JP2004532675A - 免疫学的に不活性な羊膜の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、プログラムされた帝王切開物から収集された胎児の羊膜を使用する免疫学的に不活性な羊膜の製造方法を開示する。本発明における免疫学的に不活性な羊膜は、2、3度の火傷における皮膚の置換物として、末梢神経の再生を誘導する神経スリーブとして、角膜移植片として、膀胱および子宮の再構築において、心房間および心室間短絡のような心臓の異常形成の矯正において、ならびに弁器官の再構築において適用することができる。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、滅菌条件下にプログラムされた帝王切開物(caesareans)から収集された胎児の膜を使用する免疫学的に不活性な羊膜の製造方法を開示する。本発明における免疫学的に不活性な羊膜は、2、3度の火傷における皮膚置換物として、末梢神経の再生を誘導する神経スリーブとして、角膜移植片として、膀胱および尿道の再構築において、心房間および心室間短絡のような心臓の異常形成の矯正において、ならびに弁器官の再構築において適用することができる。
【背景技術】
【0002】
広範囲にわたる火傷患者の特殊な症例では、自家皮膚供与部位の不足(1)により、急性期および再構築期のいずれにおいても、創傷の被覆が、依然として主要な問題となっている。したがって、永久的な皮膚置換物の開発に成功することは、このような患者のケアに対し大きなインパクトを与える。
【0003】
1910年に、Davisは(1として引用)皮膚移植の整形用材料として胎児膜(羊膜および絨毛膜)の使用を始めて報告したが、皮膚の同種移植片の場合と同様に拒絶反応が大きく、大きな成功には、到らなかった。
【0004】
皮膚は複雑な臓器である。それは、機械的に、二層、すなわち表皮および真皮からなる。第一の層は、細菌に対する障壁を付与し、4つの層、すなわち基底層、有棘層、顆粒層および角質層からなる。真皮はその網状のうねりで皮膚に対し強度および弾力性を付与する(2)。
【0005】
現時点において大部分の火傷創傷は、可能な限り速やかに、中間層自家移植片で閉鎖するのが最善である。しかしながら、この自家移植片は、全層の皮膚を置換するには不充分なものである(2)。
【0006】
それにもかかわらず、外科領域における羊膜の使用は拡大され、1940年代には4名の研究者が、様々な眼疾患の処置における羊膜の有益な役割について報告している(3)。現在では、羊膜は、たとえば、潰瘍を伴う持続性角膜表皮欠損(4 〜 6)、翼状贅片(7)等のある種の眼疾患の処置、および結膜表面の再構築に際しての優れた材料として認識されている。下腿潰瘍およびスティーブン-ジョンソン症候群の皮膚喪失における有益な効果、ならびに火傷および外科的創傷における一時的な皮膚の包帯としての有益な効果も報告されている(9)。
【0007】
数名の研究者らは、トリプシン消化および機械的な掻は(11, 12)の組み合わせで羊膜上皮を除去することにより予め露出させた羊膜のマトリックス上で、角質上皮の幹細胞を培養したが(10)この方法においては、羊膜が細胞増殖のための培養基としてのみ働く(11)。
【0008】
眼は古くから、その構造物の多くが血管化されることがなく、それ故免疫細胞が到達することができず、その構造物に対して反応することができない「免疫特権的な」部位として認識されている。他方、トリプシン消化は、細胞外マトリックス(ECM)を損傷し、コラーゲナーゼの活性化、ECMの分解、フィブリノーゲンの沈着および瘢痕形成を導く可能性がある。
【0009】
本発明は、完全なECMのままとしながらこの副作用を回避するものである。
【0010】
様々なタイプのポリウレタン膜様マトリックス(12)や非細胞性コラーゲンマトリックス(13)を用いて培養されたケラチン生成細胞に対して、多くの試みがなされてきた。近年において、皮膚移植片は、初期の自家移植片および同種移植片の調製物から、生合成及び組織工学的処理による皮膚置換物(13)へと進展してきている。その結果、火傷の処置に対する、新材料の利用可能性ならびに羊膜移植に伴う以前の失敗は、ほとんど放置されてたままである。しかしながら、組織工学処理ならびに用いられる培養基はきわめて高価である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、驚くべきことに、通常は廃棄される材料である羊膜を乾燥することにより、羊膜が免疫学的に不活性になり、上皮をもたないが完全なECMを持つ膜が同種細胞での自発的なコロニー形成を可能にするので、自家ケラチン形成細胞の培養を要しないことを見出した。この所見に基づき、従来技術の不都合、すなわち従来の皮膚移植片によって起こる拒絶反応の問題を回避できる、以下に記載する本発明の方法を完成した。
【0012】
(本発明の方法)
上述のように、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトB型およびC型肝炎ウイルス(HBV;HCV)並びに梅毒が陰性の血清である母体の滅菌条件下にプログラムされた帝王切開物から収集された胎児の膜を使用する免疫学的に不活性な羊膜の製造方法に関する。
【0013】
本発明の方法は、
a.真皮および脱落膜の残留物から羊膜を分離し、
b.食塩水で羊膜を洗浄して、母側からの夾雑断片を除去し、
c.穿孔した金属シート上において羊膜を伸展しながら、ガーゼで乾燥し、かつ膜全表面をガーゼで被覆し、
d.穿孔した第二の金属シートでガーゼを被覆し、次いで閉鎖されたパッケージを構築するために、シートの二端を折り畳み、
e.閉鎖されたパッケージを滅菌スリーブ中に封入し、
f.閉鎖されたパッケージを、5%CO2を含有する雰囲気中において、37℃の温度で96時間保持し、
g.生理学的溶液(0.9%, NaCl)中で、膜を再水和し、
h.10%ジメチルスルホキシドを含有する培地中で膜を低温保存
する工程を含むものである。
【0014】
工程f)においては、膜の温度を約4℃とし、他の条件を一定に保持する。
【0015】
本発明はまた、本発明によって得られ、食塩溶液中での再水和によって回収される、免疫学的に不活性な羊膜を包含する。
【0016】
羊膜の再水和メジウムを構成する食塩溶液は、10 mM Hepesおよび2 mM L-グルタミンを含有するRPMIとすることもできる。
【発明の効果】
【0017】
本発明の膜は、
・2、3度の火傷を有する皮膚への移植、
・末梢神経の再生、
・角膜移植、
・膀胱および尿道の再構築、
・心房間および心室間短絡のような心臓の異常形成の矯正、
・弁器官の再構築
を目的とする適応物質の調製における用途が見出されている。
【実施例】
【0018】
乾燥羊膜が免疫原性をもたないことを確証するために、以下の試験を実施した。これらは本発明の範囲を制限するものと考えてはならない。
【0019】
(試験1)皮膚移植
試験動物
この試験には2.5月齢のWistarラット6匹を使用した。
実験操作
4×6 cmサイズの全層皮膚断片を、動物の背部から切り取り、同じサイズの膜断片で置換した。6/0の絹糸で縫合を実施した。対照動物は、同じ操作を行って、同じドナーからの新鮮な(生存)膜で、移植を行った。
【0020】
移植した膜および連続的な正常皮膚の小断片を、移植後様々な時間で、実験動物および対照動物の両者から収集し、組織学的分析を行った。
【0021】
図1は移植3週後におけるこの試験の結果を示す。図にみられるように、予め乾燥した膜を移植した動物では皮膚および毛皮は再生されるが、一方、生存膜を移植された動物では開口した創傷が見られる。さらに、予め乾燥した膜を移植された動物では、移植領域を剃毛した場合、正常な皮膚と膜の境が依然として肉眼的に確認できるものの、膜に相当する領域は、組織学的に正常な皮膚と識別できなかった。
【0022】
(試験2)神経の再生
試験動物
これらの試験には2.5月齢のWistarラット6匹を使用した。
【0023】
実験操作
1 cmの坐骨神経を切除し、ヒト羊膜チューブで置換した(図2)。
【0024】
神経再生の形態的および機能的評価は、すべての動物について、電気生理学的および組織学的解析により実施した。
【0025】
得られた結果は、免疫学的に不活性なヒト羊膜が、3〜4週後において完全に機能的が回復して、ニューロンの再生を促進し、新しい血管の形成を刺激すること。
【0026】
同種の実験が、最近、意図せずに上皮細胞を熱で死滅させた羊膜を使用して報告されている。この著者らは、膜は再吸収されると主張している(14)。この実験は神経の再生時間が著しく短いラットで行われたために可能であった。しかしながら、ヒトではこのようなことはなく、完全な神経の再生前の膜の再吸収は、結局のところ神経の成長を抑止する。
【0027】
本発明は記載した実施態様によって限定されるものではなく、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を単に例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
【0028】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】実施例1記載の実験の結果(移植3週後)を示す。
【図2】実施例2の実験の結果を示す。
【0001】
本発明は、滅菌条件下にプログラムされた帝王切開物(caesareans)から収集された胎児の膜を使用する免疫学的に不活性な羊膜の製造方法を開示する。本発明における免疫学的に不活性な羊膜は、2、3度の火傷における皮膚置換物として、末梢神経の再生を誘導する神経スリーブとして、角膜移植片として、膀胱および尿道の再構築において、心房間および心室間短絡のような心臓の異常形成の矯正において、ならびに弁器官の再構築において適用することができる。
【背景技術】
【0002】
広範囲にわたる火傷患者の特殊な症例では、自家皮膚供与部位の不足(1)により、急性期および再構築期のいずれにおいても、創傷の被覆が、依然として主要な問題となっている。したがって、永久的な皮膚置換物の開発に成功することは、このような患者のケアに対し大きなインパクトを与える。
【0003】
1910年に、Davisは(1として引用)皮膚移植の整形用材料として胎児膜(羊膜および絨毛膜)の使用を始めて報告したが、皮膚の同種移植片の場合と同様に拒絶反応が大きく、大きな成功には、到らなかった。
【0004】
皮膚は複雑な臓器である。それは、機械的に、二層、すなわち表皮および真皮からなる。第一の層は、細菌に対する障壁を付与し、4つの層、すなわち基底層、有棘層、顆粒層および角質層からなる。真皮はその網状のうねりで皮膚に対し強度および弾力性を付与する(2)。
【0005】
現時点において大部分の火傷創傷は、可能な限り速やかに、中間層自家移植片で閉鎖するのが最善である。しかしながら、この自家移植片は、全層の皮膚を置換するには不充分なものである(2)。
【0006】
それにもかかわらず、外科領域における羊膜の使用は拡大され、1940年代には4名の研究者が、様々な眼疾患の処置における羊膜の有益な役割について報告している(3)。現在では、羊膜は、たとえば、潰瘍を伴う持続性角膜表皮欠損(4 〜 6)、翼状贅片(7)等のある種の眼疾患の処置、および結膜表面の再構築に際しての優れた材料として認識されている。下腿潰瘍およびスティーブン-ジョンソン症候群の皮膚喪失における有益な効果、ならびに火傷および外科的創傷における一時的な皮膚の包帯としての有益な効果も報告されている(9)。
【0007】
数名の研究者らは、トリプシン消化および機械的な掻は(11, 12)の組み合わせで羊膜上皮を除去することにより予め露出させた羊膜のマトリックス上で、角質上皮の幹細胞を培養したが(10)この方法においては、羊膜が細胞増殖のための培養基としてのみ働く(11)。
【0008】
眼は古くから、その構造物の多くが血管化されることがなく、それ故免疫細胞が到達することができず、その構造物に対して反応することができない「免疫特権的な」部位として認識されている。他方、トリプシン消化は、細胞外マトリックス(ECM)を損傷し、コラーゲナーゼの活性化、ECMの分解、フィブリノーゲンの沈着および瘢痕形成を導く可能性がある。
【0009】
本発明は、完全なECMのままとしながらこの副作用を回避するものである。
【0010】
様々なタイプのポリウレタン膜様マトリックス(12)や非細胞性コラーゲンマトリックス(13)を用いて培養されたケラチン生成細胞に対して、多くの試みがなされてきた。近年において、皮膚移植片は、初期の自家移植片および同種移植片の調製物から、生合成及び組織工学的処理による皮膚置換物(13)へと進展してきている。その結果、火傷の処置に対する、新材料の利用可能性ならびに羊膜移植に伴う以前の失敗は、ほとんど放置されてたままである。しかしながら、組織工学処理ならびに用いられる培養基はきわめて高価である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、驚くべきことに、通常は廃棄される材料である羊膜を乾燥することにより、羊膜が免疫学的に不活性になり、上皮をもたないが完全なECMを持つ膜が同種細胞での自発的なコロニー形成を可能にするので、自家ケラチン形成細胞の培養を要しないことを見出した。この所見に基づき、従来技術の不都合、すなわち従来の皮膚移植片によって起こる拒絶反応の問題を回避できる、以下に記載する本発明の方法を完成した。
【0012】
(本発明の方法)
上述のように、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒトB型およびC型肝炎ウイルス(HBV;HCV)並びに梅毒が陰性の血清である母体の滅菌条件下にプログラムされた帝王切開物から収集された胎児の膜を使用する免疫学的に不活性な羊膜の製造方法に関する。
【0013】
本発明の方法は、
a.真皮および脱落膜の残留物から羊膜を分離し、
b.食塩水で羊膜を洗浄して、母側からの夾雑断片を除去し、
c.穿孔した金属シート上において羊膜を伸展しながら、ガーゼで乾燥し、かつ膜全表面をガーゼで被覆し、
d.穿孔した第二の金属シートでガーゼを被覆し、次いで閉鎖されたパッケージを構築するために、シートの二端を折り畳み、
e.閉鎖されたパッケージを滅菌スリーブ中に封入し、
f.閉鎖されたパッケージを、5%CO2を含有する雰囲気中において、37℃の温度で96時間保持し、
g.生理学的溶液(0.9%, NaCl)中で、膜を再水和し、
h.10%ジメチルスルホキシドを含有する培地中で膜を低温保存
する工程を含むものである。
【0014】
工程f)においては、膜の温度を約4℃とし、他の条件を一定に保持する。
【0015】
本発明はまた、本発明によって得られ、食塩溶液中での再水和によって回収される、免疫学的に不活性な羊膜を包含する。
【0016】
羊膜の再水和メジウムを構成する食塩溶液は、10 mM Hepesおよび2 mM L-グルタミンを含有するRPMIとすることもできる。
【発明の効果】
【0017】
本発明の膜は、
・2、3度の火傷を有する皮膚への移植、
・末梢神経の再生、
・角膜移植、
・膀胱および尿道の再構築、
・心房間および心室間短絡のような心臓の異常形成の矯正、
・弁器官の再構築
を目的とする適応物質の調製における用途が見出されている。
【実施例】
【0018】
乾燥羊膜が免疫原性をもたないことを確証するために、以下の試験を実施した。これらは本発明の範囲を制限するものと考えてはならない。
【0019】
(試験1)皮膚移植
試験動物
この試験には2.5月齢のWistarラット6匹を使用した。
実験操作
4×6 cmサイズの全層皮膚断片を、動物の背部から切り取り、同じサイズの膜断片で置換した。6/0の絹糸で縫合を実施した。対照動物は、同じ操作を行って、同じドナーからの新鮮な(生存)膜で、移植を行った。
【0020】
移植した膜および連続的な正常皮膚の小断片を、移植後様々な時間で、実験動物および対照動物の両者から収集し、組織学的分析を行った。
【0021】
図1は移植3週後におけるこの試験の結果を示す。図にみられるように、予め乾燥した膜を移植した動物では皮膚および毛皮は再生されるが、一方、生存膜を移植された動物では開口した創傷が見られる。さらに、予め乾燥した膜を移植された動物では、移植領域を剃毛した場合、正常な皮膚と膜の境が依然として肉眼的に確認できるものの、膜に相当する領域は、組織学的に正常な皮膚と識別できなかった。
【0022】
(試験2)神経の再生
試験動物
これらの試験には2.5月齢のWistarラット6匹を使用した。
【0023】
実験操作
1 cmの坐骨神経を切除し、ヒト羊膜チューブで置換した(図2)。
【0024】
神経再生の形態的および機能的評価は、すべての動物について、電気生理学的および組織学的解析により実施した。
【0025】
得られた結果は、免疫学的に不活性なヒト羊膜が、3〜4週後において完全に機能的が回復して、ニューロンの再生を促進し、新しい血管の形成を刺激すること。
【0026】
同種の実験が、最近、意図せずに上皮細胞を熱で死滅させた羊膜を使用して報告されている。この著者らは、膜は再吸収されると主張している(14)。この実験は神経の再生時間が著しく短いラットで行われたために可能であった。しかしながら、ヒトではこのようなことはなく、完全な神経の再生前の膜の再吸収は、結局のところ神経の成長を抑止する。
【0027】
本発明は記載した実施態様によって限定されるものではなく、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を単に例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。
【0028】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】実施例1記載の実験の結果(移植3週後)を示す。
【図2】実施例2の実験の結果を示す。
Claims (10)
- 滅菌条件下にプログラムされた帝王切開物(caesareans)から収集された胎児の膜を使用する免疫学的に不活性な羊膜の製造方法において、
a.真皮および脱落膜の残留物から羊膜を分離し、
b.食塩水で該羊膜を洗浄して、母側からの夾雑断片を除去し、
c.穿孔した金属シート上で該羊膜を伸展しながら、ガーゼで乾燥し、かつ該膜全表面をガーゼで被覆し、
d.穿孔した第二の金属シートでガーゼを被覆し、次いで閉鎖されたパッケージを構築するために、シートの二端を折り畳み、
e.閉鎖されたパッケージを滅菌スリーブ中に封入し、
f.閉鎖されたパッケージを、5%CO2を含有する雰囲気中において37℃の温度で96時間保持し、
g.生理学的溶液(0.9%, NaCl)中で該膜を再水和し、
h.10%ジメチルスルホキシドを含有する培地中で該膜を低温保存する
工程を含むことを特徴とする上記方法。 - 工程f)において、該膜の乾燥温度は約4℃とし、他の条件は同一とすることを特徴とする「請求項1」記載の方法。
- 「請求項1または2」記載の方法を使用して得られる免疫学的に不活性な羊膜。
- それらの回収が、食塩溶液中における再水和によって実施されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜。
- 2、3度の火傷を有する皮膚における移植を目的とした製品の製造に適用されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜の使用。
- 末梢神経の再生を目的とした長時間持続する神経スリーブの製造に適用されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜の使用。
- 角膜移植を目的とした製品の製造に適用されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜の使用。
- 膀胱および尿道の再構築を目的とした製品の製造に適用されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜の使用。
- 心房間および心室間短絡のような心臓の異常形成の矯正に適用されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜の使用。
- 弁器官の再構築を目的とした製品の製造に適用されることを特徴とする「請求項3」記載の免疫学的に不活性な羊膜の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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PT102589A PT102589A (pt) | 2001-03-30 | 2001-03-30 | Metodo para a preparacao de membranas amnioticas imunologicamente inertes |
PCT/PT2002/000005 WO2002079456A2 (en) | 2001-03-30 | 2002-03-27 | A method for the preparation of immunologically inert amniotic membranes |
Publications (1)
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP2002578459A Pending JP2004532675A (ja) | 2001-03-30 | 2002-03-27 | 免疫学的に不活性な羊膜の製造方法 |
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EP (1) | EP1383868A2 (ja) |
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BR (1) | BR0208712A (ja) |
CA (1) | CA2442827A1 (ja) |
IL (1) | IL158163A0 (ja) |
NO (1) | NO20034368L (ja) |
PT (1) | PT102589A (ja) |
WO (1) | WO2002079456A2 (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2007054015A (ja) * | 2005-08-26 | 2007-03-08 | Toyama Univ | 乾燥羊膜及び羊膜の乾燥処理方法 |
Families Citing this family (16)
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WO2007023750A1 (ja) * | 2005-08-26 | 2007-03-01 | National University Corporation University Of Toyama | 乾燥羊膜及び羊膜の乾燥処理方法 |
CA2949643C (en) | 2005-09-27 | 2018-05-15 | Tissuetech, Inc. | Amniotic membrane preparations and purified compositions and methods of use |
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