JP4681214B2 - コラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法 - Google Patents
コラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4681214B2 JP4681214B2 JP2003165583A JP2003165583A JP4681214B2 JP 4681214 B2 JP4681214 B2 JP 4681214B2 JP 2003165583 A JP2003165583 A JP 2003165583A JP 2003165583 A JP2003165583 A JP 2003165583A JP 4681214 B2 JP4681214 B2 JP 4681214B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- collagen sponge
- producing
- sponge
- artificial skin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 title claims description 154
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 57
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 72
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 72
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 72
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 15
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000010409 thin film Substances 0.000 claims description 8
- 238000005187 foaming Methods 0.000 claims description 6
- 238000010030 laminating Methods 0.000 claims description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 53
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 13
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 description 10
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 10
- 229920006268 silicone film Polymers 0.000 description 10
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 10
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 8
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 8
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 6
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 108010045569 atelocollagen Proteins 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 5
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 239000010408 film Substances 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- VPVXHAANQNHFSF-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxan-2-one Chemical compound O=C1COCCO1 VPVXHAANQNHFSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 2
- 238000009941 weaving Methods 0.000 description 2
- 239000002759 woven fabric Substances 0.000 description 2
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical compound O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Prostheses (AREA)
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、簡略化された工程で、高い歩留りが得られるコラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法、並びに、上記コラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジを有する人工皮膚及び細胞組織培養基材に関する。
【0002】
【従来の技術】
コラーゲンスポンジを人工皮膚として熱傷等の患部に埋植すると、その多孔質の構造により線維芽細胞の増殖に適した無数の孔(空間)を提供し、線維芽細胞の増殖を助けることで患部の治癒を促進する作用を有することが知られている。更に、このようなコラーゲンスポンジにシリコーンフィルム等からなる水分透過調節層を積層したものは、患部からの水分の蒸散や微生物等の浸入等を抑制できることから、優れた人工皮膚として用いられている。
【0003】
このような人工皮膚としては、例えば、特許文献1には、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層に、生体吸収性高分子物質の繊維材料から形成される中間層を介して、多数の微細小孔を有するコラーゲンスポンジ層が積層されている人工皮膚が開示されている。また、このような人工皮膚の製造方法として、特許文献2には、親水性有機溶剤の水溶液にて湿潤した後凍結乾燥処理するコラーゲンスポンジの乾燥法が、特許文献3には、コラーゲン溶液に脂溶性有機溶媒を添加し、ホモジナイズして発泡させるコラーゲンスポンジの製造方法が開示されている。
【0004】
これまでに公開されている、コラーゲンスポンジを製造する方法、又は、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層とコラーゲンスポンジ層とを有する人工皮膚を製造する方法としては、例えば、非特許文献1に開示されているものが挙げられる。その概略を図1及び図2に示す。
【0005】
図1のコラーゲンスポンジの製造方法は、コラーゲン溶液のpHや濃度の調整を行うコラーゲン希釈溶液調製工程と、コラーゲンを発泡させてから凍結乾燥する1次コラーゲンスポンジ製造工程と、未架橋コラーゲンスポンジをグルタルアルデヒド(GA)で架橋するGA架橋工程と、架橋コラーゲンスポンジを凍結乾燥する2次コラーゲンスポンジ製造工程とからなる。
また、図2の人工皮膚の製造方法は、コラーゲン溶液のpHや濃度の調整を行うコラーゲン希釈溶液調製工程と、コラーゲンを発泡させてから凍結乾燥する1次コラーゲンスポンジ製造工程と、未架橋コラーゲンスポンジの表面にシリコーン等の水分透過調節層を積層する製膜工程と、未架橋コラーゲンスポンジをグルタルアルデヒド(GA)で架橋するGA架橋工程と、架橋コラーゲンスポンジを凍結乾燥する2次コラーゲンスポンジ製造工程とからなる。
【0006】
しかし、このような従来のコラーゲンスポンジの製造方法又は人工皮膚の製造方法は、工程が煩雑であるうえ、最終的に得られたコラーゲンスポンジや、人工皮膚のコラーゲンスポンジ層の表面にひびや割れが生じたり、人工皮膚の水分透過調節層に皺がよったりする不良品が生じ、歩留りが低下することがあるという問題があった。
【0007】
【特許文献1】
特許第2987464号公報
【特許文献2】
特公平7−100号公報
【特許文献3】
特許第2997823号公報
【非特許文献1】
Biomaterials 14,1030(1993)
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、簡略化された工程で、高い歩留りが得られるコラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法、並びに、上記コラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジを有する人工皮膚及び細胞組織培養基材を提供することを目的とする。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酢酸を用いてコラーゲン希釈溶液のpHを調整する工程、及び、pH調整されたコラーゲン希釈溶液にグルタルアルデヒドを添加し、凍結乾燥して架橋コラーゲンスポンジを調製する工程を有し、かつ、上記コラーゲン希釈溶液を発泡する工程を有しないことを特徴とするコラーゲンスポンジの製造方法である。
【0012】
本発明は、少なくとも、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層とコラーゲンスポンジ層とを有する人工皮膚を製造する方法であって、上述のコラーゲンスポンジの製造方法により架橋コラーゲンスポンジを調製した後、上記架橋コラーゲンスポンジ上に上記水分透過調節層を積層する人工皮膚の製造方法である。
以下に本発明を詳述する。
【0013】
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法では、酢酸を用いてpHを調整したコラーゲン希釈溶液を用いる(以下、コラーゲン希釈溶液調製方法の改良ともいう)。
コラーゲンスポンジの原料となるコラーゲンとしては、コラーゲンの末端を酵素的に処理して抗原性をなくしたものを用いることが好ましい。このようなコラーゲンとしては、従来公知のコラーゲンスポンジの原料が広く使用でき、例えば、酸可溶性コラーゲン、中性塩可溶性コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン等の可溶性コラーゲン;天然の又は化学修飾されたコラーゲン繊維;可溶性コラーゲンを不溶化した再生コラーゲン繊維等を用いることができる。
【0014】
上記コラーゲンスポンジの原料となるコラーゲンは、酸を用いて溶液のpHを3程度に調整することにより可溶化してコラーゲン希釈溶液として用いている。従来のコラーゲンスポンジの製造方法では、pHの調整には塩酸が用いられていた。
コラーゲン希釈溶液調製方法の改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法では、酢酸を用いてpHの調整を行うことにより、最終的に得られるコラーゲンスポンジのひびや割れの発生を抑制し、歩留りを向上することができる。なお、酢酸だけでは酢酸の使用量が多すぎ、酢酸の濃度が高くなりすぎる場合には、塩酸等を併用してもかまわない。
【0015】
この理由については明らかではないが、酢酸によりpHを調整した場合には、発泡操作を省略してそのまま凍結して凍結乾燥しても均一な孔径のコラーゲンスポンジが得られることから、酢酸を用いれば得られるコラーゲンスポンジの孔径が均一化されることにより機械的物性が向上して、ひびや割れの発生を抑制することができるためと考えられる。また、上述のようにコラーゲン希釈溶液調製方法の改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法では、発泡操作を省略しても均一な孔径のコラーゲンスポンジが得られることから、工程を簡略化することができる。
【0016】
図3にコラーゲン希釈溶液調製方法の改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法の一例の概略を示した。図3では、コラーゲン希釈溶液調製方法の改良に関する特徴部分以外は従来のコラーゲンスポンジの製造方法を記しているが、必要に応じて本明細書に記載する他の本発明のコラーゲンスポンジの製造方法を組み合わせてもよい。
【0017】
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法は、未架橋のコラーゲンスポンジをグルタルアルデヒド揮発ガス中で架橋する工程を有する(以下、気相架橋法についての改良ともいう)。従来のコラーゲンスポンジの製造方法では、グルタルアルデヒド水溶液中に未架橋のコラーゲンスポンジを浸漬し、一定時間放置することによりGA架橋を施していた。この場合、グルタルアルデヒドは一般に毒性が高いことから、臨床用途に使用するためには充分に残留グルタルアルデヒドを除去する必要がある。しかし、親水性の高いコラーゲンスポンジからグルタルアルデヒドを完全に除去するのは困難であり、従来は蒸留水等を用いて何度も洗浄することを行っていたが、操作が煩雑であるうえ、水洗の際に軟弱なコラーゲンスポンジが損傷して、最終的に得られるコラーゲンスポンジのひびや割れの原因ともなっていた。
【0018】
本発明者らは、グルタルアルデヒドが揮発性を有することに着目し、アルデヒドが揮発したグルタルアルデヒド揮発ガス中でコラーゲンスポンジの架橋を行うことにより、又は、真空加熱処理を行うことにより、残留グルタルアルデヒドの除去を目的とする洗浄操作を省略でき、コラーゲンスポンジのひびや割れによる歩留りの低下を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0019】
上記グルタルアルデヒド揮発ガス中でコラーゲンスポンジを架橋させる方法としては特に限定されないが、例えば、密封した容器内にグルタルアルデヒド水溶液と、該グルタルアルデヒド水溶液に直接接触しないように未架橋コラーゲンスポンジを置き、一定時間放置する方法等が挙げられる。この場合、上記グルタルアルデヒド水溶液の濃度の好ましい下限は1mM、好ましい上限は2.5Mである。1mM未満であると、気相中のグルタルアルデヒド濃度が低く、架橋できなかったり架橋に長時間を要したりすることがあり、2.5Mを超えると、溶液の取り扱いが困難になったりすることがある。
【0020】
また、気相架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法によれば、乾燥状態のコラーゲンスポンジを直接グルタルアルデヒド架橋できることから、従来のコラーゲンスポンジの製造方法のように、液相でグルタルアルデヒド架橋した後、再度凍結乾燥して2次コラーゲンスポンジとする必要もなく、大幅に工程を簡略化できる。
【0021】
図4に気相架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法の一例の概略を示した。図4では、気相架橋法についての改良に関する特徴部分以外は従来のコラーゲンスポンジの製造方法を記しているが、必要に応じて本明細書に記載する他の本発明のコラーゲンスポンジの製造方法を組み合わせてもよい。
【0022】
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法は、コラーゲン希釈溶液にグルタルアルデヒドを添加し、凍結乾燥して架橋コラーゲンスポンジを調製する工程を有する(以下、溶液架橋法についての改良ともいう)。
図1に示したように、従来のコラーゲンスポンジの製造方法では、1次コラーゲンスポンジ上に水分透過調節層を積層してからグルタルアルデヒド架橋を行っていた。しかしこの方法では、上述のように煩雑な残留グルタルアルデヒド除去操作を要し、またこの操作により歩留りが低下していた。
本発明者らは、鋭意検討の結果、コラーゲン希釈溶液を凍結し真空乾燥してコラーゲンスポンジを作製する際に、予め上記コラーゲン希釈溶液にグルタルアルデヒドを添加しておくことにより、架橋されたコラーゲンスポンジが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0023】
従来、水溶液中のコラーゲン濃度は低いために、コラーゲン希釈溶液中にグルタルアルデヒドを直接添加しても架橋は形成されないと考えられていた。しかし、グルタルアルデヒドを添加したコラーゲン希釈溶液を凍結乾燥する場合には、凍結乾燥の過程において溶液が濃縮されコラーゲン濃度が高まることから、架橋が形成されるものと考えられる。また、グルタルアルデヒドは揮発性を有し、凍結乾燥の過程において気散することから、得られた架橋コラーゲンスポンジ中にグルタルアルデヒドが残留することもない。また、従来のコラーゲンスポンジの製造方法のように、いったん製造した未架橋のコラーゲンスポンジを液相でグルタルアルデヒド架橋した後、再度凍結乾燥して2次コラーゲンスポンジとする必要もなく、大幅に工程を簡略化できる。
【0024】
更に、理由は定かではないが、溶液架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により得られたコラーゲンスポンジは、従来の方法により製造したコラーゲンスポンジに比べ吸水性に優れ、また、細胞接着性にも優れる。従って、溶液架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により製造したコラーゲンスポンジを用いれば、線維芽細胞の浸入性がよく治癒が促進される他、皮膚、骨、血管、神経等の再生医療等において、このコラーゲンスポンジを細胞播種の足場とした場合にも、細胞の接着に極めて優れ有用である。
【0025】
溶液架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法において、コラーゲン希釈溶液に添加するグルタルアルデヒドの濃度の好ましい下限は0.01mM、好ましい上限は1Mである。0.01mM未満であると、充分な架橋を形成できないことがあり、1Mを超えると、高架橋になりすぎてコラーゲンスポンジ層の親水性が低下して線維芽細胞の浸入性が低下し治癒が遅くなることがある。
【0026】
図5に溶液架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法の一例の概略を示した。図5では、溶液架橋法についての改良に関する特徴部分以外は従来のコラーゲンスポンジの製造方法を記しているが、必要に応じて本明細書に記載する他の本発明のコラーゲンスポンジの製造方法を組み合わせてもよい。
【0027】
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジは、微細な多数の小孔を有するものであって、その孔径の好ましい下限は5μm、好ましい上限は1000μmである。5μm未満であると、線維芽細胞が浸入しにくく治癒が遅れることがあり、1000μmを超えると、コラーゲンスポンジの強度が不足したり、かえって治癒に時間がかかったりすることがある。より好ましい下限は50μm、より好ましい上限は130μmである。
【0028】
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジは、細胞を播種して組織を構築する、いわゆる再生医療に供するための細胞組織培養基材として好適に用いることができる。
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジを用いてなる細胞組織培養基材もまた、本発明の1つである。
【0029】
本発明の細胞組織培養基材は、更に、強度を補ったり、また、再生すべき組織の形状に整えたりする目的で補強材を有することが好ましい。
上記補強材としては特に限定されないが、例えば、生体吸収性高分子物質の繊維材料等が挙げられる。
上記生体吸収性高分子物質としては、例えば、グリコール酸、乳酸、ジオキサノン、カプロラクトン等の単独又は共重合体等を挙げることができる。
また、上記繊維材料には、例えば、高分子物質の1種又は2種以上をたとえば紡糸した糸条等を編成、織成、交編織成、不織布化等したりスライバーや短繊維材料をシート化したりして得られる編物、織物、不織布その他のシート状繊維材料が包含される。
上記補強材による補強の方法としては特に限定されず、例えば、コラーゲンスポンジの片面又は両面に積層してもよく、コラーゲンスポンジを製造する際に、コラーゲンスポンジ中に補強材が形成されるようにしてもよい。
【0030】
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジは、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層を積層することにより、人工皮膚として好適に用いることができる。
本発明のコラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジと、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層とを有する人工皮膚もまた、本発明の1つである。
【0031】
上記水分透過調節層としては、例えば、シリコーン、ポリウレタン、ポリアクリレートエステル、ポリメタクリレートエステル等の水分透過性高分子物質の薄膜からなるものが挙げられる。なかでも、製膜性や生体適合性に優れることからシリコーンが好適である。
【0032】
上記水分透過調節層は、水分透過性の好ましい下限が0.1mg/hr・cm2、好ましい上限が2mg/hr・cm2である。0.1mg/hr・cm2未満であると、患部に水分が滞留して治癒が遅くなることがあり、2mg/hr・cm2を超えると、患部からの水分の蒸散が大きすぎて患者の負担が大きくなることがある。より好ましい下限は0.9mg/hr・cm2、より好ましい上限は1.7mg/hr・cm2である。
【0033】
上記水分透過調節層の厚さとしては、材質ごとに上述の水分透過性を実現できる厚さに適宜調整され特に限定されない。例えばシリコーンからなる場合の好ましい下限は12.5μm、好ましい上限は200μmであり、より好ましい下限は25μm、より好ましい上限は100μmであり、更に好ましい上限は50μmである。
【0034】
上記人工皮膚は、その片面又は上記水分透過調節層とコラーゲンスポンジ層との中間に、補強材として生体吸収性高分子物質の繊維材料から形成される中間層を有していてもよい。
上記生体吸収性高分子物質としては、例えば、グリコール酸、乳酸、ジオキサノン、カプロラクトン等の単独又は共重合体等を挙げることができる。
また、上記繊維材料には、例えば、高分子物質の1種又は2種以上をたとえば紡糸した糸条等を編成、織成、交編織成、不織布化等したりスライバーや短繊維材料をシート化したりして得られる編物、織物、不織布その他のシート状繊維材料が包含される
【0035】
本発明は、少なくとも、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層とコラーゲンスポンジ層とを有する人工皮膚の製造方法である。
上記コラーゲンスポンジ層の原料となるコラーゲンとしては、コラーゲンの末端を酵素的に処理して抗原性をなくしたものを用いることが好ましい。このようなコラーゲンとしては、従来公知のコラーゲンスポンジの原料が広く使用でき、例えば、酸可溶性コラーゲン、中性塩可溶性コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン等の可溶性コラーゲン;天然の又は化学修飾されたコラーゲン繊維;可溶性コラーゲンを不溶化した再生コラーゲン繊維等を用いることができる。
【0036】
上記コラーゲンスポンジ層は、微細な多数の小孔を有するものであって、その孔径の好ましい下限は5μm、好ましい上限は1000μmである。5μm未満であると、線維芽細胞が浸入しにくく治癒が遅れることがあり、1000μmを超えると、人工皮膚の強度が不足したり、かえって治癒に時間がかかったりすることがある。より好ましい下限は50μm、より好ましい上限は130μmである。
【0037】
上記コラーゲンスポンジ層の厚さとしては1mm以上であることが好ましい。1mm未満であると、重度の熱傷には適用できないことがある。より好ましい下限は2mm、好ましい上限は4mmである。
【0038】
上記水分透過調節層としては、上述した本発明の人工皮膚を構成する水分透過調節層と同様のものを用いることができ、その水分透過性、厚さについても本発明の人工皮膚を構成する水分透過調節層と同様である。
また、上記人工皮膚は、その片面又は上記水分透過調節層とコラーゲンスポンジ層との中間に、補強材として生体吸収性高分子物質の繊維材料から形成される中間層を有していてもよい。
上記生体吸収性高分子物質としては、上述した本発明の細胞組織培養基材に用いられる生体吸収性高分子物質と同様のものを使用することができる。
【0039】
このような人工皮膚は、図2に示した従来の人工皮膚の製造方法により製造できるが、本発明者らは、鋭意検討した結果、製造方法の改良によりコラーゲン層のひびや割れ、水分透過調節層の皺等による不良品の発生を抑制して高い歩留りを実現し、また、工程を簡略化できることを見出した。
【0040】
本発明の人工皮膚の製造方法では、未架橋コラーゲンスポンジにグルタルアルデヒド架橋処理を加え、凍結乾燥して架橋コラーゲンスポンジを調製した後、架橋コラーゲンスポンジ上に水分透過調節層を積層する(以下、工程の改良ともいう)。
図2に示したように、従来の人工皮膚の製造方法では、製膜工程を行ってからGA架橋工程を行い、凍結乾燥して2次コラーゲンスポンジを製造していた。これは、未架橋コラーゲンスポンジ上に予め高強度の水分透過調節層を製膜しておくことにより、GA架橋やGA架橋後の洗浄において軟弱なコラーゲンスポンジが破損するのを防ぐためであった。
しかしながら、本発明者らが検討したところ、GA架橋から洗浄、凍結乾燥の工程を通じてコラーゲンスポンジの収縮が起こることから、予め製膜してコラーゲンスポンジを固定してしまうと、この収縮に耐えきれずにスポンジにひびや割れが入ったり、水分透過調節層に皺が入ったりすることがわかった。
【0041】
工程の改良に関する本発明の人工皮膚の製造方法では、製膜を施していない未架橋のコラーゲンスポンジをグルタルアルデヒド架橋し、凍結乾燥してから後、水分透過調節層を積層することにより、コラーゲンスポンジは収縮する際には固定されていないので、スポンジの収縮によるスポンジのひびや割れ、水分透過調節層の皺の発生を抑制することができる。
【0042】
図6に工程の改良に関する本発明の人工皮膚の製造方法の一例の概略を示した。図6では、工程の改良に関する特徴部分以外は従来の人工皮膚の製造方法を記しているが、必要に応じて本明細書に記載する他の本発明の人工皮膚の製造方法を組み合わせてもよい。
【0043】
【実施例】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【0044】
(参考例1)
コラーゲン溶液(新田ゼラチン社製、「アテロコラーゲン」)を原料とし、精製水、5N−酢酸及び1N−塩酸を用いて濃度3mg/ml、pH 3.0のコラーゲン希釈溶液を調製した。
得られたコラーゲン希釈溶液50gを凍結乾燥用のステンレス製枠(11cm×8.5cm)内に流し込んだ。ステンレス製枠を−40℃に冷却してコラーゲン発泡液を凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行った。更に真空減圧下(0.01mmHg)105℃で24時間加熱乾燥を行い、1次コラーゲンスポンジを得た。
次いで、0.2重量%のグルタルアルデヒド/酢酸溶液中、5℃で24時間架橋反応を行った。得られた架橋コラーゲンスポンジをイオン交換水で充分洗浄した後、15%エタノール水溶液で置換した。
その後、−110℃で凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。
得られたコラーゲンスポンジに厚さ100μmのシリコーン膜を貼付、乾燥し、コラーゲンスポンジ層上にシリコーン膜が積層した人工皮膚を得た。
【0045】
(参考例2)
コラーゲン溶液(新田ゼラチン社製、「アテロコラーゲン」)を原料とし、精製水、5N−酢酸及び1N−塩酸を用いて濃度3mg/ml、pH 3.0のコラーゲン希釈溶液を調製した。
得られたコラーゲン希釈溶液50gにクロロホルム0.5gを添加した。得られたクリーム状の発泡液を凍結乾燥用のステンレス製枠(11cm×8.5cm)内に流し込んだ。ステンレス製枠を−40℃に冷却してコラーゲン発泡液を凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行い、コラーゲンスポンジを得た。
得られたコラーゲンスポンジを体積8,000mLの密閉容器中に入れ、別に調製した2重量%のグルタルアルデヒド/酢酸溶液50mLをコラーゲンスポンジに直接触れないように加えた。この密閉容器を40℃、3時間静置してコラーゲンスポンジを架橋し、架橋コラーゲンスポンジを得た。
得られた架橋コラーゲンスポンジに、更に真空減圧下(0.01mmHg)105℃で24時間加熱乾燥を行い、厚さ100μmのシリコーン膜を貼付してコラーゲンスポンジ層上にシリコーン膜が積層した人工皮膚を得た。
【0046】
(実施例3)
コラーゲン溶液(新田ゼラチン社製、「アテロコラーゲン」)を原料とし、精製水、5N−酢酸及び1N−塩酸を用いてコラーゲン濃度3mg/ml、pH 3.0に調整した後、更に、最終のグルタルアルデヒド濃度が0.05mMになるようにグルタルアルデヒドを添加した。
得られたグルタルアルデヒド含有コラーゲン希釈溶液50gを凍結乾燥用のステンレス製枠(11cm×8.5cm)内に流し込んだ。ステンレス製枠を−40℃に冷却してコラーゲン発泡液を凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行った。更に真空減圧下(0.01mmHg)105℃で24時間加熱乾燥を行い、架橋コラーゲンスポンジを得た。
得られた架橋コラーゲンスポンジに厚さ100μmのシリコーン膜を貼付し、乾燥してコラーゲンスポンジ層上にシリコーン膜が積層した人工皮膚を得た。
【0047】
(参考例4)
コラーゲン溶液(新田ゼラチン社製、「アテロコラーゲン」)を原料とし、精製水及び1N−塩酸を用いて濃度3mg/ml、pH 3.0のコラーゲン希釈溶液を調製した。
得られたコラーゲン希釈溶液50gにクロロホルム0.5gを添加し、ホモジナイザー(日本精機社製、「エクセルオートホモジナイザー」)を用い、6000rpmで1分間ホモジナイズした。得られた発泡液を凍結乾燥用のステンレス製枠(11cm×8.5cm)内に流し込んだ。ステンレス製枠を−40℃に冷却してコラーゲン発泡液を凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行った。更に真空減圧下(0.01mmHg)105℃で24時間加熱乾燥を行い、1次コラーゲンスポンジを得た。
得られた1次コラーゲンスポンジを0.2重量%のグルタルアルデヒド/酢酸溶液中に浸漬し、5℃で24時間架橋反応を行った。得られた架橋コラーゲンスポンジをイオン交換水で充分洗浄した後、15%エタノール水溶液で置換した。
−110℃で凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥して2次コラーゲンスポンジを作製し、この2次コラーゲンスポンジに厚さ100μmのシリコーン膜を貼付してコラーゲンスポンジ層上にシリコーン膜が積層し、乾燥して人工皮膚を得た。
【0048】
(比較例1)
コラーゲン溶液(新田ゼラチン社製、「アテロコラーゲン」)を原料とし、精製水及び1N−塩酸を用いて濃度3mg/ml、pH 3.0のコラーゲン希釈溶液を調製した。
得られたコラーゲン希釈溶液50gにクロロホルム0.5gを添加し、ホモジナイザー(日本精機社製、「エクセルオートホモジナイザー」)を用い、6000rpmで1分間ホモジナイズした。得られたクリーム状の発泡液を凍結乾燥用のステンレス製枠(11cm×8.5cm)内に流し込んだ。ステンレス製枠を−40℃に冷却してコラーゲン発泡液を凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行った。更に真空減圧下(0.01mmHg)105℃で24時間加熱乾燥を行い、1次コラーゲンスポンジを得た。
得られた1次コラーゲンスポンジに厚さ100μmのシリコーン膜を貼付し、乾燥した。
次いで、0.2重量%のグルタルアルデヒド/酢酸溶液中、5℃で24時間架橋反応を行った。得られた架橋コラーゲンスポンジをイオン交換水で充分洗浄した後、15%エタノール水溶液で置換した。
−80℃で凍結し、真空減圧下(0.01mmHg)30℃で24時間凍結乾燥を行いコラーゲンスポンジ層上にシリコーン膜が積層した人工皮膚を得た。
【0049】
(評価)
実施例3、参考例1、2及び4、並びに、比較例1で作製した人工皮膚各々100枚について、コラーゲンスポンジ層のひび、シリコーン膜の剥がれ、及び、シリコーン膜の皺があるものを目視にて調べ、不良品を除いた後の歩留りを求めた。なお、歩留りの算出に際しては、コラーゲンスポンジ層のひびと、シリコーン膜の剥がれ、シリコーン膜の皺とは重複して生じているものも1枚として計測した。
【0050】
【表1】
【0051】
【発明の効果】
本発明によれば、簡略化された工程で、高い歩留りが得られるコラーゲンスポンジの製造方法、人工皮膚の製造方法、及び、上記コラーゲンスポンジの製造方法により製造されたコラーゲンスポンジを有する人工皮膚及び細胞組織培養基材を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】従来のコラーゲンスポンジの製造方法の一例を示す概略図である。
【図2】従来の人工皮膚の製造方法の一例を示す概略図である。
【図3】コラーゲン希釈溶液調製方法の改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法の一例を示す概略図である。
【図4】気相架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法の一例を示す概略図である。
【図5】溶液架橋法についての改良に関する本発明のコラーゲンスポンジの製造方法の一例を示す概略図である。
【図6】工程の改良に関する本発明の人工皮膚の製造方法の一例を示す概略図である。
Claims (2)
- 酢酸を用いてコラーゲン希釈溶液のpHを調整する工程、及び、pH調整されたコラーゲン希釈溶液にグルタルアルデヒドを添加し、凍結乾燥して架橋コラーゲンスポンジを調製する工程を有し、かつ、
前記コラーゲン希釈溶液を発泡する工程を有しない
ことを特徴とするコラーゲンスポンジの製造方法。 - 少なくとも、水分透過性高分子物質の薄膜からなる水分透過調節層とコラーゲンスポンジ層とを有する人工皮膚を製造する方法であって、
請求項1記載のコラーゲンスポンジの製造方法により架橋コラーゲンスポンジを調製した後、前記架橋コラーゲンスポンジ上に前記水分透過調節層を積層する
ことを特徴とする人工皮膚の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003165583A JP4681214B2 (ja) | 2003-06-10 | 2003-06-10 | コラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003165583A JP4681214B2 (ja) | 2003-06-10 | 2003-06-10 | コラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005000314A JP2005000314A (ja) | 2005-01-06 |
JP4681214B2 true JP4681214B2 (ja) | 2011-05-11 |
Family
ID=34092020
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003165583A Expired - Fee Related JP4681214B2 (ja) | 2003-06-10 | 2003-06-10 | コラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4681214B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013105665A1 (ja) | 2012-01-12 | 2013-07-18 | 株式会社ニッピ | コラーゲン構造体、およびコラーゲン構造体の製造方法 |
WO2020122007A1 (ja) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | 株式会社ビーエムジー | 2反応剤型のシート状組織接着補強材 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5339323B2 (ja) * | 2006-10-19 | 2013-11-13 | 独立行政法人物質・材料研究機構 | 多孔質体とその製造方法 |
DK2380979T3 (da) | 2008-12-22 | 2015-06-22 | Univ Hokkaido Nat Univ Corp | Proteinstof med trippelhelixstruktur samt fremgangsmåde til dets fremstilling |
JP5837819B2 (ja) * | 2011-12-28 | 2015-12-24 | グンゼ株式会社 | 高分子スポンジ洗浄装置、及び高分子スポンジ洗浄方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS52102418A (en) * | 1976-02-23 | 1977-08-27 | Avicon Inc | Web derived from colagen fiber having stypiic and wound blocking property |
JPS61207340A (ja) * | 1985-03-13 | 1986-09-13 | Koken:Kk | コラーゲン基質の細胞増殖性向上処理方法 |
JPH04227264A (ja) * | 1990-04-06 | 1992-08-17 | Organogenesis Inc | コラーゲン構造体 |
JPH04266764A (ja) * | 1991-02-22 | 1992-09-22 | Terumo Corp | 人工皮膚およびその製造法 |
JPH06503735A (ja) * | 1990-12-05 | 1994-04-28 | バイタフォー ウーンド ヒーリング インコーポレーテッド | 創傷用包帯剤およびその製造法 |
JPH06505642A (ja) * | 1990-05-29 | 1994-06-30 | ストライカー・コーポレーション | 合成骨マトリックス |
JPH10505527A (ja) * | 1993-04-15 | 1998-06-02 | リ,シュ−タング | 吸収性血管創傷被覆材 |
JP2002143290A (ja) * | 2000-11-16 | 2002-05-21 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 架橋複合生体材料 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0089145B1 (en) * | 1982-03-08 | 1987-06-16 | Collagen Corporation | Injectable cross-linked collagen implant material |
-
2003
- 2003-06-10 JP JP2003165583A patent/JP4681214B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS52102418A (en) * | 1976-02-23 | 1977-08-27 | Avicon Inc | Web derived from colagen fiber having stypiic and wound blocking property |
JPS61207340A (ja) * | 1985-03-13 | 1986-09-13 | Koken:Kk | コラーゲン基質の細胞増殖性向上処理方法 |
JPH04227264A (ja) * | 1990-04-06 | 1992-08-17 | Organogenesis Inc | コラーゲン構造体 |
JPH06505642A (ja) * | 1990-05-29 | 1994-06-30 | ストライカー・コーポレーション | 合成骨マトリックス |
JPH06503735A (ja) * | 1990-12-05 | 1994-04-28 | バイタフォー ウーンド ヒーリング インコーポレーテッド | 創傷用包帯剤およびその製造法 |
JPH04266764A (ja) * | 1991-02-22 | 1992-09-22 | Terumo Corp | 人工皮膚およびその製造法 |
JPH10505527A (ja) * | 1993-04-15 | 1998-06-02 | リ,シュ−タング | 吸収性血管創傷被覆材 |
JP2002143290A (ja) * | 2000-11-16 | 2002-05-21 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 架橋複合生体材料 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013105665A1 (ja) | 2012-01-12 | 2013-07-18 | 株式会社ニッピ | コラーゲン構造体、およびコラーゲン構造体の製造方法 |
WO2020122007A1 (ja) | 2018-12-14 | 2020-06-18 | 株式会社ビーエムジー | 2反応剤型のシート状組織接着補強材 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2005000314A (ja) | 2005-01-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4674211B2 (ja) | 人工皮膚の製造方法 | |
EP1273312B1 (en) | Implant for cartilage tissue regeneration | |
JP5224250B2 (ja) | 医用代用膜 | |
EP3375461B1 (en) | Tissue repair fiber membrane, preparation method and application thereof, and tissue repair product | |
US6500464B2 (en) | Bilayered collagen construct | |
ES2397381T3 (es) | Producto reparador dural y meníngeo suturable que comprende matriz de colágeno | |
CN106267347B (zh) | 盆底生物补片及其制备方法 | |
CN109876186B (zh) | 一种用于神经修复的生物医用可降解双层支架及其制备方法 | |
CN111558082A (zh) | 一种用于引导口腔骨组织再生的膜及其制备方法 | |
JP2004532675A (ja) | 免疫学的に不活性な羊膜の製造方法 | |
JP4681214B2 (ja) | コラーゲンスポンジの製造方法及び人工皮膚の製造方法 | |
US6241774B1 (en) | Artificial esophagus | |
CN107349456B (zh) | 一种具有孔隙大小自适应调节能力的胶原海绵制备方法及胶原海绵 | |
KR0141988B1 (ko) | 생분해성 막과 그 제조방법 | |
CN109701077B (zh) | 一种微孔再生组织基质及其制备和应用 | |
JP3772232B2 (ja) | 組織含有人工真皮及びその製造法 | |
KR20070064329A (ko) | 콜라겐 스펀지의 제조 방법, 인공 피부의 제조 방법, 인공피부 및 세포 조직 배양 기재 | |
JP5224440B2 (ja) | 三次元培養弾性線維組織及び三次元培養弾性線維組織の製造方法 | |
CN102671243A (zh) | 一种负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料及其制备方法 | |
CN111450315A (zh) | 一种抑炎水凝胶涂覆聚丙烯补片及其制备方法 | |
Gudemac et al. | Comparative cellular local response in abdominal defect plastic surgery with bovine pericardium and bovine fascia preserved in formaldehyde in experimental rabbits | |
JPH08196618A (ja) | 細胞侵入性コラーゲン製剤、および人工皮膚、およびそれらの製造方法 | |
WO2024146489A1 (zh) | 一种天然双层重组类胶原蛋白可吸收生物膜及其制备方法与应用 | |
EP2473134A1 (en) | High strength, high stiffness, reconstituted collagen membranes for biomedical implantation | |
JP2000245450A (ja) | 生着率を改善する培養表皮用シート |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060425 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091228 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20091228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100302 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100423 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110201 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110204 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4681214 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140210 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140210 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |