DE3687099T2

DE3687099T2 - Verwendung von einem cartilago-induzierenden faktor (cif) zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von entzuendungen.

Info

Publication number: DE3687099T2
Application number: DE8686306000T
Authority: DE
Inventors: Rosa Armstrong; Hanne Bentz; Larry Ellingsworth
Original assignee: Collagen Corp
Current assignee: Collagen Aesthetics Inc
Priority date: 1985-08-06
Filing date: 1986-08-04
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2006-08-05
Also published as: EP0451439B1; DE3650499T2; DE3650499D1; US5008240A; JPH06228005A; EP0213776A2; AU6087586A; ATE135231T1; ATE82133T1; DE3687099D1; EP0213776A3; US4806523A; EP0451439A1; AU591513B2; CA1265445A; EP0213776B1; JPH0798754B2

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der entzündungshemmenden Verbindungen. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Polypeptiden, die als knorpelbildende Faktoren (CIF's) bezeichnet werden, und funktionell verwandte Polypeptide als Faktoren zur Inhibierung entzündlicher Prozesse einschließlich lymphohistiozytärer, granulomatöser und akuter Entzündungen.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 85304848.6 der Anmelderin, veröffentlicht am 22. Januar 1986 unter der Nr. 0169016, beschreibt zwei aus Rinderknochen gewonnene CIF's, genannt CIF-A und CIF-B. Beide weisen bei der Bestimmung mittels SDS-PAGE ein Molekulargewicht von annähernd 26 000 Dalton auf und sind Dimere. Sie zeigen beide in vitro von alleine knorpelbildende Aktivität, wie durch die Bildung von knorpelspezifischem Proteoglycan (PG) in einem Modell aus einer Kultur aus Agarosegel unter Verwendung mesenchymaler Zellen von Rattenföten gemessen wurde. Keiner ist jedoch in vivo von selbst knorpelbildend aktiv. Sequenzieren der Aminosäuren von CIF-A zeigte, daß er eine partielle (30 Aminosäuren) N-terminale Sequenz aufweist, die identisch ist mit derjenigen, die für ein von der menschlichen Placenta stammendes Polypeptid berichtet wird, das transformierender Wachstumsfaktor vom Beta-Typ (TGF-β) genannt wird. Die partielle N-terminale Sequenz von CIF-B ist von der von TGF-β verschieden. Beide CIF's zeigen Aktivität im TGF-β-Test (Fähigkeit, das verankerungsunabhängige Wachstum von Nierenzellenkolonien normaler Ratten in Weichagar zu induzieren).
Von Rindernieren, menschlicher Placenta und menschlichen Blutplättchen stammendes TGF-β wird in der internationalen Patentanmeldung PCT/US83/01460, veröffentlicht am 29. März 1984 unter der Nr. WO 84/01106 und der EPA 84450016.5, veröffentlicht am 19. Dezember 1984 unter der Nr. 0128849, beschrieben. Diese Anmeldungen legen Daten vor, die zeigen, daß solches TGF-β, wenn es mit EGF oder TGF-α kombiniert wird,
1. die Zellproliferation in der zuvor erwähnten Testkultur aus Weichagar fördert und
2. die Zellproliferation und Proteinablagerung in einem Modell zur Wundheilung anhand von weichem Gewebe von Ratten fördert.
Die Anmeldungen charakterisieren die TGF-β's als Dimere mit einem Molekulargewicht von annähernd 26 000 Dalton, das mittels SDS-PAGE bestimmt wurde.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Befund, daß die zwei zuvor beschriebenen, von Knochen stammenden CIF's eine entzündungshemmende Aktivität aufweisen. Bewertungen von CIF- haltigen Implantaten weisen darauf hin, daß CIF sowohl lokal als auch systemisch inhibierend auf akute und/oder chronische Entzündungen wirkt. Wegen der Ähnlichkeit (oder vielleicht Identität im Falle von CIF-A) dieser Polypeptide mit TGF-β's, glaubt man, daß TGF-β's ebenfalls diese neuentdeckten Aktivitäten aufweisen. Diese Aktivitäten scheinen von der Gegenwart aktivierender Agenzien oder Co-Faktoren unabhängig zu sein und unterscheiden sich von der in vitro knorpelbildenden Aktivität und von der Aktivität der Zellproliferation, über die zuvor berichtet wurde. Der Einfachheit halber wird der Ausdruck CIF in diesem Abschnitt und den Ansprüchen als Oberbegriff verwendet, der CIF-A, CIF-B, die TGF-β's und ihre funktionellen Äquivalente umfaßt.
Demgemäß stellt die Erfindung die Verwendung eines knorpelinduzierenden Faktors (CIF) zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Entzündungen bereit. Sowohl akute als auch chronische Formen der Entzündung können so behandelt werden. Darüberhinaus kann die Behandlung systemisch erfolgen oder CIF kann lokal verabreicht werden, um bestimmte Entzündungsherde zu behandeln.
In den Zeichnungen sind:
Fig. 1 die Aminosäuresequenz eines von einem Blutplättchen stammenden Human-TFG-β-Monomeren,
Fig. 2 die graphische Darstellung der optischen Dichten (Absorption) (280 nm) der Fraktionen der Gelfiltration des Beispiels 1 (C),
Fig. 3 die graphische Darstellung der optischen Dichte (280 nm) der Eluatfraktionen der präparativen Ionenaustauschchromatographie des Beispiels 1 (D) und
Fig. 4 die graphische Darstellung der Ergebnisse der T-Zellenproliferations-Tests, die in Beispiel 4 (B) beschrieben sind.
Der hier verwendete Ausdruck "Entzündung" soll sowohl akute Reaktionen umfassen (d. h. eine Reaktion, in der die entzündlichen Prozesse aktiv sind) und chronische Reaktionen (d. h. eine Reaktion, die durch langsames Fortschreiten und die Bildung von neuem verbindenden Gewebe gekennzeichnet ist). Chronische und akute Entzündungen können durch die betroffenen Zelltypen unterschieden werden. Eine akute Entzündung betrifft oftmals polymorphkernige Neutrophile; wogegen chronische Entzündungen normalerweise durch eine lymphohistiozytische und/oder granulomatöse Reaktion gekennzeichnet ist. Beispiele für spezifische Entzündungstypen sind die diffuse, herdförmige, kroupöse, interstitielle, obliterative, parenchymatöse, reaktive, spezifische, toxische und traumatische Entzündung.
Der hier verwendete Ausdruck "Behandlung" soll Prophylaxe oder Abschwächung eines bestehenden Leidens bedeuten. Demgemäß kann im Fall einer Entzündung das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes verwendet werden, um eine Entzündung zu verhindern oder eine existierende Entzündung zu mildern.
Der Ausdruck "funktionelles Äquivalent", der zur Beschreibung eines Polypeptids verwendet wird, bedeutet solche Polypeptide, und zwar sowohl natürliche als auch synthetische ungeachtet ihrer Spezies oder Abstammung, die dieselbe Aminosäuresequenz wie das erwähnte Polypeptid aufweisen, sowie Polypeptide mit im wesentlichen homologer (d. h. mindestens 90% Identität der Aminosäuresequenzen), aber unterschiedlicher Aminosäuresequenz, wobei der (die) Unterschied(e) die entzündungshemmende Aktivität nicht nachteilig beeinflussen.
CIF-A, CIF-B und TGF-β's zeigen Aktivität in dem TGF-β-Test der in "Methods for Preparation of Media Supplements and Substrate for Serum-free Animals Cell Culture" (1984), Seiten 181-194, Alan R Liss, Inc. beschrieben ist. Dieser Test bestimmt die Fähigkeit, verankerungsunabhängiges Wachstum in nichtneoplastischen Nierenfibroplasten normaler Ratten (NRK) zu induzieren, indem die Bildung von Zellkolonien in Weichagar gemessen wird. Verfahren zum Gewinnen von TGF-β's aus Plättchen, Placenta- und Nierengewebe sind in der internationalen Patentveröffentlichung WO 84/01106 und der EPA-Veröffentlichung Nr. 0128849 beschrieben. Diese umfassen die Extraktion des Zellmaterials mit Säure-Ethanol, Auftrennen des Extrakts nach Größe durch Gelfiltration und Isolieren des TGF-β aus dem Filtrat durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC).
Ein Verfahren zum Isolieren von CIF's aus Rinderknochen ist in der europäischen Patentanmeldung Nr. 85304848.6 beschrieben. Es umfaßt das Extrahieren entmineralisierter Knochen (DMB) mit einem Extraktanz (z. B. ≥ 4M Guanidinhydrochlorid, 8M Harnstoff), das nichtfaserige Proteine löslich macht, Gelfiltration des Extrakts, um eine < 30 kD Fraktion zu erhalten, Chromatographieren der Fraktion auf Carboxymethylzellulose (CMC) bei einem pH von 4,5 bis 5,5, vorzugsweise 4,8, Eluieren der an CMC adsorbierten Fraktion mit einem NaCl-Gradienten und Reinigen der Proteine aus der Fraktion, die bei etwa 150-250 mM NaCl durch RP-HPLC oder Gelelektrophorese eluiert wird.
CIF-A, CIF-B und die TGF-β, die bis heute aus natürlichen Quellen isoliert wurden, sind Polypeptiddimere von annäherend 25-26 kD Molekulargewicht, wie es nach SDS-PAGE bestimmt wurde. Nature 1985, 316, Seiten 701-705 berichtet von einer cDNA-Nukleotidsequenz und einer abgeleiteten Aminosäuresequenz für von Blutplättchen stammendem Human-TGF-β. Reife, von Blutplättchen stammende Human-TGF-β sind als Homodimere eines 112 Aminosäuren langen Monomeren charakterisiert.
Von Blutplättchen/Placenta/Nieren stammender TGF-β und CIF-A und CIF-B sind, was die TGF-β Aktivität betrifft, nicht artenspezifisch. Man nimmt daher an, daß diese Polypeptide unter den Tierarten in hohem Maße erhalten geblieben sind (z. B. hat ein vorgegebenes Polypeptid von verschiedenen Säugetierarten eine Aminosäuresequenz, die sich, wenn überhaupt, durch Addition, Deletion oder der Substitution von einem oder mehreren Aminosäureabkömmlingen unterscheidet, was die nichtartenspezifische Aktivität nicht nachteilig beeinflußt) und eine Funktionalität über alle Arten hinweg aufweisen.
Demgemäß können CIF-A, CIF-B und die TGF-β's aus Zellen oder Gewebe verschiedenen tierischen Ursprungs gewonnen oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden. Entsprechend kann CIF (TGF-β) einer Wirbeltierart zum Behandeln einer anderen Wirbeltierart verwendet werden. Die am meisten verbreitete Verwendung von CIF (TGF-β) als entzündungshemmendes Mittel ist die Behandlung von Menschen, domestizierten Tieren wie Rind, Schaf und Schweinen und Tieren zum Sporttreiben oder Haustieren wie Pferden: Hunden und Katzen. CIF-A und CIF-B werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt verwendet.

Beispiele:

Die folgenden Beispiele sollen die spezifischen Ausführungsformen der Erfindung veranschaulichen. Sie sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.

1. Herstellung von CIF's aus Knochen

A) Herstellung eines entmineralisierten Knochens

Rindermittelfußknochen wurden frisch vom Schlachthaus erhalten und auf Trockeneis transportiert. Die Knochen wurden von Mark und Nichtknochen-Geweben gesäubert, in Stücke von weniger als 1 cm Durchmesser gebrochen und in einer Mühle bei 4ºC pulverisiert. Der pulverisierte Knochen wurde zweimal mit 9,4 l zweimal destillierten Wassers pro kg Knochen für etwa jeweils 15 min gewaschen und dann über Nacht in 0,01 N HCl bei 4ºC gewaschen. Der gewaschene Knochen wurde unter Verwendung von 3 · dem 3-fachen Volumen Ethanol, gefolgt von 3 · dem 3-fachen Volumen Diethylether, entfettet. Es wurde jeweils 20 min lang bei Raumtemperatur gewaschen. Das erhaltene entfettete Knochenpulver wurde dann in 0,5 N HCl (25 l/kg entfetteter Knochen) bei 4ºC entmineralisiert. Die Säure wurde dekantiert und der erhaltene entmineralisierte Knochen (DMB) gewaschen, bis der pH der Waschlösung größer als 4 war und der DMB auf einem Saugfilter getrocknet.

B) Extraktion von nichtkollagenen Proteinen

Der in A) hergestellte DMB wurde mit 3,3 l 4 M Guanidin-HCl, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), pH 6,8, 1 mM PMSF, 10 mM NEM pro kg 16 Stunden lang extrahiert, die Suspension abgesaugt und das nichtlösliche Material nochmals 4 Stunden lang extrahiert. Die löslichen Fraktionen wurden vereinigt und mindestens 5 · durch Ultrafiltration mittels einer Amicon Ultrafiltrationseinheit (10 K) konzentriert und das Konzentrat sechsmal gegen das 35-fache Volumen kalten entionisierten Wassers über eine Zeitspanne von 4 Tagen dialysiert und dann lyophilisiert. Alle Verfahren in diesem Absatz wurden bei 4ºC durchgeführt, mit Ausnahme der Lyophilisierung, die unter Lyophilisierungsstandardbedingungen durchgeführt wurde.

C) Gelfiltration

Der in 4 M Guanidin-HCl wieder aufgelöste Extrakt aus B) wurde auf einer in 4 M Guanidin-HCl, 0,02 % Natriumazid, 10 mM EDTA, pH 6,8 äquilibrierten Sephacryl S-200-Säule fraktioniert. Die Fraktionen wurden mittels ihres Absorptionsvermögens bei 280 nm analysiert und die Fraktionen, wie in Fig. 2 gezeigt, vereinigt. Fraktion F2 von Fig. 2, die eine Proteinfraktion mit einem niedrigen Molekulargewicht (LMW 10 000-30 000 Daltons) darstellt, wurde sechsmal gegen das 180-fache Volumen entionisierten Wassers dialysiert und lyophilisiert. Alle Arbeiten außer der Lyophilisierung und der Dialyse (4ºC) wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

D) Ionenaustauschchromatographie

Fraktion F2 aus C) wurde in 6 M Harnstoff, 10 mM NaCl, 1 mM NEM, 50 mM Natriumazetat, pH 4,8, aufgelöst und bei 10 000 Umdrehungen 5 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde auf einer CM-52 Säule (im Handel erhältliches CMC), die in demselben Puffer äquilibriert wurde, fraktioniert. Gebundene Proteine wurden von der Säule unter Verwendung eines NaCl-Gradienten von 10 mM - 400 mM in demselben Puffer bei einem Gesamtvolumen von 350 ml mit einer Fließgeschwindigkeit von 27 ml/h eluiert. Drei Hauptfraktionen, genannt CM-1, CM-2 und CM-3 wurden gesammelt, wie in Fig. 3 gezeigt. CM-2 und CM-3 wurden bei ungefähr 150-250 mM NaCl eluiert. Jede Fraktion wurde sechsmal gegen das 110-fache Volumen entionisierten Wassers vier Tage lang dialysiert und lyophilisiert. Alle zuvor genannten Arbeiten außer der Dialyse (4ºC) wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.

E) RP-HPLC

Die vereinigten lyophilisierten Fraktionen CM-2 und CM- 3 aus D) wurden jeweils in 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) gelöst und Aliquote der Lösungen auf Vydac C18 RP-HPLC-Säulen (4,6 mm ID · 25 cm) geladen und mit 0,1 % TFA 5 min lang bei 1 ml/min gewaschen. Das Elutionslösungsmittel war ein 0 %-60 % Acetonitrilgradient in 0,1 % TFA bei einer Rate von 2 % pro min.
Aus der RP-HPLC der vereinigten CM-2 und CM-3 Fraktionen wurden 2 Peaks erhalten - Peak A bei etwa 29,5 min und Peak B bei etwa 31,2 min. Die Proteine dieser Peaks sind Gegenstand der bereits erwähnten US-Patentanmeldung Nr. 630,938. Sie wurden mit CIF-A bzw. CIF-B bezeichnet.
Die Proteine wurden bis zur Verwendung bei -20ºC in 0,1 % TFA-Acetonitrilelutionslösung aufbewahrt.

F) Charakterisierung von CIF-A und CIF-B

Die nachfolgende Tabelle 1 gibt die partiellen Aminosäurezusammensetzungen von CIF-A und CIF-B an. Aminosäure Menge (gefundene Mole/100 Mole) (ND = nicht bestimmt)
Eine SDS-PAGE-Analyse von CIF-A und CIF-B ergibt, daß beide ein Molekulargewicht von etwa 26 000 Dalton aufweisen. Beide Proteine zeigen im vorgenannten TGF- β-Test eine Aktivität, die mit derjenigen vergleichbar ist, die für TGF-β's beschrieben ist, die aus menschlichen Blutplättchen, menschlicher Placenta oder Rindernieren stammen.
Sequenzieren der ersten 30 N-terminalen Aminosäuren von CIF-A und CIF-B wurde durchgeführt und folgendes gefunden:
Die N-terminale Aminosäuresequenz von CIF-A ist identisch mit der, die für ein von Blutplättchen stammendes Human-TGF-β beschrieben wurde (siehe Nature, infra).

2. Entzündungshemmende Aktivität von CIF's

A) Formulierung von CIF-A/CIF-B haltigen Implantaten

Ein kollagener Träger wurde durch Mischen eines gelösten Kollagens (CIS) (1-3 mg Protein/ml; erhältlich von Collagen Corporation unter dem Warenzeichen VITROGEN 1000) mit einem Pulver aus Knochenkollagen (BCP, lyophilisierter Feststoff aus Knochenkollagen) hergestellt und so eine minimale Endkonzentration von 10% Kollagen aus CIS erhalten. Eine Mischung aus CIF-A und CIF-B (in 0,1 % TFA) in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 1 wurde dem Träger in Gewichtsverhältnissen von 1 : 1200, 1 : 4500, 1 : 6000, 1 : 8000 und 1 : 20 000 zugefügt. Die Formulierungen wurden 1-2 Stunden lang bei 4ºC gerührt und entweder direkt lyophilisiert oder gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert. Der Träger alleine wurde als Vergleichskontrolle verwendet.

B) Histologische Auswertung der Implantatformulierungen von A)

1. Implantation

Die lyophilisierten Formulierungen wurden mit zwei Gewichtsteilen kalten sterilen Wasser rehydratisiert und gemischt, um eine homogene Paste zu bilden. Das rehydratisierte Material wurde zu kompakten Pellets geformt (80-100 mg Naßgewicht). Die Pellets wurden subkutan im Bauch-Brust-Bereich junger männlicher Ratten implantiert. Jede Ratte erhielt bilateral Implantate. Die Explantate wurden nach 3, 10 und 14 Tagen nach der Implantation wieder entnommen und histologisch ausgewertet.

2. Histologische Auswertung

Die Explantate wurden in 10%igem neutralen Formalin fixiert und nach Routineverfahren in Paraffin eingebettet. Die Abschnitte wurden nachfolgend entweder mit Hämatoxylin-Eosin oder mit Gomori trichome gefärbt.

3. Ergebnisse

Die Ergebnisse der histologischen Auswertung sind nachfolgend zusammengefaßt.
3 Tage nach Implantation

1. Träger alleine

3 Tage nach Implantation war das Implantat zum größten Teil azellulär. Wenige Neutrophile waren der am meisten auftretende Zelltyp.

2. CIF-Träger

Das Implantat war nach 3 Tagen ebenfalls relativ azellulär. Es trat jedoch eine offensichtliche Aktivierung von Fibroplasten benachbarter Muskeln und des umgebenden subkutanen Gewebes auf. Diese Fibroplasten enthielten viel Zytoplasma und waren zum größten Teil euchromatisch, was dafür sprach, daß die Zellen hochaktiviert waren. An den Rändern des Implantats trat bereits Fibroplasteninfiltration auf.
10 Tage nach der Implantation

1. Träger alleine

Das Entzündungsprofil war 10 Tage nach der Implantation beträchtlich verändert. Das Implantat enthielt ein diffuses Gemisch eines Infiltrats von Entzündungszellen, das im wesentlichen aus Lymphozyten und Histiozyten bestand. Herdförmige Bereiche von Granulozyten (Neutrophile und Eosinophile) und Riesenzellen waren rund um die Knochenkollagenteilchen nachweisbar.

2. CIF-Träger

Zu diesem Zeitpunkt waren wenige Entzündungszellen mit dem Implantat verbunden. Zahlreiche hyperplastische Fibroplasten waren durch das Implantat hindurch vorhanden. Eine kollagene Verbindungsgewebematrix rund um die Pulverteilchen aus Knochenkollagen und diese umgebend wurde nachgewiesen.
14 Tage nach Implantation

1. Träger alleine

14 Tage nach der Implantation waren die meisten Knochenkollagenteilchen durch Granuloma, die aus Lymphozyten, Histiozyten und Riesenzellen bestehen, abgesondert. Implantatbegleitende Fibrose wurde ebenso nachgewiesen wie mehrherdige Bereiche von Eosinophilen.

2. CIF-Träger

Verglichen mit den Kontrollimplantaten war die implantatbegleitende Entzündung vernachlässigbar. Eine dichte kollagene Verbindungsgewebematrix war durch das Implantat hindurch nachweisbar. Morphologisch schienen die Fibroplasten weniger metabolisch aktiv zu sein als zu früheren Zeitpunkten.
Diese histologischen Beobachtungen zeigen, daß CIF in vivo entzündliche Zellfunktionen hemmt. Der Mangel an polymorphkernigen Neutrophilen, Lymphozyten und Histiozyten an den CIF-haltigen Implantatstellen weist auf die Wirkung von CIF als potentes entzündungshemmendes Mittel hin.
In den Implantaten mit einem Gewichtsverhältnis von CIF zu Träger von 1 : 8000 und 1 : 20 000 trat ein beträchtlicher Rückgang der implantatbegleitenden Entzündungen auf, verglichen mit den Implantaten mit dem Träger alleine. Die Implantate, die ein höheres CIF-zu-Träger-Gewichtsverhältnis enthielten, entwikkelten eine dichte kollagene Verbindungsgewebematrix durch das Implantat hindurch. Bei jedem CIF-Gehalt war die implantatbegleitende Entzündung vernachlässigbar im Vergleich dazu, wenn kein CIF vorhanden war.
In ähnlichen in vivo-Untersuchungen, in denen die Ratten bilateral Implantate mit und ohne CIF-haltigen Extrakten erhalten hatten, wurde festgestellt, daß die Entzündung in einem von dem CIF-haltigen Implantat entfernten weiteren Implantat abgeschwächt oder nicht vorhanden war. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, daß CIF sowohl systemisch als auch lokal wirkt.
Wenn er als lokales entzündungshemmendes Mittel angewendet wird, wird CIF (und/oder TGF-β) normalerweise in wirksamen Mengen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger in Gewichtsverhältnissen zum Träger im Bereich von 1 : 1000 bis 1 : 20 000 formuliert. Falls Gewebeablagerung am Wirkort unerwünscht ist, kann der Gehalt an CIF-zu-Träger unter die Werte gesenkt werden (z. B. bei Gewichtsverhältnissen unter etwa 1 : 6000 im Fall eines Kollagenträgers), die die Gewebeablagerung fördern. Zusätzlich zur injizierbaren Formulierung kann der CIF festen, permeablen Implantaten, wie kollagenen Weich- und Hartgewebeimplantaten, Prothesen, Schwämmen, Wundverbänden und -nähten zugesetzt (eindispergiert) werden, um lokale entzündliche Reaktionen auf solche festen Körper zu modulieren. Da solche Implantate aus permeablen Materialien hergestellt sind, kann der CIF aus dem Implantat diffundieren und so seine entzündungshemmenden Eigenschaften ausüben. Falls es erwünscht ist, andere Aktivitäten des CIF zu minimieren (Zellproliferation, Gewebeablagerung), wird der CIF frei von aktivierenden Agenzien oder Co- Faktoren zugesetzt, vorzugsweise bei einem Gehalt, der unterhalb desjenigen liegt, der die Gewebeablagerung fördert.
Zur lokalen Behandlung von Entzündungen an inneren Körperstellen wird die CIF- oder TGF-β-haltige Formulierung injiziert, inhaliert, chirurgisch eingesetzt oder auf andere Weise lokal verabreicht, abhängig von der speziellen Formulierung und dem Ort, an dem eine Kontrolle der Entzündung erwünscht ist.
Zur systemischen Verabreichung kann CIF mit herkömmlichen Trägern, die mit wasserlöslichen Proteinen zur Injektion in den Kreislauf verwendet werden, formuliert werden. Wahlweise kann er als Implantat mit Langzeitwirkung formuliert werden, falls die zu behandelnde Indikation dies erfordert.
Die Menge an verabreichtem CIF (TGF-β) zur Behandlung der Entzündung hängt vom Patienten ab, dem zu behandelnden entzündlichen Zustand und der Art der Verabreichung. Im allgemeinen liegen die erwachsenen Menschen verabreichten Mengen im Bereich von etwa 0,1 - 1000 ug. Wenn CIF lokal verabreicht wird, werden normalerweise Mengen im unteren Teil dieses Bereichs verwendet, typischerweise 0,1-10 ug. Entsprechend liegen die Mengen bei systemischer Verabreichung typischerweise im 10-1000 ug-Bereich.
CIF kann bei der Behandlung von Entzündungen, die das Atemsystem betreffen, besonders wirksam sein. Bei dieser Anwendung können die CIF's durch Inhalation mit einem geeigneten Aerosol verabreicht werden. In dieser Form sind diese Faktoren hilfreich für die Behandlung von diffusen interstitiellen Leiden der Lunge wie Asbestose, Silikose oder der Staublunge der Bergarbeiter; die Behandlung immunologischer Krankheiten, die den Atemtrakt betreffen, wie rheumatische Arthritis, Lupus erythematodes oder Goodpasture- Syndrom; und die Behandlung granulomatöser Entzündungen der Lungen und des Lungentrakts wie Wegener Granulomatose und eosinophiler Granulomatose.
Diese entzündungshemmenden Peptide können mit Trägern in Form von Heilsalben, Salben, Tinkturen und anderen äußerlichen Formulierungen kombiniert werden und sind deshalb hilfreich bei der Bekämpfung von Hautentzündungen durch äußerliche Anwendung. Diese Formulierungen sind besonders hilfreich bei der lokalen Behandlung von Psoriasis vulgaris, Kontaktdermatitis, Hautgeschwüren und akuter oder chronischer ekzematöser Dermatitis.
CIF kann entweder alleine oder in Kombination mit einem ihn langsam freisetzenden Träger verwendet werden und in oder um Gelenke, Knochen oder Muskel zur Bekämpfung der mit verschiedenen Leiden verbundenen Entzündung injiziert werden. Einige Beispiele dafür sind Myositis (virale, bakterielle, parasitäre, pilzartige oder autoimmune Prozesse); Myasthenia gravis, Osteomyelitis, Osteoarthritis und rheumatoide Arthritis.
Da sich die CIF-Moleküle als bei niedrigem pH stabil und resistent gegen Enzymverdauung erwiesen haben, können diese Faktoren systemisch durch Nahrungsaufnahme verabreicht werden. Diese Eigenschaften machen diese Faktoren insbesondere brauchbar für die Bekämpfung von Entzündungen im Gastrointestinaltrakt. Dies ist insbesondere hilfreich bei der Behandlung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren, granulomatöser Gastritis, Speiseröhrenentzündungen (vielfältige Ursachen), Enteritis (vielfältige Ursachen) und Colitis (vielfältige Ursachen).

3. CIF verwendende in vivo-Tests im Arthritismodell am Nagetier

Experimentell kollageninduzierte Arthritis (ECIA) kann in Ratten durch intradermale Injektion eines nativen Kollagens vom Typ II (Rind oder Ratte), das in einem unvollständigen Freund'schen Adjuvans emulgiert ist, induziert werden. Am Inzuchtstamm der Lewis-Ratte LEW (RTl¹) konnte gezeigt werden, daß sich innerhalb von 14 bis 30 Tagen nach Immunisierung eine periphere Polyarthritis entwickelt. Gelenks- und Ohrknorpel entwickeln ein diffuses mononukleares Zellinfiltrat. Sensibilisierte Ratten reagieren auf die Exposition des intradermalen Hauttests und entwickeln zirkulierende Antikörper gegen das native Kollagen vom Typ II.
12 LEW-Ratten (12-15 Wochen alt) werden in drei Gruppen mit jeweils 4 Tieren aufgeteilt. Die Gruppen I und II werden durch intradermale Injektion mit Rinderkollagen Typ II in vollständigem Freund'schen Adjuvans bei 2,5 ml pro kg/Gewicht gegen das Rinderkollagen vom Typ II sensibilisert. Die Gruppe III dient als nichtsensibilisierte Kontrollgruppe.
Knöchelmessungen und subjektives Einteilen (0-+4) der Arthritis aufgrund des Entzündungsgrades und der Schwellung von Fingern und Zehen, Füßen und Knöcheln werden vor der Sensibilisierung und regelmäßig während des Tests hindurch durchgeführt. Ratten in Gruppe I, die eine signifikante Entzündungsreaktion zeigen, werden mittels Injektion von CIF (500 ng in 0,05 ml sterilem PBS) direkt in das Gelenk an den Tagen 1, 3, 5 und 7 nach der beobachteten Reaktion behandelt. Ratten der Gruppe II, die eine solche Reaktion zeigten, wurden in ähnlicher Weise durch Injektion von PBS ohne CIF behandelt.
Seren der Ratten vor und nach der Behandlung werden gesammelt und mittels eines ELISA auf Antikörper vom Kollagen-II Typ untersucht. Die Ratten werden an 3 Tagen, bevor sie getötet werden, einem intradermalen Hauttest unter Verwendung von 50 ug Kollagen des Typs II in das Abdomen unterzogen. Hautrötung und Verhärtung werden 24, 48 und 72 Stunden nach der Exposition gemessen. Nach 72 Stunden wird an der gereizten Stelle eine Biopsie vorgenommen und das Gewebe histologisch untersucht.
Die Ratten werden 5-7 Tage nach der letzten Injektion getötet, ausgeblutet und ihre Pfoten in 10% neutralem Formalin für die histologische Untersuchung fixiert.
Die Ergebnisse dieser Tests zeigen, daß die Behandlung mit CIF die Entzündung im Vergleich zur nichtbehandelten Kontrollgruppe beträchtlich abschwächt. Die CIF-behandelten Gruppen zeigen eine abgeschwächte Reaktion auf die Exposition von Kollagen des Typs II beim Hauttest, im Vergleich zu der nichtbehandelten Kontrollgruppe. Darüberhinaus weist die behandelte Gruppe einen signifikant geringeren Antikörpertiter gegen Kollagen des Typs II auf. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, daß die Verabreichung von CIF in die angegriffenen Gelenke die Entzündung nicht nur lokal bekämpft, sondern als ein immunsuppressives Mittel zur Behandlung von Arthritis systemisch wirksam ist.

Claims

1. Verwendung eines knorpelinduzierenden Faktors (CIF) mit einem Molekulargewicht von etwa 26 000 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Entzündungen.

2. Verwendung von CIF nach Anspruch 1, worin CIF ein Homodimeres ist, dessen Ketten jeweils

(a) die folgenden partiellen N-terminalen Aminosäuresequenzen:

Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-Cys-Phe-Ser-Ser-Thr-Glu-Lys- Asn-Cys-Cys-Val-Arg-Gln-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-Arg-Lys- Asp-Leu-Gly-Trp-; oder

(b) die folgenden partiellen N-terminalen Aminosäuresequenzen:

Ala-Leu-Asp-Ala-Ala-Tyr-Cys-Phe-Arg-Asn-Val-Glu-Asp- Asn-Cys-Cys-Leu-Arg-Pro-Leu-Tyr-Ile-Asp-Phe-Lys-Arg- Asp-Leu-Gly-Trp aufweisen.

3. Verwendung von CIF nach Anspruch 1, worin CIF ein Homodimeres ist, dessen Ketten jeweils die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz aufweisen.

4. Verwendung von CIF nach Anspruch 1, worin CIF im wesentlichen frei von einem aktivierenden Agens oder einem Co-Faktor ist.

5. Verwendung von CIF nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin CIF systemisch angewandt wird.

6. Verwendung von CIF nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das CIF lokal angewandt wird.

7. Verwendung von CIF nach Anspruch 6, worin CIF als Implantat in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger angewandt wird.

8. Verwendung von CIF nach Anspruch 7, worin der Träger ein kollagener Träger ist.