JPH07509611A - 形態形成蛋白質溶解型複合体，及びその組成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３５、当該骨ｉｌｌｌｌ全不全肉腫、骨粗Ｎ症及びパジェント病からなる群より 選択される請求項３４記載の発明３６、組織の状態を評価する方法で、ｍ織、又 は体液サンプル中の抗モルフオシエン抗体の存在を検出する工程よりなる方法３ ７、損失、又は損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法で、組織あるいは 体液サンプル中の抗モルフオシエン抗体の存在を検出する工程よりなる方法 ３８、組織不全を診断する方法で、組織、又は体液サンプル中の抗モルフオシエ ン抗体を検出する工程よりなる方法３９、組織不全を診断する、又は哺乳類の損 失した、若しくは損傷した組織の再生治療の効果を評価するキットで、以下のも のからなるキット： ａ）当該哺乳類からの細胞、又は体液サンプルを採取する手段 ｂ）当該サンプル中の内因性抗モルフオシエン抗体と特異的に相互作用する事が 出来る結合蛋白質Ｃ）当該内因性抗モルフオシエン抗体に結合した結合蛋白質を 検出する手段 明　細　書 形態形成蛋白質溶解型複合体、及びその組成主所Ω立互 本発明は全般に形態形成蛋白質に関する、さらに詳しくは水系溶媒に改善された 溶解度を有する組成に関する主尻皇宜五 形態形成蛋白質（モルフオシエン）はよ（知られており、先行技術に述べられて いる０例えば、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ、Ｎｏｓ。

４．９６８．５９０；５，０１１，６９１；５，０１８．７５３；ＰＣＴ　Ｕ　 ３９２１０１９６８及びＰＣＴ　ＵＳ９２１０７４３２　ｉや０ｚｋａｙｎａｋ らの（１９９２）　Ｊ、Ｂ　ｉ　ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　ｉｉｉ：２５２２０−２５２２７及び０ｚｋａｙｎａｋらの（１９ ９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、土７９　：１１６ −１２３　を含めて科学文献に発行されているいろいろな論文などを参照できる 。

先行技術は骨からどのようにして形態形成蛋白質を単離するかとか、これらの蛋 白質をコードする遺伝子をどのようにして同定するかとか、遺伝子組み換えテク ノロジーを使って、どのようにそれらを発現させるかということを開示している 。形態形成蛍白質は、それらが正しく折りたたまれ２量化し、適切な３次元コン フォーメーションがとれるよう、ジスルフィド結合した時、哺乳類の軟骨性骨形 成や他の組織形成を誘導することができる。

当該蛋白質は、局所あるいは全身投与により治療への適用に利用される。骨誘導 が望まれているときには、例えば、モルフオシエンは一般に、遊走性前駆細胞（ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌ）の浸潤、増殖、分化を許容する、適切なコン フォーメーションを存する、適切なマトリックスと関連する哺乳類の骨形成の望 まれる箇所に投与される。適切なマトリックス表面に吸着した骨形前形成蛋白質 は、−ａ的には、当業者では骨形成法として考えられている。当該蛋白質は骨か ら単離する事が出来るし、好ましくは当該蛋白質をコードする遺伝子は、遺伝子 組み換えにより、適切な宿主細胞で産生ずる事が出来る。

モルフオシエンの前駆体ポリペプチド鎖は、Ｎ末端のシグナル配列とプロ領域（ ｐｒｏ　ｒｅｇｉｏｎ）の共通の構造モチーフを共有し、そのどちらも切断され て、ジスルフィド結合が出来る成熟配列になり、ファミリーの中ではアミノ酸配 列が高度に保存されるＮ末端延長部分及びＣ末端ドメインよりなる。

成！！！２量体の形で、モルフオシエンは、一般に生理的条件下では、はとんど 不溶である。これらの蛍白質の溶解度を上昇させることは、治療薬としてモルフ オシエンの全身投与の効果を増強するので重要な医療の用途がある。血清アルブ ミン、カゼインを含むいろいろなキャリア蛋白質は、モルフオシエンの溶解度を 増加させる事が知られている（例えば国際出＠　ＵＳ９２１０７４３２参照）６ 国際比１１１ＵＳ９２１０５３０９　（ＷＯ９３１０００５０）では、成熟２量 体のＢＭＰ２の溶解度を増す各種のアミノ酸、及びそれらのメチルエステル及び グアニジン、塩化ナトリウム、ヘパリンなどを含む各種の溶解剤の利用について 検討している。

形態形成蛋白質の組み換え体発現の改善方法については、当該技術分野で努力が 続けられている。

本発明の目的は高特異活性を有する形態形成蛋白質を生産し、精製する方法、及 び、これらの蛋白質からなる製剤組成と骨形成方法について改善を提供する事に ある。

他の目的は、本質的に形態形成蛋白質由来のアミノ酸配列からなる溶解型形態形 成蛋白質を提供する事にある。他の目的は、形態形成蛋白質の溶解型複合体を安 定化する製剤を提供する事にある。

さらに他の目的は、当該溶解型形態形成蛋白質と成熟形態形成蛋白質を識別する 手段を提供し、血清、脳を髄液、腹水などの体液中の当該蛋白質の定量方法を提 供し、これらの各種類を識別する事が出来るポリクロナルやモノクロナル抗体を 提供する事にある。

他の目的は体液中に存在するモルフオシエンや、内因性抗モルフオシエン抗体の 濃度を追跡するための抗体や生物学的診断方法を提供し及び体液中の当該蛋白質 の濃度の変動を検出するアッセイ法を提供することにある。Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎ ｔＮｏ。

４．８５７，４５６や、Ｕｒｉｓｔらは（１９８４）Ｐｒｏｃ。

Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７６：４７２−４７５で骨形前形成蛋白質であると 思われる蛋白質を検出する血清のアッセイ法について論じている。この蛋白質は 、ここで言う形態形成蛋白質のファミリーの一員ではなく分子量、構造特性、溶 解度などで当該蛋白質とは異なる。

主所五斐旌 哺乳動物細胞から培養培地へ分泌する形態形成蛋白質は、分泌蛋白質のかなりの 留分として熔解型蛋白質を含む事が判明し、そしてこの溶解型が非共存結合で少 なくとも一つの、好ましくは二つのプロドメインと結合している成熟２量体（そ れらの端を切った形のものも含む）からなることが判明した。さらに抗体が当該 蛋白質のこれらの二つ型を識別するのに使用できる事も判明した。これらの抗体 は、形態形成蛋白性の成熟型と溶解型を選択的に単離し、また産生される成熟型 と溶解型の量を定量する精製工程の一部として使用してもよい、これらの抗体は 、また体液中の形態形成蛋白質の濃度を追跡したり、各種の型の蛋白ｔｆｉ度の 変動を検出する診断方法の一部として用いてもよい、抗体や蛋白質は、さらに、 生体中の各種のこれらの蛋白質に対する、内因性の抗モルフオシエン抗体の濃度 を検出、及び追跡する診断アッセイにも使用してもよい。

本発明の重要な具体例は形態形成活性を有する２量体構造の特定と関連する一対 のポリペプチドサブユニットからなる２量体蛋白質である。ここで特定されるよ うに、関連親出願にはモルフオシエンは、一般的には、形態学的に許容し得る環 境中では、以下のような生物学的な機能の全てが可能である：前駆細胞の増殖を 促進する一分化細胞の増殖を促進する；そして分化細胞の成長と維持を支援する 。

２量１体形態形成蛋白質の各サブユニットはモルフオシエンファミリーに特徴的 な７個以上のシスティン残基を有する、少なくとも１００個のアミノ酸ペプチド 配列からなる。好ましくは、少な（ともサブユニットの一つは、モルフオシエン ファミリーの一員の変異、又は対立形質遺伝子変異若しくは種間変異、若しくは キメラ型変異、若しくは他の配列変異のプロ領域の一部、若しくは全部からなる ペプチドと非共有結合的に複合体を形成しているモルフオシエンファミリーの一 員の変異、又は対立形質遺伝子変異若しくは種間変異、若しくはキメラ型変異、 若しくは他の配列変異の成熟型のサブユニットからなる。その一対のサブユニッ トと一つの、好ましくは二つのプロ領域ペプチドが、水系溶媒中で、複合体形成 しない対のサブユニットより、より溶解性のある複合体を形成する。

好ましくは、二つのサブユニットがモルフオシエンファミリーの一員の変異、又 は対立形質遺伝子変異若しくは種間変異、若しくはキメラ型変異、若しくは他の 配列変異の成熟型サブユニットからなり、二つのサブユニットは非共有結合的に プロ領域の全部、若しくは一部からなるペプチドと複合体を形成する。

さらに好ましくは、各サブユニットがヒト０Ｐ−１の変異、又は種間変異、若し くは対立形質遺伝子変異、若しくは他の配列変種の成熟型であり、およびプロ領 域ペプチドがヒ）ＯＰ−１、又は種間変異、若しくは対立形質遺伝子変異、キメ ラ型変異、又は他の配列変異のプロ領域の完全なまたは部分配列である。現在の ところ、好ましいプロ領域は、プロ領域の全長型である。プロ領域フラグメント としてはプロ配列の最初の１８アミノ酸を含むことが好ましい。他の有用なプロ 領域フラグメントはインタクトなプロ領域配列の端の切れた配列である。切断は Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ、の蛋白分解酵素開裂部位で起こる。当業者あ れば、既知のモルフオシエンをコードしている遺伝子配列から、プロ領域をコー ドする有用な配列を得ることが出来る。またはキメラ型プロ領域を、一つ以上の 既知のモルフオシエン配列から構築する事が出来る。さらに他の選択として、一 つ以上の既知のプロ配列の合成配列変種をつくることもできる。

ここで使用されるように、モルフオシエン蛋白の成熟型サブユニットはインタク トのＣ末端ドメインとインタクトあるいは切断（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型のＮ末 端延長部分を含む０例えば、０Ｐ−１のを用な成熟配列はＳｅｑ　ＩＤ　Ｎｏ、 １の残基２９３−４３１で特定される。さらに、それらの切断配列をも含み、残 基３００−４３１．３１３−４３１，３１５−４３１．３１６−４３１や３１８ −４３１で特定される配列を含む。この最後の配列は、Ｎ末端延長部分の配列の 最後の約１０残基のみを保持することに注意しなければならない。図２は、多く の好ましいモルフオシエン配列のＮ末端延長部分を表す、切断が起こる可能性の ある標準のＡｒ　ｇ−Ｘａ　ａ−Ｘａ　ａ−Ａｒ　ｇの切断箇所は、図のなかで 、枠で囲まれているか、アンダーラインが引いである。当業者であれば理解でき るように成Ｐ２１体は、異なるＮ末端切断部位を有するサブユニットの結合も含 まれる。

他の溶解型のモルフオシエンは、当該蛋白質の（下記参照）未切断のプロ型の２ 量体や、２量体の一つのサブユニットが当該蛋白質の未切断プロ型であったり、 他のサブユニットが成熟型の蛋白質、好ましくは切断プロドメインと非共有結合 的に結合するそれらの切断型の半２１体（ｈｅｍｉ−ｄ　ｉｍｅｒ）ものも含む 。

本発明の熔解型蛋白質は、さらに哺乳類、特にヒトに投与する治療Ｔ：！組成物 の製剤や、細胞サンプルや、これに限るものではないが血清、脳を髄液、腹水な どの体液中の当該蛋白質や、当該蛋白質に対する内因性の抗体の濃度の追跡のた めの生物学的アッセイの開発に有用である。さらに本発明の他の目的や、特徴や 有利性は以下の詳細な説明より、より明確になる。

区血■皿工屋五里 図１は配列をコードする核酸から発現される、モルフオシエンペプチド鎖の概要 の表現である。そこで、あやめ陰影線の範囲はシグナル配列を表す；点画部分は プロドメインを表し；あやめ線領域は成熟蛋白質のＮ末端じＮ末端延長部分”） を表し：なにもない部分は保存された７つのシスティンドメインと、紺縞線で示 された保存されたシスティンで特定される成熱蛋白質配列のＣ末端領域を表して いる； 図２は各種の成熟型のモルフオシエンのＮ末端延長部分の配列をリストしである 。

図３は哺乳動物細胞からＴＢＳ　（１−リス緩衝生理食塩水）中でのＩＭＡＣ， Ｓ−セファロースおよびＳ−２００ＨＲクロマトグラフイーで生産、精製した溶 解型モルフオシエン（ＯＰ−１）のゲル濾過カラムの溶出曲線である。ここで■ 。はボイド容量で、ＡＤＨはアルコール脱水素酵素（分子量１５０キロダルトン ）で、ＢＳＡは生血清アルブミン（分子量６７キロダルトン）で、ＣＡが炭酸脱 水酵素（分子１ｔ２９キロダルトン）、ＣｙｔＣはチトクロムＣ（分子量１２． ５キロダルトン）である。

川風呈晟哩 ここで本質的に当該蛋白質のアミノ酸配列から組成される溶解型の形態形成蛋白 質が本発明により判明した。溶解型はプロドメイン、またはそれらのフラグメン トからなる非共有結合的に結合している複合体で、形態形成活性を有する２量体 蛋白種と非共存結合的に結合し、または複合体を形成する。２００未満のアミノ 酸からなる２量体の各ポリペプチドは、それぞれＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１の残基 ３３０−４３１と３３５−４３１で特定される、少なくともＣ末端６、好ましく は７個のシスティン骨格からなる。好ましくは、２量体種のポリペプチド鎖は、 これらの配列の成熟型か、またはそれらの切断型からなる。好ましい切断型は、 インタクトのＣ末端ドメインを含み、少なくとも１０個のアミノ酸のＮ末延長部 分配列からなる。これらの溶解型の形態形成蛋白質は、培養細胞培地や哺乳類の 体液から分離してもよいし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでつくってもよい。

ｉｎ　ｖｉｖｏ　の生理的条件下で、プロドメインは蛋白質の運搬性を高めるの に利用してもよいし、蛋白分解酵素や、抗体を含むスカベンジャー分子から保護 するのに利用してもよい。

プロドメインは、さらに蛋白質を特定の組織へ標的化するのに役立ててもよいし 、共有受容体との相互作用でモルフオシエン細胞表面受容体に、モルフオシエン を発現させるのに利用してもよい０分離した蛋白質は治療用製剤、特に経口、非 経口投与用に使用してもよいし、内因性のモルフオシエンや、内因性の抗モルフ オシエン抗体のレベルを追跡する診断や、他の組織評価キットやアッセイの開発 に利用してもよい。

を員失、若しくはｔ負傷した組織の再生の為や、組織不全や、病気の組織破壊的 作用の阻害の為の治療における当該モルフオシエンの用途の詳細な説明は　国際 出願　ＵＳ９２１０１９６Ｂ（ＷＯ９２／１５３２３）ｉＵｓ９２１０７３５Ｂ 　（ＷＯ９２１０４６９２）とＵＳ９２１０７４３２　（ＷＯ９３１０５７５１ ）に開示されている。参照によりここに組み入れた０本発明の溶解型のモルフオ シエン複合体も含め、モルフオシエンは損失した、若しくは損傷した骨、歯、歯 周組織、肝臓、心臓、肺臓、神経＆ｌｌ織を再生することや、免疫応答と関連す る＆ＩＩ織破壊的な作用から、これらの組織を保護する為の治療の一部として、 特別な有用性を持っていると考えられている。当該蛋白質は骨粗に症や骨軟化症 や骨肉腫などの代謝性骨疾患の治療や；肝硬変、肝炎、アルコール性肝疾患や肝 炎性脳疾患などの肝疾患の治療や；虚血性再潅流関連の、特に、神経あるいは心 Ｎ＆ＩＩ織などの組織損傷の治療や予防に、組織保護効果を発現する事が予測さ れる。以下に本発明の有用な溶解型モルフオシエン複合体、及びそれらの作り方 や使用法についての詳細な説明を開示する。

！、な汐″Ｐモルフオシエン　人　−白　か゛の本発明の有用なモルフオシエン の中で０Ｐ−１，０Ｐ−２、ＣＢＭＰ２蛋白質のような骨形成蛋白や、ＤＰＰ　 （■々蝿から）。

Ｖｇｌ（爪蛙から）、Ｖｇｒ−１（７ウスから、Ｕ、Ｓ、５゜（０１１，６９１ Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら参照）、ＧＤＦ−１（マウスから、Ｌｅｅ（１９９１）Ｐ ＮＡＳ　８８：４２５０−４２５４参照）、６０Ａ蛋白（狸々蝿から、Ｓｅｑ、 ＩＤＮ０１２４、Ｗｈａｒｔｏｎら（１９９１）ＰＮＡＳ　８８：９２１４−９ ２１８参照）や最近、同定された０Ｐ−３のようなアミノ酸配列関連蛋白質とし て、もともと同定された蛋白質である。

このファミリーは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのサブクラスであるが、図１ に概要を開示しているが、特徴的な構造的特色や、保存された７個のシスティン 構造を含むかなりのアミノ酸配列のホモロジーを共有している６図に示すように 、蛋白質は前駆体ポリペプチド配列ｌＯとして翻訳される。Ｎ末端レグナルペプ チド配列１２、（″プレ・プロ″領域、図中、あやめ陰影で示される）を有し、 一般に、約３０残基以下で、続いて点画で示されており、分解して成熟配列１６ を生じる”プロ”領域１４を有する。成熟配列は保持されたＣ末端７個のシステ ィンドメイン２０、Ｎ末端配列１８・・ここではＮ末端延長部分という・・の両 者を含み、各種のモルフオシエンで配列が暑く変わっている。システィンは縦縞 線２２で図中に開示されている。ポリペプチド鎖は２量化しこれらの２量体は、 一般に、二つのポリペプチド鎖を結合する少なくとも一つの鎖間のジスルフィド 結合で安定化されている。

シグナルペプチドはＶｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　の方法（（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４：４６８３−４６９１．）を用いて、 特定の配列中の予測される開裂箇所で、翻訳時に、早く開裂される０図、■中の ”プロ”型の蛋白質サブユニット、２４．はプロドメインも成熟ドメインも含み 、−緒にペプチド結合している。一般に、このプロ型は蛋白質が細胞内にいる間 に開裂され、プロドメインは非共有結合的に成熟型のサブユニット結合されたま まで、培養哺乳動物細胞から分泌される、第一次の型と思われる溶解型種を生成 する。

−Ｃに、従来の精製技術は複合体を解離させる変性条件を利用した。

哺乳動物細胞から分泌される他の溶解型のモルフオシエンは、これらの蛋白質の プロ型の２量体を含み、ここではプロ領域は成熟ドメインから切断されず、”半 ２量体”、ここでは一つのサブユニットがプロ型のポリペプチド鎖サブユニット がらなり、他のサブユニットが切断された成熟型のポリペプチド鎖サブユニット （それらの切断型も含む）、好ましくは切断プロドメインと非共有結合的に結合 しているものである０分離したプロドメインは一般に、配列分析からも、溶液中 での、その特性測定からみても、著しく疎水性の特性を有している０分離したプ ロ領域単独でも、一般に、水溶液にはそれほど溶解しないし、洗剤、尿素、グア ニジン塩酸塩、等および／又は一つ以上のキャリア蛋白質のような変性剤の存在 が必要である。従って、与えられた理論に限ることなく、切断プロ領域の非共有 結合的な成熟モルフオシエン２Ｉ体種との結合は、プロ領域の疎水性部分と、２ １体種の相当する疎水性部分との相互作用が含まれており、その相互作用は、も しそうでなければ暴露された成熟２量体の疎水性領域を、水溶液に対する成熟２ 量体種の親和性を高めながら、水系の環境への暴露から効果的に保護あるいは隠 す。

モルフオシエンはＴＧＦ−βスーパーファミリーの構造的に関連する蛋白質の中 のサブファミリーの蛋白質からなる。ここで開示するモルフオシエンのように、 ＴＧＦ−βもまた、成熟ＴＧＦ−β蛋白と非共有結合的に結合するプロ領域を存 している。しかし、モルフオシエンとは異なり、ＴＧＦ−βのプロ領域は多くの システィンを含有しているし、特定の結合蛋白質とジスルフィド結合を形成して いる。ＴＧＦ−β１のプロドメインもまた、一つ以上のマンノース残基にリン酸 化されており、一方、モルフオシエンプロ領域では、一般にはそうでない。

有用なプロドメインは、以下に示すプロ領域の全長を含み、またこれらの各種の 切断型、特にＡｒ　ｇ−Ｘａ　ａ−Ｘａ　ａ　−Ａｒｇ、の蛋白分解酵素開裂開 裂部位での開裂型も含む。例えば、○Ｐ−１では、可能なプロ配列は　残基３Ｏ −２９２（全長型）；４Ｂ−２９２；　１５８−２９２　ｉ　で特定される配列 を含む。

溶解型０Ｐ−１複合体の安定性は、プロ領域が全長型からなるときの方が４８− ２９２切断型のような切断型のときより増強される。残基３０−４７は他のモル フオシエンのＮ末端部位との配列相同性を示し、全てのモルフオシエンの複合体 の安定化を増強するのに、特に有用性があると信じられる。従って、現在のとこ ろ好ましいプロ配列は、特定のモルフオシエンのプロ領域の全長型をコードする 配列である（以下参照）、有用性を有することが予測される他のプロ配列は、生 物学的に合成したプロ配列、特に一つ以上のプロ配列のＮ末端部分由来の配列を 組み入れた配列を含む。

下記の表Ｉは、そこで使用される命名法、サブユニット配列の各種の領域を特定 する配列、それらの参考Ｓｅｑ、ＩＤ、それらの核酸及びアミノ酸配列の参考文 献も含め、今までに同定された各種の好ましいモルフオシエンについて開示しで あるφこれらの文献の開示は参考に、ここに組み入れた。特定された成熟蛋白質 配列は、これらの配列の最長の予期し得る型である。

上記のように、より短い、切断型のこれらの配列もまた予期し得る。好ましくは 切断成熟配列は少なくともＮ末端延長部分の１０個のアミノ酸を含む０図、２は 以下に述べる数多くの好ましいモルフオシエン配列Ｎ末端延長部分を列挙してい る。成熟サブユニット型の切断配列を生じるＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ、 開裂部位が、図の中で枠でかこまれているか、アンダーラインが引いである。

表　■ ’ｏｐ−ｉ”　はそれらの対立形質や種の変種、例えばヒト０Ｐ−１じｈＯＰ− １”）、又はマウスＯＰ−１１ｍＯＰ−１”）なども含む０Ｐ−１蛋白質をコー ドするＤＮＡ配列の、一部若しくは全部から発現された形態形成活性を存する蛋 白質の群を総称的に指して云う。

蛋白質の全長をコードするｃＤＮＡ及びアミノ酸配列はＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、 ｌと２　（ｈＯＰｌ）とＳｅＱ、１ＤＮｏｓ、３と４（ｍＯＰｌ）に示されてい る。

成熟蛋白質は残基２９３−４３１　（ｈＯＰｌ）と２９２−４３０　（ｍＯＰ　 １　）に特定されている。ここで保存された７個のシスティン骨格が、それぞれ 、残基３３０−４３１と３２９−４３０に、Ｎ末端延長部分は、それぞれ、残基 ２９３−３２９と２９２−３２９に特定されている。当該蛋白質のプロ領域は開 裂されて成熟で、形態形成活性を存する蛋白質を生じるが、本質的に残基３０− ２９２　（ｈＯＰｌ）と残基３０−２９１　（ｍＯＰｌ）により特定される。

”０Ｐ−２”　はそれらの対立形質や種の変種、例えばヒ）ＯＰ−２（ｈＯＰ− ２°゛）、又はマウス０Ｐ−２（ｍ０Ｐ−２”）なども含む０Ｐ−２蛋白質をコ ードするＤＮＡ配列の一部、若しくは全部から発現された活性を有する蛋白質の 群を総称的に指して云う。蛋白質の全長はＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、５と６　（ｈ ＯＰ２）とＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、７と８（ｍＯＰ２）に示されている。成熟蛋 白質は本質的に残基２６４−４０２（ｈ。

Ｐ２）と２６１−３９９　（ｍＯＰ２）に特定されティる。ここで保存された７ 個のシスティン骨格が、それぞれ、残基３０１−４０２と２９８−３９９に、Ｎ 末端延長部分は、それぞれ、残基２６４−３００と２６１−２９７に特定されて いる。当該蛋白質のプロ領域は開裂されて成熟で、形態形成活性を有する蛋白質 を生じるが、本質的に残基１Ｂ−２６３（ｈＯＰ２）と残基１８−２６０　（ｍ ＯＰ２）により特定される。（他の開裂部位も両方の０Ｐ−２蛋白質の上流２１ 残基のところで起きる。） ”０Ｐ−３”　はそれらの対立形質や種の変種、例えばマウス０Ｐ−３（”ｍ０ Ｐ−３’　）なども含む０Ｐ−３蛋白質をコードするＤＮＡ配列の一部、又は全 部から発現された活性を有する蛋白質の群を総称的に指して云う。

蛋白質の全長はＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、９に示されている。成熟蛋白質は本質的 に残基２６１−３９９又は２６４−３９９に特定されている。ここで保存された ７個のシスティン骨格が、残基２９Ｂ−３９９に、Ｎ末端延長部分は、残基２６ ４−２９７又は２６１−２９７に特定されている。当該蛋白質のプロ領域は開裂 されて成熟で、形態形成活性を有する蛋白質を生じるが、本質的に残基２０−２ ６２により特定される。

”　ＢＭＰ２／ＢＭＰ４”　Ｌ；！ヒｌ−ＢＭＰ２とＢＭＰＩＤ遺伝子でコード される蛋白質配列を指して云う、蛋白質全長のアミノ酸配列はＢＭＰ２ＡやＢＭ Ｐ２Ｂ、又はＢＭＰ２やＢＭＰ４として文献に言及されておりＳｅｑ。

ＩＤ　Ｎｏｓ、１０と１１に及びＷｏｚｎｅ）’ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ 　２４２電１５２８−１５３４、に、それぞれ記載されている。ＢＭＰ２　（Ｂ ＭＰ２Ａ）のプロドメインは残基２５−２４８、または２５−２８２を含んでお り；成熟蛋白質は残、３２４９−３９６、または２８３−３９６を含んでいるが 、その残基２４９−２９６／２８３−２９６はＮ末端延長部分を特定し、２９５ −３９６はＣ末端ドメインを特定する。ＢＭＰ４　（ＢＭＰ２Ｂ）のプロ領域は 、残基２５−２５６、または２５−２９２を含む；成熟蛋白質は残基２５７−４ ０８、または２９３−４０８を含み、その２５７−３０７／２９３−３０７はＮ 末端延長部分を特定し３０８−４０８はＣ末端ドメインを特定する。

”ＤＰＰ”　は■々蝿のＤＰＰ遺伝子によりコードされる蛋白質の配列を指して 云う、蛋白質全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含んでＳｅｑ、ＩＤ　Ｎ ｏ、１２とＰａｄｇｅｔｔら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２５：８１−８４に 発表されている。プロドメインは、シグナルペプチド開裂部位から残基４５６ま で続いている。成熟蛋白質は、残基４５７−５８８で特定されるし、ここで残基 ４５７−５８６はＮ末端延長部分を特定し４８７−５８８はＣ末端ドメインを特 定する。

”Ｖｇｒ　は爪蛙のＶｇｌ遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う、 蛋白質の全長のアミノ酸配列は成功型やプロ領域も含みＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１ ３とＷｅｅｋｓ（１９８７）Ｃｅｌｌ　５土：８６１−８６７に記載されている 。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基２４６まで続いている；成 熟蛋白質は残基２４７−３６０で特定できるし、その残基２４７−２５８はＮ末 端の延長部分を特定し、２５９−３６０はＣ末端ドメインを特定する。

”Ｖｇｒ−１”　はマウスＶｇｒ−１遺伝子によりコードされる蛋白質配列をＩ 旨して云う６蛋白質の全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含みＳｅｑ、Ｉ Ｄ　Ｎｏ。

１４とＬｙｏｎｓら（１９８９）ＰＮＡＳ８６：４５５４−４５５８に記載され ている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基２９９まで続いてい る；成熟蛋白質は残基３００−４３８で特定できるし、その残基の３００−３３ ６はＮ末端の延長部分を特定し、３３７−４３８はＣ末端を特定する。

”ＧＤＦ−１”　はヒトＧＤＦ−１遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指し て云う、蛋白質の全長のｃＤＮＡおよびコードされたアミノ酸配列はＳｅｑ、１ ０　Ｎｏ。

１５とＬｅｅ　（１９９１）ＰＮＡＳ　８８：４２５０−４２５４に記載されて いる。プロドメインは、シグナルペプチド開裂部位から残基３１４まで続いてい る；成熟蛋白質は残基２１５−３７２で特定できるし、その残基２１５−２５６ はＮ末端の延長部分を特定し、２５７−３７２はＣ末端を特定する。

”６０Ａ”　は■々蝿６０Ａ遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云う 、蛋白質の全長のアミノ酸配列は、Ｓｅｑ、ＴＤ　Ｎｏ、１６とＷｈａｒｔＯｎ ら（１９９１）ＰＮＡＳ　８工：９２１４−９２１８に記載されている。プロド メインはシグナルペプチド開裂部位から残基３２４まで続いている。成熟蛋白質 は残基３２５−４５５で特定できるし、その残基３２５−３５３はＮ末端の延長 部分を特定し、残基３５４−４５５はＣ末端を特定する。

”ＢＭＰ３”　はヒトＢＭＰ　３遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して 云う、蛋白質の全長のアミノ酸配列は、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１７とＷｏｚｅｎ ｅｙら５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１５２Ｂ−１５３４に記載されている。プロド メインはシグナルペプチド開裂部位から残基２９０まで続いている。成Ｐ蛍白質 は残基２９１−４７２で特定できるし、その残基２９１−３７０ははＮ末端の延 長部分を特定し、残基３７１−４７２はＣ末端を特定する。

”ＢＭＰ５″　はヒ）ＢＭＰ５遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して云 う、蛋白質の全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含みＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ 、１８とＣｅ１ｅｓｔｅら（１９９０）ＰＮＡＳ８７　：９８４３−９８４７に 記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基３１６まで 続いている；成熟蛋白質は残！３１７−４５４で特定できるし、その残基３１７ −３５２はＮ末端を特定し、３５２−４５４はＣ末端を特定する。

”ＢＭＰ　６”　はヒトＢＭＰ６遺伝子によりコードされる蛋白質配列を指して 云う、蛋白質の全長のアミノ酸配列は成熟型やプロ領域も含みＳｅｑ、ＩＤ　Ｎ ｏ、１６とＣ１ｅｓｔｅら（１９９０）ＰＮＡＳ８７　：９８４３−９８４７に 記載されている。プロドメインはシグナルペプチド開裂部位から残基３７４まで 続いている；成熟蛋白質は残基３７５−５１３で特定できるし、その残基３７５ −４１１はＮ末端を特定し、４１２−５１３はＣ末端を特定する。

０Ｐ−２や０Ｐ−３蛋白質はこのファミリーの他の蛋白質と共通する保存された システィン骨格の他にＣ末端領域にもう一つのソスティン残基を有していること を注意する必要がある（例えばこれらの配列の残６３３８を参照）、ＧＤＦ−１ 蛋白質は保存された骨格に４個のアミノ酸が挿入されているじＧＩｙ−Ｃ；Ｉｙ −Ｐｒｏ−Ｐｒｏ”）が、この挿入は、おそら（折りたたまれた構造中のシステ ィンとの関係に影響を与えないであろう。さらにＣＢＭＰ２蛋白質はシスティン 骨格の一アミノ酸残基を欠いている。

２１体モルフオシエン種は還元されると不活性であるが、酸化型ホモ２１体とし て、及び本発明の他のモルフオシエンとの併用で酸化されると活性である。この ように、ここで特定されるように、溶解型モルフオシエン複合体に有用なモルフ オシエンは一対のポリペプチド鎖からなる２量体蛋白質であり、その各ポリペプ チド鎖は２００個以下のアミノ酸でこれらのシスティンと機能的に同等な配列（ 配列中のシスティンの１次配列を変えるアミノ酸の挿入や削除、しかし折りたた まれた構造の関係は変えない）も含む、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１の残基３３５− ４３１で特定される、少なくともＣ末端の６、好ましくは７個のシスティン骨格 からなる。そのようにして、ポリペプチド鎖が折りたたまれたとき一対のポリペ プチド鎖からなる２量体蛋白質種は、本発明で特定しているようにモルフオシエ ンとして作用する事力咄来るように、適当な鎖内、鎖間のジスルフィド結合も含 め、適当な３次元構造をとる。モルフオシエンの成熟２Ｎ体が、本発明に従って 少なくとも一つの、好ましくは二つのプロドメインが複合体を形成すると、これ らの構造体の溶解度は改善される。

本発明の溶解型モルフオシエンに有用な好ましいＣ末端配列を特定している各種 の一般的な配列（一般的配列　１−６）はＵＳＳＮ　０７／９２３，７８０、に 開示されており、参考に上記に組み入れた。現在のところ好ましい一般的な配列 を以下に示す。

下記に示されている一般的配列７　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２０）と一般的配列 ８　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２１）は０Ｐ−１，０Ｐ−２，０Ｐ−３、ＣＢＭＰ ２Ａ、ＣＢＭＰ２Ｂ、ＢＭＰ３゜６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ５．ＢＭＰ６ ．Ｖｒｇ−１、やＧＤＦ−１を含む現在までに同定されている好ましいモルフオ シエン蛋白ファミリーの中で共育している相同性を備えている。これらの蛋白質 のアミノ酸配列はここに（配列リスト参照）、また当業者に例えば国際出願　公 開　ＵＳ　９２１０７３５８、（ＷＯ９３１０４６９２）にも開示されている。

一般的配列は６と７個のシスティン骨格によって特定されるＣ末端Ｘメインの配 列が共通するアミノ酸の同一性も、配列中の変異部位の互換性のある残基も含む 、一般的配列４１位（一般的配列７）あるいは４６位（一般的配列８）のもう一 つのシスティンを許容し、分子間、分子内ジスルフィド結合が形成出来る適当な システィン骨格を提供し、蛋白質の３次元構造に影響する危険なアミノ酸を含有 する。

ｆｆ１Ｇ１−二 Ｉ、ｅｕ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＰｈｅＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　 Ｔｒｐ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｘ ａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＡｌａＸａａ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｘａ ａ　Ｃｙｓ　ＸａａＸａａ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ Ｘａａ　ｘａａ　ｘａａ　Ａｓｎ　ＥＭ　ｕａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ 　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　 Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＣｙｓＣｙｓ　Ｘａａ　ｐｒｏ　ｘａａ　Ｘ ａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ｘａ ａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｌａｕ　Ｘａａ Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｈａｔ　Ｘａａ　Ｖａｌ　Ｘａａｘａａ　Ｃ ｙＳ　ｘａａ　Ｃ７０ｘａａここで各Ｘａａは以下のように特定された１以上の アミノ酸からなる群から独立的に選択される：”Ｒｅｓ″は”残基”を意味する 。残基２．のＸａａ＝（Ｔｙｒ　または　Ｌｙｓ）；残基３、のＸａａ＝Ｖａｌ 　または　１ｉｅ）；残基４．のＸａａ＝Ｓｅｒ、Ａｓｐ　または　Ｇｌｕ）； 残基６．のＸａａ−（Ａｒｇ、Ｇｉｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ　または　Ａｌａ）；残 基７゜のＸａａ−（Ａｓｐ　または　Ｇｌｕ）：残基８．のＸａａ−（Ｌｅｕ、 Ｖａｌ　または　ｌ１ｅ）；残基１１．のＸａａ−（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、 Ｈ４ｓ、Ａｓｎ　またはＳ　ｅ　ｒ）；残基１２．のＸａａ−（Ａｓｐ、Ａｒｇ 、Ａｓｎまたは　Ｇｌｕ）；残基１３．のＸａａ−（Ｔｒｐ　または５ｅｒ）； 残基１４、のＸａａ＝（ｌｉｅ　または　Ｖａｔ）、残基１５．のＸａａ＝（ｌ ｉｅ　または　Ｖａｌ）；残基の１６．Ｘａａｓ＋＋＋（、Ａ。

ｌａ　または　５ｅｒ）；残基１８．のＸａａ　−（Ｇｌｕ、　ＣｌＩｎ、Ｌｅ ｕ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ　またはＡｒｇ）；残基１９．のＸａａ＝（０１ｙ　または 　５ｅｒ）；残基２０．のＸａａ−（Ｔｙｒ　または　Ｐｈｅ）；残基２１．の Ｘａａ＝　（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｈｉｓ、Ｃ１ｎ、Ｌｅｕ　また は　Ｇｌｙ）；残基２３．のＸａ　ａ　−（Ｔｙ　ｒ、　Ａｓ　ｎ　または　Ｐ ｈｅ）；残基２６．のＸａａ＝　（Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、 Ａｌａ　または５ｅｒ）；残基２８．のＸａａ＝　（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、 Ｇｌｎ　または　Ａｌａ）；残基３０．のＸａａ＝　（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ 、Ｇｌｎ、ＩＩｅ　または　Ａｓｎ）；残基３１．のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅＵ 　または　Ｔｙｒ）；残基３３．のＸａａ＝　（Ｌｅｕ、Ｖａｌまたは　Ｍｅｔ ）；残基３４．のＸａａ＝　（Ａｓｎ、Ａｓｐ。

Ａｌａ、Ｔｈｒ　または　Ｐｒｏ）；残基３５．のχａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、 Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ａｌａ　または　Ｌｙｓ）；残基３６．のＸａａ＝　（Ｔｙｒ 、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ　または　ｌ１ｅ）；残基３７．のχａａ＝　（Ｍｅ ｔ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ　または　Ｌｅｕ）；残基３８．のＸａａ＝　（Ａｓｎ、Ｓ ｅｔ　または　Ｌｙｓ）；残基３９．のＸａａ＝　（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ　 または　Ｐｒｏ）；残基４０．のＸａａｘ（Ｔｈｒ、Ｌｅｕ　または　５ｅｒ） ；残基４４．のＸａａ−（１１ｅ、Ｖａｌ　または　Ｔｈｒ）；残基４５．のＸ ａａ＝（Ｖａ　ｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ　または　１ｉｅ）；残基４６．のＸａａ＝ （Ｇｌｎ　または　Ａｒｇ）；残基４７のＸａａ−（Ｔｈｒ、Ａｌａ　またはＳ 　ｅ　ｔ）：残基４８、のＸａａ＝　（Ｌｅｕまたは　ｌ１ｅ）；残基４９．の Ｘａａ−（Ｖａ　ｌ　または　Ｍｅｔ）；残基５０のＸａａ＝　（Ｈｉｓ、Ａｓ ｎ　または　Ａｒｇ）；残基５１．のＸａａ＝　（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｓ ｅｔ、Ａｌａ　または　Ｖ　ａ　ｌ）；残基５２．のＸａａ＝（Ｉｌｅ。

Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ｃｒｙ　または　Ｌｅｕ）；残基５３．のＸ ａａ＝　（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ　またはＰｈｅ）；残基５ ４．のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｔ　またはＶａｌ）ｉ残基５５．のＸａａ＝　（ Ｇｌｕ、Ａｓｐ。

Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ　または　Ｌｙｓ）；残基５６゜のＸａａ−（ Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｖａ　１．Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ 　または　）（ｉｓ）；残基５７゜のＸａａ＝　（Ｖａ　１．Ａｌａ　または　 ｌ１ｅ）；残基５８゜のＸａａ−（Ｐｒｏ　または　Ａｓｐ）；残基５９．のＸ ａａ＝（Ｌｙｓ、ｌｅｕ　またはＧｌｕ）；残基６０．のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ　または　Ａｌａ）；残基６３．のＸａａ＝（Ａｌａ　または　Ｖａｌ）； 残基６５．のＸ　ａ　ａ　＝　（Ｔ　ｈｒ＋Ａｌａ　または　Ｇｌｕ）；残基６ ６、のＸａａ＝（Ｇｉｎ。

Ｌｙｓ、Ａｒｇ　または　Ｇｌｕ）；残基６７、のＸａａｘ（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ　 または　Ｖａｌ）；残基６８．のＸａａｘ（Ａｓｎ、Ｓｅｔ、Ａｓｐ　または　 Ｇｌｙ）；残基６９．のＸａａ＝　（Ａｌａ、Ｐｒｏ　または　５ｅｒ）；残基 ７０．のＸａａ＝　（Ｉ　ｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａ　ｌ　または　Ｌｅｕ）；残基７ １゜のＸａ　ａ＝　（Ｓｅｒ、Ａｌ　ａ　または　Ｐｒｏ）；残基７２．のＸａ ａ　−（Ｖａ　１．Ｌｅｕ、Ｍｅｔ　または　ｌ１ｅ）；残基７４、のＸａａ＝ （Ｔｙｒ　または　Ｐｈｅ）；残基７５．のＸａａ＝　（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅ ｕ　または　Ｈｉｓ）；残基７６、のＸａ　ａ＝　（Ａｓ　ｐ、Ａｓ　ｎ　また は　Ｌｅｕ）；残基７７、のＸａａ＝　（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｒｇ　ま たは５ｅｒ）；残基７８．のＸａａ−（Ｓｅｒ、Ｇｉｎ、Ａｓｎ。

Ｔｙｒ　または　Ａｓｐ）；残基７９．のＸａａ＝（Ｓｅｔ。

Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ　または　Ｌｙｓ）；残基８０．のＸａａ＝　（Ａｓｎ 、Ｔｈｒ　または　Ｌｙｓ）；残基８２．のＸａａ−（ｒｌｅ、Ｖａｔ　または 　Ａｓｎ）；残基８４．のＸａａ＝（ＬｙＳ　または　Ａｒｇ）；残基８５．の χａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ　または　Ｖａｌ）；残基 ８６．のＸａａ＝　（Ｔｙｒ、Ｇｌｕ　または　Ｈｉｓ）；残基８７、のＸａａ ＝　（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ　または　Ｐｒｏ）；残基８８．のＸａａ＝　（ Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ　または　Ａｓｐ）；残基９０．のＸａａ＝　（Ｖａ　 Ｉ、Ｔｈｒ、Ａｌａ　または　１ｉｅ）；残基９２．のＸａａ−（Ａｒｇ、Ｌｙ ｓ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ　または　Ｇｌｕ）；残基９３゜のＸａａ＝（Ａｌ ａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ　または　５ｅｒ）；残基９５．のＸａａ＝（Ｇｌｙ　また は　Ａｌａ）；残基９７゜のＸａａ＝（Ｈｉｓ　または　Ａｒｇ）上に述べたよ うに一般的配列８　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２１）は一般的配列７の全部を含み 、さらにＮ末端が以下の配列を含む：Ｃｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ 従って、残Ｓ７で始まる一般的配列８の各Ｘａａは、−Ｃ的配列７で開示されて いる各残基の番号が、一般的配列８では５ずつずれているようになっている一般 的配列７で特定される特定のアミノ酸である。このように一般的配列７の“残基 ２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙ　ｓ）”は一般的配列８の残基７になっている 。一般的配列８では残基２のＸａａ＝　（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ　または　Ｇ ｉｎ）；残基３．のＸａａ＝（Ｌ）’Ｓ。

Ａｒｇ　または　Ｍｅｔ）；残基４．のＸａａ＝　（Ｈｉｓ、Ａｒｇ　または　 Ｇｉｎ）；残基５．のＸａａ＝　（Ｃ１ｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、 Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　または　Ｔｙｒ）。

従って、好ましいＣ末端配列を特定する他の有用な配列は、上記一般的配列　７ と８に組み入れられており、どの配列とも少なくとも７０％のアミノ酸配列相同 性、又は類似性、そして好ましくは、８０％の相同性、又は類似性を共有するも のである。これらには、対立形質遺伝子変異、種間変異、キメラ型変異及び他の 変異（例えば”ミューティン”、又は”変異蛋白ｎ）の他に天然に存在するか、 生物学的に合成されるかを問わずこの形態形成蛍白質ファミリーの新規なものを も含む事が予測される。ここで用いられているように、”アミノ酸配列相同性” はアミノ酸配列類似性という意味で理解され、相同性の配列は、同一、又は類似 のアミノ酸を共有している。ここで類似のア１．５．５ｕｐｐ１．３、ｐｐ、３ ４５−３６２　（Ｍ、Ｏ，Ｄａｙｏｒｒ、４５、ＮａＬ’ｌ　ＢｉｏＭｅｄ、　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｄｎ、、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，１９７８）に特 定されている保存されたアミノ酸である。このように、対照配列に７０％のアミ ノ酸相同性を共有する候補配列は、対照配列と候補配列を一緒に並べてみて、候 補配列の７０％のアミノ酸が、対照配列に相当するアミノ酸と同一、又は、それ らに保存されたアミノ酸変化を構成することが必要である。′アミノ酸配列の同 一性”は２つの並べられた配列間で、同一のアミノ酸であることが必要であると 理解される。このように対照配列と６０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列 は、候補配列を対照配列と一緒に並べてみて、候補配列の６０％のアミノ酸が、 対照配列の相当するアミノ酸と同一であることが要求される。

ここで用いられるように、全ての相同性と同一性は０Ｐ−１を対照配列として計 算される。また、ここで用いられるように、配列はＮｅｅｄｌｅｍａｎｎら（１ ９７０）Ｊ、Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　４８：４４３−４５３　の方法を用いて相同性 及び同一性計算用に整列させ、同一性はＡ１４ｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ 、Ｉｎｃ、）により計算される。全ての場合について、並べられているままで、 候補配列の内部欠落やアミノ酸の挿入は相同性／同一性の計算時には無視される 。またここで用いられるように、”配列変種”とはアミノ酸変化や配列の変化が 、蛋白質の形態形成的活性（例えば組織再生活性）を著しく変えないし、変種分 子は天然に存在する型の分子と実質的に同じように、実質的に同じ機能を発揮す るモルフオシエン蛋白質のアミノ酸配列の変種型を云うものと理解される。

配列変種は、単一の、又は複数のアミノ酸変化を含み、以下に述べるようなキメ ラ型配列も含まれる。変種は天然に存在するものでもよいし、標準的な組み換え ＤＮＡテクノロジーあるいは化学的蛋白質合成法を用いた生物学的合成法により 誘導してもよい。

現在のところ本発明の溶解型モルフオシエン複合体に有用なもっとも好ましい蛋 白質の配列はｈｏＰｌ　（例えばＳｅｑ、ＩＤＮｏ、５の残基３３５−４３１） の保存された６個のシスティン骨格を特定するアミノ酸配列と６０％以上、好ま しくは６５％以上の同一性を存する配列である。これらのもっとも好ましい配列 は■々蝿６０Ａ蛋白質も含み、０Ｐ−１０Ｐ−２の対立形質や種の変種を含む、 従って、本発明の他の好ましい点は、有用なモルフオシエンはいろいろな同定さ れた０Ｐ−１や０Ｐ−２（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２２）の種間で相同性を持って いる　”ＯＰＸ”とここでは云われている一般的アミノ酸配列を有する各種のポ リペプチド鎖からなる活性蛋白質も含む。

本発明のさらに好ましい点は、有用なモルフオシエンがＯＰｌ、若しくはＯ２０ の保存されたＣ末端のシスティンドメインをコードするＤＮＡ、若しくはＲＮＡ 配列と、例えば、それぞれ、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１と５　のヌクレオチド１ ０３６−１３４とヌクレオチド１３９０−１６９５で特定されるが、厳密なハイ ブリダイゼイシヲンの条件下でハイブリダイズする核酸をコードするアミノ酸配 列からなる活性蛋白質を含む、ここで用いられるように、厳密なハイブリダイゼ イションの条件とは３７°Ｃで一晩、４０％ホルムアルデヒド中で、５ｘＳＳＰ Ｅ、５ｘＤｅｎｈａｒｄＬン容液、０．１％ＳＤＳでハイフ゛リダイゼイション を行い５０°Ｃで０．１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。同様に本発明 の他の好ましい点は、有用なプロ領域ペプチドは、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１− １９に列挙されているいずれの配列の、少なくともＮ末端の１８個のアミノ酸を コードするＤＮＡ、若しくはＲＮＡ配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核 酸をコードするアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を含む、もっとも好ましく は、ペプチドがＯＰＩ、又はＯ２０のプロ領域配列の少なくともＮ末端の１８個 のアミノ酸、例えば、それぞれＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１と５のヌクレオチド１ ３６−１９２やヌクレオチド１５２−２１１であるが、をコードしているＤＮＡ 、又はＲＮＡ配列とハイブリダイズする核酸によってコードされる。

有用なＮ末端の延長部分配列が、上記のＣ末端ドメインと一緒に使用するため図 ２に列挙されている。さらに上記の如く、Ｎ末端延長部分の全長、又は、それら の切断型は好ましい２量体種で用いてもよい。

成熟２量体種はインタクトなりＮＡ、又はそれらの切断型から生産してもよい、 さらに本発明の実施例として、キメラ型の−Ｆ−ルフォジェン配列を用いること が出来る。このように、キメラ型モルフオシエンをコードするＤＮＡは一つのモ ルフオシエンからのＮ末端延長部分と、−以上の他のモルフオシエン由来のＣ末 端ドメインの全部、あるいは一部を用いて、構築する事が出来る。これらのキメ ラ型蛋白質は、当業者によく知られている標準的な組み換えＤＮＡ法、又は化学 的自動核酸合成法を用いた合成をしてもよい。他のキメラ型モルフオシエンは、 プロドメインが一つ以上のモルフオシエンのプロ配列に相当するＤＮＡ配列から コードされており、成熟ドメインの一部又は全部が、一つ以上の異なるモルフオ シエン由来のＤＮＡによりコードされている溶解型モルフオシエン複合体を含む 。

これらの溶解型キメラは以下に述べるように、単一の合成りＮＡから生産しても よいし、また別の選択で、以下に述べるように、分離した成分からｉｎ　ｖｉＬ ｒｏでつくることが出来る。

最後に、モルフオシエンのプロドメイン及び／又は成熟型Ｎ末端延長部分それ自 身を組織標的化配列として使用してもよい。

上記の如く、モルフオシエンファミリーはそれらのＣ末端活性ドメインに著しい 配列相同性を共有している。反対にその配列は成熟蛋白質のプロドメインや、Ｎ 末端の３９個のアミノ酸を特定している配列とは著しく異なっている。従って、 プロドメイン及び／又はＮ末端延長部分の配列はモルフオシエンに特異的である 可能性がある。従って、これらのモルフオシエン特異的配列の一部、又は全部が 、本発明で開示されているモルフオシエンの組織標的化配列として用いることが 出来る０例えば、Ｎ末端延長部分及び／又はプロドメインは、プロドメインと結 合したモルフオシエンをその組織に配向させるのに、標的組織で一以上の分子と 特異的に相互作用する事が出来る。このように、例えば○Ｐ−１やＢＭＰ２やＢ ＭＰ４のモルフオシエン特異的な配列は、モルフオシエン複合体が骨に標的化さ れた時、特に有用な配列になることが出来る。なお、これらの蛋白質の全ては、 本来、骨組織と関連して発見さ、れたもの（例えば、ＵＳ　Ｐａｔ、Ｎｏ、５． ０１１．６９９を参照）である、同様に、ＢＭＰ６　（またはＶ　ｇ　ｒ−１） 特異配列は肺組織への標的化が望まれている時に使用してもよい、別の選択では 、ＧＤＦ−１のモルフオシエン特異配列は溶解型モルフオシエン複合体を神経組 織、特に脳組織へ標的化するのに使用してもよい、ここではＧＤＦ−１が主とし て発現されているようである（例えば、ここで引用文献として挙げているＬｅｅ 、ＰＮＡＳ、８８：４２５０−４２５４　（１９９１）を参照、参照によりここ に組み入れられる。）。

１１、□μモルフオシエン　八　〇′　−“に　る溶解型モルフオシエン複合体 は、標準的な組み換え体発現技術を用いて、真核宿主細胞、好ましくは哺乳動物 細胞から生産できる。現在のところ好ましい模範的なプロトコルは以下に示され るが、特別のベクター構成とチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株を用 いる。当業者の技術では、他のベクターや他の細胞系なども含め、他の発現系も 有用であるが、本発明は以下に詳述する方法によってのみ生産できる溶解型形態 形成蛋白質複合体に限るものではない、ＣＯ３−？）ＢＳＣ細胞用に開発した組 み換え体発現系を用いても、ここで開示しである結果と類似の結果が観察された 。

前駆体配列をコードしたモルフオシエンＤＮＡを適当な、市販品（７）ｐ　ＵＣ Ｃ型ツクー（例えばｐＵＣ−１９，ＡＴＣＣ＃３７２４５、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、ＭＤ）の挿入箇所に適当なプロモーター／エンハンサ−配列で３“末端配列に 従ってサックローン化される。有用なりＮＡ配列はこれらの蛋白質をコードする 、発表された配列及び／又は合成構築物も含む、現在のところ好ましいプロモー ター／エンハンサ−配列はＣＭＶプロモーター（ヒト　サイトメガロウィルスの 主たる中間体−アーリープロモーター）とラウス肉腫ウィルスＬＴＲエンハンサ −配列（例えばＣ１ｏｎＬｅｃｈ、Ｉｎｃ、、Ｐａ１ｏ　ＡＩＬＯより得られる ）により増強されたマウス乳ガンウィルスプロモーター（ｍＭＴＶ）である０発 現はさらにトランスアクチベーティングエンハンサー配列を用いて増強する事が 出来る。プラスミドはＳＶ４０アーリープロモーター制御下に増幅可能なマーカ ーとしてＤＨＦＲを含んでいる（ＡＴＣＣ＃３７１４８）。

トランスフェクション、細胞培養、遺伝子増幅や蛋白発現条件は当業者によく知 られている、例えば、Ａｕ５ｕｂｅｌら（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　 ５ｏｎｓ。

ＮＹ（１９８９）などの開示されている標準的な条件である。

簡単にはトランスフェクトされた細胞は０゜１−５％の透析された牛胎児血清を 含む培地で培養され、サブクローニングし標準的なウェスタンプロット、あるい はノーザンプロットで評価して、安定的にトランスフェクトされた高発現型の細 胞株が得られる０組み込まれた配列状態やコピー数増幅の程度を調べるのにサザ ーンフ′ロントもまた用し）られる。

現在のところ、好ましい発現ベクターはＳＶ４０アーリープロモーター制御下で 選択マーカーと誘導遺伝子増幅剤としてＤＨＦＲ遺伝子を含む、ＤＨＦＲのＤＮ Ａ配列は従来技術でよく特徴づけられており、市販品が入手できる０例えば、適 当なベクターがｐＭＡＭ−ｎｅｏ　（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、　、Ｐａ１ｏ 　Ａｌｔｏ、ＣＡ）から、ｎｅｏ遺伝子（ＢａｍＨＩ切断）を、ＳＶ４０アーリ ープロモーター制御下でＤＨＦＲ遺伝子を含んでいるＰＳＶ５−ＤＨＦＲ由来の Ｓｐｈｌ−ＢａｍＨｌ、若しくはＰｖｕＩ［−ＢａｍＨＩフラグメントで置き換 える・ことにより生成する事が出来る。ＢａｍＨ１部位は５ｐｈＩ、若しくはｐ ｖｕ　１部位で、ベクターの骨格にフラグメントを挿入させるよう、標準的な技 術（例えば、リンカーインサーシゴンや部位特異的変異など）で作り出すことが 出来る０モルフオシエンＤＮＡはＭＭＴＶ−ＬＴＲ配列（マウス乳ガンウィルス ＬＴＲ）の下流のポリリンカ一部位に挿入出来る。ＣＭＶプロモーター配列はそ れから発現ベクター（例えば、ｐＣＤＭ８由来のもの、Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎｎ 、Ｉｎｃ、））に挿入してもよい、ＤＨＦＲ発現を制御するＳＶ４０アーリープ ロモーターは産生されるＤＨＦＲのｍＲＮＡのレヘルを下げるためにこれらのベ クターの中で修飾されるのが好ましい。

現在のところ、好ましい哺乳動物細胞株はＣＨＯチャイニーズハムスター卵巣細 胞株であり、高発現レベルの安定なモルフオシエン産生細胞株の樹立の好ましい 手順は、安定なＣＨＯ細胞株、好ましくはＣＨＯ−ＤＸＢＩＩ、を上記の発現ベ クターでトランスフェクトし、モルフオシエン発現レベルの高いクローンを分離 し、高発現クローンのボピュレーシゴンを得るために以下に開示しである制限希 釈法を用いてこれらのクローンをサブクローニングにかける。サブクローニング は、好ましくは、モルフオシエン産生用の増殖培地にはＭＴＸの添加は必要でな い安定な高発現クローンの同定するのにＭＴＸの存在しない状態で行うのがよい 。

サブクローニングプロトコルで細胞は１０個の１００ｍｍベトリ皿に、培養培地 にはＭＴＸを添加して、好ましくは添加しないで、細胞密度が１プレート当たり ５０あるいは１００個のいずれかの細胞になるよう播種する。増殖１４日後にク ローンはクローニングシリンダーや標準的な操作を利用して分離され、２４穴プ レートで培養される。クローンはそれから標準的な操作を利用してウェスタン免 疫プロントでモルフオシエンの発現についてスクリーニングされ、モルフオシエ ンの発現レヘルについて親株と比較される。その後、高発現クローンの細胞株の 安定性はモルフオシエン発現レベルを多数回の細胞継代培養しながら追跡する事 により測定した。（例えば、４代か５代）ｎｌ、ｌや　′からｒ″　モルフオシ エン　人　のモルフオシエンは補乳動吻細胞から溶解型複合体として発現する。

一般に、しかしながら、複合体は精製過程で、一般的には精製溶液によく添加さ れる変性剤、例えば洗剤、アルコール、存機溶媒、土構造破壊剤や溶液のｐＨを 下げるのに添加される化合物などに曝された時に解離する。以下に、調整培地、 （別の選択では、血清、脳を髄液、腹水などの体ａ）からの溶解型蛋白質の現在 もっとも好ましい精製プロトコルは変性剤のない条件で行う、当該方法は早く、 再現性もよく実質的に純粋な形で溶解型モルフオシエン複合体が単離される。

溶解型モルフオシエン複合体は調整培地から、変性剤なしで行われる、単純な３ 工程のクロマトグラフィープロトコルを利用して単離することが出来る。プロト コルは培地（あるいは体液）をアフィニティーカラムに通し、次いでイオン交換 クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ一工程を含む、以下に述べるア フィニティーカラムはＺｎ−ＩＭＡＣである０本発明のプロトコルは各種のモル フオシエンの精製に一般的な適用が可能であり、それらの全ては以下に述べるプ ロトコルのほんの僅かの変更により単離可能であることが予測される。別のプロ トコルとしては、標準的な操作を利用して作られた、例えば、特定のモルフオシ エンプロドメイン（例えば、蛋白Ａ結合のセファロースカラムに結合した）に特 異な抗体を用いて免疫アフィニティーカラムを利用する事が予測される。免疫ア フィニティーカラムの開発のプロトコルは従来技術に開示されている。

（例えば、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔ　ｉｏｎ、 Ｍ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅ ｇｏ、１９９０、特に第４節及び第ＸＩ節） 本実験では０Ｐ−１は上記の如＜　ＣＨＯ細胞で発現された。

０．５％ＦＢＳを含むＣＨＯ細胞調整培地は、最初に、固定化金属イオン・アフ ィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製された。調整培地由来の溶解 型０Ｐ−１複合体は選択的にＺｎ−ＩＭＡＣ樹脂に結合し、その結合した複合体 を効果的に溶出させるには、高濃度のイミダゾール（５０ｍＭイミダゾール、ｐ Ｈ８）が必要である。Ｚｎ−ＩＭＡＣ段階では、最初の流しの時及び３５ｍＭイ ミダゾール洗浄分画に溶出する多くのコンタミしている血清蛋白質から、溶解型 ０Ｐ−１を分離する。

Ｚｎ−ＩＭＡＣ精製溶解型０Ｐ−１は次に２０ｍＭ　ＮａＰＯ。

（ｐＨ７，０）と５０ｍＭ　ＮａＣｌで平衡化されたＳ−セファロース・カチオ ン交換カラムに通用される。このＳ−セファロース段階ではさらに精製して次の ゲル濾過工程への調製に溶解型０Ｐ−１複合体を濃縮するのに役立っている。蛋 白質はＴＢＳで平衡化されたセファクリルＳ−２０ＯＨＲカラムに載せられる。

実質的に同しプロトコルを利用して、溶解型モルフオシエンを血清、脳をｖＡｅ 、腹水を含む一つ以上の体液から単離してもよい。

ｒ　Ｍ　Ａ　Ｃはカラム容量の３倍量の０．２Ｍ　ＺｎＳＯ４で飽和されたキレ −ティング・セファロース（ファルマシア）をもちいて行われた。調整培地はｐ Ｈ７に滴定され、５００ｍＭ　Ｎａｃｌ、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０ ）で平衡化したＺｎ−ＩＭＡＣ樹脂に直接、載せられた。Ｚｎ−ＩＭＡＣ樹脂に は…脂１ｍＬ当たり８０ｍＬの最初の調整培地が載せられた。負荷のあとカラム は平衡緩衝液で洗浄され、殆どのコンタミ蛋白質は平衡緩衝液中３５ｍＭイミダ ゾールで溶出した。溶解型０Ｐ−１複合体は、ソノ後、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、 ５００ｍＭＮａＣ１？８液中、５０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８，０）で溶出した 。

溶解型０Ｐ−１複合体を含む５０ｍＭイミダゾール溶出画分は９倍量の２０ｍＭ 　ＮａＰＯ，で希釈し、２０ｍＭ　ＮａＰＯ，（ｐＨ７，０）、５０ｍＭ　Ｎａ Ｃ１で平衡化しているＳ−セファロースカラムに載せられた。Ｓ−セファロース 樹脂に樹脂１ｍＬ当たり、８００ｍＬの最初の調整培地を負荷した。負荷後Ｓ− セファロースカラムは平衡緩衝液で洗浄され、１００ｍＭ　ＮａＣｌで、引き続 き３００ｍＭと５００ｍＭ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　ＮａＰＯ，（ｐＨ７，０）で 溶出された。３００ｍＭ　ＮａＣｌ　ｉ９出分はさらにゲル濾過クロマトグラフ ィーで精製された。５０ｍ１の３００ｍＭ　ＮａＣ＋溶出分を、トリス緩衝生理 食塩水（ＴＢＳ）、５０ｍＭ　）リス、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　（ｐＨ７，４） で平衡化されたセファクリル　Ｓ−２００ＨＲ（ファルマシア）に載せた。カラ ムは１０ｍＬの分画で流速５ｍＬ／分で溶出した。溶解型０Ｐ−１の見かけの分 子量は蛋白質分子を標！１！（アルコール脱水素酵素、（ＡＤＨ５１５０キロダ ルトン）、生血清アルブミン（ＢＳＡ、６８キロダルトン）炭酸脱水酵素（ＣＡ 、３０キロダルトン）及びチトクロムＣ（ｃｙｔ　Ｃ，１２，５キロダルトン） ）と比較して決定した。（図３参照）Ｓ−２００力ラム分画の純度は、標準的な コマノシーブルーで染色した１５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上での分離に より測定した。成熟。Ｐ−１とプロドメインの同一性は、Ｉ準的な逆相　Ｃ１８ ＨＰＬＣを用いて成ｐｏｐ−１をプロドメインがら分離した後に、Ｎ末端配列分 析で測定した。

図３は２８０ｏｍにおける吸光度曲線を示している。溶解型０Ｐ−１複合体は見 かけ１１０キロダルトンの分子量で溶出している。二つのプロドメイン（各々、 ３９キロダルトン）と結合している一つの成ｐｏｐ−１２量体（３５−３６キロ ダルトン）と溶解型０Ｐ−１複合体の予測される組成とよく一致している。最終 的な複合体の純度は、適切な分画について還元型１５％ポリアクリルアミドゲル 分析により証明する事が出来る。

複合体成分は、Ｓ−２００、又は５−２ｏｏＨＲカラムからの複合体を含む分画 について逆相　Ｃ１８ＨＰＬＣカラムにかけ、標準的な操作を用いてアセトニト リル・グアニジン塩（０，１％ＴＦＡ）で溶出することにより証明できる。この 段階で複合体は解離し、プロドメインと成熟種は分かれて溶出する。

これらの分離した種はその後標準的な操作を利用して（例えば、旦且ユｄｅ　ｔ ｏ　Ｆジ」」」Ｌ山Ｉ　Ｐｕｒｉｆｉｃａ旦上ユニ、Ｍ、ＤｅｕＢｓｃｈｅｒ、 ｉｌｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、１９９ｏ、特に ｐｐ６０２−６１３参照）Ｎ末端配列分析にかけられ、単離された３６ｋＤａ、 ３９ｋＤａの蛋白の同一性について、それぞれ成熟モルフオシエン、単離された 切断型プロドメインとして確認された。０Ｐ−１産生ずる哺乳動物細胞がら単離 されたプロドメインＮ末端配列分析で２つの形のプロ領域、即ち、インタクト型 （Ｓｅｑ。

ＩＤ　Ｎｏ、１＋７）残！ｉ３０から始まる）と切Ｉｔ型（Ｓｅｑ、ＩＤＮｏ、 ｌの残基４８がら始まる）があることがゎがった、単離した成熟種のポリペプチ ドサブユニットのＮ末端配列分析ではＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１の残基２９３．３ ００．３１３．３１５．３１６及び３１８から始まる成熟配列の一連のＮ末端が あることが判明した。これらの全ては、標準的な骨誘導アッセイで示されるよう に活性である。

Ｖ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　’ｔ””　モ）Ｉｉフｔジエン　Ａ　ノ培養培地や体液 から、溶解型複合体を精製する別の方法として、溶解型複合体は精製プロドメイ ンや成熟２量体種からつくることもできる。複合体形成が成功するにはジスルフ ィド結合に影響せず、これらの分子の折りたたまれた構造を緩和するのに十分な 変性条件下で成分の解離が必要である。好ましくは、変性条件が、切断プロドメ インが、緩和された折りたたみ状件下で、成熟２１体種と結合する機会をもてる に十分な分子内小孔の環境を擬似することである。そこで変性剤の溶液中の濃度 は制御され、好ましくは、プロドメインが２Ｍ体と結合したままで、２１体とプ ロ領域の適切なりフォールディングが許容できるように段階的にに減少させる。

有用な変性剤としては、ｐＨ４−１０、好ましくはｐＨ６−８の緩衝液中で、４ −６Ｍの尿素、グアニジン塩酸塩（ＧｕＨＣＩ）を含む、そして、溶解型複合体 は調節された透析か、変性剤の最終濃度が０．１−２Ｍ　以下の尿素、又はＧｕ ＨＣＩ、好ましくは１−２Ｍ以下の尿素、又はＧｕＨＣＩの溶液、ここで好まし くは生理緩衝液に、希釈する事によって作られる。蛋白質精製や変性操作や考察 については従来技術によく開示されており、適切な変性プロトコルをすぐに開発 するための詳細は当業者の通常の技術を有するものにより決められる。一つの有 用なテキストは、例えば、Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ、Ｍ、ＤｅｕｔｓｃｈｅｒＳＷ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｓａ ｎ　Ｄｉｅｇｏ、１９９０、特に第ＶＬ複合体形成は一つ以上のシャペロン蛋白 質を加えることにより支援される。

■１泊”刑モルフオシエン　八　の６ 生理緩衝液中、例えば、トリス緩衝生理食塩水やリン酸緩衝生理食塩水など、で の高度に精製された溶解型モルフオシエンの安定性は、いろいろな手段で増強で きる。現在好ましくは、プロ配列（例えば、ｏｐ−１のＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１ の残基３Ｏ−４７）のすくなくとも最初の１８個のアミノ酸、好ましくはプロ領 域の全長、からなるプロ領域によるものである。残基３０−４７は他のモルフオ シエンのＮ末端部分と配列相同性を示し、全てのモルフオシエンの複合体安定性 を増強するのに特にを用と考えられている。

溶解型モルフオシエン複合体の安定性を増強させる他の有用な手段は、３つのク ラスの添加剤を含む、これらの添加剤は塩基性アミノ酸（例えば、Ｌ−アルギニ ン、リジンとベタイン）；非イオン性洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ　８０又はＮｏ ｎ１ｄｅｔＰ−１２０）；とキャリア蛋白質（例えば、血清アルブミンとカゼイ ン）を含む、これらの添加剤の有用な濃度は１−１００ｍＭ、好ましくは、１０ −７０ｍＭ、５０ｍＭ　塩基性アミノ酸を含む、０．０１−１．０％好ましくは 、０．０５−０．２％。

０．１％（容量／容量）の非イオン性洗剤を含む；０．０１−１．０％、好まし くは０．０５−０．２％、０．１％（重量／容量）のキャリア蛋白質を含む。

■、゛′　”　モルフオシエン　八　の゛プロドメインと成熟２１体種との結合 は異なる活性測定により示されるようにｉｎ　ｖｉｖｏ　での蛋白質の形態形成 性活性に影響を与えない、特に、標準的なラット骨減少症モデルに投与サレタ溶 解型０Ｐ−１複合体は、成熟モルフォジェンヲ使用したときに得られる結果とＩ Ｉ（Ｈした様式で、骨成長やオステオカルシン産生を有意に増加する。（以下の 表■を参照）アッセイは国際出願　ＵＳ９２１０７４３２　（ＷＯ９３１０５７ ５１）に開示している骨粗鬆症モデルに類似しているが卵巣摘除の動物ではなく 、むしろ老齢の雌性ラットを使用している。簡単には若齢及び老齢の雌性ラット （チャールズリバーラボ、それぞれ、１１５−１４５．３３５−４６０ｇの体重 ）に毎日７日間、尾静脈注射で、２０μｇ／ｋｇ体重　の溶解型０Ｐ−１、ある いは１００μｇ／ｋｇ体重　の溶解型０Ｐ−１を投与した。対照群の若年及び老 年の雌性ラットにはトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）のみを投与した。水や餌は 全ての動物に自由に摂取させた。１４日後、動物は屠殺され、新しい骨成長を標 準的な＆１ｌｖａ病理学的方法により測定した。血清中のオステオカルシン濃度 も測定した９モルフオシエン投与による好ましくない効果は体重や組織重量の変 化の測定や、血液学的プロフィールによる測定では認められなかった。

表ｎ 動物数　動物群　骨面積　オステオカルシン（Ｂ、Ａｒ／Ｔ、Ａｒ）　（ｎｇ／ ｍ１）４　対照群　５，５　上０゜６４　１１．８９±４．２５　老齢雌性　７ ．６８　上０゜６３率傘　２　２．２　４　上２゜２８傘傘２０μｇ／ｋ　ｇ 溶解型０Ｐ−１ ５老齢雌性　９．８２±３．３１率　２０．８７±ａｉ４＊１００μｓ／ｋ　ｇ 溶解型０Ｐ−１ 本Ｐ＜０．０５ 傘寧　Ｐ＜０．０１ 卵巣摘除ラットを使用したＷＯ９３１０５７５１に開示されている骨粗に症モデ ルにおいて溶解型の０Ｐ−１種合体を使用して行った類似の実験でも、複合体を 使用した事による好ましくない結果は認められなかった。

成熟型も溶解型のモルフオシエン、両者とも以下に示すように、ＣＡＭ　（細胞 接着分子）の発現を誘導することができる。

簡単にはＮ−ＣＡＭ　同型（Ｎ−ＣＡＭ−１８０、Ｎ−ＣＡＭ＝１４０とＮ−Ｃ ＡＭ１２０）の誘導は市販の入手出来る抗体ｍＡｂ　Ｈ２Ｓ、１２３（シグマ） との反応や標準的なウェスタンプロット分析（例えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ １ｏｎｉｎ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ　む　Ｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　、　Ｓａｍｂｒ。

ｏｋら　Ｗ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、１９８９、特に１８節）で追跡できる。培養している神経由来、ＮＧ１ ０Ｂ−１５細胞（ＡＴＣ。

Ｒｏｃｋｖｉｌ！ｅ、ＭＤ）、の形質転換細胞に、成熟型のモルフオシエン２量 体あるいは溶解型モルフオシエン複合体（１０−１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは 少なくとも４０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかをインキュベートすると、これらの細胞 が再分化し、形質転換していない神経に特徴的な形態に戻るのが誘導された。

また、全ての３種のＮ−ＣＡＭの特異な誘導や増強された発現も含まれる。実験 では細胞はポリーＬ−リジン・コートされた６穴プレートで２次培養され、実験 前２日間、化学的に特定の培地で増殖した０モルフオシエンの新しい溶液（２， ５μｍ）は毎日添加された。

■、菰生皮生 以下にポリクロナル及びモノクロナル抗体産生の標準的プロトコルを開示する。

溶解型複合体のみを認識する抗体のために、好ましくは単離されたプロ領域が抗 原として使用されることである；ここでは成熱蛋白に対する特異的な抗体が望ま れており、抗原は好ましくは、少なくともＣ末端ドメインかインククトな成熟配 列からなるのがよい。

ポリクロナル抗体は以下のように作られる。各ウサギに、５００μｍの完全フロ インドアジュバントと混合した０、１％ＳＤＳ中、１００μｇ１５００μｌの抗 原で一次免疫した。抗原は動物の背中や脇腹の多数の箇所に皮下注射した。不完 全フロインドアジュバントをもちいて同様な方法で１力月後、ウサギにブースタ ー投与した。検査用の血は７日後に耳静脈より採血する。２回のブーストと検査 をモルフオシエン抗原に対する抗体がＥＬＩＳＡ法で血清に検出できるまで、− カ月間隔でおこなった。その後、ウサギはフ゛−スト後７日と１０日に１００μ ｇの抗原の投与と採血（１回１５ｍ１）を１力月毎に行う。

特定のモルフオシエンに特異的なモノクロナル抗体は以下のように調製出来る。

マウスにはモルフオシエン抗原を２回注射する。蛋白質や蛋白質フラグメントは 好ましくは組み換え技術で産生ずる。最初の注射には完全フロインドアジュバン ト中に１００μｇの抗原を含有し皮下投与される。２回目の注射は不完全アジュ バントに５０μｇの抗原を含存し腹腔内に投与する。

マウスはその後、８力月間にわたり、いろいろな時間に４回の腹腔内注射で全部 で２３０ｎｇの０Ｐ−３を投与される。マウスには細胞融合の１週間前に抗原（ 例えば１００μｇ）を腹腔内に投与し、さらに適当な架橋剤で生血清アルブミン と結合したペプチドフラグメントをブーストしてもよい。ブーストは融合Ｍ５Ｅ ＪＩ％’ｌ　（ＩＰ＞、４ＥＩＪ　（ＩＰ）、３ＥＪｒｊＩ　（ＩＰ）、１日（ ＩＰ）Ｉり返してもよい、マウス牌細胞を市販品で入手出来ルミエローマ細胞と ＰＥＧ　１５００（ベーリンガーマンハイム、独〕を使ってＩ：１の比率で融合 し、融合細胞をプレートにのせ、モルフオシエン配列の抗原として適切な部分を 用いて、成功型あるいは溶解型モルフオシエンに特異的な抗体をスクリーニング する。細胞融合とモノクロナルのスクリーニングの工程は従来技術で広く知られ た標準的な本によく開示された標準的な操作で行うことが出来る。

これらの標準的な操作を用いて、抗プロドメイン抗血清を抗原として０Ｐ−１由 来の単離したプロドメインを用いて調製した。抗原として、大腸菌産生の切断型 ０Ｐ−１を用いて、成熟ドメインに対するモノクロナル抗体（ｍＡｂ”）マウス で産還元条件下で行われた標準的なウェスタンプロット分析では抗プロドメイン 抗血清（″抗−ブロ′）はプロドメインにのみ特異的であり、成熟０Ｐ−１に対 するｍＡｂ（”抗−成ＰＯＰ−１”）は２１体サブユニットに特異的でありこれ らの２個の抗体は交差反応しないので、例えば調製培地や血清などのサンプル中 の溶解型と成熟型の蛋白を識別するのに使うことが出来る。ウェスタンプロット の結果が以下の表に■まとめであるが、ｍＡｂの成熟０Ｐ−１に対する反応性は ”ｙｙ“で示し抗−プロ抗血清の反応性は”ｘｘ”で示しである。

表■ 抗体　精製　ＣＨＯ細胞　分　離　精　製溶解型　調製培地　プロドメイン　２ 回体０Ｐ−１サブユニット 抗−プロ　ｘｘ　ｘｘ　ｘｘ 抗−成熟　ｙｙ　ｙｙ　ｙｙ ７８ｅ、中のモルフオシエンを検出したり、溶解型と成熟型２量体モルフオシエ ンの型を識別する能力は診断検査に貴重な手段を提供しており、血清や他の体液 中のモルフオシエンの濃度や型を追跡したり、診断方法や他の組織評価キットを 開発したりすることができる。

例えば、０Ｐ−１は正常な骨成長や骨吸収に直接的に関連する。このように溶解 型○Ｐ−１は、子どものように、高い骨代謝回転のヒトには高濃度で検出され、 骨粗鬆症、骨肉腫、パジエノト病などのような疾患の患者では実質的には低い濃 度で検出されることが予期される。

血清中の０Ｐ−１又はＢＭＰ２やＢＭＰ４のように骨組織へ標的化されているモ ルフオシエン類のレベルの追跡は個人の骨組織の状態を評価したり、損傷したり 損失した骨組織を再生する治療効果を追跡する手段を提供する。同様に内因性の ＧＤＦ−１のレベルを追跡することは、神経Ｍｉ織、特に、脳組織の健康状態に ついての診断的情報を提供する事が出来る。さらに本開示に従って溶液中の溶解 型と成熟型のレベルを識別する事が出来る。

現在、体液中のモルフオシエンレベルを評価する好ましい検出方法は、抗体や、 他のモルフオシエンと特異的に反応し、モルフオシエンとの複合体の一部として 検知され得る適当な結合蛋白質を用いたイムノアッセイからなる。イムノアッセ イは、当業者に知られている標準的な技術とモルフオシエンに対するものでしか もモルフオシエンに特異的である抗体を利用して行うことが出来る。注目のモル フオシエン蛋白質の型を認識する抗体は、ここで開示されたように作ることが出 来、これらの抗体は血清、全血、又は腹水のような体液中の内因性蛋白質のレベ ルを追跡するのに使用される。溶解型モルフオシエンの内因性の４度を追跡する のに、選ばれた抗体は、好ましくは溶解型に結合特異性を有するもの、例えば、 プロドメインに特異性を有するものがよい、そのような抗体は、本質的に本発明 で開示したように、プロドメイン、又は、その一部を抗原として用いて作る事力 咄来る。抗原として使用する適切なプロドメインは、溶解型複合体を単離して得 られる。標準的な操作、例えば、上記の如く複合体をＨＰＬＣカラムにかけたり 、ゲル電気泳動による分離、を利用して、成熟ドメインがら非共有結合的に結合 するプロドメインを分離した。別の選択として一量体の形のプロ型の蛋白を抗原 として、使うことが出来る。候補の抗体はウェスタンプロットにより、又は、注 目の蛋白質のン容解型蓋白のプロドメインを認識し、しかし、上記の如く成熟型 は認識しない他の標準的なイムノアッセイによりスクリーニングされる。

−量体のプロ型はＣＨＯ産生細胞の細胞溶解産物から、又はプロ型をコードする ＤＮＡを前核細胞、例えば大腸菌での発現により得ること力咄来る。プロ型は哺 乳類細胞では、見かけの分子量が約５０キロダルトンであるが、その後、ＨＰＬ Ｃ及び／又はゲル電気泳動により単離できる。

溶液中に存在する形態形生性蛋白質の量を定量するために、当該蛋白質に特異的 なポリクロナル、又はモノクロナル抗体を用いてイムノアッセイを行い、モルフ オシエンを検出する事が出来る０本発明では、上記の如く、溶解型及び成熟型の モルフオシエンを、２つの型の蛋白質を識別出来る抗体を用いて、両者を区別す ることができる。現在のところ、好ましいアッセイは、ＥＬｒＳＡ法やラジオイ ムノアッセイ法があり、またサンプル中のモルフオシエンを定量するのに有用な 標準的なコンペティターアッセイも含む、ここでは、サンプル中の未知の量のモ ルフオシエンが抗モルフオシエン抗体と反応し、この相互作用が既知量の標識化 された抗原と競合する。その後、平衡状態での結合、又は、フリーの４１！ｍ化 抗原のレベルを測定して、溶液中の標識化されていない抗原の量を定量する。こ れらのアッセイの代表的なものを以下に開示する。しかしながら、当業者にはわ かるように、これらプロトコルの変法は他のイムノアッセイと同様に公知であり 、当業者の技術範囲内である。例えば、以下に示されるＥＬＩＳＡプロトコルで は、溶解型０Ｐ−１はビオチン化した抗プロ抗血清を用いてサンプル中のものを 同定している。ビオチン化した抗体は、以下に示すよ゛うに、比色法や化学発光 法で測定できる。また別の選択では、抗体は１１５１のような適当な分子で放射 線標識できる。さらに、使用しうる別のプロトコルでは固相イムノアッセイがあ り、好ましくは、マトリックス表面に結合した抗モルフオシエン抗体を用いたア フィニティーカラムを用いて、血清サンプルをそこを通過させることが出来る。

有用なイムノアッセイの詳細な説明、プロトコルや考察も含み、については、例 えば、Ｍｏ１ｅｃｕｌ−ａｒＣｌｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕａｌ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８９、特に第１８節参照 血清アッセイについては、好ましくは、まず、血清は血清アルブミンのような過 剰な、コンタミしている血清蛋白質をのぞく為に、部分精製する。好ましくは血 清は硫安（例えば４５％）沈澱により抽出され、複合体は沈殿する。血清中に存 在する他の蛋白質の溶解度と比較して、溶解型あるいは成熟型モルフオシエンの 溶解度が区別出来ることを利点としてさらに精製ができる。更なる精製は公知の クロマトグラフィー技術でも出来る。

溶解型○Ｐ−１は、以下のように、ＥＬＩＳＡ法で０Ｐ−１プロドメインに特異 的なポリクロナル抗体を用いて検出できる。

ｌμｇ／１００μｍのアフィニティー精製した０Ｐ−１プロに特異的なポリクロ ナルウサギＩｇＧを９６穴プレートの各ウェルに加え、３７Ｃで１時間インキュ ベート、する、各ウェルを４回、ｐ　Ｈ８，２、Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１５ Ｍ　ＮＡＣＩ、０゜１６７Ｍ　はう酸ナトリウム緩衝ｔＬ（ＢＳＢ）で洗浄する 。非特異的結合を最小限におさえるため、ウェルをＢＳＢ中１％牛血清アルブミ ン（ＢＳＡ）で完全に満たしてブロックし３７°Ｃで１時間インキュベートする 。ウェルはその後４回、０．１％のＴｗｅｅｎ２０含むＢＳＢで洗浄する。１０ ０μ＋の培養上清か血清の検査サンプルの適当な希釈溶液を、各ウェルにｎ−３ で加え、３７°Ｃで３０分インキュベートした。インキュベートした後、１００ μｌのビオチン化つサギ抗プロ血清（ストック溶液は約１ｍｇ／ｍｌで使用前に １％ＢＳＡを含むＢＳＢに１：４００で希釈する）を各ウェルに加え３７°Ｃ３ ０分インキュベートする。ウェルをその後４回、０．１％のＴｗｅｅｎ２０含む ＢＳＢで洗浄する。１００μｌのストレバビデイン−アルカリ（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓ。

ｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ、使用前に０． １％のＴｗｅｅｎ２０含むＢＳＢで１：２０００に希釈する）を各ウェルに加え 、３７°Ｃ３０分インキュベートする。プレートを４回ｐＨ０，２，０，５Ｍ） リス緩衝食塩水で洗浄する。５０μｍの基質（ＥＬＩＳＡ増幅システムキット、 Ｌ、ｉ　ｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ ）を１５分間、室温でインキュベートしである各ウェルに加えた。その後、５０ μｌの増幅剤（同じ増幅システムキットから）を加え、さらに１５分間、室温で インキュベートした０反応は５０μＩの０．３Ｍ硫酸を加えて停止させた。

各ウェルの溶液の４９０ｎｍのＯＤ値を記録する。サンフル中の溶解型０Ｐ−１ のレベルを定量するのにテストサンプルと平行して標準曲線を作成した。標準曲 線は既知の量の精製０Ｐ−１プロが加えられてめられる。また、別の選択では、 例えば、Ｌｕｍ１−ｐｈｏｓ　５３０（ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＬｕｍｉｎｅｓｃ ｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を基質として、標準蛍光計で３００−６ ５０ｎｍの検出を利用して、複合体は化学発光で検知できるが、これは、一般に 、可視光の変化による検出より、より高感度のアッセイを提供するものである。

モルフオシエン（溶解型あるいは成熟型）は、以下のように、標準的なプレート ・イムノアッセイで検出できる。抗モルフオシエン抗体の実験的測定限度は（例 えば抗０Ｐ−１は、一般に、５５０−８０ｎ／ウエルであるが）ｐｖｃプレート のウェルに依存する０例えば、５０μｌのＰＢＳ燐酸緩衝食塩水中での測定、室 温で結合出来る十分なインキュベーション後、−ｉに１時間であるが、プレート を　Ｐ　Ｂ　Ｓ／Ｔｗ　ｅ　ｅ　ｎ２０溶液じ洗浄緩衝液”）で洗浄し、２００ μｌのブロック（ｌ　ｘＢＳＢ中、３％ＢＳＡ、０．１μリジン）を各ウェルに 加え１時間インキュベートする。その後、各ウェルを再び、洗浄緩衝液で洗浄す る。

４０μｌの順次希釈した血漿からなるサンプル（上述したように、部分精製した ものが好ましい）を、又はモルフオシエン標準（例えば、０Ｐ−１）をウェルの ｎ＝３で加える。サンプルは好ましくはＰ　ＴＴＨ（１５ｍＭ　ＫＨ！　Ｐ　Ｏ ４，８ｍＭ　ＮａｚＰ○４　、　２７　ｍＭ　Ｋ　ＣＩ、１３７ｍＭ　ＮａＣ１ ，０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０．１ｍｇ／ｍｌ　Ｈ３Ａ、０．０５％　ＮａＮ７、 ｐ　Ｈ７，２）で希釈する。１０μＩの標識化競合抗原、好ましくは、１００． ０００−５００．０００ｃｐｍ／サンプルが加えられ（例えば、”ＪＯＰ−Ｌ標 準的な操作で放射線１ｍ化する）、プレートを４°Ｃで一晩インキユベートする 。その後プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥する。ウェルを切り離し、結合し た標識化０Ｐ−１を４１ｍ的なガンマ−カウンターで測定する。サンプルの存在 下、と存在していない場合に測定された標識化抗原の量を比較する。その差はサ ンプル液中に存在するサンプル抗原（モルフオシエン）の量に比例する。

付随するアッセイ法として、内因性の抗モルフオシエン抗体を検出し、溶解型と 成熟型に対する抗体間の識別できるイムノアッセイを開発する事が出来る。内因 性の抗モルフオシエン抗体は血清中に検出されており、例えば、哺乳動物に骨形 成手段を移植したとき、そのレベルが上昇する事が知られている。特定の理論に 限定することなくこれらの抗体は血清中の生しうる蛋白のレベルを変えることに より、モルフオシエン活性を調整するのにも有用である。血中、又は体液中の内 因性抗体のレベルを追跡するアッセイは、このように組織の状態を評価する診断 アッセイにも利用できるし、組織再生の治療効果の追跡する手段を提供するもの である。

内因性の抗モルフオシエン抗体を検出する、現在好ましい方法は標準的なウェス タンプロットによる方法である。これらのアッセイの詳細な説明については、例 えば、文献として組み入れている　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８９、特に１８． ６０−１８．７５を参照すればよい、精製した成熟型、あるいは溶解型モルフオ シエンは、溶液中の蛋白質を分離する為に工夫された、酸化あるいは還元条件下 でＳＰＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけられ、蛋白質は、その後、フ ッ素化ビニリデン細孔膜（０，４５ｍ　孔径）に標準緩衝液及び操作を使って移 された。そしてフィルターを検査される血清（多種類の希釈で）とインキュベー トする。

プロドメインか成熟モルフオシエンのいずれかに結合した抗体は抗ヒト抗体蛋白 、例えばヤギ抗ヒトＩＣ２を用いて検出する。

モルフオシエン抗体の力価はシグナルが検出されなくなるまで血清をさらに希釈 して決定する。

Ｘ、汁２・′としてｒ″　モルフオシエンの７　る　法　びそ至１月 本発明の溶解型モルフオシエンは哺乳類、特にヒトの病気、あるいは損傷した組 織を再生する治療薬として特に有用である。

溶解型複合体は損傷した、病気の肺臓、肝臓、心臓、腎臓、神経組織、膵臓ｍ織 の再生に、又はこれらの組織、骨髄、皮膚、消化管粘膜や他の生体Ｍｉ織の移植 や植接に特別な利点をもって使用することができる。

本発明で開示される溶解型モルフオシエンは適当な手段により、好ましくは、直 接、若しくは全身投与、例えば、非経口的に、若しくは経口で、する事が出来る 。モルフオシエンが直接（例えば、局所で、注射により望まれる＆ｌｌ織へ）、 若しくは、非経口的に静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼、脳室内、頭蓋内、間 接色白、を髄内、くも膜下槽内、腹腔内、バッカル、直腸、膣、鼻腔内あるいは エアロゾル投与により投与されるが、モルフオシエン複合体は好ましくは水溶液 からなる。溶液は生理学的に許容できるもので、望まれるモルフオシエンを愚者 に投与するのに加えて、溶液は患者の電解質や体液バランスに副作用を示さない ものである。このように、溶解型モルフオシエンの水系溶媒は通常の生理食塩水 （０，９％　ＮａＣ１、０，１５Ｍ、ＰＨ７−７，４，）よりなる。

本発明の溶解型は上記の如く容易に培養細胞培地から生理緩衝液溶液に精製でき る。さらに、上記の如く、もし望まれる場合、溶解型複合体は、塩基性アミノ酸 （例えば、Ｌ−アルギニン、リジン、ベタイン）、非イオン性洗剤（例えば、Ｔ ｗｅｅｎ−８０あるいは　Ｎｏｎ１ｄｅｔ−１２０）キャリア蛋白（血清アルブ ミンやカゼイン）等の一つ以上の添加剤と一緒に製剤することができる。

経口あるいは非経口投与にを用な溶液は、製剤技術の公知の方法のいずれによっ ても調製することができる０例えば、Ｒｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ、り、ＭａｃｋＰｕ ｂ、。

１９９０　に開示されている。製剤は、例えば、ポリエチレングリコールのよう なポリアルキレングリコール、又は植物油、又は水素化ナフタレンのようなもの も含んでもよい、直接投与の製剤は、特に、グリセリンや他の高粘度の組成物を ふくんでもよい、生物適合性ポリマー、好ましくは、例えば、ヒアルロン酸、コ ラーゲン、リン酸トリカルシウム、ポリブチレート、ポリラクチド、ポリグリコ リド、ラクチド／グリコリド　コポリマーのような生物吸収性ポリマーを含む、 はｉｎ　ｖｉｖ。

で、溶解型モルフオシエンの放出を制御できる有用な賦形剤として使用できる。

他の可能性のある、当該モルフオシエンの有用な非経口デリバリ−システムはエ チレン−酢酸ビニル　コポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み可能な注入シス テムやリポソームを含む。

吸入投与の製剤としては、賦形剤として、例えば、ラクトースを含んでもよいし 、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココレート、デオ キシコレート、又は油性溶液を鼻用ドロップ剤や鼻腔内投与用ゲルとして、含む 水溶液であってもよい。

本発明で開示された熔解型モルフオシエンは経口投与することもできる。治療薬 としての蛋白質の経口投与は一般的には、殆どの蛋白質が血流に吸収される前に 、哺乳類の消化器系の消化酵素や酸により、容易に分解されるので、実際的では ない。

しかしながら、本発明で開示したモルフオシエンの成熟ドメインは、一般に、酸 に対して安定で、蛋白分解酵素に耐性である。

（例えば、Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔ、　Ｎｏ、４．９６８．５９０）さらに、少なく とも一つのモルフオシエン、０Ｐ−１、は乳腺抽出物、初乳やミルク、唾液中で 同定されている。さらに、乳腺抽出物から精製された０Ｐ−１が形態形成活性を 有している０例えば、この蛋白質は、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ、Ｎｏ、４．９６８．５９ ０に開示されているように、標準的なｉｎ　ｖｉｖｏの骨アンセイを用いて評価 すると、適当なマトリックス剤に結合して皮下に埋め込んだときに、軟骨内骨形 成を誘導する。さらに、内因性のモルフオシエンもまたヒト血清中で検出されて いる（上記参照）、最後に、形態形成活性を特定する多くの実験で、溶解型と成 熟型のモルフオシエンの比較したところ、プロドメインと２量体種との非共有結 合は形態形成活性に影響しないことがわかった。これらの結果は、経口や非経口 投与がモルフオシエンをヒトに投与する実行可能な手段であるということと、溶 解型モルフオシエンが全身投与プロトコルで有用性を有する事を示している。

本発明で提供される溶解型モルフオシエンはモルフオシエンを望まれる組織へ標 的化する事が出来る分子と結合することができる０例えば、テトラサイクリンや ジフォスフォネート（ビスフォスフォネート）は、哺乳類に全身投与したとき、 骨ミネラル、特に骨リモデリング帯に結合する事は知られている。従って、これ らの分子は溶解型モルフオシエンを骨組織へ標的化する有用な試薬として含むこ とが出来る。また、別の選択として、望まれる標的組繊細胞表面と特異的に相互 作用する抗体や他の結合蛋白質をもまた使用することができる。さらに、そのよ うな標的化分子はモルフオシエン複合体と、例えば、化学的架橋、又はＡｓｐ− Ｐｒｏのような酸分解しゃすい結合を作る。

標準的な遺伝子工学的手段などにより、共有結合させてもよい有用な標的化分子 は、例えば、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ、Ｎｏ、５．０９１．５１３に開示されている単一 鎖結合部位テクノロジーを利用して、デザインすることができる。

最後に、本発明で提供される溶解型モルフオシエン複合体は単独、又は組織修復 や、再生することができる、若しくは炎症を阻害する事が出来る分子を含め、組 織形態形成に有効な事が知られている他の分子と併用で投与する事が出来る。骨 粗Ｎ症患者の骨組織成長を促進する有用な補助因子の例は例えば、それに限るも のではないが、ビタミンＤ３．カルシトニン、プロスタグランジン、副甲状腺ホ ルモン、デキサメタシン、ニストロジエン、ＩＧＦ−１、ＩＣＦ−ＩＩが挙げら れる。神経組織修復や再生に有用な補助因子は神経成長因子がある。他の有用な 補助因子には症状を緩和する補助因子があり、それらには、防腐剤、抗生物質、 抗ウィルス剤、抗菌剤、鎮痛剤や麻酔剤が挙げられる。

本発明で提供される化合物は薬理学的に許容しうる、毒性のない賦活剤やキャリ ヤーとの混合による薬理学的組成物に製剤する事が出来る。上記の如く、そのよ うな組成物は非経口投与では、特に溶液、又は懸濁液の形で、経口投与では、特 に錠剤やカプセル剤の形で、あるいは、鼻腔内では、特に、散財や重用ドロップ やエアロゾルの形で作ることが出来る０組織表面への接着が望まれるところに、 組成物はフィブリン−トロンビンに分散されたモルフオシエンの組成物が含まれ る。他のそのような生物接着剤は本発明に組み入れである参考文献に、例えば国 際出願ＵＳ９１１０９２７５に開示されている０組成物はさらに、塗布されたり 、噴霧されたり、又は、そうでなければ望まれる組織表面に適用することが出来 る。

組成物は、ヒトあるいは他の哺乳類に治療的に存効な量、例えば、上記の如くそ れらの特定ステップも含み、を誘導するのに十分な時間、標的組織へ適当な濃度 のモルフオシエンを供給する量を、非経口、又は経口投与のための製剤ができる 。

溶解型モルフオシエン複合体が移植操作の一部として使用される場合、モルフオ シエンは生体＆！ｌｌ織に、又はドナーから組織や器官を切除するのに先立って 移植されるべき組織や器官にモルフオシエンを供給することが出来る０モルフオ シエンはドナー主に、直接、溶解型複合体からなる製剤の組織への注射、又は間 接的に、例えば上述したどの手段をもってしても経口、又は非経口投与により供 給することが出来る。

また別の選択としては、さらに、一度ドナーから除去されれば、器官又は生体＆ ［ｌ織はモルフオシエンを含む保存溶液に入れられる。さらに、レシピアントに もまた、好ましくは、移植直前、又は同時にモルフオシエンを投与する。全ての ケースについて７容解型複合体は危険な状態時に組織へ直接、！１１織への注射 のように、投与することが出来、又は全身的に経口、若しくは非経口により、本 発明で開示し、若しくは従来技術で知られている方法で供給することが出来る０ モルフオシエンが組織や器官保存液からなる場合、入手出来るどのような市販品 の保存溶液でも、利するのに使用できる。有用な保存溶液は、本発明で組み入れ ている参考文献　ＰＣＴ／ＵＳ９２１０７３５８　に開示されている。

当業者に理解できるように治療組成物に開示された化合物の濃度はいろいろな因 子、投与される薬剤量、用いられる化学的特性（例えば疎水性）や、投与経路に より変化する。投与されるべき薬剤の好ましい用量は、おそらく、組織損傷や組 織損失のタイプや程度、特定の患者の全体の健康状態、化合物の製剤、製剤中の 賦活剤の存在やタイプや投与経路のような変数に依存する。一般的に、本発明の 化合物は非経口投与に約０．００１−１０％　重量／容量の化合物を含有する生 理緩衝水溶液で供給される。一般の用量範囲は一日、約１０ｎｇ／ｋｇ一体重か ら約１ｇ／ｋｇ一体重；好ましい用量範囲はＯ，ｌμｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ ｋｇ一体重　である、成熟モルフオシエン（例えば、０Ｐ−１，２０μｇ）を２ １日間、毎日、連続で正常に成長しているラットに投与しても、モルフオシエン に起因する病理学的損傷は認められない、さらに、１０μｇのモルフオシエンを 毎日１０日間正常の新生マウスに全身投与で注射しても、何の大きな異常も生じ なかった０モルフオシエンが本発明の方法により全身投与される場合、好ましく は、大容量の投与量が治療の初期に用いられる。その後、治療は維持量で続けら れる。

さらに、その後、投与は血中のモルフオシエンのレベルを適当な間隔で追跡して 決定する事が出来る。

血少ｌ生斑 本発明は、その精神、又は本質的な特徴から離れることなく他の特定の形で具体 化できる０本実施例は、従って、全ての点について実例として考慮されるべきも のであるが、限定するものではない。前述の明細書によるものより、むしろ添付 の請求項記載の発明の範囲、及び請求項と等価の意味と範囲内での全ての変化は 、従って、本発明に包含されるものである。

配列表 （１）全般情報： （１）出願人： （Ａ）名前：クリエイティブ　バイオモレキュルズ。

インコーホレイテッド （Ｂ）街名：サウス　ストリート　３５（Ｃ）車名：ホプキントン （１、発明の名称：新規な形態形成量白質組成物（ｉｉｉ　）配列数；２３ インコーホレイテッド （Ｂ）　！ｉ？名：サウス　ストリート　３５（Ｃ）車名：ホプキントン （Ｆ）郵便番号：０１７４８ （Ａ）出願番号： （Ｂ’）出願口： （２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１関連情報：（ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ　）仮説：無 （ｉｖ）アンチセンス：無 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１：ＴＣＴＣＡＣＡＣＴＡ　？ＴＡＧ ＧＡＡＡＣＡ　τＧＡＧＣＡＧＣＡＴ　ＡＴＧＣＣｍＴＧ　ＡＴＣＡＧＴｍＴ　 ＣＡにτＣＣＣムＧＣ１５R１ ＡＴＣＣＡＡｒＧＡＡ　ＣＡＡＣＡＴＣＣＴＡ　ＣＡＡＧＣτＣτＧＣＡＧＧＣ ム人ムムＣＣτＡＧＣＡＧＧ入Ｕ　ムムＡＡＡムＣ人ＡＣ１T９１ （２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２関連情報：（ｊ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列表示；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　！Ｉｉ ｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｙｔ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅムｒｇ 　Ｐｈｅ　ｊｕｐ　ＬｅｕＶａｌ　Ｐｈｅ　Ａ５Ｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌｔ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ｌ１ｉｓτｒｐ　７１１　Ｖａｌ　Ａｊｎ　Ｐｒｏ　 ＡｒｇＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＴｙｒＡｒｇ　ｊｕｎ　Ｍｅｔ　Ｖａｎ　Ｖａ ｌムｒｇ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｈ１ｓ４２０４２５４コ〇 （２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、３関連情報：（１１）分子Ｐ：ｉ：ｃＤＮＡ （ｘｌ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ｕｃｃＡｒｃＴ、ｕ　ＧＧＧＴＴ ＣＣＡＣＡ　ＡＡＣロー届ＣＧπＣＡＧＣＡＧＣＴ　ＧＡＴＧＪ、ＧＣＧＣＣＣ ＴｒＴＣＣＴＴＣＴ　１５X３ ＧＧＣＡＣＧＴ［、ＡＣＧＣＡＣＡＡＣＡτＣＣｎＣＣＡＧＣＴＡ　ＣＣＡＣＡ ＧＣＡＡＡ　ＣＧＣＣＴＡＡＧＡＧ　ＣＡＧＧＡＡＡＡＡτ@１６５３ （２）Ｓｅｑ、Ｎ）　Ｎｏ、４関連情報：（１【）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：Ｌｓｕτｒｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　 Ｌｅｕ　Ｐｂｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕムｒｇ　Ｓｃｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａ ｓｐ　Ｐｈｉ　５ｅｒＬｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｉｆｉｓ　Ｓ ｅｒ　Ｓａｔ　Ｆｈｅ　Ｉｌａ　ＦｕＳ　Ａｒｇムｒｇ　Ｌｅｕムｒｇ　５ｅｒ Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　 ＩＩｓ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ工１ｅ　ｔａｕ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＰｒｏ　ＵＳ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｇ１１ｌｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｉｆ ｉｓ　ＡＪｎ　Ｓｅｔ　Ａｌａ　ＰｒB ！１ｅｔ　Ｆｈｅ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｕｐ　Ｌｓｕ　Ｔｙｒ　Ａ＄ｌＩ　Ａｌａ 　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　Ｇｌ■ Ｐｒｏ　ｂｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｃ１ｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔ ｙｒ　Ｌ７ｓ　Ａｌａ　Ｖａｎ　Ｆｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒｌｏｏ　１０５　１１ ０ Ｇｌａ　Ｇ１７　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌ！ｌ 　Ａｓｐ　Ｓａｒ　ｌ１１ｇ　Ｐｂｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａ撃■ Ｐｈ＠　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　）Ｉｉｓ　Ｈｌｓ　入ｒＢ 　Ｇｌｕ　ｌ’ｈｅ　ムｒｇ　Ｐｂｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　５■■ Ｌｙｉ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅムｒｇ　１１ｅ　ＴｙｒＶａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｉ ｎ　ｖｄ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙムｒｇ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｓｕ　ＬＪｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔ ｈｒ　ｒｌａτｒｐ　Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅ ｕ　ｖａ１Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ 　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｍａｌ　Ａｉｎ　Ｐｒｏムｒｇ　ｌ１ｅムｓｎ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｓｉｒ　ｌ１ｅＡ５ｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅ ｕ　ｕａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ｒｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｆｉｇｓ　Ｇｌｙ　！’ ｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｉｎ　Ｌｙ■ ＧＩＪ１Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｔｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕムｒｇ２７５　２ＥＩＯ２８ ５ ＳａｒＸ１ｅＡｒｇＳｅｒＴｈｒＧｌｙＧｌｙＬｙｓにｉｎＡｒｇＳｅｘＧｉｎ ムｓｎＡｒｇＳｅｒＬｙｓＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　 Ｖａｎ　Ｖａｎ　Ａｒｇ　ｕａ　Ｃｙｓ　にｌｙ　ＣｙＳ　ｌ１ｉｊ（２）Ｓｅ ｑ、ＩＤ　Ｎｏ、５関連情報。

（ＩＩ）分子型：ｃＤＮＡ （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：（×１）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ 　Ｎ○＝７＝（２）Ｓｅｑ、ＴＤ　Ｎｏ、８関連清報：（１１）分子型：蛋白質 （Ｘｌ）配列表示二ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ 　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　ｕ＊　 Ｐｒｏムｒｇ　５ｅｒＴｈｒ　Ａｊｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｐｒ ｏ　Ａｊｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｃ；ｌｙ　ＩＩｓ　？ｂｅＡｓｐ　Ａｊ ｐ２７５　２１１０　２１！５ Ｇ１ｙ　ｌ１ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖａｎ 　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙ■ Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　 Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌ。

Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｂｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌ ｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　’／ａｌ　Ｖａｌ　Ｉ’ｒａ　Ｌｙｉ　ｎａ　Ｃｙｓ　 Ｃｙｓ　ｈｌｚ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｉ、凾■ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｖａｎ　Ｖａｎ　 Ｌｙｅ　Ａｌａ　Ｃ’ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｈ１ｓ（２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ 、９関連情ｌ１ｉ＝（ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｌ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：Ｍｅｔ、　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒ ｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕτｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ 　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓｌ　、　５　１０　１５ Ｖｄ　ＩＪｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｌ１ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ｌ１ｌｉ ｉ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Ｖａｎ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　にPｎ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　 Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｇｈｓムｒｇ　Ｇｌｕ　ＸｌｅムｒｇＧｌｕ　ｖａｌ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏムｒｇ　ＳｅｒＡｒｇ　ｕ ｎ　Ｐｒｏ　Ｖｄ　ＧｌｙＩＩｓ　Ａｊｎ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　！！ｉｓ 　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｅｌｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕムｓｐ ム５ｐＧｌｙ　ＥＬｓ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ（２）Ｓｅｑ 、ＩＤ　Ｎｏ、１０関連情Ｈ：（ＩＩ）分子皇：蛋白質 （ｘｉ）　配列ｊｔ示：　ＳＥＱ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　：　ｌ　Ｏ：Ｌｅｕ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＬｙｓＰｂｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　 Ｓｅｒムｓｐ　ＧｌｕＶａｌ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｂｅ　Ｇｌｕ　Ｌｅ ｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙ ｓＳｅｒ　Ｇｉｎ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ 　Ｐｈｅ　Ｃ１ｙ　１ｌｉｓムｓｐ　ｃｘｙ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＩｌｉｓ　Ｐｒｏ 　Ｌｅｕ　）Ｉｉｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｚ　Ｇｉｎ　ｎａ 　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　慟ＡｒｇＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｘｚ　ＨＬｓ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ 　Ａｘｐ　ＰｈａＳｅｒ　ＡＪＰ　Ｖｌｌ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　 Ｔｒｐ　Ｘユ５ｅａｌ　ムｌｘ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔ７Ｔ　Ｈ１ｓコ１ ０　３１５　３２０ Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　 Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＡｌａムＸｐ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ３２５　３］０　３３ ５ Ｓｅｒ　Ｍｅｔムｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙ ｓ　Ｖａｌ”Ｉａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｍ　Ａａｎ　Ｔｙｒ３７５　３ｆＩＯ３８５ Ｇ−ムｓｐ　ｋｔ　Ｖａｌ　Ｖａｎ　にｌｕ　にｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇ１７　Ｃ７＄ ムｒｇ（２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩＩＩＪ連情報：（！１）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：）ｌｅｔ　工ｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　ＡｓＱＡｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅ ｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５ ムｓｐ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔ７ｔ７＄ムｒＬｅｕ　Ｇ ｉｎ　５ｅｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＰｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ 　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｊｐ　Ｇ！！ＩＧｌｙ　Ｐｒｏ　ｂｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　 Ａｒｇ　にｌｙ　Ｆｈｅ　Ｈ１ｓＡｒｇ　Ｈｅ　Ａｊｎ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌ ｕ　’ｉｄ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖｉ ｎ　Ｐｒ。

Ｇｌｙ　Ｔｕｓ　Ｌｅｕ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ社ｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　’ｆ ｉｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　社ｓ　Ａｓｎｖａｌ　ＴｈｒＪｘｇ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ｊｕｐ　Ｖａｎ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ２１０　２Ｌｉ　２２Ｇ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＡｉｎＴｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｖｄ　Ｔｈｒ　ｌ１ｉｓＬｅｕ　Ｈｌｓ　Ｇｈ ＩＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　ｌＴｉ５　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　！Ｉｉｓ　Ｖ ａｎムｒｇ　ＩＩｓ　ＳｅｒＡｒｇＳｅｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　 Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｃ１ｎ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　 Ｌｌａｕ　Ｌｓ■ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｂｅ　Ｇ１７　Ｆｉｉｓ　Ａ５ｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇ１７ 　！Ｉｉｓ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒムｒｇムｒｇ　Ａｒｇムｒｇ　、Ｌｌａ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　ｌ１ｌｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ 　Ａｒｇ　Ａｌａムｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙ■ Ａ計ｙｓ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｊ　ｌ１１ｓ　Ｓｓｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙ ｒ　＝　Ａｓｐ　Ｆｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｓ　ＡｌｐＴａｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａ ｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ｕａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙ ｒ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＰｈｅＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ 　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｕａ　ムｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　ムｓｎ　 ５ｅｒＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌ ｓｕ　Ｖａｌムｓｎ　Ｓｉｒ　Ｖａｌムｓｎ　Ｓｉｒ　５ｅｒ１１ｅ　Ｐｒｏ　 Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｂｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　 Ｓａｔ　Ａｈａ　Ｘｌａ　Ｓａｔ　ＭｅｔＬｓｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｉｎ　Ｔ ｙｒ　Ｇｉｎ　ＧｌｕＭｅｔ　Ｖａｎ　Ｖｄ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ 　Ｃｙｓムｒｇ（２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１２１ｉＪ連情＠ｌ：（１１）分子 型：蛋白質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１２：ＩＩｓ　ｖＬＩＡｒｇ　Ｖａｌ 　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎムｒｇ　 Ｐｈｅ　１１ｅ　ｍｈＡｌ！　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｕａ 　Ｒｌｇ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇ１７　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　 Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒ５０　５５　５Ｑ Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ＰｈｉＡｉｎＰｒｏ　Ｐｈ ｅ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＳｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｓｒ 　Ａｊｐ　Ｌｙｓ　Ｓａｒ　ｌ１ｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓ ｎ　Ｌｙｉ　Ｌｙｇ　Ｐｒｏ　５ｅ■ Ａｊｍ　２１１ｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　’ｉａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌ ｕ　Ｇｉｎムｒｇ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｉｒ１ｓ　Ｌｙｓ　ＥAｙｓ １１ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　 Ｌ、ｎ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓムｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ｖｄ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｊｕｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｉｐ　Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　Ｓｑｒ　ｔａｕ　ｈｐＶａｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖｄ　Ａｓ ｐ　Ａｒｇτｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｎｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａｊｆ ｌ　ＴｙｒＧ１７　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖｄ　Ｇｌｕ　ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒ。

１１１ｓ　Ｉｒｉｓ　１ｌｉｓ　７１１　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇムｒｇ　Ｓｅ ｒ　Ａｌａムｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　１ｌｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｒ■ ４２０　４２５　４３Ｇ ？ｒｐ　Ｇｉｎ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　 Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＨ１ｓ　Ｌ７Ｓ　Ａ ｌｚ　ムｒｇ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　ムｓｐ　Ｖａｎ　Ｓｕｒ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡＳ ｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　Ａｌａムｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｔｈτムｒｇ　 Ａｒｇ　Ｌｙｓ４７Ｇ　４７５　４８０ ムｓｎ　Ｈｌｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＣｙＳ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｌｐ　Ｆｈｅ　５ｅｒｈｓｐ　Ｖａｌ　Ｇ ｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ｕｎＴｙｒ　Ｔ７Ｔ　Ｃ７Ｓ　ＥＬＭ　Ｇｌｙ 　Ｌ７Ｓ　Ｃ７Ｓ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌｐ　Ｈｌｓ 　Ｐｈｅ　ＡｓｎＳｅｒ　Ｔｈｒ　ＡｊｎＦｕｓ　Ａｌａ　Ｔｈｌ　Ｖｄ　Ｇｌ ｘｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　”Ｉａｌ　Ａｘｎ　Ａｇｏ　Ｍａｔ　Ａｉ＋ｓ　ＰｒB にｌｙ　Ｌｙｓ　’Ｖｍｌ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ｉｖｐ　Ｓｅｒ　Ｖｉ１Ａｌ！　Ｍｅｔ　Ｌ ｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ａｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｘ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｖ ａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｉｎ　Ｔｙｒ５６５　５７０　Ｓ７５ ＧＳ７５ＧｉｎＧｌｕコｘｒＶｄＶａｎＧｌｙＣｙｓＧｌｙＣｙｓムｒｇ（２） Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１３関連清報：（ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１３：五ａｔ　Ｖａｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅ ｕ　Ａｒｇ　Ｌｓｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ｈｌｓ　Ｈｌｓ　Ｌａ ｕ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　５ｅｒＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐ ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｉｎ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｐ ｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＰｒB Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｇｉｎム ｒｇ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇ１ｎＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏムｓｐ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｐｂｅ　Ｖａｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ 　Ａｓｎ　Ｖａｎ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＳｅｒ　Ｖｄ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｖａｎ　Ｐ ｈａ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｘ３−ｅ　工１＊　 Ｐｒｏ　ＴｙｒＳｅｒ　Ａｓｐ　Ａ５ｐ　Ｉｌｅ　Ｉｒ１ｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　 Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓムｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅｌｏ ｏ　１０５　１１０ Ｌｅｕ　Ｔ）ｒｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＭｅｔＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＧＬＫＩ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ ムｒｇＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｅ　Ａ ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｘｉｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　５ｅｒτｒｐ　Ｇｉ ｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａ ｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　工１ｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒ。

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Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　ムＸｉ　 ｔｈｅ　Ｔｈｅ　Ｌｙｓ　”Ｉａｌ　Ｓａｒ　Ｇｌｕｖａｌ　Ｔ１１ｓ　Ｖａｌ 　ｕｚ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａ：ムＳａｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇムｒ ｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｇ１ｎＳｅｒ　Ａｒｇ　Ａｊｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ 　Ｇｉｎ　Ｓｅｔ　Ｇｉｎ　ムＨｐ　Ｖａｌ　ムｌａ　Ａｒｇ　Ｖｄ　Ｓａｒ　 ５ｅｒＡｌａ　Ｓｅｒ　Ａｊｐ　Ｔｙｒ　Ｊｕｎ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙ＊ムｒｇ　Ｌｙｘ　Ｈ１ｓ（２）Ｓｅｑ、 ＩＤ　Ｎｏ、２０関連情ｅｌｆ：（ｉｉ　）分子！：蛋白質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２０：（２）Ｓｅｑ、１０　Ｎｏ、２ １関連情報：（ｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１：Ｘａａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｘａ ａ　Ｐｌ：ｏ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘｚｈ　Ｘ ａｉ　Ｌａｕ　ＸＪＬ＆　Ｘ≠■ ６５　７０　７５　［１０ （２）Ｓｅｑ、ｒＤ　Ｎｏ、２２５！連情報：（ｉｉ）分子型：蛋白質 （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２：Ｃ７ｓ　Ｘａａ　工ａａ　Ｈｌ ｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｖｉｌ　工ａａ　Ｐｈｓ　Ｘａａ　ムｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ　丁ｒｐＸｍムｓｐ　Ｔｒｐ　：ｔａｘ　Ｉｌｅ　ｕａ　Ｐｒｏ　Ｘ ａａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　ｕａ　Ｔｙｒ　Ｔ）ｒｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙＧｌｕＣｙｓＸｘａＰｂｅＰｒｏＬｅｕＸａａＳｅｒＸａａｌｌｅｔムｓｎ ム１１τｈｒム５ｎＨ１ｓム１ａ１１ｅ　Ｉａａ　にＬｏ　Ｘａａ　Ｌｓｕ　Ｖ ａｌＨｌｓ　Ｉａｌ　Ｘａａ　Ｉａａ　Ｐｒｏ　Ｘａｚ　Ｘａａ　Ｖａｌ　Ｐｒ ｏ　ＬｙｓＸａａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｉａａ　Ｌｅｕ 　Ｘａａ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｘａｘムｓｐ　 Ｘａａ　Ｓｅｒ　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｖａｎ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ｌｙｓ　 Ｘａａ　Ａｒｇムｓｎ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｖｄ工１＆社ａ　Ｃｙｓ　Ｇｕｙ　Ｃ ｙｓ　ＨＬｓ（２）Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２３１１Ｊ連情報：（ＩＩ）分子型： ペプチド （ｘｉ）配列表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３：ＶｏＡＤＨＢＳＡ　ＣＡ　Ｃｙ ｔＣ ＦＲＡＧＩＯＮ＃ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成７年１月３０日 特許庁長官　高　島　章　殿　ｊ ｌ　特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ９３１０７１８９２、発明の名称　形態形成 蛋白質溶解型複合体、及びその組成３　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　０１７４８マサチューセノツ、ホブキントン。

サウス　ストリート４５ 名　称　クリエイティブ　ハイオモレキュルズ、インコーボレイテ・ノド国　籍 　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　東京都新宿区四谷１丁目２番１号三浜ビル８階 モルフオシエンの前駆体ポリペプチド鎖は、Ｎ末端のシグナル配列とプロ領域そ のどちらも切断され、成熟配列になり、ジスルフィド結合が出来る、Ｎ末端延長 部分及びファミリーの中ではアミノ酸配列が高度に保存されたＣ末端ドメイン共 通の構造モチーフを共有している。

成熟２量体の形で、モルフオシエンは、一般に生理的条件下では、はとんど不溶 である。これらの蛋白質の溶解度を上昇させることは、治療薬としてモルフオシ エンの全身投与の効果を増強するので重要な医療の用途がある。血清アルブミン 、カゼインを含むいろいろなキャリア蛋白質は、モルフオシエンの溶解度を増加 させる事が知られている（例えば国際用１ｊＵｓ９２１０７４３２参照）。国際 比＠Ｕｓ９２１０５３０９　（ＷＯ９３１０００５０）では、成熟２量体のＢＭ Ｐ２の溶解度を増す各種のアミノ酸、及びそれらのメチルエステル及びグアニジ ン、塩化ナトリウム、ヘパリンなどを含む各種の溶解剤の利用について検討して いる。

形態形成性蛋白質の組み換え体発現の改善方法については、当該技術分野で努力 が続けられている。例えば、Ｈａｍｍｏｎｄｓら、　（１９９１）Ｍｏ１．Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎ、４：１４９−１５５やＷＯ９１／１８０４７には遺伝子組み換え のＢＭＰ２　ａ　／　Ｂ　Ｍ　Ｐ　−２ｂのハイブリッド遺伝子や哺乳動物の細 胞培養でそれらの発現が開示されている。ＢＭＰ−２ｂ成熟蛋白質の発現は、成 熟型のＢＭＰ−２ｂＤＮＡ配列の上流のＢＭＰ−２ａプロ領域をコードするＤＮ Ａ配列と結合する事により増強されることが判明した。

本発明の目的は高特異活性を有する形態形成性蛋白質を生産し、精製する方法、 及び、これらの蛋白質を含有する製剤組成と骨形成方法について改善を提供する 事にある。

他の目的は、本質的に形態形成蛋白質由来のアミノ酸配列からなる溶解型形態形 成蛋白質を提供する事にある。他の目的は、形態形成蛋白質の溶解型複合体を安 定化する製剤を提供する事にある。

さらに他の目的は、当該溶解型形態形成蛋白質と成熟形態形成蛋白質を識別する 手段を提供し、血清、脳を髄液、腹水などの体液中の当該蛋白質の定量方法を提 供し、これらの各種類を識別する事が出来るポリクロナルやモノクロナル抗体を 提供する事にある。

他の目的は体液中に存在するモルフオシエンや、内因性抗モルフオシエン抗体の 濃度を追跡するための抗体や生物学的診断方法を提供し及び体液中の当該蛋白質 の濃度の変動を検出するアッセイ法を提供することにある。Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎ ｔ　Ｎｏ、４，８５７，４５６や、Ｕｒｉｓｔらは（１９８４）Ｐｒ−笠エエ」 阻立匹、二【工」−二■ヱ」工、上工旦：４７２−４７５で骨形態形成蛋白質で あると思われる蛋白質を検出する血清のアッセイ法について論じている。この蛋 白質は、ここで言う形態形成蛋白質のファミリーの一員ではなく分子量、構造特 性、溶解度などで当該蛋白質とは異なる。

発凱■要對 哺乳動物細胞から培養培地へ分泌する形態形成蛋白質は、分泌蛋白質のかなりの 留分として溶解型蛋白質を含む事が判明し、そしてこの溶解型が非共有結合で少 なくとも一つの、好ましくは二つのプロドメインと結合している成熟２量体（そ れらの端を切った形のものも含む）からなることが判明した。さらに抗体が当該 蛋白質のこれらの二つ型を識別するのに使用できる事も判明した。これらの抗体 は、形態形成蛋白性の成熟型と溶解型を選択的に単離し、また産生される成熟型 と溶解型の量を定量する精製工程の一部として使用してもよい、これらの抗体は 、また体液中の形態形成蛋白質の濃度を追跡したり、各種の型の蛋白質濃度の変 動を検出する診断方法の一部として用いてもよい。抗体や蛋白質は、さらに、生 体中の各種のこれらの蛋白質に対する、内因性の抗モルフオシエン抗体の濃度を 検出、及び追跡する診断アッセイにも使用してもよい。

本発明の重要な具体例は形態形成活性を有する２量体構造の特定と関連する一対 のポリペプチドサブユニットからなる２量体蛋白質である。ここで特定されるよ うに、関連親出願にはモルフオシエンは、一般的には、形態学的に許容し得る環 境中では、以下のような生物学的な機能の全てが可能である：始原細胞の増殖を 促進する；分化細胞の増殖を促進する；そして分化細胞の成長と維持を支援する 。

２１体形態形成蛋白質の各サブユニットはモルフオシエンファミリーに特徴的な ７個以上のシスティン残基を有する、少な（とも１００個のアミノ酸ペプチド配 列からなる。好ましくは、少なくともサブユニットの一つは、モルフオシエンフ ァミリーの、又は対立形質遺伝子変異、若しくは種間変異若しくはキメラ型変異 、若しくは他の配列変種のプロ領域の一部、若しくは全部からなるペプチドと非 共有結合的に複合体を形成しているモルフオシエンファミリーの一員の、又はそ れらの対立形質遺伝子変異、種間変異の、若しくはそれらのキメラ型変異、若し くはそれらの他の配列変種の成熟型のサブユニットからなる。

その一対のサブユニットと一つの、好ましくは二つのプロ領域ペプチドが、水系 溶媒中で、複合体形成しない対のサブユニットより、より熔解性のある複合体を 形成する。

好ましくは、二つのサブユニットがモルフオジエンフ１ミリ−の一員の、又はそ れらの対立形質遺伝子変種、若しくは種間、若しくはそれらのキメラ型変異、若 しくはそれらの他の配列変種の成熟型サブユニットからなり、二つのサブユニ・ ントは非共有結合的にプロ領域の全部、若しくは一部からなるペプチドと複合体 を形成する。さらに好ましくは、各サブユニ・ノドがヒト０Ｐ−１の、又は種の 、若しくは対立形質の、若しくは他の配列変種の成熟型であり、およびプロｆｉ Ｉ域ペプチドがヒ）ＯＰ−１、又は種間変異若しくは対立形質遺伝子変異、キメ ラ型変異、又はそれらの他の配列変種のプロ領域の完全なまたは部分配列である 。現在のところ、好ましいプロ領域は、プロ領域の全長型である。プロ領域フラ グメントとしてはプロ配列の最初の（Ｎ末端から）１８アミノ酸を含むことが好 ましい。他の有用なプロ領域フラグメントはインタクトなプロ領域配列の端の切 れた配列である。切断はＡｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ、の蛋白分解酵素開裂 部位で起こる。当業者の通常の技術を有するものであれば、既知のモルフオシエ ンをコードしている遺伝子配列から、プロ領域をコードする有用な配列を得るこ と力咄来る。またはキメラ型プロ領域を、一つ以上の既知のモルフオシエン配列 から構築する事が出来る。さらに他の選択として、一つ以上の既知のプロ配列の 合成配列変種をつくることもできる。

ここで使用されるように、モルフオシエン蛋白の成熟型サブユニットはインタク トのＣ末端ドメインとインタクトあるＧ１は切断型のＮ末端延長部分を含む。例 えば、０Ｐ−１の有用な成熱配列はＳｅｑ　ＴＤ　Ｎｏ、１の残基２９３−４３ １で特定される。さらに、それらの切断配列をも含み、残基　３０〇−４３１， ３１３−４３１，３１５−４３１，３１６−４３１や３１Ｂ−４３１で特定され る配列を含む。この最後の配列は、Ｎ末端延長部分の配列の最後の約ｌＯ残基の みを保持することに注意しなければならない。図、２は、多くの好ましいモルフ オシエン配列のＮ末端延長部分を表す。切断が起こる可能性のある標準のＡｒｇ −Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇの切断箇所は、図のなかで、枠で囲まれているか、ア ンダーラインが引いである。

当業者の通常の技術を有するものであれば理解できるように成熟２量体は、異な るＮ末端切断部位を存するサブユニットの結合も含まれる。

他の溶解型のモルフオシエンは、当該蛋白質の（下記参照）未切断のプロ型の２ 量体や、２量体の一つのサブユニットが当該蛋白質の未切断プロ型であったり、 他のサブユニットが成熟型の蛋白質、好ましくは切断プロドメインと非共有結合 的に結合するそれらの切断型の半２量体（ｈｅｍｉ　−ｄ　ｉｍｅｒ）も含む。

本発明の溶解型蛋白質は、さらに哺乳類、特にヒトに投与する治療薬組成物の製 剤や、細胞サンプルや、これに限るものではないが血清、脳を髄液、腹水などの 体液中の当該蛋白質や、当該蛋白質に対する内因性の抗体の濃度の追跡のための 生物学的アッセイの開発に有用である。さらに本発明の他の目的や、特徴や有利 性は以下の詳細な説明より、より明確になる。

型皿■皿車呈五所 図１は配列をコードする核酸から発現される、モルフオシエンペプチド鎖の概要 の表現である。そこで、あやめ陰影線の範囲はシグナル配列を表す；点画部分は プロドメインを表し；あやめ線領域は成熟蛋白質のＮ末端じＮ末端延長部分”） を表し；なにもない部分は保存された７つのシスティンドメインと、縦縞線で示 された保存されたシスティンで特定される成熟蛋白質配列のＣ末端領域を表して いる； 図２は各種の成熟型のモルフオシエンのＮ末端延長部分の配列をリストしである 。

図３は哺乳動物細胞からＴＢＳ　（）リス緩衝生理食塩水）中でのＩＭＡＣおよ び、Ｓ−セファロースやＳ−２００ＨＲクロマトグラフイーで生産、精製した溶 解型モルフオシエン（ＯＰ−１）のゲル濾過カラムの溶出曲線である。ここで■ ｏはボイド容量で、Ａ　Ｄ　Ｈはアルコール脱水素酵素（分子量１５０キロタル トン）で、ＢＳＡは牛血清アルブミン（分子量６７キロダルトン）で、ＣＡが炭 酸脱水酵素（分子量２９キロダルトン）、ｃｙｔｃはチトクロムＣ（分子１１２ ゜５キロダルトン）である。

用廠至脱■ ここで本質的に当該蛋白質のアミノ酸配列から組成される溶解型の形態形成蛋白 質が本発明により判明した。溶解型はプロドメイン、またはそれらのフラグメン トからなる非共有結合的に結合している複合体で、形態形成活性を有する２量体 蛋白種と非共存結合的に結合し、または複合体を形成する。２００未満のアミノ 酸からなる２量体の各ポリペプチドは、それぞれＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１の残基 ３３０−４３１と３３５−４３１で特定される、少なくともＣ末端６、好ましく は７個のシスティン骨格からなる。好ましくは、２１体種のポリペプチド鎖は、 これらの配列の成熟型か、またはそれらの切断型からなる。好ましい切断型は、 インタクトのＣ末端ドメインを含み、少なくとも１０個のアミノ酸のＮ末端延長 部分配列からなる。これらの溶解型の形態形成蛋白質は、培養細胞培地や哺乳類 の体液から分離してもよいし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでつくってもよい。

ｉｎ　ｖｉｖｏの生理的条件下で、プロドメインは蛋白質の運搬性を高めるのに 利用してもよいし、蛋白分解酵素や、抗体を含むスカベンジャー分子から保護す るのに利用してもよい。

プロドメインは、さらに蛋白質を特定の組織へ標的化するのに役立ててもよいし 、共有受容体との相互作用でモルフオシエン細胞表面受容体に、モルフオシエン を発現させるのに利用してもよい。分離した蛋白質は治療用製剤、特に経口、非 経口投与用に使用してもよいし、内因性のモルフオシエンや、内因性の抗モルフ オシエン抗体のレベルを追跡する診断や、他の組織評価キットやアッセイの開発 に利用してもよい。

１員失、若しくは損傷した＆ｌｌｌ１！の再生の為や、ｍｓａ不全や、病気の組 織破壊的作用の阻害の為の治療における当該モルフオシエンの用途の詳細な説明 は　国際出願　ＵＳ９２１０１９６Ｂ（ＷＯ９２／１５３２３）；ＵＳ９２１０ ７３５Ｂ　（ＷＯ９２１０４６９２）　とＵＳ９２１０７４３２　（ＷＯ９２１ ０５７５１）に開示されている。参照によりここに組み入れられる。本発明の溶 解型のモルフオシエン複合体も含め、モルフオシエンは損失した、若しくは損傷 した骨、歯、歯周組織、肝臓、心臓、肺臓、神経組織を再生することや、免疫応 答と関連する組織破壊的な作用から、これらの組織を保護する為の治療の一部と して、特別なを用性を持っていると考えられている。当該蛋白質は骨粗鬆症や骨 軟化症や骨肉腫などの代謝性骨疾患の治療や；肝硬変、肝炎、アルコール性肝疾 患や肝炎性脳疾患などの肝疾患の治療や；虚血性再潅流関連の、特に、神経ある いは心臓組織などの組織損傷の治療や予防に、組織保護効果を発現する事が予測 される。

本発明の溶解型モルフオシエンに有用な好ましいＣ末端配列を特定している各種 の一般的な配列（一般的配列１−６）はＵＳＳＮ　０７／９２３．７８０、に開 示されており、参考に上記に組み入れた。現在のところ好ましい一般的な配列を 以下に示す。

下記に示されている一般的配列７　（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２０）と一般的配列 ８　（Ｓｅｑ、１．Ｄ　Ｎｏ、２１）は０Ｐ−１，０Ｐ−２，０Ｐ−３、ＣＢＭ Ｐ２Ａ、ＣＢＭＰ２Ｂ、ＢＭＰ３゜６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ５．ＢＭＰ ６．Ｖｒｇ−１、や　ＧＤＦ−１を含む現在までに同定されている好ましいモル フオシエン蛋白ファミリーの中で共有している相同性を備えている。これらの蛋 白質のアミノ酸配列はここに（配列リスト参照）、また当業者に、例えば国際出 願　公開　ＵＳ　９２１０７３５８、（ＷＯ９３１０４６９２）ＵＳ　９１１０ ７６３５（ＷＯ９２１０７０７３）にも開示されている。一般的配列は６と７個 のシスティン骨格によって特定されるＣ末端ドメインの配列が共通するアミノ酸 の同一性も、配列中の変異部位の互換性のある残基も含む。一般的配列４１位（ 一般的配列７）あるいは４６位（一般的配列８）のもう一つのシスティンを許容 し、分子間、分子内ジスルフィド結合が形成出来る適当なシスティン骨格を提供 し、蛋白質の３次元構造に影響する危険なアミノ酸を含有する。

現在のところ本発明の溶解型モルフオシエン複合体に有用なもっとも好ましい蛋 白質の配列はｈＯＰｌ　（例えばＳｅｑ、ＩＤＮｏ、１の残基３３５−４３１） の保存された６個のシスティン骨格を特定するアミノ酸配列と６０％以上、好ま しくは６５％以上の同一性を有する配列である。これらのもっとも好ましい配列 は狸々蝿６０Ａ蛋白質も含み、０Ｐ−１，０Ｐ−２の対立形質や種の変種を含む 。従って、本発明の他の好ましい点は、有用なモルフオシエンはいろいろな同定 された０Ｐ−１や０Ｐ−２（Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、２２）の種間で相同性を持っ ている　”ＯＰＸ’とここでは云われている一般的アミノ酸配列を有する各種の ポリペプチド鎖からなる活性蛋白質も含む。

本発明のさらに好ましい点は、有用なモルフオシエンがＯＰｌ、若しくはＯＰ２ の保存されたＣ末端のシスティンドメインをコードするＤＮＡ、若しくはＲＮＡ 配列と、例えば、それぞれ、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１と５のヌクレオチド１０ ３６−１３４とヌクレオチド１３９０−１６９５で特定されるが、厳密なハイブ リダイゼイションの条件下でハイブリダイズする核酸をコードするアミノ酸配列 からなる活性蛋白質を含む。ここで用いられるように、厳密なハイブリダイゼイ ションの条件とは３７°Ｃで一晩、４０％ホルムアルデヒド中で、５ｘＳＳＰＥ 。

５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．１％ＳＤＳでハイブリダイゼイションを行い５ ０°Ｃで０．１　ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄する。同様に本発明の他の 好ましい点は、有用なプロ領域ペプチドは、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１−１９に 列挙されているいずれの配列の、少なくともＮ末端の１８個のアミノ酸をコード するＤＮＡ、若しくはＲＮＡ配列と厳密な条件下でハイブリダイズする核酸をコ ードするアミノ酸配列からなるポリペプチド鎖を含む。

請求の範囲 １、単離された多量体蛋白質複合体であって：形態形成活性を有する蛋白質２量 体を形成するために結合する一対の蛋白質サブユニットで、 各該サブユニットは、ＳＱＥ、ＩＤ　Ｎｏ、１の残基３３５−４３１の、ヒトＯ Ｐ−１のＣ未ドメインの７個のシスティンドメインと少なくとも７０％のアミノ 酸配列相同性を有する、少なくとも１００アミノ酸配列を持ち、該サブユニット の少なくとも１つは、モルフオシエンファミリーに属する一つの、またはそれら のアミノ酸変種のサブユニットの成熟型からなり、 モルフオシエンファミリーに属する一つの、またはそれらのアミノ酸変種のプロ 領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していない対のサブ ユニットより水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成してなり、インビボで 形態形成活性を示す複合体 ２、当該両サブユニットともモルフオシエンファミリーに属する一つのサブユニ ットの成熟型またはそのアミノ酸変種がらなり、各サブユニットが該ペプチドと 非共有的に複合体を形成している、請求項１の複合体 ３、各、当該サブユニットが成熟型のヒト０Ｐ−１、又はそれらのアミノ酸変種 である請求項１記載の複合体４、ペプチドがヒトＯＰ−１のプロ領域またはそれ らのアミノ酸変種からなる請求項１．２、または３の複合体５、当該ペプチドが 、当該プロ領域を特定するアミノ酸配列の、少なくとも最初の１８のアミノ酸か らなる請求項１記載の複合体 ６、当該ペプチドが、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１−１６のプロ領域、又はそれら のアミノ酸変種を特定するアミノ酸配列の、少なくとも最初の１８のアミノ酸か らなる請求項１記載の複合体 ７、当該ペプチドが、当該プロ領域の全長からなる請求項１、又は６記載の複合 体 ８、当８亥プロ領域ペプチドが、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１の３０＝４８．３０− ２９２、及び４Ｂ−２９２残基で特定される配列から選択されたアミノ酸配列か らなる請求項１記載の複合体 ９、当３亥プロ領域へブチドが、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、１−１９のプロ領域配 列のＮ末端の１８のアミノ酸をコードするＤＮＡと厳密な条件下でハイブリダイ ズする核酸によりコードされるアミノ酸配列からなる請求項１記載の複合体１０ 、当！亥プロ９■域ペプチドが、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１の１３６−１９２の、 若しくはＳｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、５の１５７−２１１のヌクレオチドにより特定さ れるＤＮＡと厳密な条件下でハイブリダイズする核酸からなる請求項１、又は９ 記載の複合体 １１、当該サブユニットが、少なくとも２つの異なるモルフオシエンファミリー のメンバー由来のアミノ酸配列からなる請求項１記載の複合体 １２、当該ペプチドが、少なくとも２つの異なるモルフオシエンファミリーのメ ンバー由来のアミノ酸配列からなる請求項１記載の複合体 １３、（削除） １４、　ｆｉｅｆサブユニットのアミノ酸配列が、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ。

１の残基３３５−４３１の配列と６０％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸 配列からなる請求項１記載の複合体１５、当該サブユニットが、Ｓｅｑ、ＩＤ　 Ｎｏ、５−１９のいずれの配列でも特定される成熟型サブユニットからなる請求 項１記載の複合体 １６、当該す７’　ユニットが、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１のヌクレオチド１０３ ６−１３４１又は　Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、５のヌクレオチド　１３９０−１６９ ５　により特定されるＤＮＡとハイブリダイズする核酸によりコードされるアミ ノ酸配列からなる請求項１記載の複合体 １７、当該複合体の安定性を増強する分子を、さらに含む請求項１記載の複合体 １Ｂ、請求項１．２．５−９、又は１１−１７のいずれかの多量体蛋白質からな る治療剤組成 １９、当該サブユニットが、成熟型ヒト０Ｐ−１、又はそれらのアミノ酸変種で ある請求項１記載の複合体からなる治療剤組成 ２０、当該ペプチドが、ヒト０Ｐ−１のプロ領域の一部、若しくは全部、又はそ れらのアミノ酸変種からなる請求項１記載の複合体からなる治療剤組成 ２１、当該サブユニットが、Ｓｅｑ、ＩＤ　Ｎｏｓ、５−１９の配列のいずれか により特定されるサブユニットの成熟型からなる請求項１記載の複合体からなる 、請求項１８記載の治療剤組成 ２２、請求項３．４、又は１０の蛋白質からなる治療剤組成２３、さらに補助因 子からなる請求項１８、又は２２の治療剤組成 ２４、当該補助因子が症状緩和補助因子である請求項２３の治療剤組成 ２５、組織不全を診断する、または哺乳類の損失した若しくは損傷した組織の再 生治療の効果を評価するキットであって、以下のものからなるキット： ａ）当該哺乳類からの細胞又は体液サンプルを採取する手段、 ｂ）当該サンプル中の溶解型モルフオシエン複合体と特異的に相互作用する結合 蛋白質で、当該複合体が、形態形成活性を有する蛋白質２置体を形成するために 結合する一対の蛋白質サブユニットで、 各該サブユニットは、ＳＱＥ、ＩＤ　Ｎｏ、１の残基３３５−４３１の、ヒト０ Ｐ−１のＣ未ドメインの７個のシスティンドメインと少なくとも７０％のアミノ 酸配列相同性を有する、少なくとも１００アミノ酸配列を持ち、該サブユニット の少なくとも１つは、モルフオシエンファミリーに属する一つの、またはそれら のアミノ酸変種のサブユニットの成熟型からなり、 モルフオシエンファミリーに属する一つの、またはそれらのアミノ酸変種のプロ 領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していない対のサブ ユニットより水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成してなり、Ｃ）当該溶 解型モルフオシエン複合体に結合した結合蛋白質を検出する手段 ２６、当該結合蛋白質が、抗体である請求項２５記載のキ・ノド２７、組織の状 態を評価する方法であって、体液サンプル中の成熟モルフオシエンと請求項１の 多量体複合体を識別する抗体を用いてモルフオシエンを検出して、体液サンプル 中のモルフオシエンの量を対照サンプル中のモルフオシエン量を比較する工程か らなる方法。

２８、　Ｉｌｉ乳類の損失または損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法 であって、体液サンプル中の成熟モルフオシエンと請求項１の多量体複合体を識 別する抗体を用いてモルフオシエンを検出して、体液サンプル中のモルフオシエ ンの量を対照サンプル中のモルフオシエン量を比較する工程からなる方法 ２９、＠乳類のＵｔａ不全を診断する方法であって、体液サンプル中の成熟モル フオシエンと請求項１の多量体複合体を識別する抗体を用いてモルフオシエンを 検出して、体液サンプル中のモルフオシエンの量を対照サンプル中のモルフオシ エン量を比較する工程からなる方法 ３０、（削除） ３１、当該モルフオシエン量が、イムノアッセイで検出される請求項２５、又は ２６記載のキット ３２、当該モルフオシエン量が、サンプル液中の熔解型モルフオシエンを成熟モ ルフオシエンから識別する抗体により検出する請求項２５、又は２６記載のキッ ト ３３、当該体液サンプルが血清からなる請求項２５、又は２６記載のキット ３４、当該組織不全が、骨組織不全である請求項２５、又は２８記載のキット ３５、当該骨組織不全が骨肉腫、骨粗鬆症及びパンエツト病からなる群より選択 される請求項３４記載のキット３６、組織の状態を評価する方法で、組織、又は 体液サンプル中の、請求項１記載の多量体蛋白質複合体と結合する抗体の存在を 検出する工程よりなる方法 ３７．１員失、若しくは損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法で、組織 、若しくは体液サンプル中の、請求項１記載の多量体蛋白質複合体と結合する抗 体の存在を検出する工程よりなる方法 ３８、組織不全を診断する方法で、＆ｔＩ織、又は体液サンプル中の、請求項１ 記載の多量体蛋白質複合体と結合する抗体を検出する工程よりなる方法 ３９、組織不全を診断する、又は哺乳類の損失した、若しくは損傷した＆Ｉｉ織 の再生治療の効果を評価するキットで、以下のものからなるキット： ａ）当該哺乳類からの細胞、あるいは体液サンプルを採取する手段 ｂ）当該サンプル中の内因性抗モルフオシエン抗体と特異的に相互作用する事が 出来る結合蛋白質Ｃ）当該内因性抗モルフオシエン抗体に結合した結合蛋白質を 検出する手段 ４０、単離された多量体蛋白質複合体であって：形態形成活性を有する蛋白質２ 量体を形成するために結合する一対の蛋白質サブユニ７）で、 各該サブユニットは、−設配列７、ＳＱＥ、ＩＤ　Ｎｏ。

２０で特定されるアミノ酸配列を有する、少なくとも１００アミノ酸配列を持ち 、 該サブユニットの少なくとも１つは、アミノ酸変種を含むモルフオシエンファミ リーに属する一つのプロ領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を 形成していない対のサブユニットより水溶液中ではより溶解性のある複合体を形 成してなり、生理的条件下で形態形成活性を示す複合体４１、各、当該サブユニ ットが当該ペプチドと非共有結合で結合している請求項４０記載の複合体 ４２、単離された多量体蛋白質複合体であって：形態形成活性を有する蛋白質２ ｉｔ体を形成するために結合する一対の蛋白質サブユニットで、 各該サブユニットは、−設配列８、ＳＱＥ、ＩＤ　Ｎｏ。

２１で特定されるアミノ酸配列を有する、少なくとも１００アミノ酸配列を持ち 、 該サブユニットの少なくとも１つは、アミノ酸変種を含むモルフオシエンファミ リーに属する一つのプロ領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を 形成していない対のサブユニットより水溶液中ではより溶解性のある複合体を形 成してなり、生理的条件下で形態形成活性を示す複合体４３、各、当該サブユニ ットが当該ペプチドと非共有結合で結合している請求項４２記載の複合体 ４４、単離された多量体蛋白質複合体であって：形態形成活性を有する蛋白質２ 量体を形成するために結合する一対の蛋白質サブユニットで、 各該サブユニットは、ＯＰＸ、ＳＱＥ、ＩＤ　Ｎｏ、２２で特定されるアミノ酸 配列を有する、少なくとも１００アミノ酸配列を持ち、 該サブユニットの少なくとも１つは、アミノ酸変種を含むモルフオシエンファミ リーに属する一つのプロ領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を 形成していない対のサブユニットより水溶液中ではより溶解性のある複合体を形 成してなり、生理的条件下で形態形成活性を示す複合体４５、各、当該サブユニ ットが当該ペプチドと非共有結合で結合している請求項４４記載の複合体 ４６、それらのアミノ酸変種も含み、当該２量体の一つのサブユニットがＳｅｑ 、ＩＤ　Ｎｏ、１　（ＯＰＩ）の残基３３〇−４３１及び他のサブユニットがＳ ｅｑ、ＩＤ　Ｎｏ、１０（ＢＭＰ２）の残基２９５−３９６、又はＳｅｑ、ＩＤ 　Ｎｏ。

１１　（ＢＭＰ４）の残基３０Ｂ−４０８からなる請求項１記載の多量体蛋白質 複合体 ４７、それらのアミノ酸変種も含み、当該２量体の一つのサブユニットがＳｅｑ 、ＩＤ　Ｎｏ、１　（ＯＰＩ）の残基３３ｏ−４３１及び他のサブユニットがＳ ｅｑ、１０　Ｎｏ、１０（ＢＭＰ２）の残基２９５−３９６、又はＳｅｑ、ＩＤ 　Ｎｏ。

１１　（ＢＭＰ４）の残基３０Ｂ−４０８からなる請求項１記載の多量体蛋白Ｊ ｆ？３１合体からなる治療剤組成４８、当該ペプチドが、それらのアミノ酸変種 も含み、ＢＭＰ２、若しくはＢＭＰ４のプロ領域の一部、若しくは全部からなる 請求項４６、又は４７記載の多量体蛋白質複合体４９、当該ペプチドがヒト０Ｐ −１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、若しくはそれらのアミノ酸変種の、プロ領域の一部 、若しくは全部からなる請求項４６、又は４７記載の多量体蛋白質複合体５０、 当該モルフオシエン量がイムノアッセイで検出される請求項２７、又はは２８記 載の方法 ５１、当該体液サンプルが血清からなる請求項２７、又は２８記載の方法 ５２、当該組織不全が骨組織不全である請求項２９の方法５３、当該骨組織不全 が骨肉腫、骨粗■症及びパジエノト病からなる群から選択される請求項５２記載 の方法フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｄ　９２８４−４ＣＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８ＧＯＩＮ　３３ １５３　Ｄ　７０５５−２Ｊ（３１）優先権主張番号　０４０．５１０（３２） 優先臼　１９９３年３月３１日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ。

ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，Ｌ Ｋ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、ＰＴ 、　ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ ＦＩ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＢＪ （７２）発明者　ルーガー、ディヴッド　シー。

アメリカ合衆国　０１７４８　マサチューセッツ、ホブキントン、ダウネイ　ス トリート（７２）発明者　オバーマン、バーマンアメリカ合衆国　０２０５３　 マサチューセッツ、メトウェイ、サマー　ヒル　ロード（７２）発明者　オズカ イナック、エンジンアメリカ合衆国　０１７５７　マサチューセッツ、ミルフォ ード、パーデユー　ドライブ躬 （７２）発明者　クベラサムパス、サンゲーベルアメリカ合衆国　０２０５３　 マサチューセッツ、メトウェイ、スプリング　ストリートシックス

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．形態形質活性を有する特定された２量体構造と関連する一対の蛋白質サプユ ニットからなり、 各該サプユニットはモルフォジェンファミリーに特徴的なシステイン残基パター ンを有する少なくとも１００アミノ酸配列からなり、 該サプユニットのすくなくとも１つはモルフォンファミリーの一員又は対立形質 遺伝子変異、種間変異若しくはそれらの配列変異のサプユニットの成熟型からな り、モルフォジェンファミリーの一員又は種の若しくはそれらの配列変種のプロ 領域からなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していないサプユニ ット対より水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成する２量体蛋白質。
2. ２．当該サプユニットが共にモルフォジェンファミリーの一員又は対立形質の、 又は種の若しくはそれらの配列変種であるサプユニッドの成熟型からなり、該ペ プチドと非共有的に複合体を形成する請求項１の蛋白質。
3. ３．各、当該サプユニットが成熟型のヒトＯＰ−１、又は種の、若しくは対立形 質のそれらの変種である請求項１記載の蛋白質。
4. ４．ペプチドがヒトＯＰ−１のプロ領域、又は種間変異、若しくは対立形質遺伝 子変異、若しくは配列のそれらの変異からなる請求項１、２、又は３記載の蛋白 質
5. ５．当該ペプチドが、当該プロ領域を特定するアミノ酸配列の少なくとも最初の １８のアミノ酸からなる請求項１記載の蛋白質。
6. ６．当該ペプチドが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏｓ．１−１６のプロ領域、又はその配列 変種を特定するアミノ酸配列の少なくとも最初の１８のアミノ酸からなる請求項 １記載の蛋白質。
7. ７．当該ペプチドが、当該プロ領域の全長からなる請求項１、又は６記載の蛋白 質。
8. ８．当該プロ領域ペプチドが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１の残基３０−４８、３０− ２９２、及び４８−２９２で特定される配列から選択されたアミノ酸配列からな る請求項１記載の蛋白質。
9. ９．当該プロ領域ペプチドが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏｓ．１−１９のプロ領域配列の Ｎ末端の１８のアミノ酸をコードするＤＮＡと厳密な条件下でハイプリダイズす る核酸によりコードされるアミノ酸配列からなる請求項１記載の蛋白質。
10. １０．当該プロ領域が、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１の１３６−１９２の、又はＳｅｑ ．ＩＤＮｏ．５の１５７−２１１のヌクレオチドにより特定されるＤＮＡと厳密 な条件下でハイプリダイズする核酸からなる請求項１、又は９記載の蛋白質。
11. １１．当該サプユニット配列変種が、キメラ型モルフォジェンアミノ酸配列から なる請求項１記載の蛋白質。
12. １２．当該ペプチドが、キメラ型プロ領域アミノ酸配列からなる請求項１記載の 蛋白質。
13. １３．当該サプユニットが、一般配列７、又は一般配列８で特定される配列から なる請求項１記載の蛋白質。
14. １４．当該サプユニットが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１の残基３３５−４３１で特定 される配列と６０％のアミノ酸同一性を有する配列からなる請求項１記載の蛋白 質。
15. １５．当該サプユニットが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．５−１９のいずれかの配列で特 定される成熟型サプユニットからなる請求項１記載の蛋白質。
16. １６．当該サプユニットが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏ．１のヌクレオチド１０３６−１ ３４１、又はＳｅｑ．ＩＤＮｏ．５のヌクレオチド１３９０−１６９５により特 定されるＤＮＡとハイプリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列から なる請求項１記載の蛋白質。
17. １７．当該複合体の安定性を増強する事が出来る分子をさらに含む請求項１記載 の蛋白質。
18. １８．請求項１、２、５−９、又は１１−１７のいずれかの蛋白質からなる治療 剤組成。
19. １９．各当該サプユニットが、成熟型ヒトＯＰ−１、又は種の、若しくは対立形 質のそれらの変種である請求項１記載の蛋白質からなる治療剤組成。
20. ２０．当該ペプチドが、ヒトＯＰ−１のプロ領域の一部、若しくは全部、又は種 間変異、若しくは対立形質遺伝子変異からなる請求項１記載の蛋白質からなる、 治療剤組成。
21. ２１．当該サプユニットが、Ｓｅｑ．ＩＤＮｏｓ．５−１９のいずれかの配列で 特定されるサプユニットの成熟型からなる請求項１記載の蛋白質からなる、請求 項１８記載の治療剤組成。
22. ２２．請求項３、４、又は１０の蛋白質からなる治療剤組成。
23. ２３．さらに補助因子を含有する請求項１８、又は２２の治療剤組成。
24. ２４．当該補助因子が症状緩和補助因子である請求項２３の治療剤組成。
25. ２５．組織不全を診断する、又は哺乳類の損失した、若しくは損傷した組織の再 生治療の効果を評価するキットで、以下のものからなるキット； ａ）当該哺乳類からの細胞、又は体液サンプルを採取する手段。 ｂ）当該サンプル中の溶解型モルフォジェン複合体と特異的に相互作用する事が 出来る結合蛋白質。 ｃ）当該溶解型モルフォジェン複合体に結合した結合蛋白質を検出する手段。
26. ２６．当該結合蛋白質が、抗体である請求項２５記載のキット。
27. ２７．組織の状態を評価する方法で、体液サンプル中のモルフォジェン量と対照 サンプル中のモルフォジェン量を比較する工程からなる方法。
28. ２８．哺乳類の損失、又は損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法で、体 液サンプル中のモルフォジェン量を対照サンプル中のモルフォジェン量と比較す る工程からなる方法。
29. ２９．哺乳類の組織不全を診断する方法で、体液サンプル中のモルフォジェン量 を対照サンプル中のモルフォジェン量と比較する工程からなる方法。
30. ３０．当該モルフォジェンが、形態形質活性を有する特定された２量体構造と関 連する一対の蛋白質サプユニットからなる２量体蛋白質であり、 各該サプユニットはモルフォジェンファミリーに特徴的なシステイン残基パター ンを有する少なくとも１００アミノ酸配列からなり、 該サプユニットのすくなくとも１つはモルフォンファミリーの一員又は対立形質 遺伝子変異、種間変異若しくは配列の変異のサプユニットの成熟型からなり、モ ルフォジェンファミリーの一員又は種の若しくはそれらの配列変異のプロ領域か らなるペプチドと非共有的に結合して、複合体を形成していないサプユニット対 より水溶液中ではより溶解性のある複合体を形成する、請求項２５、２６、２７ または２８の発明。
31. ３１．当該モルフォジェン量が、イムノアッセイで検出される請求項２５、２６ 、２７、又は２８記載の発明。
32. ３２．当該モルフォジェン量が、サンプル液中の溶解型モルフォジェンを離別す る事が出来る抗体により検出する請求項２５、２６、２７、又は２８記載の発明 。
33. ３３．当該体液サンプルが血清からなる請求項２５、２６、２７、又は２８記載 の発明。
34. ３４．当該組織不全が、骨組織不全である請求項２５、又は２８記載の発明。
35. ３５．当該骨組織不全が骨肉腫、骨粗鬆症及びバジェット病からなる群より選択 される請求項３４記載の発明。
36. ３６．組織の状態を評価する方法で、組織、又は体液サンプル中の抗モルフォジ ェン抗体の存在を検出する工程よりなる方法。
37. ３７．損失、又は損傷した組織の再生治療の効果を評価する方法で、組織あるい は体液サンプル中の抗モルフォジェン抗体の存在を検出する工程よりなる方法。
38. ３８．組織不全を診断する方法で、組織、又は体液サンプル中の抗モルフォジェ ン抗体を検出する工程よりなる方法。
39. ３９．組織不全を診断する、又は哺乳類の損失した、若しくは損傷した組織の再 生治療の効果を評価するキットで、以下のものからなるキット； ａ）当該哺乳類からの細胞、又は体液サンプルを採取する手段。 ｂ）当該サンプル中の内因性抗モルフォジェン抗体と特異的に相互作用する事が 出来る結合蛋白質。 ｃ）当該内因性抗モルフォジェン抗体に結合した結合蛋白質を検出する手段。