DE3886493T2

DE3886493T2 - Osteoinduktive Kollagenzusammensetzung zur Bekämpfung von Knochendefekten.

Info

Publication number: DE3886493T2
Application number: DE88308793T
Authority: DE
Inventors: George Chu; Ranga Nathan; Saeid Seyedin
Original assignee: Collagen Corp
Current assignee: Collagen Aesthetics Inc
Priority date: 1987-09-25
Filing date: 1988-09-22
Publication date: 1994-04-14
Anticipated expiration: 2008-09-23
Also published as: AU618756B2; CA1335177C; EP0309241A3; AU2275188A; EP0309241A2; US4888366A; EP0309241B1; JPH01158964A; ES2060656T3; ATE98879T1; DE3886493D1; JPH0553139B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Knochenreparaturmaterialien und die so hergestellten Materialien. Genauer betrifft es die Herstellung von Collagen/Mineral- Trägern, welche chondrogene/osteogene Proteine enthalten.
Es ist wohlbekannt, daß die physiologische Reparatur von Knochenschäden und -brüchen durch Faktoren vermittelt wird, welche die Zelldifferenzierung und die Bildung der mineralischen Bestandteile des Knochens unterstützen. Unlängst wurden Versuche unternommen, den Faktor oder die Faktoren zu identifizieren, welche in diesen Aktivitäten von Bedeutung sind. US-A-4440750 und 4430760 offenbaren die Verwendung von entmineralisiertem Knochenpulver (DMB) zur Substitution welcher auch immer natürlich auftretenden, in Implantaten oder durch Injektion erforderlichen Faktoren. US-A-4294753 und 4455256, Urist, offenbaren ein Knochen-morphogenes Protein (BMP), welches aus entmineralisierten Knochen unter Verwendung von Harnstoff oder Guanidiniumchlorid extrahiert und dann wiederausgefällt wird. Weitere Aufreinigungen dieses Faktors wurden von Urist in Clin. Orthop. Rel. Res. (1982) 162:219, Science (1983) 220:680 und Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 81:371 berichtet. Osteogene Faktor- proteine mit anderen Eigenschaften als jenen, durch Urist für BMP beschriebenen, wurden aus DMB isoliert und von Seyedin und Thomas (US-A-4434094, US-A-4627982) aufgereinigt.
Da die oben genannten Faktoren zur Wiederherstellung des Knochens beitragen, war es wünschenswert, diese in für die Knochenreparatur eingesetzte Mittel einzubeziehen. In US-A-4440750 (siehe oben) wurde eine rekonstituierte Atelopeptid-Collagen-Präparation als Träger für entweder DMB oder einen DMB-Extrakt eingesetzt. US-A-4394370, Jefferies, offenbart eine Nonatelopeptid-Collagen-Zusammensetzung als Träger für einen DMB-Rohextrakt unter Bezugnahme auf die Publikationen von Urist.
Zusätzliche Untersuchungen wurden von Reddi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1983) 69:1601 angestellt, worin die Verwendung eines allogenen, entmineralisierten Knochenpulvers in Ratten als Wirtstieren beschrieben wird; Samprath, T.K. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)) (1983) 80:6591, berichtet eine weitergehende Aufreinigung der osteogenen Faktoren aus einer Anzahl von Spezies.
US-A-4563350 (äquivalent zu EP-A-182483) beschreibt die Verwendung eines Collagen-Knochenreparaturmittels, welche jedoch die Anwesenheit von nichtfibrillärem Collagen erfordert, um die induktive Aktivität effektiv bereitzustellen.
FR-A-2564732 offenbart ein osteogenes Material mit einer Mischung eines osteogenen Faktors und einem ersten stützenden Material, ausgewählt aus Collagen, Derivaten desselben und Denaturierungsprodukten desselben, gebunden an ein zweites stützendes Material, welches Keramik, Metall oder ein synthetisches Harz umfaßt.
Collagen/Mineral-Präparationen zur konduktiven Knochenreparatur, d.h. Matrices, welche das Einwachsen neuer Knorpel- und Knochenzellen erlauben, aber ohne die Einbeziehung exogener, osteoinduktiver Faktoren, sind ebenfalls beschrieben worden. EP-A-197693 beschreibt die Herstellung feuchter und trockener Mischungen von Mineral und Atelopeptid-Collagen, welche 60-98 Gew.-% Mineral und 2-40 Gew.-% Collagen enthalten. Die Zusammensetzungen werden hergestellt durch Mischung der Collagen- Suspension einer Konzentration von 65 mg/ml mit dem festen, pulverisierten Mineral. Die resultierenden Mischungen werden entweder als Paste verwendet oder werden bei Umgebungstemperatur und -druck getrocknet. Die Druckfestigkeit der Zusammensetzung kann durch Heißhärten, Reifung oder Quervernetzung verstärkt werden.
US-A-4485097, Bell, beschreibt ein Collagen-Gitter, welches Fibroblastenzellen und entmineralisiertes Knochenpulver enthält. Dieses besitzt jedoch keinen Mineralgehalt.
US-A-4097935 beschreibt ein keramisches Material auf Hydroxylapatit-Basis, welches mit Collagen gemischt werden kann, um eine Knochenersatzmischung zu erhalten.
Keine der vorangegangenen Zusammensetzungen führt zu einer homogenen, starren Präparation, welche direkt zur Implantation in Knochen eingesetzt werden und wirksam die Knochenreparatur vermitteln kann durch effektive Freisetzung der enthaltenen osteogenen Faktoren.
Es ist jetzt gefunden worden, daß trockene Prothesen, die effektive Träger für osteogene Faktoren darstellen, erhalten werden können, die homogen und fest sind und das Einwachsen von Knochen aufgrund der darin enthaltenen osteogenen Faktoren induzieren können. Dieses Ergebnis wird erzielt zunächst durch Mischung einer Lösung der osteogenen Faktorpräparation mit entweder dem Collagen oder dem Mineralbestandteil, und durch darauffolgende Kombination des übriggebliebenen Bestandteils mit der Mischung zu einer Präparation, in welcher die Collagenkonzentration in der Gesamtsuspension in der Größenordnung von 30-100 mg/ml liegt. Die Mischung wird dann bei Umgebungsdruck und bei leicht erhöhten Temperaturen getrocknet. Wird das Herstellungsverfahren in dieser Weise ausgeführt, weisen die resultierenden Zusammensetzungen die charakteristischen Eigenschaften auf, starr zu sein mit einer Druckfestigkeit von zumindest 20 Newton pro Quadratzentimeter (N/cm²) und einen homogen verteilten sowie biologisch aktiven und verfügbaren Gehalt an osteogenem Faktor zu enthalten. Sie sind zudem hypoimmunogen.
Die vorliegende Erfindung stellt deshalb ein Verfahren zur Herstellung eines hypoimmunogenen Mittels, das geeignet ist zur Implantation, zur Verfügung, um eine Knochenreparatur bei einem Wirbeltier zu erreichen,
wobei das Mittel umfaßt eine osteoinduktiv wirksame Menge eines Protein-osteoinduktiven Faktors (OF), wobei der OF ausreichend rein ist, um bei einem xenogenen Wirt hypoimmunogen zu sein, und einen Träger mit Bestandteilen, die im wesentlichen aus Mineral bestehen, das 60-98 Gew.-% ausmacht, und Collagen, das 2-40 Gew.-% des Mittels ausmacht,
wobei das Verfahren umfaßt:
(a) die Herstellung einer gleichförmigen Suspension des Collagens, des Minerals und der OF-Komponenten des Mittels in Wasser, so daß die Konzentration an Collagen in der Suspension 30-100 mg/ml beträgt, und
(b) kontrolliertes Trocknen der Suspension bei Umgebungsdruck, um einen starren Feststoff zu erhalten.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein hypoimmunogenes Mittel, das geeignet ist zur Implantation, um eine Knochenreparatur bei einem Wirbeltier zu erreichen, welches im wesentlichen aus einer Mischung von 60-98 Gew.-%, vorzugsweise 75-95 Gew.-%, Mineralteilchen, wie Calciumphosphat- Teilchen, 2-40 Gew.-%, vorzugsweise 5-25 Gew.-%, hypoimmunogenem Atelopeptid-Collagen und einer wirksamen Menge einer osteogenen Faktor/(OF)-Präparation besteht, wobei das Implantat ein poröser, starrer Feststoff mit einem Kompressionsmodul größer als 20 N/cm² ist, der, bezogen auf seine Komponenten, homogen ist, und wobei der OF in biologisch aktiver und verfügbarer Form vorliegt.
Eine Maßeinheit für eine wirksame Menge entspricht der Aktivität, die durch Einsatz von ca. 0,5-4% eines "partiell gereinigten" osteogenen Faktor-Extrakts (OFE) erhalten wird. Sowohl der Faktor als auch der Träger sind ausreichend rein, um hypoimmunogen zu sein. Der OFE ist hinsichtlich seiner Aktivität ausreichend konzentriert, daß nur das zitierte Maximum von 4 % (w/w) an OFE in der Präparation erforderlich ist.
Die Erfindung betrifft ferner ein hypoimmunogenes Mittel, das geeignet ist zur Implantation, um eine Knochenreparatur bei einem Wirbeltier zu erreichen, welches eine osteoinduktiv wirksame Menge eines Protein-osteoinduktiven Faktors (OF), abgeleitet aus Knochen, umfaßt, wobei der OF ausreichend rein ist, um bei einem xenogenen Wirt hypoimmunogen zu sein, und wobei das genannte Mittel zumindest 75 Gew.-% Mineralträger umfaßt.
Solche Mittel können beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus
(a) einem Mittel mit 85 bis 95% Mineralträger, 5 bis 15% Atelopeptid-Collagen, und wobei die Menge an OF derjenigen entspricht, die erreicht wird durch Einbau von etwa 0,5% bis 4 Gew.-% des Implantats an partiell gereinigtem OF;
(b) einem Mittel mit 87,5% TCP/HA-Gemisch und 10% nichtfibrillärem oder fibrillärem Collagen, und wobei die Menge an OF derjenigen entspricht, die erreicht wird durch Einbau von etwa 2,5 Gew.-% des Implantats an partiell gereinigtem OF; und
(c) einem Mittel mit 91,5% TCP/HA-Gemisch und 6% rekonstituiertem fibrillärem Collagen, und wobei die Menge an OF derjenigen entspricht, die erreicht wird durch Einbau von etwa 2,5 Gew.-% des Implantats an partiell gereinigtem OF.
Figur 1 ist eine schematische Darstellung einiger alternativer, beispielhafter Verfahren der Erfindung.
Figur 2 zeigt die Knochenbildungsaktivität der Mittel der Erfindung unter Verwendung von alkalischer Phosphatase als Index.
Die Figuren 3A und 3B zeigen die Knochenwachstumsergebnisse dieser Mittel unter Verwendung einer histologischen Auswertung als Kriterium.

A. Definitionen

Wie hierin verwendet, werden die Begriffe "osteoinduktiv" und "osteogen" gegeneinander austauschbar verwendet und betreffen die Überführung von Knochenvorläuferzellen in lebendes Knochengewebe. Die Induktion kann in Osteogenese resultieren, d.h. direkte Bidung von mineralisiertem Knochen durch die Sekretion der organischen und anorganischen Knochenbestandteile, oder die Osteoinduktion kann ebenfalls eine intermediäre Knorpelbildung einschließen, d.h. der osteoinduktive Faktor kann ebenfalls chondrogen sein. In der Tat wird für die Knorpelbildung diagnostisch charakteristisches Proteoglykan als Index für die osteoinduktive Aktivität der Mittel der Erfindung verwendet.
Der hierin unter Bezugnahme auf die osteogenen Faktoren verwendete Begriff "abgeleitet aus" bezieht sich auf eine strukturelle Verwandschaft oder Homologie. Er ist nicht auf eine physikalische Ableitung beschränkt. Deshalb bedeutet ein osteogener Faktor, "abgeleitet aus" Knochen, daß der Faktor oder die Faktoren eine im Vergleich mit ursprünglich im Knochengewebe gebildeten Faktoren homologe oder ähnlich funktionelle Aminosäuresequenz besitzen; es bedeutet nicht notwendigerweise, daß das verwendete Material direkt aus dem Knochen per se isoliert ist. Es könnte beispielsweise synthetisch oder durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt sein.
Der Begriff "hypoimmunogen" bezieht sich auf eine annehmbare Biokompatibilität. Es ist bekannt, daß viele Stoffe in einigen Tieren und Anwendungen immunogen sein können, jedoch in anderen Tieren keine bestimmbaren Mengen spezifischer Immunglobuline induzieren können. Es ist ebenfalls bekannt, daß ein vollständiges Fehlen spezifischer Immunglobuline und einer Entzündung nicht erforderlich sein muß. Wird es jedoch zur Beschreibung der Bestandteile des Mittels oder der Mittel der Erfindung verwendet, ist "hypoimmunogen" funktional so definiert, daß jegliche Immunantworten innerhalb annehmbarer Grenzen liegen.
"Atelopeptid-Collagen" bezieht sich auf geeignet behandeltes Collagen, um die Telopeptide oder immunogenen Abschnitte vollständig oder teilweise zu entfernen. Kurz erläutert, umfaßt Collagen eine fibrilläre Struktur, zusammengesetzt aus Bündeln tripelhelikaler Konfiguration sich wiederholender Aminosäuresequenzen. Diese tripelhelikalen Sequenzen werden terminiert durch nicht-helikale Strukturen, "Telopeptide", welche sowohl für die Quervernetzung zwischen verschiedenen Collagenketten als auch zum Teil für die Immunogenität von Collagen-Präparationen verantwortlich sind. Eine Entfernung dieser Strukturen kann durch eine Behandlung mit geeigneten proteolytischen Enzymen, wie Trypsin, bewerkstelligt werden. Das resultierende Atelopeptid-Collagen ist für eine xenogene Verwendung geeigneter, da die hauptsächlichen Spezies-spezifischen Immunogene auf diese Weise entfernt worden sind.
"Nicht-fibrilläres Collagen" ist entsprechend behandelt worden, daß es seine ursprüngliche fibrilläre Struktur nicht beibehalten hat. Diese Bezeichnung bezieht sich auf Collagen, welches solubilisiert und nicht in seine ursprüngliche fibrilläre Form rekonstituiert worden ist. Die fibrilläre Konstruktion kann durch Lösung gestört werden; sie kann entweder durch Rekonstitution der Fasern (in fibrilläre Struktur) oder durch nichtspezifische Aggregation (in nicht-fibrilläre Struktur) erneut in eine feste Form überführt werden.
"OFE" oder osteogener Faktorextrakt, bezeichnet als "partiell gereinigter OFE", ist definiert als die partiell gereinigten, hierin unten beschriebenen Extrakte aus Knochen, die die niedrige Molekulargewichtsfraktion, < 30000, darstellen, gebunden an und abgelöst von einem Kationenaustauscherharz, wie beschrieben in US-A-4627982, dessen Inhalt durch Bezugnahme hier aufgenommen wird. Die Prozentangaben an OFE in den Mitteln der Erfindung erfolgen unter Bezugnahme auf die beschriebenen, "partiell gereinigten" Präparationen. Es ist jedoch bekannt, daß andere Herstellungsverfahren, welche vergleichbare Mengen an osteogener Aktivität liefern, ebenfalls verwendet werden können, wenn diese ausreichend rein ist, um hypoimmunogen zu sein. Die osteogene Aktivität dieser Extrakte beruht auf der Anwesenheit von einem oder mehreren, darin enthaltenen osteogenen Faktoren (OF). Die Versorgung dieser Zusammensetzungen mit diesem Faktor oder diesen Faktoren (OF) kann in Form des Extrakts (OFE) erfolgen, oder es können synthetische Formen des Faktors oder der Faktoren verwendet werden, oder eine Kombination derselben. Selbstverständlich können OFE- oder OF-Präparationen größerer Reinheit als jene als "partiell gereinigt" bezeichneten verwendet werden in einer Menge, die aufgrund eines ähnlichen Aktivitätsniveaus den hierin beschriebenen entspricht.
"OF" ist definiert als der/die Faktor(en), der/die per se für die osteogene Aktivität des Extrakts verantwortlich ist/sind, unabhängig davon, ob diese(r) aus einem Extrakt erhalten wurde(n) oder chemisch synthetisiert wurde(n). OF umfaßt ebenfalls Varianten der natürlich auftretenden Materialien, welche die osteogene Aktivität und das pharmakologische Verhalten des ursprünglichen Materials beibehalten, d.h. biologisch verfügbar bleiben in den Mitteln der Erfindung.
Dementsprechend bezieht sich "ein Prozentsatz an OF, äquivalent zu partiell gereinigtem OFE" auf eine Menge einer OF-Präparation, welche die Aktivität aufweist, welche durch die Verwendung von "partiell gereinigtem OFE", wie oben definiert, in Prozentsätzen von 0,5-4% erhalten wird. Im allgemeinen wird die äquivalente Menge im genannten Bereich oder niedriger liegen, da ähnlich aufgereinigte oder höher aufgereinigte Präparationen erforderlich sein würden, um das Ausmaß an Hypoimmunogenität zu erreichen, welches zur Verwendung in allogenen oder xenogenen Empfängern erforderlich ist. Werden ein hoch aufgereinigter Extrakt oder synthetisches Material verwendet, wird ein geringerer Prozentsatz wirksam sein.
"Bewegung" von Gemischen entsprechend dem Verfahren der Erfindung bezieht sich auf eine mechanisch bedingte Bewegung der Teilchen des Gemisches durch beispielsweise konventionelle Mittel, wie Rühren, Schütteln, Vortexen oder dergleichen.
"Inkubation" bedeutet, ein Zielmaterial oder -gemisch für eine gegebene Zeitdauer unter kontrollierten oder festgelegten Bedingungen zu halten, wobei der Feuchtigkeitsgehalt während dieser Zeitdauer gleich bleibt.
Die hierin für die Zusammensetzungen der Erfindung aufgeführten Prozentangaben sind Gewicht/Gewicht-Prozentangaben der trockenen, beschriebenen Bestandteile. Obwohl Wasser oftmals (jedoch nicht immer) einen wichtigen Teil dieser Mittel darstellt, ist sein Prozentsatz veränderlich, abhängig von den gewünschten physikalischen Eigenschaften im Mittel. Die Mittel werden beispielsweise oft trocken gelagert und dann trocken oder für die Implantation rehydratisiert implantiert.
"Kontrolliertes Trocknen" bezieht sich auf ein Verfahren zur Entfernung von Feuchtigkeit, welches bei annähernd Umgebungsbedingungen von Druck und Temperatur ausgeführt wird. Es ist selbstverständlich nicht erforderlich, Luft zu verwenden, um annähernd Atmosphärendruck aufrechtzuerhalten; Stickstoff könnte beispielsweise ebenfalls verwendet werden. Da es jedoch keine größeren Stabilitätprobleme bei den hierin verwendeten Mitteln gibt, ist Luft die zweckmäßigste Lösung. Die Temperatur kann geringfügig über Umgebungsbedingungen erhöht sein, um den Trocknungsprozeß zu beschleunigen.

B. Allgemeine Beschreibung

Die Mittel der Erfindung sind Gemische wirksamer Mengen einer osteoinduktiven Faktor/OF-Präparation, welche ausreichend aufgereinigt ist, um hypoimmunogen zu sein, wenn sie xenogen verwendet wird, mit einem hypoimmunogenen Träger, wie dem Mineral/Collagen-Träger der Mittel der Erfindung. Der Prozentsatz einer besonderen, für das Mittel erforderlichen OF-Präparation wird, selbstverständlich, von der Reinheit der Präparation abhängen, aber für die "partiell gereinigten OFE"-Präparationen, wie definiert, ist ein Bereich von 0,5-4% geeignet. Höher aufgereinigter OF könnte in entsprechend niedrigeren Mengen eingesetzt werden.

Die OF-Präparation

OF-Präparationen, die das Kriterium ausreichender Reinheit, um in xenogenen Wirten hypoimmunogen zu sein, erfüllen, können auf verschiedene Arten hergestellt werden. Als Quellen für den Faktor können Knochen, Dentin, Osteosarkome oder Chondrosarkome und andere Gewebe von Wirbeltier-Herkunft mit OF-Gehalt verwendet werden. Es wurde von Sampath, T.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:6591, gezeigt, daß OF-enthaltende Präparationen aus Mensch, Affe, Rind und Ratte nicht-Speziesspezifisch sind in ihrer Fähigkeit, endochondralen Knochen in xenogenen Implantaten zu erzeugen. Aufgrunddessen kann der in den Gemischen dieser Erfindung verwendbare OF aus jeder dieser Quellen abgeleitet werden und tatsächlich jedes Protein mit osteoinduktiver Aktivität sein, das im wesentlichen diesen aus Wirbeltierquellen abgeleiteten Proteinen ähnlich ist, unabhängig davon, ob so hergestellt, unbeabsichtigt oder beabsichtigt modifiziert, durch chemische Synthese oder rekombinante DNA- Techniken oder andere derartige Verfahren hergestellt. Beispielsweise kann zusätzlich das Knochen-morphogene Protein nach Urist, bei ausreichender Aufreinigung, eventuell ebenfalls verwendet werden. Der OF muß lediglich die Erfordernisse einer grundlegenden Ähnlichkeit zu einem aus einer Wirbeltierquelle ableitbaren Protein, einer osteoinduktiven Wirkungsweise und einer annehmbar geringen Immunogenität erfüllen.
Ein nützliches Verfahren zur Herstellung des "partiell gereinigten OFE", der nützlich in den Mitteln der Erfindung ist, ist in US-A-4627982 (siehe oben) beschrieben. Kurz zusammengefaßt, beginnt es mit einer Behandlung von langem Knochenmaterial aus Schwein oder Rind (aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit) mit mechanischen und abschleifenden Techniken, um diese zu reinigen und zu zerkleinern, und einer Entfettung durch eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, wie Ether oder Ethylacetat, und einer darauffolgenden Entmineralisierung, i.a. durch eine Extraktion mit starker Säure unter Verwendung von Standardmethoden, und eine nachfolgende Verwendung des entmineralisierten Knochens (DMB) als Ausgangsmaterial.
Um solubilisierten OFE zu erhalten, wird der DMB dann mit einem chaotropen Mittel extrahiert. Die Extraktion wird vorzugsweise bei erniedrigten Temperaturen in Anwesenheit von Protease-Inhibitoren ausgeführt, um die Wahrscheinlichkeit eines enzymatischen Abbaus oder einer Denaturierung des extrahierten Proteins zu verringern, für ca. 4 h/1 d. Nach der Extraktion kann das Extraktionsmittel durch geeignete Mittel, wie Dialyse gegen Wasser, kontrollierte Elektrophorese, Gelfiltration oder jedes andere, geeignete Mittel, entfernt werden. Der Extrakt, mit oder ohne Entfernung des Extraktionsmittels, wird dann einer Gelfiltration oder einem anderen, nach der Größe auftrennenden Verfahren unterworfen, um Fraktionen eines Molekulargewichts unter ca. 30000 Dalton unter Verwendung von Standardtechniken zu erhalten.
Die Fraktion geringen Molekulargewichts wird von konkurrierenden Ionen befreit und dann einer Ionenaustauschchromatographie unterworfen unter Einsatz entweder eines Kationenaustauschs, beispielsweise mit CMC bei einem pH von annähernd 4,5-5,2 in der Anwesenheit eines nichtionischen chaotropen Mittels wie Harnstoff, um den "partiell gereinigten OFE", wie oben definiert, zu erhalten, oder unter Einsatz eines Anionenaustauschs, beispielsweise mit DEAE-Cellulose in der Anwesenheit von beispielsweise 6 M Harnstoff und 20 mM Natriumphosphat bei einem pH von annähernd 7,2.
Der OF wird an das Kationenaustauscherharz adsorbiert und unter geeigneten Bedingungen eluiert; die aktiven Eluat-Fraktionen aus der Kationenaustauschchromatographie können direkt als "partiell gereinigter OFE" in den Mitteln der Erfindung eingesetzt werden. Der Prozentbereich von 0,5-4% basiert auf einem Gewicht/Gewicht-Prozentsatz des partiell gereinigten Proteins im fertiggestellten Mittel.
Der im "partiell gereinigten OFE" enthaltene OF kann weiter aufgereinigt werden durch Präzipitation in Phosphatpuffer bei pH 6-8 durch Zugabe von 0,01-0,1 M Natriumphosphat. Der Niederschlag wird dann wieder gelöst in einem nicht-chaotropen Mittel und an einer Hydroxylapatit-Säule mittels HPLC chromatographiert.
Alternativ enthält das nicht-adsorbierte Material aus der Behandlung der Fraktion geringen Molekulargewichts, abgeleitet von DMB, mit einem Anionenaustauschharz die OF-Aktivität, und dieses nicht-adsorbierte Protein kann nach einer Dialyse zur Entfernung des Harnstoffs ebenfalls in geeigneten Prozentsätzen als Äquivalent des "partiell gereinigten OFE" verwendet werden. Das Protein in der mit dem Anionenaustauschharz behandelten Lösung kann durch Lyophilisation gewonnen oder durch Dialyse gegen 0,01 N HCl stabilisiert werden. (Der "partiell gereinigte OFE" kann ebenfalls einer Behandlung mit dem Anionenaustauschharz, wie oben beschrieben, unterworfen werden, wobei diese als ein zusätzlicher, nicht als ein alternativer Schritt eingesetzt wird.)
Da die Anionenaustauscherbehandlung nicht in dem 1982 veröffentlichten Patent beschrieben ist, werden die Einzelheiten, wie folgt, aufgeführt:
Die Fraktion geringen Molekulargewichts aus dem Gel oder die OF-enthaltende Fraktion aus dem Eluat des Kationenaustauschs wird in einem Puffer mit 6 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 20 mM NaCl und Protease-Inhibitoren gelöst. Die Lösung wird dann über eine mit demselben Puffer äquilibrierte DEAE- Cellulosesäule chromatographiert. Die Durchflußfraktion, die den OF enthält, wird gegen Wasser zur Entfernung des Harnstoffs dialysiert und der OF durch Lyophilisation gewonnen. Alternativ wird das Durchflußvolumen gegen 0,01 N HCl dialysiert und in 0,01 N HCl bei einer Proteinkonzentration von 1-10 mg/ml gelagert. Diese Lösungen sind über mehrere Monate stabil und können lyophilisiert werden.
Es sollte festgehalten werden, daß partiell gereiniger OFE lediglich als eine günstige Quelle für OF, den/die für die osteogene Aktivität verantwortlichen Faktor(en), beschrieben wird. Der OF kann auch aus anderen Quellen, wie beispielsweise gereinigten Formen des BMP von Urist oder synthetischen Materialien, erhalten werden. Synthetische Materialien können auch Varianten des natürlichen Materials einschließen, welche die biologische Aktivität und Verfügbarkeit des/der natürlichen Gegenstücks/e bewahren. Die Erfindung ist auf in der Vermittlung von induktivem Knochenwachstum wirksame Mittel ausgerichtet, unabhängig von der OF-Quelle.

Der Träger

Der Trägeranteil des bevorzugten Mittels bringt 60-90%, vorzugsweise 75%, und noch bevorzugter ca. 85-95% eines Mineralbestandteils in das Mittel ein sowie einen zusätzlichen Bestandteil, ausgewählt aus fibrillärem oder nicht-fibrillärem Kollagen oder beidem.
Der Mineralbestandteil ist allgemein ausgewählt aus verschiedenen Formen von Calciumphosphat, vorzugsweise Hydroxylapatit (HA) und Tricalciumphosphat (TCP) oder, besonders bevorzugt, Mischungen derselben. HA und TCP sind jeweils kommerziell erhältlich und es kann eine Auswahl aus einer Anzahl von Korngrößen und Porositäten getroffen werden. Diese Materialien wurden als nützlich in der Konstruktion harter Gewebeimplantate offenbart und besitzen somit eine geeignete Biokompatibilität, um einen Bestandteil der Mittel der Erfindung zu umfassen.
Siehe beispielsweise US-A-4314380 zur Offenbarung von HA-Präparationen, und Hayashi, K., et al. Arch. Orthop. Traumat. Surg. (1982) 99:265, zur Offenbarung einer alternativen Form von HA. Bei Mitteln, die eine Mischung von HA und TCP enthalten, ist es besonders bevorzugt, daß der Mineralgehalt 95% oder weniger beträgt, bei HA alleine können 98% verwendet werden.
Eine Eigenschaft der Mittel der Erfindung ist eine annehmbar geringe Immunogenität. Entsprechend ist es im allgemeinen zu bevorzugen, die Atelopeptid-Formen nicht-fibrillärer oder fibrillärer Collagen-Bestandteile zu verwenden. Es können jedoch Fälle auftreten, in welchen die Anwesenheit von Telopeptiden aufgrund der Konfiguration des implantierten Mittels, der Empfindlichkeit des Wirtes oder aus irgendeinem anderen Grund der Hypoimmunogenität nicht ausreichend abträglich ist, um das Mittel unakzeptabel zu machen. In anderen Worten ist die Verwendung von Atelopeptid-Collagenen bevorzugt, aber nicht notwendigerweise erforderlich.
Hypoimmunogenität ist besonders wichtig, um eine Verwendung xenogener Collagen-Quellen zu erlauben. Beispielsweise kann bei ausreichend abnehmender Immunogenität Collagen aus Rind oder Schwein in humanen Patienten verwendet werden.
Nicht-fibrilläres Kollagen kann geliefert werden als ein Collagen-in-Lösung oder als lyophilisierte Form von Collagen- in-Lösung, welche nicht-spezifisch aggregiert ist. Eine bevorzugte Quelle des nicht-fibrillären Collagens ist Collagen in Lösung (CIS), welches unter dem Warenzeichen Vitrogen von Collagen Corporation, Palo Alto, Kalifornien, erhältlich ist. Es kann jedoch jede nicht-rekonstituierte Collagen-Präparation verwendet werden.
Fibrilläres Collagen kann aus verschiedenen Quellen abgeleitet werden, und eine Anzahl fibrillärer Collagen-Präparationen ist nach dem Stand der Technik erhältlich, in welchen aus Knochen oder Haut verschiedener Säugetiere abgeleitetes Collagen solubilisiert oder in flüssigem Medium dispergiert und dann in fibrillärer Form zurückgewonnen wurde. Präparationen, in welchen das Collagen zu Fibrillen rekonstituiert wurde, umfassen beispielsweise, Zyderm Collagen Implant (ZCI), erhältlich von Collagen Corporation, Palo Alto, Kalifornien. Andere fibrilläre Präparationen umfassen Avitene , welches dispergierte Fasern darstellt, welche noch die ursprüngliche fibrilläre Form besitzen, und Collagenfleece , welches eine dispergierte und nachfolgend gefriergetrocknete Präparation darstellt. (Diese letztgenannten Präparationen sind dementsprechend nicht "rekonstituiert".)

Eigenschaften der Mittel

Bei einer Herstellung durch das oben beschriebene Verfahren werden die Mittel der Erfindung, welche zu 60-98%, vorzugsweise 75-95%, aus partikulärem Mineral, zu 2-40%, vorzugsweise 5%-25%, aus Collagen und einer wirksamen Menge an OF, wie jener, die durch 0,5-4% partiell gereinigten OFE, wie oben definiert, oder sein Äquivalent bereitgestellt wird, bestehen, gewisse, erwünschte Eigenschaften als Ergebnis ihrer Herstellungsart aufweisen. Zuerst sollte festgehalten werden, daß sämtliche Bestandteile ausreichend rein sein müssen oder anderenfalls so hergestellt werden müssen, daß das Mittel sich hypoimmunogen im Empfänger verhält. Als zweites muß der OF-Bestandteil gleichförmig verteilt und biologisch aktiv und verfügbar sein. Zuletzt müssen die Mineral- und Collagen-Bestandteile homogen dispergiert sein; das Mittel wird porös sein und wird eher hart als Schwamm-ähnlich sein; der Kompressionsmodul beträgt zumindest 20 N/cm².
Die Homogenität bezüglich der Collagen/Mineralbestandteile kann visuell effektiv beurteilt werden. Die gleichförmige Verteilung des OF im Implantat wird durch das Herstellungsverfahren sichergestellt; dies kann durch Standardanalyseverfahren an Probenteilen verifiziert werden. Die biologische Verfügbarkeit und Aktivität des OF wird anhand der Fähigkeit der Implantate, die Knochenbildung zu induzieren, beurteilt. Eine Vielzahl von Verfahren sind für diese Prüfung verfügbar, besonders hervorzuheben eine histologische Prüfung. Zusätzlich können die alkalische Phosphatase-Spiegel, wie unten gezeigt, zur Beurteilung einer Knochenbildung auf biochemischer Ebene verwendet werden. Andere Parameter sind ebenfalls zugänglich, wie eine Beurteilung der Calciumspiegel und eine Beobachtung der Knorpelbildung durch Bestimmung des Proteoglycans. Wenn gewünscht, kann die Hypoimmunogenität des Implantats sichergestellt werden durch fortlaufende Untersuchung der Serumspiegel des Empfängers auf Antikörper gegen die implantierten Materialien oder ihre Bestandteile.
Zur Bestimmung des Kompressionsmoduls kann eine kommerziell erhältliche Ausrüstung, wie beispielsweise Instron Universal Testing Model 4202, verwendet werden entsprechend den Richtlinien für die Bestimmung von Kompressionsmodulen, wie von der American Society for Testing Materials veröffentlicht.
Zur Ausführung dieser Bestimmung werden die Mittel zuerst 5-24 h in physiologischer Kochsalzlösung gequollen. Dieses Quellen wird für eine ausreichend lange Zeitdauer durchgeführt, um eine vollständige Benetzung sicherzustellen. Das Mittel wird dann in das Testgerät eingelegt. Ist das Material elastisch, wird es leicht komprimieren, bis ein Punkt erreicht ist, an welchem zur weiteren Kompression des Materials es erforderlich ist, die zugrundeliegende Struktur auf mikroskopischer Ebene zu zerstören. Ist das Material starr, wird dieser Punkt bei geringerer Deformation erreicht werden als bei elastischem Material. Bei Collagen/Mineral-Gemischen wird die mikroskopische Organisation zunächst durch die Tripelhelix per se aufrechterhalten, jedoch auch durch eine Wechselwirkung zwischen den tripelhelikalen Collagen-Anteilen der individuellen Fibrilllenbestandteile sowie durch die Bindung der Fibrillen aneinander. Eine Kompression unter Zerstörung einer jeden dieser Organisationsebenen wird schwieriger sein als eine allgemeine Kompression, die das Volumen an Leerraum verringert. Je höher der Organisationsgrad und die Quervernetzung der Collagen-Ketten im Mittel ist, desto schwieriger ist, selbstverständlich, diese mikroskopische Kompression.
Dementsprechend weist ein hoher Kompressionsmodul (gemessen in N/cm²) auf einen hohen organisationsgrad auf mikroskopischer Ebene hin, spezifisch auf einen hohen Quervernetzungsgrad zwischen den Collagen-Molekülen. Ein niedriger Kompressionsmodul weist auf eine geringe Quervernetzung hin. Für geeignete Eigenschaften betreffend die physikalische Handhabung und zur Aufrechterhaltung der strukturellen Unversehrtheit des Implantats als solchem ist es wichtig, daß der Kompressionsmodul angemessen hoch ist, zumindest 20 N/cm² oder mehr. Die Obergrenzen des Kompressionsmoduls werden durch die Natur der Materialien bestimmt, und man nimmt an, daß Zusammensetzungen dieses Typs in der Tat keine Modulwerte deutlich oberhalb 100 N/cm² bei jeglichem Quervernetzungsgrad aufweisen können. In jedem Fall ist es für eine Aufrechterhaltung geeigneter physikalischer Eigenschaften für die Mittel der Erfindung entscheidend, daß der Kompressionsmodul über 20 N/cm² liegt, und ein bevorzugter Bereich ist 20-30 N/cm². (Wird eine größere Festigkeit gewünscht, kann das Mittel heißgehärtet werden, wie unten beschrieben, um einen Kompressionsmodul von 50-60 N/cm² zu erhalten.) Das resultierende, entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte Mittel wird anhand dieses Maßstabs beurteilt, um zu nachzuweisen, daß die erforderliche Kompressionswiderstandkraft erreicht ist.

Herstellung der Mittel

Im Verfahren der Erfindung wird das Mittel auf solche Weise hergestellt, daß eine feste, homogene Präparation von hohem Kompressionsmodul mit biologisch verfügbarem OF erhalten wird. Um dieses Ergebnis zu erhalten, muß der abschließende Trocknungsschritt für das Mittel erfolgen unter Verwendung eines Gemisches, welches eine Suspension von Collagen in einer Konzentration von 30-100 mg/ml, die erforderliche Menge an Mineral und den OF, gleichförmig in der Suspension verteilt, enthält. Dieses Material muß getrocknet werden bei im wesentlichen Umgebungsdruck, vorzugsweise bei leicht erhöhten Temperaturen. Eine Trocknung durch Lyophilisation im letzten Schritt erzeugt ein poröses Produkt, welches bezogen auf Festigkeit und Homogenität den Anforderungen nicht entspricht.
Entsprechend wird im zur Erzielung der Mittel der Erfindung erforderlichen Verfahren eine Suspension mit 30-100 mg/ml hypoimmunogenem, vorzugsweise Atelopeptid- und vorzugsweise rekonstituiertem fibrillärem Collagen, ausreichend, um im Mittel einen Endprozentanteil an Collagen von 2-40%, vorzugsweise 5-25% einzunehmen, und ausreichendem, partikulärem Mineral, um einen Endprozentanteil an Mineral von 60-98%, vorzugsweise 75-95%, zusammen mit ausreichendem OF, um das Äquivalent an Aktivität eines Einbaus von 0,5-4% der partiell gereinigten OFE-Präparation zu erzielen, bewegt, zu gewünschter Gestalt geformt und unter kontrollierten Bedingungen getrocknet, wie hierin beschrieben. Die Trocknung unter kontrollierten Bedingungen wird fortgesetzt, bis ein Feuchtigkeitsgehalt erreicht ist, der in einem festen Material mit einem Kompressionsmodul von zumindest 20 N/cm² resultiert.
Zur Herstellung eines Mittels größerer physikalischer Festigkeit, z.B. mit einem Kompressionsmodul von ca. 50-60 N/cm², wird das obengenannte resultierende Material einem Heißhärtungsverfahren bei 50-120ºC, vorzugsweise 75-90ºC, für 4-168 h unterworfen.
Um die Herstellung zu beginnen, wird eine verdünnte, wäßrige Lösung von OF, in einigen Ausführungen in schwacher Säure, mit dem gesamten oder einem Teil des Trägers gemischt. Da der Träger im wesentlichen aus einem Mineral- und einem Collagen- Bestandteil besteht, kann der CF entweder mit der Collagen- oder der Mineral-Präparation in einem vorbereitenden Schritt gemischt werden oder der OF kann in eine Suspension des Trägers gemischt werden.
Im allgemeinen wird das Mineral in partikulärer Form zugegeben. Das Collagen wird zu Beginn zugegeben als Suspension oder Gel (fibrilläres Collagen, FC) oder Lösung (nicht-fibrilläres Collagen, NFC).
In einer Anleitung wird der OF mit dem Collagen in einem vorbereitenden Schritt gemischt, und das Gemisch bei Raumtemperatur 12-24 h inkubiert, durch Zentrifugation gesammelt und so resuspendiert, daß die Collagenkonzentration innerhalb des 30-100 mg/ml-Bereichs mit einer Pufferlösung eingestellt wird. Die Suspension wird dann unter Bewegung mit dem Mineral-Bestandteil gemischt, zu der gewünschten Gestalt geformt, und dann einer kontrollierten Trocknung unterworfen bei niedriger oder Umgebungstemperatur. Alternativ wird das Mineral unter Bewegung in einem vorbereitenden Schritt zugegeben und das Gemisch einer kontrollierten Trocknung bei niedriger oder Umgebungstemperatur unterworfen. Der Collagen-Bestandteil wird dann zugegeben zur Bildung einer cohäsiven Masse mit der vorgeschriebenen Konzentration an Collagen, zu der gewünschten Gestalt geformt und dann einer kontrollierten Trocknung unterworfen.
In verwandten Anleitungen kann ein Teil, beispielsweise eine Hälfte oder ein Drittel oder drei Viertel der Gesamtheit der Collagen- und/oder der Mineral-Bestandteile in einem vorbereitenden Schritt zugegeben werden und der Rest später. Der zugegebene Anteil jedes Bestandteils muß nicht derselbe sein.
Die kontrollierte Trocknung dient dazu, den OF im Träger zu integrieren und die Homogenität aufrechtzuerhalten. Die Bedingungen der kontrollierten Trocknung bezogen auf Zeitdauer und Temperatur sind, selbstverständlich, wechselseitig voneinander abhängig; im allgemeinen sind jedoch Umgebungstemperaturen bevorzugt. Geeignete Temperatur liegen im Bereich von 1-40ºC, vorzugsweise ca. 15-37ºC. Unter diesen Bedingungen erstrecken sich effektive Zeiten von 10-20 h, oder zweckmäßigerweise über Nacht.
Im kontrollierten Trocknungsverfahren wird die Suspension einem aktiven oder passiven Gasstrom, vorzugsweise Luft, aber auch beispielsweise einem Inertgas, wie Stickstoff, ausgesetzt, bis die wahrnehmbare Feuchtigkeit verschwunden ist. Das getrocknete Produkt kann dann gelagert werden, kann zum Gebrauch rehydratisiert werden, falls eine Nachformung erforderlich ist, oder kann direkt eingesetzt werden.
Die folgenden Anleitungen repräsentieren typische, exemplarische Anleitungen: Figur 1 zeigt ein Schema für drei besonders bevorzugte Verfahren der Erfindung.
In Figur 1a wird eine OF-Präparation in verdünnter Lösung mit einer geeigneten Menge Mineral, vorzugsweise einer porösesn HA/TCP-Mischung, vermischt und sorgfältig gemischt. Das Material wird dann luftgetrocknet, um ein sorgfältig vereinheitlichtes Gemisch von Mineral und OF zu erhalten. Die relativen Mengen werden ausgewählt, um die erforderliche Aktivität an OF im fertigen Mittel zu erhalten entsprechend dem Grad der Aufreinigung des OF-Extrakts.
Der Collagen-Bestandteil wird dann als Collagen-Suspension einer Konzentration von 60-70 mg/ml an rekonstituiertem, fibrillärem Atelopeptid-Collagen eingesetzt. Das Collagen dieser Konzentration kann eingesetzt werden, wie kommerziell als Zyderm Collagen Implant erhältlich, oder kann, wie in Figur 1a gezeigt, unter Verwendung von Standardverfahren aus Collagen-in-Lösung hergestellt werden durch eine Inkubation mit einer geeigneten Konzentration an basischem Phosphatpuffer und eine Rückgewinnung des Präzipitats in geeigneter Verdünnung bei neutralem pH, um die gewünschte Konzentration zu erhalten. Der Collagen-Bestandteil und die Mineral/OF-Mischung können dann kombiniert werden, so daß der Prozentsatz an Mineral im gesamten Gemisch 60-98% beträgt, vorzugsweise 75-95%, und an Collagen 5-25%, zusammen mit ausreichendem OF, um die Aktivität von 0,5-4% partiell gereinigter OFE-Präparation zu erzielen. Diese Materialien werden sorgfältig durch Bewegung gemischt und zu der gewünschten Gestalt geformt vor der Lufttrocknung bei einer geeigneten Temperatur.
In einem alternativen Verfahren, gezeigt in Figur 1b, wird die OF-Präparation mit Collagen-in-Lösung (nicht-fibrillär) kombiniert. Das verdünnte Collagen wird dann rekonstituiert durch Behandlung mit 1/10 Volumen 0,2 M Phosphatpuffer, um ein Präzipitat zu bilden, welches den OF einschließt. Das pH des Phosphatpuffers wird zur Erzielung eines End-pH von 7,0-7,5 entsprechend ausgewählt. Nach einer geeigneten Inkubationszeit bei Umgebungstemperatur, d.h. ca. 12-24 hr, wird das Präzipitat zentrifugiert und gesammelt. Nach Einstellung der Konzentration auf ein geeignetes Maß, d.h., zwischen 30 und 100 mg/ml, wird die OF enthaltende Collagen-Matrix mit dem partikulären Mineral gemischt, geformt und bei einer geeigneten Temperatur luftgetrocknet, um das gewünschte, feste Implantat zu erzeugen.
Wie in Figur 1c gezeigt, kann eine gründliche Mischung von Mineral und OF-Präparation durch Lyophilisation getrocknet werden, um festes Mineral/OF zu erhalten, welches dann mit dem fibrillären Collagen in einer geeigneten Konzentration gemischt wird zur Formung und Lufttrocknung.
Andere Anleitungen können selbstverständlich verwendet werden, solange das dem kontrollierten Trocknungsverfahren unterworfene Endgemisch ein gleichförmiges, homogenes Gemisch des Mittels in den erforderlichen Anteilen mit ausreichend Wasser in der Suspension enthält, daß das Collagen in einer Konzentration von 30-100 mg/ml enthalten ist.
Die Mittel der Erfindung werden zu den geeigneten Ausgestaltungen geformt, um als Auflage-Transplantate verwendet werden zu können, in Knochenrekonstruktionen, in der Behandlung von Brüchen und bei anderen orthopädischen Indikationen, wie Spondylosyndese. Die Verfahren zum Einsatz fester Mittel zur Bildung solcher Implantate und chirurgische Verfahren zu deren Implantation sind wohlbekannt, und die Mittel der Erfindung sind nützlich für den Einsatz dieser Standardmittel und -verfahren.
Im Falle einer Plazierung an die erwünschte Stelle stellt das Implantationsmittel eine Matrix für das Einwachsen neuen Knorpels und Knochen dar und stimuliert zugleich die Herstellung dieser Materialien aufgrund der Anwesenheit Osteoinduktiver Faktoren.

Verwendung der Mittel

Die Mittel der Erfindung werden in einer allgemein im Stand der Technik bekannten Weise eingesetzt, um größere oder geringfügige, durch Verletzung, Erkrankung oder ererbte Defekte verursachte Schäden in Knochen zu reparieren.
Wie in den einzelnen Beispielen unten beschrieben, sind diese Mittel nach einer subkutanen Implantation in xenogene Wirte in der Lage, die Bildung von Knochengewebe zu stimulieren. Ihre Fähigkeit, dies zu bewirken, kann durch Explantierung des Mittels und eine histologische Beurteilung des Explantats betreffend Knorpel-Proteoglycan-Bildung, Anwesenheit von Calcium und Anwesenheit von alkalischer Phosphatase bestätigt werden. (Knorpel-Proteoglycan ist ein Maß für die Knorpelbildung; alkalische Phosphatase ist ein Indikator für kalzifizierenden, hypertrophen Knorpel.) Zusätzlich ist der Wirt nachweisbar frei von gegen das implantierte Material gerichteten Antikörpern.

C. Beispiele

Die folgendem Beispiele sollen die Erfindung illustrieren. Alternative Verfahren zur Herstellung der Bestandteile des Mittels und zur Herstellung des Mittels selbst fallen ebenfalls unter den Geltungsbereich dieser Erfindung, vorausgesetzt das resultierende Mittel fällt unter den Geltungsbereich der angefügten Ansprüche.

Beispiel 1

Untersuchung induktiver Implantate

Implantation

Proben wurden subkutan in die ventrale Thoraxregion von 30-34 Tage alten, männlichen Sprague-Dawley-Ratten implantiert. Jede Ratte erhielt seitlich zwei Implantate desselben Materials und Explantate wurden zur Untersuchung nach 14 und 28 Tagen entnommen. Die Explantate wurden histologisch und durch einen Test auf alkalische Phosphatase-Aktivität untersucht.

Charakterisierung der Histologie der Explantate

Nach 14 und 28 Tagen entfernte Explantate wurde einer histologischen Beurteilung unterworfen durch Fixierung in 10% neutralem Formalin für 26 h und darauffolgende Aufarbeitung für eine Paraff in-Einlagerung. 4-6 um-Schnitte wurden aus den eingelagerten Geweben entnommen und nachfolgend mit entweder Hematoxylin-Eosin oder Saphranin-O~ angefärbt. Saphranin-O ist für Proteoglycan aus Knorpel selektiv.

Test auf alkalischen Phosphatase-Aktivität

Das Maß der alkalischen Phosphatase-Aktivität kann als Indikator für eine Knochenbildung herangezogen werden. Um die alkalische Phosphatase (AP) zu bestimmen, wurden die Explantate in kleine Stücke geschnitten und homogenisiert in 3 ml eiskaltem 1,5 M NaCl, 3 mM NaHCO&sub3;, pH 7,5. Die homogenisierten Proben wurden dann bei 12000 Upm 50 min bei 4ºC zentrifugiert und ein Aliquot des Überstands 1:10 mit kaltem, destilliertem Wasser verdünnt. Das Verfahren von Huggins, et al., J. Exp. Med. (1961) 114:761 wurde verwendet, um alkalische Phosphatase unter Verwendung von Polystyren-Platten zu bestimmen.

Nicht-Immunogenität der Implantate

Sera werden aus den implantierten Tieren nach 28 d entnommen und auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen das implantierte Material untersucht unter Verwendung einer "enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA)-Technik; Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten werden mit 2-5 g jedes Bestandteils des Mittels in 20 mM Carbonatpuffer (100:1), pH 9,6, bei 4ºC über Nacht beschichtet. Die Vertiefungen in den Platten werden 3 mal mit 0,05% Tween 20 als oberflächenaktivem Stoff enthaltendem PBS gewaschen, um ungebundenes Antigen zu entfernen.
Die Sera werden dann für 2 h bei Raumtemperatur zugegeben und die Vertiefungen in den Platten 3 mal mit PBS-Tween 20 als oberflächenaktivem Stoff gewaschen. Ziege-anti Ratte-IgG, konjugiert mit Peroxidase aus Meerrettich (horseradish peroxidase) (Verdünnung 1:2000) wird zugegeben und die Vertiefungen in den Platten 1,5-2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundener, markierter Antikörper wird dann mit PBS-Tween 20 als oberflächenaktivem Stoff entfernt, und das Peroxidase-Substrat zugegeben. Die Platten werden bei Raumtemperatur 30 min inkubiert und die Platten dann bezüglich ihrer optischen Dichte gescannt.

Bestimmung des extrahierbaren Calciums

Die Knochenbildung kann ebenfalls durch die Bestimmung von Calcium beurteilt werden. Explantate werden in kleine Stücke geschnitten und in 1:10 (m/v)- und 1:20 (m/v)-Verdünnung in 0,5 N HCl suspendiert, um den Knochen aufzulösen. Die Proben werden weitere 5 Tage bei Raumtemperatur inkubiert und bei 12000 Upm 40 min zentrifugiert, und die Calciumkonzentration des Überstands durch Atomadsorptionsspektroskopie (Trace Analysis Laboratory, Hayward, Kalifornien) bestimmt.

Beispiel 2

Herstellung lyophilisierter induktiver Mittel

Partiell gereinigter OFE wurde als 3 mg/ml enthaltende Lösung in 0,01 N HCl verwendet.
Eine 5,4 ml-Probe der OFE-Lösung wurde mit 22 ml Vitrogen CIS bei 4ºC 5 min gerührt; 569 mg poröse HA/TCP-Keramik in partikulärer Form, erworben von Zimmer Corp., Warsaw, IN, wurde zugegeben und die Mischung bei 4ºC 5 min inkubiert, und daraufhin lyophilisiert. Der resultierende Feststoff bestand aus 87,5% Keramik, 10% nicht-fibrillärem Collagen (NFC), 2,5% OFE; alle Prozentangaben betreffend Feststoffe als Gewichtsprozent. Das durch dieses Verfahren hergestellte Mittel wird in den Figuren 2 und 3 als "Beispiel 2" bezeichnet (siehe Beispiel 5). Eine Kontroll-Präparation wurde auf identische Weise hergestellt, jedoch unter Verwendung von 0,01 N HCl anstelle der OFE-Lösung.

Beispiel 3

Herstellung kontrolliert-getrockneter induktiver Mittel

Partiell gereinigter OFE wurde als 3 mg/ml enthaltende Lösung in 0,01 N HCl verwendet. Eine 5,4 ml-Probe der OFE-Lösung wurde mit 569 mg HA/TCP, erworben von Zimmer, Corp., Warsaw, IN, bei 20ºC 5 min gerührt und dann bei 37ºC luftgetrocknet. Der resultierende Feststoff wurde sorgfältig mit 1,0 ml Zyderm Collagen Implant, Konzentration 65 mg/ml, (fibrilläres Collagen) gemischt und bei 37ºC bis zur Trockenheit luftgetrocknet. Der resultierende Feststoff bestand aus 87,5% Keramik, 10% fibrillärem Kollagen und 2,5% OFE; alle Prozentangaben betreffend Feststoffe als Gewichtsprozent. Das Mittel wird als "Beispiel 3" in den Figuren 2 und 3 bezeichnet. Eine Kontroll- Präparation wurde auf identische Weise hergestellt, jedoch unter Verwendung von 0,01 N HCl anstelle der OFE-Lösung.

Beispiel 4

Alternatives Verfahren zur Herstellung kontrolliert-getrockneter induktiver Mittel

Partiell gereinigter OFE wurde als 3 mg/ml enthaltende Lösung in 0,01 N HCl verwendet. Eine 6,5 ml-Probe der OFE-Lösung wurde mit 25 ml Vitrogen Collagen-in-Lösung, Konzentration 3 mg/ml, und 3,5 ml 0,2 M Na&sub2;HPO&sub4;/0,09 M NaOH, pH 11,2, gerührt. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 16-20 h inkubiert, d.h. zweckmäßigerweise über Nacht. Das resultierende Copräzipitat aus OFE und fibrillärem Collagen (FC) wurde durch Centrifugation bei 13000 g 30 min gesammelt. Die Proteinkonzentration des Copräzipitats wurde mit PBS auf 65 mg/ml eingestellt.
Das OFE- und FC-Copräzipitat einer Konzentration von 65 mg/ml wurde mit 569 mg HA/TCP, erworben von Zimmer Corp., Warsaw, IN, gemischt und bei 37ºC bis zur Trockenheit luftgetrocknet. Der resultierende Feststoff bestand aus 87,5% Keramik, 10% fibrillärem Collagen und 2,5% OFE; alle Prozentangaben betreffend Feststof fe als Gewichtsprozent. Eine Kontroll-Präparation wurde auf identische Weise hergestellt, jedoch unter Verwendung von 0,01 N HCl anstelle der OFE-Lösung.

Beispiel 5

Vergleich verschiedener induktiver Mittel

Implantation

Das entsprechend Beispiel 2 hergestellte Material (lyophilisiertes OFE/NFC/Keramik) wurde mit annähernd einem halben Volumen Wasser hydratisiert, 5 Minuten gequollen und zu wünschenswert dimensionierten Formen vor der Implantation geformt.
Das entsprechend Beispiel 3 hergestellte Material (luftgetrocknetes OFE/FC/Keramik) wurde in trockener Form implantiert.

Knochenbildung

Das jeweilige Ausmaß der alkalischen Phosphatase/(AP)-Aktivität ist in Figur 2 für 14 und 28 Tage nach der Implantation gezeigt. Sämtliche OFE-enthaltenden Mittel zeigten ein hohes Maß an AP-Aktivität nach 14 Tagen. Nach 28 Tagen hatten sämtliche Aktivitätswerte abgenommen, wie im Laufe des Abschlusses des Knochenbildungsprozesses erwartet; das Material aus "Beispiel 3" zeigt jedoch bemerkenswert höhere Aktivitätsniveaus.

Histologische Prüfung

Die Ergebnisse der histologischen Prüfung der Explantate sind in den Figuren 3A (nach 14 Tagen) und 3B (nach 28 Tagen) gezeigt. Sämtliche 0FE-enthaltenden Proben zeigten mäßige bis gute Knorpel- und Knochenbildung in 14 Tagen. Nach 28 Tagen bestand eine gute Knochenbildung und Knochenmark-Differenzierung. Zu beiden Zeitpunkten verstärkte das entsprechend Beispiel 3 hergestellte Mittel der Erfindung nachweislich die Knochenbildung wirksamer als das ohne Lufttrocknung entsprechend Beispiel 2 hergestellte Material.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines hypoimmunogenen Mittels, das geeignet ist zur Implantation, um eine Knochenreparatur bei einem Wirbeltier zu erreichen,

wobei das Mittel umfaßt eine osteoinduktiv wirksame Menge eines Protein-osteoinduktiven Faktors (OF), wobei der OF ausreichend rein ist, um bei einem xenogenen Wirt hypoimmunogen zu sein, und einen Träger mit Bestandteilen, die im wesentlichen aus Mineral bestehen, das 60 bis 98% ausmacht, und Collagen, das 2 bis 40 Gew.-% des Mittels ausmacht,

wobei das Verfahren umfaßt:

(a) Herstellung einer gleichförmigen Suspension des Collagens, des Minerals und der OF-Komponenten des Mittels in Wasser, so daß die Konzentration an Collagen in der Suspension 30-100 mg/ml beträgt, und

(b) kontrolliertes Trocknen der Suspension bei Umgebungsdruck, um einen starren Feststoff zu erhalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Trocknen fortgesetzt wird, bis der Feststoff einen Kompressionsmodul von mindestens 20 N/cm² besitzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Trocknen bei einer Temperatur von 1 bis 40ºC während 10 bis 20 h durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Trocknen bei einer Temperatur von 15 bis 37ºC durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner ein Heißhärten des Produktes nach (b) umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Heißhärten bei 50 bis 120ºC während 4 bis 168 h durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Suspension (a) hergestellt wird durch Vermischen einer verdünnten Lösung von OF mit Mineralteilchen, Trocknen des Gemisches und Vermischen des trockenen Gemisches mit einer rekonstituierten fibrillären Atelopeptid-Collagen-Suspension, enthaltend 30 bis 100 mg/ml Collagen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Suspension (a) hergestellt worden ist durch Zugabe einer Lösung von OF zu Collagen in Lösung, Ausfällen von Collagen und OF, Resuspendieren des Niederschlags auf eine Collagenkonzentration von 30 bis 100 mg/ml und anschließendes Vermischen der erhaltenen Suspension mit Mineralteilchen.

9. Hypoimmunogenes Mittel, das geeignet ist zur Implantation, um eine Knochenreparatur bei einem Wirbeltier zu erreichen, bestehend im wesentlichen aus 60 bis 98 Gew.-% Mineralteilchen, 2 bis 40 Gew.-% hypoimmunogenem Atelopeptid-Collagen und einer wirksamen Menge einer CF-Zubereitung,

wobei das Implantat ein poröser starrer Feststoff mit einem Kompressionsmodul > 20 N/cm² ist, der, bezogen auf seine Komponenten, homogen ist, und wobei das OF in biologisch aktiver und verfügbarer Form vorliegt.

10. Mittel nach Anspruch 9, wobei die wirksame Menge der OF-Zubereitung 0,5 bis 4% partiell gereinigtes OF oder dessen Äquivalent ist.

11. Mittel nach Anspruch 10, bestehend im wesentlichen aus 75 bis 95% Mineralteilchen. 5 bis 25% hypoimmunogenem Atelopeptid- Collagen und einer wirksamen Menge einer OF-Zubereitung.

12. Hypoimmunogenes Mittel, das geeignet ist zur Implantation, um eine Knochenreparatur bei einem Wirbeltier zu erzielen, umfassend eine osteoinduktiv wirksame Menge eines Protein-osteoinduktiven Faktors (OF), abgeleitet von Knochen, wobei das OF ausreichend rein ist, um bei einem xenogenen Wirt hypoimmunogen zu sein, und wobei das Mittel mindestens 75 Gew.-% Mineralträger umfaßt.

13. Hypoimmunogenes Mittel nach Anspruch 12, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) einem Mittel mit 85 bis 95% Mineralträger, 5 bis 15% Atelopeptid-Collagen, und wobei die Menge an OF derjenigen entspricht, die erreicht wird durch Einbau von etwa 0,5% bis 4 Gew.-% des Implantats an partiell gereinigtem OF;

(b) einem Mittel mit 87,5% TCP/HA-Gemisch und 10% nichtfibrillärem oder fibrillärem Collagen, und wobei die Menge an OF derjenigen entspricht, die erreicht wird durch Einbau von etwa 2,5 Gew.-% des Implantats an partiell gereinigtem OF; und

(c) einem Mittel mit 91,5% TCP/HA-Gemisch und 6% rekonstituiertem fibrillärem Collagen. und wobei die Menge an OF derjenigen entspricht, die erreicht wird durch Einbau von etwa 2,5 Gew.-% des Implantats an partiell gereinigtem OF.