DE69839311T2

DE69839311T2 - Verfahren zum vernetzen von filmen, folien und schüttgut

Info

Publication number: DE69839311T2
Application number: DE69839311T
Authority: DE
Inventors: Scott F. San Antonio TIMMONS; Cheryl R. Blanchard; Robert A. Jackson SMITH
Original assignee: Keraplast Technologies Ltd
Current assignee: Keraplast Technologies Ltd
Priority date: 1997-11-26
Filing date: 1998-11-25
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2018-11-26
Also published as: DE69839311D1; US5948432A; US6165496A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Produkte, die aus von Haar stammendem Keratin gebildet sind. Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung aus Keratin gebildete Filme, Folien und Rohmaterialien. Die vorliegende Erfindung betrifft ein vernetztes Roh-, Film- oder Folienmaterial auf Keratinbasis zur Verwendung in biomedizinischen Implantaten, Wundverbänden und Gewebezüchtungsanwendungen. Genauer gesagt betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Material, das hauptsächlich auf α-Keratin basiert, welches durch Vernetzen von Keratin hergestellt wird, das aus einer löslichen Fraktion eines keratinhältigen Materials, wie z. B. Haar, stammt.
Stand der Technik
Chronische Wunden können durch eine Vielzahl an Vorkommnissen, unter anderem durch Operationen, anhaltende Bettruhe und traumatische Verletzungen, hervorgerufen werden. Wunden, die sich über einen Teil der Dicke erstrecken, können Verbrennungen zweiten Grades, Abschürfungen und Hauttransplantationsdonorstellen umfassen. Die Abheilung dieser Wunden kann problematisch sein, besonders bei Fällen von Diabetes mellitus oder chronischen Immunerkrankungen. Bei Wunden, die sich über die gesamte Dicke erstrecken, bleibt keine Haut übrig, dabei kann es sich um das Resultat von Traumen, Diabetes (z. B. Beingeschwüre) und venöser Stase handeln, die an den unteren Extremitäten Geschwüre über die ganze Dicke hervorrufen können. Wunden über die ganze Dicke neigen dazu, sehr langsam zu heilen. Richtige Wundversorgungsverfahren, unter anderem die Verwendung von Wundverbänden, sind von besonders großer Bedeutung für das erfolgreiche Management chronischer Wunden. Schätzungen zufolge betreffen chronische Wunden etwa vier Millionen Menschen pro Jahr, was zu Milliarden-Dollar-Beträgen an Kosten für das Gesundheitssystem führt. T. Phillips, O. Kehinde und H. Green, Treatment of Skin Ulcers with Cultivated Epidermal Allografts, J. Am. Acad. Dermatol., Band 21, 191–199 (1989).
Der Wundheilungsprozess umfasst eine komplexe Reihe biologischer Wechselwirkungen auf zellulärer Ebene, die in drei Phasen eingeteilt werden können: Hämostase und Entzündung; Bildung von Granulationsgewebe und erneute Epithelialisierung; und Remodellierung. R.A.F. Clark, Cutaneous Tissue Repair: Basic Biological Considerations, J. Am. Acad. Dermatol., Band 13, 701–725 (1985). Keratinozyten (Epidermiszellen, die Keratin produzieren und enthalten) migrieren von Wundrändern, um die Wunde zu bedecken. Wachstumsfaktoren, wie z. B. der transformierende Wachstumsfaktor β (TGF-β), spielen eine entscheidende Rolle in der Stimulation des Migrationprozesses. Die Migration tritt im Bestfall unter der Abdeckung einer feuchten Schicht auf. Es wurde herausgefunden, dass Keratine für die erneute Epithelialisierung notwendig sind. Spezifisch wurde herausgefunden, dass die Keratintypen K5 und K14 in den unteren erzeugenden Epidermiszellen und die Typen K1 und K10 in den oberen differenzierten Zellen zu finden waren. Wound Healing: Biochemical and Clinical Aspects, I. K. Cohen, R. F. Diegleman und W. J. Lindblad (Hrsg.), W. W. Saunders Company (1992). Von den Keratintypen K6 und K10 wird angenommen, dass sie in heilenden Wunden, jedoch nicht in normaler Haut vorhanden sind. Keratine sind wichtige Strukturproteine aller Epithelzelltypen und scheinen bei der Wundheilung eine bedeutende Rolle zu spielen.
Ein optimaler Wundverband schützt das verletzte Gewebe, erhält eine feuchte Umgebung, ist wasserdurchlässig, erhält eine mikrobielle Kontrolle aufrecht, sorgt für die Anlieferung von Heilmitteln an die Wundstelle, ist leicht anzulegen, erfordert kein häufiges Wechseln und ist nicht-toxisch und nicht-antigen. Obwohl sie für chronische Wunden nicht ideal sind, sind momentan mehrere Wundverbände auf dem Markt, unter anderem Verschlussverbände, nicht-adhärente Verbände, absorbierende Verbände sowie Verbände in Form von Folien, Schäumen, Pulvern und Gelen. S. Thomas, Wound Management and Dressing, The Pharmaceutical Press, London (1990).
Es wurden Versuche unternommen, verbesserte Verbände bereitzustellen, die den Wundheilungsprozess unter Verwendung biologischer Materialien, wie z. B. von Wachstumsfaktoren, unterstützen würden. Bis zum jetzigen Zeitpunkt erwiesen sich diese biologischen Materialien als sehr kostspielig und zeigten bei der Beschleuni gung des Heilungsprozesses chronischer Wunden minimale klinische Relevanz. In Fällen schwerwiegender Wunden über die gesamte Dicke werden oftmals Autotransplantate (Hauttransplantate vom Körper des Patienten) verwendet. Obwohl das Transplantat nicht-antigen ist, muss es einer Spenderstelle auf dem Körper des Patienten entnommen werden, wodurch eine zusätzliche Wunde geschaffen wird. Zusätzlich dazu kann die Verfügbarkeit von autologem Gewebe nicht ausreichend sein. Allotransplantate (Hauttransplantate von anderen Spendern als dem Patienten) werden ebenfalls verwendet, wenn Donorstellen keine Option darstellen. Allotransplantate stellen im Wesentlichen einen „Wundverband" bereit, der eine feuchte, wasserdurchlässige Schicht darstellt, jedoch normalerweise vom Patienten innerhalb von zwei Wochen abgestoßen wird und nicht Teil der neuen Epidermis wird.
Was wünschenswert wäre und vordem noch nicht bereitgestellt wurde, ist ein Wundverband, der das verletzte Gewebe schützt, eine feuchte Umgebung erhält, wasserdurchlässig ist, leicht anzulegen ist, kein häufiges Wechseln erfordert und nichttoxisch und nicht-antigen ist sowie, was am wichtigsten ist, wirksame Heilmittel an die Wundstelle anliefert.
Mit lebendigem Gewebe kompatible Filmmaterialien eignen sich für eine Reihe von Anwendungen einschließlich Gewebezüchtungsgerüste, Diffusionsmembranen, Beschichtungen für implantierbare Vorrichtungen und Zellverkapselungen. Mit lebendigem Gewebe kompatible Keratinrohmaterialien eignen sich für eine Reihe von Anwendungen einschließlich offenzelliger Gewebezüchtungsgerüste und vernetzter Biorohmaterialien.
Die Gewebetechnologie ist ein schnell wachsendes Gebiet, das eine Reihe verschiedener Technologien umfasst, deren Ziel es ist, Gewebe- und Organfunktion zu ersetzen oder wiederherzustellen. Der konstante Erfolg eines Gewebezüchtungsimplantats beruht auf der Erfindung eines biokompatiblen, mitogenen Materials, welches das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung erfolgreich unterstützen kann und sich in existierendes Gewebe integrieren kann. Solch ein Grundgerüstmaterial könnte den Status der Gewebezüchtungsverfahren weit vorantreiben und zu einer breiten An ordnung von Gewebezüchtungsimplantaten führen, die zelluläre Komponenten, wie z. B. Osteoblasten, Chondrozyten, Keratinozyten und Hepatozyten, enthalten, um Knochen-, Knorpel-, Haut- bzw. Lebergewebe wiederherzustellen oder zu ersetzen.
Diffusionsmembranen sind herkömmlich eher aus synthetischen Polymermaterialien als aus biologischen Materialien gebildet. Diffusionsmembranen, die aus biologischen Materialien stammen, weisen den Vorteil der erhöhten Biokompatibilität auf. Insbesondere nicht-antigene Diffusionsmembranen eignen sich zur Implantation im menschlichen Körper und würden große Vorteile in Anwendungen zur kontrollierten Freisetzung von Wirkstoffen bereitstellen.
Implantierbare Vorrichtungen, wie z. B. Schrittmacher, Stents, orthopädische Implantate, urologische Implantate, Zahnimplantate, Brustimplantate und Implantate zur Kiefer-Gesichts-Rekonstruktion, bestehen gegenwärtig aus oder sind umhüllt von Materialien, die Titan, Silicon, Edelstahl, Hydroxyapatit und Polyethylen umfassen, oder in Materialien, wie z. B. Silicon oder Polyurethan, verkapselt. Diese Metalle, Keramiken und synthetischen Polymere weisen Nachteile hinsichtlich Biokompatibilität und Antigenität auf, die zu Problemen in Bezug auf den Langzeitgebrauch dieser Vorrichtungen führen können. Ein aus biologischen Materialien stammendes Beschichtungsmaterial mit nicht-antigenen und mitogenen Eigenschaften würde einer Vorrichtung den Vorteil der In-vivo-Langzeitbiokompatibilität bereitstellen und die Nutzlebensdauer eines Implantats möglicherweise verlängern, während gleichzeitig das Risiko einer allergischen oder negativen Immunantwort des Wirts gesenkt wird.
Zellverkapselungsmittel, wie z. B. Chitin/Alginat und von Rindern stammendes Kollagen, werden eingesetzt, um Säugetierzellen für Anwendungen, wie z. B. Gewebezüchtung/Organregeneration, und Bakterien für Klonierungsanwendungen zu verkapseln. Ein nicht-antigenes, nicht-bioresorbierbares Zellverkapselungsmaterial würde die Vorteile der Bereitstellung einer Zelle mit einem Mitogen bieten und die Chancen erhöhen, dass die Zelle ihre Gewebezüchtungsfunktion erfüllt.
Ein vernetztes, implantierbares Rohbiomaterial, das nicht-antigen ist und die geeigneten mechanischen Eigenschaften aufweist, könnte zur Gesichts-Kiefer-Wiederherstellung, beispielsweise sowohl als Weich- als auch Hartgewebeersatz, eingesetzt werden. Ein solches Rohmaterial könnte auch für orthopädische Anwendungen, z. B. als Knochenfüllmittel und zur Knorpelregeneration, eingesetzt werden. Ein implantierbares Rohmaterial könnte auch für neurologische Anwendungen, wie z. B. Nervenregenerations-Leitschienen, verwendet werden.
Keratin, das häufig aus Wirbeltierhaaren stammt, wurde zu verschiedenen Formen verarbeitet. Das gemeinsam abgetretene US-Patent 5.358.935 offenbart mechanisch zu keratinhältigem Pulver verarbeitetes menschliches Haar. Das Haar wird gebleicht, gespült, getrocknet, zerkleinert, homogenisiert, ultraschallbehandelt und aus dem Lösungsmittel entfernt, wodurch ein Keratinpulver zurückbleibt. Im US-Patent 5.047.249 bespricht Rothman die Aktivierung von Keratin mit einem Reduktionsmittel und das Auftragen des aktivierten Keratins auf eine Wunde. Rothman geht davon aus, dass die aktivierten Keratinthiolgruppen mit Thiolgruppen in dem Wundengewebe reagieren und eine Disulfidbindung bilden, wodurch ermöglicht wird, dass das Keratin an der Wunde haftet und diese schützt.
Es wird davon ausgegangen, dass aus Keratin stammende Materialien nicht-antigen sind, insbesondere wenn sie aus patienteneigenem Keratin stammen. Ein aus einem Material auf Keratinbasis gebildeter Film wäre wünschenswert. Ein für Gewebezüchtungsgerüste, Diffusionsmembranen, implantierbare Vorrichtungsbeschichtungen und Zellverkapselungsmittel einsetzbarer Keratinfilm wäre sehr nützlich. Ein festes Keratinrohmaterial würde ebenfalls von großer Nützlichkeit sein. Darüber hinaus würde sich ein nicht-antigenes, mitogenes offenzelliges Keratingerüst bei der Verwendung als Gewebezüchtungsgerüst als äußerst hilfreich erweisen, um das Zellwachstum vor und nach der Implantation zu tragen, zu erhalten und zu stimulieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine poröse Gewebezüchtungsstruktur, die vernetztes Keratin umfasst.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen porösen Gewebezüchtungsgerüsts, das Folgendes umfasst:
Bereitstellung einer Keratinlösung, umfassend Keratin mit freien Thiolgruppen, in einem ersten Lösungsmittel;
Emulgieren der Keratinlösung in einem zweiten Lösungsmittel, wobei das zweite Lösungsmittel mit dem ersten Lösungsmittel im Wesentlichen nicht mischbar ist und das Keratin im zweiten Lösungsmittel im Wesentlichen unlöslich ist;
Einfrieren der Emulsion;
Entfernung eines wesentlichen Anteils der ersten und zweiten Lösungsmittel unter Vakuum und bei niedriger Temperatur, sodass sich ein poröses Keratinmaterial ausbildet; und
Kontaktieren des porösen Keratinmaterials mit einem Oxidationsmittel unter Bedingungen, die geeignet sind, um Disulfidvernetzungen aus einem Teil der freien Thiolgruppen zu bilden.
Ein weiteres Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines solchen porösen Gewebezüchtungsgerüsts umfasst Folgendes:
Bereitstellung des Keratinproteinmaterials mit Disulfidbindungen;
Reduktion des Keratinproteins, um Disulfidbindungen zu zerstören, um erste und zweite Fraktionen von Keratinproteinen zu erhalten, wobei die erste Fraktion wasserlöslicher ist als die zweite Fraktion;
Platzieren der wasserlöslicheren Fraktion in ein Lösungsmittel und Abscheiden des Lösungsmittels, das die wasserlösliche Fraktion enthält, auf ein offenzelliges Material;
Entfernung eines wesentlichen Anteils des Lösungsmittels aus dem offenzelligen Material; und
Oxidieren des auf das offenzellige Material abgeschiedenen Keratins.
Die vorliegende Erfindung umfasst eine aus vernetztem Keratin bestehende Folie, die kein synthetisches Bindungsmittel erfordert. Es wird angenommen, dass die Folie durch wiedergebildete Disulfidbindungen und Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten wird. Die Folie wird vorzugsweise als Wundheilverband eingesetzt. Ferner wird sie vorzugsweise als Gewebezüchtungszellgerüst für Implantatanwendungen eingesetzt. Die Folie kann aus einer Kombination aus löslichen und nicht-löslichen, aus Haaren stammenden Proteinfraktionen gebildet werden, die α- und β-Keratinfraktionen umfassen. Keratin kann aus einer Reihe von Quellen erhalten werden, die menschliches oder tierisches Haar und Finger- oder Zehennägel umfassen, wobei eine Quelle Haar des Patienten oder eines Spenders ist.
Die Folie kann durch Bereitstellung einer unlöslichen, chemisch modifizierten, in Wasser suspendierten Keratinfraktion und durch Senkung des pH-Werts – bis das Keratinprotein teilweise gequollen ist – gebildet werden. Teilweises Quellen ist als ein solches Proteinmolekülquellen definiert, dass sich die resultierende Suspension von Keratinteilchen wie eine kolloidale Suspension verhält. In einem Verfahren wird konzentrierte Schwefelsäure zugesetzt, bis ein pH von weniger als 1 erreicht ist. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung gehen davon aus, dass der niedrige pH-Wert die Wasserstoffbrückenbindungen unterbricht, die die Keratinfraktion unlöslich macht, wodurch ermöglicht wird, dass das Protein teilweise quillt. Das teilweise gequollene Keratin wird anschließend mit Ammoniumhydroxid basisch gemacht. Die Behandlung tauscht die nichtflüchtige Säure mit einer flüchtigen Base aus, die beim Trocknen entfernt wird. Alternativ dazu kann eine flüchtige Säure, wie z. B. Ameisensäure, eingesetzt werden, wodurch die Erfordernis nach einer weiteren Behandlung mit einer flüchtigen Base aufgehoben wird. Die resultierende Aufschlämmung kann anschließend auf eine flache Oberfläche oder Form mit geeigneter Geometrie und Oberflächenglätte gegossen und luftgetrocknet werden, um eine vernetzte Keratinfolie herzustellen. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung gehen davon aus, dass die Vernetzungen aus Thiolgruppen, die Disulfidbindungen wiederbilden, und aus dem Amin und den Carbonsäuregruppen, die Wasserstoffbrücken bilden, resultieren.
Die resultierende Folie besteht folglich aus reinem Keratin. Keratin hat sich als biokompatibel, als nicht-immunogen, als keine aktivierten T-Zellen hemmend und daher als nicht in die normale zellvermittelte Immunantwort eingreifend und als mitogen für Keratinozyten, Fibroblasten und menschliche Mikrogefäßendothelzellen erwiesen. Es zeigte sich auch in Wundheilungsstudien an Ratten und Menschen, dass Keratin die Epithelialisierung beschleunigt.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die teilweise Oxidation der Keratindisulfidbindungen zur Bildung von hydrophilen Gruppen. Ein solches Verfahren umfasst die Behandlung des Keratins mit Peressigsäure zur Bildung von Sulfonsäuregruppen aus einem wesentlichen, jedoch nicht dem Gesamtanteil an Disulfidbindungen. Der Großteil der Sulfonsäuregruppen bleibt in dem Endprodukt als hydrophile Gruppen zur Bindung von Wasser und zur Hydratisierung des Keratinmaterials zurück. Ein späterer Reduktionsschritt spaltet viele der restlichen Disulfidbindungen zur Bildung von Cysteinresten ab. Das teilweise oxidierte und reduzierte Keratin kann anschließend in Lösung gegeben, eingeengt und auf eine flache Oberfläche gegossen werden, um Disulfidvernetzungen zu oxidieren und wiederzubilden. In einem Verfahren dient der Sauerstoff in der Luft als Oxidationsmittel, wobei das Keratin luftgetrocknet wird, um einen Film auf der flachen Oberfläche auszubilden. Die feuchte Keratinfolie, welche hauptsächlich aus Keratin besteht, das von β- Keratin stammt, hat die Beschaffenheit von feuchtem, dickem Papier. Die Folie trocknet zu einem brüchigen Material, das zu einem biegsamen, hautähnlichen Material rehydratisiert werden kann. Die rehydratisierte Folie schaut aus und fühlt sich an wie Haut, während gleichzeitig die Feuchtigkeit in der Folie und innerhalb der Wunde beibehalten wird. Die Folie kann als Wundheilverband oder als Zellwachstumsgerüst eingesetzt werden. Die Folie kann nach Wunsch zugeschnitten und geformt werden, bevor sie auf die Wunde aufgetragen wird. Die Keratinfolien stellen einen nicht-antigenen Wundverband bereit, der die Wunde feucht hält, damit Epithelzellen migrieren können, und ein Gerüst für das Zellwachstum für Gewebezüchtungsimplantate bereitstellt. Andere Anwendungen für diese Keratinfolie umfassen die Verwendung als Diffusionsmembranen und als Verkapselungsmittel für Zellen.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren zur Bildung von Dünnfilmen, offenzelligen Schaumstoffen und Rohmaterialien auf Keratinbasis. Die Dünnfilme eignen sich zur Verwendung als Wundverbände, Gewebezüchtungsgerüste, Diffusionsmembranen, Beschichtungen für implantierbare Vorrichtungen und Zellverkapselungsmittel. In einem Verfahren wird zugeschnittenes, gewaschenes, gespültes und getrocknetes Wirbeltierhaar bereitgestellt. Das Haar wird mit einem Reduktionsmittel reduziert, sodass ein Teil der Disulfidbindungen aufgebrochen wird und eine löslichere Keratinfraktion sowie eine weniger lösliche Keratinfraktion gebildet werden. Die löslichere Keratinfraktion wird abgetrennt, abgenommen und auf eine Oberfläche abgeschieden, wodurch sich eine Schicht der löslicheren Keratinfraktion bildet. Die Keratinschicht wird einem Oxidationsmittel, wie z. B. Luft, Sauerstoff oder H₂O₂, ausgesetzt und vorzugsweise getrocknet. Die freien Thiolgruppen werden mit einem Oxidationsmittel oxidiert, wobei der resultierende Keratinfilm durch die neu gebildeten Disulfidbindungen gefestigt wird. Durch die Zugabe von Vernetzern, wie z. B. Glutaraldehyd, kann ein höherer Vernetzungsgrad und folglich eine erhöhte Festigkeit erzielt werden.
In einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Keratinlösung bereitgestellt, wobei das Keratin in einem ersten Lösungsmittel, wie z. B. wässrigem Thioglykolat, gelöst ist. Das Keratin weist freie Thiolgruppen auf, die durch Verfah ren, wie z. B. Reduktion mit Ammoniumthioglykolat, hergestellt werden. Ein zweites Lösungsmittel, wie z. B. Hexan oder Freon, wird bereitgestellt, wobei das zweite Lösungsmittel mit dem ersten Lösungsmittel vorzugsweise im Wesentlichen nicht mischbar ist und das Keratin in dem zweiten Lösungsmittel vorzugsweise im Wesentlichen unlöslich ist. Eine Emulsion des zweiten Lösungsmittels in der Keratinlösung kann unter Einsatz eines Homogenisators ausgebildet werden. Die Emulsion wird gefriergetrocknet, vorzugsweise indem die Emulsion eingefroren und die ersten und zweiten Lösungsmittel im Vakuum entfernt werden, was ein poröses Keratinmaterial ergibt. Das poröse Keratinmaterial kann in Gegenwart eines Oxidationsmittels auf Raumtemperatur erwärmt werden, was die Bildung der Disulfidbindungen zwischen den Keratinen fördert. In einem Verfahren ist das Oxidationsmittel ein sauerstoffhältiges Gas, wie z. B. Luft. In einem weiteren Verfahren wird Wasserstoffperoxid vor der Homogenisierung mit der Keratinlösung vermischt. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung gehen davon aus, dass das resultierende Material ein offenzelliges Gerüst mit im Wesentlichen kugelförmigen Hohlräumen, die dem zweiten Lösungsmittel in der Emulsion entsprechen, und eine vernetzte Keratinstruktur ist, die der Keratinlösung in der Emulsion entspricht.
In einem weiteren Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Keratinlösung bereitgestellt, wobei das Keratin in einem Lösungsmittel, wie z. B. wässrigem Thioglykolat, gelöst ist. Das Keratin weist freie Thiolgruppen auf, die durch Verfahren, wie z. B. Reduktion mit Ammoniumthioglykolat, gebildet wurden. Das Keratin kann zerstäubt und auf eine sehr kalte Oberfläche gesprüht werden, die so kalt ist, dass die Keratinlösung darauf gefriert. In einem Verfahren ist die Oberfläche die Oberfläche einer Form. Es kann noch mehr Keratinlösung zerstäubt und über das bereits gefrorene Keratin gesprüht werden, wodurch eine dickere offenzellige Schicht des gefrorenen Keratins gebildet wird. Das gefrorene Keratin kann durch Entfernen zumindest eines wesentlichen Anteils des Lösungsmittels und vorzugsweise des gesamten Lösungsmittels bei niedrigem Druck und geringer Temperatur gefriergetrocknet werden. Das Keratinmaterial kann in Gegenwart eines Oxidationsmittels auf Raumtemperatur erwärmt werden, wodurch die Bildung von Disulfidbindungen innerhalb der gebildeten Keratinfeststoffe und zwischen den gebildeten Keratinfeststoffen gefördert wird. In einem Verfahren umfasst das Oxidationsmittel gasförmigen Sauerstoff. In einem anderen Verfahren umfasst das Oxidationsmittel zur Keratinlösung zugesetztes Wasserstoffperoxid. Die Anmelder gehen davon aus, dass die resultierende Struktur ein offenzelliges Gerüst mit im Wesentlichen kugelförmigen Keratinstrukturen ist, die dem zerstäubten Keratin entsprechen und Hohlräume dazwischen aufweisen. Die Anmelder gehen davon aus, dass die im Wesentlichen kugelförmigen Keratinstrukturen darin ausgebildete Disulfidbindungen aufweisen und dass die Strukturen an jenen Stellen zwischen den Strukturen Disulfidbindungen aufweisen, an denen sie sich berühren.
In einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden Haare zugeschnitten, gewaschen, getrocknet und in Ammoniumhydroxid suspendiert, das Ammoniumthioglykolat enthält. Die Suspension ist unter Stickstoffatmosphäre. Die basische Ammoniumthioglykolatlösung dient zur Solubilisierung des Keratins und reduziert die Disulfidvernetzungen. Cysteinthiolgruppen und Cysteinthioglykolatgruppen werden aus den aufgebrochenen Disulfidbindungen gebildet. Die Stickstoffatmosphäre dient dazu, die Oxidation und die erneute Bildung der Disulfidbindungen zu verhindern. Nach dem Erhitzen folgt vorzugsweise eine Zerkleinerung der Haarteilchen mit einem Gewebehomogenisator gefolgt von weiterem Erhitzen unter Stickstoffatmosphäre. Daraus resultiert eine feine Keratinsuspension.
Die feine Keratinsuspension wird zentrifugiert, und der Überstand, welcher eine löslichere Keratinfraktion enthält, wird abgenommen und mit Säure ausgefällt. Der Niederschlag wird in Ammoniumhydroxid resuspendiert. Die Keratinlösung wird anschließend als Dünnfilm auf eine Oberfläche gegossen und an der Luft trocknen gelassen. Die Luft dient dazu, Wasser zu entfernen, das Keratin einzuengen und die Cysteinthiolgruppen zu oxidieren, wodurch Disulfidbrücken gebildet werden und der Film gefestigt wird. Durch den Einsatz chemischer Mittel, wie z. B. Glutaraldehyd, kann eine zusätzliche Vernetzung erzielt werden. Der resultierende Film ist widerstandsfähig und unlöslich.
In einem Verfahren wird zugeschnittenes, gewaschenes, gespültes und getrocknetes Wirbeltierhaar bereitgestellt. Das Haar wird mit einem Reduktionsmittel reduziert, sodass ein Teil der Disulfidbindungen aufgebrochen wird und eine löslichere Keratinfraktion und eine weniger lösliche Keratinfraktion gebildet werden. Die löslichere Keratinfraktion wird abgetrennt, abgenommen und eingeengt, und die löslichere Keratinfraktion wird in eine Form abgeschieden. Die eingeengte Keratinlösung in der Form wird einem Oxidationsmittel oder Vernetzer ausgesetzt und vorzugsweise getrocknet. Die freien Thiolgruppen werden mit dem Oxidationsmittel oxidiert oder mit dem Vernetzer vernetzt, und das Keratin wird durch die neu gebildeten Disulfidbindungen gefestigt. In einem anderen Verfahren wird die eingeengte Keratinlösung entweder in eine kalte Form zerstäubt oder mit einem polaren Lösungsmittel vermischt, emulgiert und gefriergetrocknet, um ein offenzelliges Material zu bilden. Die Keratinlösung wird einem Oxidationsmittel oder einem Vernetzer ausgesetzt, der das Material vernetzt und festigt. Es bleibt ein poröses Keratinmaterial zurück.
In einem weiteren Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die löslichere Keratinlösung beispielsweise durch Lufttrocknung oder Erhitzen bei Druck unterhalb des Umgebungsdrucks weiter eingeengt. Die eingeengte Lösung wird in eine Form gegossen und an der Luft trocknen gelassen. Die Luft dient dazu, Wasser zu entfernen, das Keratin einzuengen und die Cysteinthiolgruppen zu oxidieren, wodurch Disulfidbrücken gebildet werden und das Keratinmaterial gefestigt wird. Das resultierende Keratinrohmaterial ist widerstandsfähig und unlöslich. In einem weiteren Verfahren wird ein flüssiges Oxidationsmittel, wie z. B. Wasserstoffperoxid, eingesetzt. In einem anderen Verfahren wird ein Vernetzer, wie z. B. Glutaraldehyd, eingesetzt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Keratin-Vorbehandlung
In einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird Haar bereitgestellt, das vorzugsweise gewaschen und ungebleicht ist. Das Haar kann einer menschlichen oder einer tierischen Quelle entnommen werden. Der Patient oder ein menschlicher Spender stellen für manche medizinische Anwendungen eine bevorzugte Haarquelle dar, da Haar aus solchen Quellen am wahrscheinlichsten ein nicht-antigenes Produkt ergibt, wobei tierisches Haar für bestimmte Personen, die keine Tierproduktallergieprobleme haben, auch annehmbar sein kann. In einem Verfahren wird das Haar mit Versa-Clean^TM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA (USA)) gewaschen, mit entionisiertem Wasser gespült und an der Luft trocknen gelassen.
Teilweise Oxidation von Keratin
Das Haar kann in Peressigsäure oder einem anderen geeigneten Reagens, wie z. B. H₂O₂, oxidiert werden. In einer bevorzugten Behandlung werden 1% bis 32% Peressigsäure bei einer Temperatur zwischen etwa 0°C und 100°C etwa 0,5 bis 24 h lang eingesetzt. In einem Verfahren werden 30 g Haar mit 500 ml 32%iger Peressigsäure bei 4°C 24 h lang behandelt. Diese Behandlung mit Peressigsäure oxidiert die natürlich vorkommenden Disulfidbindungen teilweise, um mit Cysteinsäure- (-CH₂-SO₃H-) Resten und restlichen Disulfidbindungen ein Protein zu bilden. Das Haar wird vorzugsweise durch ein grobes Frittglasfilter abfiltriert und etliche Male mit entionisiertem Wasser gespült, bis die Spüllösung einen pH von 6,0 oder höher hat. Das Haar kann anschließend in einem Vakuumofen bei zwischen 20°C und 50°C 0,5 bis 5 Tage lang getrocknet werden. In einem Verfahren wird das Haar in einem Vakuumofen bei 40°C mehrere Tage lang getrocknet. Das getrocknete Haar kann anschließend pulverisiert und zu einem feinen Pulver vermahlen werden. In einem Verfahren werden zur Vermahlung des Haars Stössel und Mörser aus Keramik verwendet.
Reduktion von teilweise oxidiertem Keratin
Das Keratinpulver kann in Ammoniumthioglykolat suspendiert werden. In einem Verfahren wird aus wie oben beschriebenem Haar stammendes pulverisiertes Keratinpulver in etwa 3 N Ammoniumhydroxid, das Ammoniumthioglykolat enthält, suspendiert. Etwa 6 g Keratinpulver können pro 75 ml Ammoniumhydroxid zugesetzt werden. Die Konzentration des Ammoniumhydroxids beträgt vorzugsweise etwa 3 N, und die bevorzugte Konzentration des Ammoniumthioglykolats beträgt etwa 11 ml (als Thioglykolsäure) pro 75 ml Ammoniumhydroxid. Die Suspension kann anschließend über einen Zeitraum erhitzt werden, der ausreicht, um die lösliche Fraktion des Haars löslich zu machen. Die Suspension wird in einem Verfahren zwischen 1 bis 24 h lang auf zwischen 50°C und 90°C erhitzt, wonach abgekühlt wird. Gemäß einem weiteren Verfahren wird die Suspension etwa 4 h lang auf etwa 60°C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Diese Behandlung spaltet die restlichen Disulfidbindungen ab, um Cysteinreste in der Proteinstruktur zu bilden. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Keratinprotein sowohl Cysteinsäurereste als auch Cysteinreste. Das Verhältnis zwischen Cysteinsäureresten und Cysteinresten kann durch Variieren der Zeit, Temperatur und Konzentration des Oxidationsmittels in dem zuvor beschriebenen Peressigsäurebehandlungsschritt gesteuert werden. Die Gegenwart von Sulfonsäureresten verleiht dem Haar sowie dem Folienendprodukt eine hydrophile Eigenschaft.
Auftrennung von teilweise oxidiertem, reduziertem Keratin
Nach der oben beschriebenen Oxidations-/Reduktionsbehandlung bleibt eine hauptsächlich aus β-Keratin bestehende, beständige Keratinfraktion zurück. Diese Keratinfraktion ist vorzugsweise zumindest 80% β-Keratin, besonders bevorzugt mehr als etwa 90% β-Keratin. Diese Fraktion ist in der Suspension unlöslich und wird in einem Verfahren mittels etwa 10-minütiger Zentrifugation bei etwa 10.000 g entfernt. Ein dicker, gelartiger Überstand bleibt zurück, der entsorgt oder vorzugsweise für einen anderen Zweck behalten wird. Die restliche unlösliche Fraktion besteht zum Großteil aus der Ursprungskutikula (äußere Schicht des Haarschafts) und hauptsächlich aus β-Keratin.
Ansäuerung von teilweise oxidiertem, reduziertem Keratin
Das unlösliche Material wird auf einen anderen Behälter übergeführt und auf einen niedrigen pH angesäuert. Der pH beträgt vorzugsweise weniger als etwa 3 und besonders bevorzugt weniger als etwa 1. In einem Verfahren beträgt der pH weniger als etwa 1, und die eingesetzte Säure kann entweder konzentrierte Schwefelsäure oder Ameisensäure sein. Diese Behandlung unterbricht die Wasserstoffbrückenbindung der Kutikulastruktur des Haarschafts. Der niedrige pH unterbricht die zum festen Binden des Keratinproteins verantwortlichen Wasserstoffbrückenbindungen, was zu dessen Beständigkeit gegenüber chemischer Modifizierung führt. Die Anmelder gehen davon aus, dass die Säure das Protein zumindest teilweise auffaltet oder quellen lässt, wodurch sich die Löslichkeit erhöht. Die Aufschlämmung weist eine Konzentration im Bereich von vorzugsweise 0,001 g/ml bis 0,6 g/ml auf. Die Aufschlämmung weist besonders bevorzugt eine Konzentration im Bereich von 0,2 g/ml bis 0,3 g/ml auf.
Neutralisierung, Einengung und Oxidation von teilweise oxidiertem, reduziertem Keratin
Die aufgefaltete oder gequollene Keratinaufschlämmung kann anschließend mit Ammoniumhydroxid, vorzugsweise mit einer Konzentration von etwa 6 N, leicht basisch gemacht werden. Die Aufschlämmung kann anschließend auf eine flache Oberfläche gegossen und luftgetrocknet werden, um die vernetzte Folie zu bilden. Ein bevorzugter Bereich für die relative Feuchte beim Trocknen liegt zwischen 0% und 90%. Die relative Feuchte liegt besonders bevorzugt zwischen etwa 40% und 60% relativer Feuchte. Das teilweise aufgefaltete, gequollene und teilweise gelöste Keratin wird bei der Zugabe der Base während des Trocknens, wodurch es zur Wasserstoffbrückenbindung des Keratins kommt, rückgefaltet. Die freien Thiolgruppen bilden Disulfidbindungen.
Die unlösliche Keratinfraktion aus Haar wird folglich so behandelt, dass sie sowohl Sulfonsäuregruppe als auch Thiolgruppen aufweist, und wird von der löslichen Fraktion getrennt. Die unlösliche Fraktion wird säurebehandelt, um das Keratin teilweise aufzufalten, zu quellen und löslich zu machen, gefolgt von einer Basenbehandlung und dem Gießen auf eine flache Oberfläche zur Rückfaltung des Proteins und zur Bildung einiger Disulfidbindungen.
In einem alternativen Verfahren wird das Keratin in einem Ansäuerungsschritt in einer flüchtigen Säure, wie z. B. Ameisensäure, suspendiert, die einen ausreichend niedrigen pH aufweist, um das Keratinprotein teilweise aufzufalten oder zu quellen. In diesem Verfahren erübrigt sich die Behandlung mit einer flüchtigen Base. Dem Ansäuerungsschritt folgt unmittelbar die Ausbildung der Keratinaufschlämmung zu einer Folie.
Die resultierende Folie kann durch wiederholte Behandlung mit (siedend) heißem, entionisiertem Wasser von löslichen Reagenzien gereinigt werden, was eine vernetzte, aus reinem Keratin bestehende Folie ergibt. Die aus Keratin gebildete und hauptsächlich aus β-Keratin bestehende feuchte Keratinfolie hat die Beschaffenheit von feuchtem Papier. Die hergestellte Folie trocknet zu einem brüchigen Material, das zu einem biegsamen, hautähnlichen Material rehydratisiert werden kann, welches sich zur Verwendung als Wundheilverbandsfolie eignet. In einem bevorzugten Verwendungsverfahren wird die Folie ausreichend hydratisiert, damit die Folie über eine Wunde gelegt werden kann.
Keratinaufschlämmung, umfassend teilweise oxidierte α- und β-Keratinfraktionen In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der zur Auftrennung der löslichen und unlöslichen teilweise oxidierten Keratinfraktionen angewandte Zentrifugierungsschritt ausgelassen, und beide Fraktionen werden in der weiteren Verarbeitung eingesetzt. In einer Ausführungsform werden beide Fraktionen zusammen mit einer Säure wie oben beschrieben weiter verarbeitet. In diesem Verfahren werden sowohl lösliche als auch unlösliche Fraktionen auf einen anderen Behälter übergeführt und auf einen niedrigen pH angesäuert. Die aufgefaltete oder gequollene Keratinaufschlämmung kann anschließend mit Ammoniumhydroxid mit einer Konzentration von etwa 6 N leicht basisch gemacht werden. Die Aufschlämmung kann dann auf eine flache Oberfläche gegossen und luftgetrocknet werden, um eine vernetzte Folie zu bilden. In einem alternativen Verfahren wird das Keratin in dem Ansäuerungsschritt in einer flüchtigen Säure, wie z. B. Ameisensäure, wie zuvor be schrieben suspendiert. In diesem Verfahren erübrigt sich die Behandlung mit einer flüchtigen Base. In einem Verfahren kann die dicke Aufschlämmung mit beiden Keratinfraktionen wie zuvor beschrieben zu einem Dünnfilm gegossen werden. Das resultierende Produkt weist eine etwas glattere Beschaffenheit als ein aus reinem β-Keratin stammendes Produkt auf. In einem weiteren Verfahren kann die dicke Aufschlämmung weiter eingeengt und dazu verwendet werden, ein wie nachstehend beschriebenes Rohkeratinprodukt zu bilden.
Verwendung von teilweise oxidierter α-Keratinfraktion
In einer Ausführungsform beträgt die Keratinmenge in der Keratinlösung zumindest 90% von α-Keratin stammendes Keratin. Die resultierende Keratinlösung, die hauptsächlich von α-Keratin stammendes teilweise oxidiertes Keratin enthält, kann wie oben beschrieben zur Bildung von Filmen und Folien verwendet werden. Das in Haar vorliegende α-Keratin weist vor der Verarbeitung eine in erster Linie kristalline Struktur auf; nach der Verarbeitung und Vernetzung ist es jedoch hauptsächlich amorph. Folglich beziehen sich die Bezeichnungen „α" und „β" auf die Keratinproteinstrukturen an der Quelle und nicht unbedingt auf die Keratinproteinstrukturen nach der Verarbeitung und dem Vernetzen. Das α-Keratin stammt hauptsächlich aus Haar-Kortexkeratin, während das β-Keratin in erster Linie aus Haar-Kutikulakeratin stammt. In einem bevorzugten Verfahren wird Haar-Kortexkeratin eingesetzt.
In einer weiteren Ausführungsform wird die lösliche Keratinfraktion eingesetzt, um eine Folie oder einen Film auszubilden. Nach dem wie oben beschriebenen Zentrifugieren kann die unlösliche Fraktion für einen anderen Gebrauch beiseite gelegt werden. Ein dicker, gelartiger Überstand bleibt zurück, der eine lösliche, teilweise oxidierte Keratinfraktion umfasst, die hauptsächlich von α-Keratin stammt. Die Keratinfraktion wird als „löslich" bezeichnet, da sie in einer basischen, wässrigen Lösung löslich ist. In einem bevorzugten Verfahren bezieht sich „lösliches" Keratin auf eine Keratinfraktion, die bei einem pH von 10 oder mehr löslich ist, aber auch bei einem niedrigeren, basischen pH gegebenenfalls löslich ist. In einem bevorzugten Verfah ren bezieht sich „unlösliches" Keratin auf ein Keratin, das bei einem pH von 10 unlöslich ist. Der Überstand wird abgenommen. Der Überstand kann mit konzentrierter HCl behandelt werden, bis sich ein gummiartiger Niederschlag bildet. Der Niederschlag kann abgenommen, mit entionisiertem Wasser gewaschen und in 15 ml 3 N Ammoniumhydroxid gelöst werden, um eine Keratinlösung zu bilden.
Keratinfolienanwendungen
Die Anmelder gehen davon aus, dass das gemäß diesem Verfahren hergestellte Keratinprodukt zur Verwendung als mitogenes Zellwachstumsgerüst und als Nährstoffträger für das Zellwachstum geeignet ist. Die Anmelder gehen auch davon aus, dass die vernetzte Keratinfolie als Gerüstmaterial für eine Reihe von Zellen, einschließlich Hautkomponentenzellen (Keratinozyten, Fibroblasten, Endothelzellen), Osteoblasten, Chondrozyten und Hepatozyten, verwendet werden kann. Die Anmelder haben insbesondere gezeigt, dass Hautkomponentenzellen auf der Keratinfolie vorteilhaft wachsen und sich vermehren. Die Anmelder gehen darüber hinaus davon aus, dass die Keratinfolie als Diffusionsmembran und zur Verkapselung von Zellen für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden kann.
Antibakterielle Additive, Salben und Biologika, wie z. B. Wachstumsfaktoren oder Kollagen, können zu der Keratinfolie zugesetzt werden. Bakterizide Salben oder eine Suspension aus Antibiotika oder Biologika können in den Folienverband imprägniert werden, indem eine Klinge mit dem Additiv an der Vorderseite über die Folie geführt wird, wodurch das Additiv gleichmäßig über die Folie verteilt wird. Alternativ dazu kann das Folienmaterial in einer Lösung eingeweicht werden, die das gewünschte Additiv enthält, und das Additiv auf die Folienoberfläche ausfallen gelassen werden. Das Lösungsmittel kann anschließend abgezogen werden, womit das Folienmaterial mit dem gewünschten Additiv imprägniert und beschichtet verbleibt.
Keratinreduktion ohne zuvorigen Teiloxidationsschritt
Wie zuvor beschrieben hergestelltes, sauberes, keratinhältiges Haar kann in einem Reduktionsmittel suspendiert werden. Ammoniumthioglykolat stellt ein bevorzugtes Reduktionsmittel dar. Andere Reduktionsmittel, von denen angenommen wird, dass sie zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Mercaptoethanol, Dithiothreit, Thioglycerin, Thiomilchsäure, Glutathion, Cystein und Natriumsulfid. In einem Verfahren wird das wie oben beschriebene gewaschene und zugeschnittene Haar in etwa 3 N Ammoniumhydroxid, das Ammoniumthioglykolat enthält, suspendiert. Man geht davon aus, dass Ammoniumhydroxid die Carbonsäuren und die Cysteinthiolgruppen deprotoniert, wodurch ein polyanionisches Polymer mit erhöhter Löslichkeit in Wasser gebildet wird. Es wird angenommen, dass das Ammoniumhydroxid das Keratinprotein teilweise quellen lässt, wodurch zusätzliche Disulfidbindungen einer Reaktion mit Thioglykolsäure ausgesetzt werden. Etwa 6 g Haar können pro 75 ml Ammoniumhydroxid zugesetzt werden. Die Konzentration von Ammoniumhydroxid beträgt vorzugsweise etwa 3 N, und die bevorzugte Konzentration von Ammoniumthioglykolat ist etwa 11 ml (als Thioglykolsäure) pro 75 ml Ammoniumhydroxid. Die Suspension kann anschließend über einen Zeitraum erhitzt werden, der ausreicht, um die lösliche Fraktion des Haars löslich zu machen. In einem Verfahren wird die Suspension zwischen 50°C und 90°C zwischen 1 und 24 h lang erhitzt und anschließend abgekühlt. In einem bevorzugten Verfahren wird die Suspension etwa 2 h lang unter Stickstoffatmosphäre auf etwa 60°C erhitzt und mit einem Gewebehomogenisator, wie im nächsten Abschnitt detaillierter beschrieben wird, etwa 30 min lang homogenisiert, bis sich eine feine Dispersion bildet.
Homogenisierung/Zerkleinerung von reduziertem Keratin
Die hierin verwendete Bezeichnung Homogenisierung bezieht sich auf die Zerkleinerung der Haarteilchen, die mittels einer Rotor/Stator-Kombinations-Homogenisatorklinge in kleinere Teilchen aufgespalten werden. Das reduzierte Haar wurde in der Ammoniumthioglykolatlösung unter Anwendung der im oben durch Verweis aufgenommenen US-Patent 5.358.35 (ohne den Einsatz von flüssigem N₂) beschriebenen Verfahren in situ homogenisiert. Haar ist durch eine widerstandsfähige äußere Keratinschicht geschützt, die gegenüber chemischer Behandlung beständig ist. Die äußere Schicht besteht hauptsächlich aus β-Keratinmaterial. Bei der Homogenisierung wird das äußere Kutikulaschutzmaterial von dem inneren Kortexmaterial getrennt und das Haar zerkleinert, um kleine Keratinteilchen zu bilden. Der Kortex enthält Keratine, die in Wasser mäßig löslich sind, jedoch Keratine, die normalerweise Wasser nicht ausgesetzt sind, befinden sich innerhalb der Schutzkutikula. Der Kortex enthält hauptsächlich α-Keratin. Die Homogenisierung legt auch Disulfidbindungen gegenüber Reaktanten, wie z. B. Thioglykolat, frei. Die Dispersion in einem Verfahren wird weitere 2 h bei 60°C unter Stickstoffatmosphäre erhitzt, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt wird. Durch den fortgesetzten Erhitzungsschritt steht Zeit zur Verfügung, in der das Ammoniumthioglykolat die neu freigelegten Cysteindisulfidbindungen aufbricht und reduziert. Eine dicke Aufschlämmung ist in einem bevorzugten Verfahren das erwartete Resultat. Das Erhitzen beschleunigt die Reduktion der Disulfidbindungen. Die Stickstoffatmosphäre verhindert die Oxidation der Thiolgruppen durch Luftsauerstoff. Die Anmelder gehen davon aus, dass diese Behandlung die Disulfidbindungen abspaltet, um Cystein und Cystein-Thioglykolat-Disulfidreste in der Proteinstruktur zu bilden.
Abtrennung
Nach der oben beschriebenen Behandlung bleibt eine hauptsächlich aus β-Keratin bestehende, der Behandlung gegenüber beständige Keratinfraktion zurück. Diese Fraktion ist in der Suspension unlöslich und wird in einem Verfahren durch ca. 10-minütiges Zentrifugieren bei etwa 10.000 g entfernt. Die unlösliche Fraktion kann für einen anderen Zweck beiseite gelegt werden. Es bleibt ein Überstand zurück, der eine lösliche Keratinfraktion umfasst, die hauptsächlich aus α-Keratin stammt. Die Keratinfraktion wird als „löslich" bezeichnet, da sie in einer basischen, wässrigen Lösung löslich ist. In einem bevorzugten Verfahren bezieht sich „lösliches" Keratin auf eine Keratinfraktion, die bei einem pH von 10 oder mehr löslich ist, aber auch bei einem niedrigeren, basischen pH gegebenenfalls löslich ist. In einem bevorzugten Ver fahren bezieht sich „unlösliches" Keratin auf ein Keratin, das bei einem pH von weniger als 10 unlöslich ist. Der Überstand wird abgenommen. Der Überstand kann mit konzentrierter HCl behandelt werden, bis sich ein gummiartiger Niederschlag bildet. Der Niederschlag kann abgenommen, mit entionisiertem Wasser gewaschen und in 15 ml 3 N Ammoniumhydroxid gelöst werden, um eine Keratinlösung zu bilden.
In einer Ausführungsform ist das Keratin in der Keratinlösung zumindest 90% aus α-Keratin stammendes Keratin. Das in Haar vorliegende α-Keratin weist vor der Verarbeitung eine in erster Linie kristalline Struktur auf; nach der Verarbeitung und Vernetzung ist es jedoch hauptsächlich amorph. Folglich beziehen sich die Bezeichnungen „α" und „β" auf die Keratinproteinstrukturen an der Quelle und nicht unbedingt auf die Keratinproteinstrukturen nach der Verarbeitung und dem Vernetzen. Das α-Keratin stammt hauptsächlich aus Haar-Kortexkeratin, während das β-Keratin in erster Linie aus Haar-Kutikulakeratin stammt. Haar-Kutikulakeratin umfasst üblicherweise einen wesentlichen Farbanteil des Originalhaars. Haar-Kortexkeratin umfasst die Originalhaarfarbe nicht. In einem bevorzugten Verfahren wird Haar-Kortexkeratin eingesetzt.
Film- und Folienbildung
Die Lösung kann zu einem Dünnfilm gegossen und zu einem hauptsächlich aus α-Keratin stammenden, vernetzten Film lufttrocknen gelassen werden. Das Keratin bildet Disulfidbindungen wieder, was der Folie zusätzliche Festigkeit verleiht. Schwächere Bindungen, wie z. B. Wasserstoffbrückenbindungen, verleihen dem Film auf Keratinbasis ebenfalls Festigkeit, wenn die Lösung konzentrierter wird, wodurch die Keratinproteine in größerer Nähe zueinander angeordnet werden. In einem Verfahren wird die Lösung auf eine Drehtrommel oder ein Laufband gegossen. Durch das Gießen der Lösung auf eine flache Oberfläche wird eine dünne, flache Geometrie gebildet, die jener des Endfilms ähnelt. Die Bildung der flachen Oberfläche schafft ein hohes Oberflächen/Volumen-Verhältnis, was ermöglicht, dass Luft in einen wesentlichen Anteil der Gesamttiefe und des Gesamtvolumens der Lösung eindringt.
Einengung und Oxidation
Die Lufttrocknung erfüllt mehrere Funktionen. Zuerst entfernt die Luft Wasser, wodurch die Keratinlösung konzentrierter wird. Die konzentriertere Lösung erhöht die Bildungsrate und die Anzahl der wiedergebildeten Disulfidbindungen. Die gebildeten oder wiedergebildeten Disulfidbindungen liegen nicht zwingend zwischen den gleichen Cysteingruppen in dem Anfangsprotein. Zweitens enthält die Luft Sauerstoff, wodurch die freien Thiolgruppen in dem Protein oxidiert werden, was zur Bildung von Disulfidbindungen führt. Anstelle von Luft können andere Oxidationsgase, z. B. Sauerstoff, eingesetzt werden. Oxidationsflüssigkeiten, wie z. B. Wasserstoffperoxid, eignen sich ebenfalls zur Oxidation der freien Thiolgruppen. Drittens ermöglicht Luft die Verdampfung des Ammoniumhydroxids. Der resultierende niedrigere pH hilft auch bei der Wiederbildung der Disulfidbindungen. Viertens ermöglicht Luft, dass etwas überschüssiges Thioglykolat entweichen kann. Wenn die Filmbildung in Gegenwart von Stickstoff anstatt von Luft durchgeführt wird, gehen die Anmelder davon aus, dass der gebildete Film weitaus weniger Disulfidbindungen aufweist, aber dass der Film mit Wasserstoffbrückenbindungen gebunden ist, was einen Film ergibt, der weicher als der in Gegenwart von Sauerstoff gebildete Film ist. Die resultierende Restthiolaktivität würde Stellen zur Aufnahme von gewünschten thiolhältigen biologischen Faktoren bereitstellen.
Die Einengung und Oxidation bewirkt die Bildung eines widerstandsfähigen, unlöslichen Materials. Überschüssiges Thioglykolat und das Disulfid der Thioglykolsäure bleiben gegebenenfalls in dem Film zurück und können mittels Extraktion in siedendem Wasser entfernt werden. In einem Reinigungsverfahren wird der Film etwa 1,5 h lang in siedendes Wasser eingetaucht, wobei das Wasser alle 15 min ausgetauscht wird. Es wird angenommen, dass dieser Reinigungsvorgang hauptsächlich überschüssiges unreagiertes Thioglykolat und nicht an das Proteinrückgrat gebundenes Thioglykolat entfernt.
Eine langsame Verdampfung kann ebenfalls angewandt werden, um Ammoniumhydroxid aus dem Material zu entfernen, wodurch der pH gesenkt und die Vernet zungsbildung beschleunigt wird. Die Reduktion des pH-Werts selbst führt zu einer erhöhten Vernetzung und einem erhöhten Niederschlag des Proteins. Ein zusätzlicher Vernetzer, wie z. B. Glutaraldehyd, kann verwendet werden, um Vernetzungen zu bilden, die keine Disulfidvernetzungen sind. Der Einsatz von Glutaraldehyd ermöglicht eine Vernetzung ohne das gleiche Ausmaß an Einengung oder Wasserentfernung zu erfordern, die zur Vernetzung benötigt wird, welche hauptsächlich auf der Disulfidbindungsbildung beruht, und könnte auch den endgültigen Vernetzungsgrad im Vergleich zum Oxidationsvernetzungsvorgang erhöhen.
Ein weiteres Verfahren zur Bildung der Disulfidvernetzungen umfasst die Schritte des Entfernens des Wassers und des Ammoniumhydroxids unter Vakuum. In einem Verfahren wird die lösliche Keratinfraktion in Lösung in eine Kammer platziert und ein Vakuum in der Kammer angelegt, wodurch der Großteil des Wassers aus dem Material entfernt wird. Das Wasser verflüchtigt sich bei einer niedrigen Temperatur, wodurch ein vernetztes Keratinmaterial zurückbleibt.
Anwendungen
Die Anmelder gehen davon aus, dass das resultierende Material zu einem Dünnfilm, einem Wundverband oder einem Gewebezüchtungsgerüst ausgebildet werden kann. Eine Diffusionsmembran, beispielsweise zur Medikamentenabgabe, stellt eine andere Anwendungsmöglichkeit dar. Weiters findet es Anwendung als Beschichtung von implantierbaren Vorrichtungen, wie z. B. Stents und Kiefer-Gesichts-Implantaten, mit dem nicht-antigenen vernetzten Keratinfilmmaterial. Die zu beschichtenden Teile können in die keratinhältige Lösung getaucht werden, gefolgt von Lufttrocknung oder anderen Verfahren zur Beschleunigung der Vernetzung. Dadurch ergibt sich eine starke Haftung an das Implantat, da die Vernetzung auf der eigentlichen Implantatform als Dünnfilm stattfindet. Eine weitere Anwendung ist als Verkapselungsmittel zur Verkapselung von Zellen. Einzelne Zellen können verkapselt werden, wodurch beispielsweise ermöglicht wird, dass der Film als Nährstoffquelle, ein Mitogen oder eine Diffusionsmembran dient.
Weitere Einengung
In einem weiteren Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird die resultierende Keratinsuspension weiter eingeengt. Die resultierende Lösung wird vorzugsweise auf eine Konzentration zwischen etwa 0,1 und 0,5 g pro ml, noch bevorzugter zwischen etwa 0,3 und 0,4 g pro ml, besonders bevorzugt auf etwa 0,35 g pro ml, eingeengt. Die konzentrierte Keratinlösung kann zur Bildung eines wie nachstehend detailliert beschriebenen porösen, offenzelligen Keratingerüsts im offenzelligen Abschnitt eingesetzt werden.
Keratinaufschlämmung umfassend α- und β-Keratinfraktionen
In einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Keratinzentrifugierschritt zur Trennung der löslichen und unlöslichen Keratinfraktionen ausgelassen, und beide Fraktionen werden zur weiteren Verarbeitung eingesetzt. In einem Verfahren kann die dicke Aufschlämmung mit beiden Keratinfraktionen wie zuvor beschrieben zu einem Dünnfilm gegossen werden. Das resultierende Produkt weist eine etwas rauere Beschaffenheit als das reine aus α-Keratin stammende Produkt auf. In einem weiteren Verfahren kann die dicke Aufschlämmung zusätzliche eingeengt und eingesetzt werden, um ein wie zuvor beschriebenes Keratinrohprodukt zu bilden.
Keratinaufschlämmung umfassend α- und β-Keratinfraktionen mit zusätzlicher Säurebehandlung
In einem weiteren Verfahren der vorliegenden Erfindung wird der Keratinzentrifugierschritt zur Trennung der löslichen und unlöslichen Keratinfraktionen ausgelassen, und beide Fraktionen werden mit Säure weiter verarbeitet. In diesem Verfahren werden sowohl lösliche als auch unlösliche Fraktionen auf einen anderen Behälter übergeführt und auf einen niedrigen pH angesäuert. Der pH ist vorzugsweise weniger als etwa 3 und besonders bevorzugt weniger als etwa 1. In einem Verfahren ist der pH weniger als etwa 1, und die eingesetzte Säure kann Salzsäure, konzentrierte Schwefelsäure oder Ameisensäure sein. Die Anmelder gehen davon aus, dass die Säure zumindest teilweise das Protein quellen lässt, was die Löslichkeit der unlöslichen Fraktion erhöht. Die Aufschlämmung weist vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,001 g/ml bis 0,6 g/ml auf. Die Aufschlämmung weist vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,2 g/ml bis 0,3 g/ml auf.
Die aufgefaltete oder gequollene Keratinaufschlämmung kann anschließend mit Ammoniumhydroxid, vorzugsweise mit einer Konzentration von etwa 6 N, leicht basisch gemacht werden. Die Aufschlämmung kann anschließend auf eine flache Oberfläche gegossen und luftgetrocknet werden, um die vernetzte Folie zu bilden. Ein bevorzugter Bereich für die relative Feuchte beim Trocknen liegt zwischen 0% und 90%. Die relative Feuchte liegt besonders bevorzugt zwischen etwa 40% und 60% relativer Feuchte. Das teilweise aufgefaltete oder gequollene, teilweise gelöste Keratin wird bei der Zugabe der Base während des Trocknens rückgefaltet, wodurch es zur Wasserstoffbrückenbindung des Keratins kommt. Die freien Thiolgruppen bilden Disulfidbindungen. In einem alternativen Verfahren kann Glutaraldehyd zum teilweise gelösten Keratin zugesetzt werden, um einen erhöhten Vernetzungsgrad bereitzustellen. Als alternatives Verfahren wird das Keratin in einem Ansäuerungsschritt in einer flüchtigen Säure, wie z. B. Salzsäure oder Ameisensäure, die einen ausreichend niedrigen pH aufweist, um das Keratinprotein teilweise zu quellen, suspendiert. In diesem Verfahren erübrigt sich die Behandlung mit einer flüchtigen Base. Dem Ansäuerungsschritt kann unmittelbar die Ausbildung der Keratinaufschlämmung zu einer Folie folgen. Die Keratinaufschlämmung kann auch zur Herstellung von Rohkeratin weiter eingeengt werden.
Keratinaufschlämmung umfassend hauptsächlich β-Keratin mit zusätzlicher Säurebehandlung
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Keratinzentrifugierschritt zur Trennung der löslichen und unlöslichen Keratinfraktionen durchge führt und die β-Fraktion zusätzlich mit Säure verarbeitet. In diesem Verfahren wird die unlösliche Fraktion auf einen anderen Behälter übergeführt und auf einen niedrigen pH angesäuert. Der pH beträgt vorzugsweise weniger als etwa 3 und noch bevorzugter weniger als etwa 1. In einem Verfahren beträgt der pH weniger als etwa 1, und die eingesetzte Säure kann Salzsäure, konzentrierte Schwefelsäure oder Ameisensäure sein. Die Anmelder gehen davon aus, dass die Säure zumindest teilweise das Protein quellen lässt, was die Löslichkeit der unlöslichen Fraktion erhöht. Die Aufschlämmung weist vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,001 g/ml bis 0,6 g/ml auf. Die Aufschlämmung weist vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,2 g/ml bis 0,3 g/ml auf.
Die Keratinaufschlämmung kann anschließend mit Ammoniumhydroxid, vorzugsweise mit einer Konzentration von 6 N, leicht basisch gemacht werden. Die Aufschlämmung kann anschließend auf eine flache Oberfläche gegossen und luftgetrocknet werden, um die vernetzte Folie zu bilden. Ein bevorzugter Bereich für die relative Feuchte beim Trocknen liegt zwischen 0% und 90%. Die relative Feuchte liegt besonders bevorzugt zwischen etwa 40% und 60% relativer Feuchte. Das teilweise aufgefaltete, gequollene und teilweise gelöste Keratin wird bei der Zugabe der Base während des Trocknens rückgefaltet, wodurch es zur Wasserstoffbrückenbindung des Keratins kommt. Die freien Thiolgruppen bilden Disulfidbindungen. In einem alternativen Verfahren kann Glutaraldehyd zum teilweise gelösten Keratin zugesetzt werden, um einen erhöhten Vernetzungsgrad bereitzustellen. Als alternatives Verfahren wird das Keratin in einem Ansäuerungsschritt in einer flüchtigen Säure, wie z. B. Salzsäure, die einen ausreichend niedrigen pH aufweist, um das Keratinprotein teilweise zu quellen, suspendiert. In diesem Verfahren erübrigt sich die Behandlung mit einer flüchtigen Base. Dem Ansäuerungsschritt kann unmittelbar die Ausbildung der Keratinaufschlämmung zu einer Folie folgen. Die Keratinaufschlämmung kann auch zusätzlich eingeengt werden, um Keratinrohmaterial auszubilden.
Offenzellige Keratin- und Keratinrohmaterialien
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Bildung von Keratinrohmaterialien und porösen offenzelligen Materialien. Das Rohmaterial eignet sich zur Verwendung als vernetzte implantierbare Vorrichtung, die zur Kiefer-Gesichts-Rekonstruktion, beispielsweise als Weich- und Hartgewebeersatz, eingesetzt werden kann. Das Rohmaterial kann auch für orthopädische Anwendungen, z. B. als Knochenfüllmittel und zur Knorpelregeneration, eingesetzt werden. Das implantierbare Material kann in Schlauchform auch für neurologische Anwendungen, wie z. B. Nervenregenerations-Leitschienen, verwendet werden. Das poröse Keratinmaterial kann als Gewebezüchtungsgerüst verwendet werden.
Die Erfindung umfasst Verfahren zur Bildung von festen und porösen Keratinrohmaterialien. Ein keratinhältiges Material, wie z. B. menschliches Haar, wird bereitgestellt. Das Haar wird in Flüssigkeit suspendiert und mit einem Reduktionsmittel reduziert, wodurch die Disulfidbindungen aufgebrochen werden. Eine keratinhältige Aufschlämmung ist das bevorzugte Ergebnis. Die Aufschlämmung, die weiter verarbeitet und gereinigt werden kann, wird vorzugsweise zusätzlich eingeengt und in eine Form abgeschieden, um einen festen Teil in Form der Form zu bilden. Alternativ dazu kann die Aufschlämmung eingesetzt werden, um offenzellige Schaummaterialien unter Einsatz einer Reihe von in der Literatur beschriebener Verfahren zu verarbeiten. In einem Verfahren wird ein Sprühnebel der zerstäubten Keratinlösung auf der Oberfläche einer abgekühlten Form angewandt, wodurch eine wie von Lo et al. zur PLLA-Schaumherstellung (H. Lo, S. Kadiyala, S. E. Guggino und K. W. Leong, „Poly (L-lactic acid) foams with cell seeding and controlled-release capacity", J. Biomed. Mater. Res., Bd. 30, S. 475–484 (1996)) beschriebene Schaumstruktur aufgebaut wird. Ein zweites, ebenfalls für PLA/PGA-Polymere entwickeltes Verfahren setzt gefriergetrocknete Emulsionen aus Polymerlösungen ein, um offenzellige Polymerstrukturen zu verarbeiten (K. E. Healy, K. Whang und C. H. Thomas, „Method of fabricating emulsion freeze-dried scaffold bodies and resulting products", US-Patent 5.723.508 , ausgegeben am 3. März 1998). Ein ähnliches Verfahren kann unter Einsatz der geeigneten Lösungsmittel und Bedingungen modifiziert werden, um ein offenzelliges Keratingerüst zu bilden. Das Keratin wird beispielsweise in einem flüchtigen nichtpolaren Lösungsmittel gelöst und mit einem flüchtigen polaren Lösungsmittel, worin das Keratin unlöslich ist, vermischt. Diese zwei Lösungsmittel sind unmischbar. Eine Emulsion wird mittels Ultraschall oder eines Homogenisators gebildet, eingefroren und gefriergetrocknet, um die Lösungsmittel zu entfernen. Ein Oxidationsmittel, wie z. B. Luft oder Peroxid, oder ein Vernetzer, wie z. B. Glutaraldehyd, kann dem Keratinmaterial in der Emulsionsphase zugeführt werden. Die Keratinkonzentration und das Oxidationsmittel dienen zur Beschleunigung der Keratinvernetzung. Das resultierende keratinvernetzte Produkt ist hart und porös, wobei die Mikrostruktur von dem jeweils angewandten Verfahren abhängt.
Versuchsergebnisse, teilweise oxidiertes Keratinprodukt
In einem ersten Versuch wurde ein Folienwundverband, der kein Bindemittel erfordert, aus aus menschlichem Haar stammendem Keratin hergestellt. Menschliches Haar wurde von Männern im Alter zwischen 10 und 30 Jahren erhalten, mit Versa-Clean^TM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA (USA)) gewaschen, mit entionisiertem Wasser gespült und an der Luft trocknen gelassen. Dieses Haar wurde anschließend mittels einer Schneidmaschine in etwa 0,25 Zoll bis 2 Zoll lange Stücke geschnitten. 30 g des Haars wurden mit 500 ml 32%iger Peressigsäure (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI (USA)) 24 h lang bei 4°C behandelt. Diese Behandlung führte zur teilweisen Oxidierung der Disulfidbindungen. Das Haar wurde mittels eines groben Frittglasfilters abfiltriert und etliche Male mit entionisiertem Wasser gespült, bis die Spüllösung einen pH von 6,0 oder höher hatte. Das Haar wurde in einem Vakuumofen bei 40°C mehrere Tage lang getrocknet, bis es völlig trocken war, und mit Stössel und Mörser aus Keramik zu einem feinen Pulver vermahlen. Das resultierende Material, 19 g, wurde zusätzlich modifiziert, um eine biegsame, hydratisierbare Folie zu bilden, die hauptsächlich aus β-Keratin besteht.
6 g des pulverisierten oxidierten Haars wurden in 75 ml 3 N Ammoniumhydroxid, das 11 ml Ammoniumthioglykolat (als Thioglykolsäure) enthält, suspendiert. Die Suspension wurde 4 h lang auf 60°C erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abge kühlt. Durch diese Behandlung wurden die restlichen Disulfidbindungen gespalten, um Cysteinreste in der Proteinstruktur zu bilden. Eine unlösliche Fraktion blieb übrig, die gegenüber der Löslichmachung durch Ammoniumhydroxid und Ammoniumthioglykolat beständig war. Die unlösliche Fraktion, die hauptsächlich aus β-Keratin besteht, wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 10.000 g isoliert. Ein dicker, gummiartiger Überstand wurde aus dem zentrifugierten Material entfernt und beiseite gelegt.
Die restliche unlösliche Fraktion besteht hauptsächlich aus der Ursprungskutikula (äußere Schicht des Haarschafts) und hauptsächlich aus β-Keratin. Das unlösliche Material wurde auf einen Kolben übertragen und auf einen pH von zwischen 0 und etwa 1 angesäuert. Das teilweise aufgefaltete Keratin wurde mit 6 N Ammoniumhydroxid leicht basisch gemacht. Die Aufschlämmung wurde anschließend auf eine flache Oberfläche gegossen und luftgetrocknet, um eine vernetzte Folie zu bilden. Die resultierende Folie wurde durch Eintauchen in siedendes Wasser gereinigt, wodurch lösliche Reagenzien entfernt wurden.
Die Verwendung von keratinhältigen Materialien bei der Förderung der Wundheilung wurde in mehreren Experimenten gezeigt. In einem ersten Experiment wurde verarbeitetes menschliches Haar mit Zellkulturmedium inkubiert. Das Medium/Haar-Gemisch wurde durch einen Mikrofilter filtriert. Zelllinien, die für die Wundheilung relevant sind, unter anderem menschliche Mikrogefäßendothelzellen, Keratinozyten und Fibroblasten, wurden unter Verwendung dieses Mediumextrakts in Kultur platziert. Die signifikante Proliferation dieser Wundheilungszellen wurde gemessen. Keratinozyten vermehrten sich im Übermaß, Fibroblasten vermehrten sich in geringem Ausmaß, und Endothelzellen vermehrten sich im Übermaß.
Die mitogene Aktivität, die in Fibroblasten-, Keratinozyten- und Endothel-Zellkulturen beobachtet wurde, ist ein zusätzlicher Beweis dafür, dass das keratinöse Proteinmaterial nicht nur biokompatibel, sondern auch mit diesen Zelllinien mitogen ist. Zusätzliche Biokompatibilität wurde beobachtet, als Keratin-Mikrofibrillen mit dem Mikroskop in direktem Kontakt mit Zellen in den Zellkulturen beobachtet wurden. Spezifisch wurde beobachtet, wie Keratinozyten und Fibroblasten an Mikrofibrillen anhafteten und sich um diese ansammelten, was darauf hinweist, dass die gewünschte Zellaktivität auf dieser natürlich entwickelten Biopolymer-Matrix aufrechterhalten werden kann.
In einem zweiten Experiment wurde verarbeitetes menschliches Haar-Pulver mit Zellkulturmedium inkubiert. Das Medium/Keratin-Gemisch wurde durch einen Mikrofilter filtriert. Dieser Medium-Extrakt wurde in Proliferationsstudien mit Lymphozyten verwendet. Die Lymphozyten-Zelllinie zeigte keine Vermehrung, was darauf hinweist, dass das Material nicht-immunogen ist.
In einem dritten Experiment wurde verarbeitetes menschliches Haar-Pulver mit Zellkulturmedium inkubiert. Das Medium/Haar-Gemisch wurde anschließend durch einen Mikrofilter filtriert. Dieser Medium-Extrakt wurde in Proliferationsstudien mit aktivierten T-Lymphozyten verwendet. Die T-Lymphozyten vermehrten sich in normalem Ausmaß, was darauf hinweist, dass es zu keiner Inhibierung der normalen zellvermittelten Immunantwort durch das Keratin kommt. Dies zeigte keine Inhibierung dieser sehr wichtigen Funktion von Immunzellen.
In einem vierten Experiment wurden achtundzwanzig haarlose Ratten auf beiden Seiten der dorsalen Mittellinie mit einem Dermatom verwundet, wodurch eine Wunde, die sich über einen Teil der Dicke erstreckt, entsteht, die 0,12 Zoll tief ist und eine Oberfläche von 2,0 × 4,0 cm aufweist. Die Hälfte der Wunden wurde mit Keratinpulver behandelt, die andere Hälfte nicht, beide Hälften wurden mit Polyurethanverband bedeckt. Die Heilung der Wunden wurde beobachtet, und eine Biopsie wurde zur histochemischen Analyse an den Tagen 0, 2, 4 und 6 durchgeführt. Planimetriestudien zeigten an Tag 4 eine Epithelialisierung der keratinbehandelten Wunden von 97% und eine Epithelialisierung der unbehandelten Wunden von 78%. Eine histologische Analyse durch eine H-&-E-Färbung zeigte unter dem Mikroskop eine vollständige Epithelialisierung der keratinbehandelten Wunden an Tag 2 und nur eine teilweise Epithelialisierung der unbehandelten Wunden an Tag 2. Histologische Analysen an den Tagen 4 und 6 zeigten ebenfalls eine Beschleunigung des Epithelialisierungs-Reifungsprozesses bei den keratinbehandelten Wunden.
Im Moment werden klinische Studien am Menschen an Donorstellen für Hauttransplantate durchgeführt. Eine Hälfte der Donor-Wundstelle wird mit sterilisiertem Keratinpulver behandelt, und die gegenüber liegende Hälfte wird auf eine herkömmliche Art und Weise mit nicht-adhärentem Adaptic^TM-Verband von Johnson & Johnson behandelt. Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass es bei den keratinbehandelten Hälften zu einer früheren Epithelialisierung sowie zu einer schnelleren Reifung kommt. Dies wurde sowohl durch klinische Beobachtungen als auch durch histologische Ergebnisse von 4-mm-Stanzbiopsien bestätigt. Subjektiv berichteten die Patienten auch von viel weniger Schmerzen in den keratinbehandelten Wunden.
Versuchsergebnisse, Keratinprodukt ohne teilweise Oxidation
In einem fünften Experiment wurde menschliches Haar von Männern im Alter zwischen 10 und 30 Jahren entnommen, mit Versa-Clean^TM (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA (USA)) gewaschen, mit entionisiertem Wasser gespült und an der Luft trocknen gelassen. Dieses Haar wurde anschließend mittels einer Schneidmaschine in etwa 0,25 Zoll bis 2 Zoll lange Stücke geschnitten. 6 g des Haars wurden in 75 ml 3 N Ammoniumhydroxid, das 11 ml Ammoniumthioglykolat enthielt, suspendiert. Durch diese Behandlung wurden die Disulfidcystinbindungen abgespalten, um Cysteinreste in der Proteinstruktur zu bilden. Die Suspension wurde 2 h lang unter Stickstoffstrom auf 60°C erhitzt und anschließend mit einem Gewebehomogenisator 30 min lang homogenisiert, bis sich eine feine Dispersion bildete. Die Dispersion wurde zusätzliche 2 h unter Stickstoffatmosphäre auf 60°C erhitzt und anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt. Die dicke Aufschlämmung wurde in ein Röhrchen übergeführt und 10 min bei 5.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit konzentrierter Salzsäure behandelt, bis sich ein gummiartiger Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit entionisiertem Wasser gewaschen und anschließend in 15 ml 3 N Ammoniumhydroxid gelöst.
Diese Lösung wurde anschließend zu einem Dünnfilm gegossen und trocknen gelassen. Die Lösung wurde mittels Verdampfung weiter eingeengt und zu einem festen Materialblock gegossen. Die Entfernung der flüchtigen Base und des Wassers aus der Lösung und die Wirkung von Luft auf den freien Thiolanteil des löslichen Polypeptids bewirkte, dass sich das Material zu einem unlöslichen, harten Material vernetzte. Das Material wurde anschließend gereinigt und durch 1,5-stündige Extraktion in siedendem Wasser von jeglicher zurückbleibender Thioglykolsäure befreit.
In einem sechsten Experiment wurde menschliches Haar wie zuvor beschrieben chemisch behandelt. Dadurch bildete sich eine Keratin-Lösung, die anschließend in eine Folie gegossen und oxidativ vernetzt wurde, um eine nicht-lösliche Keratinfolie auszubilden. Die Folie wurde mittels 1,5-stündiger Extraktion mit siedendem Wasser gereinigt, wobei das Wasser alle 15 min ausgetauscht wurde. Segmente der Folie wurden anschließend mit Keratinozyten, Fibroblasten und menschlichen Mikrogefäßendothelzellen inkubiert. Es zeigte sich, dass diese Zellen auf der Keratin-Folie vorteilhaft wachsen und sich proliferieren. Dies weist darauf hin, dass sich Hautkomponentenzellen in der Gegenwart der Keratinfolie, die durch das oben stehend beschriebene Verfahren gebildet wird, vorteilhaft vermehren.

Claims

Poröses Gewebezüchtungsgerüst, umfassend vernetztes Keratin.
Gewebezüchtungsgerüst nach Anspruch 1, wobei das Gerüst aus einer porösen, offenzelligen Keratinstruktur besteht.
Poröses Gewebezüchtungsgerüst nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Keratinmaterial hauptsächlich α-Keratin ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Keratinmaterial hauptsächlich β-Keratin ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach Anspruch 1 oder 2, worin das Keratinmaterial hauptsächlich ein Gemisch aus α-Keratin und β-Keratin ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Gewebezüchtungsgerüst für Osteoblasten, Chondrozyten, Keratinozyten oder Hepatozyten ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Gerüst ein Knochenersatzgerüst ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gerüst ein Knorpelersatzgerüst ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Gerüst ein Hautersatzgerüst ist.
Gewebezüchtungsgerüst nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Keratin mitogene Aktivität aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines porösen Gewebezüchtungsgerüsts nach einem der vorangegangenen Ansprüche, umfassend: Bereitstellung einer Keratinlösung, umfassend Keratin mit freien Thiolgruppen, in einem ersten Lösungsmittel; Emulgieren der Keratinlösung in einem zweiten Lösungsmittel, wobei das zweite Lösungsmittel mit dem ersten Lösungsmittel im Wesentlichen nicht mischbar ist und das Keratin im zweiten Lösungsmittel im Wesentlichen unlöslich ist; Einfrieren der Emulsion; Entfernung eines wesentlichen Anteils der ersten und zweiten Lösungsmittel unter Vakuum und bei niedriger Temperatur, sodass sich ein poröses Keratinmaterial ausbildet; und Kontaktieren des porösen Keratinmaterials mit einem Oxidationsmittel unter Bedingungen, die geeignet sind, um Disulfidvernetzungen aus einem Teil der freien Thiolgruppen zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Oxidationsmittel gasförmiger Sauerstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Oxidationsmittel Wasserstoffperoxid ist.
Verfahren zur Herstellung eines porösen Gewebezüchtungsgerüsts nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend: Bereitstellung des Keratinproteinmaterials mit Disulfidbindungen, welches von menschlichen oder tierischen Haaren oder Nägeln stammt; Reduktion des Keratinproteins, um Disulfidbindungen zu zerstören, um erste und zweite Fraktionen von Keratinproteinen zu erhalten, wobei die erste Fraktion wasserlöslicher ist als die zweite Fraktion; Platzieren der wasserlöslicheren Fraktion in ein Lösungsmittel und Abscheiden des Lösungsmittels, das die wasserlösliche Fraktion enthält, auf ein offenzelliges Material; Entfernung eines wesentlichen Anteils des Lösungsmittels aus dem offenzelligen Material; und Oxidieren des auf das offenzellige Material abgeschiedenen Keratins.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Keratin von menschlichem Haar stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei das Keratin von tierischem Haar stammt.