JPH07508733A - 白血病抑制因子結合蛋白 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 白血病抑制因子結合蛋白 本発明は、白血病抑制因子結合蛋白質（ＬＢＰ）、特に可溶性ＬＢＰ、その用途 およびこれを含む組成物に関するものである。

白血病抑制因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）は多機能性糖蛋白であり、ある種の骨髄性白血病 セルラインにおける分化の誘導、正常胚性幹細胞における分化の抑制、骨芽細胞 およびＤＡ−１造血細胞の増殖刺激および巨核球前駆体に対するインターロイキ ン−３（ＩＬ−３）の増殖作用の強化を含シ広範なタイプの組織および細胞に対 する作用をもつ。機能的には、上記因子は、アドレナリン作動性からコリン作動 性モードへ自律神経のシグナル伝達を切り替え、骨からのカルシウム放出を刺激 し、肝細胞による急性期蛋白の産生を刺激し、脂肪細胞１へのリボ蛋白質リパー ゼによる脂質輸送を抑制することによって脂肪蓄積の喪失を誘導することができ る。

ＬＩＦの全既知標的組織において同調応答を必要とするあらゆる状況を想定する ことは難しいため、この作用配列は不可解である。従って、ＬＩＦの作用は、恐 ら（はＬＩＦ産生細胞およびＬＩＦ応答細胞の同時局在により制限されるように 設計されていると思われ、ＬＩＦ産生は厳重に調節されている。しかしながら、 かかる配列の結果、ＬＩＦは、血液および他の体液を含む循環系へある程度放出 されると思われる。

本発明に至るまでの研究において、本発明者らは、ＬＩＦの生物活性を抑制し得 る血清中のＬＩＦ結合蛋白質を発見した。このＬＩＦきっ抗物質が同定されたた め、現在ではＬＩＦ治療における抑制力が大きくなり、治療上望ましくない局所 投与されたＬＩＦの何らかの全身作用は阻止され得る。本発明はまた、ＬＩＦ関 連疾患または症状の処置に有用な新規薬剤を提供する。一実施態様において、本 発明者らは、ＬＩＦ結合蛋白の抑制効果が、異種系、すなわち−は乳類から得ら れたＬＩＦ結合蛋白質が別のは乳類におけるＬＩＦ抑制に使用される場合により 著しくなり得ることを見出した。

従って、本発明の一態様は、は乳類から単離され得る可溶性形態のＬＩＦ結合蛋 白１ｔ（ＬＢＰ）を提供する。

さらに特定すれば、本発明は、第一は乳動物種から得られる可溶性形態の分離Ｌ ＢＰに関するものであって、前記ＬＢＰは、その前記第一は乳動物種由来のしＩ ＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、第 二は乳動物種由来のＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制するこ とができる。

分離ＬＢＰは、重量、生物活性または他の慣用的測定手段により測定されたとこ ろによると、好ましくは、それが溶液または組成物中で分子の少なくとも２０％ 、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、より一層 好ましくは少なくとも８５％を占めるという意味で生物学的に純粋である。ＬＢ Ｐは分離されているが、それはまた組成物形態の場合もあり得る。本発明のこの 態様によると、第一は乳動物種から得られる可溶性形態のＬＢＰを含む組成物が 考えられる。ここで前記ＬＢＰは、それが前記第一は乳動物種からのＬＩＦがＭ １骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて第二は乳動 物種由来のＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制し得、前記組成 物はＬＢＰ特性をもたない蛋白質分子を実質的には含まない。

第一は乳動物種から得られる可溶性形態の分離ＬＢＰは、さらに、このＬＢＰが 、前記の第一は乳動物種由来のＬＩＦに関する結合親和力と比べた場合第二は乳 動物種からのＬＩＦに関して少なくとも１００倍高い結合親和力を有することを 特徴とする。

本発明によると、第一は乳類は、好ましくはヒト、マウスまたはラットまたは他 のネズミ科動物、ブタ、ウシ、ヒツジまたは他の反すう動物、ヤギ、ウマまたは 霊長動物である。また第二は乳類は、ヒト、マウスまたはラットまたは他のネズ ミ科動物、ブタ、ウシ、ヒツジまたは他の反すう動物、ヤギ、ウマまたは霊長動 物であり得る。好ましくは、第一は乳類はヒト以外のは乳類であり、第二は乳類 はヒトである。最も好ましくは、第一は乳動物種はマウスであり、第二は乳動物 種はヒトである。

従って、好ましい態様において、本発明は、ネズミ科動物から単離され得る可溶 性形態のＬＢＰに関するものである。さらに特定すれば、本発明は、ネズミ科動 物から単離され得る可溶性形態のＬＢＰを提供し、前記ＬＢＰは、ネズミＬＩＦ と比べてヒトＬＩＦをより強力に抑制し得る。

分離ＬＢＰは、自然に存在する分子、自然に存在する誘導体、その一部または断 片であり得るか、または組換えまたは合成誘導体、その一部または断片を含む分 子の組換えまたは合成形態であり得る。ＬＢＰは、天然グリコノル化、部分的グ リコリル化または非グリコリル化され得るか、または自然に存在する分子から改 変されたグリコジル化パターンを有し得る。この分子に対し、例えばＮ−グリカ ナーゼ処理を施した結果、脱グリコジル化または実質的脱グリコジル化分子が生 成され得る。ここでＬＢＰの「誘導体」は、一般に、自然に存在する配列に対す るアミノ酸残基の単一または多数のアミノ酸挿入、欠失および／または置換、ま たはＬＢＰに伴う分子、例えば炭水化物部分の挿入、欠失および／または置換を 含むものと考えられる。「誘導体」はまた、ＬＢＰのアミノ酸配列と少な（とも ４５％のアミノ酸配列類似性をもつ分子であると考えられる。

ＬＢＰのアミノ酸挿入誘導体は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合体 並びに単一または多数のアミノ酸の配列内挿入体を含む。挿入アミノ酸配列変異 体は、１個またはそれ以上のアミノ酸残基が蛋白中の予め定められた部位へ導入 されているものであるが、生成した産物の適当なスクリーニングで無作為な挿入 も可能である。欠失変異体は、配列から１個またはそれ以上のアミノ酸が除去さ れていることを特徴とする。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１個の 残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されているものである。典型的な 置換は、下記表１に従い行なわれたものである。

表１ アミノ酸置換に好適な残基 もとの残基　例示的置換 Ａ　ｌａ　Ｓ　ｅｒ Ａｒｇ　Ｌｙｓ Ｈｉｓ　Ａｓｎ５Ｇｉｎ Ｌｙｓ　ＡｒｇＳＧｉｎ、　Ｇｌｕ Ｍｅｔ　、Ｌｅｕ、　Ｉ　１ｅ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ、　Ｌｅｕ、　Ｔｙｒ Ｌ’ＢＰがアミノ酸置換により誘導体化されている場合、アミノ酸１よ、一般１ こ類似特性、例えば疎水性、親水性、電気陰性、巨大側鎖などを有する他のアミ ノ酸により置換される。アミノ酸置換は典型的には単−残基番二関して行なわれ る。アミノ酸挿入は通常的１−１０アミノ酸残基の程度であり、欠失１よ糸り１ −２０残基の範囲である。好ましくは、欠失または挿入は隣接対で行なわれ、す なわち２残基の欠失または２残基の挿入となる。

上記に示されたアミノ酸変異体は、当業界ではよ（知られｔこペプチド合成技術 、例えば固相ペプチド合成（１４）などを用いて、また（ま組換えＤＮＡ操（乍 （こより容易に行なわれ得る。既知または部分的既知配列を有するＤＮＡで予め 定められた部位における置換突然変異誘発技術は公知であり、例えばＭ１３突然 変異変異性がある。置換、挿入または欠失変異体として現れる変異蛋白質を製造 するためのＤＮＡ配列の操作は、好都合には例えばマニアチス等（”　）に記載 されている。

本発明ＬＢＰの組換えまたは合成突然変異体および誘導体の他の例は、ＬＢＰに 伴う分子、例えば炭水化物、脂質および／または蛋白質またはポリペプチドの単 一または多数の置換、欠失および／または付加を含む。

−態様において、ＬＢＰにおけるそのカルボキシ末端先端部分が先端切除される ことにより、前記ＬＢＰは可溶性にされている。

別の態様において、ＬＢＰは、前記第一および第二は乳動物種から得られたＬＢ Ｐ間の融合分子である。

この態様によると、ＬＢＰを特定する融合ポリペプチドが提供され、前記融合ポ リペプチドは第一および第二アミノ酸配列を含む。ここで、前記第一アミノ酸配 列は第一は乳動物種からのＬＢＰから誘導され得、前記第二アミノ酸配列は第二 は乳動物種からのＬＢＰから誘導され得、この場合、前記第一は乳動物種からの ＬＢＰは、それが前記第一は乳動物種からのＬＩＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分 化を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、前記第二は乳動物種からのＬＩＦ の同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制することができるため、前記融合 ポリペプチドは、前記第一は乳動物種からのＬＩＦよりもかなりの程度まで前記 第二は乳動物種からのＬＩＦを抑制する能力を保持している。

好ましい態様において、第一は乳動物種は、マウス、ラットまたは他のネズミ科 動物、ブタ、ウシ、ヒツジまたは他の反すう動物、ヤギ、ウマまたは霊長動物で あり、第二は乳動物種はヒトである。最も好ましくは、第一は乳動物種はマウス であり、融合ポリペプチドはマウスＬＢＰの「ヒト化」形態として称される。上 記分子は、前記第二は乳類からのＬＢＰを前記第一は乳類に投与することにより 抗原性免疫応答の可能な誘導を回避または軽減する場合に特に有利である。

本発明のこの最も好ましい態様によると、ＬＢＰを特定する融合ポリペプチドが 提供され、前記融合ポリペプチドは第一および第二アミノ酸配列を含む。ここで 前記第一アミノ酸配列はマウスからのＬＢＰから誘導され得、前記第二アミノ酸 配列はヒトからのＬＢＰから誘導され得、この場合、前記融合ポリペプチドは、 それがマウスＬＩＦがＭ１骨髄性白血病細胞分化を誘導する能力を抑制し得る度 合と比べて、ヒト由来のＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制し 得、そしてヒトへ前記融合ポリペプチドを投与すると、天然または組換えマウス ＬＢＰをヒトに投与した場合と比べて前記融合ポリペプチドに対する免疫応答は 実質的に低減化される。好都合には、「免疫応答」は、分子に特異的な抗体の力 価により測定され、および／または細胞免疫応答の範囲を含む。

融合ポリペプチドは、ある範囲の適当な方法により製造され得るが、好都合には 、ｈＬＩＦレセプターα鎖への結合性および図９で概略を示した実験で報告され たものに類似したマウスＬＩＦレセプターα鎖（ｍＬＢＰ）への非常に高い親和 力による結合性の両方を付与するｈＬＩＦ分子上の部位に関する地図を作成すべ （発明者らにより使用される方法と類似した方法により製造される。特に、ｈＬ ＢＰ分子フレーム構造を用いて一連のマウス−ヒトｍＬＢＰキメラ分子を構築す ることにより、ｈＬＢＰ配列への置換に必要なｈＬＩＦアミノ酸残基の最小数が 決定され、ｈＬＢＰ独特の特性を有する分子が作成される。

請求の範囲を含む本明細書中におけるｒＬＢＰＪという表示は、上記ＬＢＰを特 定する融合ポリペプチドを指すものを包含する。

また、「類似体」および「誘導体」という語は、そのインビボまたはインビトロ での高い安定性および／または効力を特徴とするＬＢＰの機能的化学均等物質を 包含する。「類似体」および「誘導体」という語はまた、上記ＬＢＰのアミノ酸 誘導体を包含する。

ここで考えられるＬＢＰの類似体は、側鎖への修飾、非天然アミノ酸の組み込み および／または分子の誘導体化並びにＬＢＰ分子またはその類似体に立体配座的 拘束を強いる架橋剤および他の方法の使用を含むが、これらに限定されるわけで はない。本発明により考えられる側鎖修飾の例には、例えばアルデヒドとの反応 、次いでＮａＢＨ４での還元による還元的アルキル化、メチルアセチミデートに よるアミド化、無水酢酸によるアシル化、シアネートによるアミノ基のカルバモ イル化、２．４．６−　トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミ ノ基のトリニトロベンジル化、こはく酸無水物およびテトラヒドロフタル酸無水 物によるアミノ基のアシル化、およびピリドキサルー５°−燐酸によるリジンの ビオチニル化、次いでＮａＢＨｓでの還元によるアミノ基の修飾がある。

アルギニン残基のグアニジノ基は、試薬、例えば２．３−ブタンジオン、フェニ ルグリオキサルおよびグリオキサルとの複素環縮合生成物の形成により修飾され 得る。

カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成によるカルボジイミド活性化、次い で例えば対応するアミドへの後続的誘導体化により修飾され得る。

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメ チル化、システィン酸への過蟻酸酸化、他のチオール化合物との混合ジスルフィ ドの形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、４ −クロロ水銀ベンゾエート、４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル 水銀、２−クロロ水銀−４−二トロフェノールおよび他の水銀剤を用いた水銀誘 導体の形成、アルカリｐＨでのシアネートによるカルバモイル化といった方法に より修飾され得る。

トリプトファン残基は、例えばＮ−ブロモスクシンイミドによる酸化または２− ヒドロキシ−５−ニトロベンジルプロミドまたはスルフェニルハライドによるイ ンドール環のアルキル化により修飾され得る。他方チロシン残基は、テトラニト ロメタンによるニトロ化により改変され、３−ニトロチロシン誘導体が形成され 得る。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化 またはジエチルピロカルボネートによるＮ−カルボエトキシル化により達成され 得る。他のタイプの修飾としては、チロシンのヨウ素化およびリジンのビオチニ ル化がある。

蛋白合成中における非天然アミノ酸および誘導体の組み込みの例には、ノルロイ シン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、６ −アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリノン、ノルバリン、フェニルグリノン、オ ルニチン、サルコツン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルへブタン酸、 ２−チェニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用があるが、こ れらに限定されるわけではない。

架橋剤は例えば３Ｄ立体配座を安定化するのに使用され得、ホモ２官能架橋剤、 例えば（ＣＨｚ）ｎスペイサ−基（ただし、ｎ＝ｌ〜ｎ＝６）を有する２官能イ ミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキノスクシンイミドエステル、 および普通はアミノ反応性部分、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび別 の基特異的反応性部分、例えばマレイミドまたはジチオ部分（ＳＨ）またはカル ボジイミド（Ｃ○○Ｈ）を含むヘテロ２官能試薬が用いられる。さらに、ペプチ ドは、例えばＣおよびＮ　−メチルアミノ酸の組み込み、アミノ酸のＣおよびＣ β原子間α　α　α の二重結合の導入、および共有結合の導入、例えばＮおよびＣ末端間、２側鎖間 または側鎖およびＮまたはＣ末端間のアミド結合形成による環状ペプチドまたは 類似体の形成により立体配座的に拘束され得る。

本発明のＬＢＰ分子はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の均等 または類似脂肪酸を用いてＰＥＧ修飾（ｐｅｇｏｌａｔｅ）されることにより、 蛋白の安定性および／または半減期の増加を促進し得る。この点について、好都 合には、ＰＥＧを用いてインターロイキン１のインビボ半減期を増加させる方法 について報告しているアメリカ合衆国特許第５０８９２６１号を参考にすること ができる。

好都合には、ＬＢＰは、血液、血清または他の生物学的液体試料からの精製また は手積製形態であり得る。より好都合には、ＬＢＰは、固定ＬＩＦカラムによる アフィニティー・クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、サイ ズ排除クロマトグラフィーおよびプレバラティブ天然ポリアクリルアミドゲル電 気泳動を用いる逐次分画化により精製または手積製され得る。ＬＢＰが特定生物 試料から濃厚化された場合、本発明の範囲から逸脱することな（、前記方法の１ つまたはそれ以上を改変するか、または類似もしくは均等内容の方法と置き換え ることができる。

ＬＩＦアフィニティー・カラムで使用されるＬＩＦは、一般に、第一は乳類、す なわちＬＢＰおよびＬｌの両方とも同じは乳類に由来するが、精製されるＬＢＰ と結合し得るＬＩＦであればアフィニティー・カラムで使用され得る。

好都合には、ＬＢＰの精製は、標識ＬＩＦおよび好ましくは放射性標識Ｌ４Ｆへ の結合により例えば公知１”１−ＬＩＦ結合検定を用いてモニターされる。ＬＢ Ｐ活性の他のモニタ一手段もあり、例えば競争的検定によるＬＩＦ活性の特異抗 体結合または阻害が使用され得る。

総括的に上述した要領で精製された場合、本発明の好ましい態様によるネズミＬ ＢＰ（ｍＬＢＰ）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ測定によるとグリコジル化形態で約９０ ０００″：１００００ダルトンおよび別のグリコジル化形態で６５０００±１０ ０００ダルトンの見かけ上の分子量を有し、約０．５−２ナノモルの平衡解離定 数で１２５Ｉ−ネズミ（ＩＩＬＩＦ）と特異的に結合する。さらに、ＩＩＩＬ　 Ｉ　Ｆは、ｍＬＢＰへの結合に関する”５　Ｉ　−ｈＬ　Ｉ　Ｆとの競争におい てヒトＬ　Ｉ　Ｆ（ｈＬ　Ｉ　Ｆ）よりも約１０００−１００００倍効力が劣る 。しかしながら、さらに重要なことに、ここに報告したインビトロ効果により示 されたところによると、＋ｅＬＢＰは、ｍＬ　Ｔ　ＦよりもｈＬＩＦの阻害剤と して少なくとも１００倍高い活性であり、一般には約１０００倍高い活性を示す 。さらに、ｈＬＩＦに対するｍＬＢＰの直接結合親和力は、ｍＬＩＦの場合より も約１００倍高い。

本発明の最も好ましい態様において、ｍＬＢＰは、Ｎ−末端領域にＧｌｙ−Ｖａ ｌ−Ｇｌｎ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｔｈｒ　 −Ａｓｎ　−Ａｓｎ−Ｍｅｔ　−Ａｒｇ　−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ− Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１）を含むアミノ 酸配列を有し、特に水性緩衝液には可溶性であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定 されたところによるとグリコノル化形態で９００００±１００００ダルトンおよ び好ましくは９００００±５０００ダルトンの見かけ上の分子量を有する。

Ｎ−グリカナーゼによる処理に基づくと、−説グリコリル化形態は、ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ測定によると約６５０００±１５０００ダルトンおよび好ましくは６５０ ００±１００００ダルトンの分子量を有し、別の脱グリコジル化形態は約５００ ００±１００００ダルトンの分子量を有する。本発明は、アミノ酸配列：ｃｉｙ −Ｖａｌ　−Ｇｉｎ　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ−Ｔ ｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ　−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−ＡＳＤ−Ｃｙｓ− Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１）と少なくとも ４５％、好ましくは少なくとも５５％、さらに好ましくは少なくとも６５％、そ れよりさらに好ましくは少な（とも７５−８５％、さらに一層好ましくは９０％ より高い類似性をもっＮ−末端アミノ酸配列を有するＬＢＰ分子を包含する。

本発明は、ＬＢＰを特定する融合ポリペプチドを含む上記のＬＢＰをコードする ヌクレオチド配列またはＬＢＰをコードする配列に相補的な配列を含む核酸分子 、好ましくは分離核酸分子を包含する。ヌクレオチド配列は、ＬＢＰの天然アミ ノ酸配列に対応し得るか、または配列に対する単一または多数のヌクレオチド置 換、欠失および／または付加を含み得る。好ましくは、核酸は、Ｇｌｙ−Ｖａｌ 　−Ｇｌｎ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｔｈｒ　 −Ａｓｎ　−Ａｓｎ　−Ｍｅｔ　−Ａｒｇ−Ｖａｌ　−Ｔｒｐ−Ａｓｐ　−Ｃｙ ｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ　−Ｐｒｏ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（配列番号１）を含 むＮ−末端アミノ酸配列をもつＬＢＰをコードするか、または低度、好ましくは 中程度、さらに好ましくは高度ストリンジエンシー条件下で上記アミノ酸配列を コードするヌクレオチド配列と／ゾブリダイズし得るヌクレオチド配列を含む。

別の言い方で付は加えると、ハイブリダイズするヌクレオチド配列は、上記アミ ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも４５％、好ましくは少な（ とも５５％、さらに好ましくは少なくとも６５−７５％、さらに一層好ましくは ８５％より高い類似性を有する。

ストリンジエンシーのレベルを定義するためには、好都合にはサムプルツク等（ １５）、３８７−３８９頁を参考にすることができ、その中の１１節での洗浄段 階はここでは高度ストリンジエンシーであると考えられる。ここで低度ストリン ジエンシー洗浄は、３７−４５℃”’Ｃ２−３時Ｆ’１０．１　％　−０，５Ｘ ｖ／ｖＳ　Ｄ　Ｓ　テすると定義され、中レベルのストリンジエンシーは２−３ ＩＩ間≧４５℃テ０．２５％−〇、５％ｖ／ｖＳＤＳであると考えられる。核酸 分子の濃度、純度および供給源によっては、代替的条件も適用され得る。

特に好ましい態様において、本発明の核酸分子は、真核生物（例、ＣＨＯ細胞ま たは他のは乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞）および／または原核生物（例、エシ ェリヒア・コリ）において複製および発現可能な発現ベクター中に存する。かが る発現ベクターおよびそれにより形質転換された細胞は、本発明の組換えＬ　Ｂ 　Ｐ分子の好都合な供給源である。

本発明のＬＢＰは、局所産生または投与されたＬＩＦの全身効果の阻害剤として 特に有用である。処置されるは乳類に対し異種のＬＢＰの使用が同−源ＬＢＰ（ すなわち、同種は乳類からのＬＢＰ）よりも著しく高い活性を示す場合、この高 い活性は、例えばは乳類への異種蛋白導入の免疫学的結果の低減化に特に有利で ある。また活性が高い場合、確実にＬＢＰを特定部位に局在させることができ、 かつは乳類の他の領域に播種し得ないように可能な限り少量のＬＢＰを投与すれ ばよい。また、血清を含む循環液中で有効レベルのＬＢＰを維持することにより 、例えばＬＩＦが局所投与される場合、治療中に投与されたＬＩＦの播種を阻止 することは、ＬＩＦ療法と同時に重要であり得る。

従って、本発明の別の態様は、は乳類におけるＬＩＦの活性の阻害方法であって 、前記は乳類に可溶性ＬＢＰの有効量を投与することを含む方法に関するもので ある。

さらに特定すれば、本発明は、は乳類におＣブるＬＩＦ活性の阻害方法であって 、前記は乳類に可溶性異種ＬＢＰの有効量を投与することを含む方法に関するも のである。ここで、前記異種ＬＢＰは、ＬＢＰと同じは乳類起源のＬＩＦの場合 よりも、処置されるは乳類において高いＬＩＦ阻害力を示し得る。

好ましくは、処置されるは乳類はヒトであり、ＬＢＰＩｔｍＬＢＰである。

好ましくは、この方法は、治療上望ましくないが、意図されたものではないが、 または所望されていない局所産生ＬＩＦの全身作用を抑制するのに使用される。

投与は、処置されている症状に適用し得る好都合な手段により行なわれ得るが、 特に好都合にはＬＩＦを抑制すべき部位に局所投与する。別法として、ＬＢＰは 血清レベルを高めるべ（投与され得、かつＬＩＦは局所投与される。

ＬＢＰの有効量は処置されるは乳類および症状により異なるが、０．００１μｇ ／ｍｌ〜１００　μｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１　μｇ／ｍｌ〜５０　μｇ／ ｍｌ、さらに好ましくは０．１　μｇ／＋ａｌ〜２０　μｇ／ｍＬおよび最も好 ましくは０．５μｇ／ｌ１１１〜ｌＯμｇ／ｍｌの血清レベルの範囲であり得る 。要求される量は、ＬＩＦ活性を完全または部分的に抑制するか、または少なく ともそれを臨床的に許容し得るレベルに低減化するのに必要とされる量である。

さらに、ｒＬＩＦ活性」は、ＬＩＦに伴う全活性またはこれらの活性の幾つかの みであり得、若干の好都合な方法、例えば生物検定（９）またはレセプター結合 検定で測定され得る。

ＬＢＰは、単独または他の活性化合物、例えば限定されるわけではないがサイト カイン、抗生物質、抗癌剤または免疫刺激または低減性化合物と組み合わせて投 与され得る。ＬＢＰおよび他の活性化合物の投与は、同時または連続投与による ものであり得る。さらに、ＬＢＰが単独投与される場合も他の化合物との組み合 わせで投与される場合も、ＬＢＰの単一用量は充分であり得るか、または処置さ れる症状およびは乳類および有害な臨床反応が現れるか否かによっては、多重服 用または連続注入が要求され得る。

本発明のさらに別の態様は、上記ＬＢＰおよび１種またはそれ以上の医薬的に許 容し得る担体および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物の 製造は、レミントンズ・ファーマンニーティカル・サイエンシーズ、第１７版（ マツハ・パブリンノング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア、アメリカ 合衆国）で総括的に検討されている。別法として、ＬＢＰは、トランスジェニッ ク動物細胞または微生物細胞を用いて遺伝子的に投与され得る。

上記ＬＢＰを含む医薬組成物の有効成分は、最適治療応答を与えるべく調節され た用量摂取法で投与された場合に優れた活性を呈するものと考えられる。例えば 、幾つかの分割用量は、毎日、毎週、毎月または池の適当な時間間隔で投与され 得るか、または用量は事態の緊急性による指示に応じて比例的に低減化され得る 。活性化合物は、好都合な方法、例えば経口、局所、静脈内、筋肉内、皮下、鼻 腔内、皮肉または生薬経路またはインブラント法（例、低速放出分子を使用）で 投与され得る。投与経路によっては、ＬＢＰを含む有効成分を不活化し得る酵素 、酸および他の自然条件の作用から前記成分を保護する材料で前記成分を被覆す る必要があり得る。非経口以外の投与経路によりワクチンを投与するためには、 ＬＢＰは、その不活化を阻止する材料を用いて被覆または投与され得る。例えば 、ＬＢＰは佐剤を用いて投与され得、酵素阻害剤と共にまたはリポソームにより 同時投与され得る。

また、活性化合物は、グリセリン、液体ポリエチレングリコールおよび／または それらの混合物および油類で製造された分散液により投与され得る。通常の貯蔵 および使用条件下において、これらの製剤は、微生物の成長を阻止するための保 存剤を含む。

注射可能用途に適した医薬形態は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液お よび無菌粉末を含むものであり、その場で無菌注射可能溶液または分散液が製造 される。いずれの場合でも、前記形態は無菌でなければならず、容易に注射器で 使用できる程度に流動性でなければならない。前記形態は、製造および貯蔵条件 下で安定していなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から 保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例、 グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリフールなと）、 それらの適当な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒質であり得る。適切 な液性は、例えばコーティング、例えばレンチンの使用、分散液の場合に要求さ れる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作 用の阻止は、様々な抗生物質および抗菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール 、フェノール、ソルビン酸、トルメロサールなどにより行なわれ得る。多くの場 合、等張剤、例えば砂糖または塩化ナトリウムを含む方が好ましい。注射可能組 成物の吸収は、例えば吸収遅延剤を組成物中で使用することにより延長され得る 。

無菌注射可能溶液は、必要量の活性化合物を上記で列挙した様々な他の成分を一 般に、分散液は、基剤の分散媒質および上記で列挙したものから必要とされる他 の成分を含む無菌賦形剤に様々な滅菌有効成分（複数も可）を混入させることに より製造される。無菌注射可能溶液製造用の無菌粉末の場合、好ましい製造方法 は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、有効成分および追加で所望の成分があれ ばその成分も含む粉末がその予め滅菌ろ過した溶液から得られる。

ＬＢＰが上記要領で好適に保護されている場合、分子は、例えば不活性希釈剤ま たは同化性食用担体により経口投与され得るか、またはゼラチン硬または軟カプ セルに封入され得るか、または錠剤に圧縮成型され得るが、または食餌療法の食 物と直接混合され得る。経口治療投与の場合、活性化合物は、賦形剤と混合され 、経口摂取用錠剤、口内用錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シ ロップ、カシェ剤などの形態で使用され得る。上記組成物および製剤は、少なく とも１重量％の割合で活性化合物を含むべきである。勿論、組成物および製剤の パーセンテージは変動し得、好都合には単位重量の約５〜約８０％であり得る。

ワクチン組成物中の活性化合物の量は、適当な用量が得られる量とする。本発明 による好ましい組成物または製剤は、経口用量単位形態が約０．５μｇないし２ ０ｍｇの活性化合物を含むように製造される。

また、錠剤、トローチ、丸薬、カプセルなどは、結合剤、例えばトラガカント（ グラガカント）ゴム、アラビアゴム、とうもろこし澱粉またはゼラチン、賦形剤 、例えば燐酸二カルシウム、崩壊剤、例えばとうもろこし澱粉、じゃがいも澱粉 、アルギニン酸など、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含み得る。甘 味剤、例えばしょ糖、乳糖またはサッカリン、または調味剤、例えばペパーミン ト、冬緑油またはサクランボ風味剤も加えられ得る。単位形態がカプセルである 場合、上記タイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の物質もコー ティングとしてまたは他の方法で用量単位の物理的形態を修飾するために存在し 得る。

例えば、錠剤、丸薬またはカプセルは、セラック、砂糖またはそれらの両方によ り被覆され得る。７０ツブまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてしょ 糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素および風味剤、例えばサ クランボまたはオレンジ風味剤を含み得る。勿論、単位用量形態製造に使用され る材料は、医薬的に純粋かつ使用量では実質的に非毒性であるべきである。さら に、活性化合物は、持続放出製品および製剤中に混合され得る。

本明細書で使用されている医薬的に許容し得る担体および／または希釈剤は、溶 媒、分散媒質、水溶液、コーティング、抗生および抗菌剤、等張および吸収遅延 剤などを全て包含する。医薬活性物質用の前記媒質および薬剤の使用は当業界で は公知である。慣用的媒質または薬剤が有効成分と配合禁忌である場合を除き、 組成物中におけるその使用が考えられる。補足的有効成分も組成物中に混合され 得る。

は乳類に異種ＬＢＰを投与する場合の潜在的に不利な作用を低減化するために、 異種ＬＢＰを誘導体化または他の方法で改変することにより、処置されるは乳類 におけるその抗原性を低減化することができる。これは、ＬＢＰを処置されるは 乳類由来の蛋白と類似したものにすることにより達成され得る。例えば、ＬＢＰ は、処置されるは乳動物種に由来する蛋白またはポリペプチドまたは他の適当な 分子によりカップリングまたはマスクされ得るか、または異種ＬＢＰまたはその 一部を標的種類に由来するＬＢＰにカップリングまたは融合し得る。特に好まし い態様において、不ズミＬＢＰはヒトにおいて非免疫性にされ、ヒト分子と類似 したものに誘導体化される。

本発明のさらに別の態様において、第一は乳類に由来するＬＢＰは、第二は乳類 に由来するＬＩＦの検出に使用される。

−態様は、生物試料からＬＩＦを検出する方法に関するものであり、前記方法で は、まず生物試料をは乳類からの固定化ＬＢＰと接触させる。ここで、ＬＢＰは 、それがＬＢＰと同じは乳類に由来するＬＩＦが示すＭ１骨髄性白血病細胞の分 化誘導能力を抑制し得る度合と比べて最初に挙げたＬＩＦの同能力をインビトロ でかなりの程度まで抑制し得るものであり、および／または前記ＬＢＰは、前記 ＬＢＰと同じは乳類に由来するＬＩＦの結合親和力と比べた場合前記の最初に挙 げたし■Ｆに関して少な（とも１００倍高い結合親和力を有するものであり、こ こで、前記接触は複合体が試料中の固定ＬＢＰおよびＬＩＦ間に形成されるのに 充分な時間および条件下で行なわれる。さらに前記方法では、ＬＢＰ−ＬＩＦ複 合体を、前記ＬＩＦに特異的でありシグナルを提供し得るリポータ−分子により 標識した抗体と接触させ、前記リポータ−分子により発せられるシグナルに基づ き結合ＬＩＦの存在を測定する。

別の態様では、ＬＢＰ−ＬＩＦ複合体を、前記ＬＩＦに特異的な非標識抗体と接 触させ、次にＬＩＦが、リポータ−分子により標識され、前記第一抗体に特異的 な第二抗体により検出される。

さらに別の態様において、試料中のＬＩＦを（例えば固定抗体により）固定し、 次いで結合ＬＩＦが、標識ＬＢＰまたはまず非標識ＬＢＰ、次いで前記ＬＢＰに 特異的な標識抗体により検出される。

本発明のこの態様の一興体例は、ｍＬＢＰを用いてｈＬＩＦを検出する好ましい 態様に関して後述されている。しかしながら、本発明はそれらに限定されるわけ ではなく、他のは乳類からのＬＢＰおよびＬＩＦの使用も包含する。

この態様は生物試料におけるｈＬＩＦの検出方法に関するものであり、前記方法 は、前記試料を、ｍＬＢＰ−ｈＬＩＦ複合体が形成されるのに充分な時間および 条件下で固体支持体に固定した前述のＬＩＬＢＰに接触させ、次いで前記ｍＬＢ Ｐ−ｈＬ　Ｉ　Ｆ複合体の存在を検出することを含む。

特に好ましい方法において、ｍＬＢＰ−ｈＬＩＦ複合体は、複合体をｈＬＩＦに 関する抗体と接触させることにより検出される。この場合抗体そのものはリポー タ−分子により標識されているか、またはｍＬＢＰ−ｈＬＩＦ抗体複合体を第一 抗体に結合し得る標識第二抗体と接触させる段階が追加される。

抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであり得、両方ともｈＬ　Ｉ　Ｆに よる適当な動物の免疫化により得られ、いずれのタイプもＬＩＦ検定で使用され 得る。両タイプの血清を得る方法は当業界ではよく知られている。好ましさの点 ではポリクローナル血清の方が劣るが、適当な実験動物に有効量のｈＬＩＦまた はその抗原性部分を注射し、動物から血清を採取し、既知免疫吸着技術のいずれ かを用いて特異血清を単離することにより比較的容易に製造される。この方法に より製造される抗体は事実上いずれのタイプのＬＩＦ検定でも使用され得るが、 生成物が不均一性であり得るため、それらは一般にあまり有利ではない。

抗体を大量に製造でき、生成物が均一であるため、免疫検定におけるモノクロー ナル抗体の使用は特に好ましい。不死セルラインおよび免疫原製剤に対して感作 したリンパ球を融合することにより誘導されるモノクローナル抗体製造用のハイ ブリドーマセルラインの製造は、当業界に精通した者にはよく知られた技術によ り行なわれ得る。（例えば、トイラードおよびホフマン、「ベーシック・ファク ツ・アバウド・ハイブリドーマズ」、「コンベンゾイウム・オブ・イムノロジー 」第２巻中、ンユバルッ編、１９８１、コーラ−およびミルスタイン、「ネイチ ャー」、２５６．４９５−４９９．１９７５、「ヨーロピアン・ジャーナル・オ ブ・イムノロジー」、６．５１１−５１９．１９７６参照）。

ｈＬＩＦの存在は、若干の方法、例えばウェスタン・プロッティングおよびＥＬ ＩＳＡ方法により達成され得る。アメリカ合衆国特許第４０１６０４３．４４２ ４２７９および４０１８６５３号を参照すると判るように、広い範囲の免疫検定 技術が使用できる。勿論、これらには非競争タイプの両車一部位および二部位ま たは「サンドイッチ」検定並びに伝統的な競争結合検定がある。これらの検定は また、標的への標識抗体の直接結合を含む。

サンドインチ検定は、最も有用かつ常用されている検定法の一つであり、本発明 での使用に好適である。サンドインチ検定技術の若干の変形も存在し、それらは 全て本発明に包含されるものとする。簡単に述べると、典型的なフォワード検定 では、ｍＬＢＰを固体基質に固定し、試験すべき試料を結合分子と接触させる。

適当な期間、すなわちｍＬＢＰ−ｈＬＩＦ複合体を形成させ得るのに充分な時間 インキュベーションした後、次に検出可能なシグナルを発生し得るリポータ−分 子で標識したｈＬＩＦに特異的な抗体を加え、ｍＬＢＰ−ｈＬＩＦ標識抗体の複 合体形成に充分な時間インキュベーションする。未反応物質があればそれらを洗 浄除去し、リポータ−分子により発せられたシグナルを観察することによりｈＬ 　Ｔ　Ｆの存在を測定する。結果は、可視シグナルの単なる観察により定性的で あり得るか、または既知量のハブテンを含む対照試料との比較により定量され得 る。フォワード検定に関する変形には同時検定があり、試料および標識抗体の両 方が結合ｍＬＢＰに同時に加えられる。本発明によると、試料はｈＬＩＦを含み 得るものであり、生物学的液体（例、血液、血清、組織抽出物）、発酵液および 例えば細胞培養物からの上清液がある。

典型的なフォワード・サンドイッチ検定法において、ｍＬＢＰまたはそのｈＬＩ Ｆ結合部分は、固体表面に共有結合的または受動的に結合している。固体表面は 典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も常用されているポリマーは、セル ロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたは ポリプロピレンである。固体支持体は、管、ビーズ、マイクロプレートのディス クまたは免疫検定の実施に適した他の表面形態であり得る。結合方法は当業界で はよく知られており、一般にｍＬＢＰをポリマーに架橋共有結合させるか、また は物理的に吸着させることから成る。ｌ１ｌＬＢＰを固定後、ポリマー−ｍＬＢ Ｐ複合体を試験試料用製品中で洗浄する。次いで、試験される試料のアリコート を固相複合体に加え、試料中のｈＬＩＦを固定ＧＬＢＰに結合させるのに充分な 時間（例、２−４０分）、適当な条件（例、２５°Ｃ）下でインキユベーンコン する。インキュベーション期間後、複合体を洗浄し、所望により乾燥し、次いで ｈＬＩＦに特異的な抗体とインキユベーンコンする。抗体を、ＩＩＬＢＰとｈＬ ＩＦの結合を示すのに使用されるリポータ−分子に結合する。別法として、リポ ータ−分子にコンジュゲートされ、第一抗体に結合し得る第二抗体が使用され得 る。

代替的方法では、生物学的試料中で標的分子（すなわちｈＬ　Ｉ　Ｆ）を固定し 、次いで固定された標的を、リポータ−分子で標識されている場合もされていな い場合もあり得るｍＬＢＰに暴露する。標的の量およびリポータ−分子シグナル の強度によっては、結合標的はＷＬＢＰの直接標識により検出可能となり得る。

別法として、ＩＩＬＢＰに特異的な標識抗体を複合体に暴露すると、３次複合体 が形成される。この複合体は、リポータ−分子が放出するシグナルにより検出さ れる。

本明細嘗て使用されている「リポータ−分子」は、その化学的性質により、抗原 結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味 する。検出は定性的または定量的のいずれかであり得る。このタイプの検定にお いて最も常用されているリポータ−分子は、酵素、蛍光団または放射性核種含有 分子（すなわち、放射性同位元素）および化学発光性分子である。

酵素免疫検定の場合、一般にはグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸手段により 、酵素をｈＬＩＦ特異抗体にコンツユゲートする。しかしながら、容易に認めら れるように、広範な種類の異なるコンジュゲーション技術が存在し、これらは当 技術分野の熟練者により容易に使用され得る。常用される酵素には、特に西洋わ さびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼお よびアルカリ性ホスファターゼがある。特異酵素とともに使用される基質は、一 般に、対応する酵素による加水分解時に検出可能な色変化が生じるように選択さ れる。適当な酵素の例には、アルカリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼ がある。また、蛍光原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ）基質を使用することができ、 上述の色素原基質ではない蛍光生成物が得られる。一般的に、酵素標識抗体をｍ ＬＢＰ−ｈＬＩＦ複合体に加え、結合させ、次いで過剰の試薬を洗浄除去する。

次に、適当な基質を含む溶液を３次複合体に加える。基質は抗体に結合させた酵 素と反応して、定性的可視シグナルを生じ、これはさらに普通は分光測光法によ り定量され、試料中に存在したハブテンの量の指標を与え得る。「リポータ−分 子」はまた、細胞凝集または凝集阻害、例えばラテックスビーズにおける赤血球 などにも広く使用される。

別法として、蛍光化合物、例えばフルオレセインおよびローダミンは、それらの 結合能力を改変することな（抗体に化学結合され得る。特定波長の光で照らすこ とにより活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸着し、分子にお いて興奮状態を誘導すると、光学顕微鏡で視覚的に検出され得る特徴的な色で光 を放射する。ＥＩＡの場合と同様、蛍光標識抗体をｗＬＢＰ−ｈＬＩＦに結合さ せる。非結合試薬を洗浄除去後、３次複合体を適当な波長の光に暴露した結果、 観察される蛍光は興味の対象であるハブテンの存在を示す。免疫蛍光およびＥＩ Ａ技術は両方とも当業界では充分に確立されており、特に本方法の場合に好まし い。しかしながら、他のリポータ−分子、例えば放射性同位元素、化学発光性ま たは生物発光性分子も使用され得る。上記考察は、抗体が抗免疫グロブリンであ り、標識されることにより４次複合体が得られる場合に適用される。

さらに、本発明のｍＬＢＰはキット形態に封入され得、例えばＬＩＦに関する検 定に用いられる。このキットはｍＬＢＰ封入に適合した区画形態であり、さらに ＬＩＦ検定用試薬を同ごまたは異なる区画中に含み得る。

前述の記載事項は、前記の第一は乳動物種からのＬＢＰを用いて第二は乳動物種 からのＬＩＦを検出する場合に等しく適用され得る。さらに変形としては、例え ば固定抗体を用いてＬＩＦを結合し、次いでリポータ−分子にコンジュゲートし たＬＢＰにより結合ＬＩＦを検出するか、またはまずＬＢＰ、次いでリポータ− 分子にコンツユゲートしたＬＢＰ結合抗体を使用する方法が考えられる。

本発明について、下記の非限定的な図面および／または実施例によりさらに説明 する。

図面の説明 図１は、正常マウス血清の存在および非存在下における１２５１−ＩＬ　Ｉ　Ｆ のサイズ排除プロフィールを示すグラフ表示である。ウルトロケルＡｃＡ４４（ ２０Ｘ１Ｃ■）カラムを平衡状態にし、０．２ｍｌ／分で２０ミリモルのＮａ燐 酸緩衝液（ｐＨ７゜４）、１５０ミリモルのＮａＣ１（ＰＢＳ）に流し、１分分 画を集め、ガンマカウンターで計数した。（Ａ）１０００００ｃｐｍ”Ｉ−ａ＋ ＬＩＦ、１００μＩＰＢｓ中、（Ｂ）１０００００ｃｐｍ１２ｓＩ−ｍＬ　Ｉ　 Ｆ、室温で１６時間１００μｌ正常マウス血清とプレインキユベーンコンした。

図２は、ＬＩＦアフィニティー・クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグ ラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによる正常マウス血清の典型的分 画化を示すグラフ表示である。Ｃｏｎ−Ａセファロース結合検定における分画の 吸光度および特異的＋２５ｉ　１ＬＩＦ結合状態が示されている。（Ａ）実施例 に記載されている通り、５０Ｉｌ１１マウス血清をＰＢＳ中ＬＩＦ−ｐＡＢＡＥ −セファロース４Ｂのカラムに適用し、グアニジン−ＨＣｌを溶離剤とした。（ Ｂ）実施例に記載されている通り、アフィニティー・クロマトグラフィーからの 活性分画をプールし、モノ−ＱＨＲ５１５に適用し、塩勾配により溶離した。（ Ｃ）アニオン交換クロマトグラフィーからの活性分画をプールし、１００μｌに 濃縮し、ＰＢＳ中で平衡させたスーパロース−１２１０／３０カラムに注入し、 同じ緩衝液を用いてイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）溶離を行った。

図３は、ＬＢＰのプレパラティブ天然ゲル電気泳動の写真およびグラフ表示であ る。上部パネル、実施例に記載されている通り、ＬＩＦ−結合活性を含むサイズ 排除クロマトグラフィーからの分画をプールし、２０ｍ１の７．５％Ｗ／Ｖポリ アクリルアミド天然ゲルに適用し、バイオラド・モデル４９１ブレツブ・セルで 電気泳動にかけた。Ｃｏｎ　−Ａセファロース結合検定において溶離した分画の 特異的＋２５１−ｍＬ　Ｉ　Ｆ結合が示されている。下部パネル：様々な精製段 階からのＬＢＰ活性を含むプールした分画の２０μｍアリコートのＮａＤｏｄＳ Ｏ，−ＰＡＧＥ：　ｓ。

低分子量標準（ファルマシア）（分子量Ｘ　１０−ｊ）：　ａ、正常マウス血清 （１１５Ｑ）；ｂおよびＣ１第１ＬＩＦ−ｐＡＢＡＥセファ０−ス４Ｂカラム、 ｄ５第２ＬＩＦ−ｐＡＢＡＥセフ７０−ス４Ｂカラムｊ　ｅ、モノ−Ｑ　ＨＲ５ １５カラム、ｆ１スーパロース−１２１０／３０カラム：ｇ１ブレパラティブ天 然ゲル電気泳動、矢印は興味の対象であるバンドを示す。

図４は、ＬＢＰ、可溶化ネズミ肝臓膜および３Ｔ３−Ｌ１細胞への１０１１ＬＩ Ｆ結合のスカッチャード分析を図示するグラフ表示である。（Ａ）全ｃｐｍ結合 （ム）、非特異的ｃｐｍ結合（・）および特異的ｃｐＩｌ結合（０）を示すマウ ス血清（５μｍ、全部で２１０μｍ中）への”　ト１Ｌ　Ｔ　Ｆ結合に関する飽 和等温。（Ｂ）マウス血清（５μｌ、全部で２１０μｍ中）（Ｏ）および精製Ｌ ＢＰ（１μｍ、全部で９０μｌ中）（・）におけるＬＢＰへの”’　Ｉ　−ｍＬ 　Ｉ　Ｆ結合のスカッチャード変換。（Ｃ）可溶化ネズミ肝臓膜（２５μｌ、全 部で１７５μｍ）（○）および３Ｔ３−Ｌｌ細胞（０，６Ｘ１０’、全部で８０ μｍ中）（・）への”’　Ｉ　−ｒｒｒＬ　Ｉ　Ｆのスカッチャード変換。

図５は、ｔｌｌＭＬ　Ｂ　Ｐ　（全容量１００　μｌ）ｌ：関ｔ６（Ａ）’　” 　Ｉ　−ｔｂＬ　Ｉ　Ｆ　オヨヒ（Ｂ）”’　Ｉ　−ｈＬ　Ｉ　Ｆの結合と競争 する非標識ｒａＬ　Ｔ　Ｆ（○）およびｈＬ　Ｉ　Ｆ（・）に関する置換曲線の グラフ表示である。

図６は、アフィニティー精製ＬＢＰによるＭ１白血病細胞のｒｐＬ　Ｉ　Ｆ刺激 コロニーの分化誘導の遮断を示すグラフ表示である。（Ａ）示されている一定量 のｍＬＩＦの存在下におけるＬＢＰの滴定。（Ｂ）示されている一定レベルのＬ ＢＰによる鵬ＬＩＦの滴定。

図７は、正常マウス血清によるＭ１白血病細胞のｍＬＩＦおよびｈＬ　Ｉ　Ｆ刺 激コロニー誘導の遮断を示すグラフ表示である。ｍＬＩＦおよびｈＬＩＦは、ネ ズミＭ１コロニーの分化を刺激する同等の能力を有する。Ａ、１００Ｕのエシェ リヒア・コリ誘導ネズミＬ　Ｉ　Ｆ（ｅｉＬ　Ｉ　Ｆ）および８００Ｕのエシェ リヒア・コリ誘導ヒトＬ　Ｉ　Ｆ（ｅｈＬ　Ｉ　Ｆ）に対する効果。Ｂ、４００ Ｕ（７）ｅＩｌｌＬＩＦ並びに各々２００単位のｅｈＬＩＦ、ＣＨＯ細胞誘導ヒ トＬ　Ｉ　Ｆ（ｃｈｏｈＬ　Ｉ　Ｆ）および酵母誘導ヒトＬＩＦ（ＹｈＬＩＦ） に対する効果。図６Ａの場合と同様、正常マウス血清の１＝８希釈物（１２５ｎ ｇ／ｍｌ　ＬＢＰに等しい）は、１００　ＵｌｏｌｌのｔａＬ　Ｉ　Ｆにより刺 激された活性の５０％を阻害し得た。対照的に、正常マウス血清の１：５１２程 度の高度希釈物（〜１　、５　ｎｇ／ｍｌ　Ｌ　Ｂ　Ｐに等しい）でも、８００ 　Ｕ／ｍｌのｈＬ　Ｉ　Ｆにより刺激された活性の５０％を阻害し得た。

図８は、９６ウエルｐｖｃプレートに固定されたｍＬＢＰへ（７）”Ｉ−ｍＬＩ Ｆ（Ａ）および”５ｌ−ｈＬＩＦ（Ｂ）の特異的結合を示すグラフ表示である。

アフィニティー精製ｍＬＢＰを様々な緩衝液（ＰＢＳ、０．１モルのＮａＨＣＯ ｓ　ｐＨ９，５および０．１モルのＮａＨＣＯ３ｐＨ９，５，４μｇ／ｌ１１１ の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）中で希釈し、１００μｍアリコートを室温 で１６時間９６ウエルＰＶＣプレート（コスタ−）中でインキュベーションした 。次いで、プレートを０．０５％ｖ／ｖトウィーン２０（洗浄緩衝液）含有ＰＢ Ｓで洗浄し、室温で１時間１０％ｖ／　ｖ胎児牛血清含有Ｈｅｐｅｓ緩衝ＲＰＭ Ｉ媒質で遮断した。プレートを洗浄緩衝液で再洗浄し、次いで室温で１６時間５ ０μｌのＨＲＦ含有”’Ｉ−ｍＬＩＦ＊たは”’Ｉ−ｈＬＩＦとインキュベーシ ョンした。さらに２０μｍの５０μｇ／ｍｌ非標識ｍＬ　Ｉ　ＦまたはｈＬＩＦ を含むインキュベーション物から非特異的結合を測定した。プレートを洗浄緩衝 液中で３回洗浄することにより、結合および遊離標識リガンドを分離した。

プレートを乾燥し、結合標識リガンドを含む検定プレートを、２４時間ホスフフ ァイメージヤー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）スクリーン（モレキュラー・ グイナミクス）に暴露した。イメージファントのバージョン３（モレキュラー・ ダイナミクス）ソフトウェアを用いて結果を分析した。アルファベットを付した 棒線は、次の通りである。

ａ）ＰＢＳ中５．７５　μｇ／＋＊ｌ　ｗＬ　Ｂ　Ｐｂ）０．１モル重炭酸Ｎａ 、ｐＨ９，５中２．８８　μｇ／ｍｌ　ｔａＬ　Ｂ　ＰＣ）０．１モル重炭酸Ｎ ａ１’ｐＨ９，５中１．４４　μｇ／ｍｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐｄ）０．１モル重炭酸 Ｎａ、ｐＨ９，５中０．７２　μｇ／ｍｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐｅ）０．１モル重炭酸 Ｎａ、ｐＨ９，５中０．３６　μｇ／＋ｓｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐｆ）０．１モル重炭 酸Ｎａ、　ｐＨ９，５中０．１８　μｇ／ｍｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐｇ）ＰＢＳ中５． ７６μｇ／ｓｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐ　＋４μｇ／ｍ１ＢｓＡｈ＞　０．１モル重炭酸 Ｎａ、ｐＨ９，５中２．８８μｇ／ｍ１ｍＬＢＰ＋４μｇ／ｍｌ　ＢＳＡｉ）　 ０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中１．４４μｇ／ｍｌ　ｍＬＢＰ＋４μｇ／ ｍｌ　ＢＳＡＤ　０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中０．７２μｇ／ｍｌ　５ ＬＢＰ＋４μｇ／ｍｌ　ＢＳＡｋ）’　０．１モル重炭酸Ｎａ５ｐＨ９，５中０ ．３６μｇ／ｍｌ　ａＬＢＰ＋４．ｃｚｇ／ｍｌ　ＢＳＡｌ）　０．１モル重炭 酸Ｎａ、ｐＨ９，５中０．１８μｇ／ｍ１ｍＬＢＰ＋４μｇ／ｍｌ　ＢＳＡｍ） ＰＢＳ中５．７６　μｇ／ｍｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐｎ）０．１モル重炭酸Ｎａ５ｐＨ ９，５中２．８８μｇ／ｍ１ｍＬＢＰｏ）０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中 １．４４μｇ／＋１　ｔｒｒＬＢＰｐ）０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中０ ．７２　μｇ／ｍｌ　ｔｇＬ　Ｂ　Ｐｑ）０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中 ０．３６　μｇ／ａｌ　ｍＬ　Ｂ　Ｐｒ）０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中 ０．１８μｇ／ｍｌ　ｍＬＢＰｓ）ＰＢＳ中５．７６μｇ／ａｌｌ　ｍＬＢＰ＋ ４μｇ／ｍｌ　ＢＳＡｔ）　０．１モル重炭酸Ｎａ５ｐＨ９，５中２．８８μｇ ／ｌｌ１ｌ　ｍＬＢＰ＋４μｇ／ｍｌ　ＢＳＡｕ）　０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐ Ｈ９，５中１．４４μｇ／＋ｍｌ　ｍＬＢＰ＋４μｇ／ｍｌ　ＢＳＡｖ）ｏ、ｉ モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中０．７２μｇ／ｍｌ　ｍＬＢＰ＋４μｇ／ｍｌ　 ＢＳＡＶ）　０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中０．３６μｇ／＋ｍｌ　ｍＬ ＢＰ＋４μｇ／ＩＩＩ　ＢＳＡＸ）　０．１モル重炭酸Ｎａ、ｐＨ９，５中０． １８．ｃｚｇ／ｍｌ　ｍＬＢＰ＋４μｇ／＋ｍｌ　ＢＳＡ図９は、マウスＬＩＦ （・）、ヒトＬＩＦ（○）、ブタＬＩＦ（ム）および一連のマウス−ヒトＬＩＦ キメラ分子（閣１口、◆、◇）の競争的結合を示すグラフ表示である。ＰＢＳ中 １／２０の割合で希釈した正常マウス血清の２０μｍアリコートを、１０μｌの １２’ｒ−ｈＬ　ＩＦ、ＰＢＳ中で希釈した５０μｍの非標識リガンドおよび２ ５μｌのコンカナバリン−Ａセファロース４Ｂ（各々１ミリモルのＭｇＣｈ、Ｍ ｎＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む０．１モル酢酸ナトリウムｐＨ６，０中１／４ の割合で希釈）と共に０．６５ミクロンのデュラポア膜（ミルポア）を含む９６ ウエルろ過検定プレートに加え、室温で一夜撹はんしながらインキュベーション した。上清の真空ろ過により結合および遊離放射能を分離し、コンカナバリン− Ａセファロース沈澱物を冷ＰＢＳで１回洗浄した。コンカナバリン−Ａセファロ ース沈澱物を含む検定プレートを、２４時間ホスファーイメーノヤー・スクリー ン（モレキュラー・グイナミクス）に暴露した。イメージファントのバージョン ３（モレキュラー・ダイナミクス）ソフトウェアを用いて結果を分析した。

図１０は、１ＬＢＰおよび組換えｈＬ　Ｉ　Ｆレセプターα鎖へのｍＬＩＦおよ びｈＬＩＦに関する比較結合データを示すグラフ表示である。

（Ａ）ｍＬＢＰ（１／２０の割合で希釈した正常マウス血１）へ（７）’　”　 Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆ結合（・、Ｋｄ＝１−４ナノモル）、ｍＬＢＰ（１／１００ ０の割合で希釈した正常マウ７ＪｎｆｆＤへ（ＤＩ”　Ｉ　−ｈＬ　Ｉ　Ｆｍ合 （０，Ｋｄ＝　１７ヒ＝＋−ｔ−ル）、ｈＬＩＦレセプターα鎮の可溶性先端切 除形態をコードするプラスミドによるＣＯ８細胞のトランスフェクションの４日 後に集められた条件培地への１２１１−ｈＬ　Ｉ　Ｆ結合（ム、Ｋｄ＝３００− ４００ピコモル）および高親和力ｈＬＩＦレセプターを発現する４４×１０６細 胞／ｍ１アレン１細胞への”’Ｉ−ｈＬＩＦ結合（△、Ｋｄ＝８０ピコモル）の スカッチャード分析。

（Ｂ）ｉＬ　Ｂ　Ｐヘノ結合１：関ｔ　ル’　”　Ｉ　−ｈＬ　Ｉ　Ｆ　ト非標 Ｗｉマｆｙ７．　Ｌ　Ｉ　Ｆ　（＠、ＩＤ５ｏ”５００ナノモル）およびヒトＬ 　Ｉ　Ｆ（０，Ｉ　Ｄｉｏ＝０．１ナノモル）の競争。実験条件は図５に記載さ れている通りであった。

（Ｃ）ｈＬＩＦレセプターα鎖の可溶性先端切除形態をコードするプラスミドに よるＣＯ８細胞のトランスフェクションの４日後に集められた条件培地への結合 に関する”Ｓ　Ｉ　−ｈＬ　Ｉ　Ｆと非標識マウスＬＩＦ（・、ＩＤｕ＞１００ ００ナノモル）およびヒトＬＩＦ（○、ＩＤ、。＝２ナノモル）の競争。実験条 件は図５に記載されている通りであった。

図１１Ａは、ｈＬＩＦ−アフィゲル−１０カラムからの溶離分画のクーマシー・ ブルー染色ゲルを示す写真表示である。製造者の使用説明書に従い５ｍｌのアフ ィゲル−１０（バイオラド）、３．５ｍｇのｈＬＩＦおよび充填蛋白質として５ ｍｇの卵アルブミンを用いて、ｈＬ　Ｉ　Ｆ−アフィゲルカラムを合成した。Ｑ Ｑｍｌ量の正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス血清（ｗＬＢＰの供給源として）を、ＰＢ Ｓ中で平衡させた５ｍｌのｈＬＩＦ−アフィゲル−１０カラムに適用した。カラ ムを８５１１１の平衡緩衝液および同緩衝液中６モルのグアニジノーＨＣＩへの ３０＋１−次勾配により溶離した。

２．５ｍｌの分画を終始０．５ａ＋１／分の流速で回収し、必要ならばＰＤＩＯ カラム（）アルマシア）を用いて平衡緩衝液へ交換し、セントリコン超小型濃縮 装置（アミコン）を用いてｌ　ｍ１ｌｌ：ｆｉ縮した。ラエムリ（４）の方法に 従い５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。各分画の１５μｌアリコートをＳＤＳ試料緩衝 液中１／２の割合で希釈し、ミニープロチアンＩＩシステム（バイオラド）にお いて１３％Ｗ／Ｖポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、クーマン−・ブリリ アントブルーで染色した。分子量マーカーの位置が示されている。

図１１Ｂは、ｈＬＩＦ−アフィゲル−１０カラムからの溶離分画の直接１２５１ −ｍＬＩＦ結合検定による５ＬＢＰ量のモニターを示すグラフ表示である。

図１２は、Ｎ−グリカナーゼを用いたｍＬＢＰの脱グリコリル化を示す写真表示 である。５０ミリモルの燐酸ナトリウム（ｐＨ７，５）中１２５Ｉ−■ＬＢＰの アリコートを、３７℃で２４時間同じ緩衝液中ｏ、２５単位のＮ−グリヵナーゼ （ゲンザイム）（レーンａおよびｂ）、緩衝液単独（レーンＣ）または同じ緩衝 液中鎖２５単位のＮ−グリカナーゼ、０．１％Ｗ／ＶＳＤＳおよび１％ｖ／ｖ２ −メルカプトエタノールの存在下でインキユベーンコンした。インキュベーショ ン混合物をＳＤＳ試料緩衝液中１／２の割合で希釈し、ミニープロチアンＩＩシ ステム（バイオラド）において１０％ｗ／ｖポリアクリルアミドゲル電気泳動に かけ、クーマン−・ブリリアントブルーで染色し、乾燥し、２４時間ホスファ− イメージヤ−・スクリーン（モレキュラー・ダイナミクス）に暴露した。イメー ジファントのバージョン３（モレキュラー・グイナミクス）ソフトウェアを用い て結果を分析した。分子量マーカーの位置が示されている。

実施例１ １、原材料および方法 マウス血清の採取 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＣＢＡ　ｆ／Ｃａ　ＨＳＤＢＡ／２Ｊおよ びＢＡＬＢ／Ｃ／Ａｎブラッドレイ・マウスからの血液を全採血により採取した 。

１０分間３０００ｇの遠心分離により赤血球を血清から分離し、血清を６が月ま での間−２０℃で貯蔵した。

アフィニティー・クロマトグラフィー クアトレカサスおよびアンフィンゼンの方法（２）に従い、白血病抑制因子ｐ− アミノベンズアミドエチル−セファロース４Ｂ（ＬＩ　Ｆ−ｐＡＢＡＥセファロ ース４Ｂ）を製造した。簡単に述べると、８．４ｇのＣＮＢｒ−活性化セファロ ース４Ｂ（ファルマンア、ラップサラ）を１ミリモルＨＣＩ中で洗浄し、４℃で １６時間ｐＨ１０で等容量の２モルのジエチルアミンと反応させた。ｐ−ニトロ ベンズアミド−エチルセフ７０−ス４Ｂを５０％Ｖ／Ｖジメチルホルムアミドに より充分に洗浄し、次いで４０°Ｃで６０分間０．５モル重炭酸ナトリウム、ｐ Ｈ８，５中０．２モルのジチオン酸ナトリウムで還元した。ｐ−アミノベンズア ミドエチル・セファロース４Ｂを０．５モルＨＣＩ中で洗浄し、次に４℃で７分 間０．１モルの亜硝酸ナトリウムによりジアゾ化した。次に、このジアゾニウム −セファ０一ス誘導体の７＋１アリコートを、４℃で１６時間０．２モルのテト ラはう酸ナトリウム（ｐＨ９，２）１０ｍｌ中エシェリヒア・コリ誘導ネズミＬ ＩＦ３および非特異的充填蛋白質として鶏卵アルブミン（シグマ、ミズーリ）と 反応させた。ＬＩ　Ｆ−ｐＡＢＡＥ−セファロース４Ｂを、使用前に１５０ミリ モルの塩化ナトリウムを含む２０ミリモルの燐酸ナトリウム、ｐＨ７，４（ＰＢ Ｓ）およびＰＢＳ中６モルのグアニジン−ＭＣＩにより充分に洗浄した。

ＰＢＳ中ＬＩＦ結合蛋白質（Ｌ　Ｂ　Ｐ）活性を含むマウス血清またはプール分 画の５０ｍ１アリコートを、ＰＢＳ（これおよび後続の全緩衝液は、０．０２％ ｖ／ｖトウィーン２０および０．０２％Ｗ／ｖアジ化ナトリウムを含む）中で平 衡させたＬＩＦ−ｐＡＢＡＥ−セファ０−ス４Ｂの１３×０、ＴＣＯｌカラムに 適用し、２０ｍ１の平衡緩衝液、次いで同緩衝液中６モルのグアニジン−ＨＣｌ への１５ｍ１−次勾配により溶離した。２．５＋ａｌの分画を流速０．５■１／ 分で集め、必要ならば予め封入したセファデックスＧ−２５カラム（ＰＤＩＯ、 ファルマシア、ラップサラ）を用いて平衡緩衝液中へ交換した。

アニオン交換クロマトグラフィー ＬＩＦ−結合活性を含むアフィニティー・クロマトグラフィーからの分画をブー ルし、２０ミリモルのトリス（ｐＨ７，０）により２０倍に希釈し、次いで同緩 衝液中で平衡させたモノ−Ｑ　ＨＲ５１５（ファルマシア、ラップサラ）カラム に適用した。２５ｒｎｌの平衡緩衝液、次いで平衡緩衝液中１モルＮａＣ１への ３Ｑｍｌ−次勾配を用いて溶離を行った。０．５ｍ１分画を流速０．５ｍｌ／分 で集めた。

サイズ排除クロマトグラフィー ＬＩＦ結合活性を含むアニオン交換クロマトグラフィーからの分画をプールし、 セントリコン−１０超小型濃縮装置（アミコン、マサチューセッツ）を用いて１ ００μｌに濃縮した。試料を、ＰＢＳ中で平衡させたスバロース−１２１０／３ ０（ファルマシア、ラップサラ）カラムに注入し、同緩衝液を用いてイソクラテ ィック溶離を行った。０．２ｇ１分画を流速０．２ｍｌ／分で集めた。

分取天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＬＩＦ結合活性を含むサイズ排除クロ マトグラフィーからの分画を、０．０６２モルのトリス（ｐＨ６，８）、１２． ５％ｖ／ｖグリセリン、０，０２％ｖ／ｖブロモフェノールブルー中で２倍希釈 し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４）は含まず、１０ＩＩｌｌの０ ．１２５モルのトリス（ｐＨ６，８）、４％ｖ／ｖアクリルアミド１０．１１％ ｖ／ｖスタッキングゲルを含む２０ｍ１の０．３７５モルのトリス（ｐＨ８，８ ）、７゜５％ｗ／ｖポリアクリルアミド１０．２％Ｗ／Ｖビス分離ゲルに適用し た。試料を、約６時間４０ミリアンペアで電極緩衝液として領０２５モルのトリ ス、０．１９モルのグリノン緩衝液（ｐＨ８，３）を用いて、モデル４９１ブレ ツブセル（バイオラド、カリフォルニア）における電気泳動にかけた。ゲルから ブロモフェノールブルー染料前端の溶離後、２．５１０１の分画を流速１ｍ１／ 分で集めた。

分析的ドデンル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動うエムリの方法 （４）によりＮａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥを行った。分析試料のアリコートを、 Ｎ　ａ　Ｄ　ｏｄ　Ｓ　Ｏａ試料績＃液中で希釈し、ミニープロチアンＩＩシス テム（バイオラド、カリフォルニア）で１２．５％Ｖ／Ｖポリアクリルアミドゲ ルにおける電気原動にかけ、銀染色（Ｓ）シた。

ＬＩＦのヨウ素化 エシェリヒア・コリにおいて製造された１−２μｇ量の組換えネズミまたはヒ） ＬＩＦを、前記要領（りでヨウ素化し、精製した。ヨウ素化物質は生物活性を保 持し、”’　ト１Ｌ　Ｉ　Ｆの場合３−５Ｘ１０’ｃｐ１１／ピコモルおよび” ＳＩ　−ｈＬ　ＩＦの場合６−１０　Ｘ　１０　’ｃｐＵａ／ピコモルの比活性 を有していた。

結合検定 ＬＩＦ結合活性を含む試料のアリコートを、１０μｍの”５Ｉ−ＬＩＦ（５−１ ０ｘ　１０　’ｃｐｍ）および５０−１００μ工のコンカナバリン−Ａセファロ ース（ファルマノア、ラップサラ）を含むエツペンドルフ管に加えた（各々１ミ リモルのＭｇＣ１，、ＭｎＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む１００ミリモルの酢酸 ナトリウム（ｐＨ６，０）で４倍希釈）。さらに１０μｌの５０μｇｏａｌ非標 識ＬＩＦを含むインキュベーション混合物から非特異結合を測定した。検定管を 室温で１６時間撹はんしながらインキュベーションした。インキュベーション混 合物を再懸濁し、先細り状超小型遠心分離管中それを１５０μｍの胎児牛血清（ Ｆｅ２）上に層状に重ね、１３００Ｑ　ｒｐｍで１分間回転させることにより、 結合および遊離標識を分離した。次いで、外科用メスの刃を用いてセファロース 沈澱物を含む管の先端を切断し、沈澱物および上清の両方をガンマカウンター（ パラカード・クリスタル・マルチディテクター、バラカード・インスッルメンツ ）で１分間計数した。

競争的結合実験の場合、ＬＢＰおよびコンカナバリン−Ａセファ０−スを、ｌＸ ｌ０−’ないし２Ｘ１０’ｎｇの非標識リガンドおよび一定濃度（２ナノモル） の標識リガンドとインキユベーンコンし、次いで上記と同様に処理した。

スカノチャード分析 ３Ｔ３−Ｌ１細胞を上記要領（′）に従い維持し、１０％ｖ／ｖ胎児牛血清（Ｈ ＲＦ）と共に４０ミリモルのＥＤＴＡおよび２００μｇ／ａｌのフンドロイチン スルフェートを含むＨｅｐｅｓ’ａｌＲＰＭＩ培地を用いて採取した。６０μｌ のＨＲＦに再懸濁した細胞を、１０μｍの１２’　Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆと共にフ ァルコン２０５４管（ベクトン・ディノキンノン、ニューンヤーンー）に入れ、 次いで３時間４℃でインキュベーションした。非特異結合を上記要領で測定した 。マウス肝臓膜を本質的に上記要領（７）で製造し、１％ｖ／ｖトリトンＸ−１ ００（ピアス、イリノイ）に可溶化し、ＬＢＰの場合と同様に検定した。飽和結 合実験を実施し、結合等温のスカッチャード分析を曲線当てはめプログラム「リ ガンド」（ａ）を用いて測定した後、前記要領（りに従い放射性リガンドの結合 可能な分画について補正した。スカッチャード分析により、標識リガンドのその 結合部位に対する親和力およびこれらの結合部位の濃度が導出され、それによっ て既知容量の試料中におけるＬＢＰが定量され得、−ＬＢＰ分子当たり一結合部 位およびＬＢＰについて９０ｋＤａの分子量が仮定される。

生物検定 生物検定用試料を、予め封入されたセファデックスＧ２５Ｍ（ＰＤＩＯカラム、 ファルマシア、ウソブサラ）を用いて規定食塩水中へ交換し、セントリコン−１ ０超小型ａ縮装置’（アミコン、マサチューセッツ）を用いてａ縮し、０．４５ μ層フィルター（ミルボア、マサチューセッツ）に通すことにより滅菌した。Ｍ １分化検定は、前記要領（９）に従い行われた。

蛋白質検定 製造者の使用説明書に従いクーマシーブルーを基剤とする試薬（ピアス、イリノ イ）を用いて、蛋白質をブラッドフォードの方８（＋３）により評価した。

アミノ酸配列分析 アミノ酸配列分析は、前記要領（”　）に従いポリビニリデンジフルオリド（Ｐ ＶＤＦ）ｉにプロットした蛋白質のニドマン分解法により行なわれた。

２、ＬＩＦ結合蛋白質の分析 マウス血清におけるＬＩＦ結合活性の同定ＬＩＦ結合蛋白質（ＬＢＰ）は、＋２ ’　Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆが競争的ラジオイムノアッセイでは中和性モノクローナ ル抗体または競争的ラジオレセプター検定では３Ｔ３−Ｌ１細胞上のその細胞レ セプターへ結合するのを阻害し得ることにより正常マウス血清から検出された。

それは１／４〜１／８の希釈率で正常マウス血清からこれらの検定法のいずれか により検出されたが、妊娠マウスの血清では２０〜３０倍高い希釈率であり、新 生児マウスの血清では２−４倍低い希釈率であった（表２）。ＬＩＦは非常に強 い塩基性蛋白質であるため、このＬＩＦ結合活性が酸性血清蛋白質とＬＩＦの非 特異的会合によるものか否かを測定することが重要であった。しかしながら、リ ソチーム、α−キモトリプシノゲン−Ａおよびチトクロム−Ｃを含む様々な他の 塩基性蛋白質は、ＬＢＰへのＩ２ｓト１ＬＩＦ結合に関して競争し得なかった。

さらに、他の急性期蛋白質、例えばＩＬ−１およびＩＬ−６もまた結合に関して 競争し得なかった。

ＬＢＰへの”’　Ｉ　−ｍｌ−Ｉ　Ｆの直接結合は、２つの異なる方法で検出さ れた。サイズ排除クロマトグラフィーによると、”　Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆは約２ ０ｋＤａの分子量を呈する。”　Ｉ　−ａ＋Ｌ　Ｉ　Ｆを、非解離性条件下、正 常マウス血清の存在下でクロマトグラフィーにかけると、１１０ｋＤａの見かけ 上の分子量をもつ標識複合体が検出され（図１）、血清中のＬＩＦ結合蛋白質が 約９０ｋＤａの分子量を有することが示された。コンカナバリン−Ａセファロー スは、血清から”ＳトＩＬＩＦ−ＬＢＰ複合体を沈澱させる能力を有することが 立証され、これらの試験用に標識された組換えＬＩＦはエンエリヒア・コリで製 造されたため、炭水化物基を含まないことから、ＬＢＰが糖蛋白質であることが 示された。可溶化レセプター検定（”）について最近報告されたところによると 、この特性を用いることにより遊離１２５Ｉ−ＬＩＦから結合”Ｉ−ＬＩＦが分 離された。

ＬＢＰの単離 正常マウス血清からのＩ！ＬＢＰの精製は、方法に関する項で詳述されている通 り、固定ＬＩＦカラムでのアフィニティー・クロマトグラフィー、アニオン交換 クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびプレパラティブ天然 ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いる逐次分画化し、直接１２ ５Ｉ−ｍＬ　Ｉ　Ｆ結合検定によりＬＢＰをモニターすることにより達成された 。

ＬＢＰは、蛋白質精製方法で常用される多くの化学物質、例えばアセトニトリル 、メタノール、ＮａＤｏｄＳＯ４および硫酸アンモニウムの存在下および酸性条 件により完全に不活化される非常に不安定な蛋白質であることが見出された。こ のことは、多くの高度分解ｆｉｔ製技術の使用が排除されるため、ｍＬＢＰ単離 における主な障害であることが判明しており、分画化中に得られる比較的低い収 率に関する根拠であり得る（表３）。

ＬＩＦ分子におけるリンン残基の化学的修飾はその生物活性を破壊することが示 されたが、チロシン残基のヨウ素化はＬＩＦ活性（３）に対して有害なものでは ない。従って、チロシン残基を通してセファロースビーズに蛋白質を結合させる 方法は、確実にＬＩＦ分子がアフィニティーカラム・マトリックス結合時に活性 となるように選択された。ｍＬＩＦ−ｐＡＢＡＥセファロース４Ｂアフィニティ ー・マトリックスによるアフィニティー・クロマトグラフィー（図２Ａ）は汚染 性血清蛋白質の大部分を除去したが、溶離剤として使用されたグアニジンはＬＢ Ｐ活性に対しである種度の変性作用を有していた。アフィニティー・クロマトグ ラフィーの第２ラウンドの結果、顕著な追加精製が行なわれた。対照的に、ＬＢ Ｐは対照卵アルブミン−ｐＡＢＡＥセファロース４Ｂカラムに結合しなかった。

アニオン交換（図２Ｂ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（図２Ｃ）により 、蛋白質の性質が酸性であり、その分子量が約９０ｋＤａであることが確認され 、さらに約１゜６倍精製が達成された。サイズ排除カラムからの分画の分析的Ｎ ａＤｏｄＳＯ４−ＰＡＧＥは、１２．５％Ｗ／〜ｔポリアクリルアミドゲル上で 互いに殆ど離れていない２つのハンドを示したか、他の汚染性バンドからは充分 に離れていた。両方とも約９０ｋＤａの見かけ上の分子量を有し、分析的ＮａＤ ｏｄＳＯ４ＰＡＧＥゲルの銀染色により測定されたところによると、サイズ排除 カラム分画および天然プレバラティブゲル分画におけるそれらの分布は、直接＋ ２５　Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆ結合検定によるＬＢＰ活性の場合と正確に適合してい た。２つのピーク分画を７％ｗ／ｖＮａＤｏｄＳＱ、−ＰＡＧＥケルにおいて電 気泳動させ、ＰＶＤＦ膜ヘブロットし、興味の対象である２つのハンドをＮ−末 端配列決定にかけた。主要バンドは僅かに低い分子量を有し、５ピコモルのレベ ルでアミノ酸配列（２３アミノ酸残基）が得られたが、高い方の分子量バンドか らは３ピコモルのレベルで配列（８アミノ酸残基）カ得られた。両方とも次の配 列と一致するＮ−末端配列を示した：Ｇ１ｙ−Ｖａｌ−Ｇ　ｉｎ　−Ａ　ｓｐ　 −Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　−Ａｓｎ　− Ｍｅｔ　−Ａｒｇ　−Ｖａｌ　−Ｔｒｐ−Ａｓｐ　−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ　 −Ｐｒｏ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ（配列番号１）、＋ａＬＢＰの２形態は どの標本からも見出されず、グリコジル化変異型であることが予測されたが、ｍ ＬＢＰｏ）ｃ末端がさらに同定され、分子のこの末端における差異により僅かな サイズ不均一性が説明され得た。

天然条件を用いる分取ゲル電気泳動（図３Ａ）により、この段階から活性分画を プール後、分析的ＮａＤｏｄＳＯ，−ＰＡＧＥにより示された９０および６７ｋ Ｄａの２つのみの主要バンド（図３Ｂ）を伴う汚染性蛋白質からのＬＢＰの高度 分解分離が行なわれた。この段階からプールした分画を検定で用いることにより 、ＬＢＰの結合特性を測定した。

ＬＢＰの結合特性 精！ｉ！ＬＢＰへの”’　Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆの特異的結合は図４Ａに示されて いる。正常マウス血清または精製ＬＢＰへの”５Ｉ　−ｔｓＬ　Ｉ　Ｆの飽和結 合等温のスカッチャード分析は、ＬＢＰが単一種類のｍＬ　Ｉ　Ｆ結合部位を含 むことを示しくＫＤ５００ピコモル−３ナノモル）、正常マウス血清が約１−５ μｇ／＋ａｌのＬＢＰを含むことを示した０図４Ｂ）。ｍＬ　Ｉ　Ｆに対するＬ ＢＰの親和力は、マウス肝臓膜からデタージエントにより可溶化された低親和力 ＬＩＦレセプターの場合と同等であり（ＫＤ＝６８０ピコモル）、３Ｔ３−Ｌｌ 細胞における高親和力細胞レセプターの場合よりも著しく低かった（ＫＤ＝５７ ピコモル）（図４Ｃ）。

ｈＬＩＦはｍＬＢＰに結合し得たが、その結合特性はかなり異なっていた。非標 識ｍＬＩＦおよびｈＬ　Ｉ　Ｆは、ｍＬＢＰへの結合に関して’２ＳＩ　−ｗＬ 　Ｉ　Ｆとの似た競争能力を示したが（図５Ａ）、ＩＩＬＩＦは、ｒｎＬ　Ｂ　 Ｐへの結合に関する１２５■−ｈＬＩＦとの競争においてｈＬＩＦよりも効力が 一貫して１００００倍の割合で低かった（図５Ｂ）。

ＬＢＰの遮断活性 アフィニティー精製ｍＬＢＰを、ネズミＭ１骨髄性白血病細胞の培養物中でマウ スＬＩＦと合わせると、それは、用量依存的にＩｊＦがＭ１コロニーの分化を誘 導する能力を遮断した（６２−１２５ｎｇ／＋ｌ　ＬＢＰで９０Ｕ／ｌｌｌ　Ｌ 　Ｉ　Ｆ）５０％阻害）。中間用量の＋ｍＬＩＦ（Ｍｌコロニーの５０％分化を 刺激する）は、高用量のＬＢＰによる阻害を示したが、恐らく低用量のＬＢＰ（ ２−４ｎｇ／ｍｌ）では増加したと思われる（図６Ａ）。培養物における１２５ ｎｇ／ｍｌのＬＢＰの存在は、ｍＬＩＦ？ａ定曲線を高い■ＬＩＦ用量に向がっ て２倍シフトさせ得た（図６Ｂ）。

図７は、正常マウス血清にょるＭ１白血病細胞のｍＬＩＦおよびｈＬＩＦ刺激コ ロニーの誘導の遮断を示す。３００−ｔ−ズミＭＩ骨髄性白血病細胞のＩ＋１１ 培養物において、正常成熟（８週）Ｃ５７ＢＬマウスがらの血清０．１ｍｌは、 １００単位の精製組換えエシェリヒア・コリ誘導ネズミＬＩＦの７日間のインキ ュベーノコン後に分化誘導作用を遮断し得た（１：８の血清希釈率により５０％ 遮断）（図７Ａ）。

この血清は、８００単位の精製組換えエシェリヒア・コリ誘導ヒトＬＩＦの作用 に対してさらに大きな遮断能力を有していた（１・５１２の血清希釈率により５ ０％遮断）。ヒトＬＩＦ遮断における同様の高い活性は、エシェリヒア・コリ、 ＣＨＯ細胞または酵母において発現された精製組換えヒトＬＩＦを用いても観察 された（図７Ｂ）。

実施例２ ｍＬ　Ｂ　ＰへのｍＬ　Ｉ　ＦおよびｈＬＩＦ”結合図８は、９６ウエ／ＬＦ’ ＶＣプＬ／　）Ｉ：固定したｎ＋ＬＢＰへの”Ｊ　ｍＬＩＦ（Ａ）および＋２’ 　Ｉ　−Ｌ　Ｉ　Ｆ（Ｂ）の特異的結合を示すグラフ表示である。結果は、固体 支持体に固定したｍＬＩＦが、試料中からｈＬＩＦを捕獲するためのリガンドを 提供することを示している。図８は、ｈＬＩＦが、特異的結合により測定された ところによると、ｍＬ　Ｉ　Ｆよりも少な（とも２０−３０倍高率でｍＬＢＰに 結合したことを示している。かがる発見に関する治療的含蓄に加えて、これらの 結果は、生物試料におけるｈＬＩＦの存在を検定するのに適当なりガントとして ｍＬＢＰを同定している。

実施例３ 融合ＬＢＰポリペプチド ヒト対象へマウス蛋白質を投与すると、治療上望ましくない結果を伴う抗原性免 疫応答が誘導され得る。この潜在的問題を回避または低減化するために、ヒトＬ ＢＰと抗原的には非常に類似しているが、ｍＬＢＰの特性であるｈＬＩＦに関す る高い親和力を保持している蛋白質を構築する。使用される方法は、発明者らが ｈＬＩＦレセプターα鎖への結合性およびマウスＬＩＦレセプターα鎖（ｍＬＢ Ｐ）への非常に高いアフィニティー結合性の両方を付与するｈＬ　Ｉ　Ｆ分子上 の部位の地図作製に以前に使用した方法に類似している。ｍＬＩＦ分子フレーム 構造を用いることにより、発明者らは、一連のマウス−ヒトＬＩＦキメラ分子を 構築することにより、ｍＬ　Ｉ　Ｆ配列へ置換してｈＬ　Ｉ　Ｆ固有の特性を有 する分子を作製するために必要なｈＬ　Ｉ　Ｆアミノ酸残基の最少数を決定した （図９参照）。

組換えＤＮＡ科学技術を用いて一連のマウス−ヒトＬＢＰキメラ分子を構築する ことにより、ｈＬＢＰ（可溶性ヒトＬＩＦレセプターα鎖）配列へ置換すること により、ｈＬＢＰと同様に低親和力でｈＬ　Ｉ　Ｆと結合する分子ではなく、ｍ ＬＢＰと同様に高い親和力でｈＬ　Ｉ　Ｆへ結合する分子を作成するために必要 なｍＬ、ＢＰアミノ酸残基の最少数が決定される（図１０）。試験されたマウス ＬＩＦレセプターの形態は全て、細胞性であろうと可溶性であろうと、ｍＬＢＰ の結合特性を共有するため、組換えｍＬＢＰ分子は、正常マウス血清がら単離さ れたｒａＬＢＰの天然形態と同一の結合および阻害特性を有するものと予想され る。最終目的は、ｈＬＩＦレセプターα鎖アミノ酸配列に基づいているが、Ｃ末 端が先端切除されているため細胞膜結合性ではない可溶性分子であり、ＬＩＦ結 合特性を保持する最少サイズを有し、容易に大量発現される組換え分子を合成す ることである。さらに、この分子は、マウスＬＩＦレセプターα鎖アミノ酸配列 において同−位置にあるアミノ酸残基の代わりに用いられる約５−１５アミノ酸 残基を含む。これらの置換は、ｈＬＢＰ分子が高親和力でｈＬＩＦと結合し、す なわちインビトロまたはインビボで有効なｈＬＩＦきっ抗物質として作用するの を特異的に誘導するが、これらのごく少数のアミノ酸置換が、ヒトＬＢＰ分子を インビボでヒト免疫系において抗原性となるように誘発するとは考えられない。

実施例４ Ｎ−グリカナーゼによるｍＬＢＰの消化■ＬＢＰのＮ−末端アミノ酸配列決定は 、それが細胞性ＬＩＦレセプターα鎖の先端切除形態であることを示唆している 。５ＤＳ−ＰＡＧＥにより蛋白質のサイズを評価し、これをアミノ酸配列におけ る全アミノ酸残基の個々の分子量を合計することにより計算された蛋白質の予測 分子量と相関させることができる。マウス血清から単離されたｍＬＢＰは、炭水 化物結合性レクチン、コンカナバリン−Ａへの結合能力を有するため、当然グリ コジル化分子であるはずである。グリコジル化蛋白質中の炭水化物対蛋白質の比 率を推定する技術は容易に利用され得ないため、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより推定さ れたｍＬＢＰの見かけ上の９Ｏ−９５ｋＤａ分子量をアミノ酸配列と相関させる ことはできない。

ＷＬＢＰの第２形態は、時間をかけてｍＬＢＰの精製製剤から明白になり、蛋白 質加水分解的減成により形成されると予測される。ｍＬＢＰのこの形態は、ｍＬ ＩＦおよびｈＬＩＦの両方と結合し得、ＳＤＳ’−ＰＡＧＥにより推定されたと ころによると約５５ｋＤａの分子量を有する（図１１Ａ、Ｂ）。

ｍＬＢＰの９Ｏ−９５ｋＤａおよび６５ｋＤａの両形態のＣ末端の位置を推定す るため、これらの両形態を含む製剤を、アスパラギン残基およびＮ結合炭水化物 間の結合を特異的に開裂する酵素であるＮ−グリカナーゼによる消化にかけた。

消化を完全に行なわせ、脱グリコジル化蛋白質の分子量を５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り推定した（図１２）。Ｎ−グリカナーゼ消化により生じた２つのバンドは、各 々約６３ｋＤａおよび５０ｋＤａの分子量を有していた。これらのバンドは、Ｎ 結合炭水化物を伴わないｍＬＢＰの２形態の蛋白質コアの分子量に対応するため 、アミノ酸配列と相関し得る。

細胞性ｍＬＩＦレセプターは、２つのへモポエチンドメイン、３つのフィブロネ クチンＩＩＩ様ドメイン、トランスメンブレンドメインおよび細胞質ドメインを 含み、１９０ｋＤａのグリコジル化分子量（１２）を有する。２つのへモポエチ ンドメインおよび３つのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメインのうちの２つから成 る可溶性■ＬＩＦレセプターの報告された形態の分子量は、グリコジル化される と（”）１３０ｋＤａであり、コア蛋白質については７５ｋＤａである。２つの へモポエチンドメインおよび３つのフィブロネクチン様ドメインのうちの１つか ら成るコア蛋白質について予測される分子量は６３ｋＤａであり、２つのへモポ エチンドメインだけの場合、予測分子量は５３ｋＤａである。これらの分子量は 、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより推定されたところによるとＩＩＬＢＰの２つの脱グリ コジル化形態の分子量に完全に対応しており、ｍＬＢＰの様々な形態がフィブロ ネクチンエエ１様ドメインの逐次蛋白質加水分解的除去により作成され、これら の形態は各々ＩＩＬＢＰに関して記載した結合活性を保持していることを示す。

実施例５ ｍＬＢＰのＣ末端のアミノ酸配列の決定Ｃ末端アミノ酸配列に関するさらなる情 報は、ＵＡＬＢＰの蛋白質加水分解的に製造されたペプチド断片を配列決定する ことにより得られる。配列データが可能な限り少ない蛋白質を用いて１ＩＬＢＰ の異なる分子量形態から得られるようにするため、蛋白質加水分解的消化は、５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびゲルから抽出されたペプチド内で行なわれ、微小配列 分析用に逆相ＨＰＬＣにより分離される。

簡単に述べると、正確な分子量のクーマン−ブルー染色バンドをゲルから切り取 り、３％ｗ／ｖＳＤＳを含む５０％ｖ／ｖｎ−プロパツールにより脱色する。次 に、ゲル薄片を水で充分に洗浄し、遠心分離凍結乾燥により乾燥する。次いで、 ゲル薄片を、０．０２％ｖ／′ｖトウィーン２ｏおよび１−２μｇのプロテアー ゼ（例、トリプシンまたはＬｙｓＣ）を含む１００μｌの０．１モルＮａＨＣＯ ｓ中で再水和する。

次いで、ペプチドを、４時間１００μｌの１％Ｖ／Ｖトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）、４時間１００μｌの７０％ｖ／ｖＴＦＡ、１６時間１００μｌの７Ｏ％ｖ／ ｖＴＦＡおよび２×４時間１００μｍの５０％ν／ＶＴＦＡ１５０％アセトニト リルによりゲル薄片から抽出する。溶離剤を合わせ、はぼ濃縮乾固し、次いで０ ．１％ｖ／ｖＴＦＡにより１＋１に希釈する。次いで、ペプチドを逆相ＨＰＬＣ により分離し、アミノ酸配列分析にかける。

表２ 血清におけるＬＢＰのレベル１ 血清型　株　性別　年令　ＲＩＡで５０％　ＬＢＰ濃度（週）　阻害を与える　 （μｇ／国１）希釈率 マウス 成熟　混合　混合　Ｎ／Ａ３　１／４−１／８　１１Ｉ　Ｃ５７Ｍ　６　１／４ 　１ ／Ｉ　Ｃ５７Ｆ　６　１／４　１ ／／　ＣＢＡ　Ｆ　１２　１／４　１ 新生児　ＣＢＡ　Ｆ　１　１／２　０．５／ＣＢＡ　Ｍ　１　１／１　０．２５ ／／ＣＢＡ　Ｍ　２　１／４　１ 妊娠　ＣＢＡ２　Ｆ　１２　１／１２８　３２ヒト　Ｎ／Ａ３　混合　Ｎ／Ａ３ 　Ｎ／ＤＩ　Ｏラット　Ｎ／Ａ　３　混合　Ｎ／Ａ”　１／４　１１　血清から 検出されたＬＢＰのレベルを、競争ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）において中 和性モノクローナル抗体への１２５１−ｍＬ　Ｉ　Ｆの特異的結合の５０％を阻 害するのに必要とされる血清の希釈率として表した。正常マウス血清における】 ２’　Ｉ　−ｍＬ　Ｉ　Ｆ結合部位の数をスカッチャード分析により測定すると １μｇ／ｍｌであり、ＲＩＡにおける５０％阻害をＬＢＰ濃度に変換するための 標準として使用した。

２　妊娠１４日。

３　適用できず。

４　検出され得す。

表３ 正常マウス血清からのＬＢＰの典型的精製１分画方法　容量　全ＬＢＰ　全蛋白 質　収率　Ｐ！（ｍｌ）　（μｇ）（μｇ）　（％）　（倍）正常血清　８５　 １０２　２．２４Ｘ１０’　−−ＬＩＦセファロース１７８４１１．５４Ｘ１０ ’　３９．８　５８ＬＩＦセフアロース２　３８　１８　２．７３Ｘ１０３１９ ．４　１４７アニオン交換　８．９　１８　２．４５Ｘ１０”　１９．９　１５ ８サイズ排除　３．２　６．０　５７３　７．８　２３２天然ゲル　０．８　１ ，４　１１．６　１．４　２６２０１　正常マウス血清からのＬＢＰの典型的精 製。スカッチャード分析から誘導された”　ト１Ｌ　Ｉ　Ｆ結合部位の濃度から ＬＢＰの合計を計算し、ＩＬＢＰ分子当たり１結合部位およびＬＢＰに関して９ ０ｋＤａの分子量を仮定した。

２　精製（倍）。

当業界の軌線者にとって、ここに記載された発明に対して、具体的に記載したち の以外の変形および修飾がなされ得ることは明らかなはずである。本発明はそれ らの変形および修飾を全て包含するものとする。本発明はまた、個々にまたは集 合的にこの明細書で参照または示された段階、特徴、組成物および化合物の全て 並びに前記段階または特徴の２つまたはそれ以上のいずれかおよびあらゆる組み 合わせを包含する。

参考文献 １、メットカーフ、Ｄ、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・セル・クロ ーニング」、２・９５−１０８．１９９１゜２、クアトレカサス、Ｐおよびアン フィンゼン、Ｃ，Ｂ、ｒメソッズ・イン・エンサイモロジー」、２２：３４５− ３７８．１９７１゜３　ヒルトン、ＤＨ６、ニコラ、ＮＡ、およびメントカーフ 、Ｄ、「プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリカ」、８５：５９７ １−５９７５．１９８８゜ ４　ラエムリ、Ｕ、に、ｒネイチャー」、２２７＋６８０−６８５．１９７０゜ ５　ブソチャー、Ｌ、Ａおよびトムキンス、Ｊ、に、ｒアナリテイカル・ノ１イ オケミストリー」、１４８：３８４−３８８．１９８５゜６、グリーン、Ｈおよ びケヒンデ、○　「セル」、１：１１３−１１６．１９７４゜ ７、クアトレカサス、Ｐ　「プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーク・オブ・アメリ カ」、６９：３１８−３２２．１９７２゜８、ムンノン、Ｐ、Ｊ、およびロッド バード、Ｄ、「アナリテイカル・／くイオケミストリー」、１０７：３０７−． ３１０．１９８０゜９　メソトカーフ、Ｄ１ヒルトン、Ｄ、Ｊ、およびニコラ、 Ｎ、Ａ、ｒルーキミア」、２：２１６−２２２．１９９０．１０　ワード、ＬＤ 、ホンダ、Ｊ　、ホワイトヘッド、Ｒ，Ｈおよびンンブノン、Ｒ，Ｊ、ｒエレク トロフオレンス」、１１：８８３−８９１．１９９０゜１１　ニコラ、Ｎ、Ａお よびカリ−１Ｄ、Ａ、ｒグロース・ファクターズ」、６１１９−１２９．１９９ ２゜ １２、ギアリング、ＤＰｏ、サト、Ｃ，Ｊ、、パンデンボス、Ｔ８、ギンペル、 ＳＤｌ、デラニー、ＰＢ１キング、Ｊ　、プライス、■３、コスマン、Ｄ、およ びベックマン、Ｎ１．Ｐ、ｒＥＭＢｏジャーナル」、１０：２８３９−２８４８ ．１９９１゜ １３　ブラッドフォード、ＭＭ　「アナリテイカル・バイオケミストリー」、７ ２：２４８．１９７６゜ １４、メリフィールド、「ツヤ−ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテ ィー」、８５：２１４９．１９６４゜１５　サムプルツク等、「モレキュラー・ クローニング、ア・ラボラド１ノー・マニュアル」、コールド・スプリング・ノ １−ノく−・ラボラド１ノーズ、コールド・ス−ｊ＋）’Ｊ’）’−ハーバー、 ニューヨーク、アメリカ合衆国、１９８９゜配列リスト （１）総括的情報・ （ｉ）出願人（アメリカ合衆国）、ニコス・アントニー・ニコラ（アメリカ合衆 国以外）ニアムラ・ノド・コーポレイシコン・１ノミテ・ノド（ｉｉ）発明の名 称、白血病阻害因子結合蛋白質（ｉｉｉ）配列の数　１ （ｉｖ）通信先住所。

（Ａ）名宛人　デビーズ・コリノン・ケープ（Ｂ）通り＝　１リトル・コリンズ ・ストリート（Ｃ）市・　メルボルン （Ｄ）州　ビクトリア （Ｅ）国、オーストラリア （Ｆ）郵便番号　３０００ （Ｖ）コンピューター読み取り可能フオーム：（、へ）媒体タイプ・５．２５” フロッピー・ディスケ・ノド（Ｂ）コンピューター　ＩＢＭコンパティプル（Ｃ ）オペレーティング・システムＭＳ−ＤＯＳ５．０（Ｄ）ソフトウエアワードパ ーフェクト５．１（ｖｌ）最新出願データ （Ａ）出願番号国際出願 （Ｂ）出願臼　１９９３年７月１日 （Ｃ）分類・ （ｖｉｉ）先行出願データ： （Ａ）出願番号、オーストラリア国特許出願第ＰＬ３２６５／９２号（Ｂ）出願 臼：　１９９２年７月１日 （ｖｉｉｉ）代理人／エージェント情報：（Ａ）名前、ジョン・マイケル・スラ ソタリー（Ｂ）登録番号： （Ｃ）証明／認可証番号：Ｅ　Ｊ　Ｈ／Ｊ　ＭＳ／ＥＫ（ｉｘ）テレコミュニケ ーンヨン情報：（Ａ）電話：（０３）２５４　２７７７（Ｂ）テレファックス： （０３）２５４　２７７０配列番号１に関する情報・ （１）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２３アミノ酸残基 （Ｂ）タイプ、アミノ酸 （Ｃ）鎖構造＝１本 （Ｄ）トポロジー、線形 （１１）分子タイプ、蛋白質 （Ｖ）フラグメントタイプ二Ｎ末端フラグメント（ｘｉ）配列記載、配列番号Ｉ Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　ＩＱＡｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈ ｒ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　２０Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ 分画番号 ＩＧ　２ 時間（分） 時間（分） 已１ｋ Ｆ２Ｏ３ ［ＬＩＦ］（単位　７ｍ０ 逆数的血清希釈率 ＦＩ３８Ａ 特異的結合 ０　３００００６α）００９００００１２００００１５００００鞠′Ｒ１／！８ 尉Ｉ冨曇 濃度（ナノモル） 国際調査報告　′−１−１□Ｎａ ＰＣＴ／ＡＵ！３＃ 国際調査報告ＰＣＴＩＡＩｊ９３１ＤＬｍＳ唱譜＝エエヘ≧＝＝１＃究＝；７も ｍ：１＝畳＝ｆｏｒ！ｈｅｓｅｐａｎｉｃｕ−ｗｉｎｃｈ　ａｒｅｍｅｒｅＪｙ ｇｒｖｅｎｆｏｒｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｉｎｆｏｒｎｓａムｏｎ。

Ｆｏｒ＋ｓ　ＰＣＴｎＳｋｎｒ町紬式１ｕａｉｌｙ　岬μＸｊｕ１７１９９２１ 　ａｅｐｉｕフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０９ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｖ　７０５５ −２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　 ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＶ （７２）発明者　メトカーフ、ドナルドオーストラリア連邦ヴイクトリア３１０ ３、ポールウィン、ユニオン・ロード２６８番（７２）発明者　シンプソン、リ チャード・ジェイオーストラリア連邦ヴイクトリア３１２１、リッチモンド、ス タンリー・ストリート４２番

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）第一ほ乳動物種から得られる可溶性形態で分離された白血病抑制因子（Ｌ ＩＦ）結合蛋白質（ＬＢＰ）であって、これが第一ほ乳動物種からのＬＩＦがＭ １骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、第二ほ乳 動物種からのＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制し得るＬＢＰ 。
2. （２）ＬＢＰが、第一ほ乳動物種からのＬＩＦに対する結合親和力と比べて、第 二ほ乳動物種からのＬＩＦに対して少なくとも１００倍高い結合親和力を有する ことを特徴とする、第一ほ乳動物種から得られる可溶性形態の分離ＬＢＰ。
3. （３）第一ほ乳動物種が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、 ウマまたは霊長動物から成る群から選択される、請求項１または２記載の分離Ｌ ＢＰ。
4. （４）第二ほ乳動物種が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、 ウマまたは霊長動物から成る群から選択される、請求項１または２記載の分離Ｌ ＢＰ。
5. （５）第一ほ乳動物種がマウスであり、第二ほ乳動物種がヒトである、請求項１ または２記載の分離ＬＢＰ。
6. （６） （ｉ）一グリコシル化形態での見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定によ ると約９００００±１００００ダルトンである、（ｉｉ）一非グリコシル化形態 のＮ−グリカナーゼ処理後における見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定 によると約６５０００±１５０００ダルトンである、および （ｉｉｉ）アミノ酸配列が、そのＮ末端部分に【配列があります】 （配列番号１）を実質的に含むか、またはそれと少なくとも５５％アミノ酸類似 性を有するという特性の１つまたはそれ以上を有する、請求項５記載の分離ＬＢ Ｐまたはその機能的突然変異体、誘導体または一部。
7. （７）ＬＢＰを特定する融合ポリペプチドであって、第一および第二アミノ酸配 列を含む融合ポリペプチドであり、ここで第一アミノ酸配列は第一ほ乳動物種由 来のＬＢＰから誘導され得、第二アミノ酸配列は第二ほ乳動物種由来のＬＢＰか ら誘導され得、ここで第一ほ乳動物種由来のＬＢＰは、これが第一ほ乳動物種か らのＬＩＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑制し得る度合と比 べて、第二ほ乳動物種からのＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑 制し得るものであることから、第一ほ乳動物種由来のＬＩＦの場合と比べて第二 ほ乳動物種由来のＬＩＦをかなりの程度まで抑制する能力を保持している融合ポ リペプチド。
8. （８）融合ポリペプチドが、第一ほ乳動物種からのＬＩＦに関する親和力と比べ ると第二ほ乳動物種由来のＬＩＦに関して少なくとも１００倍高い結合親和力を 有することを特徴とする、請求項７記載の融合ポリペプチド。
9. （９）第一ほ乳動物種がマウスであり、第二ほ乳動物種がヒトである、請求項７ または８記載の融合ポリペプチド。
10. （１０）ＬＢＰを特定する融合ポリペプチドであって、第一および第二アミノ酸 配列を含む融合ポリペプチドであり、ここで第一アミノ酸配列はマウス由来のＬ ＢＰから誘導され得、第二アミノ酸配列はヒト由来のＬＢＰから誘導され得、こ こで融合ポリペプチドは、これがマウスＬＩＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分化を 誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、ヒト由来のＬＩＦの同能力をインビト ロ。 でかなりの程度まで抑制し得るものであり、融合ポリペプチドをヒトに投与する と、天然または組換えマウスＬＢＰをヒトに投与した場合と比べて融合ポリペプ チドに対する免疫応答を実質的に低減化させるものである、融合ポリペプチド。
11. （１１）第一ほ乳動物種から得られる可溶性形態のＬＢＰを含む組成物であって 、ＬＢＰは、これが第一ほ乳動物種からのＬＩＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分化 を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、第二ほ乳動物種からのＬＩＦの同能 力をインビトロでかなりの程度まで抑制し得るものであり、ＬＢＰ特性をもたな い蛋白質分子を実質的に含まない組成物。
12. （１２）ＬＢＰが、第一ほ乳動物種からのＬＩＦに関する結合親和力と比べて、 第二ほ乳動物種からのＬＩＦに関して少なくとも１００倍高い結合親和力を有す ることを特徴とする、第一ほ乳動物種から得られる可溶性形態のＬＢＰを含む組 成物。
13. （１３）第一ほ乳動物種が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ 、ウマまたは霊長動物から成る群から選択される、請求項１１または１２記載の 組成物。
14. （１４）第二ほ乳動物種が、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ 、ウマまたは霊長動物から成る群から選択される、請求項１１または１２記載の 組成物。
15. （１５）第一ほ乳動物種がマウスであり、第二ほ乳動物種がヒトである、請求項 １１または１２記載の組成物。
16. （１６）ＬＢＰか°、 （ｉ）−グリコシル化形態での見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定によ ると約９００００±１００００ダルトンである、（ｉｉ）−非グリコシル化形態 のＮ−グリカナーゼ処理後における見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定 によると約６５０００±１５０００ダルトンである、および （ｉｉｉ）アミノ酸配列が、そのＮ末端部分に【配列があります】 （配列番号１）を実質的に含むか、またはそれと少なくとも５５％アミノ酸類似 性を有するという特性の１つまたはそれ以上を有するＬＢＰまたはその機能的突 然変異体、誘導体または一部である、請求項１１記載の組成物。
17. （１７）請求項１または２または６または７記載のＬＢＰをコートする配列かま たはその配列に相補的なヌクレオチド配列を含むか、またはＬＢＰをコードし、 アミノ酸配列： 【配列があります】 （配列番号１）をコードする核酸分子と低ストリンジェンシー条件下でハイブリ ダイズし得るヌクレオチド配列を含む核酸分離体。
18. （１８）請求項１７記載のヌクレオチド配列中の少なくとも１０ヌクレオチドの 隣接配列とハイブリダイズし得る核酸分離体。
19. （１９）請求項１７記載の核酸分離体を含むベクター。
20. （２０）ほ乳類におけるＬＩＦ活性の抑制方法であって、上記ほ乳類に有効量の 可溶性異種ＬＢＰを投与することを含み、上記異種ＬＢＰが、ＬＢＰと同じほ乳 類由来のＬＩＦの場合と比べて処置され間ほ乳類においてＬＩＦを強力に抑制し 得るものである方法。
21. （２１）ＬＢＰが、 （ｉ）−グリコシル化形態での見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定によ ると約９００００±１００００ダルトンである、（ｉｉ）−非グリコシル化形態 のＮ−グリカナーゼ処理後における見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定 によると約６５０００±１５０００ダルトンである、および （ｉｉｉ）アミノ酸配列が、そのＮ末端部分に【配列があります】 （配列番号１）を実質的に含むか、またはそれと少なくとも５５％アミノ酸類似 性を有するという特性の１つまたはそれ以上を有するＬＢＰまたはその機能的突 然変異体、誘導体または一部である、請求項２０記載の方法。
22. （２２）ＬＢＰが融合ポリペプチドであり、第一および第二アミノ酸配列を含む 融合ポリペプチドであり、ここで第一アミノ酸配列は第一ほ乳動物種由来のＬＢ Ｐから誘導され得、第二アミノ酸配列は第二ほ乳動物種由来のＬＢＰから誘導さ れ得、ここで第一ほ乳動物種由来のＬＢＰは、これが第一ほ乳動物種からのＬＩ ＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、第 二ほ乳動物種からのＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制し得る ものであることから、融合ポリペプチドが、第一ほ乳動物種由来のＬＩＦの場合 と比べて第二ほ乳動物種由来のＬＩＦをかなりの程度まで抑制する能力を保持し ているものである、請求項２０記載の方法。
23. （２３）ＬＢＰが融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドはＬＢＰを 特定し、かつ第一および第二アミノ酸配列を含むものであり、ここで第一アミノ 酸配列はマウス由来のＬＢＰから誘導され得、第二アミノ酸配列はヒト由来のＬ ＢＰから誘導され得、ここで融合ポリペプチドは、これがマウスＬＩＦがＭ１骨 髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑制し得る度合と比べて、ヒト由来のＬ ＩＦの同能力をインビトロでかなりの程度まで抑制し得るものであり、融合ポリ ペプチドをヒトに投与すると、天然または組換えマウスＬＢＰをヒトに投与した 場合と比べて融合ポリペプチドに対する免疫応答が実質的に低減化する、請求項 ２０記載の方法。
24. （２４）処置されるほ乳類がヒトであり、ＬＢＰがマウスに起源を有する、請求 項２１または２２記載の方法。
25. （２５）ほ乳類の血清における異種ＬＢＰの有効量が血清１ｍ１当たり０．００ １μｇ〜１００μｇである、請求項２４記載の方法。
26. （２６）さらにサイトカイン、抗生物質、抗癌剤および免疫調節性化合物から成 る群から選択される１種またはそれ以上の活性化合物の連続または同時投与を含 む、請求項２０記載の方法。
27. （２７）１種またはそれ以上の医薬用担体および／または希釈剤と共に請求項１ または２または６または７記載のＬＢＰを含む医薬組成物。
28. （２８）生物試料からのＬＩＦ検出方法であって、生物試料をほ乳類由来の固定 化ＬＢＰと接触させることを含む方法であり、ここでＬＢＰは、これがＬＢＰと 同じほ乳類に由来するＬＩＦがＭ１骨髄性白血病細胞の分化を誘導する能力を抑 制し得る度合と比べて、最初に挙げたＬＩＦの同能力をインビトロでかなりの程 度まで抑制し得、および／またはＬＢＰは、前記ＬＢＰと同じほ乳類に由来する ＬＩＦの結合親和力と比べて、最初に挙げたＬＩＦに関して少なくとも１００倍 高い結合親和力を有するものであり、ここで前記接触は、試料中で固定化ＬＢＰ およびＬＩＦ間に複合体が形成されるのに充分な時間および条件下で行なわれ、 さらにＬＢＰ−ＬＩＦ複合体を、前記ＬＩＦに特異的であってシグナルを供し得 るリポータ−分子により標識された抗体と接触させ、前記リポータ−分子により 発せられたシグナルに基づいて結合ＬＩＦの存在を測定することを含む方法。
29. （２９）代わりにＬＢＰ−ＬＩＦ複合体を前記ＬＩＦに特異的な非標識抗体と接 触させ、次いで第１抗体に特異的であり、リポータ−分子により標識された第２ 抗体を用いてＬＩＦ結合抗体を検出することを含む、請求項２８記載の方法。
30. （３０）ＬＢＰが、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマま たは霊長動物から成る群から選ばれるほ乳類に由来する、請求項２８または２９ 記載の方法。
31. （３１）ＬＩＦが、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマま たは霊長動物から成る群から選ばれるほ乳類に由来する、請求項２８または２９ 記載の方法。
32. （３２）ＬＢＰがマウスに由来し、ＬＩＦがヒトに由来する、請求項２８または ２９記載の方法。
33. （３３）ＬＢＰが、 （ｉ）−グリコシル化形態での見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定によ ると約９００００±１００００ダルトンである、（ｉｉ）−非グリコシル化形態 のＮ−グリカナーゼ処理後における見かけ上の分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ測定 によると約６５０００±１５０００ダルトンである、および （ｉｉｉ）アミノ酸配列が、そのＮ末端部分に【配列があります】 （配列番号１）を実質的に含むか、またはそれと少なくとも５５％アミノ酸類似 性を有するという特性の１つまたはそれ以上を有するＬＢＰまたはその機能的突 然変異体、議導体または一部である、請求項３２記載の方法。