptionsassays unter Verwendung des DUOCEL®-Kohlenstoffschaums;
3 ist eine Abbildung, die die Bioaktivität von BMP-2, welches auf dem Kohlenstoffschaum adsorbiert ist, zeigt;
4 ist eine Abbildung, die die Ergebnisse aus den Experimenten zur Aktivität der alkalischen Phosphatase in Maus-Myoblasten zeigt;
5 ist eine Abbildung, die die Ergebnisse aus den Experimenten zur Aktivität der alkalischen Phosphatase in humanen Osteoblasten zeigt;
6 ist eine Abbildung der ELISA-Testergebnisse für den BMP-2-Assay;
7 ist eine Abbildung der ELISA-Testergebnisse für den BMP-2-Assay nach zusätzlichem Spülen mit PBS;
8 ist eine Abbildung der Ergebnisse des MTT-Assays zur Bestimmung der Replikation der Maus-Myoblasten, wobei die Werte auf der Y-Achse den relativen MTT-Metabolismus anzeigen (normalisiert in Bezug auf Tag 1, Kontrolle = 1);
9 ist eine Abbildung der spezifischen Aktivität der alkalischen Phosphatase bei Induktion von BMP, das an den Kohlenstoffschaum gebunden ist;
10 ist ein Flussdiagramm des Untersuchungsprotokolls für Beispiel 3;
11A ist eine Abbildung der Ergebnisse des Protein-Freisetzungstests für Albumin;
11B ist eine Abbildung der Ergebnisse des Protein-Freisetzungstests für BMP-2;
11C ist eine Abbildung der Ergebnisse des Protein-Freisetzungstests für Kollagen-1;
12 zeigt Bilder einer Immunzytofluoreszenz-Analyse von induzierten Osteoblasten;
13 zeigt die Ergebnisse der Kultivierung von Zellen, die auf Kohlenstoffschaum kultiviert wurden, der mit Albumin, BMP-2, Kollagen-1 und Wasser behandelt wurde;
14 ist eine Abbildung die eine Bindung von BMP-2 an Kohlenstoffschaum-Partikel zeigt, wobei eine Induktion der alkalischen Phosphatase in C2C12-Maus-Myoblasten-Zellen verwendet wurde; und
15 zeigt Bilder der ektopischen Knochenbildung, die durch Kohlenstoffschaum-Partikel oder mit BMP-2 beschichtete Kohlenstoffschaum-Partikel, die für 30 Tage in einen abdominalen Muskelbeutel einer Lewis-Ratte implantiert wurden, wobei die Messung unter Verwendung von Mikro-CT erfolgte.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die nachstehenden Ausführungen beschreiben die Erfindung mit Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen, welche in den Figuren veranschaulicht sein können. Es sollte jedoch verstanden werden, dass diese bevorzugten Ausführungsformen lediglich beispielhaft gezeigt werden, und keine dieser Ausführungen sollte dahingehend verstanden werden, dass sie den Gesamtschutzbereich der beanspruchten Erfindung einschränkt. Die verschiedenen Ausführungsformen, die in den Figuren gezeigt werden, und die vorliegend beschrieben werden, schließen sich nicht notwendigerweise gegenseitig aus, solange dies vorliegend nicht anderweitig erwähnt wird. Beispielsweise kann ein in einer Ausführungsform beschriebenes oder gezeigtes Merkmal auch in anderen Ausführungsformen eingeschlossen werden, wobei es jedoch nicht notwendigerweise eingeschlossen wird. Somit umfasst die vorliegende Erfindung eine Vielzahl von Kombinationen und/oder Einbindungen der vorliegend beschriebenen, spezifischen Ausführungsformen.
Die Erfindung stellt kohlenstoffartige Partikel, die wahlweise in einer Trägermatrix dispergiert oder in einen biokompatiblen Netzbehälter eingeschlossen sind, für die Regeneration von Knochen und/oder Weichgewebe bereit. Wie vorliegend verwendet bezeichnet „kohlenstoffartige Partikel“ 3-dimensionale Partikel, die aus Kohlenstoffatomen bestehen, und insbesondere Kohlenstoff-Allotrope, wie beispielsweise amorphe Kohlenstoffe, glasartige Kohlenstoffe, pyrolytische Kohlenstoffe, Graphit-haltige Kohlenstoffe, und Kombination derselben, wobei jedoch Kohlenstofffaser und Kohlenstoffnanoröhrchen ausdrücklich ausgeschlossen sind. In einigen Ausführungsformen werden Partikel erzeugt, indem ein poröses kohlenstoffartiges Vorläufermaterial in einzelne sich frei bewegende Partikel oder Körner zermahlen oder fragmentiert wird. In einigen Ausführungsformen können die Partikel durch die Zerkleinerung von Kohlenstoffschaum-Strukturen erhalten werden. Um die Bezugnahme zu vereinfachen, wird der Begriff „Kohlenstoffschaum“ vorliegend in bevorzugten Ausführungsformen, soweit es nicht anders angegeben wird, verwendet, um glasartige Kohlenstoffschäume zu beschreiben, wobei jedoch Graphit-haltige und pyrolytische Kohlenstoffe eingeschlossen sind. Alle Kohlenstoffschäume haben eine gemeinsame Morphologie, die dreidimensionale Bindungen zwischen Kohlenstoff-Atomen zur Bildung von Knoten und Ligamente umfasst, die dreidimensional verknüpft sind, wodurch eine offene zelluläre Struktur gebildet wird. Die Zellwände, Knoten und Ligamente bilden gemeinsam das miteinander verbundene Netzwerk (d.h. die kontinuierliche Phase) der Schaummatrix, welches die offenen Räume der Matrix definiert, wobei die Poren diejenigen offenen Räume oder Löcher sind, welche durch die Zellwände gebildet werden. Siehe 1A für eine bildliche Bezugnahme. Geeignete Kohlenstoffschäume zur Verwendung im Rahmen der Erfindung umfassen (ohne Einschränkung) pyrolytische Kohlenstoffschäume, glasartige Kohlenstoffschäume, aktivierte Kohlenstoffe und ähnliches. Die kohlenstoffartige Matrix hat eine offene Zellstruktur und ist stärker bevorzugt ein netzartiger, glasartiger Kohlenstoffschaum. Netzartige, glasartige Kohlenstoffschäume weisen miteinander verbundene Poren innerhalb der Matrix auf, die die Passage von Gas oder Flüssigkeit durch die offenen Räume von einer Zelle in die nächste ermöglichen, im Gegensatz zu geschlossenen Zellstrukturen, bei denen die Zellen vollständig von ihren Wänden eingeschlossen sind und keine miteinander verbundenen Öffnungen aufweisen. Es wird verstanden werden, dass eine Kombination von offenen und geschlossenen Zellstrukturen auch in dem kohlenstoffartigen Vorläufer-Material vorhanden sein kann.
Unabhängig davon wird das poröse kohlenstoffartige Vorläufer-Material pulverisiert, zermahlen oder anderweitig in einzelne Partikel fragmentiert, sodass die einzelnen Partikel erfindungsgemäß ihrerseits nicht länger dadurch charakterisiert sind, dass sie eine poröse Matrixstruktur aufweisen. Mit anderen Worten sind die resultierenden Partikel einzelne, feste (monolithische) Körper ohne Makroporosität im Gegensatz zum ursprünglichen, kontinuierlichen, porösen Material. Bei Kombination, Vermischen und/oder Aggregation bildet diese gewollte Aggregation von Partikeln jedoch erneut interstitielle Räume zwischen den einzelnen, diskreten Partikeln aus, was eine artifizielle „Porosität“ in der aggregierten Mischung bildet. Diese artifizielle „Porosität“ trägt zu einem wesentlichen Gas/Flüssigkeit-Fluss und zu einem Eindringen von Zellen bei Begrenzung (wie in einer Knochenlücke oder in einem Knochendefekt) bei. Die resultierenden Partikel bestehen vorzugsweise im Wesentlichen aus dem kohlenstoffartigen Material oder sie bestehen sogar aus dem kohlenstoffartigen Material.
Die Partikelgröße der resultierenden Partikel wird zu einem gewissen Grad von der Porengröße des kohlenstoffartigen Vorläufer-Materials abhängen sowie auch vom Ausmaß, in dem das Vorläufer-Material einer Pulverisierung unterzogen wird. Dies bedeutet, dass die Partikel einfach dadurch gebildet werden können, dass das Vorläufer-Material zerbrochen, fragmentiert oder entlang der Ligamente der Matrix aufgebrochen wird, wodurch die poröse Struktur zerstört wird, was zu ungleichmäßigen, nicht-porösen Kohlenstoffschaum-Fragmenten führt (mit Verstrebungen/Ligamenten, die sich vom Körper des Partikels ausdehnen, jedoch wie die Form eines „Toy Jack“). Jedoch können die zerbrochenen, nicht-porösen Stücke des Kohlenstoffschaums weiter in kleinere und kleinere einzelne Stücke pulverisiert werden und letztendlich in einen Puder (der eine einheitlichere regelmäßigere Partikelform und Partikelgröße aufweisen kann). Somit umfasst der Begriff „Partikel“ wie vorliegend verwendet größere nicht-poröse Körper, die eher Körnchen-förmig sind, sowie auch kleinere Puderartige, nicht-poröse Partikel aus kohlenstoffartigem Material. Ferner sollte verstanden werden, dass die Begriffe „Partikel“ und „Körnchen“ vorliegend austauschbar verwendet werden können und nicht notwendigerweise auf Partikel einer Zellengröße Bezug nehmen, soweit dies nicht anderweitig angemerkt wird. Siehe 1B.

In einer oder in mehreren Ausführungsformen umfasst das Verfahren zunächst das Zerkleinern oder die Fragmentierung des porösen kohlenstoffartigen Vorläufer-Materials in einzelne, sich frei bewegende Partikel oder Körnchen der gewünschten Größe. In einer oder in mehreren Ausführungsformen kann das kohlenstoffartige Vorläufer-Material zerkleinert oder fragmentiert werden, indem man zwischen zwei sich gegenüberliegenden Oberflächen eine transiente, vertikal orientierte Kraft auf das kohlenstoffartige Material anwendet. Dieser Ansatz führt üblicherweise zu unregelmäßigen Fragmenten die eine ungefähre Ausdehnung von 50-1000 µm aufweisen, abhängig von der Porosität (und damit von den Ausdehnungen der Verstrebungen/Ligamente) des ausgewählten Vorläufer-Kohlenstoffschaum-Materials (siehe Tabelle I). Tabelle I. Nominale Ausdehnungen von Partikeln, die durch eine Kompressionszerkleinerung von 45,80 und 100 ppi glasartigen Kohlenstoffschaum (DuoCel, ERG Aerospace, Oakland, CA) erhalten wurde.

Kohlenstoffschaum Porosität (Poren pro Inch)	45 ppi	80 ppi	100 ppi
Maximaler mittlerer Durchmesser (Bereich)	560	321	139
Standardfehler des Mittelwerts	202	168	64
Minimaler mittlerer Durchmesser (Bereich)	153	93	50
Standardfehler des Mittelwerts	69	35	12
Fläche (µm²)	0.085	0.031	0.0072

Die Längeneinheiten sind in Mikrometer (µm) angegeben. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen allen Messgruppen waren bei P<0.0001 (gepaarter T-Test). Der „Durchmesser“ bezieht sich auf die maximale Oberfläche-zu-Oberfläche-Ausdehnung des Partikels (d.h. die größte Ausdehnung des Partikels).
Somit können die Partikelgrößen für unregelmäßige nicht-poröse Kohlenstoffschaumfragmente bis zu etwa 1000 µm betragen, und den gesamten Bereich bis zu etwa 40 µm abdecken. Es wird verständlich sein, dass zahllose Partikelausdehnungen erreicht werden können, indem man spezifische Morphologien des Kohlenstoffschaum-Vorläufers auswählt, die geeignete Ausdehnungen aufweisen (Porosität, Ligament-Länge), um zerkleinerte Teile der Zielgröße zu erhalten (wobei sich eine weitere Pulverisierung des zuvor zerkleinerten Schaums anschließen kann oder auch nicht).
In anderen Ausführungsformen kann das kohlenstoffartige Vorläufer-Material Scherkräften unterworfen werden, wie beispielsweise solchen, die erzeugt werden können, indem man das Material zwischen zwei sich gegenüberliegenden Oberflächen einbringt, wobei sich diese in entgegengesetzte Richtungen horizontal bewegen, sobald Kraft auf den Kohlenstoff ausgeübt wird. Dieses Vorgehen führt zu Partikeln, die einen breiteren Größenbereich von größer dimensionierten Partikeln mit einer größeren Unregelmäßigkeit in Bezug auf die Form aufweisen. In anderen Ausführungsformen können die resultierenden Partikel ferner einer Pulverisierung unterzogen werden, wobei ein Mörser und ein Pistill verwendet werden, um einen feinen Kohlenstoff-Puder mit kleineren einheitlichen Ausdehnungen zu erhalten. Unabhängig von der Ausführungsform kann diesem Pulverisierungs-Prozess ein Sortieren und Gruppieren der Materialien nach Größe folgen, wie beispielsweise Sieben, um einzelne Größenbereiche zu erhalten, die für die gewünschte Anwendung geeignet sind.
Beispielhafte Kohlenstoffschäume zur Verwendung als Vorläufer im Rahmen der Erfindung sind kommerziell von mehreren Herstellern erhältlich, einschließlich -ohne Einschränkung- ERG Aerospace Corp., Oakland, CA (DUOCEL® RVC 45, 60, 80, and 100 glasartiger Kohlenstoffschaum); GrafTech International, Parma, OH (GRAFOAM® FPA-02, -05, -10, -20, und -35 Graphit-haltiger Schaum); PocoGraphite, Inc., Decatur, TX (POCOfoam® Graphit-haltiger Schaum); Koppers, Pittsburgh, PA (KFOAM® L1, L1a, und D1 Graphit-haltiger Schaum); Touchstone Research Laboratory, Ltd., Triadelphia, WV (CFOAM® 20, oder 25); und Ultramet, Pacoima CA (RVC 65 PPI, 80 PPI, RVC mit CVD Materialien, und RVC mit integral gebundener Beschichtung). Verfahren zur Herstellung von Kohlenstoffschäumen sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich US-Patentnummern US 6 103 149 A , US 6 656 238 B1 , US 6 656 239 B1 und US 6 749 652 B1 , die vorliegend soweit durch Bezugnahme eingeschlossen sind, als dass sie mit der vorliegenden Offenbarung nicht inkonsistent sind.
Darüber hinaus sollte verstanden werden, dass andere nicht schaumartige Kohlenstoff-Rohmaterialien als Vorläufer für die Fragmentierung verwendet werden können, sofern andere Formen oder Größen der Kohlenstoffpartikel gewünscht werden. Wenn die Partikelgröße verringert wird, ist die Partikelform immer weniger abhängig von der Form des Vorläufer-Rohmaterials, und die molekulare Struktur des Materials selbst wird wichtiger. Zur Verwendung im Rahmen der Erfindung kann eine Vielzahl von nahezu einheitlichen, monodispersen Partikelsammlungen in Kombination mit osteogenen Bestandteilen genutzt werden, um das Knochenwachstum zu fördern. Alternativ dazu kann eine Vielzahl von Partikeln mit variierender Partikelgröße (polydisperse Sammlung) mit osteogenen Bestandteilen kombiniert werden, um ein morphologisch-heterogenes Transplantat zu bilden. Es wird ferner angestrebt, dass kohlenstoffartige Partikel zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung Materialien umfassen, die in Partikelform synthetisiert wurden oder anderweitig in Partikelform erhalten wurden (und nicht durch Zerreiben oder Pulverisieren von größeren Vorläufer-Strukturen). Solche Materialien können durch Extrusion, dreidimensionales Drucken oder Ähnliches erzeugt werden.
In einer oder in mehreren Ausführungsformen sind die kohlenstoffartigen Partikel in einer Trägermatrix dispergiert, die die Kohäsion und die Formbarkeit erhöht, sodass eine fließfähige Komposit-Zusammensetzung erhalten wird. Beispielhafte Träger umfassen beliebige biokompatible und bioabbaubare Matrix-Materialien, wie beispielsweise eine Matrix vom Gel- oder Hydrogel-Typ (oder einen Gel- oder Hydrogel-Vorläufer, der anschließend geliert wird), in der die Partikel dispergiert werden können, sodass ein autarker Körper erhalten wird. Der Begriff „autarker Körper“ bedeutet, dass das Komposit seine Form ohne eine externe Stützstruktur beibehält, und nicht lediglich aufgrund seiner eigenen internen Kräfte für eine Deformation anfällig ist. Der autarke Körper ist jedoch „fließfähig“, was bedeutet, dass er biegsam und deformierbar ist, wie ein Gel, eine Spachtelmasse (Putty) oder eine Paste, ohne Brechen oder Rissbildung. Mit anderen Worten wird der autarke Körper sich nach Biegung, Dehnung, Knickung und/oder Kompression nicht in eine Form zurückbiegen oder in diese Form zurückspringen. Wenn somit ein externer Druck oder eine Kraft auf den autarken Körper angewendet wird, kann dieser im Hinblick auf die Zielstelle für die Implantation geformt, gegossen, in eine Form gebracht, extrudiert und/oder injiziert werden, wie es angebracht ist. In einer oder in mehreren Ausführungsformen ist die fließfähige Komposit-Zusammensetzung durch eine Spritze applizierbar, was bedeutet, dass sie in einer Spritze aufgezogen und/oder aus einer Spritze ausgestoßen werden kann. Geeignete Träger können, ohne Einschränkung, Gelatine, Carboxymethylcellulose, Hyaluronsäure, Phosphatidylcholin, Atelokollagen (solubilisiertes Kollagen), und Ähnliches umfassen. Das Gewichtsverhältnis von Kohlenstoffpartikel zu Träger kann breit variieren, wobei beispielhafte Bereiche von etwa 1:2 bis etwa 1:10 umfassen, und vorzugsweise etwa 1:4.
In einer oder in mehreren Ausführungsformen kann die Trägermatrix ferner wahlweise Kohäsionsmittel umfassen. Beispiele für natürliche Kohäsionsmittel umfassen, ohne Einschränkung, Kollagen (z.B. zerriebenes), Albumin, nicht-quervernetzte Kollagenfasern, Chitin, Chitosan, Seide, Carbonfasern und Ähnliches. Demineralisierte Knochenmatrix (DBM) kann ebenfalls als Kohäsionsmittel verwendet werden (so wie auch ein osteopromotives Mittel). Sofern vorhanden wird das Gewichtsverhältnis von Träger zu Kohäsionsmittel von etwa 0,5:1 bis etwa 1:5 reichen, und vorzugsweise etwa 1:1 betragen.
Synthetische Kolloide, Hydrogele oder Kryogele, die aus Polymeren, wie beispielsweise Polyvinylalkohol, Polyurethan oder Polyacrylamid, bestehen, können ebenfalls mit KohlenstoffPartikeln mit oder ohne vorherige Adsorption mit einem therapeutischen Bestandteil erzeugt werden. Es wird verständlich sein, dass Kohlenstoffpartikel, die in polymere Materialien eingebettet sind, in chirurgischen Verfahren ohne Träger oder Kohäsionsmittel verabreicht werden können. Diese vollständig synthetischen Implantat-Materialien können durch Veränderung der Reaktionsbedingungen die Form eines festen Blatts (sheet) annehmen, oder es kann sich um geringfügig viskose aber kohärente Gele handeln, die durch Ausstoßen aus einer Spritze verabreicht werden können.
In einer oder in mehreren Ausführungsformen kann das Komposit ferner eine wässrige Salzlösung, wie beispielsweise eine Phosphat-gepufferte Salzlösung, eine physiologische Salzlösung, eine Salzlösung nach Hank oder deionisiertes Wasser oder andere biokompatible Lösungsmittelsysteme umfassen, um das einheitliche Dispergieren und Anfeuchten der Komposit-Mischung (d.h. der kohlenstoffartigen Partikel, des Trägers und wahlweise des Kohäsionsmittels) durch die Matrix hinweg zu unterstützen. Sofern vorhanden wird das Verhältnis von Träger zu Pufferlösung von etwa 0,5:1 bis etwa 5:1 betragen, und vorzugsweise etwa 2:1.
In einer alternativen Ausführungsform können die kohlenstoffartigen Partikel anstatt in eine Trägermatrix dispergiert zu werden in einen biokompatiblen Netzbehälter eingeschlossen werden. Die Maschengröße des Behälters wird basierend auf der kleinsten Partikelgröße der Partikel ausgewählt werden. Beispiele für geeignete biokompatible Netz-Materialien umfassen ein Polyethylenterephthalat (PET)-Netz, ein Polyester-Netz und Ähnliches.
Unabhängig von der Ausführungsform werden die Partikel mit einem oder mit mehreren osteopromotiven und/oder therapeutischen Mitteln kombiniert. In einer oder mehreren Ausführungsformen werden die Kohlenstoff-Partikel mit therapeutischen und/oder osteopromotiven Mitteln (die selbst in Partikelform vorliegen können) gemischt. In einer oder in mehreren Ausführungsformen kann eine Beschichtung, ein Film oder eine monomolekulare Schicht eines therapeutischen und/oder osteopromotiven Mittels auf der Oberfläche des einzelnen Kohlenstoffpartikels mobilisiert werden. „Osteopromotive“ Mittel sind Materialien, die eine Knochenbildung ermöglichen oder verstärken. Es wird verständlich sein, dass ein bestimmtes Material sowohl osteopromotiv als auch therapeutisch sein kann, und diese Kategorien sind deskriptiv und nicht notwendigerweise einander ausschließend. Osteopromotive Materialien umfassen sowohl osteoinduktive Zusammensetzungen als auch osteokonduktive Zusammensetzungen. Zum Vergleich: osteokonduktive Zusammensetzungen sind solche, die ein Knochenwachstum über die Oberfläche des Materials erlauben oder sogar verstärken (wobei dies jedoch oftmals ein zusätzliches osteoinduktives Signal benötigt), und umfassen allogene oder autogene Knochenfragmente, Calciumphosphat, bioaktive Keramiken (z.B. synthetisches Hydroxylapatit, Korallin, gesinterten Knochen (Bio Oss®), poröses Polycaprolacton und Kombinationen davon. Osteoinduktive Materialien stimulieren aus Osteo-Vorläuferzellen dazu, sich in Osteoblasten zu differenzieren, die dann eine Bildung von neuem Knochen beginnen, und sie umfassen Zytokine, demineralisierte Knochenmatrix (DBM) und Ähnliches. Therapeutisch nützliche Zytokine umfassen knochenmorphogenetische Proteine („BMPs“), Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktoren, Parathyroid-Hormon, von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktoren, epidermaler Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und Ähnliches. Nützliche biologische Therapeutika die mit den Kohlenstoffpartikeln verwendet werden können umfassen Heparin, Chondroitinsulfat, Blutplättchen-reiches Plasma, Knochenmark-Aspirat, oder mesenchymale Stammzellen. Es wird verständlich sein, dass einige dieser Therapeutika mit den Kohlenstoffpartikeln und/oder Trägern vorgemischt und für die weitere Verwendung gelagert werden können während andere, labilere oder autologe Materialien am Ort der Versorgung eingeführt werden kann. Andere osteopromotive Mittel zur Verwendung im Rahmen der Erfindung umfassen Nukleinsäure-Vektoren (z.B. Plasmid-DNA, cDNA, mikroRNA, 1gRNA, siRNA, Adenovirus-assoziierte oder RNAi-Konstrukte), die Nukleinsäure-Sequenzen umfassen, welche Proteine kodieren, oder RNAs , von denen aus in vitro Studien oder aus präklinischen Studien bekannt ist, dass sie osteopromotiv sind. Andere therapeutische Mittel zur Verwendung im Rahmen der Erfindung umfassen Small Molecule-Wirkstoffe sowie auch biologische Wirkstoffe. Beispielhafte Small Molecule-Wirkstoffe umfassen Antibiotika (z.B. Vancomycin, Tobramycin, Gentamicin, nanopartikuläres Silber), Anti-entzündliche Mittel (z.B. COX-1, COX-2, steroidale Mittel), und Anti-Gerinnungsmittel (z.B. konjugierte Heparine, Warfarin). Eine zusätzliche Klasse von Therapeutika umfasst Small Molecules, von denen man weiß, dass sie synergistisch oder agonistisch in Bezug auf therapeutische Signalübertragungswege wirken. Beispielhafte therapeutische, biologische Wirkstoffe umfassen Proteine die aus tierischen Geweben isoliert wurden, wie beispielsweise Kollagen, Fibrin, Fibrinogen, Vitronectin und Immunglobuline sowie auch synthetische therapeutische monoklonale Antikörper.
Es wird verständlich sein, dass zahlreiche der obigen Materialien allein oder in Kombination verwendet werden können. Es wird ferner verständlich sein, dass die obigen Materialien mit osteogenen Knochen-bildenden Strategien kombiniert werden können, die eine ex vivo Manipulation, eine Anhaftung von Material, eine Replikation und differenzierte Funktion von exogenen Zellen an die oben erwähnten osteokonduktiven Materialien einschließen. Es können beispielsweise explantierte, minimal veränderte Zellen entweder aus dem Patienten (Autotransplantat) oder aus Donoren (Allotransplantat) verwendet werden, um Knochenwachstum zu verstärken, einschließlich adulter Stammzellen (z.B. Knochenmark, Nabelschnurblut, usw.), von Knochen abgeleiteter Osteoblasten, aus Knorpel isolierter Chondrozyten, und komplexer, undefinierter Zellpopulationen, die gegenwärtig in klinischer Nutzung sind, einschließlich Knochenmark-Aspirat und Blutplättchen-reiches Plasma. Genetisch manipulierte allogene immunkompatible Zellen, die osteoinduktive Wachstumsfaktoren, Zytokine oder Zellanhaftungs-Proteine exprimieren, können ebenfalls therapeutisches Potenzial im Zusammenhang mit den vorliegend beschriebenen Materialien aufweisen.
Bei ihrer Verwendung werden die Partikel zunächst in 100 % Ethanol eingeweicht, um alle verbleibenden Oberflächenkontaminationen, die nach dem Herstellung-und Verarbeitungsprozess übrig geblieben sind, zu entfernen, und sie werden anschließend sterilisiert, entweder durch Kontakt mit 70-prozentigem Ethanol oder durch Autoklavieren mit Dampf. Nach dieser Vorbereitung der Oberfläche sind die kohlenstoffartigen Partikel bereit, um mit den osteopromotiven und/oder therapeutischen Mitteln kombiniert zu werden. In einigen Ausführungsformen werden die Partikel im Hinblick auf eine Adsorption von osteopromotiven und/oder therapeutischen Mitteln optimiert, die in wirksamer Weise an einer Wunde oder an einer defekten Stelle angewendet werden können. Das direkteste Verfahren zur Anwendung der Materialien auf die Partikel ist durch direkten Kontakt mit den kohlenstoffartigen Partikeln in einer wässrigen Lösung, die in Bezug auf die Konzentration des Therapeutikums, pH, Ionenstärke und den Einschluss anderer Solute, wie beispielsweise Salze, Tenside, komplexe Kohlenhydrate, Glycosaminoglycane, Lipide und Ähnliches, optimiert worden ist.
Zur Beladung der therapeutischen und/oder osteopromotiven Mittel, wie beispielsweise rhBMP-2 werden die zuvor sterilisierten Partikel beispielsweise zunächst in dem selben Lösungsmittel-System verwendet, das zuvor für die Bereitstellung von rhBMP-2 verwendet wurde. Als nächstes werden die gespülten Partikel mit einer Lösung in Kontakt gebracht, welche die spezifizierten Konzentrationen des therapeutischen und/oder osteopromotiven Mittels enthält. Die Adsorption von einigen therapeutischen und/oder osteopromotiven Mitteln, wie beispielsweise rhBMP-2 verläuft sehr schnell (bedarf mindestens 30 Minuten und vorzugsweise weniger als 12 Stunden Kontakt), während andere therapeutische und/oder osteopromotive Mittel, wie beispielsweise nicht-TGF-beta-Zytokin-Protein und Small Molecule-Therapeutika eine anschließende Lyophilisierung der Lösung des therapeutischen und/oder osteopromotiven Mittels auf der Oberfläche der Partikel benötigen kann. Die resultierenden entsprechend behandelten Partikel sind ohne weitere Verarbeitung für die Verwendung einsatzbereit, beispielsweise als Implantate für Tierstudien oder als zugelassene Implantate in orthopädischen Verfahren oder in wundtherapeutischen Verfahren, bei denen die Partikel in einem Netzbeutel oder in anderen Behältern eingeengt werden.
In alternativen Ausführungsformen können unbeschichtete oder beschichtete Partikel ebenfalls in einem Träger dispergiert werden, wobei ein wie vorliegend beschriebenes Komposit gebildet wird. Das Komposit kann beispielsweise in vorteilhafter Weise durch einen Chirurgen gebildet werden, unmittelbar vor dem Zeitpunkt der Nutzung (z.B. während des chirurgischen Eingriffs). Alternativ dazu kann das Komposit lyophilisiert und anschließend zum Zeitpunkt der Nutzung rehydriert werden, oder es kann eingefroren (vorzugsweise bei -80 °C) bis zur Verwendung gelagert werden, abhängig von den physikalischen und chemischen Eigenschaften des therapeutischen und/oder osteopromotiven Mittels.
In einer oder in mehreren Ausführungsformen nutzt die Erfindung die überraschende Einsicht, dass BMPs und andere biologisch aktive osteopromotive Materialien und/oder therapeutische Mittel, wie beispielsweise therapeutische Zytokine und passivierende Blut-Proteine, an diese kohlenstoffartigen Matrizen mit einer Beharrlichkeit anhaften, die sich einem Spülen (Abspülen) widersetzen kann, und des weiteren, dass die gebundenen Substanzen mit definierter Funktionalität ihre biologische Aktivität beibehalten (wie durch Challenge-Test mit reagierenden Zelllinien untersucht wurde). Dies bedeutet, dass wenn man das Komposit implantiert, die Beschichtung resistent gegen eine unmittelbare Freisetzung aus den Partikeln und ein Wegbewegen von der Implantationsstelle ist. Diese Eigenschaften stellen ein auf Kohlenstoff basierendes Implantat bereit, das einen kleinen Ausstoß des Wirkstoffs liefert, der ausreicht, um Stammzellen zur Implantationsstelle zu lenken, während der Großteil der Wirkstoffbeschichtung in situ für eine ausreichend lange Zeit verbleibt, um die zelluläre Differenzierung entlang von Signalwegen auszulösen, die osteopromotiv sind. Die Daten zeigen insbesondere, dass die adsorptive Bindung eines osteopromotiven Zytokins (z.B. rhBMP-2) an das Kohlenstoffschaum-Gerüst die absorptive Bindung (welche aus der einfachen Infiltration der therapeutischen Lösung in den Kohlenstoffschaum resultiert) übersteigt. Die Bedeutung dieses unerwarteten Ergebnisses liegt darin, dass sich ein additiver Effekt auf die Bildung von neuem Knochen ergibt, der aufgrund der 2 unterschiedlichen pharmacokinetischen Freisetzungsprofile größer ist als die Konzentration des osteopromotiven Mittels allein. Das erste dieser Profile ist ein verhältnismäßig schneller Ausstoß der absorbierten osteopromotiven Fraktion gefolgt von einem zweiten, wesentlich langsameren Freisetzungsprofil aus der adsorbierte Fraktion, die an die Oberfläche des Partikels gebunden hat.
In einer oder in mehreren Ausführungsformen ist die Beschichtung auf der Oberfläche der Kohlenstoffschaum-Partikel immobilisiert, jedoch ist dieser vorzugsweise nicht kovalent oder anderweitig chemischen daran gebunden. Somit ist das Beschichtungsmaterial physikalisch immobilisiert und basiert vielmehr auf van der Waals-Anziehung oder einer Ionen-ähnlichen Anziehung zwischen der Oberfläche der Kohlenstoffschaum-Partikel und dem Beschichtungsmaterial. Die stellt einen wichtigen Vorteil bereit, da die osteopromotiven oder therapeutischen Mittel nicht (für die kovalenten Bindung) chemisch modifiziert werden müssen und somit ihre volle Bioverfügbarkeit bei der Implantation in einen Patienten beibehalten, obwohl sie fest an die Partikel gebunden sind. Die Verwendung der Beschichtung in Kombination mit den Kohlenstoffschaum-Partikeln ermöglicht in vorteilhafter Weise nicht nur das Einwachsen von Knochen, sondern auch das Durchwachsen von Knochen durch das gesamte Komposit.
Die Kohlenstoffschaum-Partikel sind durch die Fähigkeit charakterisiert, Proteine, die an der Oberfläche der Partikel adsorbiert sind, zu erhalten. Genauer gesagt haben die Partikel, wenn sie einem Protein-Elutions-Test unterzogen werden, die Fähigkeit, mindestens etwa 50 % des Proteins, stärker bevorzugt mindestens etwa 7 % des Proteins, und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 900 % des Proteins, das ursprünglich mit dem Partikel in Kontakt gebracht wurde, zu erhalten. Dies bedeutet, dass wenn der Kohlenstoff-Partikel in Kontakt mit einer Lösung gebracht wird, die ein Protein enthält, wie beispielsweise BMP, mindestens etwa 50 % des Proteins aus der freien Lösung aufgenommen werden wird und von dem Schaum und den resultierenden Partikeln zurückgehalten werden wird (vorzugsweise mindestens etwa 70 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 90 %) basierend auf der Gesamtmenge an Protein in der Lösung, die als 100 % angesehen wird. Mit anderen Worten wird der Proteingehalt der Lösung um mindestens etwa 50, 70 oder vorzugsweise 90 % verringert, nachdem der Partikel in die Lösung getaucht und aus dieser wieder entfernt wurde. Das Zurückhalten von Protein kann unter Verwendung eines Protein-Elutions-Tests untersucht werden, wie er in US 2012/0185047 A1 und US 2012/0095558 A1 beschrieben ist, die vorliegend durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Die Protein-Elutions-Tests sind vielteilig und berücksichtigen wichtige funktionelle Punkte zum produktiven Kontakt zwischen osteoinduktivem Material und konduktiven Kohlenstoffschaum-Partikeln, zum Grad des Überdauerns der Bindungsinteraktion, dem prozentualen Anteil der Beschichtung, der in die Umgebung freigesetzt wird, und dem prozentualen Anteil der in biologisch aktiver, bioverfügbarer Form zurückgehalten wird. Ein Beispiel für eine solche ausführliche Analyse umfasst das Inkontaktbringen von ausgewählten Schaum-Materialien mit einer Zytokin-Lösung bekannter Konzentration entweder durch Passage der Lösung über das feste Objekt oder durch Beladung bei Vakuum mit geringem Druck. Die Konzentration der verbleibenden Waschlösungen nach Ablauf einer spezifischen Beladungszeit wird erneut durch einen enzymgebundenen Immunsorbentassay (ELISA) untersucht, um die Abreicherung an Zytokin und damit de facto die Überführung von Zytokin in den Kohlenstoffschaum zu bestimmen. Wiederholte Beladungsstudien unter Verwendung von rekombinanten humanen BMP-2 (rhBMP) ergaben verlässlich Werte für die Abreicherung von mindestens 50 %; dies bedeutet, dass ein einfacher Kontakt zwischen dem gelösten Stoff und dem Kohlenstoff-Material eine Überführung von 50 % des Zytokins aus der Lösung in den Kohlenstoffschaum ergibt. Die Verifizierung dieses angenommenen prozentualen Anteils der Ladung kann unter Verwendung von einer von zwei Verfahren validiert werden: 1) Sandwich-ELISA im Hinblick auf Protein, das von beschichtetem Kohlenstoffschaum mit chaotropen Mitteln (z.B. 4M Guanidinhydrochlorid) oder Reagenzien, die mit der ionischen Interaktion interferieren (z.B., 5M NaCl; 0,5M Glycin, NaOH, pH 10), abgelöst wurde; oder 2) Festphasen-ELISA im Hinblick auf Zytokin, das an eine Kohlenstoffmatrix adsorbiert ist unter Verwendung eines BMP-2-Antikörpers, der an Biotin oder an ein Enzym konjugiert ist, welches ein Chromogen erzeugt, sodass eine Quantifizierung der Menge an BMP-2 erfolgen kann, dass an die Oberfläche des Materials adsorbiert hat.
Gebundene BMPs (wie beispielsweise BMP-2 oder andere vorliegend beschriebene Zytokine) können ferner durch das Kriterium der biologischen Aktivität begutachtet werden, indem man diese mit Zelllinien, welche in der Lage sind, auf das jeweils adsorbierte Zytokin zu reagieren, in Kontakt bringt. Dies bedeutet, dass Zellen, die Zytokin-beschichteten Partikeln ausgesetzt werden, leicht dahingehend induziert werden können, dass sie neue Phänotypen entwickeln, wie beispielsweise ein knochenbildender Osteoblast, was unter Verwendung einer Kombination von enzymatischen, molekularen (real-time PCR) und histochemischen Assays gemessen werden kann. Dies ist wichtig für die Beibehaltung der biologischen Aktivität an der klinisch relevanten Implantationsstelle (im Gegensatz zu einer Bewegung weg von der Implantationsstelle).
Darüber hinaus haben die Partikel eine bemerkenswerte Eigenschaft, die Beschichtung nach der Implantation zu erhalten, was die Bestandteile des Regenerationsprozesses des Knochens in das Implantat bringt. Dies ist besonders vorteilhaft bei der Verwendung von Proteinen, wie beispielsweise BMP, die von den Partikeln zurückgehalten werden anstatt in das umgebende Gewebe freigesetzt zu werden, was die Bildung von ektopischem Knochen oder unerwünschtem Knochenüberwuchs verhindert. Nach der Implantation werden die Partikel vorzugsweise mindestens etwa 75 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 80 %, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 % des immobilisierten Proteins zurückbehalten haben, basierend auf dem Gesamt-Proteingehalt der Beschichtung, die als 100 % angesehen wird. Dies kann in vitro für eine gegebene Matrix vor der Implantation unter Verwendung eines Protein-Freisetzungstests untersucht werden. Wenn Implantate der vorliegenden Erfindung einem Protein Freisetzungstests für einen Zeitraum von einer Woche unterzogen werden, werden diese somit eine hohe Zurückbehaltung und eine geringe Freisetzung von gebundenem Protein zeigen. Somit kann die Geschwindigkeit der Mineralisierung verlässlich unter Verwendung des Komposits der vorliegenden Erfindung kontrolliert werden, da eine lineare Beziehung zwischen der Menge an osteopromotiven Material (wie beispielsweise BMP), das in dem Implantat vorliegt, und der Mineralisierungsgeschwindigkeit besteht. Somit kann eine gegebene Menge an Protein vor der Implantation auf die Partikel geladen werden, sodass ein angestrebtes Ausmaß an Mineralisierung erreicht wird, da sehr wenig Protein an das umgebende Gewebe verloren wird.
Dies ist eine wichtige und unerwartete Entwicklung. Ihre Bedeutung liegt in der Notwendigkeit, dass solche osteopromotiven Mittel in einem schnellen Ausstoß freigesetzt werden, gefolgt von einer langsameren, anhaltenden Freisetzung, um eine optimale klinische Wirksamkeit zu erreichen; dies ist in der Literatur anerkannt. Im Zusammenhang mit Zytokinen beispielsweise erzeugt die anfängliche Freisetzung des Zytokins von einer Implantationsstelle (in die das Komposit implantiert wurde) einen Konzentrationsgradienten des Zytokin-Signals, der dazu dient, Stammzellen und differenzierte Osteoblasten zur Wundstelle zu leiten. Die nachfolgende langsame Freisetzung dient zur Auslösung mehrerer Signalübertragungswege, die zu einer Differenzierung von Stammzellen, die nun in Kontakt mit der Komposit-Oberfläche stehen, zu Osteoblasten führt.
Wie jedoch erwähnt sind zusätzliche Ausführungsformen auf die Mischung der Kohlenstoff-Partikel mit einem geeigneten osteopromotiven und/oder therapeutischen Material gerichtet, bei dem es sich wiederum ebenfalls um einen Partikel handeln kann, das jedoch auch in Form einer Flüssigkeit, eines Gel oder in einer anderen Form oder dispergiert in diesen vorliegen kann. Solche Ausführungsformen erfordern nicht notwendigerweise eine Beschichtung und/oder eine Adsorption des osteopromotiven und/oder therapeutischen Materials an die Oberfläche des Partikels (obgleich eine solche trotzdem stattfinden kann). Die Kohlenstoff-Partikel und die osteopromotiven und/oder therapeutischen Mittel können in einer geeigneten Trägermatrix dispergiert sein, sodass ein Komposit gebildet wird. Die Kohlenstoffpartikel und die osteopromotiven und/oder therapeutischen Mittel können vorgemischt werden, bevor sie in den Träger dispergiert werden, oder sie können nacheinander oder gleichzeitig (jedoch einzeln) in dem Träger dispergiert werden, sodass ein Komposit entsteht.
Verfahren zur Verwendung der erfindungsgemäßen auf Kohlenstoffschaum-Partikel basierenden Implantate werden ebenfalls vorliegend beschrieben. Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen die Bereitstellung einer Kohlenstoffschaum-Partikel-Mischung, die in einer Trägermatrix dispergiert ist oder von einem biokompatiblen Netz-Behältnis umschlossen ist. Beispielsweise wird das Implantat an einen Chirurgen oder an eine andere medizinische oder klinische Fachkraft für die Einbringung, Insertion oder Fixierung in einer Knochenlücke oder an einer Stelle mit Gewebeschädigung bereitgestellt. Das erfindungsgemäße Implantat kann als Knochenlücken-Füller für nahezu alle Arten von Lücken, Defekten oder Spalten in Knochen verwendet werden, unabhängig davon, ob diese von einer chirurgischen Resektion, einem Trauma, einer Erkrankung, einer pathologischen Anatomie, usw., herrühren. Genauer gesagt kann das Implantat als Knochentransplantat-Gerüst für den Ersatz und/oder die Reparatur von Knochenteilen, bei Schädeldach-Defekten, osteochondralen Defekten, gebrochenen Wirbeln, intervertebraler oder posterolateraler Spinalfusion, Kieferkamm-Verstärkung, Wiederherstellung der Extraktionsalveole und ähnlichem verwendet werden und/oder als ein Gerüst für die Reparatur von Weichgeweben. Es wird somit verständlich sein, dass das Implantat so geformt werden kann, dass es in die Lücken und Aussparungen im Knochen, in die durch den Knochen reichenenden Löcher, in beschädigte oder fehlende Endabschnitte, oder ähnlichem, passt. Das Implantat kann durch einen Chirurgen geformt, ausgeformt oder injiziert/mit der Spritze verabreicht werden, sodass es exakt der Form und Größe der unregelmäßigen Lücken entspricht und eine präzise Schnittstelle mit unbeschädigtem Knochen, der die Lücke umgibt (ähnlich zu herkömmlichen Knochenzement), bildet. Abhängig von der Trägermatrix, die mit dem Implantat verwendet wird, kann es dem Implantat erlaubt werden, sich zu „setzen“ und auszuhärten. Alternativ dazu kann das Implantat während des Regeneration-Prozesses einigermaßen biegsam bleiben.
In einer oder in mehreren Ausführungsformen wird das Komposit-Implantat an einen Chirurgen bereitgestellt, vorzugsweise mit Instruktionen bezüglich der Ausformung des Implantats, damit dieses in die Lücke eingepasst werden kann, und der Fixierung des Implantats in der Lücke. Solch ein Kit könnte ferner wahlweise Hilfsmittel für die Injektion oder das Ausstoßen des Implantats umfassen, sowie geeignete Hilfsmittel und Fixierungsmittel zur Fixierung des Füllstoffs in der Lücke. Nachdem das Implantat hinsichtlich seiner Form und Größe an die Knochenlücke angepasst wurde, kann es in die Lücke eingebracht und unter Verwendung geeigneter Verfahren, wie beispielsweise durch Nägel, Schrauben, reibungsangepasste Verbindung, Nähte, Klebstoffe, Vernähen der Haut des Patienten, Vernähen mit anderen umliegenden Weichgeweben, wie beispielsweise Faszie oder Bindegewebe und/oder Kombinationen davon. In ein oder in mehreren Ausführungsformen kann das Implantat auch in die Lücke eingebracht werden und sofern notwendig (ferner) vor und/oder nach der Fixierung geformt oder mit Konturen versehen werden. Es sollte gleichermaßen verständlich sein, dass das Implantat-Material selbst in perkutanen Anwendungen mittels einer Spritzennadel-Injektion für einfache orthopädische Verfahren, die keine offene Chirurgie erfordern, verwendet werden kann.
Darüber hinaus wären kohlenstoffartige Partikel, die in ein geeignetes therapeutisches Gerüst eingebettet sind, wie beispielsweise einen blutstillenden Schwamm, nützlich für die Wundversorgung oder für Verfahren, die eine langsame Bereitstellung eines Proteins oder eines Small Molecule-Therapeutikums erfordern. Weitere Verwendungen umfassen die posterolaterale Spinalfüsion, bei der die Kohlenstoffschaum-Partikel-Mischung, die in eine Trägermatrix dispergiert oder von einem biokompatiblen Netzbehältnis umschlossen ist, über die transversalen Fortsätze der zu fusionierenden Wirbel gelegt wird. Das Komposit könnte ferner mit anderen Gerüsten, die im Stand der Technik bekannt sind, kombiniert werden, wie beispielsweise mit Kollagen-Schwämmen, Fibrin-Gelen und synthetischen Polymeren, einschließlich Polycaprolacton, Polylactid, Poly(lactid-co-glycolsäure) und Polyglycolsäure, Pads für die Wundbehandlung und ähnlichem.
Diese anpassbaren/adaptiven therapeutischen Modalitäten können potenziell genutzt werden, um eines von mehreren gegenwärtig bestehenden Bedürfnissen in der regenerativen Medizin zu erfüllen, einschließlich:

• Spinalfusion (Kohlenstoff-Partikel-Mischung eingeschlossen in ein PET-Netz oder äquivalentem; im Verbund mit fließfähigen Trägerformulierungen, um eine Verabreichung des Materials an intervertebrale Ring-Vorrichtungen mittels einer Spritze zu ermöglichen);
• Röhrenknochendefekte (Kohlenstoff-Partikel-Mischungen in fließfähiger Form, verabreichbar durch eine Spritze in offenem chirurgischen Eingriff oder perkutan mit einer auf die Spritze angepassten Nadel);
• Füllen von Knochendefekt-Lücken oder Zahnextraktionshöhlen für die Implantatseinbringung (entweder von einem PET-Netz eingefasst oder fließfähige Kohlenstoff-Partikel-Mischungsfomulierungen);
• Anwendung einer Kohlenstoff-Partikel-Mischung entweder in fließfähigen Formulierungen (Verabreichung per Spritze) oder eingebettet in hergestelltem Kollagen oder in Lagen eines synthetischen Polymers (wie z.B. Polyvinylalkohol, Polyurethan, oder quervernetztes Styrol) für die direkte Anwendung (diabetische Fußgeschwüre oder andere chronische Wunden) oder für die chirurgische Implantation in Kontakt mit vaskulärem, Kardiomyozyten-, Leber-, Nieren-, oder anderen Geweben, die durch extrazelluläre Matrix charakterisiert sind;
• Wiederherstellung der Knochenanatomie, wobei eine Mischung von KohlenstoffPartikeln und biologisch aktiver, demineralisierter Knochenmatrix verwendet wird, um eine Knochenbildung zu induzieren;
• Knochenbildung an heterotropen Stellen (wie beispielsweise bei der posterolateralen Spinalfusion), wobei Komposite aus Kohlenstoff-Partikeln/demineralisierter Knochenmatrix verwendet werden.

Die Erfindung schlägt ferner die Verwendung der Kohlenstoff-Partikel in alternativen Träger-Matrices vor, wie beispielsweise in aushärtbaren Polymer-Matrices. Solche aushärtbaren Polymer-Matrices umfassen alle biologisch kompatiblen Polymere die durch Einwirken einer aktivierenden Strahlung (z.B. UV, Infrarot) oder durch thermale Erwärmung gehärtet werden können, um eine verhältnismäßig biegsame, ausgehärtete Struktur zu bilden. Beispielsweise können die Kohlenstoff-Partikel als Teil einer aushärtbaren Matrix verwendet werden, um eine auf den Patienten zugeschnittene, spezifische dreidimensionale Form für die Knochenreparatur zu bilden. In ähnlicher Weise können die Kohlenstoff-Partikel in Polymer-Lagen, welche für die Knochenreparatur eingesetzt werden können, eingebettet werden.
Sobald das Kohlenstoff-Partikel-Material implantiert wird, beginnt die Osteogenese, was das Einwachsen von Knochen und Gewebe in die Kohlenstoff-Partikel umfasst, einschließlich der Bildung und Beibehaltung eines vaskulären Bettes in dem Kohlenstoff-Partikel-Implantat was letztlich zur Bildung von neuem Knochen (Mineralisierung) führt. Anders als bei vielen existierenden Gerüsten ist die vaskuläre Versorgung des Patienten in der Lage, die Kohlenstoff-Partikel des Implantats leicht zu durchdringen, wobei dies die Entwicklung von neuen Blutgefäßen fördert, welche für die Reparatur des Knochens von Bedeutung sind und die Bildung eines robusten, vaskulären Bettes ermöglichen. Das erfindungsgemäße Implantat fördert in vorteilhafter Weise die Vaskularisierung der gesamten Kohlenstoff-Partikel-Mischung, sodass dies nicht nur zu einem Einwachsen von Knochengewebe an der äußeren Oberfläche des Implantats (1-2 mm) führt, sondern zu einem „Durchwachsen“ des Knochengewebes durch den gesamten Körper des Implantats. Während Knochengewebe die Matrix infiltriert und mineralisiert, werden die Kohlenstoff-Partikel-Mischung und das Implantat langsam abgebaut und vom Körper des Patienten absorbiert. Vorzugsweise ist die Kohlenstoff-Partikel-Mischung etwa 6 Wochen nach der Implantation mindestens zu etwa 75 % resorbiert, stärker bevorzugt mindestens zu etwa 85 % resorbiert und noch stärker bevorzugt mindestens zu etwa 95 % resorbiert. Mit anderen Worten wird die behandelte Region 6 Wochen nach der Implantation weniger als etwa 25 % kohlenstoffartiges Material aus dem Implantat, stärker bevorzugt weniger als etwa 15 % kohlenstoffartiges Material, und noch stärker bevorzugt weniger als etwa 5 % kohlenstoffartiges Material umfassen, basierend auf dem anfänglichen Gesamtgehalt an Kohlenstoff des Implantats, der als 100 % angesehen wird. Die Begriffe „Resorption“ und „Bioresorption“ werden vorliegend austauschbar verwendet und bedeuten, dass das Material im Laufe der Zeit durch zelluläre Aktivität oder durch chemischen Abbau vom Körper zersetzt wird und keine mechanische Entfernung aus dem Körper benötigt. Ein besonders unerwarteter Aspekt der Erfindung besteht darin, dass vorzugsweise ein direktes Verdrängen/Ersetzen des Implantats durch neues Gewebe beobachtet wird, im Gegensatz zu einem Überwachsen des Gewebes. Dieses Durchwachsen von Knochen, das sich an der ursprünglichen Position des Implantats ausrichtet, ist ein überraschender und besonders vorteilhafter Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Es wird verständlich sein, dass das erfindungsgemäße Implantat zusätzliche Verwendungen finden wird, die jenseits von dem herkömmlichen Füllen von Knochenlücken liegt, einschließlich Arthroplastie, Reparatur von Brüchen und rekonstruktiven Chirurgie. Das Implantat könnte ferner Anwendung bei der plastischen und kosmetischen Chirurgie finden, bei denen Modifikationen von Knochen (einschließlich Wiederaufbau und Verstärkung) erforderlich sind. Wie oben angemerkt kann das Implantat auch als Wirkstoff-Verabreichungs-Mittel für orthopädische Anwendungen dienen, welches eine lokale Bereitstellung von therapeutischen Mitteln, osteogenen Faktoren (beispielsweise BMPs und anderen biologisch-reaktiven Modifikatoren), und Faktoren zur Inhibierung der Knochenresorption (wie Bisphosphonate) ermöglicht.
Es wird verständlich sein, dass nicht nur Knochen-Transplantationsverfahren sondern auch andere regenerative Verfahren für Weichgewebe, die eine Transplantation erfordern, substantiell verstärkt und von dieser Erfindung angesprochen werden. Insbesondere das Einschließen einer Kohlenstoffschaum-Partikel-Mischung in biokompatible Netzstrukturen, der Einbau von Körnchen in Kollagenfaser-Matrices sowie fließfähige Ausführungsformen, die durch Verbindung mit Mitteln erzeugt wurden, die den festen Partikeln Viskosität oder Mischbarkeit verleihen, führen zu einer Anpassbarkeit des therapeutischen Bestandteils an eine Vielzahl von Lücken, Läsionen, Defekten und anderen anatomischen Bereichen, die ein an den Defekt angepasstes therapeutisches Transplantat erfordern.
Zusätzliche Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann bei Durchsicht der vorliegenden Offenbarung und der nachstehenden Beispiele ersichtlich sein. Die Erfindung wird vorliegend beispielsweise in Bezug auf humane Therapien erörtert; es wird jedoch verständlich sein, dass die Behandlung für die klinische Forschung angewendet werden kann oder für die therapeutische Behandlung eines beliebigen Tiers, einschließlich (ohne Einschränkung) Hunde, Katzen und andere Haustiere sowie auch Nagetiere, Primaten, Pferde, Rinder usw.
Wie vorliegend verwendet bedeutet der Ausdruck „und/oder“, sofern er in einer Liste von zwei oder mehreren Dingen verwendet wird, dass eines der aufgelisteten Dinge selbst oder in einer beliebigen Kombination mit zwei oder mehreren der aufgelisteten Dinge verwendet werden kann. Wenn beispielsweise eine Zusammensetzung so beschrieben wird, dass sie die Bestandteile A, B und/oder C enthält oder ausschließt, so kann die Zusammensetzung folgendes enthalten oder ausschließen: A allein; B allein; C allein; A und B in Kombination; A und C in Kombination; B und C in Kombination; oder A, B und C in Kombination.
Die vorliegende Beschreibung verwendet ferner numerische Bereiche, um bestimmte Parameter zu quantifizieren, die verschiedene Ausführungsformen der Erfindung betreffen. Sollte verständlich sein, dass wenn numerische Bereiche genannt werden diese Bereiche so auszulegen sind, dass sie eine wörtliche Stütze für Anspruchseinschränkungen bereitstellen, die lediglich den unteren Wert des Bereichs zitieren, sowie auch Anspruchsänderungen, die lediglich den oberen Wert des Bereichs zitieren. Ein offenbarter numerischer Bereich von etwa 10 bis etwa 100 stellt beispielsweise wörtlichen Stütze für einen Anspruch bereit, der „mehr als etwa 10“ (ohne obere Grenze) nennt, und für einen Anspruch, der „weniger als etwa 100“ (ohne untere Grenze) nennt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele zeigen die erfindungsgemäßen Verfahren. Es sollte jedoch verstanden werden, dass diese Beispiele zum Zwecke der Veranschaulichung bereitgestellt werden, und nichts in diesen Beispielen als Einschränkung des Gesamtschutzbereichs der Erfindung aufgefasst werden darf.
BEISPIEL 1
Osteoinduktive Eigenschaften von glasartigen Kohlenstoffschaum-Materialien
Material und Methoden
In diesem Beispiel wurden 6 × 5 mm große Kohlenstoffschaum-Scheiben (DUOCEL®, ERG Aerospace), die aus Grundmaterialien hergestellt worden waren, in 70 % Ethanol sterilisiert und ausführlich in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gespült. Für die Beladungsuntersuchungen mit BMP-2 wurden die Schaum-Scheiben in PBS, die spezifische Mengen von Zytokin enthielt, für 24 Stunden getaucht. Ungebundenes Zytokin wurde von der Schaum-gebundenen Fraktion durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit getrennt, gefolgt von 3-maligem Spülen in PBS. Das nicht vom Kohlenstoffschaum adsorbierte BMP-2 wurde in der verbleibenden Flüssigkeit und den nachfolgenden Waschlösungen unter Verwendung eines ELISA-Assays gemessen.
Die gespülten Scheiben, die das adsorbierte BMP-2 enthielten, wurden dann in die Vertiefungen einer Gewebekultur-Platte eingebracht, und C2C12-Maus-Myoblasten-Zellen wurden durch direktes Pipettieren zu der Kohlenstoff-Matrix zugegeben. Kohlenstoffmaterialien, die in PBS vorinkubiert worden waren, welche 50, 100 oder 200 ng/ml BMP-2 enthielt, enthielten die experimentellen Untersuchungsgruppen. Zellkulturmedium wurde zu den Platten gegeben, welche die Zellen und die Kohlenstoffmatrix enthielten, gefolgt von 2 Stunden Anhaftung. Die C2C12-Negativkontrollen-Zellkulturen erhielten kein zusätzliches Material, während die Positivkontrollen lösliches BMP-2 erhielten, welches zu Zellen gegeben wurde, die bereits an dem Polystyrol der Gewebekultur hafteten. Vier Tage später wurden gewaschene Zell-Monolayer oder dreidimensionale Kulturen auf Kohlenstoffschaum lysiert und die Aktivitäten der alkalischen Phosphatase in den Zellextrakten wurde bestimmt. Die spezifischen Aktivitäten der alkalischen Phosphatase wurden durch Normalisierung gegen Zellzahlen in Parallelkulturen unter Verwendung eines MTT-Zellüberlebens-Assays bestimmt.
Die Osteoinduktivität von DUOCEL®-Kohlenstoffschaum wurde durch Material-Infiltration von C2C12-Maus-Myoblasten oder humanen NHOSC-Osteoblasten in gespülte Kohlenstoffschaum-Scheiben gefolgt von der Messung der Induktion der alkalischen Phosphatase überprüft. Kontroll-Zellkulturen waren zweidimensionale Zell-Monolayer auf Gewebekultur-Polystyrol. Die spezifischen Enzymaktivitäten wurden an den Tagen 2, 4 und 6 (C2C12) oder an den Tagen 3, 5 und 7 (NHOSC-Zellen) bestimmt.
Ergebnisse
Ein typisches Ergebnis eines BMP-2-Absorptionsassays unter Verwendung eines DUOCEL®-Kohlenstoffschaums ist in 2 gezeigt. Ungebundene Werte wurden durch ELISA erhalten und gebundene Werte durch Subtraktion von ungebundenem vom Ausgangswert. Bei geringeren BMP-2-Ausgangswerten (50 und 100 ng/ml) waren die adsorbierte und die nicht-adsorbierte Fraktion ungefähr gleich. Bei einem höheren BMP-2-Ausgangswert (500 ng/ml) tendierte das Verhältnis adsorbiert:nicht-adsorbiert zu einer Erhöhung von 1:1 zu einem Wert von etwa 5:1. Die gesammelten Ergebnisse von mehreren Versuchsreihen zeigen eine BMP-2-Konzentrationsabhängigkeit der Bindung bei einer konstanten Eingabe der Kohlenstoffschaum-Masse (Daten nicht gezeigt).
Um einerseits die relative Menge des an die Kohlenstoff-Scheiben gebundenen BMP-2 festzustellen, und andererseits festzustellen, ob die biologische Aktivität nach der Adsorption erhalten geblieben ist, wurden C2C12-Myoblasten den gespülten Scheiben ausgesetzt und die Aktivität der alkalischen Phosphatase wurde vier Tage später gemessen (3). Diese Maus-Myoblasten-Zelllinie ist in der Lage, den Phänotyp einer Knochenzelle anzunehmen (Osteoblast), wenn sie osteoinduktiven Zytokinen ausgesetzt wird (einschließlich BMP-2), und sie stellt daher ein valides Bioassay-System für eine durch Zytokine hervorgerufene Zell-Signalübertragung dar. Die Induktion der alkalischen Phosphatase stellt einen verlässlichen phänotypischen Marker für ein Vorliegen des Osteoblasten-Phänotyps in entsprechend induzierten Zellen dar. Bezeichnenderweise induzierten die Kohlenstoffschaum-Scheiben, die in den angegebenen BMP-2-Lösungen prä-adsorbiert worden waren, eine Menge an Aktivität der alkalischen Phosphatase, die identisch zur C2C12-Positivkontrollen-Zellkultur war, welche die gleiche Menge an löslichen Zytokin erhalten hatte. Dieses Ergebnis verweist darauf, dass das Ausmaß der durch behandelten Kohlenstoffschaum induzierten Aktivität der alkalischen Phosphatase das Ergebnis sowohl des adsorbierten Zytokins als auch der intrinsischen Osteoinduktivität des Materials ist, da die Menge von BMP-2, welche durch die Scheiben zurückgehalten wurde, nur ungefähr 50-80% der ursprünglichen Tränklösung betrug (2).
Die Experimente zur Induktion der alkalischen Phosphatase (über einen Zeitraum von 6-7 Tagen) wurden ebenfalls unter Verwendung eines DUOCEL®-Kohlenstoffschaums durchgeführt, wobei diese dann mit C2C12-Myoblasten und humanen NHOSC-Osteoblasten in Kontakt gebracht wurden (4 und 5). Die erstgenannte Zelllinie berücksichtigt die Fähigkeit eines vorbestimmten Zelltyps, sich zu re-differenzieren, und die letztgenannte berücksichtigt die Fähigkeit eines Osteoblasten, einen zellulären Phänotyp hoch zu regulieren. Beide Zelllinien, die mit Biomaterial in Kontakt gebracht wurden, zeigten Erhöhungen der spezifischen Aktivität der alkalischen Phosphatasen. Die C2C12-Zellen tendierten zu allen Zeitpunkten zu höheren Aktivitäten als die Kontrollen, wobei jedoch ein statistisch signifikanter Unterschied zu den Kontrollen lediglich am Tag 2 vorlag (4). Im Gegensatz dazu reagierte die NHOSC-Zelllinie auf Kohlenstoffschaum durch Synthese von 8-10-fach höheren Mengen an alkalischer Phosphatase, wobei dies über das gesamte Zeitintervall statistisch signifikant war (5). Parallele Analysen der verstärkten Osteoblasten-ähnlichen Genexpression durch RT-PCR ergaben ähnliche Trends (Daten nicht gezeigt).
Schlussfolgerungen
Kohlenstoffschaum-Materialien weisen physikalische Eigenschaften auf, die natürlichen Knochen nachahmen. Die wichtigsten dieser Eigenschaften umfassen mechanische Festigkeit, Porendurchmesser und Poren-Interkonnektivität, wobei diese Eigenschaften in den vorliegenden Untersuchungen zu den signifikanten Tendenzen einer Knochenbildung beitrugen. Diese Tendenzen umfassten sowohl die Neigung der Materialien, BMP-2 in einer zur Signalübertragung fähigen chemischen Form zu adsorbieren, und die Bereitstellung eines dreidimensionalen Gerüsts, das es Phänotypen von Knochenzellen (Osteoblasten) ermöglicht, exprimiert zu werden, selbst in Zellen die einen vorbestimmten Phänotyp zeigen. Diese zwei Ergebnisse sind mit der früheren wissenschaftlichen Literatur im Einklang, die den Punkt der Knochenzelldifferenzierung betrifft, und begleitenden Prädiktoren von Materialien und medizinischen Geräten, deren klinische Ergebnisse zu einer signifikanten Knochenbildung führten. Diese Ergebnisse zeigen die osteoinduktive Biomaterial-Eigenschaft von Kohlenstoffschaum.
BEISPIEL 2
BMP-2 Adsorption, Freisetzung und Osteoinduktion
In diesem Beispiel wurde die Fähigkeit von Kohlenstoffschaum-Materialien untersucht, BMP-2 so an mesenchymale Stammzellen bereitzustellen, dass die Differenzierung von Osteoblasten gefördert wird. Diese anfänglichen Tests untersuchten zwei miteinander in Verbindung stehende Aspekte: quantitative Aspekte der BMP-2-Bindung an zwei Kohlenstoffschaum-Materialien unter Verwendung eines ELISA-Assays; und die Verifizierung der Zytokin-Bindung durch ELISA-Analyse der Menge des mutmaßlich gebundenen Zytokins, welches unter Verwendung chemischer Mittel desorbiert wurde. Ein vorläufiger Bericht der Stammzell-Replikation und Osteoinduktion wird ebenfalls gezeigt. Glasartiger DUOCEL® 80 PPI Kohlenstoffschaum und Graphit-haltiger Kopper KFOAM® 80 PPI Kohlenstoffschaum wurden verwendet. Die Proben wurden vom Block des Herstellers unter Verwendung von Biopsie-Stanzer in Zylinder mit einem Durchmesser von 8-10 mm und einer Dicke von 2-3 mm geschnitten, abhängig vom Test-Protokoll (siehe unten). Zusätzliche Verarbeitung ist nachstehend beschrieben.
BMP-2-Bindungs-Assays
Die Kohlenstoffschaum-Zylinder wurden durch Untertauchen in 70% Ethanol für 4 Stunden sterilisiert, anschließend zur Entfernung von Flüssigkeit zentrifugiert, dann für 14 Stunden unter einer Haube mit laminarer Strömung getrocknet. Es wurden BMP-2-Lösungen (10, 5 und 2 µg/ml) mit sterilem Wasser hergestellt, und 1 ml von jeder dieser Lösungen wurde in einer Zellkulturplatte mit 12 Vertiefungen zu den Kohlenstoffschaum-Konstrukten gegeben. Die Platten wurden bei 37°C in eine Vakuum-Vorrichtung überführt, und die BMP-Lösung wurde unter Vakuum für 24 Stunden in das Hohlraumvolumen des Schaums getrieben. Überschüssige BMP-Lösung wurde anschließend von den Zylindern durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 200 UpM entfernt und die Schäume wurden in saubere Vertiefungen überführt und über Nacht an der Luft getrocknet. Die BMP-Waschlösungen (ursprüngliche Tränklösung plus 200 UpM Hohlraumvolumenfraktion) wurden kombiniert und bei -20°C für die Abschätzung von ungebundenen BMP-2 (d.h. die „übrig gebliebene“ Fraktion, die nicht durch den Schaum adsorbiert wurde) mittels ELISA gelagert. Die getrockneten Kohlenstoff-Scheiben wurden anschließend 6 Zyklen aus Spülen (durch Untertauchen) in 1 ml PBS, gefolgt von Zentrifugation, Vereinigung der Eluate und Trocknung unterzogen („Eluate der Tage 1-6“). ELISA-Assays von BMP-2-Standards, Tränklösungen, Post-Tränklösungen und Spüllösungen der Scheiben wurden unter Verwendung eines Sandwich-Assays durchgeführt. Standard-Kurven wurden erzeugt, indem das gleiche kommerzielle BMP-2-Produkt verwendet wurde, das für die Bindung verwendet wurde (eBioscience).
BMP-2-Elutions-Assay
Die Kohlenstoffschaum-Scheiben wurden in BMP-2-Vorratslösungen (2 µg/ml) prä-adsorbiert, wobei ein Vakuum mit geringem Druck verwendet wurde, wie es oben beschrieben ist. Für detaillierte Scheiben wurden anschließend wie oben beschrieben bei 200 UpM zentrifugiert und die entfernte Flüssigkeit wurde mit der ursprünglichen Tränklösung kombiniert. Diesem Schritt folgten zwei Spülschritte für 24 Stunden mit PBS, wie sie oben beschrieben sind. Die gespülten, mit BMP infundierten Scheiben wurden anschließend zwei unterschiedlichen Elutionsprotokollen unterworfen, die aus einem Einweichen für 4 Stunden in 1M Glycin oder einem Einweichen für 2 Stunden in 4M Guanidin-Hydrochlorid bestanden. Diese Lösungen werden routinemäßig verwendet, um adsorbierte, immobilisierte Proteine oder Proteine, die in einer extrazellulären Matrix eingebettet sind, zu solubilisieren. Die Eluate-Lösungen wurden mit Flüssigkeit kombiniert, die durch Zentrifugation bei 200 UpM gewonnen wurde, und durch Zugabe von 72 µl 1M Tris zur Bewirkung einer Verschiebung zu pH 7,5 neutralisiert. Die neutralisierten Eluat-Lösungen wurden gemeinsam mit den Kontroll-BMP-2-Lösungen, die Glycin oder Guanidin-Salze in Konzentrationen enthielten, die den experimentellen Scheiben entsprachen, durch ELISA analysiert, wie es oben beschrieben ist.
C2C12-Replikation und Osteoblasten-Induktions-Assays
Beide Arten von Kohlenstoffschaum-Scheiben wurden mit Ethanol sterilisiert, mit PBS befeuchtet, und anschließend wurde PBS, die 100 ng BMP-2 enthielt, direkt auf die Materialien angewendet. Dem BMP wurde es erlaubt, für 2 Stunden bei 37°C an die Materialien zu adsorbieren. Zehntausend C2C12-Maus-Myoblasten-Zellen wurden anschließend in leere Vertiefungen (Gewebekultur-Polystyrol) gegeben oder (in einem Volumen von 50 µl) auf Kohlenstoffschaum-Scheiben mit oder ohne voradsorbiertem BMP gegeben. Nach 2 Stunden Anhaften der Zellen bei 37°C erhielten alle Vertiefungen 400 µl DMEM-Gewebekulturmedium plus 10% FBS. An den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach dem Ausplattieren wurden die Vertiefungen, welche den kompletten Datensatz enthielten, im Hinblick auf den MTT- und den alkalische Phosphatase-Aktivitäts-Assay bearbeitet.
Ergebnisse
BMP-2-Bindungs-Assay
Der anfängliche Bindungs-Assay ergab, dass ungefähr die Hälfte (etwa 50 %) des BMP-2 in der Tränklösung wiedergewonnen wurde, nachdem es 24 Stunden dem Kohlenstoffschaum ausgesetzt war (6). Dieses Ergebnis wurde unabhängig von der Ausgangskonzentration der BMP-2-Vorratslösung erhalten. Genauer gesagt wurde die Konzentration der Tränklösungen um ungefähr 50 % verringert, nachdem diese den Kohlenstoff-Scheiben ausgesetzt wurde. Bezeichnenderweise führte das zusätzliche Spülen mit PBS, welches locker gebundenes BMP-Protein oder eingeschlossene BMP-Lösung eluieren sollte, lediglich zu einer geringfügig zunehmenden Detektion von freigesetzten BMP durch ELISA über einen Zeitraum von 6 Tagen (7). Die Menge an BMP-2, die von jeder BMP-Tränkkonzentration freigesetzt wurde, entsprach lediglich ungefähr 1% der gesamten Einsatzmenge.
BMP-2-Elutions-Assay
Die Ergebnisse des BMP-2-Elutions-Assays unter Verwendung der chaotropen Mittel Guanidin-HCl und Glycin waren nicht schlüssig. In beiden Fällen ergab die vorherige Adsorption von BMP-2 in einer Konzentration von 2 µg/ml in der Tränklösung einer ungefähr 50-%ige Beladung von Zytokin auf dem Material und 50 %, die voraussichtlich von Kohlenstoff gebunden wurden. BMP-2 wurde in keiner der Desorptionslösungen nachgewiesen, was darauf verweist, dass entweder ein Teil des BMP-2 in der Tränklösung mit dem Kohlenstoff in Kontakt tritt und denaturiert wird (wodurch das Zytokin durch BMP-IgG im ELISA unnachweisbar wird) oder BMP tatsächlich gebunden wird, dann jedoch irreversibel.
C2C12-Zellreplikation und alkalische Phosphatase-Induktions-Assay
Wir waren daran interessiert, Basisdaten für die Zellreplikation und die Entwicklung des Osteoblasten-Phänotyps als Antwort auf den Kontakt mit Kohlenstoffschaum-Materialien zu etablieren. Wir haben in diesen Untersuchungen BMP der Positivkontrolle für die Induktion von Osteoblasten-Marker verwendet, sowie um zu bestimmen, ob es eine Synergie (positive oder negative) mit Kohlenstoff-Materialien gab. Diese vorläufige Untersuchung umfasste jeweils einen Vertreter der glasartigen Kohlenstoffmaterialien (DUOCEL®) und der Graphit-haltigen Kohlenstoffmaterialien (KFOAM®). C2C12-Myoblasten wurden aufgrund ihrer multipotenten Fähigkeiten, einschließlich der Fähigkeit, den Phänotyp von Osteoblasten anzunehmen, für diese vorläufigen Assays ausgewählt.
Die Replikation von C2C12-Zellen wurde unter Verwendung eines Standard-MTT-Assays, der die Zellrespiration misst, bestimmt. Die relative Anzahl von Zellen zwischen den Vertiefungen der Behandlung kann auf diese Weise verhältnismäßig akkurat bestimmt werden. In diesen Untersuchungen wurde herausgefunden, dass die Zellzahl mit zunehmender Zeit in der Kultur ansteigt, wie es vorhersehbar war. An jedem beliebigen Zeitpunkt, überstieg die Anzahl von Zellen in den TCP-Vertiefungen die Anzahl der Zellen in Kultur, die zu einem der Kohlenstoffschäume gegeben wurden (8). Bezeichnenderweise wurde möglicherweise eine Verzögerung bezüglich der Zellzahl bei den Kohlenstoffschaum-Kulturen beobachtet, jedoch nicht in den TCP-Vertiefungen. Im Einklang mit der Literatur zu der Differenzierung von pluripotenten Stammzellen verringerte BMP bei einer Konzentration von 200 ng/ml die Zellreplikation bei allen Behandlungen auf ein Ausmaß, das unterhalb der unbehandelten Kontrollen lag. BMP + Schaumkontakt erwies sich als zytotoxisch, da die Zellzahlen sich am Tag 7 gemäß den Kriterien, die durch den MTT-Assay festgelegt sind, gegen 0 bewegte.
Alkalische Phosphatase ist ein Schlüsselenzym, das im Kreislauf der Vorgänge, die zur Differenzierung von Osteoblasten führen, früh induziert wird. Das Ausmaß der Aktivität dieses Enzyms liegt nahe bei 0 in nicht stimulierten C2C12-Zellen, wobei die Induktion durch BMP schnell erfolgt, innerhalb eines Tages oder innerhalb von zwei Tagen nach Kontakt mit dem Zytokin. Im Einklang mit dieser Annahme wurde alkalische Phosphatase tatsächlich durch BMP in Kontroll-Zellkulturen zwischen den Tagen 3 und 5 induziert (9). Interessanterweise erhöhte sich die Aktivität der alkalischen Phosphatase in Zellen, die den beiden Kohlenstoffschäumen ausgesetzt waren, ohne BMP etwa 5-50-fach am Tag 3. Bei dem glasartigen DUOCEL® Kohlenstoff führte BMP zu einer zusätzlichen 2-3-fachen Erhöhung der Aktivität. Dieser synergistische Zytokin-Effekt wurde bei dem Graphit-haltigen KFOAM® nicht beobachtet. Im Einklang mit den Ergebnissen zum MTT-Überleben war die Aktivität der alkalischen Phosphatase in Kulturen am Tag 7 nicht nachweisbar, wobei die Zellzahlen im MTT-Assay abgenommen hatten (vergleiche 8).
Schlussfolgerungen
Wir waren ein wenig vom Ausbleiben der BMP-Elution, das in gespülten, vorbeladenen Kohlenstoff-Scheiben nachgewiesen wurde, überrascht, da die Protein-Bindung durch mehrere Formen von Kohlenstoff-Materialien stark ist (jedoch nicht kovalent) und irreversibel sein kann. Basierend auf den Ergebnissen zur Induktion der alkalischen Phosphatase ist es wahrscheinlich, dass das fest gebundene BMP biologische Aktivität behält. Die untersuchten C2C12-Zellen zeigten im Kontakt mit dem glasartigen und dem Graphit-haltigen Schaum eine verhältnismäßig gute Biokompatibilität. Replikation, Überleben und Induktivität wurden für mindestens fünf Tage in Kultur erhalten. Die Abnahme bezüglich dieser Parameter am Tag 7 ist vermutlich durch die geringe Penetration des Materials mit Nährstoffen und/oder Sauerstoff zu erklären, was aufgrund der Neovaskularisierung, die in diesen Materialien in früheren Tierstudien beobachtet wurde, kein Problem in vivo darstellen sollte. Wir waren einigermaßen überrascht, zu beobachten, dass trotz Fehlen von BMP die Schäume eine Osteoinduktivität zeigten. Diese wichtige Eigenschaft wurde in anderen nicht-biologischen Implantat-Materialien ebenfalls beobachtet. Diese Eigenschaft, in Kombination mit der positiven Synergie, die für BMP-2 beobachtet wurde, könnte sich als entscheidend erweisen, um ein neues Knochenüberbrückendes, Lücken füllendes Material für die orthopädische Gemeinschaft bereitzustellen.
BEISPIEL 3
Evaluierung der Osteoblasten-Integration in eine poröse Kohlenstoffschaum-Matrix
Das Ziel dieser Studie bestand darin, mehrere Faktoren zu untersuchen, die mit dem Anhaften von Zellen an die Oberfläche (Osteoblasten-Integration) des Kohlenstoffschaums einhergehen, und die Wirkungen von verschiedenen Beschichtungen zu untersuchen, welche auf das Gerüst des Kohlenstoffschaums aufgebracht wurden. Ein Flussdiagramm des Untersuchungsprotokolls ist in 10 gezeigt.
Material und Methoden
Netzförmiger, glasartiger Kohlenstoffschaum (DUOCEL® RVC Kohlenstoffschaum; ERG Materials and Aerospace Corporation, Oakland, CA) mit 80 PPI, 3% relative Dichte und Porengrößen die von 40-250 µm reichten wurde für diese Experimente verwendet. Vier unterschiedliche Arten von Kohlenstoffschaum-Bedingungen wurden untersucht: (A) ursprünglicher (unbeschichteter) Kohlenstoffschaum; (B) mit Albumin beschichteter Kohlenstoffschaum; (C) mit Kollagen Typ I beschichteter Kohlenstoffschaum; und (D) mit knochenmorphogenetischem Protein 2 („BMP-2“) beschichteter Kohlenstoffschaum. Der ursprüngliche (unbeschichtete) Kohlenstoffschaum wurde als Basis für den Vergleich mit den anderen Probengruppen ausgewählt. Insgesamt 96 Scheiben (24 von jeder Probengruppe) wurden bearbeitet und in Zylinder mit einem Durchmesser von 1 cm und einer Dicke von 2 mm geschnitten. Diese Scheiben wurden mit Alkohol gereinigt, um verbleibenden Kohlenstoffstaub von der Verarbeitung zu entfernen.
Herstellung der Kohlenstoffschaum-Beschichtungen
Die Scheiben wurden einer von drei Vorbehandlungen unterworfen: (1) Eintauchen in 10 µg/ml humanem Serumalbumin (HSA) mit destilliertem Wasser für 24 Stunden bei 37°C; (2) Eintauchen in eine Lösung von Kollagen Typ I für 24 Stunden bei 37°C; oder (3) Eintauchen in 10 µg/ml BMP-2 mit destilliertem Wasser für 24 Stunden bei 37°C. Kohlenstoffschaum-Scheiben, die in destilliertem Wasser eingetaucht worden waren, dienten als Kontrolle. Es wurde ein Vakuumsystem bei geringem Druck verwendet, um die Absorption der Beschichtungen in die Poren innerhalb der Kohlenstoffschaum-Scheiben zu erreichen. Die behandelten Kohlenstoffschäume wurden anschließend vorsichtig zentrifugiert, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Alle Proben wurden anschließend in einem biologischen Abzug über Nacht an der Luft getrocknet. Verbleibende Lösungen der Vorbehandlung wurden gesammelt und im Hinblick auf die Konzentrationen von Albumin, Kollagen I oder BMP-2 unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunsorbentassays (ELISA) gemessen.
Charakterisierung von beschichtetem Kohlenstoffschaum
In vitro-Protein-Freisetzungstest:
Beschichtete Kohlenstoffschaum-Scheiben (6 Proben/Gruppe) wurden in eine Platte mit 24 Vertiefungen mit 1 ml Phosphat-gepufferter Lösung (PBS) mit pH 7,4 Freisetzungspuffer eingebracht. Die Kohlenstoffschaum-Scheiben wurden anschließend bei 37°C inkubiert, der Freisetzungspuffer wurde gesammelt und täglich über 6 Tage hinweg gegen frischen Puffer ausgetauscht. Alle Proben wurden anschließend bei -20°C bis zur weiteren Analyse gelagert. Das Albumin, Kollagen Typ I oder BMP-2, das von den Proben freigesetzt wurde, wurde anschließend unter Verwendung eines ELISA bestimmt. Doppelreihen von 8 zweifachen Verdünnungen von jedem beschichteten Material, die von 1000 bis 4 ng/ml reichten, wurden hergestellt, und diese dienten als Standarddatensatz zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen der Probengruppen. Die Absorbanz der Proben und Standards wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegerätes gemessen, und die kumulative Freisetzung von Albumin, Kollagen Typ I oder BMP-2 wurde ausgehend von diesen Standardkurven extrapoliert.
Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
Alle Proben wurden auf SEM-Halter montiert und die porösen Eigenschaften des Kohlenstoffschaums (SEM-Abbildungen) wurden beobachtet und bei 10 kV oder 15 kV unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops begutachtet.
Zellkulturen und Induktion
Knochenmarkszellen (BMC) wurden aus dem Knochenmark von weiblichen Lewis-Ratten gewonnen. Nach Töten der Ratten durch Ersticken mit CO₂ wurden die Oberschenkelknochen aseptisch herausgeschnitten, die metaphysären Enden wurden abgeschnitten und das Mark wurde mit 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) unter Verwendung einer Spritze mit einer 22-Gauge-Nadel aus der Markhöhle gespült. Zellklumpen wurden durch wiederholtes Pipettieren der Zellsuspension dispergiert, und die in geringer Dichte vorkommenden mononukleären Zellen des Knochenmarks wurden unter Verwendung einer Dichtezentrifugation Histopaque®-1083 isoliert. Die Zellen wurden anschließend mit PBS gewaschen und für die Kultur und die Differenzierung der Osteoblasten präpariert. BMCs wurden induziert, damit sich diese in Osteoblasten differenzieren, wobei ein vollständiges Medium verwendet wurde, das aus DMEM bestand, welches mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS),10 mM β-Glycerinphosphat, 100 µM L-Ascorbinsäure und 10 nM Dexamethason, 2 mM Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, und 10-4 M L-Ascorbinsäure supplementiert war. Die induzierten BMCs wurden anschließend auf den beschichteten Kohlenstoffschaum-Scheiben ausgesät und in einem Inkubator bei 37°C für sieben Tage kultiviert.
Charakterisierung der Osteoblasten
Osteocalcin, Osteopontin und Kollagen Typ I
Bei der zweiten Passage wurden die induzierten Osteoblasten in 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,01 % Triton X-100 in PBS durchdrungen und in 1 % Blockserum für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit Anti-Osteocalcin, Osteopontin oder Kollagen Typ I für 1 Stunde inkubiert und visualisiert, wobei ein Alexa-Fluor-konjugierter (Molecular Probes, Eugene, OR) (für Osteocalcin und Osteopontin) oder ein Alexa-Fluor 488-konjugierter (Molecular Probes, Eugene, OR) (für Kollagen Typ I) sekundären Antikörper verwendet wurde. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Zellkerne wurden mit DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR) gegengefärbt.
Von Kossa-Färbung
Das Vorhandensein von Calcium-Ablagerungen wurde durch von Kossa-Färbung gezeigt. Potentielle Osteoblasten wurden in PBS gespült und in 4 % Paraformaldehyd für 30 Minuten fixiert und anschließend mit 1 % Silbernitratlösung (Sigma-Aldrich, US) unter ultravioletten Licht für 20 Minuten inkubiert. Nicht reagiertes Silber wurde mit 5 % Natriumthiosulfat (Sigma-Aldrich, US) für 5 Minuten entfernt. Die gefärbten Objektträger wurden anschließend nach permanenter Befestigung unter dem Mikroskop beobachtet.
Zellkultur auf Kohlenstoffschaum
Induzierte Osteoblasten in 50 µl-Suspensionen (3,5×10⁶ Zellen/ml) wurden auf jedes Gerüst in Platten mit 24 Vertiefungen geladen. Die Gerüste wurden ohne Störung in einem Inkubator bei 37 °C für 2 Stunden belassen, um es den Zellen zu ermöglichen, an das Gerüst anzuhaften, und anschließend wurden die ausgesäten Zellen auf den Materialien in Kultur belassen, wobei die gleichen osteogenen Medien verwendet wurden. Das Medium wurde alle 3 Tage ausgetauscht, und am Tag 7 wurden die Proben für die morphologische und biochemische Begutachtung geerntet. Zellen der Kulturschale wurden als Kontrolle verwendet.
Morphologische Begutachtung
Um die SEM-Untersuchung vorzubereiten, wurden Membranen mit Kulturzellen vom Tag 7 mit 2 % Glutaraldehyd für 60 Minuten bei 4 °C fixiert. Die Proben wurden anschließend zweimal in PBS gewaschen und für 60 Minuten mit 2 % Osmiumtetroxid in Kontakt gebracht. Nachdem die Proben in destilliertem Wasser gespült worden waren, wurden sie durch eine abgestufte Reihe (20%, 40%, 60%, 80%, 95%, and 100%) Ethanol für 5 Minuten dehydriert. Der Vorgang der Dehydrierung wurde in Hexamethyldisilazan (HMDS) für 10 Minuten vervollständigt. Nach Trocknen an der Luft wurden die Proben mit Gold Spot-beschichtet und auf SEM-Halterungen aufgebracht. SEM-Abbildungen wurden bei 10 kV oder 15 kV beobachtet und für die morphologische Begutachtung der induzierten osteogenen Zellen auf den Gerüsten gespeichert.
Zytotoxizität
Die Zytotoxizität von Kohlenstoffschäumen wurde quantitativ durch Messung der Freisetzung von Laktat-Dehydrogenase (LDH) bestimmt. Ein CytoTox 96®-Assay wurde verwendet, um das Verhältnis von leblosen Zellen zu lebenden Zellen auf dem Knochen oder dem Komposit-Gerüst zu messen. LDH ist ein hervorragender Indikator für Zelltod und Zellschaden. Leblose Zellen setzen LDH während der Kultivierung frei, und es ist daher essenziell, die kultivierten Medien gemeinsam mit dem Überstand des Lysepuffers zu sammeln. 10 µl der Aliquots des Mediums wurden mit 200 µl LDH-Reagenz gemischt und die kultivierten Medien und die Lysepuffer-Lösungen für jede der vier Gruppen wurden in ihre entsprechende Vertiefung überführt. Ein Spektrophotometer (Spectra MAX Gemini XS) wurde verwendet, um die Absorbanz der Lösungen bei einer Wellenlänge von 490 nm zu messen. Höhere Auslesungen entsprachen einer stärker toxischen Umgebung für die osteogenen Zellen.
Zellüberleben
Das Überleben der Zellen wurde durch Analyse der Mitochondrien-Aktivitäten in den kultivierten Zellen auf den Scheiben bestimmt. Der AlamarBlue®-Assay (BioSource, US) wurde verwendet, um die Aktivität der Zellen nach 7 Tagen Zellkultur zu bestimmen. Das AlamarBlue®-Reagenz ist ein wertvolles Werkzeug, das verwendet wird, um die Zellproliferation auf den Scheiben sicherzustellen, indem die Zellzahl mit den Absorptionswerten korreliert wird. Im Gegensatz zu Zytotoxizitäts-Tests wurde das kultivierte Medium mit PBS vollständig entfernt, und frisches Medium wurde zugegeben, um die Komposit-Proben zu bedecken. In jede Vertiefung wurden 3 ml der neuen konditionierten Medien gegeben, die mit 200 µl AlamarBlue® supplementiert waren, und die Inkubation wurde bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 4 Stunden fortgesetzt. Das Kulturmedium wurde anschließend in eine Platte mit 96 Vertiefungen überführt und auf einem Spektrophotometer (Spectra MAX Gemini XS) bei einer Anregungs-Wellenlänge von 570 nm und einer Emissions-Wellenlänge von 600 nm ausgelesen, und die Daten wurden unter Verwendung von SoftMax PRO analysiert. Die AlamarBlue®-Absorbanz der DNA-Werte wurde für jede Probe berechnet.
Messung der Zellzahl
Die Zellzahlen wurden durch fluorometrische Quantifizierung von DNA auf dem Kohlenstoffschaum-Konstrukt bestimmt. Nach dem AlamarBlue®-Assay wurden die Zell-Gerüste mit PBS gespült, gefolgt von 1 ml Lysepuffer und 2 Minuten Ultraschall. Das Lysat wurde anschließend in einem besonderen Röhrchen aufbewahrt. 100 µl einer Probe des Überstands wurden in 1,5 ml eines 200 ng/ml Hoechst 33258 Fluoreszenz-Farbstoffs (Sigma-Aldrich, US) vermischt und bei Ex 350 nm und EM 455 nm im Fluorometer ausgelesen. Die DNA-Konzentration in den Proben wurde gegen eine DNA-Standardkurve bestimmt.
Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP)
Die ALP-Aktivität von osteogenen Zellen wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt. Nach einem vorhergehenden Zyklus aus Einfrieren/Auftauen (Einfrieren bei -80 °C für 30 Minuten und Auftauen bei 37 °C für 30 Minuten) und einer Homogenisierung für den DNA-Assay wurden 100 µl der Probe von dem Lysat entfernt, zu dem 100 µl p-Nitrophenylphosphat-Lösung gegeben worden war. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wurde die Erzeugung von p-Nitrophenol in Gegenwart von ALP bei einer Absorptions-Wellenlänge von 405 nm gemessen. Die Messung des ALP-Assays wurde gegen die Menge der Gesamt-DNA in jeder Probe normalisiert.
Molekulare Marker (Osteocalcin)
Zellen-Lysate wurden für den Osteocalcin-Assay verwendet, wobei ein Sandwich-ELISA angewendet wurde. 2 µg/ml des primären Antikörpers wurden beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen, in 200 µl 5 % Milch verteilt und bei 37 °C für 4-6 Stunden inkubiert. Proben mit 50 µl des Überstands wurden zu der Beschichtungsplatte gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von Waschen der Platte und Zugabe von 100 µl 1 µg/ml Antikörper, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 1 Stunde. Die Platten wurden gewaschen und anschließend wurde 20 µl Streptavidin in 10 ml PBS zugegeben, und bei 40 °C inkubiert. Als nächstes wurde 2 pNPP pro 10 ml eines Diethanolamin-Puffers aufgelöst, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C im Dunkeln für 5-20 Minuten. Ein Spektrophotometer (Spectra MAX Gemini XS) wurde verwendet, um die Absorption der Lösungen bei einer Wellenlänge von 405 nm zu messen, und die Absorption des ELISA wurde gegen die Menge der Gesamt-DNA in jeder Probe normalisiert.
Ergebnisse
Charakterisierung des beschichteten Kohlenstoffschaums
Proteinfreisetzungstest
Sowohl Albumin als auch BMP-2 zeigten innerhalb der ersten 24 Stunden eine minimale stoßartige Freisetzung, wobei das Albumin 0,108 % freisetzte und BMP-2 0,2733 % freisetzte (11 AB). Diesen stoßartigen Freisetzungen folgten Freisetzungsraten die signifikant verringert waren. Kollagen Typ I zeigte nicht das gleiche stoßartige Freisetzungsprofil, das bei Albumin und BMP-2 innerhalb der ersten 24 Stunden beobachtet wurde (11C). Kollagen Typ I wurde kontinuierlich bei einer Rate von 0,0003 % während der ersten sechs Tage der Messung freigesetzt. Diese vernachlässgbare Freisetzung von Kollagen Typ I aus dem Kohlenstoffschaum erlaubte eine hohe Retention von Proteinen auf der Oberfläche des Biomaterials, die anschließend zu ihrer biologischen Wirkung auf anhaftende Zellen beiträgt.

Während die kumulativen Freisetzungen von Albumin und BMP-2 aus dem Kohlenstoff größer waren als die des Kollagens Typ I betrugen die Rezensionen von Albumin und BMP-2 auch weiterhin bis zu 99,89 % bzw. 99,68%. Es ist daher möglich, dass die minimalen Freisetzungsraten es ermöglicht haben, dass ausreichende Mengen von Albumin und BMP-2 verbleiben, und anschließend die Zelladhäsion, Proliferation und die Bildung einer knochenartigen Matrix fördern. Die stabile und anhaltende Retention von Proteinen auf dem Gerüst wird die Erhöhung der Freisetzungsdauer und der lokalen Proteinkonzentration ermöglichen. Dieses Freisetzungsmuster kann nur selten zu einer entfernten Verteilung des Proteins und zu einer anschließenden ektopischen Knochenbildung führen. Tabelle II: Proteinfreisetzung von beschichtetem Kohlenstoffschaum

	Albumin		BMP-2		Kollagen Typ I
	Konzentration (µg/ml)	Rate (%)	Konzentration (µg/ml)	Rate (%)	Konzentration (µg/ml)	Rate (%)
Tag 1	0.31510±0.05510	0.1081	0.76700±0.31370	0.2733	0.00074±0.00002	0.0003
Tag 2	0.00442±0.00122	0.0015	0.09230±0.05300	0.0329	0.00074±0.00005	0.0003
Tag 3	0.00061±0.00007	0.0002	0.01080±0.00105	0.0038	0.00071±0.00001	0.0002
Tag 4	0.00084±0.00008	0.0003	0.01100±0.00118	0.0039	0.00069±0.00002	0.0002
Tag 5	0.00070±0.00002	0.0002	0.01020±0.00082	0.0036	0.00069±0.00003	0.0002
Tag 6	0.00076±0.00010	0.0003	0.00957±0.00025	0.0034	0.00072±0.00004	0.0002
Original	10.00000		10.00000		10.00000
Rest	0.35570		0.80780		0.26970

Die prozentuale Freisetzung von Protein wurde zu jedem Zeitpunkt wie folgt bestimmt: $Freisetzungsrate = \frac{M e n g e d e s a m T a g X f r e i g e s e t z t e n P r o t e i n s}{(50 μ g P r o t e i n - M e n g e d e s r e s t l . P r o t e i n s) / 6 P r o b e n} \times 100 %$
Charakterisierung der Osteoblasten

Die Fähigkeit der induzierten Osteoblasten zur Expression von Osteocalcin, Osteopontin und Kollagen Typ I wurde durch Immunzytofluoreszenz untersucht (12). Während die Expression von Osteocalcin (in rot, 12 A) und Osteopontin (in rot, 12 B) in induzierten Osteoblasten sehr deutlich war, wurden diese Zellen weiter durch positive Färbung auf Kollagen Typ I identifiziert (in grün, 12A-B), was darauf verweist, dass die induzierten Zellen den unterscheidbaren Osteoblasten-Phänotyp aufwiesen. Um zu zeigen, dass die Zellen die Fähigkeit aufweisen, die Matrix zu mineralisieren, wurden auf Petrischalen kultivierte Zellen einer von Kossa-Färbung unterzogen, um die Kalziumablagerung sichtbar zu machen (12C). Die dunkel gefärbten mineralisieren Nodien wurden durch Silbernitrat sichtbar gemacht, was auf eine normale Osteoblasten-Funktion in konditionierter Kultur verweist. Tabelle III. Zellkultur auf Kohlenstoffschaum

	AlamarBlue® (OD/µg DNA)	ALP (OD/µg DNA)	Osteocalcin (ng/µm DNA)	LDH
Albumin	0.007±0.003	0.005±0.003	0.039±0.023	-0.951±1.041
BMP-2	0.010±0.001	0.006±0.002	0.028±0.011	1.491±1.126
Kollagen I	0.015±0.001	0.008±0.003	0.065±0.045	1.829±1.961
H₂O	0.015±0.002	0.009±0.002	0.018±0.013	0.520±0.786

Um die Wirkungen der unterschiedlichen Proteinbeschichtungen auf Osteoblasten zu untersuchen, haben wir das Überleben der Zellen, die ALP Aktivität, die Expression von Osteocalcin und den Zellschaden der Osteoblasten unter Verwendung von Spektrophotometrie oder Spektrofluorometrie auf der Ebene der Einzelzellen untersucht, indem Zellen auf Kohlenstoffschaum in vitro für eine Woche kultiviert wurden. Die relative Quantifizierung der Aktivitäten wurde in dieser Untersuchung auf der Ebene der Einzelzellen durchgeführt, weil verstärkten zelluläre Funktionen und Viabilitäten definitiv nachgegangen werden sollte, wenn die Zellmengen verhältnismäßig leicht kontrollierbar sind, wie beim sich zusammensetzenden Knochen. Vergleiche wurden angestellt zwischen den Gruppen von Albumin, BMP-2, Kollagen Typ I und H₂O behandelten Kohlenstoffschäumen (13).
Kohlenstoffschäume, die mit Kollagen Typ I und H₂O behandelt worden waren, führten zu einem höheren Überleben der Zellen als in den Albumin- und BMP-2-Gruppen, die durch die AlamarBlue®-Auslesung, welche durch die DNA-Mengen jeder Gruppe normalisiert war, repräsentiert wurden. ALP-Aktivität und Osteocalcin-Expression sind Indikatoren des Osteoblasten-Phänotyps in Bezug auf Funktion und Reife, und korrelieren teilweise mit der Fähigkeit zur Knochenbildung. Es schien so als ob die ALP-Aktivität auf sich veränderte Materialien in ähnlicher Weise wie das Zellüberleben reagierte, wobei höhere Werte für ALP in den Gruppen von Kollagen Typ I und H₂O beobachtet wurden. Im Vergleich mit anderen Gruppen stimulierte Kollagen Typ I eine höhere Osteocalcin-Expression, obgleich die statistische Signifikanz mit Ausnahme von Kollagen Typ I versus H₂O zweifelhaft war. Es wurde erwartet, dass BMP-2, das hinreichend bekannte osteogene Protein, welches bei rekonstruktiven Operationen von Knochen weite Verbreitung gefunden hat, die Differenzierung und Funktion von Osteoblasten ermöglicht. In der vorliegenden Untersuchung jedoch schien BMP-2 keine günstigere Umgebung für die Funktion der Osteoblasten bereitzustellen, was sich durch die geringere Produktion von ALP und Osteocalcin beobachten ließ. Paradoxerweise führte Kohlenstoffschaum, der mit Kollagen Typ I und BMP-2 behandelt worden war, zu einer offensichtlichen Zytotoxizität, was sich durch eine höhere Auslesung des LDH-Verhältnisses zeigte. Es ist schwierig, den gleichzeitig fördernden und hemmenden Effekt von Kollagen Typ I auf die Osteoblasten zu interpretieren, die durch die höheren Auslesungen im AlamarBlue®- und LDH-Assay belegt wurden. Die Albumin-Gruppe zeigte jedoch das geringste Zellüberleben (d.h. AlamarBlue®/DNA) sowie auch die geringste nachteilige Wirkung auf die Zellen (d.h. LDH). Im Gegensatz dazu zeigte mit H₂O behandelter Kohlenstoffschaum, dem jegliche Proteinbeschichtung fehlte, vielversprechende Eigenschaften: höheres Zellüberleben, geringere Zelltoxizität und höhere ALP-Aktivität mit Ausnahme der geringen Osteocalcin-Produktion.
BEISPIEL 4
Begutachtung von Kohlenstoffschaum in Partikelform
Die hier vervollständigten Arbeiten zeigen, dass Kohlenstoffschaum-Partikel mit ihrem monolithischen Kohlenstoffschaum-Ausgangsmaterial die Fähigkeit teilen, sowohl an BMP-2 zu binden als auch die Anhaftung von Osteoblasten und Stammzellen an die Oberfläche des Materials zu fördern. Diese Eigenschaften tragen zu einem Transplantat-Material bei, welches osteogen, osteoinduktiv sowie auch osteokonduktiv ist. Diese drei grundlegenden Eigenschaften führen in Kombination mit der erzeugten „Porosität“ und „Porengeometrie“ der aggregierten Partikel, welche zu einem größeren oder geringeren Grad die Geometrie des Ausgangs-Schaummaterials widerspiegelt, wenn die Partikel eingeengt in einer Trägermatrix vorliegen, zu Implantat-Materialien die signifikant eine de novo Knochenbildung an chirurgisch erzeugten Defektstellen fördert. Der Machbarkeitsnachweis wurde teilweise durch Verwenden von osteopromotiven in vitro Assays, Hochdurchsatz-Tiermodellen für die ektopische Knochenbildung und klinisch-mimetischen Tiermodellen für kritische Knochendefekte entwickelt.
14 ist eine Darstellung, die eine Bindung von BMP-2 an Kohlenstoffschaum-Partikel unter Verwendung einer Induktion der alkalischen Phosphatase in C2C12-Maus-Myoblasten-Zellen zeigt. Replikat-Chargen von 10 mg Kohlenstoffschaum-Partikeln wurden in 500 ng BMP-2 in 200 µl PBS getaucht. Nach 18 Stunden Durchtränken wurden die Kohlenstoffschaum-Partikel aus drei Replikaten von der BMP-Lösung getrennt (GRAN(-)) und in Kontakt mit C2C12-Zellen gebracht, die auf einer Plastikoberfläche wuchsen. Drei andere Kohlenstoffschaum-Partikel-Replikate wurden in der BMP-2-Tränklösung schockgefroren (GRAN(+)) und ebenfalls in Kontakt mit den wachsenden Zellen gebracht. Replikate derselben Gruppen wurden in Transwell-Schalen überführt, die einen Kontakt mit dem Gewebekultur-Medium erlaubte, jedoch einen direkten Zellkontakt verhinderte (TW(-) und TW(+)). Als Kontrolle wurde 500 ng BMP-2 direkt zum Medium gegeben, in dem die C2C12-Zellen wuchsen. Fünf Tage nach Zugabe von Partikel-gebundenem oder freiem BMP wurden die Zellen lysiert und die Aktivität der alkalischen Phosphatase (ein Maß für die osteogene Induktion) wurde gemessen (+/- SEM).
Die Daten in 14 zeigen, dass die Menge an Aktivität der alkalischen Phosphatase, die in den C2C12-Zellen durch BMP-2-beschichtete Kohlenstoffschaum-Partikel (aka „VCF-Partikel“) induziert wurde, äquivalent zu der war, die durch lösliches BMP-2 induziert wurde, das dem Kulturmedium zugegeben wurde (vergleiche TCP~BMP mit GRAN (-)). Bezeichnenderweise war die alkalische Phosphatase, die durch Kohlenstoffschaum-Partikel induziert wurde, welche in BMP-2-Lösung getränkt und lyophilisiert worden waren (und somit die gesamte Dosis an BMP-2 an die Zellen lieferte), gegenüber der Kontrolle oder den nicht getränkten Replikaten nicht erhöht. Dieses Ergebnis verweist darauf, dass BMP schnell und quantitativ von den Oberflächen der Kohlenstoffschaum-Partikel gebunden wird, und dass darüber hinaus die biologische Aktivität während und nach dem Bindungsschritt beibehalten wird. Von gleicher Bedeutung ist die Einsicht, dass weder die beschichteten/segregierten noch die beschichteten/lyophilisierten Materialien in den Transwell-Schalen (TW(+) und TW(-)) in der Lage waren, die alkalische Phosphatase zu induzieren, was die exzellenten erhaltenden Eigenschaften des Materials zeigt. Diese unerwartete Eigenschaft der Kohlenstoffschaum-Partikel ermöglicht ein „langsames“ Emotionsprofil, das zu einer außergewöhnlich guten neuen Knochenbildung führt, wenn derartige Komposite in Tiere implantiert werden (siehe unten). Ein solches Elutionsprofil wurde bei mehreren Gelegenheiten unter zahlreichen experimentellen Bedingungen durch die Anmelder gemessen, was die oft in der Literatur vertretene Meinung stützt, dass ein kleiner Ausstoß gefolgt von einer langsamen Freisetzung über mehrere Tage optimal für eine therapeutische Verabreichung von BMP-2 ist.
Ein Hochdurchsatz-Tiermodell für die ektopische Knochenbildung, bei dem Transplantat-Materialien in eine blutende Muskelstelle implantiert werden, wurde ebenfalls entwickelt, um die Wirksamkeit der Kohlenstoffschaum (aka glasartiger Kohlenstoffschaum oder VCF)-Partikel und die Komposite davon zu unterstützen. 15 zeigt Bilder der ektopische Knochenbildung, die durch Kohlenstoffschaum-Partikel oder mit BMP-2-beschichtete Kohlenstoffschaum-Partikel, welche für 30 Tage in einen abdominalen Muskelbeutel einer Lewis-Ratte implantiert wurden, wie sie durch MikroCT gemessen wurde. Die Menge der Bildung von neuem Knochen, die durch ein Kontroll-Implantat (VCF 3D Scheibe + 1000 ng BMP-2) induziert wurde, wurde mit BMP-2-beschichteten Kohlenstoffschaum-Partikeln, die entweder mit Kollagen + Gelatine oder mit DBM + Gelatine verbunden waren, verglichen. Zweidimensionale µCT-Abbildungen sind links gezeigt, und die gemessenen Knochen-Volumina (mm3) sind rechts tabellarisch aufgeführt (Mittelwert aus 3 Messungen). Wie in 14 gezeigt ist, erwiesen sich Kohlenstoffschaum-Partikel, die mit BMP-2 beschichtet und anschließend entweder mit einer Kollagen/Gelatine-Matrix oder mit einer DBM/Gelatine-Matrix gemischt worden waren, bei der Erzeugung von neuem Knochenvolumen, wie es in der µCT gemessen wurde, vorteilhaft im Vergleich zu Kohlenstoffschaum-Partikeln (3D VCF)-Scheiben, die mit BMP-2 beschichtet worden waren. Diese Ergebnisse wurden mit zahlreichen der VCF-Partikel-/Komposit-Formulierungen, die in Tabelle IV abgebildet sind, wiederholt (siehe unten).
Die folgenden Einschlusskriterien wurden bei der Entwicklung von VCF-Partikeln für Transplantation-Anwendungen verwendet:

1. Identifikation eines Polyethylenterephthalat (PET)-Netzes als geeignetes, biokompatibles Einschlussmaterial für Kohlenstoffschaum-Partikel, die nur osteopromotive oder therapeutische Beschichtungen enthalten (ohne Träger). Diese Konfiguration erlaubt ein Durchwachsen von neuem Knochen während sie gleichzeitig die defekte Stelle ausgleicht und einfach chirurgisch anzuwenden ist.
2. Einschluss eines Trägermaterials, das zum Zusammenhalt des Rohmaterials aufgrund seiner Löslichkeit in der flüssigen Phase beiträgt. Diese Eigenschaft des Komposits verleiht die Fähigkeit, das Transplantat-Rohmaterial entweder als handgeformtes Objekt oder durch Herausdrücken aus einer Spritze (mit oder ohne perkutane Möglichkeit der Spritzeninjektion) zu verabreichen.
3. Einschluss eines unlöslichen Materials, das zum Zusammenhalt des Komposits durch Erhöhung der Viskosität und Bereitstellung eines Grads von Oberflächenspannung beiträgt, der ausreicht, um das Auflösen der Trägerzusammensetzung bei Kontakt mit Körperflüssigkeiten an der Transplantatstelle (durch Verringerung der effektiven Wasserkonzentration) zu verringert. Es wurde herausgefunden, dass ein zerriebenes Kollagen-Produkt, das in der Lage ist, ein Hydrogel zu bilden, diese Rolle gut erfüllt.
4. Optimierung der BMP-2-Zytokin-Adhäsion an die VCF-Partikel vor dem Mischen mit Verarbeitungsbestandteilen, um einen osteoinduktiven Stimulus bereitzustellen.
5. Es wurde ferner erkannt, dass die Verdünnung des körnigen BMP-2/VCF-Bestandteils zu einer unakzeptablen Verdünnung der Osteoinduktivität führen kann, und in Reaktion auf diese Besorgnis wurden VCF-BMP-2-Ausführungsformen entwickelt und untersucht, bei denen die beschichteten Körner allein in Fibrin-Gelen eingebaut oder von PET-Netzmaterial umschlossen wurden, was zu Knochenersatzersatz-Materialien führte, welche die Fähigkeit verloren haben, durch Herausdrücken aus einer Spritze verabreicht zu werden, die jedoch entweder unter Verwendung eines Applikators mit großer Bohrung verabreicht werden können oder die per Hand in unregelmäßig geformte Knochenlücken eingebracht werden können.

Aus den oben genannten Einschlusskriterien wurde eine einfache Test-Matrix entwickelt. Diese bestand darin, Pilot-Formulierungen aus Kohlenstoffschaum-Partikeln (aka „VCF-Körnchen“), Trägermaterial und kohäsivem Material zu entwickeln, die eine geeignete Darstellung von VCF (und folglich dem gebundenen BMP-2-Zytokin) im Endprodukt ermöglichte, um für eine adäquate Knochenbildung zu sorgen. Diese Entscheidung basierte auf früheren in vitro Studien und Tierstudien, in denen die Induktion von Knochenzell-bildenden Merkmalen identifiziert wurde. Die in Tabelle IV aufgeführten Formulierungen wurden in einem sterilen Röhrchen hergestellt, in 3 cc-Spritzen rückgeführt, und das Material wurde auf eine saubere Parafilm-Oberfläche ausgestoßen. Unmittelbar nach dem Ausstoßen, wurde der Wulst des Komposit-Materials in 37 °C Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) eingetaucht und für 15 Minuten beobachtet, um eine Tendenz zu einer „Auflösung“ zu identifizieren. Diese Terminologie wurde verwendet, um den Ausfluss von sichtbarem, festem Material aus dem Körper der Wulst als Ergebnis der Solubilisierung und der Diffusion aus dem Trägermaterial heraus zu beschreiben. Die hinsichtlich der Auflösung getesteten Materialien wurden anschließend bei 37 °C (zur Nachahmung der Körpertemperatur) gehalten und „Spülungsresistenz“ wurde als Neigung des erwärmten Materials verzeichnet, sich zu widersetzen, während der Bewegung auf einem Schüttler bei 37 °C inkohärent zu werden (als Ergebnis des Phasenübergangs von Gel zu Flüssigkeit). Tabelle IV. Komposit-Transplantatformulierungen, die in Auflösung- und Spülresistenz-Assays getestet wurden. Die tatsächlichen Formulierungen bestanden aus dem 5-fachen der angegebenen Volumina/Massen.

Key	VCF (mg)	Kohäsion (mg)	Träger (mg)	PBS (ml)	Auflösung (Zeit @ 25°C)	Spülresis. (Zeit @ 37°C)
A	60	Zerriebenes Kollagen	N/A	N/A	Gut	Gut
		(160)			(30 min)	(30 min)
B	60	Zerriebenes Kollagen	Gelatine	0.3	Exzellent	Exzellent
		(160)	(100 mg)		(>60 min)	(35 min)
C	60	Zerriebenes Kollagen	Carboxymethylcellulose	1.3	Sehr gut	Sehr gut
		(160)	(120)		(40 min)	(25 min)
D	60	N/A	Gelatine	2.3	Exzellent	Exzellent
			-180		(>60 min)	(35 min)
E	60	N/A	Carboxymethylcellulose	3.3	Sehr gut	Gut
			(120)		(30 min)	(15 min)
F	60	DBM (140)	Gelatine (180)	0.6	Exzellent	Exzellent
					(>60 min)	(35 min)
G	60	DBM (140)	Carboxymethylcellulose	0.6	Exzellent	Exzellent
			(120)		(>60 min)	(35 min)
H	60	DBM (140)	Glycerin	0.3	Schlecht	Schlecht
			(450)		(5 min)	(1 min)
I	60	DBM (140)	CaSO4	0.45	Mittelmäßig	Mittelmäßig
			(180)		(10 min)	(5 min)
J	60	DBM (140)	Phosphatidylcholin	0.6	Mittelmäßig	Mittelmäßig
			(400)		(10 min)	(5 min)
K	60	DBM (140)	Hyaluronsäure (400)	0.6	Mittelmäßig	Schlecht
					(10 min)	(5 min)

Ergebnisse und Schlussfolgerungen:
Alle der getesteten Material-Kombinationen (die hauptsächlich durch den Trägertyp unterschieden wurden) verhielten sich akzeptabel, basierend auf der Erwartung, dass sie aus einer Spritze ausgestoßen werden können, formbar sind (vorliegend nicht quantifiziert) und bei Untertauchen in 37 °C PBS (Auflösung) ihre Kohärenz beibehalten. Einige der Kombinationen aus Träger und Transplantat-Material zeigten eine schlechte Performance, da ihnen eine Spülung fehlte, einschließlich CaSO₄, Phosphatidylcholin und Hyaluronsäure. Die Träger Gelatine und Carboxymethylcellulose zeigten in allen Kriterien eine gute Performance und werden daher vorliegend als bevorzugte Ausführungsformen in Betracht gezogen. Die Bewertung und Untersuchung von weiteren Materialien wird gegenwärtig durchgeführt. Sowohl Gelatine- als auch Carboxymethylcellulose-Träger werden weiteren Untersuchungen in Tiermodellen unterzogen, um ihre relativen Fähigkeiten zur Förderung neuer Knochenbildung unter strikteren Bedingungen sicherzustellen.
Die VCF-Partikel-Transplantate, die vorliegend beschrieben werden, wurden entwickelt, um Nachteile im Stand der Technik zu überwinden. In diesem Zusammenhang wird auf die folgenden Performance-Punkte aufmerksam gemacht, die durch die beschriebenen Materialien berücksichtigt wurden:

1. Außergewöhnliche Adsorption und Retention des Zytokins BMP-2 (und anderen klinisch relevanten Zytokinen) an der Transplantationsstelle. Es ist allgemein anerkannt, dass dieses Ergebnis den Titer von Reparatur-Zellen an der defekten Stelle (durch die Beschränkung von Zytokin an der Transplantationsstelle) sowie auch durch die Verringerung der Zytokin-Dosis, was unerwünschte Wirkungen abseits der Zielstelle verringert, erhöht. Wir merken an, dass diese Performance-Eigenschaften einen Beitrag zum Repertoire der FDP-genehmigten klinischen Anwendungen für gegenwärtig zugelassene Therapeutika leisten wird.
2. Verbesserte Handhabung und Anpassbarkeit an die Defektstelle. Dies bedeutet, dass synthetische Knochenersatz-Materialien verhältnismäßig spröde sind und aufgrund ihrer chemischen Zusammensetzungen und Ausdehnungen nicht dabei dienlich sind, sich an unregelmäßige Defekte anzupassen. Das gleiche gilt für die Allotransplantations- und Autotransplantations-Knochentransplantat-Materialien die von Donoren bzw. Patienten erhalten werden. Bezeichnenderweise erfährt der gegenwärtige Versorgungsstandard bei Knochentransplantaten (BMP-2, das auf einem Kollagen-Schwamm angewendet wird) Kompressionskräfte während der Anwendung und eine Implantation, die zu einem Ausstoß der Zytokin-Lösung führt. Dies führt sowohl zur reduzierten lokalen Wirksamkeit als auch zu einer ungewollten ektopischen Knochenbildung abseits der Zielstelle.
3. Die VCL-Partikel-Transplantatmaterialien übertreffen aufgrund ihrer Geometrie auch andere Arten von Transplantat-Materialien. Dies bedeutet, dass ein Gerüsts mit einer vernetzten „Porosität“, die sowohl hinsichtlich der Ausdehnung als auch in Bezug auf den Porendurchmesser optimal ist, auf eine Wunde angewendet wird. Andere Transplantatmaterialien (insbesondere Gläser, Keramiken und Nicht-glasartige Kohlenstoff-Verbindungen) scheitern daran, diesen allgemein akzeptierten engen Bereich von Porositäten bereitzustellen, der vorliegend durch wiederholte experimentelle Entdeckung durch die Anmelder gezeigt wird. Das signifikante Ergebnis dieser Optimierungen ist die schnelle und starke Entwicklung eines vaskularisierten Gewebe-Bettes, das nach allgemeiner Auffassung eine fundamentale Voraussetzung für erfolgreiche Transplantationsverfahren ist.

Vorteilhafte und nicht-offensichtliche Merkmale der Erfindung umfassen:

1. Die Bindung von BMP-2 (und anderen relevanten Protein-Therapeutika) an die Kohlenstoffschaum-Partikel wird durch nicht-kovalente Bindungsinteraktionen erreicht und widersteht daher der Auflösung einer hydrodynamischen Elution. Transplantate, die unter Verwendung der vorliegend beschriebenen Materialien und Methoden hergestellt wurden, sind nicht einfach nur „Therapeutikumeluierend“ (wie dies der Fall ist bei synthetischen Polymeren, Gläsern, Keramiken, Metallen und anderen herkömmlich verwendeten Transplantatmaterialien), sondern sie sind „Therapeutikum-behaltend“.
2. Die vorliegend beschriebenen Materialien und Komposite unterstützen nicht nur eine exzellente Zellbindung, Replikation und Therapeutikum-spezifische Differenzierung, sondern dienen dazu, eine frühe Neovaskularisierung zu steuern.
3. Die vorliegend beschriebenen Materialien werden, wenn sie mit den vorgeschlagenen Kompositionen verbunden werden, langsam durch zelluläre Interaktionen abgebaut, wodurch ein resorbierbares Transplantat bereitgestellt wird.
4. Anders als bei festen Kohlenstoffschaum-Konstrukten, die in früheren Publikationen und Patentanmeldungen beschrieben wurden, können die Kohlenstoffschaum-Partikel und Komposite geformt, injiziert und extrudiert werden, um in unregelmäßige Defektformen und Volumina zu passen, wodurch eine einfache chirurgische Implantation ermöglicht wird, während die klinischen Anwendungen erweitert werden.

Diese Erfindung wurde entwickelt, um die Patientenversorgung zu verbessern. Die Population der Patienten wird von der Einführung dieser Technologie durch verbesserte chirurgische Optionen hinsichtlich regenerativer chirurgischer Verfahren, günstigen klinischen Ergebnissen mit weniger wiederholten chirurgischen Eingriffen und geringeren Auslagen profitieren. Diese Ergebnisse werden über die Entwicklung von einer oder mehreren der postulierten Ausführungsformen erreicht, die eine wirksame Verabreichung/Retention von therapeutischen Mitteln, Optionen für die Anwendung des geeigneten Transplantats (in einem Netz zurückgehalten, Spritze oder perkutane Verabreichung) und Anpassung des Transplantat-Materials an die Wunde/Defektstelle einschließen.
Diese Materialien wurden einer intensiven Untersuchung sowohl in vitro als auch in vivo in Tiermodell-Testverfahren unterzogen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen haben gezeigt, dass partikelförmige, glasartige Kohlenstoff-Partikel biokompatibel sind, die Anhaftung und Differenzierung von Zellen fördern, für die Regeneration wichtige Wachstumsfaktoren in einer aktiven, eluierbaren Form binden, und ein dreidimensionales Substrat bereitstellen, dass die Neovaskularisierung fördert. Das letztgenannte Ergebnis ist von kritischer Bedeutung für den Beginn der Heilung sämtlicher Gewebedefekte, einschließlich muskuloskelettaler, kardiärer, hepatischer, vaskulärer und epidermaler Gewebe.

Claims

Zusammensetzung für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen, wobei die Zusammensetzung eine Vielzahl von kohlenstoffartigen Partikeln und mindestens ein osteopromotives und/oder therapeutisches Mittel umfasst, wobei die kohlenstoffartigen Partikel nicht-makroporöse, granulöse Körper sind, die in einer Trägermatrix dispergiert oder in einen biokompatiblen Netzbehälter eingeschlossen sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel eine maximale Oberfläche-zu-Oberfläche-Ausdehnung von weniger als etwa 1000 µm aufweisen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel sich von Kohlenstoffschaum ableiten.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel pulverisierter Kohlenstoffschaum sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung eine frei fließende trockene Zusammensetzung ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel physisch mit dem mindestens einen osteopromotiven und/oder therapeutischen Mittel vermischt sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel eine Beschichtung mit dem mindestens einen osteopromotiven und/oder therapeutischen Mittel umfassen.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das osteopromotive und/oder therapeutische Mittel auf der Oberfläche der kohlenstoffartigen Partikel adsorbiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das osteopromotive und/oder therapeutische Mittel auf der Oberfläche der kohlenstoffartigen Partikel lyophilisiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel und das mindestens eine osteopromotive und/oder therapeutische Mittel einzeln in der Trägermatrix dispergiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die kohlenstoffartigen Partikel eine Beschichtung mit dem mindestens einen osteopromotiven und/oder therapeutischen Mittel umfassen, und wobei die beschichteten Partikel in der Trägermatrix dispergiert sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung ein fließfähiges Komposit in Form eines autarken Körpers ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gelatine, Carboxymethylcellulose, Hyaluronsäure, Phosphatidylcholin, Atelokollagen, und Kombinationen davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Trägermatrix ein härtbares Polymer ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die ferner ein Kohäsionsmittel umfasst, dass ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus zerriebenem Kollagen, demineralisierter Knochenmatrix, nicht-quervernetzten Kollagenfasern, Chitin, Chitosan, Seide, Carbonfasern und Kombinationen davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das osteopromotive und/oder therapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus osteokonduktiven Materialien, osteoinduktiven Materialien, Small Molecule-Wirkstoffen, biologischen Wirkstoffen und Kombinationen davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das osteopromotive und/oder therapeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Knochenfragmenten, Calciumphosphat, Hydroxylapatit, Korallin, gesintertem Knochen, porösem Polycaprolacton, Zytokinen, demineralisierter Knochenmatrix, Wachstumsfaktoren, Hormonen, Antibiotika, Anti-entzündlichen Mitteln, Anti-Gerinnungsmitteln, Proteinen, Stammzellen, Plasma, Knochenmarks-Aspirat, monoklonalen Antikörpern, Immunglobulinen, Fusionsproteinen, Zellen, subzellulären Fraktionen, Geweben, Vollblut, Enzymen, DNA, cDNA, Gentherapie-Vektoren, Nukleinsäure-Inhibitoren, chemotherapeutischen Mitteln und Kombinationen davon.
Implantat für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen, wobei das Implantat eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-17 umfasst.
Implantat nach Anspruch 18, das ferner ein biokompatibles Gerüst umfasst, wobei die Zusammensetzung in dem Gerüst eingebettet ist.
Implantat nach Anspruch 19, wobei das biokompatible Gerüst ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kollagenschwamm, Fibrin-Gel, Polycaprolacton, Polylactid, Poly(lactid-coglycolsäure) und Polyglycolsäure.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-17 zur Verwendung in einem Verfahren für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen in einem Subjekt, das dies benötigt, bei dem man: (a) die Zusammensetzung bereitstellt; und (b) die Zusammensetzung an einer Implantationsstelle in das Subjekt implantiert, die einen Knochendefekt oder einen Gewebeschaden aufweist.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 21, wobei der Knochendefekt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Schädeldach-Defekten, osteochondralen Defekten, gebrochene Wirbel, intervertebrale oder posterolaterale Spinalfusion, Kieferkamm-Verstärkung, Wiederherstellung der Extraktionsalveole, Reparatur von Defekten des Beckenkamms.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 21, wobei man beim Implantieren die Zusammensetzung so ausformt, dass sie in den Knochendefekt passt, um eine genaue Schnittstelle mit unbeschädigtem Knochen zu bilden, der an den Knochendefekt grenzt.
Zusammensetzung zur Verwendung nach Anspruch 21, wobei man beim Bereitstellen (a) eine Spritze bereitstellt, die ein Reservoir aufweist, das mit der Zusammensetzung beladen ist, und wobei man beim Implantieren (b) die Zusammensetzung aus der Spritze an der Implantationsstelle verteilt.
Kit für die Regeneration von Gewebe und/oder Knochen in einem Subjekt, dass dies benötigt, wobei der Kit folgendes umfasst: eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-17; und Instruktionen für die Implantation derselben in ein Subjekt an einer Implantationsstelle, die einen Knochendefekt oder einen Gewebeschaden aufweist.
Kit nach Anspruch 25, wobei der Kit ferner eine Spritze, die ein Reservoir aufweist, welches mit der Zusammensetzung beladen ist, für die Verteilung in der Implantationsstelle umfasst.
Kit nach Anspruch 25, der ferner einen biokompatiblen Netzbehälter umfasst, wobei die Zusammensetzung in dem Container für die Implantation in das Subjekt eingeschlossen ist.
Kit nach Anspruch 25, der ferner ein biokompatibles Gerüst enthält, wobei die Zusammensetzung in dem biokompatiblen Gerüst für die Implantation in das Subjekt eingebettet ist.