JPH06503735A - 創傷用包帯剤およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷用包帯剤およびその製造法 本発明は、表皮および少なくとも真皮の構成部分が失われた創傷の治療にとくに 適するがそれに限られることのない、皮膚細胞を担持する創傷用包帯剤に関する 。このような創傷は、たとえば、火傷、下肢の潰瘍、圧迫による壊死および皮膚 移植提供部位を含む。

皮膚細胞はインビトロでは液体培地の懸濁液中で増殖することができない。しか しながら、適した基体（＋ｕｂｓｔ＋ａｔｅ）の表面上ではインビトロにおいて 増殖か可能であり、適切な条件下では層状のコロニーに増殖し、最終的にはコン フルエントな層（ｃｏｎｌｌｕｅｎｔ　１ａｙｅ「）を作る。基体は、たとえば 合成ポリマーまたはコラーゲンであってもよい。培養された皮膚細胞は培養フラ スコまたはほかの培養容器のポリスチレンの表面に接着（ａｄｈｅｒｅ）しうる 。

前記の方法で増殖した培養された皮膚細胞を徹者に移すことは多くの問題を引き 起こす。たとえば、培養フラスコから培養された皮膚細胞層を、酵素の助けによ りうまく除去することができたとしても、除去操作は多大な注意を必要とし、い ずれにしても研究所および臨床的な環境の両者において取り扱うことが困難なき わめてぜい弱な産物しかもたらさない。しかしながら、このタイプの細胞培養物 は皮膚の増殖を研究するために用いられ、皮膚移植片として臨床的に用いられて いる。

ディー　アッセリニュ−（Ｄ　Ａｓ５ｅｌｉｎｅａｕ）およびエムプルニエラス ｆＭ　Ｐ＋ｕｎｉｔ＋ａｓ１　による、ブリ・ソト　ンエイダーマトロう／イ（ Ｂａｉｔ　Ｉ　Ｄｅ＋ｍａ１ｏｌＯｇｙｆ１１１、付録２７．２１９〜２２２１ ［（１９８４１には、架橋していないコラーゲン上で培養された線維芽細胞の格 子に表皮細胞をインビトロで播くことｆｉｅｅｄｉｎｇ）か記載されている。容 易に取り扱いうる格子の必要性か確認され記載されている。４．５ｍｇの仔維芽 細胞と、１０％ウシ胎児血清が添加されたイーグルＭＥＭに基いた培地中で混合 して格子を作る。しかしながら、その格子はたった５〜６ｇの垂直引張り破裂強 度（ｖｅ「ｔｉｃａｌ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ＴｕｐｌｕＴｅ　＋＋＋ｅｎＨｈｌ 　Ｌかない。

ジェイ　エフ　ブルク（Ｉ　Ｆ　Ｂｕ＋ｋｅ）　らによる、アンサーブ（Ａｎｎ 　Ｓｕｎｇ）　９４．４１３頁（１９８＋）には、ゲルの形態の滅菌可能な人工 真皮を形成するためにグルタルアルデヒドを用いて架橋されたコラーゲン−コン ドロイチン６硫酸複合体を臨床的に使用することが記載されている。この人工真 皮はサイラスティックの人工表皮と組合わせて用いられる。人工真皮は創傷床に 移植され、人工表皮で覆われる。前者は新しい結合組織の合成のための鋳型（ｌ ｅｍｐｌａｔｅ）として役立つ。人工真皮はしだいに、人工真皮に侵入する新し い結合組織マトリックスにおいて増殖する線維芽細胞の個体群のホストとなり、 血管新生が生じる。人工真皮は最終的にはバイオ−同化（ｂｉｏ−ａｂｓｏ＋ｐ ｔｉｏｎ）　されるか、保護的な人工表皮はそのままであり、発生した新生真皮 を露出することか臨床的に適当なばあいには、除去することかできる。それに続 いて新生真皮の上皮による被覆が、除去された人工表皮のかわりに表皮の自己移 植片を供給することにより生じる。

イー　ベル（Ｅ　Ｂｅ１ｌ）らによる、サイエンス（Ｓｃｉ＝ｎｃ＋ｆ２＋１． １９８１年３月６日、１０５２〜１０５６頁には、同しネズミのトナーからえら れた自己由来の線維芽細胞と架橋していないコラーゲンの格子の成型体（＋　ａ 　Ｓ））からなる前移植片（ｐｉｅ−Ｈａｌｔ）に自己由来のネズミの表皮細胞 をインビトロで播くことか記載されている。表皮細胞は格子をすみやかに覆い、 角質化する多層の人工表皮を生じるように分化する。えられた移植片はドナーに 自己移植され、通常、良好な生着および血管新生が見られた。

ビー　イー　ハル（Ｂ　Ｅ　Ｈｕｌｌ）らによる、「ア　クリニカル　トライア ル　オブ　バイオレイヤード　スキンイクイバレンツ（Ａ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　 Ｔｒｉａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌａｙｅ＋＋ｄ　５ｋｉｎＥｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ） 　Ｊ　、サージエリ−（Ｓｕｒｇｅｒｙ）　！０７　（５）、４９６〜５０２頁 には、同種の線維芽細胞と架橋していないコラーゲンを組合せることが記載され ている。えられたマトリックスは自己由来の表皮細胞の層で覆われ、インビトロ で培養された。架橋していないコラーゲン自体であらかじめ経験したインビトロ での増殖に比べて、表皮の増殖は線維芽細胞−コラーゲンマトリックスにおいて 改善された。予期されたように、ネズミの移植において、えられた同種移植片は 免疫の拒絶の標的とはならず、この点において同種の線維芽細胞のみで占められ た架橋されていないコラーゲンマトリックスからなる移植片と同等に機能した。

同様の成果がイー　ベル（Ｅ　Ｂ！ＩＩ）らによる、ジャーナル　オブ　インベ スティゲイティブ　ダーマトロジー（ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｌｎｖ＋＋ｔｉｇ ａ＋ｉｖｅ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）８１．２５〜＋０５頁ｔ＋　９８３）に 、インビト０において、架橋されていないコラーゲンマトリックス中に線維芽細 胞を含んで構成される真皮の等個物ｆｄｅ＋ｍａｌ　＋ｑｕｉｖａｌｅｎ＋：　 上を１うケラチノサイトから、表皮組織か発達することが記載されている。

イー　ベル（Ｅ　Ｂｅ１ｌｊらによる、プ０シーディング　オブ　ナチュラル　 アカデミ−オブ　サイエンス　オブザ　ユナイテッド　ステイッ　オブ　アメリ カ（ＰｒＯＣＮａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）　７６　＋３）、１９７９ 年３月、１２７４〜１２７８頁には、インビトロで基体として格子を用い線維芽 細胞が成長し増殖する際、水和した架橋されていないコラーゲン格子の相当な収 縮が生じることが記載されている。基体面積において本来の面積の約３％に減少 することが報告され、インビボにおける創傷治癒のあいだの生理学的なコラーゲ ンおよびほかの線維状の生理学的なタンパク質との細胞相互作用の収縮効果の原 理と比較されている。

コラーゲン基体上での皮膚細胞の培養はほかにも広く記されており、相当な研究 の努力の課題となっている。

皮膚細胞を架橋されていないコラーゲン基体で培養することは、たとえば、エイ 　エルダッド（Ａ　Ｈｄａｄ）　らによる、バーンズ（Ｂｕｒｎｔ）　１３．１ ７３〜１８０頁（１９１１７＋およびエイチ　グリーン（ＨＧ＋ａｅｎｊ　らに よる、プロシーディングオブ　ナチュラル　アカデミ−オブ　サイエンス　オブ 　ザ　ユナイテッド　スティン　オブ　アメリカ７６．５６６５〜５６６８頁（ ＋９７９）にも記載されている。

さらに、架橋していないコラーゲンの移植片に関連する取り扱いの困難さに加え て、培養された皮膚細胞の移植後の生着率は低いことがしだいに明らかになって きた。

このことは、たとえば、アール　フィリップ　アンドビー　ギルチレスト（ＲＰ ｈ１ｌｉｐ　ａｎｄ　Ｂ　Ｇ１１ｃｈ＋ｅｉｔ）らによる、ジェイ　ダーム　サ ーブｌ　ＩＩ　Ｄ＋＋ｍ　ＳｕＢ　ｌ！　＋５．１１６９頁（１９８９）に報告 されている。これはある程度は創傷床の機能不全、創傷床の感染および移植片の 機械的強変が実際に小さいということのために、それが移されるばあいに移植片 中の細胞層に損傷を与える結果でありうる。

前記の文献の内容かられかるように、最近の多くの技術は、上皮細胞がその上に 培養されて２層を形成するような線維芽細胞−コラーゲン格子の偽真皮（ｐｓｅ ｕｄｏｄｅ＋ｍ口）の提供に集中している。この偽真皮は、線維芽細胞が播かれ た架橋されていないコラーゲンゲル上の皮膚細胞とポリスチレンの培養皿の成型 体（ｃａｓｔ　ｉｎａ　ｐｏ１７ｓｔｙｒｅｎｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈ） からなる。線維芽細胞はコラーゲンゲルを作り直し、収縮させてより容易に取り 扱いつる構造を生み出す。線維芽細胞は上皮の移動およびコラーゲンゲル基体の 表面での増殖を改善すると信じられている。これは以前にはハル（Ｈｕｌｌ）ら 、およびクーラン（Ｃｏｕｌｏｍｂ）　らにより、ジエイ　インベスティゲイテ ィブ　ダーマトロジ−９２、＋２２頁（１，９８９）に記載されている。これら の皮膚等個物は、それらの相対的な耐久性および取り扱いの特徴は別にして、天 然の基体を提供することによって肉芽組織を形成させ、血管形成を生じさせて創 傷の治癒をうながす。同種の線維芽細胞を播くことにより架橋していないコラー ゲン−線維芽細胞格子があらかじめ調製される。自己由来の表皮を後に播くこと で免疫拒絶の対象とならない同種移植片が生ずる。

しかしながら、架橋していないコラーゲンゲルを基体として用いることにはいく つかの欠点がある。架橋していないコラーゲンゲルは容易に滅菌することができ ず、このことにより、コラーゲン基体物質を基体として使用するために容易に利 用しうるようにすること、および線維芽細胞−コラーゲン格子を表皮の迅速な後 培養のために利用しうるようにすることに必要不可欠な保管に問題が生ずる。ド ナーからの感染の伝達の可能性があるために、同種移植片格子の保管に関しては とくに危険がある。

使用の際には、感染の危険を減らすために抗生剤および無菌技術に依存する必要 があるか、このことは滅菌より信頼性がなく、めんどうで費用がかかる。架橋し ていないコラーゲン細胞のさらなる欠点は、移植片として患者（二連用するばあ いは、線維芽細胞の影響で収縮し続けるつ・もしれないということである。

このことは、肥厚性搬痕の危険性の増加、つまり明らかに望ましくないことを結 果として生じうる。おそらく、さらに重要なことには、移植片を患者に移す前に 上皮細胞層を充分にコンフルエントにさせることが通常必要である。インビトロ において上皮のコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）は通常１４〜２１日で 達する。これはしばしば、たとえば、吸音が緊急の閉鎖を要求する火傷を負った ばあいの移植治療において、あまりにも長くかかりすぎる。

このことは、自己移植をすることが多くのばあい実際には避けられることを意味 してきた。免疫抑制治療法と組み合わせた同種移植がそのかわりに利用できるが 、これは常に可能ではなく、前記のように、免疫抑制剤の副作用と同様、移植ト ナーと吸音との間の交差感染（とくにウィルス性の交差感染）の危険性をはらん でいる。

本発明の第１の目的は架橋されたコラーゲンからなる滅菌した細胞成長支持基体 および担持ｉｃａ＋＋ｉｎｇ・皮膚細胞からなる創傷用包帯剤を提供することで ある。

架橋されたコラーゲンは実質的に無水であってもよいか、スポンジ様構造を有す るように多孔性であってもよく、これは決して厳密には必須ではない。

包帯剤は表皮細胞および真皮細胞のいずれかまたは両者を含んでなってもよいが 、本発明は培養された表皮細胞担持体として特別な適用性を有する。包帯剤は、 たとえばケラチノサイト、線維芽細胞などの上皮細胞または内皮細胞を含んでな ってもよい。臨床に用いる好ましい包帯剤は、コラーゲンのすき間に侵入できる 培養した線維芽細胞および少なくともサブ−コンフルエンス（ｓｕｂ−ｃｏｎｌ ｌｕｅｎｅｅ）に達した培養した上皮層を含んでなり、臨床に用いるという点で は２種の細胞の培養が有利であり、自己由来の細胞培養物は宿主（患者）からの 免疫学的拒絶がほとんどまたはまったくないために、培養された自己由来の上皮 細胞を用いることが好ましい。驚くべきことに、創傷床に移された創傷用包帯剤 が満足な生着の可能性を有する前に、上皮細胞層が架橋されたコラーゲン基体上 で確実にコンフルエンスに達する必要がないことがわかった。しかしながら、都 合のよいことに、細胞は移す前に少なくとも３０％好ましくは４０％、最も好ま しくは５０％以上のコンフルエンスに達するへきである。播かれた初めの上皮細 胞の密度が！、　２５Ｘ　１０５細胞／’ｃｍ２とすると、上皮が５０％コンフ ルエンスに到達するためには５〜７日間要することがわかった。フルコンフルエ ンス（ｌｕｌｌ　ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）　は７〜１０日間の期間で達しうるが 、ローリ−の方法（＋９７５）を用いると、フルコンフルエンスのための必要条 件は、最小て６．２５Ｘ　ｔｏ４細胞ｙ’Ｃｆｎ−の播種密度で載る、前述のよ うに製造された、架橋されたコラ−ケン基体は、哺乳類動物の真皮およびに皮て 通盾みられる４−＜ての夕１′プの細胞の増殖を支持するであろうし、とくに、 内皮細胞と同様に、線維芽細胞およびケラチノサイトならびにほかの上皮細胞の ためのずっと改良された培養環境を提供する。線維芽細胞は多孔性の架橋された コラ−ケンマトリックスを通って移動し、その中で分裂する。そして架橋してい ないコラ−ケンにおけるよりも早くコロニーをつくり、包帯剤の顕著な収縮なし に基体を作りかえるｆ＋ｅｍｏｄｅｌ）。

本発明の特別な具体例では、特定の創傷を負ったα者に供される同種移植片また は自己移植片の前駆体の形態で包帯剤が提供され、多孔性の架橋されたコラーゲ ンマトリックス中で培養された同種のまたは自己の線維芽細胞を何する多孔性の 架橋されたコラーゲンマトリックスと任意には自己由来の上皮の表面デポジショ ン（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）または自己由来の培養された上皮の表面サブ−コン フルエンスとからなる。

架橋されたコラーゲン基体は一般的には適合するシートの形態である。「ンート ゴという用語は、一般にその厚さに比べて相当広い弔たく平行な向かい合った表 面を何する本体１ｂｏｄｙ）の意味を表現するための便利な用語として用いられ 、ストリップの形態のコラ−ケン基体を含む。

基体は商業的に入手可能な天然のいかなるコラーゲン、たとえばウシ脚コラーケ ンなとから生産されてもよい。

一般的には、コラーゲン出発物質は、酵素的に消化された均一なゲル様水性ディ スパージョンに変換され、ひき続いて成型され１ｃａｔ口、乾燥されて工（有結 合的に架橋されうる。コラ−ケンの消化に適する酵素はペブンンを含む。コラー ゲンの酵素的な消化は水の存在下で行なわれ、えられたディスパージョンは一般 的にホモジナイズされ、濾過されて注ぐことのできる　（ｐｏｕｚｂｌ＋）液体 をえる。

フィルターの孔の大きさは、たとえば２００７１ｍより小さくてよい。好都合に は、フィルターの孔の大きさは１５０μｍより小さく、好ましくは１２０μｍよ り小さいであろう。しかしながらフィルターの大きさは７０μｍより大きく、好 ましくは９０１１ｍより大きく、たとえば１００１１ｍなどが好都合である。

コラーゲンディスパージョン中のコラーゲンの濃度は最終産物の性質と、ディス パージョンが有用な物理的形態に変換されるように成型することの実用性との間 のバランスとして通常選ばれる。コラ−ケンゲルディスパージョン中のコラーゲ ン濃度は、０．１重量％を超えるのが好都合である。０．２５重量％より大きい 濃度が好ましく、とくに０５重量％より大きいコラーゲンゲル濃度が好ましい。

コラーゲン濃度は、あるばあいではわずかに大きいかもしれないが、好ましくは 約２重量％であればよい。

好都合には、コラーゲンディスパージョンは成型されてシートを形成する。

コラーゲンの成型シートの厚さは、最終的な包帯剤で埋められる創傷の深さに依 存し、適合性のために実際のニーズによって強いられる限定に通常は従う。成型 コラーゲンシートの厚さは一般的には２０ｍｍより大きくなく、また、０．５１ より小さくもなく、概して１〜１０ｍｍである。

実際には、皮膚細胞の培養物を扱い、運ぶのに充分な厚さおよび適合性に充分な 薄さであるへきである１、コラーゲンの厚さは実際には、とくに基体が多孔性の 形態であるばあいに、架橋されたコラ−ケン基体によって運ばれる細胞まで栄養 物か届くことを許容できないほどは制限しない。実質的に最終的な包帯剤の厚さ は実際に可能であるし、皮膚の輪郭をもとに戻すために深い創傷の創傷床をつく りあげることを可能とする。

成型されたコラーゲンシートの乾燥は、実際しばしば効果的な架橋を容易にする ために架橋の前に達成され、凍結乾燥が好ましい。しかしながら、架橋は結果と して前乾燥（ｐｉｅ−ｄｙｉｎｇ）をもたらしうる。

このようにして成型されたシート状コラーゲンは好都合にはグルタルアルデヒド またはホルムアルデヒドを用いて架橋されつる。しかしながら、これら以外の架 橋剤、たとえばジアミン類、イソシアナート類およびジカルボン酸類も用いられ うる。ホルムアルデヒドが好ましい。

典型的な架橋方法は成型したコラーゲンシートをホルムアルデヒドを用いて蒸気 なめしする（ｖａｐｏｒ　ｔａｎｎｉｎｇ）ことからなる。

本発明に使用するのに適した前処理された商業上入手可能な架橋されたコラーゲ ンは商標名コラスタット（ＣＯＬＬＡＳＴＡＴ）で販売されている。

同様の架橋されたコラーゲンは、再結合ｆ＋ｅｎａｔｕ＋ｅｊおよび共有結合的 に架橋されているコラーゲンてあり、約１〜２重量％のコラーゲンを含有する溶 液でｐＨ３，０〜５０の緩衝液中にトロポーコラ−ケンを溶解することを含む手 順において、たとえばジアルデヒド類、ジカルボン酸類およびジアミン類などの 容易に入手可能な多機能性架橋剤を利用する。そののち、１％のたとえばグルタ ルアルデヒド、ホルムアルデヒドなとのジアルデヒド架橋剤を加え、その混合物 は凍結され約２４時間保管される。

本発明の使用に好ましい基体は、４０°Ｃ〜８５°Ｃ（典型的には５５℃〜６５ ℃）の範囲の収縮温度（＋ｈ＋ｉｎｋ＋＋ｍｐｅ＋ａ！ｕｚ）で架橋されたコラ ーゲンのものである。

いかなるばあいでも、架橋後のコラーゲンシートは一般的に適したサイズに切断 し、細菌耐性の小袋に包装され、最終的に滅菌される。好ましい滅菌方法は小袋 に封をしたのちに行なわれるγ照射であるが、そのかわりの方法として、エチレ ンオキサイドガスを封する前に架橋されたコラーゲンと接触するように導入して もよく、残った量のエチレンオキサイドは小袋に含まれていてもよい。

架橋工程後に存在しているかもしれない残りの架橋剤は、皮膚細胞の増殖を支持 する基体としての架橋されたコラーゲンの使用に対して細胞毒性作用をもつ可能 性があり、この目的で基体を用いつる（ｖｅａｂｌｅ）ところまで除去されるべ きである。除去は通常洗浄によって行なわれるであろう。好ましい洗浄は滅菌し たリン酸塩緩衝生理食塩水による洗浄である。望ましくは、ホルムアルデヒドの 残余が０．０２ｍｇ／　ｇを超えるべきではない。なぜなら、これを超えるレベ ルでは皮膚細胞毒性を示すであろうと思われるからである。

創傷用包帯剤用の架橋されていないコラーゲンの公知の使用においてコラーゲン の孔径は多様てあり、たとえば血管形成に加えて線維芽細胞の増殖および基体侵 入にで本質的な特徴ではないが、線維芽細胞の培養に有利であるので、多孔性の 基体に基づく包帯剤は本発明の好ましい実施態様を表わす。実際のところ、本発 明に用いられる基体の多孔性の特性は、基体のボディ内への線維芽細胞の移動が 適応するように選択されるであろう。そして、この目的のために孔径は１０μｍ およびそれより大きいものが望ましい。基体における最小孔径は好都合には２０ μ口またはそれより大であり、たとえば、３０μｍより大きな（たとえば５０μ ｍ）最小孔径であることが実施上好ましい。本発明にしたがって使用される基体 における孔径の範囲は一般的には１０００μｍより小さい最高限度をもつであろ う。最高限度が３００μｍの孔径をもつ包帯剤が効果的である。適切な最大孔径 の例は１７５μｍまたはそれより小さいもの（たとえば１５０μｍ）である。し たがって、好ましい実施態様における孔径は２０〜３００μｍまたとえば、２０ 〜２５０　μｍまたは５０〜３００μｍの範囲であろう。

架橋されたコラーゲンは平均孔径が５０〜１５０μｍの範囲にある多孔性構造を もっておればよく、好都合には孔は２０〜２５０μｍの径分布をもつ。

本発明に用いられる多孔性基体は、間に（ｉｎｔ＋＋＋１Ｎｉａｌｌｙ）液体培 地および成長ホルモンを含有しうる。

皮膚細胞は本発明にしたがって使用される基体に播かれうる。

本発明による包帯剤における上皮細胞は、空気　液体界面で基体表面を提供する 液体培地に浸された基体で一般的にコラーゲン基体上に増殖する。前記細胞は界 面で成長し、層をなし分化する。成型した基体において、生産においてその上で 基体が成型されるようなその表面は細胞の成長のためにより滑らかな表面を作り 出す。したがって、この表面は好ましくは空気　液体界面にさらされるべきであ る。

好都合には、基体は成長すべき細胞のデポジションを受けいれるためにさらされ るこのような表面を有する積層された２層（ｌａｍｉｎａＮｄ　ｂｉ−ｌａｙｅ 「）の形状であッテもよい。

表面の滑らかさにおける有益な改良は、皮膚細胞を担持するための架橋されたコ ラーゲンフィルムの第１の層（たとえば、５重量％またはそれより多いコラーゲ ン、好ましくは５〜８重量％のコラーゲンを含有するコラーゲンディスパージョ ン（ｄｉｓｐｅ［５ｉｏｎ）からの１成型体（ｏｎｅｃａｌｌ））を、架橋また は架橋されなくてもよい第２のコラーゲン層（たとえば、コラーゲンスポンジ） に、典型的には基体の第２の層が成型されたその表面に、積層することによって 達成されつる。直前に示したように、第２の層は架橋されていてもよいが、実際 上は第２の層は架橋されないことが好ましい；第２の層が架橋されるばあいは、 好都合にはフィルムコラーゲンは第２の層におけるコラーゲンと実質的に同程度 に架橋されていればよい。実際、本発明に用いられる架橋されたコラーゲンスポ ンジは少しばかり架橋されていることだけを必要とする。フィルムの第１の層は 好都合には実質的に無孔性であってもよい。

表面の滑らかさは線維芽細胞の培養にはあまり重要ではない。線維芽細胞は、基 体表面にのみデポジットされるときでさえ、多孔性の架橋されたコラーゲン基体 中に移動する。しかしながら、培養用の線維芽細胞はコラーゲン中の液体培地お よび増殖によって多孔性コラーゲンのボディ内に通常担持される。

当然、皮膚プラグ（ｐｌｕｇ＋）などの組織断片は培養用の細胞を供給するため に使用しうる。好都合には基体はこのような組織断片を受け入れるために基体中 に入れ物を供えている。宿主（患者）からの自己由来の皮膚プラグは切開され、 コラーゲンマトリックスにおける対応する穴に配置されうる。このようなプラグ は典型的には直径２〜３ｍｍであろう。これは下肢の潰瘍、外傷性の切開および 圧迫による壊死への適用のために緊急性をともなって使用しうる、迅速に移しう る包帯剤を供給する。皮膚細胞は皮膚プラグからコラーゲンマトリックス中へお よびコラーゲンマトリックス上に本来の場所に移動し、続いてそのマトリックス は創傷の中へ再び吸収される。このことにより即時に処置がなされ、当然の順序 を負って自己移植することによって創傷が閉鎖されるであろうが、比較的離れた 創傷口の端と端の間の領域にわたる本来のコンフルエンスのスピードは、満足な 創傷の閉鎖やおそらくは患者の生存のために要求されるような、重度の広範囲に わたる火傷の損傷のばあいは不適当な能率を示す。

同種移植は免疫拒絶を受け、またこの分野で知られている他の基体を用いてコン フルエンスを移すために上皮の自己移植片を生産する培養時間は一般的に吸音の 受け入れ（ｐａｔｉｅｎｔ　ａｄｍｉｔｔａｎｃｅ）から１４〜２１日という期 間であるので、本発明による包帯剤は実に驚くべき意味をもつ。

同種移植片は事前に生産された貯蔵から入手できなげればならないし、自己移植 片は人手できないか、遅い処理にのみ入手可能か、または計画された手術法（た とえば、プラスチック手術法などのばあい）にのみ敏速に入手可能であるという のに対して、本発明は短期間、おそらくわずか５日間で、事前に計画や貯蔵を必 要とすることなく入手可能な、移植コンフルエンス（ｌｚｎ＋ｌｅ＋ｃｏｎｌｌ ｕｅｎｃｒ）に達した移植片を可能にする。

本発明の全ての実施態様において、記載された創傷用包帯剤は患者自身の皮膚組 織による適切な置換をともなって１４日後に再吸収されうる。本発明の特別な特 徴は、創傷の中に配置されたときにコラーゲンマトリックスは著しくは収縮しな いので、肥厚性搬痕の発生の危険性が減じられることである。

架橋されたコラーゲン基体は容易に滅菌することができ、貯蔵と使用の困難性を 減じる。培養において線維芽細胞を播いても、基体は著しくは収縮しない。この ことは、包帯剤が、使用における実施上の利点を与える細胞を播く段階における のと移植される段階とでサイズが実質的に同じであることを意味する。

第２の見地としては、本発明は、キットの使用において上皮細胞のデポジットを 受け入れるための基体として働く滅菌した架橋されたコラーゲンシートを収容す るパッケージ、および前記コラーゲンシートを収納するような寸法に作られた滅 菌した培養容器からなる皮膚移植キットを提供し、前記のコラーゲンシートおよ び培養容器は細菌不透過性膜（ｂａｃｔ＋＋ｉａｌｌｙ−ｉｍｐｅ＋ｍｅａｂｌ ｅ　ｍｅｍｂｒａｎ＋）によって限定された滅菌環境のなかに配置される。パッ ケージは細菌不透過性膜を限定する壁）ｗａｌｌ　ｄｅｆｉｎｉｎｇｔｈｅ　ｔ ＋＋ｃｔｅ＋ｉａｌｌｙ−ｉｍｐ＋＋ｍｅａｔ＋ｌｅ　ｍ＋ｍｂ＋１ｎｅ）を提 供しうる。

また、当然、パッケージは前記コラーゲンシー１・および前記培養容器を含む殺 菌不透過性模エンベロープ、または前記コラーゲンシートおよび前記培養容器を 別々に含む２つの前記のようなエンベロープを収容する。コラーゲンシートは前 培養された線維芽細胞を支持し、凍結されうる。

本発明はその範囲内に、前述された好ましい特徴をもつ、架橋されたコラーゲン の皮膚細胞培養基体を生産する方法をも含む。その方法とは哺乳類の皮膚細胞に 付随的に細胞毒性を示す架橋剤を用いて架橋されたコラーゲンシートを処理して 、架橋反応によって消費されなかった架橋剤を除去することからなり、その処理 はシートが皮膚細胞培養物を支持しうる能力が、基体上にデポジットした皮膚細 胞の８０％がデポジット後１２時間生存することで示されるまで継続される。

本発明はその範囲の中に、架橋されたコラーゲンからなる滅菌した細胞成長を支 持する基体、および本来の成長のために内部の創傷の部位で内皮または他の組織 を供給する、担持する（ｃａ＋Ｂｉｎｇ）内皮細胞または他の組繊細胞からなる 、内部に移植可能で生物学的に吸収可能な創傷治療デバイスを包含する。

また、本発明は創傷の治療方法をも含み、その方法とは、直前に記載したような 移植可能なデバイスを創傷に内部的に適用する本発明による創傷用包帯剤を、創 傷（たとえば、末梢性の創傷）に適用することからなる。

先に述べたように、創傷はもし外因的であれば、火傷、下肢の潰瘍または皮膚移 植提供部位でもよいし、あるいはとこずれまたはその池の圧迫による壊死であっ てもよい。包帯剤は全層および部分的な厚さの皮膚創傷のいずれにも有用であり 、深い創傷には皮膚の輪郭（ｐ「ｏｆｉｌｅ）を回復するように創傷をうめる（ ｐａｃｋ　ＱＩＩ＋）のに充分な厚さのものであればよい。

美容的な目的として、本発明は外科的または非外科的な穿孔の外傷を負っている 動物の体の皮膚表面に局所的・に適用される美容的な皮膚治療方法を提供し、そ の方法とは前記表面に本発明による創傷用包帯剤を適用することからなるもので ある。

本発明の範囲内には、皮膚細胞および前記皮膚細胞が接着する架橋されたコラー ゲン基体からなる生きた組織移植片を生産するための、皮膚細胞のインビトロ培 養用の基体としての架橋されたコラーゲンの使用が含まれる。

以下の特定の実施例によって本発明を例示する。顕微鏡写真はつぎのような図面 をあられす。

図１は、皮膚プラグをコラスタットに配置して１２日後、皮膚プラグからの上皮 の外植がないことを示す、２０倍で観察された顕微鏡写真である。

図２は、コラスタット上で１３日間培養された表皮細胞のニュートラルレッド染 色を示す、１０倍で観察された顕微鏡写真である。

図３は表皮細胞を播き１３日間培養したコラスタットの組織断面（ヘマトキシリ ン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）　；１０倍観察）を示す。

図４は４日間コラスタット包帯剤の最上部で成長した培養上皮のディスパースｆ ｄｉ＋ｐａ＋ｅ）　されたシートを間接的に免疫学的パーオキサイド染色した顕 微鏡写真である。

実施例１ 上皮を、皮膚プラグから培養した。一連の直径２〜３ｍｍの幼若な包皮の皮膚プ ラグを手術中に廃棄されたヒト包皮組織から切開した。皮膚プラグが適応する穴 をコラスタットシート中にあけ、プラグを穴中に配置した。えられた培養物をそ れぞれ基本的には、バーロウ　ワイ（Ｂａｌｌｏｔ　Ｙ）およびビイ　アール　 ジエイ（Ｐｙｅ　ＲＩ）のケラチノサイト　カルチャー　イン　メソッズ　イン 　モレキュラー　バイオロジー、１９９０年、第９章、ヒューマナプレス（Ｋｅ ＋ａｌｉｎｏｃｙ！ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｉｎ　Ｍｅｊｈｏｄ＋　ｉｎＭｏｌｅ ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１９９０．Ｃｈ　９．Ｈｕｍａｎａ　Ｐｏｅｔｓ） に記載されたバーロウおよびビイの方法を用いて育てた。

１２日後、組織学的に調べたところ、図１に示されるように（図１において、ａ は皮膚プラグの表皮であり、ｂは真皮であり、Ｃはコラスタットマトリックスで ある）、皮膚プラグからの上皮の外植は見られなかった。幼若な包皮を正確に配 置することは、その柔軟な性質ゆえに非常に難しく、上皮細胞の効果的な成長の ために皮膚表面はコラスタットと同平面上にあるべきである。外植がないことは 、また、皮膚プラグの厚さ全体を通して培養栄養物の拡散がうまくいかなかった 結果でもありえ、この推測は皮膚プラグの組織学的試験においてみられた組織の 退化によっていくぶんサポートされる。

実施例２ コラスタット上に上皮細胞を播くことによって上皮を培養した。手術中に廃棄さ れたヒト包皮組織から単離さシート包帯剤に播いた。実施例１において述べたケ ラチノサイトの培地を用いる基礎培養法（ｌＢＢｌｌｆｅｅｄｉｎｇ）を採用し 、播いた細胞をバーロウ　ワイおよびビイ　アール　ジエイのケラチノサイト　 カルチャー　イン　メソッズ　イン　モレキュラー　バイオロジー、１９９０年 、第９章、ヒューマナプレスにおいて述べられた方法にしたかって培養した。組 織学的試験によって、１．５Ｘ１０６細胞の密度で播かれた培養のばあい２０日 後に実質的な上皮細胞の成長が明らかにされる。高播種密度の培養のばあい１３ 日後に、図２に示されるように（図２において、ａは表皮細胞を示し、ｂはコラ ーゲンマトリックスを示す）、上皮細胞の表面の広がりをともなって広範囲にわ たる均等な上皮の発達が観察され、図３によって表わされるように（図３におい て、ａは表皮細胞を示し、ｂはコラーゲンマトリックスを示す）、コラスタット のボディ中への上皮のいくらかの移動が観察された。

実施例３ コラスタット上で上皮のコンフルエンスを培養した。

表皮細胞（約５．２５Ｘ　１０’細胞ｃｍ−２）を培養フラスコ中で前記のバー ロウおよびビイの方法にしたがってコンフルエンスまで培養した。えられたシー ト表皮は培養フラスコからディスパース（ｄｉｓｐａ＋ｅ）　され、反転するこ となくコラスタットシートに移した。えられた培養物を４日間基本的には実施例 １に記載された培地で育てインキュベートした。上皮の発達はインキュベーショ ン後に調べた。

結果は図４に示す（図４において、ａはコラスタット包帯剤の最上部上における 培養した上皮の成長を示し、ｂは上皮のコラーゲンにそった多孔性構造中への移 動を示し、ｃはコラ−ケンマトリックスを示す）。

実施例４ 線維芽細胞および内皮細胞をコラーゲンマトリックスの中で成長させた。ヒト真 皮の線維芽細胞およびウシ内皮細胞を、４×１０　細胞ｃ１１−２の濃度で１０ 重量％の胎児仔ウシ血清を加えたＤＭＥＭからなる１〜２ｍｌの培地であらかじ め水和したコラスタットシート包帯剤上に播いた。培養物を３７℃で１１日まで インキュベートした。選択した包帯剤をトリチウム標識チミジン（”ＨＴｄＲ） を用いテ種々の時点でパルスラベルした（　３）ＩＴｄＲは、ＤＮＡを合成する 細胞によって利用されるので、細胞成長の指標である）。

３ＨＴｄＲの細胞取込みの評価は選択した培養物を３ＨＴｄＲとともに４時間イ ンキュベートすることによって行なった。

そののち、このように処理された包帯剤の各々を数回、焼結されたガラスフィル ター（有孔性Ｇ３）上、氷冷したリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳＩ　中種やか な真空下ですすいだ。続いて包帯剤を１０％トリクロール酢酸（ＴＣＡｊ中で固 定し、１％ＳＤＳ中に溶解した７ＣＡ沈殿物における放射活性を測定し、要すれ ばそののちオプティソルブ（Ｑｐｆｉｓｏｌｙ）中にコラーゲン包帯剤を完全に 可溶化した。

１１日間にわたり、細胞による　３ＨＴｄＲの取込みにおいて直線的な増加が観 察された。

加えて、細胞を含有するコラスタット包帯剤を選択した間隔でニュートラルレッ ト生体染色で染色した。細胞への染料の取込みにより、およびそれらの形態によ り、生存度を評価した。細胞は５２日間の期間にわたり包帯剤全体中への移動お よび包帯剤材料内での分裂が観察された。

実施例５ ヒト皮膚の体外移植組織培養物から単離された線維芽細胞を１ｇあたり最大０． ０２ｍｇのホルムアルデヒドを含有するコラスタット包帯剤中に４×ｌＯ細胞ｃ ｍ’の濃度で播き、ＤＭＥＭ＋　１０％胎児仔ウシ血清中で２〜３日間３７℃で 培養した。そののち、前記のようにして培養した線維芽細胞を含有する包帯剤を 空気−液体界面まで上げた。コラスタット−線維芽細胞包帯剤に同一のドナーか らの上皮細胞を播き、前述のバーロウおよびビイの方法によって１．２５Ｘ　１ ０　細胞Ｃ１１ｌ−２の密度で単離し、コンフルエンスに達するまで７〜１４日 間３７℃で成長させた。この期間、基本的には成長因子添加物（ｇｒｏｗｔｈ　 ｆａｃｔｏｒ＋ｕｐｐｌｅｍｅｎ＋＋）および１０重量％の胎児仔ウシ血清を含 有する３ＤＭＥＭ　：Ｆ１２中で培養物を育てた（レインワルドおよびグリーン ｆＲｈｅｉｎｖａｌｄ　＆　Ｇ「ｅｅｎ）　、１９７５年）。創傷を閉鎖したの ち数週間が経過した自己移植片は患者により生体吸収されるようになったので、 この方法で生産された培養物は上皮細胞がコンフルエンスに達成していない、４ 日後に創傷に移植されうろことがわかった。

実施例６ 前述のバーロウおよびビイの方法を採用して、上皮を組織培養プラスチック上で １０日の期間にわたり完全なシートとして成長させた。上皮のシートはディスパ ースによって酵素的にはがした。そののち、シートを実施例５に記載されたよう なコラスタット−線維芽細胞中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）包帯剤の最上 部に移し、基本的には実施例５に記載されたように育てた。上皮のシートを空気 −液体界面に維持し、さらにインビトロで約４日間培養して上皮をコラ−ケンに 充分に接着させた。そののち、えられた包帯剤の自己移植が実施例５に匹敵する 結果をともなってもたらされた。

実施例７ 複合的な基体は以下の方法で調製された。

８重量％のコラーゲンを含有するコラ−ケンディスパージョンをシリコーン化し た紙のシート上に２ｍｍの厚さに成型し、さらなるシリコーン化した紙のシート を露出したフィルム表面にわたって配置した。積層物をそののち室温で一晩放置 し部分的に乾燥した。一枚のはがすべきシート（ｒｅｌｅａｓｅ　５ｈｅｅｔ） を各試料から除き、露出した表面を架橋されたコラーゲンシートの表面と接触さ せた。

架橋されたコラーゲンシートは０７５重量％コラーゲンか２．０重量％コラーゲ ンのいずれかを含有した。残りのはがすべきシートを除き、複合体をさらに一晩 中室温で放置しフィルム構成要素を充分に乾燥した。乾燥状態で、複合体の全層 は３〜４ｍｍの間であり、フィルム構成要素の厚さは０．５ｍｍより薄かった。

乾燥後、複合体をエチレンオキサイド滅菌法またはγ照射のどちらかによって滅 菌した。

複合のコラーゲン基体を上皮細胞を培養する前にリン酸塩緩衝生理食塩水中です すいだ。ついで、複合体を実施例２に記載されたような組織培地であらかじめ水 和した。ケラチノサイトをフィルムの表面に１　ｃｍ＋２あたり約１、２５Ｘ　 １０５細胞の播種密度で播いた。２４時間後、ケラチノサイトのコラーゲンフィ ルムへの接着を観察した。これらの細胞のニュートラルレッド生体染色により、 細胞は、コラーゲンフィルムの表面上で分裂し成長しつづけたが多孔性コラーゲ ンシートの中には移動しなかったことが示された。７２時間後、ケラ千ノサイト が約５０％のコンフルエンスに達したのか観察され、フルコンフルエンスは１週 間から１０日の期間後に達成された。

ＦＩ　Ｇ、　７ Ｆｌθ、３ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．架橋されたコラーゲンからなる滅菌した細胞成長支持基体および担持皮膚細 胞からなる創傷用包帯剤。
2. ２．前記基体が４０〜８５℃の範囲の収縮温度で架橋されたコラーゲンからなる 請求の範囲第１項記載の創傷用包帯剤。
3. ３．前記架橋されたコラーゲンが、平均孔径が５０〜１５０μｍの範囲および該 孔の径分布が２０〜２５０μｍである多孔性構造を有する請求の範囲第１項また は第２項記載の創傷用包帯剤。
4. ４．前記基体が架橋されたコラーゲンの第１の層および多孔性コラーゲンの第２ の層からなる請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の創傷用包帯剤。
5. ５．前記第２の層が架橋されていないコラーゲンからなる請求の範囲第４項記載 の創傷用包帯剤。
6. ６．前記基体が１〜１０ｍｍの厚さを有する前記請求の範囲のいずれかの項に記 載の創傷用包帯剤。
7. ７．前記基体が多孔性であり、間に培地を含むものである前記請求の範囲のいず れかの項に記載の創傷用包帯剤。
8. ８．前記基体が多孔性であり、間に成長ホルモンを含むものである前記請求の範 囲のいずれかの項に記載の創傷用包帯剤。
9. ９．前記皮膚細胞が表皮細胞および／または真皮細胞からなる前記請求の範囲の いずれかの項に記載の創傷用包帯剤。
10. １０．前記皮膚細胞が上皮細胞、線維芽細胞または内皮細胞からなる前記請求の 範囲のいずれかの項に記載の創傷用包帯剤。
11. １１．上皮細胞がケラチノサイトである請求の範囲第１０項に記載の創傷用包帯 剤。
12. １２．前記皮膚細胞が播種されて培養された細胞からなる前記請求の範囲のいず れかの項に記載の創傷用包帯剤。
13. １３．前記皮膚細胞が組織断片の形態の細胞からなる前記請求の範囲のいずれか の項に記載の創傷用包帯剤。
14. １４．前記基体が容器の中に配され、前記組織断片が該容器に受け入れられる請 求の範囲第１３項記載の創傷用包帯剤。
15. １５．前記組織断片が皮膚プラグである請求の範囲第１３項または第１４項記載 の創傷用包帯剤。
16. １６．前記皮膚細胞が前記基体で培養されてサブーコンフルエンスとなる前記請 求の範囲のいずれかの項に記載の創傷用包帯剤。
17. １７．前記請求の範囲のいずれかの項に記載の創傷用包帯剤であって、特別な創 傷を負った患者に供される同種移植片または自己移植片の前駆体の形態であり、 中に培養された同種または自己由来の線維芽細胞を有する多孔性の架橋されたコ ラーゲンマトリックスからなる創傷用包帯剤。
18. １８．前記線維芽細胞を有する架橋されたコラーゲンマトリックスが、自己由来 の上皮を表面にデポジションされている請求の範囲第１７項に記載の創傷用包帯 剤。
19. １９．前記線維芽細胞を有するコラーゲンマトリックスが、培養された自己由来 の上皮のサブーコンフルエンスをその表面に有する請求の範囲第１７項記載の創 傷用包帯剤。
20. ２０．実質的にこれまでに記載した特別な実施例のいずれかに記載の創傷用包帯 剤。
21. ２１．（ｉ）キットの使用において上皮細胞のデポジットを受けいれるコラーゲ ン基体を収容し、滅菌した架橋されたコラーゲンシート細胞キャリヤーからなる パッケージおよび（ｉｉ）コラーゲン基体を収納するような寸法に作られた滅菌 した培養容器 からなる皮膚移植キットであって、該コラーゲン基体および培養容器が細菌不透 過性の膜によって限定された滅菌した環境のなかに配置される皮膚移植キット。
22. ２２．前記コラーゲンシートが予め培養された線維芽細胞を支持し、前記コラー ゲン基体が冷凍される請求の範囲第２１項記載のパッケージ。
23. ２３．前記パッケージが細菌不透過性膜を限定する壁を提供する請求の範囲第２ １項または第２２項記載のキット。
24. ２４．前記パッケージが、前記コラーゲン基体と前記培養容器をともに含有する 細菌不透過性膜エンベロープ、または前記コラーゲン基体と前記培養容器を別々 に含有するそのような２つのエンベロープを収容する請求の範囲第２１項または 第２２項記載のキット。
25. ２５．前記請求の範囲第１項〜第２０項のいずれかに記載の創傷用包帯剤を創傷 に適用することからなる創傷の治療法。
26. ２６．前記創傷が部分的に厚い皮膚の創傷である請求の範囲第２５項記載の方法 。
27. ２７．前記創傷が全層の皮膚創傷である請求の範囲第２５項記載の方法。
28. ２８．前記創傷が火傷である請求の範囲第２５項〜第２７項のいずれかに記載の 方法。
29. ２９．前記創傷が下肢の潰瘍である請求の範囲第２５項〜第２７項のいずれかに 記載の方法。
30. ３０．前記創傷が圧迫による壊死である請求の範囲第２５項〜第２７項のいずれ かに記載の方法。
31. ３１．前記圧迫による壊死がとこずれである請求の範囲第３０項記載の方法。
32. ３２．前記創傷が皮膚移植提供部位である請求の範囲第２５項〜第２７項のいず れかに記載の方法。
33. ３３．外科的または非外科的な穿孔の外傷を被った動物の皮膚表面に局所的に適 用される美容的皮膚治療法であって、該表面に請求の範囲第１項〜第２０項のい ずれかに記載の創傷用包帯剤を適用することからなる方法。
34. ３４．穿孔の外傷が全層の皮膚穿孔である請求の範囲第３３項記載の方法。
35. ３５．皮膚細胞および該皮膚細胞が接着した架橋されたコラーゲンからなる基体 からなる生きた組織移植片を生産するための皮膚細胞のインビトロ培養用基体と しての架橋されたコラーゲンの用途。
36. ３６．哺乳類の皮膚細胞に対して付随的に細胞毒性がある架橋剤を用いて架橋さ れたコラーゲンシートを処理し、該架橋反応により消費されない架橋剤を除去す ることからなる、架橋されたコラーゲンの皮膚細胞培養基体の製造法であって、 該処理が、基体に８０％の皮膚細胞のデポジットがデポジションしたのち１２時 間生存することにより示されるような皮膚細胞培養の支持能をシートが有するま で続けられる、架橋されたコラーゲン皮膚細胞培養基体の製造法。
37. ３７．前記架橋されたコラーゲンシートが架橋剤用溶媒で洗浄されることにより 処理される請求の範囲第３６項記載の方法。
38. ３８．前記架橋されたコラーゲンシートが、消費されない架橋剤の含量が架橋さ れたコラーゲンシート１ｇ当たり架橋剤０．０２ｍｇ以下になるまで処理される 請求の範囲第３６項または第３７項記載の方法。
39. ３９．前記架橋されたコラーゲンがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドまた はほかの水溶性架橋剤によって架橋されたものである請求の範囲第３６項〜第３ ８項のいずれかに記載の方法。
40. ４０．前記架橋されたコラーゲンが、消費されないホルムアルデヒド、グルタル アルデヒドまたはほかの架橋剤を、リン酸塩緩衝生理食塩水でシートを洗浄する ことにより処理して除去されたものである請求の範囲第３９項記載の方法。
41. ４１．実質的にこれまでに記載した特別な実施例のいずれかに記載の架橋された コラーゲン皮膚細胞培養基体の製造法。