DE69115934T2

DE69115934T2 - Synthetische knochenbildungsschicht

Info

Publication number: DE69115934T2
Application number: DE69115934T
Authority: DE
Inventors: Tarrant Berlowitz; Thangavel Kuberasampath
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1990-05-29
Filing date: 1991-05-22
Publication date: 1996-05-23
Anticipated expiration: 2011-05-23
Also published as: ES2081484T3; ATE132043T1; US20020151985A1; AU639574B2; AU7961491A; US6468308B1; GR3019339T3; DE69115934D1; JPH06505642A; CA2082946C; US6077988A; JP2679409B2; US5645591A; EP0608211A4; WO1991018558A1; DK0608211T3; EP0608211A1; US6605117B2; EP0608211B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft osteogene Vorrichtungen und insbesondere künstliche Implantate, welche die Osteogenese in vivo induzieren. Die Erfindung betrifft im besonderen biokompatible, bioresorbierbare synthetische Matrices, welche die enchondrale Knochenbildung in vivo fördern.
Die potentielle Brauchbarkeit osteogener Vorrichtungen, die befähigt sind, die enchondrale Knochenbildung in vivo zu induzieren, ist in weitem Umfang anerkannt. Dabei wird erwartet, daß die Verfügbarkeit einer derartigen Vorrichtung die orthopädische Medizin, bestimmte Arten der plastischen Chirurgie sowie verschiedene Verfahren zur periodontalen und kraniofazialen Rekonstruktion revolutionieren würden.
Die Entwicklungskaskade der Knochendifferenzierung im Knochengewebe von Säugern ist auf diesem Gebiet gut dokumentiert (Reddi, Collagen Rel. Res. 1 (1981) 209-226). Obgleich die genauen Mechanismen, auf denen die phänotypischen Umwandlungen beruhen, unklar sind, wurde gezeigt, daß die natürliche enchondrale Knochendifferenzierungsaktivität der Knochenmatrix unter Abtrennung extrahiert und mit einer inaktiven Restkollagenmatrix unter Wiedererhalt der vollen Aktivität bei der Induktion der Knochenbildung wiederhergestellt werden kann (Sampath et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 7599-7603).
Es ist bekannt, daß das Knochengewebe von Säugern einen oder mehrere aktive Faktoren enthält, die Proteinmaterialien darstellen und befähigt sind, die Entwicklungskaskade der zellulären Ereignisse, die in der enchondralen Knochenbildung resultieren, zu induzieren. Dieser aktive Faktor wurde in der Literatur verschiedentlich als knochenmorphogenetisches oder morphogenes Protein, als Knocheninduktionsprotein, als osteogenes Protein, Osteogenin oder osteoinduktives Protein bezeichnet.
In jüngster Zeit wurden die als osteogenes Protein (OP) bezeichneten Proteinfaktoren, die für die Induktion der Osteogenese verantwortlich sind, gereinigt und in rekombinanten Wirtszellen exprimiert, wobei gezeigt wurde, daß sie tatsächlich osteomduktiv wirken, wenn sie in geeigneter Weise auf einer Matrix sorbiert sind (US-Patent 4 968 590, veröffentlicht am 6. November 1990).
Aus Untersuchungen ergab sich, daß, während die osteoinduktiven Proteine speciesunabhängig aktiv sind, die bisher zur Induktion der enchondralen Knochenbildung erforderliche Kollagen-Knochenmatrix speciesspezifisch ist (Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6591-6594). Implantate aus entmineralisierter, extrahierter xenogener Knochenmatrix und OP führten stets zu einer starken entzündlichen Reaktion, welche die Osteogenese unterdrückte, wahrscheinlich aufgrund immunogener Proteinkomponenten in der Knochenmatrix. Daher unterliegt die Induktion der Knochenbildung, bei der die Verwendung einer allogenen Knochenmatrix erforderlich ist, einer erheblichen Einschränkung hinsichtlich der klinischen Anwendung in der Humanmedizin, da menschliches Knochengewebe weder leicht noch kostengünstig erhältlich ist.
Der derzeitige Stand der Technik bezüglich Materialien, wie sie bei chirurgischen Verfahren verwendet werden, bei denen eine gelenkte Knochenreparatur erforderlich ist, wie etwa bei der Rekontourierung oder beim Auffüllen von Knochendefekten, ist in einer Publikation von Deatherage (J. Oral Maxillofac. Surg. 17 (1988) 359-395) beschrieben. Sämtliche bekannten beschriebenen Implantatmaterialien (Hydroxylapatit, gefriergetrockneter Knochen oder autogene Knochentransplantate) besitzen jedoch nur geringe oder keine osteoinduktiven Eigenschaften. Es ist klar, daß bei den meisten Verfahren die Fähigkeit zur Induktion der Osteogenese gegenüber der Knochenausfüllung bevorzugt ist.
Die Patentschrift US 4 795 467 beschreibt eine Zusammensetzung zur Knochenreparatur, die Calciumphosphatmineralien und Atelopeptid sowie rekonstituiertes, vernetztes Fibrillokollagen enthält. In US 4 563 350 ist eine osteogene Vorrichtung beschrieben, die einen die Knochenbildung induzierenden Extrakt sowie eine Kollagenmatrix enthält, die aus etwa 90 % trypsinbehandelter Rinder-Knochenmatrix und 10 % Hautkollagen vom Rind besteht. In US 4 789 663 ist ferner ein Verfahren zur gelenkten Knochenreparatur durch Ausfüllen beschrieben, bei dem der Knochendefekt mit frischem Knochen in Kontakt gebracht wird, wobei xenogenes Kollagen aus Knochen und/oder Haut verwendet wird, das zur Entfernung von Telopeptiden enzymatisch behandelt und künstlich vernetzt wurde. In EPO 309 241 ist ferner eine Vorrichtung zur Induktion der enchondralen Knochenbildung angegeben, die einen osteogenen Extrakt sowie eine Matrix als Trägermaterial aufweist, die 60 bis 90 % Mineralkomponenten und 2 bis 40 % Kollagen enthält. Von Deatherage et al. (Collagen Rel. Res. 7 (1987) 2225-2231) wurde eine augenscheinlich xenogene implantierbare Vorrichtung beschrieben, die einen Rinder-Knochenmatrixextrakt sowie menschliches Hautkollagen vom Typ I enthält. In der Patentschrift US 4 975 526 (publiziert am 4. Dezember 1990) mit dem Titel "Bone Collagen Matrix for Xenogenic Implants" ist schließlich ein xenogenes Knochenimplantat beschrieben, das aus entmineralisiertem Rinderknochen hergestellt ist und ein osteogenes Protein enthält.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine biokompatible und biologisch abbaubare Knochenmatrix anzugeben, die in Säuger als Wirtsorganismen ohne signifikante inhibierende immunogene Reaktion implantierbar ist. Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine biokompatible und biologisch abbaubare Matrix anzugeben, die zur Induktion der Knochenbildung bei Säugern einschließlich Menschen befähigt ist, wenn sie osteogenes Protein enthält. Eine weitere Aufgabe besteht darin, das gelenkte Knochenwachstum bei Ausfüllung bei Säugern einschließlich Menschen zu fördern. Weitere Aufgaben sind die Angabe eines verbesserten Materials zur Beschichtung von implantierbaren Prothesevorrichtungen und die Förderung des zellulären Einwachsens in derartige Vorrichtungen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung derartiger Matrixmaterialien anzugeben.
Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung und den Zeichnungen sowie den Ansprüchen hervor.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde festgestellt, daß das innerhalb einer porösen, bioresorbierbaren Matrix, die Kollagen und Glykosaminoglykan enthält, dispergiertes osteogenes Protein befähigt ist, die Osteogenese in vivo zu induzieren. Diese Erkenntnis diente zur Entwicklung der hier beschriebenen osteogenen Vorrichtungen, die zu einer Induktion der enchondralen Knochenbildung bei Säuger-Wirtsorganismen führen, wobei die Knochenbildung in einer Form erfolgt, die im wesentlichen der Form der Vorrichtung entspricht. Die Vorrichtungen können ferner auch als Oberflächenbeschichtung für implantierbare Prothesevorrichtungen zur Förderung des zellulären Einwachsens herangezogen werden.
Die poröse Matrix der osteogenen Vorrichtung enthält ein vernetztes Polymer von Kollagen und Glykosaminoglykan. Kollagen stellt eine Haupt-Proteinkomponente des Bindegewebes bei Vertebraten und Invertebraten dar. Kollagen vom Typ I oder vom Typ II oder Gemische dieser Kollagene sind als Matrixmaterialien der osteogenen Vorrichtung bevorzugt. Das Kollagen stellt vorzugsweise etwa 80 bis 95 Gew.-% der Matrix dar.
Glykosaminoglykane (GAGs) sind Mucopolysaccharide tierischen Ursprungs. Sie sind aus Hexosaminresten aufgebaut, die glykosidisch gebunden sind und in einer mehr oder weniger regelmäßigen Weise mit Hexuronsäure- oder Hexoseresten abwechseln. Die GAGs stellen vorzugsweise mindestens etwa 5 Gew.-% und noch bevorzugter etwa 6 bis etwa 15 Gew.-% des Polymers dar. Beispiele für geeignete GAGs sind solche, die Sulfatgruppen enthalten, wie Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6-sulfat, Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparin und Heparansulfat sowie Kombinationen dieser Verbindungen.
Das Kollagen-GAG-Polymer ist vernetzt, um die Löslichkeit und die mechanischen Eigenschaften der Matrix einzustellen. Es wurde festgestellt, daß die Vernetzung der Matrix zu einem Mc-Wert (mittleres Molekulargewicht zwischen den Vernetzungen) von etwa 800 bis etwa 60000 und vorzugsweise einem Mc-Wert von 5000 bis 10000 für die osteogene Vorrichtung am günstigsten ist.
Nach einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Erzielung eines gelenkten Knochenwachstums, bei dem ein lebender Säugerknochen mit der vernetzten Kollagen- GAG-Matrix in Kontakt gebracht wird. Unter gelenktem Knochenwachstum wird das Knochenwachstum von einem lebenden Knochen aus verstanden, bei dem eine Migration von Osteoblasten vom Knochen in den unmittelbar daran angrenzenden Bereich erfolgt. Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das Matrixmaterial als Beschichtung auf einem Implantat vorgesehen, das mit lebendem Knochen in Kontakt gebracht wird. Geeignete Implantate bestehen aus einem inerten Material, wie Keramik, Metalle oder Polymere. Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das gelenkte Knochenwachstum von einem lebenden Säugerknochen durch Inkontaktbringen des Knochens mit einem Matrixmaterial induziert, in dem ein Kleber in einer zur Verfestigung der Matrix bei der Implantation in einen Säugerorganismus oder bei Erwärmen auf 37 ºC ausreichenden Menge dispergiert wurde. Ein geeigneter Kleber ist Methylcellulose. Die Matrix verfestigt sich im wesentlichen in der Form der implantierten Matrix.
Bei einer alternativen Ausführungsform wird das osteogene Protein in der porösen Matrix dispergiert. Das osteogene Protein weist zwei Untereinheiten auf, die unter oxidierenden Bedingungen ein Dimer bilden. Das Protein kann nach Verfahren der DNA-Rekombination hergestellt werden oder einen Extrakt oder ein aus einer natürlichen Quelle gewonnenes, gereinigtes Material darstellen. Nach einem bevorzugten Aspekt besitzt eine der Untereinheiten dieses Proteins eine Aminosäuresequenz, die ein ausreichendes Duplikat der Aminosäuresequenz der nachstehend angegebenen Protein-Untereinheit Opi darstellt, so daß diese Untereinheit, wenn sie unter oxidierenden Bedingungen mit einer zweiten, geeigneten Untereinheit kombiniert wird, die enchondrale Knochenbildung bei Säugern induziert, wenn sie in der dem Säuger implantierten Matrix vorliegt. OPi stellt eine Protein-Untereinheit mit der nachstehend angegebenen Aminosäuresequenz dar:
Wenn OP1 zu einem Homodimer oder mit bestimmten anderen Proteinsequenzen zu einem Heterodimer dimerisiert wird, ist es in der Lage, die enchondrale Knochenbildung zu induzieren.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung der osteogenen Vorrichtung, die das osteogene Protein enthält. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte: Vorsehen einer porösen Matrix, die ein Kollagen-Glykosaminoglykan-Polymer enthält, das zu einem Molekulargewicht Mc zwischen den Vernetzungen von etwa 800 bis etwa 60000 vernetzt ist, und Dispergieren eines osteogenen Proteins in einer zur Induktion der enchondralen Knochenbildung, die bei Implantation in einem Wirtsorganismus im wesentlichen in der Form der Matrix erfolgt, ausreichenden Menge in der Matrix.
Bei der Dispergierung kann das osteogene Protein in einem Lösungsmittel, wie etwa gepufferter Kochsalzlösung oder Acetonitril, dispergiert werden. Wenn unlösliches Kollagen in die Matrix eingebracht werden soll, kann es ebenfalls im Lösungsmittel dispergiert werden. Nach einem Aspekt der Erfindung ist das Lösungsmittel eine angesäuerte wäßrige Lösung, die etwa 30 bis etwa 55 % und vorzugsweise etwa 50 % Acetonitril enthält. Dieser Dispergierschritt kann auch durch Entwässern eines Gemischs, welches das osteogene Protein und Teilchen des Kollagen-GAG-Polymers enthält, erfolgen. Alternativ dazu kann die Dispergierung auch durch Lyophilisierung des Gemischs vorgenommen werden, wobei unter Lyophilisierung die Entwässerung des gefrorenen Materials im Vakuum verstanden wird.
Vor dem Dispergierschritt kann die Matrix mit dem Lösungsmittel, in dem das osteogene Protein dispergiert wurde, voraquilibriert werden. Das Verfahren kann ferner noch die Schritte der Formgebung des Produkts des Dispergierschrittes zu einer Form mit vorgegebenen Abmessungen sowie die Implantation des ausgeformten Produkts in einen Säuger umfassen. Die Implantation der Vorrichtung führt zur Induktion der Bildung von enchondralem Knochen, der im wesentlichen die Form des implantierten Formkörpers aufweist.
Die Erfindung ist schließlich bei Verfahren zur Induktion von enchondralem Knochenwachstum bei Säugern anwendbar, bei dem das poröse Matrixmaterial, welches das dispergierte osteogene Protein der oben beschriebenen Art enthält, entweder chirurgisch oder auf andere Weise an einer Stelle implantiert wird, an der Knochenbildung erwünscht ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die oben angegebenen sowie weitere Aufgaben der Erfindung und ihre verschiedenen Merkmale sowie die Erfindung selbst werden aus der nachstehenden Beschreibung unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen noch besser verständlich; es zeigen:
Fig. 1: ein Mikrophoto eines Kollagen-GAG-Implantats ohne osteogenes Protein, aus dem die Infiltration von lediglich Mesenchymzellen hervorgeht, und
Fig. 2: ein Mikrophoto einer Kollagen-GAG-Matrix, die osteogenes Protein enthält, wobei das Vorliegen von Osteoblasten (Pfeile), die Knochenbildung sowie das Einwachsen von Gefäßen erkennbar sind.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung gibt eine osteogene Vorrichtung an, die befähigt ist, bei Implantation in einen Säugerorganismus die De-Novo-Osteogenese zu induzieren. Die hier nachvollziehbar beschriebene Vorrichtung gestattet es dem Arzt, eine optimale, vorhersagbare Knochenbildung beispielsweise zur Korrektur erworbener oder ererbter kraniofazialer und anderer Anomalien des Skeletts oder der Zähne zu erzielen (Glowacki et al., Lancet 1 (1981) 959- 963). Die Vorrichtungen können zur Induktion einer lokalen enchondralen Knochenbildung bei Knochenbrüchen mit Spalt oder anderen klinischen Anwendungen einschließlich periodontalen Anwendungen verwendet werden, bei denen Knochenbildung erforderlich ist. Beispiele für andere mögliche klinische Anwendungen sind etwa in der Chirurgie die Vergrößerung von Konturen, die Wirbelsäulenversteifung und die orthopädische Rekonstruktion.
Die zur Induktion des De-novo-Knochenwachstums geeignete osteogene Vorrichtung enthält osteogenes Protein, das in einer vernetzten Matrix von Kollagen und GAG-Polymeren dispergiert ist. Das osteogene Protein kann unter Anwendung der in der Patentschrift US 4 975 526 (Titel: "Osteogenic Protein"), der PCT-Anmeldung US 89/01469 (Nr. 89/09788) (Titel: "Biosynthetic osteogenic Proteins and Osteogenic Devices Containing Them") und der PCT-Anmeldung Nr. US 89/01453 (Nr. 89/09787) (Titel: "Osteogenic Devices") angegebenen Verfahren hergestellt werden. Die beiden PCT-Anmeldungen wurden am 7. April 1989 angemeldet. Alternativ dazu können zur Herstellung der Vorrichtungen geeignete Extrakte, die reich an osteogenem Protein sind, gemäß dem Patent US 4 294 753 (Erfinder Urist) erhalten werden. Auf die in diesen Druckschriften enthaltene Offenbarung wird hier Bezug genommen. Alternativ dazu können beliebige andere Proteine mit osteogener Aktivität bei Säugern Verwendung finden. Darüber hinaus ist es für gentechnische Fachleute möglich, Gene aus cDNA oder Genbibliotheken zu isolieren, die geeignete Aminosäuresequenzen codieren, oder DNAs aus Oligonucleotiden aufzubauen und diese dann in verschiedenen Arten von Wirtszellen zu exprimieren, zu denen sowohl Prokaryonten als auch Eukaryonten gehören, um so große Mengen von aktiven Proteinen zu erzeugen, die zur Induktion der Knochenbildung bei Säugern einschließlich Menschen befähigt sind.
Das Matrixmaterial besteht aus Kollagen-Polymeren und Glykosaminoglykanen. Es kann im wesentlichen nach Yannas et al., Patente US 4 280 954 und 4 448 718, hergestellt werden, wobei auf die Lehre dieser Dokumente Bezug genommen wird. Alternativ kann das poröse GAG-Kollagen-Matrixmaterial auch im Handel erhalten werden. So sind beispielsweise poröse Mikroträger aus einem vernetzten Kollagen-GAG-Copolymer, die zur In-vitro-Verwendung vorgesehen sind (Informatrix ) von der Biomat Corporation (Belmont, MA) erhältlich. Dieses Material wurde ursprünglich zur Anwendung für medizinische Wundverbände entwickelt und enthält aus Rinderhaut extrahiertes Kollagen und 8 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat. Andere GAG-Species, wie Heparin oder Hyaluronsäure, können in üblicher Weise eingebracht werden.
Kurz zusammengefaßt stellt Kollagen einen Hauptproteinbestandteil des Bindegewebes dar und wird in weitem Umfang für verschiedene medizinische und chirurgische Anwendungen, wie bei der chirurgischen Prothetik und der Herstellung von Implantaten, eingesetzt. Dieses Protein wird aufgrund seiner proteolytischen Abbaubarkeit durch Kollagenasen, die sich an der Implantationsstelle befinden, leicht resorbiert. Es kann in Form makroskopischer Fasern vorliegen, die chemisch und mechanisch von den Nichtkollagen-Komponenten des Gewebes getrennt werden können. Zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung eignet sich Kollagen aus beliebigen Quellen, einschließlich von unlöslichem Kollagen, säurelöslichem Kollagen, in neutralen oder basischen wäßrigen Lösungen löslichem Kollagen sowie solcher Kollagene, die im Handel erhältlich sind. Typische tierische Quellen hierfür sind z.B. Kalbshaut, Achillessehnen vom Rind, Rinderknochen sowie Sehnen aus Rattenschwänzen.
Glykosaminoglykane (GAGs) oder Mucopolysaccharide sind hexosaminhaltige Polysaccharide tierischen Ursprungs. Chemisch bestehen GAGs aus glykosidisch gebundenen Hexosaminresten, die in einer mehr oder weniger regelmäßigen Weise mit Hexuronsäureresten oder Hexoseresten abwechseln (vgl. z. B. Dodgson et al. in der Monographie "Carbohydrate Metabolism and its Disorders" (Hrsg. Dickens et al.), Band 1, Academic Press (1968) ). Beispiele für geeignete GAGs sind Hyaluronsäure, Heparin, Heparansulfat, Chondroitin-6-sulfat, Chondroitin-4-sulfat, Dermatansulfat und Keratansulfat. Auch andere GAGs sind zur Herstellung der hier beschriebenen Matrix geeignet, wobei der Fachmann entweder weiß oder befähigt ist, wie andere geeignete GAGs ausfindig gemacht werden können, ohne daß hierzu mehr als Routineexperimente erforderlich wären. Hinsichtlich einer detaillierteren Beschreibung von Mucopolysacchariden wird auf die Monographie von Aspinall "Polysaccharides", Pergamon Press, Oxford (1970) verwiesen.
Kollagen kann in wäßrigen sauren Lösungen mit GAG umgesetzt werden. Diese Reaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Typischerweise werden kleine Mengen Kollagen, etwa 0,3 Gew.-%, in einer verdünnten Essigsäurelösung dispergiert und kräftig gerührt. Dann wird das GAG langsam, beispielsweise tropfenweise, zu der wäßrigen Kollagendispersion zugegeben, wodurch es zu einer Kopräzipitation von Kollagen mit GAG kommt. Das Kopräzipitat stellt eine verfilzte Masse von mit GAG beschichteten Kollagenfibrillen dar. Diese verknäuelte Masse von Fasern kann zu einer homogenen Dispersion feiner Fasern homogenisiert werden, die dann abfiltriert und getrocknet werden können. Hinsichtlich der Bedingungen wurde festgestellt, daß bei einem ph-Wert von etwa 3 und einer Temperatur von etwa 37 ºC eine maximale Bindung der GAGs an Kollagen ohne nennenswerte teilweise Denaturierung (Gelatinisierung) erfolgt. Obgleich diese Bedingungen bevorzugt sind, eignen sich auch andere Reaktionsbedingungen, die zu einer signifikanten Reaktion zwischen Kollagen und einem Mucopolysaccharid führen.
Während das oben beschriebene Kopräzipitationsverfahren bevorzugt ist, können Kollagen und GAGs auch in anderer Weise miteinander umgesetzt werden. Die wesentliche Bedingung hierbei ist, daß die beiden Materialien unter Bedingungen miteinander in innigen Kontakt kommen, die eine Bindung der GAGs an den Kollagenketten erlauben. Ein anderes geeignetes Verfahren besteht in der Beschichtung von Kollagen mit GAGs, die etwa durch Eintauchen von aus Kollagen hergestellten Formkörpern in eine GAG-Lösung erfolgen kann. Eine geeignete Abwandlung des letztgenannten Verfahrens besteht darin, daß zunächst ein Formkörper, eine Platte, ein Film oder ein Schlauch aus einem Nichtkollagen-Material, wie etwa einem synthetischen, natürlichen oder modifizierten natürlichen Polymer, mit Kollagen beschichtet werden, worauf die entsprechenden, mit Kollagen beschichteten Gegenstände in die GAG-Lösung eingetaucht werden. Ein weiteres geeignetes Verfahren besteht darin, Kollagen innig mit GAG zu mischen, wobei jede Komponente in Form eines trockenen Pulvers vorliegt.
Es ist klar, daß das wie oben beschrieben hergestellte Kollagen-GAG-Produkt zur Endanwendung in die Form von Platten, Filmen, Schläuchen oder anderen Formkörpern oder von Teilchen gebracht werden kann.
Zur Erzielung einer signifikanten Erhöhung der Beständigkeit gegen Kollagenresorption ist es erforderlich, daß mindestens etwa 0,5 Gew.-% GAG an den Kollagenketten gebunden ist. Die Obergrenze kann durch die Stellen am Kollagen vorgegeben sein, die zur Bindung von GAG verfügbar sind. Für Compositmaterialien, bei denen das GAG Chondroitin-6-sulfat ist, wurden Gehalte von etwa 28 Gew.-% erzielt; mit Hyaluronsäure beträgt die erzielte Obergrenze andererseits etwa 25 %.
Durch die Umsetzung mit den GAGs erhält das Kollagen auch noch eine andere wertvolle Eigenschaft, nämlich die Eigenschaft, keine Immunreaktion (Fremdmaterialreaktion) bei einem Wirtsorganismus hervorzurufen. Zur Umwandlung von Kollagen in ein Material, das nach der Implantation nicht als Fremdmaterial erkannt wird, ist es erforderlich, es mit mindestens etwa 1 Gew.-% GAG umzusetzen.
Die Unlöslichkeit der Kollagen-GAG-Produkte kann durch kovalente Vernetzung dieser Materialien auf den gewünschten Wert erhöht werden. Allgemein eignen sich zur Vernetzung von Kollagen geeignete Verfahren zur kovalenten Vernetzung auch zur Vernetzung dieser Compositmaterialien. Eine derartige kovalente Vernetzung dient zur Verhinderung der Auflösung des Mucopolysaccharids in wäßrigen Lösungen, wodurch die Materialien für chirurgische Prothesen, etc., geeignet gemacht werden.
Die kovalente Vernetzung dient ferner auch zur Erhöhung der Resorptionsbeständigkeit dieser Materialien. Die genaue Funktion der Vernetzung wird in dieser Hinsicht nicht verstanden, jedoch ist es möglich, daß durch die Vernetzung die GAG-Einheiten an Stellen auf den Kollagenketten verankert werden, die normalerweise durch Kollagenase angegriffen werden. Eine weitere mögliche Erklärung besteht darin, daß das Netzwerk der Kollagenfasern durch die Vernetzung so abgedichtet wird, daß das Eindiffundieren von zum Kollagenabbau befähigten Enzymen physikalisch ausgeschlossen wird.
Es wurde festgestellt, daß die vernetzten Compositmaterialien ein Molekulargewicht Mc von etwa 800 bis etwa 60000 haben sollten. Materialien mit Mc-Werten unterhalb von etwa 800 oder oberhalb von etwa 60000 zeigen signifikant verschlechterte mechanische Eigenschaften. Compositmaterialien mit einem Mc-Wert von etwa 5000 bis etwa 10000 scheinen gut ausgeglichene mechanische Eigenschaften aufzuweisen, so daß dieser Bereich der Vernetzung für Produkte, bei denen derartige ausgeglichene Eigenschaften verlangt sind, bevorzugt sind.
Die kovalente Vernetzung kann nach zahlreichen speziellen Verfahren vorgenommen werden, die in die allgemeinen Kategorien der chemischen Vernetzung, der Strahlungsvernetzung und der Vernetzung durch thermische Dehydratisierung einzuordnen sind. Ein Vorteil der meisten in Betracht gezogenen Vernetzungsverfahren, einschließlich der Vernetzung mit Glutaraldehyd und der Vernetzung durch thermische Dehydratisierung, besteht darin, daß sie auch dazu dienen, Bakterienwachstum auf den Materialien zu verhindern. Auf diese Weise werden die Compositmaterialien bei der Vernetzung gleichzeitig sterilisiert.
Ein geeignetes chemisches Verfahren zur kovalenten Vernetzung von Kollagen-GAG-Compositmaterialien ist als Aldehydvernetzung bekannt. Bei diesem Verfahren werden die Matenahen mit wäßrigen Lösungen von Aldehyden in Kontakt gebracht, die zur Vernetzung der Materialien dienen. Beispiele für geeignete Aldehyde sind Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal. Der bevorzugte Aldehyd ist Glutaraldehyd, da er den gewünschten Wert der Vernetzungsdichte rascher als andere Aldehyde zu erzielen erlaubt und auch befähigt ist, relativ hohe Werte der Vernetzungsdichte zu liefern. Das Eintauchen der Compositmaterialien in Aldehydlösungen führt zu einer teilweisen Entfernung der Polysaccharidkomponente durch Auflösung, wodurch die Menge des Polysaccharids im Endprodukt verringert wird. Nicht umgesetzter Aldehyd sollte von den Kollagen-GAG-Materialien abgetrennt werden, da Restmengen an Aldehyden sehr toxisch sind.
Beispiele für andere geeignete chemische Verfahren sind die Carbodiimidkupplung, die Azidkuppid und die Diisocyanatvernetzung.
Ein bevorzugtes Vernetzungsverfahren wird als thermische Dehydratisierung bezeichnet. Bei der Vernetzung durch thermische Dehydratisierung ist es nicht erforderlich, zusätzliche Vernetzungsmittel zuzugeben. Der Schlüsselaspekt bei diesem Verfahren besteht in der Entwässerung des zu vernetzenden Produkts auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als etwa 1 %. Die Menge an Wasser, die abgetrennt werden muß, variiert in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren, jedoch muß allgemein eine ausreichende Wassermenge abgetrennt werden, um die gewünschte Vernetzungsdichte zu erzielen. So kann das Kollagen-GAG-Produkt höheren Temperaturen und/oder Vakuumbedingungen unterworfen werden, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf extrem niedere Werte verringert ist. Wenn kein Vakuum angewandt wird, können Temperaturen von mehr als etwa 80 ºC und vorzugsweise über 90 ºC angewandt werden. Bei 23 ºC ist ein Vakuum von mindestens etwa 10&supmin;&sup5; mm Hg und vorzugsweise von weniger als 10&supmin;&sup6; mm Hg günstig. Erhöhte Temperatur und Vakuum können auch in Kombination angewandt werden; dies ist auch der schnellste Weg und daher bevorzugt. Bei einem Vakuum von mindestens etwa 10&supmin;&sup5; mm Hg ist es bevorzugt, eine Temperatur von mindestens etwa 35 ºC anzuwenden. Die Materialien werden allgemein den Bedingungen von erhöhter Temperatur und Vakuum ausgesetzt, bis der gewünschte Grad der Unlöslichkeit erhalten wird. Je höher die Temperatur, desto geringer ist das zur Erzielung einer gegebenen Vernetzungsdichte erforderliche Vakuum, und umgekehrt. Ein typisches Vernetzungsverfahren zur Erzielung eines Molekulargewichts M von etwa 5000 bis 10000 besteht darin, das Kollagen-GAG-Material einer Temperatur von 95 ºC und einem Vakuum von 0,01 mm Hg während 24 h auszusetzen. Dieses Verfahren der Vernetzung durch thermische Dehydratisierung vermeidet bestimmte Nachteile der Aldehydvernetzung und liefert Compositmaterialien, bei denen relativ große Mengen GAG fest an den Kollagenketten gebunden sind.
Optimale mechanische Eigenschaften werden für reine Kollagenmaterialien erzielt, deren Mc-Wert, der das mittlere Molekulargewicht zwischen den Vernetzungen angibt, zwischen 5000 und 10000 liegt. Bestimmte Kollagen-GAG-Compositmatenahen, die nach dem Verfahren der Vernetzung durch thermische Dehydratisierung hergestellt wurden, weisen sehr gute Bruchdehnung, Festigkeit und Zähigkeit im Vergleich mit Kollagen mit ähnlichen Mc-Werten auf.
Im Hinblick auf die Resorptionsbeständigkeit, das Nichtvorliegen von Fremdmaterialreaktionen, die mechanischen Eigenschaften und die Blutverträglichkeit sollten vernetzte Compositmaterialien mindestens etwa 0,5 % gebundenes GAG enthalten. Compositmaterialien, die etwa 6 bis etwa 15 % eines sulfathaltigen GAG's enthalten, sind aufgrund ihrer hervorragenden Eigenschaften, wozu auch die Blutverträglichkeit gehört, besonders bevorzugt. Der hier angegebene prozentuale Anteil an GAG ist der Anteil, der erhalten wird, wenn die Messung unmittelbar nach der Vernetzung vorgenommen wird. Durch gründliches Waschen kann nicht kovalent gebundenes GAG entfernt werden.
In trockenem Zustand enthalten die im Handel erhältlichen porösen Mikroträger etwa 5 g Kollagen pro Liter Innenvolumen der Kügelchen. Sie zeigen eine Schrumpfung von etwa 20 Volum-% nach Hydratation und Suspendieren in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). 1 g hydratisierte Mikroträger in PBS nehmen nach Absitzenlassen ein Bettvolumen von etwa 250 ml ein. Das Material besteht zu etwa 99,5 % aus Hohlräumen. Aufgrund dieses Umstands kann dieses Material sehr wirkungsvoll ausgenützt werden im Hinblick auf die mögliche Zellmasse, die pro Gramm Mikroträger wachsen gelassen werden kann.
Die Teilchen sind im wesentlichen kugelförmig und besitzen einen Durchmesser von etwa 500 um. Die Rasterelektronenmikroskopie ergibt Poren von etwa 20 um auf der Oberfläche und 40 um im Inneren. Das Innere besteht aus faserigen und blattförmigen Strukturen, die Oberflächen zur Zellverankerung darstellen. Da die Hohlräume miteinander verbunden sind, wird hierdurch ein Zugang zu den Zellen über das gesamte Innere der Teilchen ermöglicht.
Wenn die Mikroträger in PBS oder Kulturmedium suspendiert werden, bleiben sie nahezu neutral in der Schwebe. Kleine Mengen an eingeschlossener Luft oder Veränderungen bei der Temperatur der Lösung genügen, um die Teilchen aufschwimmen oder absinken zu lassen. Das kugelförmige Kollagen-GAG-Material wird in 70%igem Ethanol ausgefällt, um die Luft in den Kügelchen durch eine Flüssigkeit zu ersetzen. Das Ethanol wird dann durch gepufferte Kochsalzlösung oder 30- bis 55%iges, mit Trifluoressigsäure (TFA) oder anderen Säuren angesäuertes Acetonitril ersetzt. Acetonitril (ACN) ist ein organisches Lösungsmittel, mit dem Proteine ohne Beeinträchtigung ihrer Primärstruktur denaturiert werden können. Acrylnitril stellt ein übliches Reagens bei der Hochleistungsflüssigchromatographie dar und wird zur Elution von Proteinen aus Säulen auf der Basis von Kieselsäure durch Störung der hydrophoben Wechselwirkungen verwendet.
Wenn das Matrixmaterial das osteogene Protein enthalten soll, wird das Protein entweder zu mit Tris gepufferter Kochsalzlösung (TBS) oder Acetonitril/TFA zugegeben und dann dem im gleichen Puffer voräquilibrierten Kollagen-GAG- Material hinzugefügt. Das Gemisch wird dann bei 4 ºC inkubiert und danach lyophilisiert. Dieses Matrixmaterial kann durch Zusatz von unlöslichem Rinderkollagen schwerer gemacht werden. Das resultierende Matrixmaterial stellt ein feines, wasserunlösliches Pulver dar, dessen Teilchen nicht aneinander haften.
Das Matrixmaterial besitzt vorzugsweise die in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführten Eigenschaften. Tabelle 1 Rasterelektronenmikroskopie Porengröße Teilchengröße Löcher Quecksilber-Porosimetrie-Daten Porenvolumen Rohdichte Reindichte spezifische Oberfläche Porenoberfläche Porendurchmesser
Bei der praktischen Anwendung der Erfindung muß die Matrix, beispielsweise chirurgisch, implantiert werden, um so bei verschiedenen orthopädischen, periodontalen und rekonstruktiven Verfahren als Modell für die Knochenbildung zu dienen, oder die Matrix wird in Form einer Kollagenbeschichtung für Implantate verwendet. Die Matrix kann vor dem chirurgischen Eingriff in die gewünschte Form gebracht oder während der Operation durch den Arzt oder einen Techniker geformt werden. Das Material kann ferner auch in eine Stelle injiziert werden, an der Knochenwachstum gewünscht wird.
Alternativ dazu kann das Material als Beschichtung auf ein prothetisches Implantat aufgebracht oder darauf absorbiert werden, um die Haftung des Implantats am Knochen zu verbessern. Geeignete Implantate bestehen aus inerten Materialien, wie Keramik, Metallen, wie Titan, Cadmium, Nickel oder Cobalt, oder aus Polymeren, wie Poly(glykolsäure) oder Poly (milchsäure). Nach Zusatz eines wärmeaktivierbaren Klebers, wie Methylcellulose, verfestigt sich das Material nach der Implantation oder bei Erwärmung auf 37 ºC.
Das Material kann entsprechend für subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Implantate verwendet werden; das Material kann so geformt werden, daß es eine Fraktur mit Spalt überbrückt oder einen Knochendefekt ausfüllt. Das Material fördert die Zellmotilität, die zellulären biosynthetischen Funktionen und die Zellteilung. Daher können Osteoblasten dazu veranlaßt werden, von dem lebenden Knochen in das Material einzuwandern. Darüber hinaus besitzt das vernetzte Kollagen-GAG-Material eine negative Oberflächenladung, wodurch die Zellanheftung gefördert wird. Ferner synthetisieren Osteoblasten Fibronectin, also ein zelluläres Haftungsprotein, das Kollagen bindet, wodurch die Fähigkeit der wandernden Osteoblasten zur Haftung am Implantat erhöht wird.
Bei den Verfahren zur Knochenbildung wird das Matrixmaterial langsam vom Körper absorbiert und in einer Form durch Knochen ersetzt, die der Form des Implantats entspricht oder ihr sehr nahe kommt. Das Matrixmaterial kann ferner auch zur Induktion der Knochenbildung sowie als Träger mit verzögerter Freisetzung verwendet werden.
Die osteogene Vorrichtung kann einen formbeständigen Feststoff aus einem teilchenförmigen Material darstellen, dessen Teilchen lose aneinander haften. Sie kann auch einen durch Formgebung hergestellten porösen Feststoff oder einfach eine Aggregation dicht gepackter Teilchen darstellen, die durch das umgebende Gewebe an ihrem Ort gehalten werden. Durch Zusatz von unlöslichem Kollagen oder inerten Polymeren zu den Teilchen aus Kollagen, GAG und osteogenem Protein kann die Dichte der Vorrichtung erhöht werden. Darüber hinaus können ein Kleber oder ein Verfestigungsmittel, wozu Methylcellulose gehört (z. B. Methocel, Dow Chemical Co.), zugegeben werden. Es ist bevorzugt, die Matrix so zu formen, daß sie der gewünschten Form des neuen Knochens entspricht, oder sie mit solchen Abmessungen vorzusehen, daß Knochendefekte mit Spalt überbrückt werden.
Die Funktionsweise der nach einem der oben angegebenen Verfahren hergestellten verschiedenen Matrices kann durch ein In-vivo-Bioassay an der Ratte ermittelt werden, wie es in den oben angegebenen Patentanmeldungen beschrieben ist. Kurz zusammengefaßt wird dabei das lyophilisierte Matriximplantat in eine subkutane Wunde eingebracht, die dann mit Metallklammern verschlossen wird. Die Implantate werden der Ratte am 12. Tag nach der Implantation wieder entnommen und histologisch auf nachweisbare Knochenbildung geprüft. Fig. 1 erweist, daß bei einem Kollagen-GAG-Implantat lediglich Mesenchymzellen im Implantatbereich vorliegen, während Fig. 2 im Ergebnis die Entwicklung von enchondralem Knochen in einem Implantat zeigt, das osteogenes Protein enthält. Eine Implantation während 12 Tagen ist üblicherweise ausreichend, um zu ermitteln, ob die Implantate neu induzierten Knochen enthalten.
Die Aktivität der alkalischen Posphatase kann als Marker für die Osteogenese herangezogen werden (Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 69 (1972) 1601-1605). Die Enzymaktivität kann nach der Homogenisierung des Implantats spektrophotometrisch bestimmt werden. Die Aktivität zeigt dabei in vivo nach 9 bis 10 Tagen Maximalwerte und fällt danach langsam ab. Implantate, die aufgrund histologischer Untersuchung keine Knochenentwicklung zeigen, weisen unter diesen Testbedingungen nur geringe oder keine Aktivität der alkalischen Phosphatase auf. Der Test ist zur Quantifizierung sowie zum raschen Erhalt eines Schätzwerts für die Knochenbildung nach Entnahme der Implantate aus dem Rattenkörper geeignet.
Alternativ kann die Menge an gebildetem Knochen auch durch Messung des Calciumgehalts des Implantats bestimmt werden.
Derartige Untersuchungen ergaben, daß die Kollagen-GAG- Teilchen in vivo nach 12 Tagen noch vorliegen. Wie aus Fig. 1 und Tabelle 2 hervorgeht, führten Vergleichsmatrices ohne osteogenes Protein in vivo nicht zu einer Induktion von Knochenwachstum; allerdings lagen einige durch die Matrix hervorgerufene Mesenchymzellen vor. Im Vergleich dazu führten Kollagen-GAG-Matrices bei Formulierung mit Präparationen von osteogenem Protein entweder in TBS oder in Acetonitril/TFA zu einer Induktion der Knochendifferenzierung nach Implantation, wie aus Fig. 2 und Tabelle 2 hervorgeht. Tabelle 2 Formulierung, Verfahren (+) Wachstum/Anzahl der Proben Knochenwachstum Acetonitril/TFA Tris-gepufferte Kochsalzlösung
Erfolgreiche Implantate zeigen ein kontrolliertes Fortschreiten durch die Stadien der matrixinduzierten enchondralen Knochenentwicklung über folgende Stadien:
(1) Vorübergehende Infiltration durch polymorphkernige Leukocyten am ersten Tag;
(2) Migration von Mesenchymzellen und Zellvermehrung am zweiten und dritten Tag;
(3) Auftreten von Chondrocyten am fünften und sechsten Tag;
(4) Knorpelmatrixbildung am siebten Tag;
(5) Verkalkung des Knorpels am achten Tag;
(6) Gefäßinvasion, Auftreten von Osteoblasten und Bildung von neuem Knochen am neunten und zehnten Tag (vgl. Fig. 2).
Wenn das Implantat mehr als 12 Tage im Körper belassen wird, treten eine Remodellierung durch entsprechendes Auftreten von Osteoblasten und Knochen sowie eine Auflösung der implantierten Matrix am 12. bis 18. Tag auf; hämatopoetische Knochenmarksdifferenzierung tritt im entsprechenden Ossiculum am 21. Tag auf. Die Ergebnisse zeigen, daß die Form des neu gebildeten Knochens im wesentlichen mit der Form der implantierten Matrix übereinstimmt.
Das Kollagen-GAG-Material wird resorbiert und macht dabei Platz für neu gebildeten Knochen, der den entsprechenden Raum einnimmt. Die Größe des gebildeten Knochens entspricht dabei der Größe des hergestellten Implantats. Ein Implantat wird als positiv betrachtet, wenn das Material an einer Stelle lokalisiert ist. Unterschiedliches Ansprechen auf Implantate wird durch Schwierigkeiten bei der Implantation aufgrund der geringen Dichte des als Prototyp verwendeten Matrixmaterials und die schwierige Lokalisation an einer subkutanen Stelle erklärt.
Einzelheiten zur Art der Herstellung und zur Anwendung der erfindungsgemäßen Materialien werden im folgenden beschrieben.

Beispiele

A. Herstellung einer Kollagen-GAG-Matrix

Das vernetzte Kollagen-GAG-Material wird nach den vorveröffentlichten Verfahrensschritten nach Yannas (Patent US 4 350 629) hergestellt. Kurz zusammengefaßt umfaßt dieses Verfahren die nachstehend angegebenen Schritte:
1. Herstellung des Kollagens
Rinderkollagen wird nach den Verfahren von Komanowsky et al. (J. Amer. Leather Chemists Assn. 69 (1974) 410-422) hergestellt. 0,55 g gefriergetrocknetes Kollagen werden in einer Wiley-Mühle (A. H. Thomas Co., Philadelphia, PA, USA) auf eine Teilchengröße von 60 mesh (Siebmaschenweite 0,249 mm) gemahlen. Dann werden 200 ml 0,05 M wäßrige Essigsäure zugegeben. Die erhaltene Lösung wird 60 min in einer mit Eiskühlmantel versehenen Mischeinrichtung (Eberbach Corp., Ann Arbor, MI, USA) mit Antrieb mit zwei Geschwindigkeiten (Waring Co., Hartford, CT, USA), der bei Verringerung der anliegenden Spannung auf 60 V mit der hohen Geschwindigkeit betrieben wurde, gerührt. Nach diesem Mischschritt wird die Lösung in ein dicht verschlossenes Glasgefäß gegeben, worin das Kollagen 72 h bei 4 ºC quellen gelassen wird.
2. Herstellung von Kollagen-chondroitin-6-sulfat- Kopräzipitaten
In einer Menge von 0,3 % (G/V) in 0,05 M Essigsäure dispergiertes Kollagen wird bei 23 ºC mit einem PTFE-Rührer gründlich gerührt. Beim Mischen der Dispersion wird Chondroitin-6-sulfat in 0,05 M Essigsäure von pH 3,2 aus einer Bürette tropfenweise in einer Geschwindigkeit von etwa 0,1 ml/s in einer Menge von 1 % (G/V) zugegeben. Der Zusatz des Chondroitin-6-sulfats führt zu einer Kopräzipitation mit Kollagen, wobei sich eine verfilzte Masse von Kollagenfibrillen bildet, die mit GAG beschichtet sind. Nach Kopräzipitation von 90 Gew.-% des Kollagens in dieser Weise mit 10 Gew.-% Chondroitin-6-sulfat ergibt eine systematische Massenbilanz, daß etwa 95 % des zugesetzten Chondroitin-6-sulfats kopräzipitiert sind.
Nach der Kopräzipitation wird die verfilzte Masse der Kollagenfibrillen in einem Waring-Mischer homogenisiert, bis die Fibrillen eine Länge von etwa 1 mm aufweisen. Das Gemisch der Fibrillen in 0,05 M Essigsäure trennt sich beim Stehenlassen ohne Rühren während mehr als 5 min in zwei Phasen, so daß vor der Filtration gemischt werden muß. Die Filtration wird durch Filtrieren der Kollagen-Mucopolysaccharid-Dispersion im Vakuum durch einen Büchnertrichter unter Verwendung von Filterpapier Nr. 576 von Schleicher und Schüll (Keene, New Hampshire, USA) durchgeführt. Das Kopräzipitat wird dann an der Luft trocknen gelassen, bis der Feuchtigkeitsgehalt etwa 20 Gew.-% beträgt.
Wenn es erwünscht ist, daß das Produkt noch eine hohe Porosität besitzt, können die Compositmaterialien gefriergetrocknet werden. Typische Bedingungen sind eine Temperatur von -50 ºC und ein Vakuum von 0,06 mm Hg.
3. Aldehydvernetzung

Verfahren A

Wie in Beispiel 2 hergestelltes Kollagen-Chondroitin-6- sulfat-Kopräzipitat wird durch Eintauchen in eine 0,02 M Glutaraldehydlösung kovalent vernetzt. Durch diese Behandlung wird ein Teil der Polysaccharidkomponente auf den Kollagenfibrillen oder Kollagenmolekülen wirksam immobilisiert. Die Vernetzung wird dadurch nachgewiesen, daß das Polysaccharid auch durch verlängertes Waschen mit einer Phosphatpufferlösung, die 0,4 M Natriumchlorid enthält und einen ph-Wert von 7,4 aufweist und ein bekanntes Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat darstellt, nicht entfernt werden kann. Nicht umgesetzter Aldehyd wird durch Behandlung mit einer Lösung von 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion (Dimedon) entfernt. Nach Abdampfen des Wassers verbleibt ein Film, der bis zu etwa 10 Gew.-% Polysaccharid enthält.

Verfahren B

Zunächst wird eine 25%ige Lösung von Glutaraldehyd (nach Herstellerangabe als Reagens geeignet, Hersteller J. T. Baker Co., Philadelphia, PA, USA) in destilliertem Wasser hergestellt. Eine ausreichende Menge dieser Lösung wird dann der sauren Kollagenlösung zugegeben, daß der Gehalt an Glutaraldehyd 0,5 Vol.-% beträgt. Die Glutaraldehydlösung wird dann zu der Dispersion zugegeben, nachdem diese 1 h in einem durch Verringerung der Spannung auf 60 V mit niedriger Geschwindigkeit betriebenen Overheadmischer (Hamilton Beach Division der Firma Scovill, Washington, N.C., USA) gemischt wurde.
0,0578 g Chondroitin-6-sulfat werden in 10 ml 0,05 M Essigsäure gelöst. Diese Lösung wird zu 175 ml der mit Glutaraldehyd behandelten Kollagendispersion zugegeben. Der Zusatz wird während 5 min vorgenommen, wobei die Dispersion in dem Overheadmischer gemischt wird.
Kurz danach wird die Dispersion in einem Büchnertrichter filtriert. Dieser Filtrationsschritt ist nach etwa 20 min abgeschlossen. Die erhaltene feuchte Membran wird dann an der Luft getrocknet und zu einer Teilchengröße von 60 mesh (Siebmaschenweite 0,249 mm) zerkleinert. Das Material wird dann in physiologischer Kochsalzlösung (0,15 M NaCl, pH 7) dispergiert.
4. Vernetzung durch thermische Dehydratisierung
Das Produkt von Beispiel 3 wird in einen Vakuumofen gebracht und bei einem Vakuum von mindestens 0,3 mm Hg 48 h einer Temperatur von 115 ºC ausgesetzt. Nach dieser Behandlung können durch 4Bstündiges Eintauchen in destilliertes Wasser, das ein Lösungsmittel für Chondroitin-6-sulfat darstellt, weniger als 10 Gew.-% des ursprünglich in den Film eingebrachten Polysaccharids entfernt werden.

B. Herstellung von osteogenem Material

Das osteogene Protein kann nach den Verfahren hergestellt werden, die in der Patentschrift US 4 968 590, der PCT-Anmeldung US 89/01469 (WO 89/09788) (Titel "Biosynthetic Osteogenic Proteins and Osteogenic Devices Containing Them") und der PCT-Anmeldung US 89/01453 (WO 89/09787) (Titel "Osteogenic Devices") beschrieben sind. Die beiden PCT-Anmeldungen wurden am 7. April 1989 eingereicht. Alternativ dazu können an osteogenem Protein, das sich zur Herstellung entsprechender Vorrichtungen eignet, reiche Extrakte nach dem Verfahren von Urist, Patent US 4 294 753, hergestellt werden.

C. Formulierung des osteogenen Proteins im Kollagen-GAG- Material

Das Kollagen-GAG-Material, das die Form kleiner Kügelchen aufweist, wird in 70%igem Ethanol dispergiert, um in den Kügelchen vorliegende Luft durch eine Flüssigkeit zu ersetzen. Die Kügelchen werden wie folgt hergestellt: Etwa 100 ml einer Lösung von Ethanol in sterilem Wasser einer Konzentration von 70 Volum-% werden in eine Flasche mit 50 ml Kollagen-GAG-Kügelchen (Biomat Corporation, Belmont, MA, USA) gegeben. Die Kügelchen werden bei 4 ºC absetzen gelassen. Die obere Schicht der Ethanollösung wird abdekantiert und durch frische 70%ige Ethanollösung ersetzt. Dieser Schritt wird wiederholt, bis sämtliche Teilchen abgesunken sind. Alternativ dazu können die Teilchen auch durch Zentrifugieren bei niederer Geschwindigkeit (z.B. bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 500) hergestellt werden.
Das 70%ige Ethanol wird dann mit 50 mM Tris-gepufferter Kochsalzlösung (Tris-HCL, 0,15 M NaCl, pH 7,0 (TBS) ) oder mit 30- bis 50%igem Acetonitril, das 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) enthält, aus den Kügelchen verdrängt. Der Ersatz des Ethanols durch den Puffer wird durch wiederholtes Zentrifugieren bei niederer Geschwindigkeit, Dekantieren und Austausch des Puffers vorgenommen. Zur Erleichterung der Herstellung und zur Vermeidung eines möglichen Abbaus des Kollagen-GAG-Materials werden diese Schritte bei 4 ºC vorgenommen.
Das osteogene Protein wird dann an das Matrixmaterial gebunden. Die Präparationen von osteogenem Protein, das an das Matrixmaterial gebunden wird, sind
(1) die aktive Sephacrylfraktion (diese Fraktion induziert Knochenwachstum bei der Ratte in einer Menge von 5 bis 20 ug/Implantat) und
(2) die Heparin-Sepharose-Fraktion (diese Fraktion induziert Knochenwachstum bei der Ratte in einer Menge von 1 bis 10 ug/Implantat).
Das osteogene Protein kann nach einem der nachstehenden Verfahren auf die Kollagen-GAG-Matrix aufgebracht werden:
1. Acetonitril/TFA-Lyophilisierung
0,2 bis 0,3 ml mit Acetonitril/TFA-Puffer voräquilibriertes Matrixmaterial werden mit 200 ul Fraktionen mit osteogenem Protein in 50%igem Acetonitril, das 0,1 % TFA enthält, versetzt. Das Gemisch wird 16 h bei 4 ºC inkubiert und dann lyophilisiert.
2. TBS-Lyophilisierung
0,2 bis 0,3 ml mit TBS-Puffer voräquilibriertes Matrixmaterial werden mit 200 ul TBS-Puffer versetzt. Dann werden 10 ul 50%iges Acetonitril mit einem Gehalt von 0,1 % TFA, welches die Präparation des osteogenen Proteins in einer konzentrierten Menge enthält, zugegeben. Der ph-Wert sollte dann auf 7,0 eingestellt werden. Das Gemisch wird 2 h bei 24 ºC und dann 16 h bei 4 ºC inkubiert und danach lyophilisiert.

D. Biologischer Test zur Induktion der Knochenbildung

Zur Kontrolle der Wirksamkeit bei der enchondralen Knochendifferenzierung kann der biologische Test zur Induktion des Knochenwachstums herangezogen werden, der von Sampath und Reddi (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 6591-6595) beschrieben wurde und auf den hier Bezug genommen wird. Dieser Test besteht in der Implantation von xenogenen Testproben vom Rind in subkutane Stellen von als Transplantatempfänger dienenden Ratten, jeweils unter Anästhesie. Für den Test werden männliche Long-Evans-Ratten im Alter von 28 bis 32 Tagen herangezogen. Unter sterilen Bedingungen wird in der Haut über der Thorakalregion ein senkrechter Schnitt (1 cm) gemacht, worauf durch stumpfes Ablösen eine Tasche erzeugt wird. In diese Tasche werden etwa 25 mg der Testprobe implantiert, worauf der Schnitt mit einer Hautklammer aus Metall verschlossen wird. Die heterotope Stelle erlaubt die Untersuchung der Induktion von Knochenwachstum ohne mögliche Unsicherheiten, die bei Verwendung orthotoper Stellen auftreten könnten. Der Tag der Implantation wird als erster Versuchstag bezeichnet.
Die Implantate werden am 12. Tag nach der Implantation wieder aus dem Rattenkörper entnommen und zum Nachweis der Knochenbildung histologisch untersucht.

E. Histologie

Die resezierten Implantate werden in Bouins-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet; danach werden Schnitte von 6 bis 8 mm hergestellt, die mit Toluidinblau oder Hämatoxylinleosin gefärbt werden.
Die Erfindung kann auch in anderen speziellen Ausführungsformen realisiert werden. Die hier angegebenen Ausführungsformen sind entsprechend in jeder Hinsicht als lediglich erläuternd und nicht einschränkend zu betrachten.

Claims

1. Osteogene Vorrichtung zur Implantation, die zur Induktion der enchondralen Knochenbildung bei Säugern in einer Form, die im wesentlichen der Form der Vorrichtung entspricht, befähigt ist und die ein osteogenes Protein enthält, das in einer porösen Matrix dispergiert ist, die ein vernetztes Kollagen-Glykosaminoglykan-Polymer mit einem Molekulargewicht Mc zwischen den Vernetzungen von etwa 800 bis etwa 60000 und z.B. 5000 bis 10000 enthält.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Glykosaminoglykan mindestens 5 Gew.-% des Polymers und beispielsweise etwa 6 bis etwa 15 Gew.-% des Polymers darstellt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Glykosaminoglykan unter Chondroitin-4-sulfat, Chondroitin-6- sulfat, Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Keratansulfat, Heparin, Heparansulfat sowie Kombinationen dieser Verbindungen ausgewählt ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Glykosaminoglykan Sulfatgruppen enthält.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei

(a) das osteogene Protein zwei Untereinheiten aufweist, die unter oxidierenden Bedingungen ein Dimer bilden,

wobei eine der Untereinheiten eine Aminosäuresequenz aufweist, die ein ausreichendes Duplikat der Aminosäuresequenz der Protein-Untereinheit OP1 darstellt, so daß diese Untereinheit in Kombination mit der zweiten Untereinheit die enchondrale Knochenbildung bei Säugern induziert, wenn sie in der dem Säuger implantierten Matrix vorliegt,

oder

(b) das Kollagen unter Kollagen vom Typ I und Kollagen vom Typ II sowie Gemischen dieser Kollagene ausgewählt ist.

6. Verfahren zur Herstellung einer Matrix zur Implantation bei Säugern zur Induktion der Knochenbildung in vivo,

das folgende Schritte umfaßt:

(a) Vorsehen einer porösen Matrix, die ein Kollagen- Glykosaminoglykan-Polymer enthält, das zu einem Molekulargewicht Mc zwischen den Vernetzungen von etwa 800 bis etwa 60000 vernetzt ist,

und

(b) Dispergieren eines osteogenen Proteins in einer zur Induktion der enchondralen Knochenbildung, die im wesentlichen in der Form der Matrix erfolgt, ausreichenden Menge in der Matrix.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei

(i) Schritt (b) durch Entwässern eines Gemischs, welches das osteogene Protein und Partikel des Polymers enthält, beispielsweise durch Lyophilisieren des Gemischs, durchgeführt wird,

oder

(ii) der Dispergierschritt ferner den Schritt der Dispergierung von unlöslichem Kollagen in der Matrix umfaßt,

oder

(iii) der zusätzliche Schritt der Formgebung des Produkts von Schritt (b) zu einer Form mit vorgegebenen Abmessungen vorgenommen wird, so daß bei der Implantation eine Induktion der enchondralen Bildung von Knochen resultiert, der im wesentlichen diese Form aufweist.

8. Verwendung eines vernetzten Kollagen-Glykosaminoglykan- Polymers, das zu einem Molekulargewicht Mc zwischen den Vernetzungen von etwa 800 bis etwa 60000 vernetzt ist, zur Herstellung von Arzneimitteln in Form einer porösen Matrix zur Induktion von Knochenwachstum, die das Inkontaktbringen von lebendem Säugerknochen mit der Matrix an der Stelle einer Fraktur oder eines Defekts im Säugerknochen zur Induktion der Migration knochenbildender Osteoblasten vom Säugerknochen zur Matrix umfaßt.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die poröse Matrix als Beschichtung auf einem Implantat vorliegt.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Implantat ein unter Keramik, Metallen und Polymermaterialien ausgewähltes inertes Material darstellt.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die Matrix einen Kleber (z.B. Methylcellulose) in einer Menge enthält, die ausreichend ist, um die Matrix bei der Implantation in einen Säugerorganismus zu verfestigen.