JPH06505965A - β型トランスフォーミング成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トーンスフォーミング 技１己Ｆ野 本発明はタンパク質化学に関する。さらに詳しくは、新型のトランスフォーミン グ成長因子βの発見および単離に関する。

背ＪＬｉ術 １９８３年９月２３日付で出願されたＰＣＴ　Ｎｏ　８４１００１１０６は、ト ランスフォーミング成長因子β１　（ＴＧＦ−β１）、ならびに、細胞増殖およ び組織修復の促進、創傷治癒、および外傷の治療のためのこの因子の使用につい て記載している。

米国特許第４．８４８．０６３号は、哺乳動物の骨中に発見された２つの軟骨誘 導因子、ＣＩＦ−ＡおよびＣＩ　Ｆ−Ｂについて記載しており、それらは（１） ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて軟骨形成を誘導する補体であり、（２）ｉｎ　ｖｉｖｏ において活性化剤または補体をなんら添加されない状態で結合組織の沈着を促進 しそして（３）ＴＧＦ−βを特徴づけるのに使用される足場非依存性細胞成長ア ッセイ（このアッセイは本明細書においては時にＴＧＦ−βアッセイと呼ばれ、 ■ｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅ　ａｒａｔｉｏｎ　ｏ　Ｍｅｄｉａ　Ｓｕ　ｌｅ ｍｅ　ｔｓ　ａｎｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏｒ　５ｅｒｕ＋＊−ｆｒｅｅ　 Ａ　ｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ　ｔｕｒｅ　（１９Ｂ４）　ｐｐ、　１８１−１ ９４．　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、に記載されている）において活性 である。

１９８６年３月６日付で出願された米国特許第４．８０６．５２３号は、ＣＩＦ −ＡおよびＣＩＰ−Ｂが双方とも抗炎症活性を持ち、マイトジェンに刺激された Ｔ細胞増殖およびＢ細胞活性化の阻害剤であることを開示している。この米国特 許はまた゛、ＣＩＦが造血およびリンパ球新生の中心に位置し、それゆえＣＩＦ が造血またはリンパ球新生の機能不全または機能障害に関連する適応症の治療に おいて有用であり得ることを報じている。ＣＩＦ−Ａはその後ＴＧＦ−β１と同 一であることが示された。ＣＩＦ−Ｂはその後新型のβ型トランスフォーミング 成長因子であると認められ、現在はＴＧＦ−β２と呼ばれている。

米国特許第４．８８６．７４７号はＴＧＦ−β３と呼ばれる第三のβ型トランス フォーミング成長因子を開示している。

ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は、すべてジスルフィド結合 によって結合した２つの同じポリペプチド鎖から構成される。すなわち、それら はホモ二量体である。ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のへテロニ量体は、ＴＧ Ｆ−β１．２と呼ばれ、同定されその利用が証明されている。１９８８年１月２ ９日付で出願されたＰＣＴ　Ｗｏ　８８１０５７８ｇは、ＴＧＦ−β１およびＴ ＧＦ−β２のへテロニ量体を開示している。１９８９年７月２０日付で出願され たＰＣＴ　ＮＯ９０１００９００は、ホモ二量体であるＴＧＦ−β１およびβ２ およびヘテロニ量体であるＴＧＦ−β１．２による炎症性疾患の治療を開示して いる。

＆脈皇皿示 本発明は、骨中に見い出された以前には知られていなかった型のＴＧＦ−β、お よび骨からもしくはｉｎ　ｖｉｔｒｏでの組換え発現から実質的に純粋なこのＴ ＧＦ−βを得る方法を提供する。このＴＧＦ−βはＴＧＦ−β２．３と表示され 、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のへテロニ量体であり、上皮細胞成長の阻害 のｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイにおいて活性である。

従って、本発明の一つの局面は、実質的に純粋なＴＣＰ−β２゜３である。他の 局面においては、軟骨形成／骨形成有効量のＴＧＦ−β２．３が実質的に非免疫 原性の担体とともに軟骨形成／骨形成性移植組成物として処方される。更なる局 面においては、有効量のＴＣＰ−β２．３が薬学的に許容され得る担体とともに 正常細胞の増殖を促進する組成物として処方される。

本発明の他の局面は、骨からＴＧＦ−β２．３を調製する方法であって、カラム クロマトグラフィーのピークよりサイドの画分を集める工程、それらの画分を逆 相１１ＰＬＣにかけ、５ＤＳ−ＰＡＧＥによりＴＧＦ−β２より移動度の低い画 分を回収する工程、それらの低移動性画分をＦＰＬＣにかけ、ｐＨ４，６−６， ７の勾配において溶出する画分を回収する工程、そのｐＨ４，６−６，７の溶出 物を逆相ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動にかける工程、および実質的に純粋なＴＧ Ｆ−β２．３を回収する工程を包含する。

本発明の他の局面は、ＴＧＦ−β２．３の移植により所定の部位において軟骨お よび／または骨形成を誘導する方法である。

本発明の他の局面は、非経口的に投与される治療有効量のＴＧＦ−β２．３の非 経口製剤による骨粗髭症の患者を治療する方法である。

本発明の他の局面は、抗炎症有効量のＴＧＦ−β２．３による炎症の患者を治療 する方法である。本発明の更なる局面は、浸透性物質からなる固形移植材に対す る局所の炎症を、この物質中に抗炎症有効量のＴＧＦ−β２．３を分散すること によって、予防または低減する方法である。

本発明の付加的な局面は、ＴＧＦ−β２．３の有効量による造血またはリンパ球 新生の機能不全もしくは機能障害に関連する適応症の患者を治療する方法である 。

本発明の他の局面は、哺乳動物における腫瘍細胞の成長を、腫瘍静止有効量のＴ ＧＦ−β２．３をその哺乳動物に投与することより、阻害する方法である。

本発明の他の局面は、ＴＧＦ−β２．３を産生ずる方法であって、ＴＧＦ−β２ またはＴＧＦ−β３のＮ−末端シグナル配列およびプロ領域（ｐｒｏｒｅｇｉｏ ｎ）をフード化するＤＮＡ配列を、ＴＧＦ−β３またはＴＧＦ−β２の成熟配列 をコード化するＤＮＡ配列に連結してキメラ構築物を生ずる工程、発現ベクター 内のこのキメラ構築物を宿主細胞内に導入する工程、発現ベクター内のＴＧＦ− β２またはＴＧＦ−β３の前駆遺伝子をこの宿主細胞内に導入する工程であって 、ここでこのＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３の前駆遺伝子は、このキメラ構築 物内のＮ−末端シグナル配列領域に実質的に相当するＮ−末端シグナル配列およ びプロ領域を有する工程、およびこの宿主細胞からＴＧＦ−β２．３を回収する 工程、による方法である０本発明の更なる局面は、虚血性心筋の再潅流（ｒｅｐ ｅｒｆ　ｕｓｉｏｎ）の結果として起こる重症心障害を予防する方法であって、 有効量のＴＧＦ−β２．３を虚血の発症前または後に患者に投与する工程を包含 する方法である。

本発明の他の局面は、動物における敗血症性ショックを治療する方法であって、 有効量のＴＧＦ−β２．３をその動物に投与する工程を包含する方法である。

本発明の更なる局面は、患者の造血幹細胞を化学療法剤の骨髄毒性から保護する 方法であって、有効量のＴＧＦ−β２．３をその化学療法剤にあてる前に患者に 投与することを包含する方法である。

本発明の更なる局面は、患者の造血幹細胞を放射線治療の骨髄毒性から保護する 方法であって、有効量のＴＧＦ−β２．３をその放射線治療にあてる前に患者に 投与することを包含する方法である。

本発明の更なる局面は、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、またはＴＧＦ−β２．３ の産生に関する疾患を診断する方法であって、ＴＧＦ−β２．３タンパク質、ま たはＴＧＦ−β２，３に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を 診断薬として用いる方法である。

本発明の他の局面は、ＴＧＦ−β２．３、または２．３の産生過剰の結果起こる 急性および慢性の疾患状態を治療する方法であって、ＴＧＦ−β２，３と反応す るモノクローナル抗体、またはＴＧＦ−β２．３と反応するモノ−ナル抗体の抗 原結合性フラグメントの治療有効量を投与することによる方法である。

本発明の他の局面は、ＴＧＦ−β２．３、または２．３を産生ずる腫癌細胞を治 療する方法であって、ＴＧＦ−β２．３と反応するモノクローナル抗体の治療有 効量を投与することによりＴＧＦ−βの免疫抑制効果を抑制する方法である。

本発明の他の局面は、転移性の癌を治療する方法であって、ＴＧＦ−β２．３と 反応するモノクローナル抗体の治療有効量を投与することにより、補体または腫 瘍除去のための免疫細胞により破壊されるよう腫瘍細胞を標識する方法である。

本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書の開示に図面の簡単な説明 図１は、陽イオン交換クロマトグラフィーによって調製し、Ｃｐｓ　ＲＰ−ＨＰ ＬＣカラムにかけて０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）におけるアセトニトリ ルの直線勾配により溶出した、ＴＧＦ−β２ピ一ク画分の溶出プロフィールであ る。

図２は、図１の場合と同様に調製したＴＧＦ−β２ピ一ク画分の、Ｍｏｎｏ−Ｓ 　ＦＰＬＣカラムにおけるｐＨ４，６−６，７およびｐＨ６，７−９，０勾配に よる溶出プロフィールであり、ｐｔ＋　４．６−６．７の画分は他のＴＧＦ−β ２ピ一ク画分よりも５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいてわずかに低い移動度を有する。

図３は、Ｍｏｎｏ−Ｓ　ＦＰＬＣカラムにおけるｐＨ４，６−ｐＨ６，７への変 化により得られ、Ｃ＋ａ逆相）ＩＰＬＣカラムにおけるアセトニトリルの直線勾 配によるクロマトグラフィーにかけられた、主として２５ＫＤのタンパク質を含 有する画分の溶出プロフィールである。このタンパク質は背後に小ピークが重な った一つの大きなピークとして溶出した。

図４は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）におけるアセトニトリルの直線勾 配によるＣ＋ｓ逆相ＨＰＬＣカラムから得られた、ＴＧＦ−β２．３とＴＧＦ− β１およびＴＧＦ−β２との溶出プロフィールの比較である。

図５は、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）におけるアセトニトリルの直線勾 配によりＣ＋ｓ逆相ＨＰＬＣカラムから２つのピークとして溶出した、還元ＴＧ Ｆ−β２．３の溶出プロフィールであり、後に溶出したピークは還元ＴＧＦ−β ２のピークと重なっている。

１区隻に皿 本発明の実施は、他に示していない限り、当該分野の技術の範囲にある、合成有 機化学、タンパク化学、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ工学の従来 の技術を用いる。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、５ｃ ｏｐｅｓＬＱＪＬＩ　（Ｓ、　Ｃｏ１ｏｖｉｃｋおよびＮ、　Ｋａｐｌａｎ編、 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）　、　Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍｏ匪、第２ 版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｉ’ｒｅｓｓＳＣｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８９、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｘ 　ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉ＋ｕ＋■立１社、１−４巻（［）、Ｍ、　Ｗｅｉｒお よびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　；　および、Ｈｏｕｓｅ著、Ｍｏ ｄｅｒｎ　Ｓ　ｎｔｈｅｔｉｃ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、第２版、Ｂｅｎｊａ＋＊ ｉｎ／Ｃｕ＋＊ｍｉｎｇｓ。

Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、カリフォルニア、１９７２を参照せよ。

本明細書において前記または後記に言及されるあらゆる特許、特許出願、および 刊行物は、すべて本明細書に参照として援用される。

Ａ、定態 本発明を定義する上で、下記の用語が用いられ、以下に示すように定義される。

本明細書で用いられる用語、「治療」とは、予防処置または現状の改善を意味す る。従って、炎症の場合では、本発明の方法は炎症を予防または存在する炎症を 緩和することに用いられ得る。

本明細書で用いられる用語「炎症」とは、急性の反応（即ち、炎症の経時的変化 が活発である反応）および慢性の反応（即ち、進行が遅いことおよび新しい結合 組織の形成を特徴とする反応）のいずれをも含む。慢性および急性の炎症は、関 与する細胞のタイプによって区分され得る。急性炎症にはしばしば多形核好中球 が関与する。これに対して、慢性炎症は通常リンパ組織球増多性および／または 肉芽腫性の反応を特徴とする特定のタイプの炎症の例として、拡散性炎、限局性 炎、クループ性炎、間質性炎、閉塞性炎、反応性炎、特異性炎、毒素性炎、およ び外傷性炎が挙げられる。

本明細書で用いられる用語「敗血症性ショック」とは、菌血症により引き起こさ れる一連の作用を指す。この作用の間には、細胞壁物質（グラム陰性菌中の菌体 内毒素、およびグラム陽性菌中のペプチドグリカン／タイツ酸複合体）が補体、 キニン、およびＡＣＴＩＩＩ　（副腎皮質刺激ホルモン）／エンドルフィン系を 活性化する。この一連の代謝作用は最後にシ讐ツク状態に進行する。

本明細書で用いられる、タンパク質は、天然において結合している他の分子を本 質的に含まない程度にまで精製されたときに、実質的に純粋である。この点につ いて、用語「実質的に純粋」とは、夾雑タンパク質を、重量で約３０％未満、好 ましくは約１０％未満、さらに好ましくは約５％未満に含有する組成物を意味す る。用語「実質的に純粋」は、ＴＧＦ−β２．３に結合して存在するタンパク質 に関して用いられ、ＴＧＦ−β２．３が非タンパク様の薬剤担体もしくは賦形剤 、またはタンパク様の薬剤担体もしくは賦形剤と混合している組成物を除外しな い。

本明細書で用いられる、ＴＧＦ−β２に実質的に相当するアミノ酸配列は、ＴＧ Ｆ−β２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する。同様 に、ＴＧＦ−β３に実質的に相当するアミノ酸配列は、ＴＧＦ−β３のアミノ酸 配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する。

本明細書で用いられる、ＴＧＦ−β２に実質的に相当するＤＮＡ配列は、ＴＧＦ −β２のＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する。同様に、 ＴＧＦ−β３に実質的に相当するＤＮＡ配列は、ＴＧＦ−β３のＤＮＡ配列に対 して少なくとも８０％の配列相同性を有する。

本明細書で用いられる用語「発現ベクター」とは、プラスミド、バクテリオファ ージ、ウィルス、または、関与する遺伝子を、その遺伝子を発現するための適切 なシグナルがそのベクターに存在するようにクローン化し得る、他の分子を指す 。発現ベクターはトランス（ｔｒａｎｓ）に供給されるファクターによる発現の 制御を要し得る。

本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」およびｒＭａｂＪとは、免疫 グロブリン組成物を指す。この組成物は実質的に均一である抗体集団を有し、そ の各々は同じ抗原決定基に結合する。他に示していない限り、この用語は、特定 の哺乳動物種もしくはイソタイプの抗体、または特定の手法で調製された抗体に は限定されない。この用語は、全抗体分子および抗原結合フラグメント（例えば 、Ｆａｂ’、Ｆ　（ａｂ’）　２）を含む。

二股Ｍ法 本発明は新規なβ型トランスフォーミング成長因子、ＴＧＦ−β２．３に関する 。今日までに天然の材料源から単離されたＴ６Ｐ−β類は、５ｌ）Ｓ−ＰＡＧＥ によって測定した分子量が約２５から２６ＫＤのポリペプチドニ量体である。Ｔ ＧＦ−β２．３は、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のへテロニ量体である。

ＴＧＦ−β類をウシ骨から単離する方法は米国特許第４．８４３．０６３号に記 載されており、その記載はすべて本明細書に参照として援用される。この方法は 、非繊維質のタンパク質を可溶化する抽出剤（例えば２４Ｍ塩酸グアニジン、８ Ｍ尿素）により脱塩骨（ＤＭＢ）を抽出し、その抽出物を、３０ＫＤより小さい 画分を得るために、ｐＥＩ　４．５−５．５、好ましくは４．８にてカルボキシ メチルセルロース（ＣＭＣ）上でゲル濾過し、ＣＭＣに吸着した画分をＨａＣ１ 勾配により溶出させ、そして約１５０−２５０＋ｓＭ　ＮａＣ１で溶出する部分 からのタンパク質を逆相ＨＰＬＣまたはゲル電気泳動により精製することを含む 。

ＴＧＦ−β類はＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｅ　ａｒ　ｔｉｏｎ　ｏ　ｅｄｉ ａ　Ｓｕ　ｅｍｎｔｓ　ａｎｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏ　Ｓｅｒｕｍ−ｆｒ ｅｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕ　ｅ（１９８４）　ｐｐ　１８１− １９４．　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、に記載されたＴＧＦ−βアッセ イにおいて活性を示す。そのアッセイは、非新生物性の正常ラット腎繊維芽細胞 における足場非依存性の成長を誘導する能力を、軟寒天中の細胞コロニー形成を 測定することによって決定する。血小板、胎盤、および腎組織からＴＧＦ−β類 を得る方法は、国際特許公報Ｎｏ　８４１０１１０６およびＥＰＡ公開第０１２ ８８４９号に記載されている。簡単には、この方法は原料物質を酸−エタノール で抽出し、ゲル濾過により抽出物のサイズをそろえ、この濾液から高速液体クロ マトグラフィー（］’１ＰＬＣ）によりＴＧＦ−βを単離することを含む。

今日までに単離されたＴＧＦ−β類は、ＴＧＦ−β活性に関しては種特異性がな い。それゆえに、これらのペプチドは動物種の間で高度に保存されており（すな わち、異なる哺乳動物種からの特定のポリペプチドが有するアミノ酸配列は、も し変化があるとしても一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、または 置換によるもので、それらは、この分子の種特異的でない活性に対して不利に作 用することはな（）、交差柵柱の機能を有すると考えられている。例えば、マウ スＴＧＦ−β１はヒトＴＧＦ−β１とただ一個のアミノ酸が異なることが示され ており（Ｄｅｒｙｎｃｋら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　２６１：４３ ７７、１９８６）、そしてマウスＴＧＦ−β２はヒトＴＧＦ−β２とただ３個の アミノ酸が異なる（Ｍｉ　１１ｅｒ　ら、　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏ、　３：１１０ ８．１９８９）。ウシのＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２は、ヒトのＴＧＦ−β １およびＴＧＦ−β２とそれぞれ完全に一致するアミノ酸配列を有する（Ｏｇａ ｗａおよび５ｅｙｅｄｉｎ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ、　Ｖａｔ　１９Ｂ、印刷中 ）。ヒトＴＧＦ−β３はニワトリＴＧＦ−β３とただ一個のアミノ酸残基が異な るが、マウスＴＧＦ−β３とは一致する（Ｄｅｎｈｅｚら、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆ ａｃｔｏｒｓ　３：１３９．１９９０）。

従って、ＴＧＦ−β類は多様な動物起源の細胞または組織から由来し得、または 組換えＤＮＡ技術によって人手し得る。相関的（こ、あるを椎動物種から得たＴ ＧＦ−βは他のを椎動物種の治療１こ用い得る。ＴＧＦ−βの最も一般的な治療 上の使用は、ヒト、ならびに牛、羊、および豚などの家畜、ならびに犬、猫、お よび馬などのスポーツ用またはぺ・、）用動物の治療１こある。

本発明のＴＧＦ−β２．３は、単独でまたはコファクターと共同して、ヒトを含 む動物の軟骨／骨組織を修復、置換、また（ま増強するために軟骨／骨形成を誘 導するのに有用であり得る。

このタンパク質の軟骨形成／骨形成作用の有効量を通常、薬学的および生理学的 に許容され得る液状または固形の移植用担体とともに処方する。

本発明のＴＧＦ−β２．３はまた、癌、新生物、および他のＴＧＦ−β２、ＴＧ Ｆ−β３、またはＴＧＦ−β２．３の産生に関与する他の疾患を検出するための 診断薬として有用であり得る。精製したＴＧＦ−β２．３はそれ自身が試薬とし て用い得、またはその代わりに、ＴＧＦ−β２．３に対するモノクローナルある いはポリクローナル抗体をそれらの診断アクセイにおける診断薬として用い得る 。

本発明のＴＧＦ−β２．３はまた、他のＴＧＦ−β類と同様に、種特異的でない 細胞増殖を促進（誘発および維持）するのに用い得る。これらの組成物の細胞増 殖活性の臨床上の適用は、火傷または創傷の回復または組織修復のための局所投 与を含む。

それらの用法では、タンパク質および活性化剤は、軟組織細胞の増殖を誘発する に十分な量で、特定の投与方式のために加えられる薬学的に許容され得る担体と 共に、処方する。局所用の投与剤は典型的には噴霧剤、ゲル剤、軟膏剤（ｏｉｎ ｔ＋ａｅｎｔ）または軟膏剤（ｓａｌｖｅ）として処方する。移植材は注射剤と して処方する。全身用の投与剤は経腸投与用（すなわち、液剤、火剤、錠剤）と してまたは非経口注射剤として処方し得る。そのような適用に用いる用量は、す べての増殖活性の性質ならびに創傷および他の損傷における可変性のため、特定 できない。

ＴＧＦ−β２．３はまた、骨粗粘症および大理石骨病のような骨の欠損症を全身 的に治療するために有用であり得る。そのような治療のためには、治療有効量の ＴＧＦ−β２．３を注入用の担体と共に処方し、患者に非経口的に投与する。用 量は一般的に０゜００１μｇ／ｋｇからｔｏ！１ｇ／ｋｇの範囲である。

ＴＧＦ−β類は、癌、骨髄腫、黒色腫およびリンパ腫を含むがこれらに制限され ないあらゆるタイプの細胞新生物の治療において腫瘍静止剤として用い得る。特 に好ましい標的は胸部、肺、結腸、および卵巣の癌である。ＴＧＦ−β類は局所 的または全身的に、治療される新生物の性質および程度に従って、投与し得る。

腫瘍静止有効量のＴＧＦ−β２，３または混合物を、薬学的に許容され得る担体 と共に、非経口投与用の注入剤として、または、持続型もしくは制御型の放出形 態であり得る固形または半固形移植材として処方する。

その代わりに、この腫瘍静止剤は、特に手術不能な腫瘍を含む固形の膿瘍に、動 脈を経由する腫瘍への供給による局所送達のための最新のカテーテル技術を用い て送達し得る。この場合、腫瘍静止剤を、腫瘍の還流を抑制する手段を提供し、 そして同時に腫瘍静止剤を局所送達する、注射用コラーゲンのような血管閉塞剤 と混合する。クリ・ノブもまた、静脈ドレナージを閉塞し、腫瘍塊中に高用量の ＴＧＦ−β２．３を保持するのに使用し得る。

全身投与のためには、腫瘍静止有効量のＴＧＦ−β２．３を、水溶性タンパク質 に用いられる慣用的な担体くたとえば、生理食塩水、糖溶液、等）と共に、循環 自注入用に処方する。その代わりに、それらを、ＴＧＦ−β２．３を循環内に長 期間にわたって放出するための、持続型の放出剤として処方し得る。全身への適 用における、腫瘍細胞に対するこの因子の特異的な標的化を、腫瘍特異性の細胞 表面抗原に対する抗体にＴＧＦ−β２．３を結合させることで成し遂げ得る。腫 瘍細胞への細胞毒性の増強を、ＴＧＦ−β２．３を細胞毒である＋３１１により 共有結合的に放射性ラベルすることで成し遂げ得る。ＴＧＦ−β類は容易にヨウ 素化され生物学的活性を完全に保持する。胸部および卵巣の腫瘍のような特定の 腫瘍型に対して特異的なモノクローナル抗体の調製は、当該分野で公知である。

所望されれば、他の化学療法剤からなる腫瘍静止剤を製剤中に含有し得る。

用語［腫瘍静止有効（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｃａｌｌｙ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）Ｊ は、腫瘍細胞の増殖を有意に（〉５０％）阻害する用量を示す。ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏアッセイでは、５０％阻害は一般に０．２μｇ／ｍｌ程度以下のＴＧＦ−β濃 度において観察され、１０μｇ／ｍｌ以下で飽和状態が達成される。ｉｎ　ｖｉ ｖｏでは阻害は患者の腫瘍負荷の監視によって監視される。特定の治療における ＴＧＦ−β２．３の腫瘍静止有効量は、患者、治療する癌のタイプおよび程度、 ならびに投与方式に依存する。一般には、成人への投与量は約０．００１μｇ／ ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの範囲にある。対応する全身投与は、ポリペプチドのク リアランスまたは他のｉｎ　５ｉｔｕでの不活性化に帰する、より高い区分の範 囲（０，０１μｓ／ｋｇから１０１ｇ／ｋｇ）を含む。

本発明のＴＧＦ−β２．３は局所および全身双方の炎症の治療に有用であり得る 。局所抗炎症剤として用いるときは通常、ＴＧＦ−β２．３の有効量を薬学的に 許容され得る担体と、担体に対する重量比が１：１０００からＬ：２００００の 範囲で処方する。もしその部位における組織沈着を望まなければ、担体に対する ＴＧＦ−β２．３の量をそれより低く下げ得る（例えば、組織沈着を促進するコ ラーゲン担体の場合は１：６０００より低い重量比）。注射剤として処方する他 にＴＧＦ−β２．３は、膠原性の軟および硬組織移植材、プロテーゼ、スポンジ 、創傷包帯、および縫合糸のような固形の浸透性移植材中に、固形物に対する局 所炎症反応を調整するために混合（分散）し得る。そのような移植材は浸透性物 質で作られているために、ＴＧＦ−β２．３は移植材から拡散して抗炎症特性を 発揮し得る。

内部の部位の炎症を局所的に治療するために用いるときは、特定の処方および炎 症の制御を必要とする部位に応じて、ＴＧＦ−β２．３を注射、吸入、外科的な 配置、または他の方法で局所投与し得る。

全身投与に関しては、水溶性タンパク質に用いられる慣用的な担体と共にＴＧＦ −β２．３を循環内への注射用に処方し得る。

その代わりに、治療中の適応症が要求するならば、ＴＧＦ−β２゜３を持続型の 放出性移植材製剤として処方し得る。

炎症の治療に投与されるＴＧＦ−β２．３の量は、患者、治療する炎症の状態、 および投与方式に依存する。一般には、成人に投与する量は約０．００１μｇ／ ｋｇからｔｏｍｇ／ｋｇの範囲にある。ＴＧＦ−β２．３を局所投与するときは 、この範囲の内の低い部分、典型的には０．１から１０μｇの量を通常使用する 。これに対応して、全身投与は典型的には１０から１０００μｇの範囲の量を含 む。

ＴＧＦ−β２．３は呼吸系に関連する炎症の治療において特に有効である。この 適用においては、ＴＧＦ−β２．３は好適な噴霧剤とともに吸入により投与し得 る。この剤形では、これらの因子は、以下のような治療に有効である。例えば、 石綿症、珪肺、または炭坑夫塵肺のような肺の間隙拡散性疾患の治療；リウマチ 性関節炎、エリテマトーデス、またはグツドバスチャー症候群のような、気道に 関連する免疫学的疾患の治療；および肉芽腫症および好酸性肉芽腫症の治療。

これらの抗炎症性ペプチドは５ａｌｖｅ　（軟膏）、ｏｉｎｔ＋ａｅｎｔ　（軟 膏）もしくは他の局所用製剤の形態の担体と組み合せ、その結果、局所適用によ る皮膚の炎症の制御に有用であり得る。

そのような製剤は、尋常性乾量、接触皮膚炎、皮膚潰瘍、および急性または慢性 の湿疹性皮膚炎の局所治療において特に有用である。

ＴＧＦ−β２．３は単独でもしくは徐放性担体と組み合わせて、種々の疾患に関 連する炎症を制御するために関節、骨、または筋の中もしくは周囲に注入し得る 。い（つかの例は、筋炎（ウィルス性、細菌性、寄生虫性、真菌性、または自己 免疫性の過程）；重症筋無力症；骨髄炎；変形性関節症およびリウマチ性関節炎 を含む。

ＴＧＦ−β分子は低ｐＨにおいて安定でかつ酵素消化に耐性であることが示され ているので、これらの因子は経口摂取により全身的に送達され得る。これらの特 性により、これらの因子は特に胃および十二指腸潰瘍、肉芽腫性胃炎、食道炎（ 多数の原因）；腸炎（多数の原因）；および結腸炎（多数の原因）の治療に対し て有効である。

ＴＧＦ−β類はまた敗血症性ショックの治療において有効であることが示されて いる（国際公開番号Ｗ０９０１０００９０３．１９８９年７月２１日出願）。Ｔ ＧＦ−β２．３を予防的にまたは治療的に、すなわち、感染が起こる前、同時、 または後に投与し得る。ＴＧＦ−β２．３は細菌感染にっ゛いて危険にさらされ ている患者、あるいは敗血症にかかっている患者の治療に用い得る。危険にさら されている患者としては、免疫抑制療法を受けている患者、重篤な火傷を負うか または他の重篤な損傷、嚢胞繊維症、腎不全、もしくは癌にかかっている患者、 または広範囲の外科手術または器官移植を受けている患者を含む。

ＴＧＦ−β２．３はこれらの患者に、上述したような全身的または局所的方法を 含む、任意の好適な技術により投与し得る。同様に、ＴＧＦ−β２，３組成物お よび用量は、上記適用例において論じたようにして、個々の患者の要求、敗血症 性シ目ツクの原因、投与方法、および実務者によって知られる他の要因を考慮し ながら処方し得る。用量は典型的にはｏ、ｏｏｔμｇ／ｋｇがら１０ｍｇ／ｋｇ の範囲にある。

ＴＧＦ−β２．３は、造血またはリンパ球新生の機能障害または機能不全に関連 する適応症の患者の治療に用い得る。ＴＧＦ−β２゜３をこれらの患者に、上述 したような全身的または局所的方法を含む任意の好適な技術により投与し得る。

同様に、ＴＧＦ−β２．３組成物および用量は、上記適用例において論じたよう にして、個々の患者の要求、投与方法、および実務者によって知られる他の要因 を考慮しながら処方し得る。用量は典型的には０．００１μｇ／ｋｇから１０ｗ ｇ／ｋＨの範囲にある。

ＴＧＦ−βはまた、シクロホスファミドやメツアランのような化学療法剤あるい は放射線治療の骨髄毒性から造血幹細胞を保護するために用い得る。そのような 適用においては治療有効量のＴＧＦ−β２．３を、化学療法剤または放射線治療 の投与に先だって、通常３−７２時間先だって、投与する。投与方式は、好まし くは大腿動脈内、腹腔内、または皮下であって、好ましくは注射による。ＴＧＦ −β２．３組成物および用量は、上記適用例において論じたようにして、個々の 患者の要求、用いられる薬剤や放射線治療の性質、組成物の投与方法、および実 務者によって知られる他の要因を考慮しながら処方し得る。用量は典型的には０ ．００１μｇ／ｋｇから１０　ｍｇ／ｋｇの範囲にある。

ＴＧＦ−βはまた、虚血性心筋の再潅流の結果起こる重症心障害の予防に用い得 る（Ｌｅｆｅｒ　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：６１．１９９０）。ＴＧＦ− β２．３は、虚血の発症前または後に、好ましくは静脈内に投与し得る。ＴＧＦ −β２．３組成物および用量は、上記適用例において論じたようにして、個々の 患者の要求、および実務者によって知られる他の要因を考慮しながら処方し得る 。用量は典型的には０．００１　μｇ／ｋｇから１０＋＊ｇ／ｋｇの範囲にある 。

ＴＧＦ−２，３の　え 本発明のタンパク質はｉｎ　ＶｉｔｒＯまたはｉｎ　ｖｉｖｏで原核あるいは真 核系のいずれにおいても発現し得る。原核生物はＥ、　ｃ。

■のによって最もしばしば代表される。しかしながら、バチルス属（例えばＢａ ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種々の種、およ び他の細菌株などの、他の微生物の株もまた用いられ得る。そのような原核系に おいては、宿主に適合性の種に由来する複製部位および制御配列を含有するプラ スミドベクターが用いられる。例えば、Ｅ、　ｃｏｌ　ｌは典型的には、Ｂｏｌ ｉｖａｒら（呼匣２：９５．１９７７）によっであるＥ、　ｃｏｌ　ｋの種から 得られたプラスミドである、ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。一 般に用いられる原核性制御配列は、本明細書において、転写開始のためのプロモ ーターを含み、必要に応じてオペレーターおよびリポソーム結合部位配列を含む ものと定義され、以下のような一般的に用いられるプロモーターを含む。例えば 、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）および乳糖（ロ幻プロモーター系（Ｃｈ ａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ　１９８：１０５６．１９７７）、およびトリプトフ ァン（！１２）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　８：４０５？、　１９８０）、およびラムグー由来ＰＬプロモータ ーおよびＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｌａｔａｋｅら、　Ｎａｔｕｒ ｅ　２９２：１２ｇ、１９８１）。しかしながら、原核生物に適合性の任意の利 用し得るプロモーター系が用いられ得る。

真核系において有用な本発明の発現系は、好適な真核性遺伝子由来のプロモータ ーを包含する。例えば、酵母に有用なある種類のプロモーターは、３−ホスホグ リセリン酸キナーゼのためのプロモーター（旧ｔｚｅｍａｎら、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５：２０？３．１９８０）を含む、解糖酵素の合成プロ モーターを含む。他のプロモーターは、エノラーゼ遺伝子（Ｍ、Ｊ、　Ｈｏ１ｌ ａｎｄ　ら、ＬＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５６：１３８５．１９８１）、または ＹＥｐ１３から得られるＬｅｕ２遺伝子（Ｊ、　Ｂｒｏａｃｈら、　Ｇｅｎｅ　 ８：１２１．１９７８）由来のものを含む。

好適な哺乳動物プロモーターは、ＳＶ４０　（Ｐｉｅｒｓ　ら、　Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３．１９７８）由来の初期および後期プロモーター、またはポリオ ーマ、アデノウィルス■、ウシ乳頭腫ウィルス、またはトリ肉腫ウィルスなどか ら得られる他のウィルス性プロモーターを含む。好適なウィルス性および哺乳動 物性エンハンサ−が上記に記載されている。植物細胞が発現系として用いられる 場合は、ツバリン合成プロモーターが好適である（Ｄｅｐｆｃｋｅｒら、　Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ａ　１．　Ｇｅｎ、　１：５６１．１９８２）。昆虫細胞培養での 発現は、バキュロウィルスベクターを用いて都合よく成し遂げ得る。

望ましいコード配列および制御配列を含有する適当なベクターの構築は、当該分 野で公知の標準的な連結および制限技術を用いる。単離プラスミド、ＤＮＡ配列 、または合成オリゴヌクレオチドを切断し、調整し、望ましい形態に連結する。

部位特異的なりＮＡの切断は、当該分野で一般的に知られた条件下で、一般的に は製造者の指示に従って、適当な制限酵素（または酵素群）を用いて処理するこ とにより行う。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ製品カタログ を参照のこと。一般には、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ配列を、約２０μ ｌの緩衝溶液中で１酵素ユニツトにより切断する；本実施例中では、典型的には 、ＤＮＡ基質の完全な消化を保証するため過剰の制限酵素を用いる。約３７°Ｃ におけるインキュベーション時間約１から２時間によって実施可能であるが、変 更は許容し得る。それぞれのインキュヘーシッン後、タンパク質をフェノール／ クロロホルム抽出により除去し得、次にジエチルエーテルで抽出し得、水性画分 から核酸を、エタノール沈澱の後セファデックス３Ｇ−５０５ｐｉｎカラム上で 分離して回収する。所望ならば、分割したフラグメントのサイズ分画を標準的手 法を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行い得 る。サイズ分画の一般的な記載は、Ｍｅｔルー１ル泣１１２．６５：４９９−５ ６０、　１９８０に見られる。

制限酵素で切断されたフラグメントの一本鎖「末端」は、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＤＮ ＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）のラージフラグメントとともに、４種類の デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）存在下に２０ないし２５℃に おいてインキコベーション時間約１５ないし２５分間で５ｈＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐ Ｈ７，６，５０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６！ＩＭ　ＤＴＴおよび ５−１０　μＭ　ｄＮＴＰｓ中で処理して、除去するかまたは二本鎖（「平滑末 端型」）に変換し得る。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントはデオキシリボヌクレオチド を５′「付着末端」に付加するが、たとえ４種類のｄＮＴＰｓが存在していても 、突出した３゛一本鎖を加水分解する。所望ならば、選択的修復を、付着末端の 性質によって決まる限度内でｄＮＴＰｓの１−３種類を与えることによって行い 得る。Ｋｌｅｎｏｌフラグメントによる処理の後、混合物をフェノール／クロロ ホルムで抽出し、エタノール沈澱の後、セファデックスＧ−５０カラム上でクロ マトグラフィーを行う。Ｓ１ヌクレアーゼをもちいた好適な条件下における処理 によって、あらゆる一本鎖部分で加水分解が起こる。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらのトリエステル法（Ｊ、　Ａ ｍ、　Ｃｈｅｔ　Ｓｏｃ、　１０３：３１８５．１９８１）により、または市販 の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製する。アニーリングに先立つ一 本鎖の標識は、過剰の、例えば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを０．１ ｎ■ａｌｅの基質に対して用いて、５０＋ｉＭ　ＴｒｉｓＳｐＨＴ、６、ＬＯ＋ ｓＭ　ＭｇＣｌ２、Ｓ＋ａＭジチオトレイトール、１−２ｍＭ　ＡＴＰ、１．７ ｐ冒ｏ１ｅｓ　３２ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍｃｉ／ｗ＋ｍｏｌｅ）、０．１ｍＭス ペルミジン、および０．１ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下で行う。

連結反応は以下の標準条件および温度下において１５−３０μｌ容量で行う：　 ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，５，１０ｄ　ＭｇＣｌ２．１０＋ａＭ 　Ｄ買、３３ｕ　ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）、１０ａ＋Ｍ−５ ０ｍＭ　ＮａＣｌ、および０℃において４０．ｃｚＭ　ＡＴＰＳｏ、０１−０． ０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（「付着末端」連結用）または １４℃において１＋ｎＭ　ＡＴＰ、０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４　 ＤＮＡリガーゼ（「平滑末端」連結用）。分子間の「付着末端」連結は、通常３ ３−１００μｇ／ｍ　ｌの全ＤＮＡ濃度で（５５−１Ｏ０ｎの全末端濃度）で行 う。分子間の平滑末端連結（通常リンカ−分子を１０−３０倍過剰に使用する） は１μＭの全末端濃度で行う。

プラスミド構築のための正しい連結反応は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｅ　５ ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＳＣ＃６１３５から得られたＥ、ｃｏｌｉ　ＭＭ ２９４株かまたは池の好適な宿主を、連結混合物と共に最初に形質転換すること により確認し得る。成功した形質転換細胞は、当該分野において知られるように 、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくは他の抗生物質耐性またはプラスミ ド構築物に依存する他のマーカーを用いて、選別する。この形質転換細胞からの プラスミドを次に、Ｄ、Ｂ、　Ｃ１ｅｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　６２：１１５９．１９６９の方法により 、必要に応じＴ　りｏ　ラム７　ニー１−　コ−／ｌ／増幅（Ｄ、Ｂ、　Ｃ１ｅ ｗｅｌｌ、　ム」１見堕工土ｏ１゜１１０：６６７．１９７２）を行った後に、 調製する。単離したＤＮＡを制限により分析、および／またはＭｅｓｓｉｎｇら 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：３０９．１９８１によりさらに 記載されたところのＦ、　Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：５４６３．１９７７のジデオキシ法により 、もしくはＭａｘａｍら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　６５＋４９９．１９ ８０の方法により配列決定する。

「ベクターフラグメント」を用いるベクターの構築において、ベクターフラグメ ントは一般に、５′　リン酸を取り除０てベクターの再連結を防ぐために細菌性 アルカリホスファ９−ゼ（ＢＡＰ）で処理する。ＢＡＰ消化を、ｐＦＩ８におい て約１５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ中でＮａ’およびＭ　ｇ２　＆存在下に、ベクターμ ｇあたり約１ユニツトのＢＡＰを用いて６０°Ｃで約１時間行う。核酸フラグメ ントを回収するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノー ル沈澱し、セファデックスＧ−５０カラムを適用して脱塩を行う。その代わりに 、不要なフラグメントの付加的な制限酵素消化により二回消化されたベクターに おいて、再連結は防ぎ得る。

ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来する、配列の修飾を必要とするベクタ一部分 には、部位特異性プライマーに誘発される突然変異を用い得る。このことは、望 ましい変異に相当する限定されたミスマツチ部位を除いて突然変異させるべき一 本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行う 。簡単には、合成オリゴヌクレオチドはファージに対して相補的な鎖の合成を指 示するプライマーとして用いられ、生成した二本鎖ＤＮＡはファージを支持する 宿主細菌内に形質転換される。形質転換細菌の培養はトップアガーにプレートし 、ファージを収容している単一の細胞からプラーク形成させる。

理論的には、新しいプラークの５０％が変異型を一本鎖として有するファージを 含み；５０％が元の配列を有する。生成したプラークは、対立遺伝子特異的条件 下でキナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイズさせる。一般には、実質 的に「正確なマツチング」を欠けばどのプローブもハイブリダイズしない条件を 得るために、ハイブリダイゼイシ目ン溶液の温度、イオン強度、およびカオトロ ピック試薬の濃度を変え得る。ＤＮＡに結合させるプローブのハイブリダイゼイ ションに関しては、標準条件（０，９Ｍ　ＮａＣ１）下における最適温度を算出 するための実験式は Ｔ（’Ｃ）　＝４＜Ｈａ　＋　Ｎｃ）　＋　２（Ｎｏ　＋　ＮＴ）　−５°Ｃで あり、ここにおいてＮａ、　Ｎｃ、　Ｎｏ、およびＮＴはプローブ中のＧ、　Ｃ ，Ａ。

およびＴ塩基の数である（Ｊ、　Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　１３８＋２６７、１９８４）。プローブとハイブリダイズしたプラー クを採取し、培養し、ＤＮＡを回収する。

宿主細胞の形質転換に必要なベクターを使用するときは、組換え構築物による宿 主細胞の形質転換が、そのような細胞に適した標準的手法を用いて行われる。カ ルシウム処理は、ＣｏｈｅｎのＰｒｏ　、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、 　Ｕ、Ｓ、Ａ、６９：２１１０１９７２で述べたようにして塩化カルシウムを用 いて、またはＭａｎｉａｔｔｓらがＭ　ｃｕｌａ　１ｏｎｉｎ　：　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌＩａｒ ｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　ｐ、　２５４で述べたＲｂＣ１法を使用して、原核生物ま たは他の実質的な細胞壁バリアを有する細胞に用いる。

Ａ　ｒｏｂａｃｔｅ　ｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ　ｓ　（Ｓｈａｖ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｇｅｎｅ　２３：３１５．１９８３）による感染はある種の植物細胞に 用いられる。細胞壁のない哺乳動物細胞に対してはＧｒａｈａｍおよびｖａｎ　 ｄｅｒ　Ｅｂ、■皿包訂５２＋５４６．１９７８のリン酸カルシウム沈澱法が好 ましい。酵母における形質転換は、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ、　Ｂａａ 、　１３０：９４６゜１９７７およびＣ，Ｌ、　Ｈｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、Ａ。

７６：３８２９，１９７９の方法に従って行う。あるいは、リポソームトランス フェクションシステムを用い得る。例えば、リボフエクチン（ＢＲＬ、　Ｇａｉ ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）の名で市販されている塩化Ｎ−［１−（２，３− ジオレイルオキシ）−プロピル１−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−トリメチルアンモニウムの ような合成脂質を用い得る。これはＰ、　Ｌ、　Ｆｅｌｇｎｅｒらがｒｏｅ、　 Ｍａｔ　、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、υ、Ｓ、Ａ、　１１４ニア４１３．１９８７ に述べたようにして用いる。

上述のいずれかの形質転換の方法により得られたｃＤＮＡライブラリーまたはゲ ノムのライブラリーをコロニーハイブリダイモーション法によりスクリーニング する。それぞれのマイクロタイタープレートを写しのニトロセルロースフィルタ ーペーパー（Ｓ　＆　Ｓ　ｔｙｐｅ　ＢＡ−８５）上に移し取り、５０ｐｇ／＋ １のアンピシリンを含むＬアガー上で３７℃で１４−１６時間コロニーを成長さ せる。コロニーを溶菌し、５００５Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣ１５分間の 連続処理によりフィルターにＤＮＡ固定し、５×標準ク工ン酸生理食塩水（ＳＳ Ｃ）で５分ずつ２回洗浄する。フィルターを風乾し、８０℃で２時間加熱する。

写しのフィルターを１フイルターあたり１０１のＤＮＡハイブリダイゼーシ讐ン バソファ−（ｐＨ７，０の５×ＳＳＣ，５ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶′ｅ、（フィ コールおよびウシ血清アルブミンを加えたポリビニルピロリドン；　ＩＸ　＝　 各０．０２％）、ｐＨ７゜０の５ｈＭリン酸ナトリウムバッファー、０．２％Ｓ ＤＳ、　２０．ｃｚ　ｇ／ｍｌポリ−Ｕ、および５０ｐｇ／ｅｌ変性サケ精子Ｄ ＮＡ）と共に４２°Ｃで６−８時間プレハイブリダイズする。

試料を所望のストリンジエンシーに応じた条件下にキナーゼ消化プローブでハイ ブリダイズする。典型的な適正ストリンジエンシー条件は１−５■１／フイルタ ーのプローブ含有ＤＮＡハイブリダイゼーションバッファーと４２℃の温度と２ ４−３６時間を用いる。より高いストリンジエンシーには、高温と短時間を用い る。フィルターを２Ｘ　５ＳＣ１０，２％ＳＤＳおよびｐＨ７１７）５０ｍＭ！ Ｊ　７酸ナトリウムバツフアーにより３７℃で各３０分ずつ４回洗浄し、次に２ ＸＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで２回洗浄し、風乾し、−７０°Ｃで２ないし３ 日間オートラジオグラフをとる。

望ましい組換え構築物の検出のためのプローブは以下のように調製し得る。核酸 が結合する相手は当業者によって知られた方法で調製される。例えば適当な配列 のクローニングおよび制限によりまたは好ましくは直接化学合成により調製する 。例えば、ここに参考として援用したＳ、Ａ、　ＮａｒａｎｇらによるＭｅｔｈ 、　Ｅｎ　ｍｏｌ、、　６８：９０．１９７９、および米国特許第４．３５６． ２７０号に記載されたホスホトリエステル法を用い得る。あるいは、ここに参考 として援用したＢｒｏｗｎらによるＭｅｔｈ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、、　６８：１ ０９．１９７９に開示されたホスホジエステル法を用い得る。他の方法はＢｅａ ｕｃａｇｅらによるＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２２：１Ｂ５．１ ９８１に開示されたジエチルホスホアミダイト法および米国特許第４、４５８． ０６６号に開示された固相支持法を含む。結合相手はまた、所望ならば、分光学 的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的方法による検出可醜な方法 を組み込んで標識され得る。例えば、プライマーは３２ｐ、蛍光染料、電子密度 試薬、酵素（ＥＬＩＳＡｓで通常用いられるような）、ビオチン、あるいは、抗 血清またはモノクローナル抗体を用い得る／％ブテンまたはタンパク質を含み得 る。

本発明のタンパク質に対する抗体は、ポリクローナルおよびモノクローナル双方 とも、従来の方法で調製し得る。一般には、タンパク質は最初に適当な動物、好 ましくはマウス、ラット、ウサギまたはヤギを免疫するのに用いられる。ウサギ およびヤギは、ポリクローナル血清の調製に好ましＩｎ’。なぜならば、得られ る血清の量の為と、抗ウサギおよび抗ヤギ抗体が利用できる為である。免疫は一 般にタンパク質を生理食塩水、好ましくは完全フロインドアジュバントのような アジュバント中に混合または乳化して、その混合物または乳化物を非経口的に（ 一般に皮下または筋肉内）注入して行う。

５０−２００μｇ／インジェクシ目ンの投与量で一般に十分である。

免疫は一般に、２−６週間後に生理食塩水中の、好ましくは完全フロインドアジ ュバントを用いたそのタンパク質を１回または２回注射して追加免疫する。ある いは、本発明の目的においてはｉｎ　ｖｉｖｏ免疫と同等であると考えられる当 該分野で知られた方法を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫によって抗体を生成し得る 。

ポリクローナル抗血清は免疫動物をガラスまたはプラスチック容器内に採血して 、血液を２５℃で１時間インキュベートし、続いて４℃で２−１８８時間インキ ュベートて得る。血清を遠心分離（例えば、ｔ、ｏｏｏｘａで１０分間）により 回収する。ウサギからは１回の採血あたり２０−５０ｍ　ｌが得られる。

モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのＮａｔｕｒｅ　 ２５６：４９５．１９７５の方法かまたはその修正法を用いて調製する。

典型的には、マウスまたはラットを上述のように免疫する。

しかしながら、血清を採取するには採血よりもむしろ肺臓（および随意にいくつ かの大リンパ節）を取り出し一個づつの細胞に単離する。所望ならば、肺臓細胞 を細胞懸濁液をそのタンパク質抗原を被覆したプレートまたはウェルに適用して スクリーニング（非特異的な付着細胞を除いた後に）し得る。

抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞はプレートに結合し 、残りの懸濁液によってすすぎ去られることはない。得られたＢ細胞またはすべ ての単離膵臓細胞を、次に骨髄腫と融合してハイブリドーマを形成するよう誘導 し、選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「■ ＾ＴＪ　）中で培養する。得られたバイブリドーマを限界希釈によりプレートし 、免疫抗原に特異的に結合する（かつ関連のない抗原には結合しない）抗体の産 生についてアッセイする。選択したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）−分泌ハイブ リドーマを、次にｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（例えば、組織培養ボトルまたはホローフ ァイバー型リアクター中で）、またはｉｎ　ｖｉｖｏ　（マウス腹水として）の いずれかで培養する。

望むならば、抗体（ポリクローナルあるいはモノクローナルを問わず）を一般的 な技術により標識し得る。好適な標識としては、蛍光剤、発色剤、放射性原子（ 特に３２ｐおよび＋２５１）、電子密度試薬、酵素、および特異的な結合相手を 持つリガンドを含む。酵素は一般に活性によって測定する。例えば、ホースラデ ィツシュペルオキシダーゼは通常３．３−．５．５’　、−テトラメチルベンジ ジン（ＴＭＢ）を青色染料に変換する能力によって検出され分光光度計で測定し 得る。「特異的な結合相手」は、例えばある抗原とそれに特異的なモノクローナ ル抗体の場合に見られるような、高い特異性を有するリガンド分子と結合できる タンパク質を意味する。他の特異的な結合相手としては、ピオチンとアビジンま たはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロティンＡ１　および当該分野で知られる 多数の受容体−リガントの組を含む。上記記述が、同じ標識がいくつかの異なる 方法で機能し得るように、種々の標識を異なる集合に類別することにはならない ことを理解すべきである。例えば、１２５Ｉは放射性標識または電子密度試薬と して機能し得る。ホースラディツシュペルオキシダーゼ（ｔ！ＲＰ）は酵素また はＭａｂに対する抗体として機能し得る。更に、種々の標識が望ましい作用と組 合せ得る。例えば、Ｍａｂ類およびアビジンは本発明の実施において標識もまた 必要とする：従って、Ｍａｂはピオチンで標識し得、その存在を１２Ｊで標識し たアビジンかまたはＨＲＰで標識した抗ビオチンＭａｂを用いて検出し得る。他 の置換および可能性は当業者には容易に自明であり、本発明の範囲の及ぶところ と同等であるとみなされる。

ＴＧＦ−βと反応する抗体は抗原の細胞表面の受容体への結合を妨げることによ ってＴＧＦ−βの生物学的活性を中和する。完全な抗体、抗原結合フラグメント （例えば、Ｆａｂ−、Ｆ（ａｂ−）２）がこれらの適用に有用であり得る。その ほかに、抗ＴＧＦ−β２．３抗体の投与は免疫複合体（抗原−抗体）の複合体を 形成し、抗原ＴＧＦ−βが全身の循環または抗原を産生じている組織の部位から クリアーされる割合を増加させる。

線維性疾患および腫瘍細胞を抗ＴＧＦ−β２．３抗体の治療有効量を投与して線 維症形成阻害または腫瘍細胞の退行に作用させ得る。投与方法および頻度、用量 範囲、および期間は、病状の重篤さと本質、および患者の総合的な健康状態によ って変化する。

好ましい実施態様においては、本発明の抗体は冒された組繊部位に単回の注射か または潅流によって局所投与する。投与した抗体量は局所組織が約ｔ−ｔｏｏｏ μｇ／＋ａｌのＴＧＰ−β濃度を維持することによって測定し得る。

この治療方法が特に有用である適応は、外科手術または外傷による過度の廠痕形 成の制御、または結合組織の癒着の形成防止においてである。局所投与による腫 瘍細胞の治療には、深部の固形腫瘍に対しては血管カテーテルを通して、または 表在あるいは皮膚の腫瘍には皮下針を通して抗体を固形腫瘍塊の中に直接送達す る。抗体は単回注射を数日間繰り返すか、または連続的な潅流によって局所投与 し得る。投与する抗体量は１μｇから１０００μｇ／ｇ腫瘍細胞が好ましい。

他の実施態様においては、抗体を静脈または腹膜潅流か、または皮下または筋肉 内に単回注射することにより投与し得る。抗体は、生理食塩水、調整塩類溶液、 ブドウ糖を加えたまたは加えない等張またはリン酸バッファー化（ｐＨ７）生理 食塩水のような当業者によって一般に知られた賦形剤中に導入し得る。

この治療方法が特に有用である適応は、間隙性肺繊維症、肝硬変、強皮症、およ び転移性感のような全身性疾患である。

局所および全身投与のいずれにおいても、生物学的に利用可能な因子の量を減少 するためにＴＧＦ−β２．３と反応する抗体を他のＴＧＦ−βと反応する抗体と 組み合わせて投与し得る。

支施■ 以下に述べる実施例は、本発明の明確な実施態様を説明するものである。これら は、いずれも、本発明を限定することを意図するものではない。

Ａ、　ＴＧ辷亙１ユ髪星皿 ウシの骨を、例えば、米国特許第４．８４３．０６３号に記載された方法で処理 して、ＴＧＦ−β２を精製した。陽イオン交換クロマトグラフィーの後で、ＴＧ Ｆ−β２のピークを含む画分を同定し、集めた。

この集めた画分をＣ１８逆相ＨＰＬＣカラム（ＩＸ２５　Ｃ１１％　５．ＩＺ、 ｖｙｄａｃ、　２１８ＴＰ５１０）にかけ、結合タンパク質は０．１％トリフル オロ酢酸（ＴＦＡ）のアセトニトリル直線グラジェントを用いて溶出した（図１ ）。この画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、本画分の大部分は２５にＤで移動する 主要バンドを含むことが明らかになった。

しかし、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２のピークの間で溶出した画分（画分＃５） では、バンドは他の画分よりも移動度がわずかに低かった。画分＃５をモノ−Ｓ 　ＦＬＰＣカラム（０，５ｘ５　ｃｔａｓ　Ｐｈａｒｔａａｃｉａ、　ＢＲ５１ ５）にかけた。このカラムは、６Ｍ尿素、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ塩 化ナトリウム、１％イソプロパツール、ｐＨ４，６で平衡状態になっている。カ ラムを、６Ｍ尿素、５０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ イソプロパツール、ｐＨ６，７で平衡状態になるよう、流速０．５ｍｌ／分で１ ０分間流してｐＨを６．７にまであげた。次に、カラムを、６Ｍ尿素、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ塩化ナトリウム、１％イソプロパツール、ｐｌ’１６．７ で平衡状態にした。さらに、カラムは同じ組成の緩衝液であるが、ｐＨ９，０で 平衡状態となるよう、流速０．５ｍｌ／分で１０分間流した。ｐ［１４，６−６ ，７グラジエント中で数種のタンパク質が溶出したが、ＴＧＦ−β２の大部分は ｐＨ６，１−９，０のグラジェント中に溶出した（図２）。

ｐａｃ６−６．７画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、画分＃４は主に２５Ｋ Ｄのタンパク質からなることが明らかになった。ｐＨ４，６−６，７グラジエン トで２５ＫＤのタンパク質を含有する、この画分＃４をＣ１８逆相）ＩＰＬＣカ ラム（０，４６Ｘ２５　Ｃ１，Ｖｙｄａｃ、　Ｓμ、２１８ＴＰ５４）にかけた 。タンパク質を、０．１％ＴＦＡのアセトニトリル直線グラジェントを用いて溶 出した。タンパク質は１つの主要ピーク　（ｐｅａｋ　＃１）として、微弱ピー ク（ｐｅａｋ　＃２）　と共に溶出した。微弱ピークは主要ピークの後方に重な り合うように出現した（図３）。５Ｏ３−ＰＡＧＥにより、主要ピークおよび微 弱ピークのいずれもにおいて、非還元条件では２５ＫＤで、還元条件では１２Ｋ Ｄから１３ＫＤで、単独のバンドがみられた。これはＴＧＦ−βに一致するバン ドである。

ＴＧＦ−β１は、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムの０．１％ＴＦＡのアセトニトリル グラジェント中で、ＴＧＦ−β２の前に溶出した。同一条件下では、組換えＴＧ Ｆ−β３は、ＴＧＦ−β２の後に溶出されてくるものと報告されている（Ｇｒａ ｙｃａｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏｌ　Ｅｎｄｏ、　３：　１９７７−１９８６、 １９８９）。同一条件下では、ＴＧＦ−β２．３へテログイ？−（ｐｅａｋ＃１ ）は、単独の鋭いピークとして、ＴＧＰ−β２のわずか少し前、ＴＧＦ−β１の 後に溶出した（図４）。そのタンパク質をＨＰＬＣの前にβ−メルカプトエタノ ールを用いて変性した場合、そのタンパク質は２つのピークで溶出した（図５） 。後の方の溶出ピークの位置は、変性した場合のＴＧＦ−β２ピークの位置に一 致した。免疫プロット法の結果、後の溶出ピークは主にＴＧＦ−β２を含んでい るが、これに対して先の溶出ピークは主にＴＧＦ−β３を含んでいることが証明 された。この結果は、２５ＫＤピークがＴＧＦ−β２．３ダイマーであるという 推論に一致した。

Ｂ、　［１紅隻！二二皇並 ミンクの肺上皮細胞（ＭｖｌＬｕ、　ＡＴＣＣＣＣＬ　６４）を９６ウエルの組 織培養プレート上で培養した。５０μｌＭＥＭにっき１×１０３個の細胞を培養 した。このＭＥＭは、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、 非必須アミノ酸、およびＬ−グルタミンを含有する。試験試料は培地で希釈し、 適切に希釈した。希釈細胞（５０μｌ）の試料はプレートして３０分後３個のテ ストウェルに加えた。５％ＣＯ２と９５％空気の混合空気を加湿して用いて、３ ７°Ｃで４日間インキュベートした後、ウェルはＰＢＳ　（リン酸緩衝化生理食 塩水）で洗浄し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，５，０，１％Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００，１０ｍＭ　＋）−１−トロフェノールリン酸からなる液１００μ ｌを添加して、細胞を溶解した。細胞の増殖は、構成的に発現される酵素である 酸性ホスファターゼを分析することにより測定した。２時間後、１０μｌの０． ＩＮ水酸化ナトリウムをそれぞれのウェルに加えた。吸光度はマルチチャンネル プレートリーダーで、４０５ｎｍに設定した吸光、および４９２ｎ＋ｎに設定し た基準フィルターで測定された。増殖の阻害−刺激作用は、処理細胞の酸性ホス ファターゼ活性を無処理細胞と比較してパーセント低下率で表した。

逆相ＦＩＰＬＣのピーク＃１およびピーク＃２から得られたタンパク質は、ミン クの肺の上皮細胞（ＭｖｌＬｕＳＡＴＣＣＣＣＬ６４）の増殖を阻害した。これ らは、それぞれ０．０２ｎｇ／ｍｌ、　０．０２５ｎｇ／ｍｌでＥＤｓｓとなっ た。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２は０．０１−０．０２ｎｇ／ｍｌのＥＤ５ｏ を有する。本結果より、本発明のＴＧＦ−β２．３はＴＧＦ−β１およびＴＧＦ −β２に匹敵する特有の生物活性を有することが証明される。

Ｃ，アミノ　９　Ｉの゛ ピーク＃１のタンパク質のアミノ酸末端の５９番目の残基までの配列を決定した 。この配列はＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３のアミノ酸末端残基が等比に混合 される混合物からなるものである（表１）。ＴＧＦ−β１配列は存在しなかった 。ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β３のいずれかとのＴＧＦ−β２との混合物を与 えるとすれば、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β３とは、初めの５９個の残基中で、＃ ９．１０．１１．１３．１９．２６．３３．４０．４５．５１．５２．５４．５ ７、および５８の位置で相違する。残基＃１１．１２．１３．１７．３３．４０ 、および５０で、ＴＧＦ−β３とマツチする残基のシグナルは総ピークシグナル の約５０％で存在していた（残り５０％はＴＧＦ−β２由来のもの）。残基＃４ ０以上では、シグナルは１（・ツクグラウンド（こ埋もれてしま（１、決定的な 同定を行うことができなかった。Ｎ末端の部分配列、分子量分析、および生物活 性のこれらの比較に基づいて、ＴＧＦ−β２．３は、ＴＧＦ−β２のＮ末端アミ ノ酸配列と相同性があるポリペプチドとＴＧＦ−β３のＮ末端アミノ酸配列と相 同性があるポリペプチドからなるものであり、両ポリペプチドは等比で存在する ことが示唆される。

（以下余白） ウ＝７７ＧＦ−Ｂ２．３　Ｎ宋立島西己不りＸｘｘ’−Ｃｙｓ　Ｘｘｘ　−Ａｒ ｇ　Ｘｘｘ’−８ｅｒＸｘｘ”　Ｊｒｐ　Ｘｘｘ５−Ｇｌｎ／ＴｈｒＤ・免且１ 」月１激 本発明のＴＧＦ−Ｂ２．３タンパク質は、免疫プロットで抗ＴＣＰ−β３ポリク ローナル抗体と強く交叉反応した。この抗体はＴＧＦ−Ｂ２を認識しない。本発 明のＴＧＦ−Ｂ２．３はまた、免疫プロットで３Ｃ７，１４，６抗ＴＧＦ−β２ モノクローナル抗体とも強く交叉反応した。このモノクローナル抗体はＴＧＦ− β１を認識しない。これらの結果により、ＴＧＦ−Ｂ２，３はＴＧＦ−Ｂ２及び ＴＧＦ−Ｂ３のエピトープを含有することが証明された。

さらに、ＴＧＦ−Ｂ２．３は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ ）ではＴＧＰ−Ｂ２と同様に、２Ｇ１抗ＴＧＦ−β２モノクローナル抗体と交叉 反応した。このモノクローナル抗体はＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−Ｂ３とは交叉 反応せず、ＴＧＦ−Ｂ２とＴＧＰ−Ｂ３のホモダイマーの混合物とは部分的にの み交叉反応した。これらの結果により、本発明のＴＧＦ−Ｂ２．３はへテロダイ マーであって、ＴＧＦ−Ｂ２とＴＧＦ−Ｂ３のホモダイマーの混合物ではないこ とが証明された。

Ｅ、ヘテロ　イマーを　る　え　の 成熟した生物活性を有するＴＧＦ−Ｂ２．３ヘテロダイマーは、ＴＧＦ−Ｂ２及 びＴＧＦ−Ｂ３の前駆体またはそれらの機能等傷物（ｆｕｎｃＨｏｎａｌ　ｅｑ ｕｉｖａｌｅｎｔ）をフードする全長のヌクレオチド配列を、前駆体を正確にプ ロセスする宿主細胞で、クローニング及び発現することによって産生され得る。

従って、成熟ＴＧＦ−β２．３ヘテロダイマーは、自然に存在するＴＧＦ−Ｂ２ ．３ヘテロダイマーと実質上区別できないだけの生物活性を有するよう産生され る。ＴＧＦ−Ｂ２及びＴＧＦ−Ｂ３の前駆体をコードする全長ヌクレオチド配列 の機能等価物は、適切な宿主細胞内で発現されるとき、成熟ＴＧＦ−β２．３ヘ テロダイマーの合成、プロセッシング、輸送を導き得る、いずれのＤＮＡ配列を も含有する。

ハイブリッド前駆体配列、例えば、ＴＧＦ−β２成熟配列の代わりにＴＧＰ−β ３成熟配列にインフレーム（１ｎ−ｆ　ｌａｍｅ）で連結されたＴＧＦ−Ｂ２前 駆体配列をコードしている配列は適切な宿主細胞内で構成され、クローン化され 得る。ＴＧＦ−β２成熟配列を有するＴＧＦ−Ｂ２前駆体配列もまた、その同じ 宿主細胞内でクローン化される。よって、その宿主細胞では、ハイブリッドおよ びＴＧＦ−βの前駆体配列のいずれの形質も発現する。１つのＴＧＦ−Ｂ２前駆 体配列、および、ＴＧＦ−β２Ｎ末端シグナルペプチド配列およびＴＧＦ−β３ 成熟配列に結合したプｃ１領域とからなる１つのハイブリッド遺伝子からなる２ つの構成物が同時に発現することにより、２つの遺伝子産物の対合およびＴＧＦ −Ｂ２゜３ヘテロダイマーの発現と生産がおこる。

同様に、ＴＧＦ−β３成熟配列の代わりにＴＧＦ−β２成熟配列にインフレーム で連結されたＴＧＦ−Ｂ３前駆体配列が、適切な宿主細胞内で構成され、クロー ン化され得る。より一般的にいえば、成熟したＴＧＦ−Ｂ２およびＴＧＦ−Ｂ３ 配列が、同−宿主中で別個に、しかし同一のシグナルペプチド及びＴＧＦ−βプ ロ領域配列に連結されたものからなる２つのハイブリッド前駆体配列のクローニ ングおよび発現により、ＴＧＦ−Ｂ２．３ヘテロダイマーの産生が起こる。

組換えＴＧＦ〜β２．３の産生のための別の方法では、ＴＧＦ−Ｂ２およびＴＧ Ｆ−Ｂ３のモノマーペプチド鎖は別個に再生され、折り畳み構造を持つＴＧＦ− βモノマーを産生し得る。続いて、これらのＴＧＦ−Ｂ２およびＴＧＦ−Ｂ３の モノマーは、１つ以上のシスティンジスルフィド結合対を通じて相互に結合され 、ＴＧＦ−Ｂ２．３ヘテロダイマーを形成する。この目的のために、成熟したＴ ＧＦ−β配列をコードするＴＧＦ−β遺伝子は、例えば大腸！１１　（Ｌ凶且） のような、バクテリア発現系（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　５ ｙｓｔｅｌ）中にクローン化される。ＴＧＦ−Ｂ２およびＴＧＦ−Ｂ３のポリペ プチド鎖は、異なる発現系で別個に発現される。ＴＧＦ−Ｂ２およびＴＧＦ−Ｂ ３のポリペプチド鎖を精製し、再生した結果、ペプチド鎖は折り畳み構造となり 、ペプチド内にジスルフィド結合ｆｆｌを形成する。続いて、ＴＣＦ−Ｂ２およ びＴＧＦ−Ｂ３のモノマーは分子内ジスルフィド結合を通じて相互に結合され、 ＴＧＦ−Ｂ２．３ヘテロダイマーを形成する。

このように、新しい型のＴＧＦ−β型ファクター、その利用、その生産方法を開 示してきた。本発明の好ましい実施態様を詳細に記載したが、添付したクレーム によって定義され、本発明の精神および目的からそれることな（、種々のバリエ ーションがなされることは明らかである。

時昭（＠） 吋聞（労） Ｆｉｇｕｒｅ　３ ＴＧＦ−１３２，３ 峙Ｆｖ′Ｊ（分） Ｆｉｇｕｒｅ　４ 峙聞（分） Ｆｉｇｕｒｅ　５ 国際調査報告 １ｍｓ＋ｎｅｔ＋ｏ＋ｍｊａｅｌ＋ｃ＋＋ａａ＊Ｎｏ、Ｐｊ、Ｔｅｌ　°＋ｔｔ ＰＣ’ｒ１０８９１１０８６０６ 丁、　Ｃ］ａｉ１％１１　１−４　ａｎｄ　６．６ｒａｉｎ　ｔｏ　ＴＧＦ−ｂ ＠ｔａ　２．：ｌ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｊａｅ　ａｎｄ’　ａ　ｔｈ＠ｒａｐｅｕ ｔｉｃ　ｃｏ＊ｐｏ＋ｎｔｉｏｎ、　ｃｌａｓｓｘｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ 　５３０．　ａｕｂｃｌａｓｓ　R９Ｑ。

Ｃｌａｉｍ　５−　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｆｉｒｓｔ　ＩＩ＠ｔ）１０ｄ　ｏ ｆ　ｐｒ＠ｐａｌ”ｉｎ９　ＴＧＦ−ＢＥＴ人２．３　ｆｒｃｍ　ｂｏｎｄ、ｃ ｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　５１４．ｓｕｂｅｌａｍｓ　４１２゜ Ｃ１ａｉＩＩ＋’１．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｆ　ｆｌｒｓｔ　＋ｗｔ、ｈｃｘ５ 　ｏｒ　ｉｎｄｕｃｌｎｇ　ｃａｒｔｉｌａｇｅａｎｄｌｏｒ　ｂｏｎｅ　ｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　５１４，５ｕｂｃ ｌａｓｓ　５２０．ｆｏｒｐｘａｒａｐｌｍ、 ｒＴ、Ｃ］ａｊ＋＊ｓ　１６−４１．６ｒａｗｎ　ｔ６４　ｍ＠ｔＦＫＷ３　ｏ ｆ　ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　ＴＧＦ−ｂｌ”ｒｏ２．３　ｒｅｃｏ＋＊ｂｉｎａｎ ｔｌｙ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４３５．　ｓｕｂｃｌａｍ ｓ　１７２．３　ｆｏｒｅｘａＩＩＩｐｌｅ。

１■、　Ｃｌａｉｍ　１１．　ｄｒａｗｎ　乞ｏ　ｓ　ｍｅｅｈｃｘｉ　ｏｆ　 ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ。

ｃｌａｓｍｉｆユａｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　５１４．　５ｕｂｃｌａｓ廖　１２ ．　ｆｏｒ　ｗｘａｍｐｌｍ。

ＩＶ　、Ｃｌａｉｍｓ　９−２６．ｄｒａｗｎ　ｒｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ 　仁ｒ＠ａｔ１ｎＱ−ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｃａｒ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｉｎｆ ｌａｗ＋＋＋＋ａｔｉｃ＋ｎ、ｒｌａｑ＊ｔｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａＩＩｓ　５ １４．　５ｕｂｃｌｓｓ磨@）２ ｆｏｒ　ｅｘａｌｌＩｐｌｅ。

Ｖ　ＣｌａｉｍＳ　２７．Ｊ３−Ｊ６．ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｊｈｏｄ　 ｏｆ　ｔ、ｒｅａｒ、ｘｎｇ１ｎδ１ｆｕｎｃｔｉｎｒ＋　ｏｆ　ｈ＊ｍａｔｏ ｐｏｅｓ＋ｓ、ｃｌａｐ＋５ｔｆｉｅｄ　コ、ｎ　ｍ１ａｓｓ　５１４．　′４ ｕｂｃ４≠吹{＋ｑ ’＋７７、ｆｔ＋ｒ　ｅｘａｍｐｌ＠。

Ｖ工　、Ｃｌａｉｍｓ　２Ｂ−３２，ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏ ｆ　ｔｒｅｓｔｊｎｇ　ｔｈｅ　ｇｒｎｗｔｈｃ＋ｆ　ａ　ｔｕｍｃ＋ｒ　Ｃｅ １ｌ　、ｃｌａｓｓｉｆｉ＠ｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　５１４．’ｓｕｂｃｌａｍ ｓ　１２．　ｆｏｒフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７／２４　 ＡＢＪ ３９／３９５　ＡＢＮ　Ｎ　９２８４−４ＣＣ０７Ｋ　３／２０　８３１８−４ Ｈ ３／２２　８３１８−４Ｈ １５１０６８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　５／１０ １５／１２　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｈ８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （７２）発明者　ダッシュ、ジェイムズアメリカ合衆国　カリフォルニア　９４ ０６２レツドウツド　シティ、セミノル　ウェイ８３７ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．実質的に純粋ななＴＧＦ−β２．３。 ２．以下の（ａ）および（ｂ）を含有する軟骨形成／骨形成物質： （８）軟骨形成または骨形成に有効な量のＴＧＦ−β２．３、および （ｂ）実質的に非免疫原性の担体。 ３．以下の（ａ）および（ｂ）を含有する、正常動物細胞の増殖を促進する組成 物： （ａ）有効量のＴＧＦ−β２．３；および（ｂ）薬学的に許容し得る担体。 ４．以下を含有する、結合組織の沈着を促進する組成物：有効量のＴＧＦ−β２ ．３；および 薬学的に許容し得る担体。 ５．以下の工程（ａ）−（ｅ）を包含する、骨からＴＧＦ−β２．３を調製する 方法： （ａ）陽イオン交換カラムクロマトグラフィーにより調製されたＴＧＦ−β２ピ ーク画分を集める工程；（ｂ）工程（ａ）で集められた画分を逆相ＨＰＬＣにか け、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＴＧＦ−β２よりも移動度の低い画分を回収する工 程；（ｃ）工程（ｂ）の低移動性画分をＦＰＬＣにかけ、ｐＨ４．６−６．７の グラジエントにおいて溶出するタンパク質を回収する工程； （ｄ）工程（ｃ）のｐＨ４．６−６．７溶出物を、逆相ＨＰＬＣまたは非変性ゲ ル電気泳動にかける工程；および（ｅ）該逆相ＨＰＬＣまたは非変性ゲル電気泳 動より、実質的に純粋なＴＧＦ−β２．３を回収する工程。 ６．ＴＧＦ−β様活性をもつタンパク質であって、請求項５に記載の方法により 調製されるタンパク質。 ７．生存哺乳動物の所定の部位において軟骨および／または骨の形成を誘発する 方法であって、該部位においてＴＧＦ−β２．３を移植する工程を包含する方法 。 ８．骨粗しょう症の患者を治療する方法であって、治療有効量のＴＧＦ−β２． ３の非経口製剤を非経口的に患者に投与する工程を包含する方法。 ９．炎症の患者を治療する方法であって、抗炎症有効量のＴＧＦ−β２．３を患 者に投与する工程を包含する方法。 １０．前記炎症が急性である、請求項９に記載の方法。 １１．前記炎症が慢性である、請求項９に記載の方法。 １２．前記ＴＧＦ−β２．３が全身に投与される、請求項９に記載の方法。 １３．前記ＴＧＦ−β２．３が局所に投与される、請求項９に記載の方法。 １４．前記炎症が患者の呼吸系に関与する、請求項９に記載の方法。 １５．前記タンパク質が吸入によって患者に投与される、請求項１４に記載の方 法。 １６．前記炎症が皮膚の炎症である、請求項９に記載の方法。 １７．前記ＴＧＦ−β２．３が局所に投与される、請求項１６に記載の方法。 １８．前記炎症が自己免疫疾患と関連する、請求項９に記載の方法。 １９．前記炎症が胃腸管内にある、請求項９に記載の方法。 ２０．前記ＴＧＦ−β２．３が薬学的に許容し得る担体と組み合わせて投与され る、請求項９に記載の方法。 ２１．前記担体が膠原性物質であり、担体に対するタンパクの質重比率は１：１ ０００から１：２００００の範囲にある、請求項９に記載の方法。 ２２．前記ＴＧＦ−β２．３は実質的にいかなる活性化剤あるいはコファクター をも含まない、請求項９に記載の方法。 ２３．浸透性物質からなる固形移植材に対する局所的な炎症反応を予防しまたは 低減する方法であって、抗炎症有効量のＴＧＦ−β２．３を該物質中に分散させ る工程を包含する、方法。 ２４．前記量は組織の沈着を促進する量よりも低量である、請求項２３に記載の 方法。 ２５．前記ＴＧＦ−β２．３は実質的にいかなる活性化剤あるいはコファクター をも含まない、請求項２３に記載の方法。 ２６．前記物質が膠原性である、請求項２３に記載の方法。 ２７．造血あるいはリンパ球新生の機能障害または機能不全に関連する適応症の 患者を治療する方法であって、有効量のＴＧＦ−β２．３を患者に投与する工程 を包含する方法。 ２８．哺乳動物において腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、腫瘍静止有効 量のＴＧＦ−β２．３を該哺乳動物に投与する工程を包含する方法。 ２９．前記ＴＧＦ−β２．３は、該哺乳動物と同じ種の哺乳動物に由来する、請 求項２８に記載の方法。 ３０．前記哺乳動物がヒトである、請求項２８に記載の方法。 ３１．前記腫瘍細胞がカルチノーマ（癌）細胞、アデノカルチノーマ（腺癌）細 胞、メラノーマ（黒色腫）細胞、またはリンパ腫細胞である、請求項２８に記載 の方法。 ３２．前記癌細胞が胸部、肺、結腸、または卵巣の癌である、請求項２８に記載 の方法。 ３３．動物において正常細胞の増殖を促進する方法であって、請求項３に記載の 組成物を該動物に投与する工程を包含する方法。 ３４．動物において軟組織細胞の増殖を促進する方法であって、請求項３に記載 の組成物を該動物に投与する工程を包含する方法。 ３５．患者の所定の部位において結合組織の沈着を促進する方法であって、請求 項４に記載の組成物を該部位に配することを包含する方法。 ３６．以下の工程を包含する、ＴＧＦ−β２．３を産生する方法：ＴＧＦ−β２ またはＴＧＦ−β３のＮ末端シグナル配列およびプロ領域をコードするＤＮＡ配 列を、ＴＧＦ−β３またはＴＧＦ−β２の成熟配列をコードするＤＮＡ配列に連 結して、キメラ構築物を生ずる工程；表現ベクター内の該キメラ構築物を宿主細 胞に導入する工程； 表現ベクター内のＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３前駆体遺伝子を該宿主細胞に 導入する工程であって、ここで該ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３前駆体遺伝子 は、該キメラ構築物内のＮ末端シグナル配列領域に実質的に相当するＮ末端シグ ナル配列およびプロ領域を有する、工程； 核宿主細胞からＴＧＦ−β２．３を回収する工程。 ３７．前記キメラ構築物および前記ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３前駆体分子 が同じ発現ベクターで運搬される、請求項３６に記載の方法。 ３８．前記キメラ構築物および前記ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３前駆体分子 が同じ発現ベクターで運搬される、請求項３６に記載の方法。 ３９．前記発現ベクターが誘導性である、請求項３６に記載の方法。 ４０．前記宿主細胞が真核性である、請求項３６に記載の方法。 ４１．請求項３６に記載のキメラ構築物。 ４２．ＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３の産生に関連する疾患を診断する方法で あって、診断薬が精製ＴＧＦ−β２．３、ＴＧＦ−β２．３に対するモノクロー ナル抗体、またはＴＧＦ−β２．３に対するポリクローナル抗体を含有する群か ら選ばれる、方法。 ４３．動物において敗血症性ショックを治療する方法であって、有効量のＴＧＦ −β２．３を該動物に投与する工程を包含する方法。 ４４．患者の造血枠細胞を化学療法剤の骨髄毒性から保護する方法であって、該 化学療法剤にあてる前に、有効量のＴＧＦ−β２．３を患者に投与する工程を包 含する方法。 ４５．患者の造血幹細脂を放射線治療の骨髄毒性から保護する方法であって、該 放射線治療にあてる前に、有効量のＴＧＦ−β２．３を患者に投与する工程を包 含する方法。 ４６．虚血性心筋の再灌流の結果起こる重症心障害を予防する方法であって、虚 血の発症前または後に、有効量のＴＧＦ−β２．３を患者に投与する工程を包含 する方法。 ４７．急性または慢性の線維症を予防する方法であって、ＴＧＦ−β２．３に反 応する治療有効量のモノクローナル抗体を投与する工程を包含する方法。 ４８．ＴＧＦ−β２．３と反応する前記抗体が、ＴＧＦ−β上のエピトープと結 合することによって、ＴＧＦ−β細胞レセプターへのＴＧＦ−βの結合を阻止す る、請求項４７に記載の方法。 ４９．ＴＧＦ−βの抑制効果を打ち消す方法であって、ＴＧＦ−β２．３と反応 する治療有効量の抗体を投与する工程を包含する方法。 ５０．ＴＧＦ−βを生成する腫瘍細胞を有する哺乳動物において、腫瘍の退縮を 誘導する方法であって、該腫瘍細胞によって生成されたＴＧＦ−βの免疫抑制効 果を低減するに十分な量の、ＴＧＦ−β２．３と反応するモノクローナル抗体を 投与する工程を包含する方法。