JPS60190796A - 脳特異的なｍＲＮＡから翻訳されたプロテイノイドの部分に対応する合成ポリペプチド、これを用いた受容体、方法及び診断系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は１合成的に作られたポリペプチド、より詳しく
はそのアミノ酸残基配列が主に脳にのみ存るメツセンジ
ャーＲＮＡ分子から翻訳された物質の配列に対応すると
ころの合成ポリペプチドに関する。

〔背景技術〕

任意の組織の機能を理解する鍵ｉｔ、、その組織に％具
な蛋白質の生化学的特徴である。哺乳類の脳は、二つの
支配的な細胞タイプっまりノイロンと神経膠から成り、
これらが多種の構造へと組織されている。脳が一つの組
織として見られるがいくつかの組織として見られるかに
拘らず、その機構は、一般に同じ生理的作用を１種々の
場所で％種々のシグナルに対して行うと考えられる多（
の細胞を含む。従って、成熟した脳において特化し念及
び一般的な脳プロセスの両者に関係するものを含む脳特
界的蛋白質の多数を見い出すと予期できる。

特定できる脳特異的蛋白質の例は、神経４プチド先駆体
、神経トランスミツター合成及び／又は処理を負う酵素
、神経トランスミツターの放出。

変性又は再摂取、シグナル受容体系及びイオンチャンネ
ルに参加する蛋白質である。原本的細胞構造に含まれる
蛋白質は、ノイロンに独特のもの（軸索突起、樹状突起
及びシナデヌ）及び特定の細胞−細胞相互作用を達成す
るに関与するものを包含する。また、記憶のような心理
的プロセス（これらは細胞レベルでは全く理解されずに
分子レベルに専らよる）に関与する蛋白質がある。明ら
かに脳は、その大きな複雑性の故に分子レベルで研究さ
れるべき別の組織である・ 従来の蛋白質化学は、脳の啄めて小ざな領域に存在する
希な独特な蛋白質又は構造を定義するには不適洛である
。また蛋白質化学レベルでのアプローチは、各々の蛋白
質のための適当な評価法を持つことにかかつており、こ
れは通常他の分子に一般化できず、かつこの７デローチ
は明らかに下垂体栄養（＋１Ｖ９０１）ｈｙｓｌｏｔｒ
ｏｐｈｌｃ　）　因子のような存在する概念的構造に適
合する分子に対してのみ適用できる。Ｇｕｉｌｌｅｒｎ
ｉｎ、　５ｃｉｅｎｃｅｓ　２０２　ｍ５９０〜４０２
（１９７８）参照。

しかし、脳の蛋白質の総てが特定のメツセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）から翻訳により合成される。即ち各々の
脳特界的蛋白質は対応するｍＲＮＡを持たねばならない
と推定される。すなわち、脳の研究への一つのアプロー
チは、メツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写を経る
こと又は脳がその完全な総遺伝能力に関していかなるメ
ツセンジャーＲＮＡ種を作るかという質問を問うことで
ある。哺乳類の脳％具的ｍＲＮＡ　の複雑性の推定値は
極めて高い：数万〜数１０万個の個々のｍＲＮＡ分子が
脳機能に関係しく　Ｂａｎｔ１６ら−ｃ３ｉｉ、　８．
１！１９−１５０（１９７６）およびｌ’４ａＳｔｉｅ
ら、、Ｃｓ１１．ヱ・７６１−７７４（１９７６）−］
、これは上に述べた脳特異性蛋白質の多様さと矛盾しな
−。

〔発明の要約〕

本発明に従い、自然に生じるグロテイノイＰ（ｐｒｏｔ
ｅｌｎｏｌｄ　）　の配列の少くとも−ス゛＄にアミノ
酸残基配列においてほとんど対応しかつデロティノイＰ
の分子量と同じ又はそれより小さな分子量を持つ合成ポ
リペプチドが作られる。ゾロティノイド自体Ｆｉ、主に
脳細胞中にのみ存るメツセンジャーＲＮＡから翻訳され
たアミノ酸残基配列を含む。メツセンシャーＲＮＡは典
型的には多アデニル酸化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ
ｄ　）　されており、脳細胞組織の細胞形質中に存在す
る。接合体（ｃｏｎ　ｊｕｇａｔｅ　）として担体に結
合され、この接合体として動物中に誘導された本発明の
合成ポリペプチドは、自然に生じるデロテノイド又は該
グロティノイドの誘導体に結合する抗体の製造を誘発し
ならびにこれら抗体がそれに対して誘発きれたところの
合成ポリペプチドに対して結合する。

本発明の別の実ＩＩｆ１熊様Ｋｂｒて１合成Ｉすぜデチ
ドハ、毘独で又は担体に結合された接合体として動物に
導入されて、その動物にかいて合成ポリペプチドに対す
る抗体の製造を誘発する。かくして作られた抗体の収穫
後に１収穫された抗体又はこれら抗体の遺伝型含有ポリ
アミド部分（以下ではまとめて受容体と呼ぶ）は、脳細
胞組織及び咳脳組織中に゛存在する自然に生じるゾロテ
ィノイドのアミノ酸残基配列の存在の検出のための指標
群を混合される。指標群は、プロティノイド又は検出さ
れるべきアミノ酸残基配列を含むゾロティノイド誘導体
と受容体の間の免疫反応の形成を指示する。

本発明の別の実施態・様は、脳細胞中にあるゾロティノ
イドの自然に生じるアミノ酸残基配列の存在を免疫反応
の形成によシ検出する診断系である。

この糸Ｆｉ１本発明の合成ポリペプチド又は担体に結合
された該ポリペプチドの接合体に対して生じた抗体又は
抗体の遺伝型含有ポリアミド部分を含むところの生理的
活性な受容体を含有する少くとも一つのノ４ツケージを
包含する。指標群すなわちラベルは、受容体が脳組織と
混合された時に、受容体とプロティノイド又は検出され
るべきアミノ酸残基配列を含むその誘導体の間の免疫の
形成を指示するために用いられる。

本発明の更に別の実施態様は、活性成分とじて本発明の
合成ポリペプチド又はこの合成ポリ被デチドの親油性誘
導体の有効量を含む医薬組成物である。親油性の合成ポ
リペプチド誘導体は、血流から血−脳バリアーを通って
脳細胞組織中１ｔＣ通過できる。本医薬組成物はまた。

医薬的に許容できる希釈剤を含む。

本発明の別の実施態様Ｆｉ、動物の脳組織に損傷が起き
たかどうかを免疫反応の形成により知るための方法であ
る。ここで、傷ついた脳組織を持つと疑われた動物から
の、傷ついた脳組織から放出式れたゾロティノイド又は
ゾロティノイド誘導体を含む脳を髄液が用意される。こ
の脳を髄液の一部を、（ｉ）生理的活性な受容体及び（
ｉｉ）指標群の有効量と混合する。受容体は、本発明の
合成ポリペプチドに対して生じた抗体又は抗体の遺伝型
含有ポリアミド部分である。この混合物において次に。

脳を髄液中のゾロティノイド又はその誘導体と受容体の
間の免疫反応の存在を検出される・免疫反応の存在は指
標群によシ指示され、免疫反応はゾロティノイド又はそ
の誘導体を含む脳組織の損傷を示す。

特定の脳組織に結合する診断剤は、本発明の別の実施態
様を構成する。この剤は、指標群に結合されうる生理活
性受容体である。この受容体は。

合成ポＩ）　−２７’チド又は担体に結合された合成ポ
リペプチドの接合体に対して生じた抗体又は抗体の遺伝
型含有部分である。免疫反応は、受容体が自然に生じた
ゾロティノイド又はその誘導体を含む脳細胞組織と混合
された時に形成される。受容体に結合された又は外生的
に供給され几剤としての指標群は、受容体とゾロティノ
イド又はその誘導体含有脳組織の間の免疫反応の形成を
指示する。

好ましい場合においては、ゾロティノイドは既知のタイ
プの脳細胞組織からの脳細胞組織中にのみほとんど存在
するｍＲＮＡから翻訳される。

本発明Ｖｉ、いくつかの利益及び利点を与える。

とくに１本発明は合成ポリペプチド及びそれにより作ら
れた受容体分子を通しての脳細胞の構造及び機能への調
査手段を与える。すなわち本発明の利益の一つとして、
脳細胞組織における特定のアミノ酸残基配列の存在を決
定することが今や可能である。

本発明の別の利益は、脳細胞に存在するゾロティノイド
の自然に生じるアミノ酸残基配列の存在の検出のための
診断系を提供することである。

本発明の更に別の利益は、特定のアミノ酸残基配列を含
む脳細胞組織と免疫反応する生理活性受容体を提供する
ことである。

本発明の別の利益は、脳細胞組織の損傷の存在を決定で
きる方法を提供することである。

本発明のいくつかの利点の一つは１本発明の合成ポリ−
ｅｆチドをその遊離の形で又は血流から血−脳バリヤー
を通って脳細胞組織に通過できる親油性誘導体として含
む医薬組成物を提供することである。

本発明のさらに別の利益及び利点は、以下の詳細な説明
及び特許請求の範囲から、当業者には明らかであろう。

図の説明 第１図は、クローンｐＩＡ７５のｐ　ＩＡ７５相補的（
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　）デオキシリポ核酸（ｃ
　ＤＮＡ　）の特徴を示す。

第１図Ａは、ｃ　ＤＮＡクローン＋）ＩＡ７５メッセン
ジャーりぎ核酸（ｍ　ＲＮＡ　）のＮｏｒｔｈｅｒｎ　
プロット分析を示すオートラジオダラムの写真である。

ラットの脳（８）、ラットの肝臓（Ｌ）％ラットの腎臓
（Ｋ）、ラットの神経膠踵・（Ｇ）、マウスの神経芽細
胞＠（Ｎ）及びラットのクローム親和細胞腫ＰＣ１２（
Ｐ）からの多アゾニール酸化メツセンジャーＲＮ　Ａ　
［ｐｏｌｙ　（Ａ　）＋ｍ　ＲＮＡ　］の各各２マイク
ログラムを１．５チアガロースダルで電気泳動によシ分
離し、ニトロセルロースにプロット（ｂｌｏｔ　）　ｌ
、、３２ｐラベルしたｐＩＡ７５とγ昆成しく　ｈｙｂ
ｒｉｄ、＋ｚｅ　）又は３２ｐラベルしたｐ１八７５及
びｐＩＢ１５の混合物と混成した。ＤＮＡサイズマーカ
ーの位置及び長さは左方に示される。第１図Ｂは、ｐＩ
Ａ７５．ｐＯ−４０，及び９１８１５ｍＲＮＡの領域的
分布のＮｏｒｔｈｅｒｎ　プロット分析を示すオートラ
ジオダラムの写真である。皮質（ｃｏｒｔｅｘ　：　ｃ
ｔｘ　）　、嗅神経球（ｏｂ）、尾状核（ｃｎ）１１海
馬（ｈｐｃ　）　、視床下部（ｈｔｈ　）、小脳（ｃｂ
）　及び脳橋／後脳（ｈｂ）　からの細胞形質ｍＲＮＡ
の各各２０マイクログラム及び脳（全体）　ｐ、ｏｌｙ
（Ａ）＋ｍ　ＲＮ　Ａの２マイクログラムを１．５チア
ガロースダルで分離し、各々のクローンに特異的なｍＲ
ＮＡ　（右方に表示）を第・１図Ａのように検出した。

第１図Ｃｕ、クローンｐＩＡ７５のセンスストランド（
５ｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ　）　のヌクレオチド配列を
示す。クローンのセンスストランドは、グラスミドｐＢ
Ｒ３２２のＥｃｏ　Ｒｌ切断位置に近い５′末端を持つ
と示される。また、ヌクレオチド配列の上に、翻訳され
たアミノ酸残基配列として示される二つの推定的なオー
プン読み出しフレーム（ｏｒｆ　１及びｏｒｆ　２　）
も示されている。抗体を生じさせるのに用いるべく選ば
れた三つのポリペプチド（ｐｌ、ｐ２．　ｐ３）は、ア
ミノ酸残基配列においてアンダーラインを付されている
。

第１図０は、ｐＩＡ７５　ｃＤＮＡクローンのセンスス
トランド及びオープン読み出しフレームの決定を例示す
る。クローンｐＩＡ７５は最上に示され、プラスミドＩ
）ＢＲ３２２（細線）における第１図Ｃと同じ配位でｃ
ＤＮＡインサート（太線）を示す。下記の制限酵素の切
断位ＩＮが示されている；　ｈｐｃ　ＩＩ　（Ｐ　）、
Ｈｌｎｆ　ｘ　（Ｆ　）及びＰｓｔｌ。ｃＤＮＡクロー
ンのセンスストランドラ決定するために用いられた制限
断片（フラグメント）の二つのストランド（Ｆｌ　；　
ＦＩＰ１％Ｆ３及びＦＩＰ２と記す）が下方に示されて
いる。５２ｐラベルした５′末端がアスタクスク（＊）
により示はれている。三つの可能な読み出しフレームの
各々におけるＴＧＡ、ＴＡＡ又はＴＡＧ終了コドン（Ｃ
ｏｄｏｎ）の位置は、黒丸（・）で下部に示されている
。二つの最大ｏｒｆも示されている。ｏｒｆ２のＡＴＧ
開始コドンの位置は日丸（０）で示されている。

第１図Ｅは、ｐＩＡ７５　ｃＤＮＡインサートの単一末
端ラベルした制限フラグメントによるｐＩＡ７５　ｍＲ
ＮＡの検出を示すオートラジオダラムの写真である。ラ
ットの脳（Ｂ）及びラットの肝＠（Ｌ）のｐｏｌｙ　（
Ａ）＋　ｍ　ＲＮ　Ａの各々の２マイクロダラムを％第
１図０に示したようＫｆ４製された単一末端ラベルした
制限フラグメントＦＩＰ１及びＦ３Ｐ２を用いてＮｏｒ
ｔｔｌｅｒｎ　プロットを用いて分析した。

第２図は、クローンｐＩＡ７５の翻訳生成物に対応する
蛋白質の特徴を示す゛。

第２図Ａは、クローンｐｌＡ７５の混成翻訳検出を示す
オートラジオダラムの写真である。ラットの脳からのｐ
ｏｌｙ（Ａ）＋ｍ　ＲＮ　Ａ及び対照又はｐＩＡ７５フ
ィルターに対して混成したｍ　ＲＮ　Ａがラビット網赤
血球溶解質を用いてインビトロで翻訳され、３５Ｓ−メ
チオニンでラベルされた生成物を１２．５’％ナトリウ
ムドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドダル（ＳＯ３−Ｐ
ＡＧＥ）上で電気泳動によｐ分画した。矢印は、約２５
キロダルトン（２５にダルトン）のバンドを示し、これ
はｐＩＡ７５混成化で合成化ＲＮＡと共に現われ。

しかも対照においては現われない７分子量推定値は、こ
れら試料と共にマーガーが測定されなかったので同等の
ｒルからの結果に基づいている。

第２図Ｂは、抗ベゾチド抗体（ｐＩＡ７５抗Ｐ１　又は
対照抗体のいずれか）を用いての１代謝的にラベルした
ラットのクローム親和＋Ｎｌ］　胞（ｐｃ１２）からの
３５５−メチオニンラベルした生成物の免疫沈澱物の５
〜１２．５チ勾配ＳＯ３−ＰＡＧＥ分析を示すオートラ
ジオダラムの写真である。矢印は、抗Ｐ１　血清で沈澱
された約２８にダルトン蛋白質（近隣のレーンで４１１
１定されたマーカーから１１ａ定）を示す。

第２図Ｃは、ｐＩＡ７５　ｃＤＮＡクローンの列をその
対応するｍＲＮＡと共に示し、コーディングの推定的位
置（太＠）及び非コーディング領域の推定的位置（細線
）を示す。

第３図は、ｐＩＡ７５抗ペプチド抗血清によるラット脳
抗原の免疫細胞技術的検出を示す。染色は、後記の材料
及び方法の部に記述されるように行われた。総ての一次
抗体は、１：５００の最終希釈率で用いられた。同じ抗
Ｐ１　パターンが１：２０、口００までの希釈率で観察
された。

第３図Ａは、視床下部の副脳室核中のノイロンの群を示
す顕微鏡写真であり、抗Ｐ１　抗血清を用いた強い染色
を示す。棒は５０ミクロンに等しい。

第６図Ｂは、第３図Ａの細胞の拡大図であって細胞形質
顆粒を示している。

第３図Ｃは、抗Ｐ１　抗体を用いて着色した支脚（ｓｕ
ｂｉｃｕｌｕｍ　）中のノイロン及び樹枝状（ｄｅｎｔ
ｒｌｔｌｃ）突起の顕微鏡写真であり、細胞の樹枝状棹
、における免疫活動（矢印）の頻度濃度を示す。棒は５
０ミクロンに等しい。

第５図りは、抗Ｐ２　抗体を用いて染色された視床下部
細胞体を示す顕微鏡写真である。染色された膨張した繊
維も示されている。棒は５０ミクロンに等しいう 第４図は、クローンＰＩ　Ｂ　２５６の特徴を示す。

第４図Ａは、ｐＩＢ２３６　ｍＲＮＡの組織分布のＮｏ
ｒｔｈｅｒｎ　ｆ　＊ット分布を示すオートラジオダラ
ムの写真である。詳細は第１図Ａで述べた通シである。

第４図８は、ラットの脳における９１８２３／１ｍＲＮ
ＡとｐＩＢ１５　ｍＲＮＡの領域的分布のＮｏｒｔｈｅ
ｒｎ　プロット分析を示すオートラジオダラムの写真で
ある。詳細は第１図Ｂで述べた通りである。

第４図Ｃは、ｐＩＢ２３６　ｃＤＮＡインサートのヌク
レオチド配列を示し、合成されたポリペプチドＰ４、Ｐ
５．Ｐ６及びＰ７の長いオープン読み出しフレーム及び
位置を示している。５′末端は、プラスミドｐＢＲ３２
２のεｃｏ　Ｒｌ切断位置に近い。

＠４図Ｏは、クローンｐ１８２３６のセンスストランド
及びオープン読み出しフレームの決定を示す。詳細は第
１図Ｂと同様である。、、Ｒは、制限エンドヌクレアー
ゼＲｓａ　ｌの略である。

第４図εは１．麻４図０におけるようにして作られた単
一末端ラベルした制限フラグメントによるｐ−１８２３
６ｍＲＮＡの検出を示す。詳に（ｌけ第１図εに述べた
通シである。

第５図は、１）１８２３（Ｓオープン読出しフレームを
示す。塩基性アミノ酸（に＝リシン、Ｒ＝アルギニン）
の対における可能なポリペグチド処理位置の場所；合成
ポリペプチドＰ４、Ｐ５、Ｐ６及びＰ７の位置（各々に
おけるアミノ酸の数が下に示きれている）：及びカルボ
キシ末端グリシン（Ｇ）（これはＩリベゾチドＰ６のア
ミド化に関与していてもよい）の位置が示されている。

第６図は、ｃ＋ｌＢ２３６．抗ペゾチド抗体によるラッ
ト脳抗原の免疫細胞化学的検出を示す。第６図Ａ〜Ｃ及
びＥ〜Ｈａにおいて、すべての切片はまた、Ｒｌｃｈａ
ｒｄｓｏｎ　の染色によシ対比染色される。

第６図Ａは、抗Ｐ５抗血清で染色された小脳細胞の低倍
率顕微鏡写真であシ、繊維索（ｔｒａｃｔｓ）を示す：
分子層（Ｍ）、プルキンイエ細胞層（Ｐ）％顆粒状細胞
層（Ｇ）及び白色物質（ＷＭ）。棒は５００ミクロンに
等しい。

＄６図Ｂは、第６図Ａで四角く囲んだ領域を示す小脳細
胞の拡大顕微鏡写真である。分子層に訃ける放射方向及
び接線方向の繊維は矢印で示されている。他の詳細は第
６図Ａと同じであシ、棒は２５ミクロンに等しい。

第６図Ｃは、抗Ｐ５抗血清を用いた着色した海馬のＣＡ
Ｂ領域の繊維を示す写真である。略記号二分子層（Ｍ）
及び錐状細胞層（Ｐ）。棒は５０ミクロンに等しい。

第６図りは、第６図Ｃと同様であるがポリペプチドＰ５
を予め吸収された抗Ｐ５抗体を用いた顕微鏡写真である
。反応しないノイロンはクレシルバイオレットで対比染
色される。棒は５０ミクロンに等しい。

＠６図Ｅは、抗Ｐ５で染色された帯状皮質内の繊維を示
す顕微鏡写真である。Ｉ−１内の接線方向の繊維（垂直
棒で示される）及びよシ深い層内の半径方向繊維が見ら
れる。左下隅の水平棒は５０ミクロンに等しい。

第６図Ｆは、抗Ｐ６抗体を用いて染色された帯状皮質内
の繊維の顕微鏡写真である。示される皮質の領域は、４
Ｘ６図Ｅのよシも深い。棒は５０ミクロンに等しい。

第６図Ｇは、抗Ｐ５抗体を用いた深い小脳核の染色を示
す顕微鏡写真であシ、大きな細胞体の強い周辺染色を示
している。棒は５０ミクロンに等しい。

第６図Ｈは、コルヒチン処理されたラットの脳幹からの
抗Ｐ５−接体で染色された細胞体の低偕率顕微鏡写真で
ある。棒は１００ミクロンに等しい。挿入した第６図Ｈ
ａは、第６図Ｈの細胞体の拡大顕微鏡写真である。

第７図は、クローンＩＥ１２０８の％徴を示す。

第７図Ａは、ｐＩＢ２０８　ｍＲＮＡの組織分布のＮｏ
ｒ　ｔｈｅｒｎ　プロット分析を示すオートラジオダラ
ムの写真である。詳細は第１図Ａと同様である。

第７Ｂは、ラットの脳の９１８２０８ｍＲＮＡとｐＩＢ
１５　、ｍＲＮＡの領域分布のＮｏｒｔｔｌｅｒｎプロ
ット分析を示すオートダラムの写真である。

ｎｌ１ｔｏは第１図Ｂと同様である。

第７図Ｃは、ｐ１８２０８　ｃＯＮＡインサートのセン
スストランドのヌクレオチド配列を示し。

翻訳されたオープン読出しフレームを示している。

インサート配列の５′末端は、プラスミドｐ８Ｒ５２２
のＥｃｏ　Ｒｌ切断位置に近い。詳細は第１図Ｃと同様
である。第７図りは、クローン１８２０８のセンススト
ランド及びオープン読出しフレームの決定を示す。詳ｍ
は＠１図０と同様である。制限エンドヌクレアーゼの略
記は次の通り　：　Ｓａｕ！ｌ　Ａ　（Ｓ）及びＡｖａ
　ｉｉ　（ｖ）。

第７図Ｅは、第７図゛Ｄで述べたように調製された単一
末端ラベルされた制限フラグメントによるｐＩＢ２０８
　ｍＲＮＡの検出を示すオートラジオダラムの写真であ
る。フラグメン）ＶＩ３１は。

より大きなｐＩＢ２０８　ｍＲＮＡのある検出をなすフ
ラグメント■Ｓ２で僅かに汚染された。詳細は４１図Ｅ
と同様である。

第８図は、クローン、０−４０の特徴を示す。

第８図Ａは、ｐｏ−４０ｍＲＮＡの組織分布のＮｏｒｔ
ｈｅｒｎ　プロット分析を示すオートラジオグラフの写
真である。詳細は第１図Ａと同様である。

第８図８は、０Ｏ−４０ｅＤＮＡクローンインサートの
センスストランドのヌクレオチド配列を示す。５′末端
は、グラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏ　Ｒｌ切断位置に
近い。詳細は第１図８と同様である。

第′８図Ｃは、ｏＯ−４０の可能なオーシン読出しフレ
ームを示す。ｃＤＮＡインサートのセンスストランド（
太線）が図の上方に示されている。

下方には、センスストランドの可能な三つの読出しフレ
ームにおいて、開始コドンの位置が白丸（０）で示され
、終了コドンが黒丸（・）で示されている。各フレーム
において最大ｏｒｆの位置及び長さくトリブレット）も
示されている。

〔発明の詳細な説明〕

発明゛明は１合成ポリペプチドならびその使用から得ら
れる生成物及び方法を意図する。

本発明の合成ポリペプチドは、自然に生じるプロティノ
イドの配列の少くとも一部処対応するアミノ酸残基配列
を持ち、かつプロティノイドの分子量に等しいないしそ
れよシ小さい分子量を持つつ合成ポリペプチドが対応す
るプロティノイドアミノ酸残基配列は、主に脳及び／又
はを髄細胞中にのみ存在するメツセンジャーＲＮＡから
翻訳される。脳及びを髄は密接に関係するので、これら
ｍＲＮＡは木切１１（］唇では「脳特異的」あるいけ「
主に脳にのみ存在する」と云うことがあるが。

それらはまた背髄にも存在することを理解せねばならな
い。すなわち１本発明の合成ポリペプチドのアミノ酸残
基配列に対応するアミノ酸残基配列を持つ自然に生じる
ゾロティノイド、蛋白質及びポリペプチドは自体、主に
脳細胞組織中でのみ作られる。このことは、ンマトスタ
チン、チロトロピン放出因子（ＴＲＦ）、ルティン化性
ホルモン放出因子（ＬＲＦ）、エンドルフィン及びエン
ケファリンのような物質、あるいはいくつかの他の小さ
なポリペプチドたとえばビンベスチン、セルレイン（ｃ
ａｅｒｕｌｅｉｎ　）又はフイサラミン（これらは脳な
らびに動物体の他の組織中で生じることが見い出されて
いる）と対照的である。（Ｇｕ目１ｅｍＩｎ、５ｃｉｅ
ｎｃｅ２０２．３９０〜４０２（１９７８）Ｅ木切細Ｉ
で用いるいくつかの語又は句の定義を以下で述べ１次に
本発明で有用な方法の一般的説明及び次［４？定の実施
態様の説明を行なう。

プロティノイドーーープロティノイドという言葉はここ
で、メツセンジャーＲＮＡの直接ポリペプチド翻訳生成
物を意味するために用いられ、約６００〜約１，０００
，０００及びたぶんそれ以上の分子量を持ちつる。ゾロ
ティノイドは、単−蛋白質又は（ａ）後に脳細胞によシ
細胞的に有用な複数の蛋白質に加工される複数の蛋白質
、（ｂ）後に脳によシ複数の細胞的に有用なポリペプチ
ドに加工される複数のポリペプチドの融合生成物又は（
Ｃ）後に細胞的に有用な物質に加工される−又は二以上
のポリペプチドと−又は二以上の蛋白質の融合生成物の
融合生成物であることができる。

プロティノイド誘導体−一−グロテイノイド誘導体とい
う言葉はここで、ゾロティノイドの細胞的処理から得ら
れるポリペプチド含有物質を慧昧するものとして用いら
れる。従ってゾロティノイド誘導体は、複数の蛋白質、
神経活動を持つ約６〜約８０のアミノ酸残基を含むポリ
ペプチドなどを含む融合生成物から細胞活動によシ切断
された蛋白質であることができる。加えて、グロテイノ
・イド誘導体は、ゾロティノイド全体又はよシ小さいプ
ロティノイドのグルコシル化生成物又はトランスアミ　
ド化−除去反応の生成物などであることができる。

免疫反応−ｍ−免疫反応という言葉はここで。

リガンドとその受容体の結合を意味し、抗原（リガンド
）と抗体（受容体）の結合、ならびに抗原と抗体（受容
体）の遺伝型含有ポリアミド部分との間の結合を包含す
る。はとんど対応する一一一はとんど対応するという言
葉はここで、アミノ酸残基配列と関連して用いられ％第
一のポリペプチドのアミノ酸残基配列が第二のポリペプ
チドに含まれるアミノ酸残基配列に十分に類似していて
、その結果第一のｙｌ？　リペプチド（たとえば合成ポ
リペプチド）に対する抗体が第二のポリペプチド（たと
えばゾロティノイド又は誘導体）と水性礎体中で混合さ
れたときに免疫反応を形成する程であることを意味する
。

そのようなポリペプチド及び抗体の調製は、後記の材料
及び方法の部で述べる。

上述の二つのポリペプチドたとえば合成ポリペプチドと
ゾロティノイドのエピトープを含むアミノ酸残基配列部
分は、最も好ましくは同一である。

しかしアミノ酸残基における保守的変化及びエビドーグ
内のアミノ酸残基の除去又は付加は行うことができ、第
一のポリペプチドに対する接体の第二のポリペプチドと
の交叉反応は既知のようになおｏ７能である。保守的な
アミノば残基変化は周知であり、リシンとアルギニンの
間、アスパルチン酸とグルタミン酸の間、ロイシンとイ
ンロイシンの間などのような残基の交換を包含する。

個々のアミノ酸残基の完全な名前が用いられ、また周知
の三文字略記及び−文字略記も用いられる。木切細俤で
述べられる各アミノ酸の完全な名前、三文字及び−文字
略記（・）対応表を下記に示す。

対応表 アラニン　Ａｌａ　＾ ｒルギニン　Ａｒｇ’　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ −ｒスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ アスパラギン又はアスノぞラギン酸　Ａｓｘ　Ｂシステ
ィン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　ε グルタミン又はグルタミン酸　Ｇｌｘ　Ｚグリシン　Ｇ
ｌｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ イソロイシン　ｌｌｅ　ｌ 口　イ　シ　ン　Ｌｅｕ　Ｌ リ　シ　ン　Ｌｙｓ　Ｋ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プ　ロ　リ　ン　Ｐｒｏ　Ｐ セ　リ　ン　Ｓｅｒ　Ｓ トレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｗ チロシン　Ｔｙ、ｒ　Ｙ パ　リ　ン　Ｖａｌ　Ｖ 下記の説明は、脳特異的なメツセンジャーＲＮＡ（ｍ　
ＲＮ　Ａ　）から翻訳されたグロティノイドを固定する
ために及びこれらグロテイノイドの少くとも一部のアミ
ノ酸残基配列にほぼ対応するアミノ酸残基配列を持つ合
成ポリペプチドの製造のために１ならびにこれら合成ポ
リペプチドから受容体分子を作るために有用な手順の概
略を示す。

■　一般的アゾローチ 脳中に発する（　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　）メツセンジャ
ーＲＮＡの複雑性は、他の組織におけるよシも高く。

従って組織特異的ｍＲＮＡ分子の多数は容易に同定でき
る。また、ニーカリオー）　（ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ　
）の蛋白質はそのｍＲＮＡとコＩＪ　ニア−でありしか
しその遺伝子とは必ずしもコリニア−でないので。

総遺伝因子ＤＮＡでなくて脳ｍＲＮＡが研究のための適
当な出発部分である。

成熟した雄ラットがモデルとしてここで選ばれた。なぜ
ならそれは行動学的、神経生理学的、生化学的及び神経
解剖学的研究に広く用いられているからである。また哺
乳動物間の脳組織構造及び機能の類似性が、ラットから
の有用な結果をヒト及び他の動物に外挿することを既仰
のように可能にする。

成熟雄Ｓｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｗｌｅｙ　ラットの脳か
らの細胞形質ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍ　ＲＮ　Ａを精製し１
次に相補的ＤＮＡ（ｅＤＮＡ）に転換した。ｃＤＮＡは
、サイズ富化及びシラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部
位へのアニーリング後に、　Ｅｓｃｈｅｒｌｃｌａ　ｅ
ｏｌｉを形質転換するために用いられた。組換えプラス
ミドＤＮＡは、個々のｃＤＮＡクローンの小さな一夜培
養物から単離され、　ｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎ　により放射性にラベルされ、そして脳、肝１裁及び
腎臓ｐｏｌｙ（Ａ）＋　ｍ　ＲＮ　Ａの試料を用いてＮ
ｏｒｔｈｅｒｎ　プロットで相補的ｍ　ＲＮ　Ａを調べ
るために用いられた。

ｃＤＮＡクローンの混成パターンは４つの類に分けられ
る二三つの組織全部に等しく混成するも（クラスＩ：１
８％）：三つの組織に異って混成するもの（クラス■；
２６％）；脳ｍ　ＲＮ　Ａ　Ｋのみ混成するもの（クラ
スＩＩＩ：３０％）：及び検知しつる混成を示さないも
の（クラスＩＶ：２６％）。

表１〜４は１作られたクローンを、それらが検出したｍ
　ＲＮ　Ａの組織分布パターンによシ分類して示す。こ
れらデータは表５にまとめられる。

クローンのいくつかに対応するｍＲＡＮ分子の豊富さく
　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　）は、過剰、の精製したシラス
ミドＤＮＡに対して、アルカリ破壊した３２ｐ末端ラベ
ルしたｐｏｔソ（Ａ）十脳ｍ　ＲＮ　Ａを混成すること
によシ独立に評価された。

Ｎ　吋）　寸 表　４ クラス■　クラスＶ ｓｏｕｔｈｅｒｎ’ポジティブ１　１９Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎノネガテイブ２　１２テストされなかった６６のクロ
ーン’　２２’　１４４奇妙なもの　１１ 合計　４１３７ １：クローンは、ネカテイプなＮｏｒｔｈｅｒｎ　プロ
ット分析及びポジティブな５ｏｕｔｈｅｒｎ　プロット
分析を示す。

２：クローンはネカテイプなＮｏｒｔｈｅｒｎ　プロッ
ト分析及びネガティブな５ｏｕｔｈｅｒｎ　プロット分
析を示す。

３：クローンは５ｏｕｔｈｅｒｎ　プロットで分析され
なかった。

４：各クラスにおけるクローンの推定数１：作られたク
ローンの数及び作られたクローンのノン−セント ２：作られたクローンと混成するｍＲＮＡの数３＝作ら
れたクローンによシ示される脳ｍ　ＲＮ　Ａのノン−セ
ント ４：各クラスについて算術的に計算した平均ｍＲＮＡ長
さ ５：サイズ及び、豊富さの合計で割った豊富さとの積の
合計 ６：数値はｌ“０配列を含む。

７：数値は、推定されたしかし検出されなかったクラス
ＷのｍＲＮＡを含む。

８：数値ｒｒ１．　１つよシ多いクラスに該当する４つ
のクローンを含む。

クローンの４つのクラスのうち、クラスｍと■のクロー
ンがここで重要である。クラス■のクローン（１９１の
うちの４５）は、脳で検出されるが肝臓又は腎臓では検
出されないｍＲＮＡに対して混成し、そしてクローンｐ
ｌＡ７５によシ例示される（詳細は後記）。これらクロ
ーンは、脳ののノンロン及び／又は神経膠中に発せられ
（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ”）　（、かし肝臓又は腎臓では
要求されないプロティノイドのためのｍＲＮＡを表わす
と推定される４８のｍ　ＲＮ　Ａ種に対応する。更に。

これらクラスｌｌ１ｍＲＮＡのあるものは、脳細胞のサ
ブセット中でのみ見い出さ、れるプロティノイド誘導体
を作力、それによシｍＲＮＡが細胞のサブセット中での
み発生られることを示唆している。

また、５つのクラス■のクローンは、各クローンにおけ
るｃＤＮＡインサートが５００〜１２５０のヌクレオチ
ド塩基長さであるけれども、１６０のヌクレオチド塩基
の脳性異的細胞形質ｐ　ｏ　ｌ　ｙ（Ａ）十ｍＲＮ＾タ
ーゲットに混成した。これら５へのクローンは、もとの
ｐｏ＋ｙ（Ａ）子細胞形１１ｊｍＲＮＡＭ製物の束部（
２〜３幅）であるが、小脳特異的ｍ　ＲＮへ分子中にも
見い出される繰返し配列要素（’ｄ□配列）を含む脳性
異的ｍＲＮＡの先駆体をＵＳＡ、　７９．４９４２−４
９４６（１９８２））。

１９１のクローンのうちの６７は、脳、肝臓又は腎臓に
おけるｍＲＮＡターゲットを検出するのに失敗した。こ
れらクローンは、ラット脳ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを
含まず、クローン集団中にいく分人工的に存在するプラ
スミドを表わすが又はそれらは比較的布なｍＲＮＡのｃ
ＤＮＡコピーを含むプラスミドを表わしうると考えられ
る。

プラスミドにおけるラット遺伝情報の仔在は。

ラットＤＮＡの５ｏｕｔｈｅｒｎプロツトを調べるため
に［５ｏｕｔｈｅｒｎ　、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉａｌ、、９
　８．　５　０　５〜５　１　７（１９７５））これら
の可能性を区別するｎ１ｃｋ　・ｔｒａｎｓｌａｔｉｏ
ｎされたシラスミドを用いてテストされた。６７のＮｏ
ｒｔｈｅｒｎ　プロットネガチグなりローンから無作為
に選ばれた６１のクローンのうち、１９（Ｓ１％）はラ
ット肝臓ＤＮＡの５ｏｕｔｔｌｅｒｎプ四ツトにおいて
制限フラグメントに対して混成した。これは、これらク
ローンがラット遺伝子から転写された希なｍ　ＲＮ　Ａ
Ｖｃ対応することを示唆してｂる。

３１のクローンは６７のＮｏｒｔｈｅｒｎ　プロットネ
ガチプなりローンから無作為に選ばれたので、テストレ
なかった残シの３６クローンの６１％、つまり２２のク
ローンもまたラット遺伝子から転写された希なｍＲＮＡ
に対応すると想定される。すなわち、合計４１のクロー
ンが希な脳ｍＲＮＡに対応し、これら４１のクローンは
クラスＮＱクローンを包含する。

残る２６のＮｏｒｔｈｅｒｎ　プロットネがチグ々クロ
ーンは、クローニングの人工物であると考えられ。

クラスＶ（表４）と分類される。クラスＶはまた。

奇好な混成ノやターンを示し、クラス夏〜■のクローン
に分類できない１１のクローンを含む。通常奇好な混成
パターンは、不連続なバンドを示さない＠、肝臓及び腎
臓ｍＲＮＡによるよごれであるたぶん、よごされた混成
パターンは、総てのサイズクラスのｍ　ＲＮ　Ａ及び三
つの全部の組ｔＡｍＲＮＡ調梨物中に存在するｐｏｌｙ
（Ａ）十尾部（ｔａ日）に対するシラスミド中のＤＯＩ
Ｖ　（Ｔ）　配列の混成による。

合計して１９１のクローンが調べられ、そのうち１５４
は１７１のｍＲＮＡ（４１の推定されたクラス■　ｍＲ
ＮＡを含め）に対応する。合計してこれらクローンは、
オツド脳の総ての細胞形質ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍ　ＲＮ　
Ａの２８％（重量）より多くに該当する。ｐｏｌｙ（Ａ
）＋　ｍ　ＲＮ　Ａのさらに２チは、層管異的な１６０
のヌクレオチド塩基ｍＲＮＡによシ説明される。各クラ
スに該当するクローンの分画け、上述の表５に示されて
いる。最大の分画け、層管異的なりラスｍクローンであ
る（６０％）。

クラス■のクローンの総て又は殆んどが首だ希な層管異
的ｍＲＮＡに対応すると考えると、クローンの半分以上
が脳中でのみ発せられるｍＲＮＡに対応することになる
、 表１〜６に示したｍＲＮＡの算術及び数平均サイズは、
各クラスについて及び全層ｍＲＮＡについて計算された
（表５）。算術平均は、用いられた検出手段により評価
されたｍＲＮＡの平均長さを表わす。数平均は、クロー
ンによシ表わされるｍＲＮＡの混合集団（ポピユレーシ
ョン）の平均長さを反影する：それは各々特定のｍ　Ｒ
Ｎ　Ａの豊富さで重みをつけられておシ、ｍＲＮへの異
種の混合物たとえばｍＲＮＡの複雑さの溶液混成測定で
用いられるものの平均長さの測定値と比べるのに適当な
数字である。

クローン（クラスＩ−＃）Ｋよシ検出された脳ｍＲＮＡ
の総数平均長さは、１７９０ヌクレオチド塩基であシ、
この数字の先の著者の測定値（１４００〜１９００ヌク
レオチド塩基）と同等である。Ｂａｎ　ｔ　Ｉ　ｅら、
Ｃｅ目、８．１３９−１５０（１９７６）　：　Ｈａｓ
ｔｉｅら、Ｃｅ１１．　９．　７６１−７７４（１９７
６）：及びＧｒｏｓら、Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅ
ｎｅｔ　ｉｃ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｓｃｈｍ
ｉ　ｔｔ、　Ｂｉｒｄ及び引ｏｏＢｅｄｓ、、　Ｒａｖ
ｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　３３５−５４
７（１９８２）う　〕 クラス■のクローンの算術平均長さは、かなり大きく、
２６４０ヌクレオチド塩基である。クラス■のクローン
の長さは、さらに長く、平均値４９６０塩基であると推
定される。このことは。

脳細胞において最も「３９達するｍＲＮＡは、よシ希な
ｍＲＮＡよシも小さい傾向があることを示す。

同じ結論が、各独立のクラスのｍＲＮＡについて二つの
平均値を計算したときにも成立する。すなわち、よシ関
連するｍＲＮＡは、よシ希なｍ　ＲＮ　Ａより短い傾向
がある。篇ろくべきことに、クラスｍのｍＲＮＡ１ｄ平
均して、他の組織中で同じく発せられるそれらよシも二
倍以上大きい。

表１〜３のクローンに対応するｍＲＮＡの豊富さは、各
クローンについて直接測定されなかった。

１１のクローンに対応するｍ　ＲＮ　Ａの豊富さが直接
測定され、そして他のクローンの相対的豊富さが混成検
知手段特異的活動の比較、直接測定した場合に対するオ
ートラジオグラフ露出倍数及び相対的バンド強度に基づ
いて決められたう得た推定の豊富さは、各ｍＲＮＡがい
くつかの不連続な殴富さのクラスの一つに入るように丸
められた。従って、豊富さの推定値は、約２の係数で正
確であると考えられる。更に、推定値が約０．０１４よ
ル下である場合、これら推定値は約ａ、ａ１チまで上方
に丸められた。

クラスｍの４７のクローンのいくつかが、後記するよう
に更に詳細な研究のために選ばれた。各々について、ヌ
クレオチド塩基の決定、及び続いて対応するｍＲＮへの
センススト２ンドの決定のためにクローンからの精製し
た。単一末端ラベルした制限フラグメントを用いるアプ
ローチをとった。次に、公知の遺伝子コードを用いてポ
テンシャルトリブレットオープン読出しフレーム（ｏｒ
ｆ）をアミノ酸残基配列に解読した。得た仮説側蛋白質
配列はそあ後、既知の蛋白質との有）得る同−性又は類
似性を見い出すために、既知の蛋白質配列の集積データ
とコンピューター分析によシ比較された。最後に、細胞
によシブロティノイドに翻訳されたと最も可能性のある
ように見えるオープン読出しフレームを選び、とれら仮
説的アミノ酸残基配列からの領域に対応する短いポリペ
プチドを化学的に合成して、ラビットで免疫原として用
いた。得た抗血清を、免疫細胞化学的手法を用いて固定
し７た脳切片におけるプロティノイド又はその誘導体の
検出のために用いた。

１例としての脳特異的クローンの特徴 クラス■の４つの脳特異的クローンを例として下記に説
明する。これらクローンは、ＰＩＡ７５、ｐＩＢ２５６
、ｐＩＢ２０８及びｐＯ−４０と呼ばれる。これらクロ
ーンの一般的特徴は、下記の表６にまとめて示す。

各々、１１２６．１５００．９７８及び１２００塩基の
クローンインサートのサイズは、各インサートのヌクレ
オチド配列から誘導された。ｍＲＮＡのサイズは、各ク
ローンがそれにＮｏｒｔｈ＠ｒｎ　プロットにおいて混
成したところの脳特異的ｍ　ＲＮ　Ａターゲットのアガ
ロースグル上での易動性から推定された。ｍ　ＲＮ　Ａ
の豊富さく　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　）は、過剰プラスミ
ドＤＮＡに混合した破壊した３２Ｐラベルしたｐｏｌｙ
（Ａ）”　ｍ　ＲＮ　Ａの量を測定することにより決定
された。　・ 簡単に云えば、これら４つのＤＮＡクローンは、１６０
０〜４０００のヌクレオチド塩基のｍＲＮＡを表わし、
その各々は全層ｍ　ＲＮ　Ａのざっと約０．０１〜約２
−の範囲の濃度で存在する。ここで用いたプロットの感
度に基づいて、肝臓又は腎臓中の対応するｍＲＮＡのレ
ベルは、細胞当シ約２００．０００ｍ、ＲＮＡ分子と仮
定して、細胞当ル１コピーよル少ないと推定される。す
なわち、この４つのクローン及びクラス■及び■のクロ
ーンのｍＲＮＡは、肝臓及び腎臓のような他の体組織に
は実質上存在しない。云い換えれば、このｍＲＮＡはほ
とんど脳細胞組織中にのみ存在する。

脳は多くの異なる構造及び細胞タイプより成るので、ｃ
ＤＮＡクローンは、７つのサブ領域（皮質、嗅神経球、
尾状核、海馬、視床下部、小脳及び脳橋／後脳）からの
脳のｍＲＮＡ調製物に対する混成のための検知手段（プ
ローブ）として、何らかの別の領域的特異性を定義する
ために用いられた。クローンはまた、何らかの細胞特異
性を測定するために、神軽起源の腫瘍〔マウスの神経芽
細胞腫、ラットのクローム親和細胞腫ＣＰＣ１２）及び
ラットの神経膠腫〕からのｍ　ＲＮ　Ａに混成された。

これらの結果は後に説明に、また表６にまとめて示す。

１；グラスミドに挿入された各クローンのヌクレオチド
配列の長さ ２：ヌクレオチド塩基の数平均長さ ５：全路ｍＲＮＡのノ七−セントとして表わした。

推定した豊富嘔 ４　：ｍＲＮＡが存在する脳中の位置 ■クローン Ａ、クローンｐＩＡ７５ １７００のヌクレオチド塩基対ｍ　ＲＮ　Ａに混成した
１）ＩＡ７５ＣＤＮＡ、クローンは、ラット脳細胞形質
ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍ　ＲＮへ全体の約０．１−で存在し
、第１図から判るように肝臓又は腎臓のｐｏｌｙ（八）
＋ｒｙ＋ＲＮＡ中には存在しない。ｐＩＡ７５クローン
に対応するｍ　ＲＮ　Ａは、第１図Ｂから判るように、
脳の７つの解剖された領域すべてにほぼ等しく発せられ
る。肝臓及び腎＠ｍＲＮＡ調製物に対して混成する仁と
の失敗は、これら組織からのｍ　ＲＮ　Ａの変性（分解
）によるのではない。

なぜなら、そのｍ　ＲＮ　Ａが組織調整されていない他
のｃＤＮＡクローン（１）１８１５）は脳に対してと同
様にとれら非神経細胞の同じｍＲＮＡＷ４製物に混成し
たからである（データは示していない）。

脳ｍＲＮＡの領域的調製において、　、ｐ　Ｉ　Ｂ　１
５に混成する調整されてないｍ　ＲＮ　Ａは、内部規準
物として働き、約同量のｍ　ＲＮ　Ａが各グルレーンに
負わされたことを示す。

従って、異なるレベルの混成は、種々の組織中のｐＩＡ
７５ｍＲＮ＾の濃度における真の差を示す。小脳中のｐ
１＾７５　ｍ　ＲＮ　Ａの明らかな豊富化は、対照１）
１８１５シグナルの同じ増加を伴い、そして従ってｐ１
＾７５ｍＲＮＡ濃度の増加ではなくてグルに施与された
全ｍＲＮＡを反影するにちがいない。

ｐ１＾７５ｍＲＮへは、第１図へで判るようにＰＣｌ　
２細胞吊で発せられるが、神経膠腫又は神経芽細胞腫中
では発せられない。従ってｐ　Ｉ　Ａ７５は、ノイロン
及びたぶん神経内分泌細胞中で（しかし神経膠膜中では
なく）作られた！ロティノイドに翻訳するｍＲＮＡに対
応するようである。

各ｃＤＮ＾インサートからの二つの制限フラグメントは
、１１２６のヌクレオチド塩基ｐＩＡ７５配列のコーデ
ィングスト２ンドを決定するために調製された（第１図
Ｃ）。各フラグメントは、二つの代替的５′末端の一つ
に３２Ｐ２ペルされて、二つの可能なｍＲＮＡ配向の各
々のための混成検出手段を第１０に示すように作った。

一つの検出手段はＮｏｒｔｈｅｒｎ　プロットで１７０
０のヌクレオチドのｍ　ＲＮ　Ａに混合し、それがｍ　
ＲＮ　Ａに対して相補的なストランド上でラベルされた
ことを示した：他方の検出手段は第２図Ｅに示すように
混成しなかった。この結果は、第１図Ｃの配列がｍＲＮ
Ａのコーディングストランドに対応することを示す。す
なわちクローンｐＩＡ７５は、全路ｍＲＮＡの約０．１
％を代表する脳性異的な１７００のヌクレオチド塩基の
ｍ　ＲＮ　Ａのセンスストランドの一部の１１２６の残
基配列である。

次にこのｍ　ＲＮ　Ａから蛋白質の性質が翻訳されえた
かどうか見るために、ヌクレオチド配列を、第１図Ｏの
ように翻訳開始体（イニシエーター）トリプレット（Ａ
ＴＧ、ＧＴＧ）及び終止体（ターミネータ−）トリプレ
ット（ＴＧＡ、ＴＡＡ、ＴＡＧ　）のためにスキャンし
た。周知の遺伝子コードを、何らかの手頃な大きさの可
能性のらる引−プン読出しフレーム（ｏｒｆ）を仮説的
プロティノイドへと解読するために用いた。

ρ１＾５７配列中に僅か二つのそのような大きなｏｒｆ
が存在し、この両者は第１図ＣにおけるようにｃＤＮＡ
配列のセンスストランドからプロテイノイド配列へと解
読された。一つの可能性のあるフレーム（ｏｒｆ　１　
）は５′末端で非結合でｓｂ、終止体に達するまで８２
のトリプレットを伸ばす。

他のフレーム（ｏｒｆ　２　）は、１１９のトリプレッ
トの長さを持ち、ｐＩＡ７５配列内に完全に含まれる。

どのようにしてクローンｐＩＡ７５のＣＯＮへの１１２
６のヌクレオチド塩基がｍ　ＲＮ　Ａの１７００ヌクレ
オチド塩基たとえば５′、ミＰル又は５＃内に整列され
るかというととは配列自体からは判らないので、　ｏｒ
ｆ　１は可能性としては細胞によシ約５０キロダルトン
（５０にダルトン）までのプロティノイドに翻訳される
ことができ。

一方、ｏｒｆ２は可能性としては約１５にダルトンでな
ければならないプロティノイドに翻訳されうる。二つの
仮説的配列の各々のコンピューター検索は、５０の残基
の重複するセグメントにおいて、いずれの既知の蛋白質
配列との同族性をも示さなかった。Ｄａｙｈｏｆｆら、
ＰＳＯＶｅｒｓｉｏｎ　４、Ａｐｒ　Ｉ　１５０．１９
８２、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ
５ａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ　、　Ｇｅｏｒｇｅｔ
ｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ＭｅｄｉｃａｌＣｅｎ
ｔｅｒ　（以下では単にＤａｙｈｏｆず　地図と云う）
。

仮説的ｏｒｆ配列が脳細胞プロティノイドに対応するか
どうか決めるために、二つのアプローチを行った。変性
した１）ＩＡ７５ＯＮＡをニトロセルロースフィルター
に結合させた。次にそのようにして作ったフィルターを
、全路ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡとの混成によシ相補的
ｍＲＮＡを精製するために用いた。フィルターをよく洗
った後に、結合したｍＲＮＡを、煮沸によシ解放し、そ
してＣ１ｅｖｅｌａｎｄら、Ｃｅｌ　Ｉ　、　２０．９
５〜１０５　（１９８０）　、Ｐ’よシ記載されるよう
にしてインビトロの蛋白質合成（へ′イブリッド放出翻
訳）をグログラムするために用いた。

精製されたｍＲＮＡは、約２５にダルトンのグル易動性
を持つプロティノイドの合成を刺激し。

これは対照反応では存在しない（第２図Ａ）。非精製の
脳ｐｏｌｙ（Ａ）十ｍ　ＲＮ　Ａは、多くのプロティノ
イドの合成をプログラムした。これらの測定から、この
分子の大きさく２５にダルトン）は、０「ず１がｐＩＡ
７５ｍＲＮＡの生成物に翻訳されるようでちることを示
唆する。なぜなら、　ｏｒｆ　２及び他の可能性はあま
シに小さいからである。

ｏｒｆ　ｊ内の二つのアミノ酸残基配列に対応する二つ
の１３の残基の合成ポリペプチド、ｐ１及びｐ２は、ｐ
　１Ａ７５ｍＲＮＡ翻訳の推定の生成物を検出するため
に化学的に合成された。第１図Ｃでアンダーラインを付
した４リイプテドは、５ｕｔＣ日ｆｆｅら、５ｃｉｅｎ
ｃｅ　、２１９．６６ｏ〜６６６（１９８５）によル説
明された規則を用いてプロ・リン残基及び荷電残基を含
むように選ばれた。これらポリペプチドは次に、材料及
び方法の部で説明するように種々の担体と結合された。

Ｐ３と名付けられた合成ポリペプチドがまた、ｏｒｆ　
２から合成された。合成ポリペプチドＰ１．Ｐ２及びＰ
３は、以下では場合によシ、合成ポリペプチドであるこ
とを云わずに単にＰｌ、Ｐ２及びＰ５と呼ばれる。

三つのポリペプチドのアミノ酸残基配列は、合理的な濃
度においてこれら三つのポリペプチドの何れかに対する
抗血清が既知の配列の何れかの蛋白質と特異的に相互反
応する可能性を排除するために、コンピュータデータベ
ース検索によシ先述のＤａｙｈｏｆｆ地図と比較された
。三つのポリペプチドのいずれも、密接な同族体を持た
ないことが判った。

？リペプチドー担体接合体に対する抗血清がラビットで
作られた。血清は、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｅ１ｌ。

２８．４７７〜４８７（１９８２）の手順を追ってＥＬ
ＩＳＡにより、適当なポリペプチドと強く反応すること
を示した。

抗血清を次に、ρ１＾７５ｍＲＮＡを作る３５Ｓ−メテ
オニンラベルされたｐｃ１２細胞の抽出物を検出するた
めに用いた。その後１合成ポリペプチドＰ１に対する抗
血清は、約２８にダルトンの僅かに拡散するダル易動性
を持つブローテイノイＰと反応することが見られた（第
２図Ｂ）、抗合成ポＩＪ　１５プチドＰ２血清は、同じ
グル易動性を持つプロティノイドに対してはよシ小さな
反応性を示すが、抗合成ポリ４プチドＰ５は反応しがか
った（データ示さず）。

従ってｏｒｆ　１は、ｐＩＡ７５に対応するｍＲＮＡの
！ロティノイドコーディングフレームである。

ｏｒｆ　１の僅か８２のトリプレットのみがｃＤＮＡ配
列の５′末端にあシかつｏｒｆ　１は２８にダルトンの
生成物の一部に翻訳されるので、ｐ１＾７５は対応する
成熟ｍ　ＲＮ　Ａの５′領域を表わすにちがいない（第
２図Ｃ）。従って、約８００のヌクレオチドを伸ばすこ
のｍ　ＲＮ　Ａ上に長い３′非翻訳領域がある。５′プ
ライムコーディング配列の約４５０のヌクレオチドは従
って欠損している。

脳のどの細胞内でＩ）ＩＡ７５ｏｒｆグロテイノイドが
発せられるかを決めるために、ラット脳の薄い固定切片
を抗Ｐ１、抗Ｐ２及び抗Ｐ３血清と反応させた。切片を
洗い、抗体−抗原（受容体−りｊｆ７ド）複合体を、西
洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合した抗ラビッ
ト免疫グロブリンによシ可視化した。

合成ポリペプチドＰ１に対する一つの抗血清は、脳のど
こにもある成るノイロンの細胞体（皮質錐状細胞のよう
な多数のノイロンを含め）と反応した（第５図へ〜Ｃ）
。反応性は細胞形質的であるように見え、顆粒状外観を
持つ。しばしば、顆粒は細胞の樹枝吠棹（ｄｅｎｄｒｌ
Ｎｃ　ｐｏｌｅ　）　に集中しておシ、また樹枝状体（
ｄｅｎｔｒｌｔｓ　）　自体の中にしばしば観察される
（第３図Ｃ）。反応する細胞体は、小脳、深小脳核、視
床下部、上位小丘、支脚及び脳皮質中に見い出された。

抗Ｐ２血清は、細胞形質染色の同じ・モターンを与えた
。しかしそれは、視床下部中の小グループの細胞に限ら
れた（第３図０）。これらのデータは抗Ｐ１染色パター
ンと共に、視床下部のプロティノイドはいく分よシ免疫
性であ）、抗Ｐ２血清はｐｃ１２抽出物の免疫沈澱につ
いて述べたようによシ弱いと解釈される。

抗Ｐ２免疫反応性は１合成ポリペプチドＰ２を用いる抗
血清の前培養にょジブロックされた。抗Ｐ１血清の反応
性は、合成ポリペプチドＰ１、Ｐｌ−チログロブリン接
合体（これに対して抗血清が生じた）又はテログロブリ
ン単独にょジブロックされることはできなかった。

染色の顕著な細胞形質の顆粒状の特性は、脳のどこでも
同じであり、視床下部において二つのポリペプチドに対
する抗血清と同様のようである。

また二つの抗血清はＰｃ１２細胞の抽出物中の同じサイ
ズのプロティノイドと反応するので、抗Ｐ１及び抗Ｐ２
血清の両者はたぶん脳中の同じゾロティノイド又はその
誘導体すなわちＰＣ１２抽出物中に見られるｐ１＾７５
ｍＲＮへの２８にダルトンの生成物と反応するのであろ
う。

合成ポリペプチドＰ３に対する抗体は、脳の片の領域と
も反応しない。この結果は、ｏｒｆ２がｐ　Ｉ　Ａ７５
の真のコーディング領域でないという結論と矛盾しない
、。

抗Ｐ１及び抗Ｐ２免疫反応の分布は一般に、第１図Ｂに
見られるようにｐＩＡ７５ｍＲＮＡの領域的局在と一致
し、反応性細胞体は脳のどこにも存在する。染色は総て
の細胞において観察される訳ではなく、形態学的に関連
すると見えるノイロンのザブセットに限られた。反応性
細胞の多くは、錐状細胞のように大きな突き出たノイロ
ンである。

細胞内の反応性プロティノイドの細胞形質的位置、及び
顆粒状外観及び免疫反応の極配向（ｐＯｌａｒｏｒｉｅ
ｎｔａｔｉｏｎ　）は、このプロティノイド又はその誘
導体が、プロティネシアス（ｐｒｏｔｅｌｎａｅｌｏｕ
ｓ　）又は樹枝状体を終着点とする物質の合成又は指向
的搬出に関連しうろこと又はそれが細胞形質的小器官た
とえばミトコンドリアの一成分であシうることを示唆す
る。従ってこれらの結果Ｖｉ、はぼ同族的なノイロンの
中で選択的に発せられかつそのカル？キシ末端の８２の
アミノ酸残基が今判ったところの２８にダルトンのゾロ
ティノイドの発見を証明する。

合成ポリペプチドＰ１及びＰ２又はそれから作られた遺
伝型含有ポリアミドに対する抗体は、ＰＣｌ３又は他の
神経細胞における２８にダルトン蛋白質の合成の研究の
ための有用な受容体であり、より詳細な免疫細胞化学及
び電子顕微碗研究による脳細胞組織におけるプロティノ
イド又はその誘導体の位置の特定のために有用である１
、これらの褥別の受容体（抗体又はそれから作られた遺
伝型含有ポリアミド）はまた、さらに配列決定を及び潜
在的機能の検知のために慣用の生化学的手段による内生
脳細胞組織の精製を容易にすることができる。細胞内の
プロティノイドの小器官類似の位置は、分泌、輸送又は
ミトコンドリア様機能との関連を示唆し、またこのゾロ
ティノイドの機能の決定をどのようなアプローテで行う
かの型費な鍵を与える。

合成ポリペプチドＰ１．Ｐ２及びＰ５のアミノ酸残基配
列は、左から右へかつアミノ末端からカルボキン末端の
方向に、アミノ酸残基の慣用の一字コードを用いて下記
式のように示される：Ｐ　Ｉ　ＣＩＰＥＧＬＥＳＹＹＴ
ＥＱ　：Ｐ　２　Ｒ９ＶＳＰＷＭＳＶＬＳＥＥ　：及び
Ｐ　５　ＣＲＰＹＰＩ）ＩＲＶＴＰＲ３。

Ｂ、クローンｐ　Ｉ　Ｂ２５６ ｐ１’Ｂ２５６ｃＤＮ＾クローンは、脳ｍ　ＲＮ　Ａの
全体の０．０１％に轟る脳性異的な１７００のヌクレオ
チドのｍＲＮＡに混成する（第４図Ａ）。

このｍＲＮＡは、皮質及び嗅覚領域には少い量で分布し
、中及び後脳宛域に多い量で存在する（第４図Ｂ）。乙
のｍ　ＲＮ　Ａは、更にテス）１れた三つの腫瘍のいず
れでも発せられず、また腸、肺、心臓及び骨格筋におい
ても発せられない。

第４図Ｃに示したストランドの約１５００のヌクレオチ
ドの配列は、第４図り及びＥに示したよう・なＮｏｒｔ
ｈｅｒｎ　プロットを検出するために反対配向の単一５
２ｐ末端２・ぐルされた制限フラグメント（切片）を用
いて、クローンｐ１＾７５について上述したのと類似の
決定法にょル、ｍＲＮＡのストランドのセンスであるこ
とが示された。またｐ１８２３６センスストランド配列
は１００を越える塩基のｐｏｌｙ（＾）延長によシ終止
してお〕（正確な数は配列グル上でカウントできない）
、マた変異ｐｏｌｙ（＾）付加配列（＾＾ＣＡＡＡ　）
１７ヌクレオチド塩基を上流に含むので、とれがゾロテ
ィノイドコーディングストランＦであることは全く確か
なようでちる。

配列を終止体（ターミネータ−）トリブレンドのために
スキャンした後に（第４図Ｂ）、クロー７０５’末端に
結合されは？Ｙ　１０００のヌクレオチドの長さで延び
ている長いｏｒｆがコーディングフレームであるにちが
いないことは明らかである。

これは、３′非コーデイング情報の４５０のヌクレオチ
ドを切シ離す。

３１８の残基の仮説間アミノ酸配列（第４図Ｃのヌクレ
オチド配列の上に示した）は、そのアミノ末端で結合さ
れていないが、らまルに大きいということはあ）えない
。なぜなら、ｍＲＮＡの全長は、ｐ１８２３６ｃＤＮ＾
インサートより僅か２００５Ｅクレ万テド長いだけであ
ると推定されるからである。５１８の残基のゾロテイノ
イド配列は、３０の残基の重複配列におけるコンピュー
ター分析によ如Ｄａｙｈｏｆｆ地図の蛋白質の各々と比
較されたが、認識しうる同族性は検索嘔れなかった。

ｐＩＢ２！６ＤＮＡは、ｐＩＡ７５について記述したよ
うにニトロセルロースフィルターに結合され、相補的ｍ
ＲＮＡが精製されそしてインビトロで翻訳された。しか
し、特別の翻訳生成物は観察されなかった。このことは
、ｐＩＢ２３６がｐＩＡ７５に対応するｍＲＮＡよシも
希なｍＲＮＡに混成するので、全く驚くにあたらない。

検出できるｐ　Ｉ　Ｂ２５６コーデイングフレームの３
１８のアミノ酸配列は、既知の医薬的に有効な神経ペプ
チドの先駆体の配列と類似でアシ、第５図に図式的に示
されている。カルぎキク末端領域は、二列の塩基性アミ
ノ酸の列：　ａｒｇ　−ｅｒｇ、ｌｙｓ　−ａｒｇ及び
ａｒｇ　−ａｒｇ　−１ｙｓ　−ｌｙｓを含む。

塩基性アミノ残基のそのような対は、多くの神経ペプチ
ド又はホルモンたとえばｐｒｏｏｐｌｏｍｅｌａｎｏ　
−ｃｏｒｔｌｎ　のための先駆体（Ｎａｋａｎｌｓｈｌ
ら、Ｎａｔｕｒｅ。

２７８．４２５−４２７（１９７９））ｃａｌｃｉｔｏ
ｎｉｎ　（Ａｍａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　、　２９８，
２４０−２４４　（１９８２＞　）及びｖａｓｓｏｐｒ
ｅｓｓｉｎ　／ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｎ　［Ｌａｎｄ　
ａｔ　ａｌｌＮａｔｕｒｅ　２９　Ｂ、２９９−４０５
（１９８２）〕及びｂｅｔａ　−ｎｅｏｅｎｄｏｒｐｈ
ｉｎ　／　ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ　Ｋａｋｌｄａｎｉ　ａ
ｔ　ａｌｌＮａｔｕｒｅ、　２９８．２４５−２４９　
（１９８２））のための先駆体において蛋白質切断位置
である。

また、これらの例の多くで、活性、ｔ？　ＩＪペプチド
配列は先駆体のカルボキシ末端に位置し１本発明ではこ
れに極めて類似している。

第５図において棒として示しまた第４図Ｃにおいてアン
ダーラインで示したように、塩基性残基の対によシ境界
を定められた領域からの５つのポリペプチドのうちの３
つ（Ｐ５．Ｐ６及びＰ７）は１合成ポリペプチドに対し
て生じた抗面清の使用によりラット脳中の９１日２３６
グロテイノイドを同定するために望ましいので、合成的
に作られた。抗血清の調製のために免疫原として用いら
れたこれらポリペプチドは、自体また薬理学的作用を確
かめるために研究された。Ｐ４〜Ｐ８と名付けられた合
成ポリペプチドはまた、場合によシ［合成ポリペプチド
Ｊという記載なしで表示される。

合成ポＩＪ　ｄプチドＰ６は、そのカルボキシ末端残基
がグリシンなので特に注目に値する。いくつかのカルボ
キシ末端的にアミド化されたポリペプチドたとえばｖａ
ｓｏｐｒｅｓｓｌｎ　（Ｌａｎｄら前出）、ｃａｌｃｉ
ｔｏｎｉｎ　（Ａｍａｒａら前出）及びａｌｐｈａ　−
ＭＳＨ（Ｎａｋａｎｉｓｈｌら、前出）は、　Ｇｌｙ　
Ａｒｇ　Ａｒｇ配列において先駆体から分析場れ、アミ
ド交換され、グリシンが除去されてカルビキシ形でなく
てアミド形の新たに形成されたカルどキシ末端残基を生
ずる。合成ポリペプチドＰ６は従って、翻訳後変性（ｐ
ｏｓｔ　ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃ
ａＮｏｎ　）のための候補であシ、そのままでその配列
が神経ペプチド先駆体を表わす構造的指標を与える。

上述の切断−アミド交換反応によ多細胞的に形質転換さ
れることができて残基上のカルボキシ末端アミド基をＧ
ｌｙ＾ｒｇ　Ａｒｇ配列のアミノ末端側に：すなわちＧ
ｌｙ残基に隣接して与えるＧｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ配列
を含むプロティノイド又は！ロティノイド誘導体に翻訳
するほとんど脳細胞組織中にのみ存在するｍ　ＲＮ　Ａ
から翻訳された合成ポＩＪ−ｅ７’チドもまた、本発明
で特に考慮される。そのような合成ポリペプチドは結局
、Ｐ６及びＰ８が含むようなカルボキシ末端グリ７ンを
含まない。むしろ、末端グリシン残基は除去され、カル
ボキシ末端アミノ酸残基はアミド基を含む。本明細書で
は、アミノ酸残基の一文字略記のうしろに−ＮＨ２を付
して表わす。そのような合成ポリペプチドは、そのアミ
ノ酸残基配列が下記に示される合成４？リペゾチドＰ９
及びＰｌｏによ勺例示される。

クローンｐＩＡ７５の研究におけると同様に、合成ポリ
ペプチドを担体と結合して接合体とし、この接合体をラ
ビットを免疫化するために用いた。

得た合成ポｊｌ−２プテド反応性抗血清は、免疫細胞化
学的研究のために用いた。この研究の詳細は。

下記の材料及び方法の部に記載される。

前述したような間接的免疫パーオキシダーゼ染色を、合
成ポリペプチドＰ４、Ｐ５、Ｐ６及びＰ７に対して生じ
た抗血清を用いて行った。合成ポリ（プチドＰ４に対し
て生じた抗血清での染色は、常にネがチグであった。し
かしＰ５に対して生じた４つの血清、Ｐ６に対して生じ
た２つの血清及びＰ７に対して生じた１つの血清は、ラ
ット脳中の免疫反応の類似の全体的パターンを与えた。

免疫反応は、脳のどこにで、も分布する繊維系中で見い
だされ、顕著な）！ターンは脳橋、小脳（第６図Ａ）、
現床下部、及び海馬及び新皮質の領域において多く見ら
れる。小脳、海馬及び新皮質において、太い膨張した繊
維が、各領域の主なアウトグツト細胞のｐｅｒｉｋａｒ
ｙａ　（細胞体）に直接関係しているように見える。

海馬及び小脳においては、Ｐ５に対する抗血清で染色さ
れた軸索突起様の突起が太くなり、各々Ｃ＾３錐状錐状
ロイロン６図Ｃ）及びプルキンイエノイロンの細胞体及
び隣接樹脂状体を取り囲み、かつたぶんこれらの上でシ
ナゲスを作っている。

神経末端状、の突起がまた小脳において顆粒状細胞層内
に見られ（第６図＾及びＢ）、深小脳核の大きなノイロ
ンのかなりの割合を取り囲みかつたぶんシナプスを作っ
ている（第６図Ｇ）。新皮質にふ・いては、免疫反応は
％後帯状束皮質中で最も強く１層３，４．５内で放射状
に向いた軸索突起様の染色及び層１内の末端野に似る接
線方向に向いた繊維が存在する（第６図Ｅ）。同様のツ
クターンが身体感覚皮質のある領域で見られ、そこでは
染色が層２〜５に及んでいる放照方向に向いた繊維中で
及び層ｌの最外層で接線方向に向いた繊維中で見られる
。

ｐ６ｉｃ対する抗血清を用いての新皮質の染色は、すべ
ての点で同様である（第６図Ｆ）が、但し染色はより弱
く１層ｌの接続方向に配列された構造中では＃１とんど
ない。Ｐ７に対する抗血清での染色Ｈ，ｐ５に対する抗
血清での染色と区別できない。また、繊維染色も、脳弓
の強くミニリン化した索、線状体、及び側嗅覚索の軸索
突起内で、ならびに視床下部索及び髄条において視察さ
れる。

しかし視床下部の腹及び基底の弓状領域中のいくつかの
極めて少し反応性の細胞体を除いて、免疫反応性の細胞
体は未処理ラットの固定した脳において可視化すること
が困難である。

細胞伴内の免疫反応の検出を改善するだめに、　。

ラットはコルヒチンで処理された。これは、輸送された
物質を細胞体中に蓄積させるよう和して、末端へのノイ
ロン細胞体からの軸索突起的輸送をグロックする。この
処理は、物質の免疫検出をその合成位置におりて行うこ
とを容易にする。

コルヒチン処理ラットにかいて、Ｐ５に対する抗血清に
よる繊維様染色はかなり減少はれた：この減少は、小脳
皮質の顆籾及び分子層内で及び帯状束及び新皮質の層ｌ
内で最も明瞭である。繊維染色は減少されたけれど、明
瞭な免疫反応細胞体が観察され、その中で核ではなくて
細胞形質が免疫反応性になる。そのような免疫反応性細
胞体（第６図Ｈ）は、脳幹で（菱形体の正中核、腹脳橋
タグメンタルエリア、及び脳橋縫線系の核中で）明瞭に
認められまた未処理ラットにおいては視床下部の側転−
−正中及びｂａｓｏａｒｃｕａｔｅ核及び吊状核内でよ
り明らかである。これら免疫反応性細胞体の分布は％ｐ
Ｉ　Ｂ　２５６ｍＲＮＡの領域的局在と一致する。

正常ガ及びコルヒチン処理したラットでの研究の多くで
用いられた抗血清での免疫反応の総ては。

１　：　５００〜１：１００００の希釈で同じであった
。１　：　１０００希釈の抗血清が合成ポリベグチドＰ
５で予備吸収された場合、総ての免疫反応は廃止された
（第６図Ｄ）。合成ポリイゾチドＰ４及びＰ６でのこの
抗血清の同じ吸収は、染色／ｆターン又は強度に効果を
持たなかった。同様に、抗合成ポリイプチドＰ６反応性
Ｆｉ、合成ポリベゾチドＰ６で物界的にブロックされ、
抗Ｐ７反応性は合成ポリ−ｅｆチドＰ７での前培養によ
りブロックされた。すなわち、三つの合成ヂリイグチド
に対する抗血清の免疫反応性の一致するツヤターンに基
づき、染色は９１８２５６ｍＲＮＡ生成物に対して特異
的である。

その配列から推論された１）ＩＢ２５６ｏｒｔの合成ポ
リペプチドル５．ｐ６又ｔｉＰ７Ｖｃ対するいくつかの
抗血清を用いて観察された選択的かつ物界的染色パター
ンは、循環関係の再現しうる・９ターンを持つノイロン
の伸展系（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ｓｙｓｔｅｍ　）がこ
のゾロテイノイドを含むかもしれないことを強く示唆し
ている。コルヒチン処理したラットにおける免疫反応性
細胞体の外観は繊維染色の同時的喪失と共に、免疫反応
性物質が成るノイロン細胞体及び輸送された神経末端に
おりて合成されるという見解を式らに支持する。

ラット脳細胞組織ホモシネ−）　（ｈｏｍｏｇｅｎａｔ
ｅ　）Ｓｃ１．ＵＳＡ、７６．４５５０−４５５４（１
９７９）。

が一般的に述べているＷｅｓｔｅｒｎプロットによす分
析された。Ｐ５、Ｐ６及びＰ７に対して生じた血清は、
各血清について一致するイブチドブロックできる反応性
を示した・ 反応性プロティノイドは％　１００にダルトンの拡散ｒ
ル易動性を持った。このゾロテイノイドｉｌｔ、その見
かけサイズが、Ｅｌｄｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

により説明されているようＶｃＮ結合炭水化物側鎖を除
去したエンドグリコシラーゼでの脳油出物の培養後に７
０にダルトンに減少するので、グリコジル化される。す
なわちクローンｐ１８２５６に対応するｍＲＮＡから翻
訳されたプロティノイドはグリコジル化により細胞的に
誘導される。

細胞分画測定は、免疫反応性１００にダルトンプロティ
ノイドはシナブトシーム（ｓｙｎａｐｔｏｓｏｍａｌ）
分画と共に精製する（　ｃｏｐｕｒｌｆｙ　）　ことを
示した。

解剖研究は、このプロティノイドが免疫細胞化学結果に
おいて述べたのと同じ脳領域に位置することを示した。

脳細胞組織抽出物の可溶化した部分を、細胞のより大き
なプロティノイドから切断されたプロティノイド誘導体
の存在について分析した。本発明の合成ポリペプチドに
対して生じた抗体受容体を用いて高圧液体クロマトグラ
フィ（ＨＰＬＣ）及び放射性免疫検知手法をここで行っ
た。合成ポリ−ｅｆチドＰ５のサイズの範囲内の免疫反
応するプロテイノーイドが、抗Ｐ５血清がＨＰＬＣ溶離
剤での検出で用いられた場合に検出された。この結果は
ｓ　ｐ　Ｉ　Ｂ２５６グロテイノイドがより小さなプロ
ティノイド誘導体のための先駆体であることを示す。

ｐ　ｌＢ２５６グロテイノイドの構造と共に、形態的デ
ータは、このプロティノイドが新しい神経ペプチドのた
めの先駆体であることを強く示唆する。ポリ−ｅ７６チ
ドがｂｏｎａ　−ｆ　Ｉｄ　ｌ　神経トランスミツター
であると考えられるために満たさねばならない灸件はか
なり厳しく、ｐＩＢ２５６ｌＢ２５６プロティノイドト
が神経トランスミツター機催を持つことの証拠は情況的
であり、上のデータから予備的である。にも拘らず、ｐ
ＩＢ２５６ｌＢ２５６プロティノイド胞的処理場れた誘
導体の−又は二以上は、神経トランスミツターであると
考えられる。

合成ポリペプチドＰ５又はＰ８が小脳プルキン化細胞又
は海馬錐状細胞中にイオン泳動的に施与される予備研究
において、この細胞のｆｉｒｉｎｇｒａｔｅ　が変えら
れる。この研究のための手順はＦｒｅｎｃｈら、　Ｒｅ
ｇｕｌａｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｌｄｅｓ、　１．１２７−
１４６（１９８０）、の記載と同様である。

よシ詳しくは％　１ミリモル濃度のＰ５が皮質ノイロン
に圧力により施与された場合、単一単位活動ポテンシャ
ルにより測定されるように自発的活動性のｒａｔｅ　の
減少があった。海馬のＣＡ３　領域中の細胞へのＰ５の
同様な施与はｈ　ｃｅｌｌ　ｆｉｒｌｎｇｒａｔｅ　の
顕著なかつ長びかてれた増加をもたらした。Ｐ４のよう
な他の合成ポリペプチドが同様に施与された場合、何の
効果もなかった。Ｐ５の電気生理学的効果は従って、ポ
ＩＪ　−ｅ　ｆチド及び反応性細胞の解剖学的位置の両
者に物界的である。マウス当り約５マイクログラムの量
でラット脳に腔内的に投与したＰ５による予備研究は、
対照ポリペプチド又は塩水を用いては見す出されなかっ
た運動活動の著し込増加を結果した。腔内投与に用いら
れた方法Ｖｉ、Ｋｏｏｂら＋　Ｒｅｇｊ＋　ｌ　ａ　ｉ
ｏ　ｒ　Ｖ　Ｐ　ｅｐ　ｔｌ　ｄ　ｅ　Ｓ　＊　２ｅ１
５５−１６３（１９８１＞、に記載はれる方法と同様で
ある。

Ｐ６のアミノ酸残基配列＋Ｐ６のアミ末端のさらに６つ
の残基を含む合成ポリペプチドＰ　８１１゜単独でイオ
ン泳動的に投与された時に電気生理学的効果を示さなか
った。しかし、既知の興奮性トランスミツターグルタミ
ン酸塩（０，５モル濃度）と基に１ミリモル濃度で投与
した場合、グルタミン酸塩誘発の刺激の長期化があった
。この効果は、Ｐ８又はＰ６に対応する天然のプロティ
ノイド又はよりおそらくその誘導体が神経活動調整作用
を与えることを示唆している。

ｐ１８２３（Ｓ７’ロテイノイドに対する抗体は、合成
ポリペプチド自体が生理的に活性であるかどうかに拘９
なく、皮質領域において顕著な大きな心的通過路（ｍａ
ｊｏｒ　ａずｆｅｒｅｎｔ　ｐａｔｈｗａｙ　）　のた
めの有用なマーカーを提供する。後により詳しく述べる
ように、９１日２３６により解読されたプロティノイド
から導かれた合成ポリペプチドのための神経トランスミ
ツター型活動が今や見いだされ、そして従ってこの研究
は新規に発見された大きな新しい神経系のみでなくその
仮説的神経トランスミツターをも示すものである。

合成’　リ’　ｆ＋）”　Ｐ４＊　Ｐ５ｈ　ｐ６、ｐ７
゜ｐＢ、ｐｇ及びＰｌｏのアミノ酸残基配列は、左から
右ヘアミノ末端からカルがキシ末端の方向に。

単一文字アミノ酸残基コードを用りて下記式により示さ
れる： Ｐ４　ＬＲＧＱＡＧＡＰＰＲＶＩＣ： Ｐ５　ＮＶＴＥＳＰＳＦＳＡＧＤＮＰＨＶＬＹＳＰＥＦ
ＲＩＳＧＡＰＤＫＹＥＳＥ：Ｐ６　ＬＬＧＬＲＧＥＰＰ
ＥＬＤＬＳＹＳＨ８ＤＬＧ：Ｐ７　ＰＴＫＤＳＹＴＬＴ
ＥＥＬＡＥＹＡＥＩＲＶに：Ｐｇ　ＬＧＳＥＲＲＬＬＧ
ＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨＳＤＬＧ：Ｐ９　ＬＬＧ
ＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ８ＤＬ−ＮＨ２；及びＰ
ＩＯＬＧＳＥＲＲＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ
８ＤＬ−ＮＨ２゜Ｃ，クローンｐｉＢ２０８ ｐｉＢ−２０８ｃＤＮＡクローｙ＃：ｔｓ約５２００及
び約１６００のヌクレオチド塩基の長さである二つの豊
富な屑物異的ｒｎ　ＲＮ　Ａ　ＪｆＣ混成する（第７図
Ａ）。二つのｍＲＮＡは、つり合ってコントロールはれ
るようである。なぜなら二つのバンドの相対的強度は、
前脳から後転にがけて各々の濃度が増すときほぼ一定の
ｔまであるからである（第７図Ｂ）。二つのｍ　ＲＮ　
Ａ種は神経膠腫ｍ　ＲＮＡで検出され、しかしＰＣ１２
又゛′は神経芽細胞腫ｍ、ＲＮ　Ａでは検出きれないの
で、これは神経膠特異的ｍ　ＲＮ　Ａのクローンである
と考えられる。混成の強さから、これら二つのｍＲＮＡ
１は、先に検出された二つの最も豊富なラット脳性真的
ｍＲＮＡであると推定きれる。相対的混成強度の差は、
このクローンがより大きな種に対して大きな同族性を持
つこと又は二つのターゲット種が異る濃度で存在するこ
とを反影しうる。

二つのｍ　ＲＮ　Ａはｂ　ｐＩＡ７５の場合と類似の決
定法により指示されるように、共通のセンスストランド
を持つ（９７８のヌクレオチド塩基のｃＤＮＡインサー
ト配列は第７図Ｃに示される）、１詳しくは第７図り及
びＥに水式れる。配列（８１Ｄ　ｌ”）の５′末端に相
補的な検知手段（ｐｒｏｂｅ　）Ｆｉ、二つのターゲラ
）ｍＲＮＡｌｃ混成した。３Ｉ亦端（Ｓ２Ｆ２）に相補
的な検知手段はより大きな種にのみ混成した。これは二
つのｍ　ＲＮ　Ａの間の類似性の領域は配列の５′部分
にあることを示している。これはまた、このクローンが
より大きｆｚ　ｍ　ＲＮ　Ａ種のコピーであることを示
す。

このかなシ大きなｏｒｆは５′末端で結合はれていす、
１２１のトリブレットのための配列中に入る（第７図Ｄ
）。仮説的ポリペグチド配列に、第７図Ｃのヌクレオチ
ド配列の上に示されている。

この仮説的配列は、Ｄａｙｈｏｆｆ地図データベース中
のどのノロティノイド配列とも同族的でない。

仮説的配列から判るように、翻訳されたポ＋）　−ｅグ
テドは極め゛て疎水性である。このノロテイノイドに対
する抗体は研究されていない。

この疎水性Ｉリペゾチドに、かなり大きな（３２ｏｏの
ヌクレオチド）極めて豊富な神経膠ｍ　ＲＮへの部分的
ｃＤＮＡ（９７Ｂのヌクレオチド）中の最大の０「スに
対応する。仮説的アミノ酸残基配列の可能性ある豊富さ
及び疎水性から、脳細胞組織中に見い出されるｐＩＢ２
０８からエンコードされたノロテイノイドは神経膠繊維
状酸性蛋白質（ＧＡＦρ）つまり分子レベルでＦｉａと
んど知られていない、広く存在する極めて不溶性の５５
Ｋにダルトンの神経膠蛋白質であると考えられる。

ｐロー４０ｃＤＮＡクローンは、脳ｍＲＮへの約０．０
５４を代表する脳性品的な４０００ヌクレオチドのｍＲ
ＮＡに混成する。このｍＲＮＡｑ、ｐＩＡ７５と類似な
脳中領域分布を持つ。但し皮質中では相対的に低ＩｎＪ
度で存在し、そこではｍＲＮＡの変性（分解）がたぶん
起る（第１図Ｂ）。

ｐｏ−４ｏクローンの配列は、それが大きな脳％界的ｍ
　ＲＮ　Ａの一部に対応すると決定された（第８図Ｂ）
。ｍ　ＲＮ　Ａコーディングストランドに対応するスト
ランドは、ｐＩＡ７５クローンに対して用いられたと類
似の決定法により同定された。このクローンのコーディ
ングもまたストランドも、長い読出しフレームを示さな
り（第８図Ｃ）。

ｐＩＡ７５について決定されたのと同じ長さの短いオー
プン読出しフレームを導き出すことはできる。しかし約
３０００のヌクレオチドがｍＲＮＡ配列から欠けており
、このクローンがｂｏｎａ　ｆｌｄａｍＲＮＡ　に対し
てどのように整列されるか知られていない。脳性鼻的ｍ
　ＲＮ＾は通常の非コーディング領域よシも大きｈので
、このクローンは対応するｍＲＮＡのプロティノイドコ
ーディング領域を失ったと考えられる。このクローンは
結局、仮説的ゾロテイノイド生成物のそれ以上の研究の
ための選択ではない。

Ｅ、一般的結論 ラット脳特異的ｍＲＮＡに対応する４つのｃＤＮＡクロ
ーンが詳細に研究された。ｍ　ＲＮ　Ａの相対的な領域
濃度、各クローンについてヌクレオチド配列及び蛋白質
コーディングストランドも決定された。

二つのりに−ンにつｂて、ｍＲＮＡのゾロティノイド生
成物ｉｊ、ｍＲＮＡのセンスストランド上のオープン読
出しフレームから予測される領域にほぼ対応する短いＩ
す々グチドを化学的に合成し。

そして１この合成イプチドに対して抗血清を生じさせる
ことにより同定された。この抗血清は免疫細胞化学によ
り、二つの脳＊ｍ的ｍＲＮＡの蛋白質生成物を含むラッ
ト脳内の細胞の特別のサラセットを同定した。このこと
は、このアプローチが。

脳グロティノイド及びその誘導体を記述しそして位置決
めするための強力な手段を提供することを示す。抗ベグ
チド受容体に、特定の細胞内でのこれら！ロティノイド
又はその誘導体を位置決めする研究のため及び慣用の生
化学的及び免疫親和性のアプローチによりｆｏティノイ
ド分子を精製するために有用である。

上述のアプローチはｂ　５ｏｒｎｓｔａｂｌｅ、　Ｎａ
ｔｕｒｅｓ２８６．２５１〜２３５（１９８２）、が記
述したように特異的遺伝子を同定するためにモノクロナ
ール抗体を用いる作戦に共通な−〈つかの特徴を持つ。

しかし、本アノローチは、いくつかの利点を提供する。

発生された抗血清は、そのアミノ酸残基配列が予め部分
的にクロナールＤＮＡのデコーディングによ〕決定され
たゾロテイノイド又はプロティノイド誘導体内の予め決
められた部位（エピトープ）と反応する。また、核酸検
出手段（ｆローブ）が提供され、これはゾロテイノイド
が見付けられた時にすでに入手されている。すなわち、
もし遺伝子位置、遺伝子表現の発展の調節又はその他の
詳細についての質問が生じるなら、水系はすでに直ちに
拡大外延できる。

さらに、自然に生じるゾロティノイド配列の別々の領域
からの二つの合成、ｌ？　ＩＪペプチドに対する抗血清
の一致する反応性を示すことにより、脳内の二つの場所
で生る免疫細胞化学的反応がこの部位にかける同じ！ロ
ティノイドの存在の結釆であ・ることの信頼性を増すこ
とができる。これは、脳抗原に対するモノクロ−ナール
抗体を用りては該崩しない。最彼に１本アプローチに、
出発点として配列決定法を用いる。そしてより構造的な
情報が出現する又は説明されるようになるので、機能を
予測するため忙配列を用いるにおいて大きな利点が生じ
るであろう。

動物異性ｍＲＮＡは、脳ｍ　ＲＮ　Ａ含量の大部分に該
当し、約ｓｏ、ｏｏｏのｔｙｔＲＮＡ種にたぶん対応し
、それのあるものは約ｏ、ｏｏｉ優のレベルで発せられ
る（　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　）。そのようなｍ　ＲＮ　
Ａは重要な生物学的役割を合理的に演じるために、各々
がたぶん脳全体に広がっているよりもいくつかの細胞中
に濃縮されていなければなら゛ない。９１Ｂ２５６ｍＲ
ＮＡのノロテノイド翻訳生成物は、そのｍＲＮＡｔｌ全
脳ｍＲＮ全層約０．０１％であると推定されるけれど、
脳細胞の小石な分画中に存在する。免疫細胞化学的技法
Ｆｉ。

０．００１’ｌで発せられたｍ　ＲＮ＾の生成物を検出
するのに十分な感度を持つようである（そのｍＲＮＡが
１０倍豊富なノロテノイドの検出は容易であるとして）
。すなわち、クラス■のクローンは、脳の小さなサラ領
域に局在すると考えられるが金屑ｍＲＮＡ中では極めて
希なｍＲＮＡに対応するとして、脳ｍ　ＲＮ　Ａのこの
姫も興味あるクラスのプロテイノイＹ生成物は本発明の
方法を用いて検出可能である。

ｐＩＡ７５とｐｉｓｚｓ６のノロティノイド生成物＃２
％脳細胞のサラセット中に存在する。各々の特異的遺伝
子が脳の鼻なる細胞サラセット中で発せられる（　ｂｅ
　ｔｕｒｎｅｄ　ｏｎ　）　ということ＆′ｉ、解剖レ
ベルですでに知られていることすなわち脳は多くの細胞
タイプから成る器官であり、ノイロンはその構成員が共
通の先駆体から分化されたところの同質的細胞クラスで
あることを分子レベルにおいて示す。

脳で特異的に発せられないｍ　ＲＮ　Ａ　（クラス■及
び■）に比べて脳％品的ｒｎ　ＲＮ　Ａ　（クラスＩＩ
Ｉ）の一般に低い豊富さ、及び極めて低い豊富さのｍＲ
ＮＡ（クラス■）の可能的に大きな数は、多くの脳性異
的ｍＲＮＡが、そのノイロン根源細胞から分化した脳細
胞のサラセット中に特異に（ｕｎｉｑｕｅｌｙ　）　発
せられることを示唆する。従って脳性異性自体Ｆｉ、む
しろ初歩的分類である。

抗鹿清反応性に基づく本研究は、細胞タイプのためのよ
り詳しい分子に基づく分類システムを提供する。実際１
本研究はすでに、二つの新規な脳性異的ゾロティノイド
及び／又はプロティノイド誘導体を同定した。一つのプ
ロティノイド又はその誘導体は、抗ｐｌ及びＰ２崩清と
免疫反応を形成し、脳細胞の大部分の細胞形質中に位蓋
する。

それは、成る大きなノイロンを除き蛋白合成の又は樹枝
状体の輸送現象に関連しているかも知れない。第二のプ
ロテイノイド又はその誘導体Ｉ′ｉｐ５゜Ｐ６及びＰ７
に対する抗血清と免疫反応を形成し。

後層からいくつかの個々の解剖学的部位に走る繊維の個
々の通過路（ｐａｔｈｗａｙ　）内に存在する。このン
０ロティノイド自体又はそれの脳細胞的処理された誘導
体は、神経活動を持ち、神経トランスミツターであるか
も知れない。

■材料及び方法 Ａ相補的デオキシリゾ核酸（ｃＤＮＡ）　クローニング
及びメツセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）手順ｍＲＮＡ
１Ｊｌ製、ｃＤＮＡクローニング及び脳性異的クローン
の選択の詳細はＥ′及びＦ部で述べる。

脳ｍＲＮＡの領域的分析のために、ラットの脳を氷上で
解剖し、全層ｍＲＮＡＫついて後記のように抽出した。

ｍＲＮＡ調製物は、１モル濃度のホルムアルデヒド中！
、Ｓ％アガロースダル上で電気泳動によシ分離され、ニ
トロセルロースに移された（　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、Ｓ
、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＬＩＳＡ。

ｌス、タコｏｉ−ｓコｏｓ＜ｉｑｇｏ）の記載のように
）。ｍＲＮＡ調製物はＧ部に記述のようにして、　Ｒｉ
ｇｂｙ　ａｔ　ａｌ、、　ＪｏＭｏｌ、　Ｂｌｏｌ、、
／　、？　３．２３７−２ｊｔ／　（／９？’７）記載
のようにｎ１ｃｋｔｒｏｎｓｌａｔｌｏｎによシ５２Ｐ
ラベルされたプラスミドプローブ（検知手段）で混成さ
れた。ある決定法では、混成プローブは下記８部で述べ
るようにポリヌクレオチドキナーゼを用いて５２ｐで末
端ラベルされた。

Ｃ１ｅｕｅｌａｎｄ　ら、Ｃｅ１ｌ　２０．　９５〜／
　０！；（ｉｑｇ’θ）、記載のよう々手順を、ポジテ
ィブ混成−翻訳検定（ＨＡＲＴ）のために用いた一ｍＲ
ＮＡはインビトロでラビットｒｅｔｕｃｌｏｃｙｔｅ溶
解質系中で翻訳された（　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎ
ｕｃｌｅａｒ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）　。

生成物は、Ｌａｅｒｒｍｌ　Ｉ　。

Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７＞　Ａ　ｇθ−乙
ｇ　、２　＜ｌｑ’ｙ／＞記載のようにナトリウムドデ
シル硫酸塩（ＳＯＳ）ダル電気泳動によシ分析された。

ラットＣ神経膠腫及びマウスｃｉ３ｏｏ神経芽細胞腫細
胞ラインは、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅｃｕ
ｌｔｕｒｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｌｏｎ　から入手された；
ラットのクローム親和性細胞腫（ｐｃ／、２）細胞は、
ｔｈｅ　５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのＪｏｅｌ　Ｌ
ｅｖｌｎｅ　博士から入手した。

Ｂ核酸配列 Ｔａｎａｋａら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｌｏｌ、、　／　
２　／　％　３３　’ｌ〜３６ａ　（１９７，ｒ）記載
の手順を用いて、下記のＦ部記載の手順で固定されたｃ
ＤＮＡクローンを負うバクテリアのクロラムフェニコー
ル処理した培焚物からシラスミドＤＮＡを調製した。

各プラスミドの−、部（／マイクログラム）を。

テトラ−又はペンタ−ヌクレオチド認識配列（Ａｌｕ　
Ｌ　Ｂｓｔ　ｌＶ＋　Ｈａｅ　ＩＩＬ　Ｓａｕ　３ａ、
　Ｈｐａ　ＩＬＨｌｎｆ　ｌ、　Ａｖａ　ＩＩ、　Ｒ５
ｌｌ１．　ＦｎｕＤ　ｌｌ　）　を持つ９つの制限エン
ドヌクレアーゼの各々で消化した。消化生成物の電気泳
動パターンを％ＢｕｔｃｌｉＨｅ、　Ｊ。

Ｇ、、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、５、コ
ク２　／　−，２７２ｇＣＩ９７ｇ）記載のようにシラ
スミドｐ　Ｂ　Ｒ３２，２のそれと比較した。それより
固定及びｃＤＮＡインサートを含む制限フラグメントの
大きさの決定ができる。

予備的な制限消化物を、３又はグつのインサート含有フ
ラグメントを与える二つの酵素により作った。これらフ
ラグメントはフオスホターゼで処理され、ポリアクリル
アミドゲル上で精製され、そしてポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて　Ｐで末端ラベルされた。末端ラベルされ
たフラグメントの少量（／％）を予めスクリーンしたい
くつかの酵素で消化し、生成物をポリアクリルアミドダ
ル上に展開した。

オートラジオグラフィで検出された生成物フラグメント
のサイズから、インサートの合理的に正確な制限マツプ
を構成することが一般に可能であった。このマツプは、
Ｍａｘａｍら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　７　’Ｉ　ｈ　５　
ｂ　Ｏ−！；乙’Ｉ　（／９７７）記載のように配列分
析の面に残る放射活性フラグメントをどのように切断す
るか決定するために用いられ、得たデータはインサート
を飽和する（　５ａｔｕｒａｔｅ　）　ようであシ、そ
してもし可能なら総ての領域について重複及び二重配列
決定を与える。通常、この作戦は、検証されたインサー
ト配列を完成するためにわずか少しの特定のフラグメン
トのみを作ることが必要である程に十分な配列゛データ
を与えるべく満足である。この技法は、ｌθθθ〜１５
００の塩基対（ｂｐ）　のいくつかのｃＤＮＡインサー
トをｌケ月に配列することを可能にした。この手順の単
一末端ラベルされた生成物のいくつかは、対応するｍ　
ＲＮ　Ａらせん化状態を決定するためＫ　Ｎｏｒｔｈｅ
ｒｎ　プロットで用いられた。

Ｃ抗ペゾチド血清 ｃＤＮＡクローンｌ）／Ａ７５オープン読出しフレーム
（ｏｒｆ）ｌ及びｏｒｆ　２、及びｃＤＮＡクローンｐ
／Ｂ２３Ａｏｒｆの領域を、５ｕｔｃｌｌｆｆｅら、−
８ｃｉｅｎｃｅ。

２／９．乙６θ〜Ａｂｌ、ＣＩｑｇ３）、記載のように
ゾロリン残基の近隣での荷電した領域のためにスキャン
した。対応する合成ポリペプチドＰ／。

Ｐ２、Ｐ３及びＰ４Ｌを、　Ｂｌｔｔｌｅら、Ｎａｔｕ
ｒａ１２９ｇ、３０〜３３　Ｃ１９ｇ２＞記載のように
作った。

合成ポリペプチドＰＫ、ＰＡ、Ｐ７及びｐｇは、ポリＲ
プチドＰ／〜Ｐ弘と同様にして作り、それらの神経活性
物質としての可能性ある役割の故に選別された。

総てのポリペプチドは、それらの当初の使用が特定の抗
血清を得ることにあるので、更に精製せずに用いた。

各ポリペプチドは、三つの担体、　ｋｅｙｈｏｌｅｌｌ
ｍｐｅｔ　ヘモシアニン（にＬＨ）、エデスチン及びグ
ルタルアルデヒド処理したチログロブリンに結合された
： Ｓ■のポリペプチドと５卯の担体蛋白質を０．２５モル
濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，２）の０．７
ｍｉ中に懸濁し、’ＩｘＬの、２ｊｔ４グルタルアルデ
ヒドと共に室温で３θ分間培養し、そして得たポリ波プ
チドー担体接合体を５ｅｐｈａｄｅｘａ−！；０　（商
標：ビーズ状の架橋した炭水化物ポリ−ｒ　−：　Ｐｈ
ａｒｍａｃｌａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｌｃａｌｓ社、Ｐ
ｌｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　）　上
でのクロマトグラフィにより精製した。

得た接合体は、ラビットを免疫化するのに用いられた。

血清は、　Ｇｒｅｅｎら、　Ｃｅ１ｌ、、２ｇ、　’Ｉ
７り〜グｇ７Ｃ／９ｇ２’）記載のように酵素結合免疫
吸着体検定（ＥＬＩＳＡ　）により抗ペプチド作用につ
いて検定された。

Ｄ４０１縄ｌＪＬ笑 組織調製の手順及び免疫細胞化学は、はぼＢｌｏｏｍら
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｌ、　Ｕ
ＳＡＩ　７　！；％１ｓｑｉ〜ｉｓｑｇ＜１９７ｇ）に
β−エンドフィン及びｒ−メラノサイト刺激ホルモンの
検出のために記載された迩シである。ラットを麻酔し、
リン酸緩衝液（０，３モル濃度、ｐ）Ｔ　ｑ　、　ｌＩ
）中の冷した新規に解重合した３％ホルムアルデヒドで
心臓穿通的（ｔｒａｎｓｃａｒｄｌａｌｌｙ）に潅注し
た。

冠状及び弓状スラブ（５ｔａｂ　）　に切断した後に、
組織を３時間固定剤にひたし、そしてリン酸塩緩衝され
た塩水（ＰＩ／ＮａＣｔ：０．１５５モル濃リン酸塩緩
衝液、ｐ■り、ｐ、θ、／、５−モル濃度ＮａＣｔ）中
の蕪糖（濃度が増加してゆ〈：ｌλから／　ｇ　％）Ｋ
通した。

乙θμ厚さの切片を冷温保持装置中で切り、ＰＩ　／　
ＮａＣ１中に集めた。これら切片を、　１〜／当り／叩
のがビン血清アルブミン及び０．３係のＴｒｌｔｏｎＸ
−／　００　（商標：ポリオキシエチレン−９オクチル
フエニルエーテル、Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ社。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｌａ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｌ
ａ　）　を含むＰＩ／ＮａＣ１中で一次抗体の適当な希
釈物に自由に浮遊させて、／Ｊ〜１ｇ時間ｙ℃で連続的
に振動させながら培養した。

ＰＩ　／　ＮａＣｔ中で洗った後に切片を２μｍ１７ｍ
Ｊのヤギ抗ラビットＩｇＧ　（西洋わさび）や−オキシ
ダーゼに接合されている）と共に室温でコ時間振動Ｆに
培養した。

更にＰＩ　／　ＮａＣｊで洗った後に、切片をｏ、ｓ’
ｉ。

ジアミノベンジジン、０゜θθ３％Ｈ２Ｏ２テｇ〜ｌＳ
分間室温で現像し、洗い、風乾した。それらを次に顕微
鏡下で調べた。いくつかの切片は、細胞核を可視化する
ためにクレシルバイオレット又はリチャードンンの染色
液によシ対比染色した。

ポリペプチドによる抗体の予備吸収のために一抗体の希
釈物を６０μ９／ｒｓＪのポリペプチドで一夜ｔ℃で培
養し、次に上述したように組織片に与えた。

ラットは、ノイロン細胞体中の免疫反応の検出を高める
ために、抱水クロラール麻酔下で（ｓｔ４ｒｅｏｔａｘ
ｌｃ脳楢内注射によりコルヒチンで（ラット当シＳθμ
９７ｆルヒチン１５θμｔのＫｒｅｂｓ−重炭酸塩溶液
：１２７ｍＭのＮａＣｔｈ３、ｇ３ｍＭのＫＣｔｈ　／
　−ｇ　ｍ　ＭのＣａＣＬ２、／、１１ｍＭのにＨ２Ｐ
ｏ４．　ｉ　ｅ　ｔ　ｇ　ｍ　ＭのＭｇ５ｒＯｓ　＆２
０ｍＭのＮａＨＣＯ３１，２１／ｌのｄ−グルコース、
θ、／係（７）＆ビン血清アルブミン、ｑｓ：ｓのＯ：
ＣＯ２比で酸素及び二酸化炭素の混合物でガス処理、ｐ
Ｊ（り、り）処理された。処理されたラットは潅注され
、他の点では前述と同じ手順でグｇ〜クコ時間後に免疫
細胞化学のために準備された。

ポリペプチド免疫化のために担体としてｋｅｙｈｏｌｅ
　Ｉｌｍｐｅｔ　ヘモシアニン（ＫＬＨ）を用いた場合
、得た抗血清は、頭頂皮質の層Ｖ及び前述した特定の抗
合成？リペプチド反応性よりも弱い他の分散した部位に
おける細胞体及び繊維に対する特異な免疫反応を示した
。この反応性は、ポリペプチドによりブロックされず、
しかしにＬＨによる前培養によりブロックできた。調製
においてにＬＨが担体として用いられた、他の脳無関係
の抗合成ポＩＪ−ｅ７’チド血清は、脳で同じ免疫反応
を示す。従って、脳のある細胞は、ＫＬＨと抗原的遺伝
基質を共有する。

この研究で用いられた他の二つの担体、エデスドに対す
る抗血清はまた、背景（バックグランド）反応性を示し
た。゛この反応性は、抗血清が／：ｌθＯＯ又はそれ以
上の′希釈度で用いられた場合。

極めて低いレベルであシ、抗合成ポリペプチド特異的反
応の強い５斑点のある西洋わさびパーオキシダーゼデポ
ジットから容易に区別しえた西洋わさび／４−オキシダ
ーゼで軽い反応を１与えた。

εメツセンジャーりが核酸（ｍＲＮＡ５”調１販細胞形
質メッセンジャーりが核酸（ｍＲＮＡ）ＰＬ大人の雄Ｓ
ｐｒａｇｕｅ　−Ｄａｗｌｅｙ　＞ット（ｃｈａｒｌｅ
ｓＲｌｖｅｒ　）の新鮮な脳、Ｉｔ：ｌｌ’ＶＸ臓又は
腎臓から、５Ｃｈｌｌ）ｌｅｒ　ら、Ｊ、　Ｍａｔ、　
Ｂｉｏｌ、、／　Ｉｌ、２％９．７〜／　／　Ａ　（／
９ｇθ）記載のようにフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール（５θ：Ｓθニア）抽出によシ単離さ
れた。抽出物は次に、　Ａｖｌｖら＠　Ｐｒｏｃ＊　Ｎ
ａｔｌｅＡｃａ’ｄ、　ｓｊＬ　ＵＳＡ、　４９　％　
／　４’　０ざ〜ｉｙｉ：ｚ（／９り２）記載のように
オリゴデオキシチミジレート（オリゴｃ＋ｒ）セルロー
スに通すことによυポリアデニル化したｍＲＮＡ　（ｐ
ｏｌｙ（Ａ）”　ｍＲＮＡ　）について富化した。

Ｆ相　的デオキシリボ　酸（ｃＤＮＡ　クローニンヱ ｃＤＮＡクローンは、ＷｌｃｋｓｎＳら、Ｊ、　Ｂｌｏ
ｌ。

ｑ１匣に、　１」二Ｌ１　コダｇ３−コグ９５（／９７
ｇ）及びＧｏｕｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　
／　９．２’７０．２−２７／θ（／９ｇθ）の方法の
修正により脳細胞形質ｐｏ　ｌ　ｙ　（Ａ）　”ｍＲＮ
Ａ　からＸａされた。

逆転写が、下記の条件下で２００μｔの体積でｌｌ、２
℃で６日分間行われた：３ＱｍＭのＴｒｌｓ、　（，２
−７ｔ／−Ｊ−１）’ｏＡ−７％ｆ“−′・８−グロノ
９ンソオール）　−ＨＣｚ　（ｐｌｕｇ、　、？　）、
１０ｍＭのＭｔｔＣｌ、３０ｍＭのユーメルカグトエタ
ノール、’７０ｍＭのＫＣｔ、各々／ｍＭのデオキシア
デノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リ
ン酸（ｄｃｖｒ＞）ｂデオキシダアノシン三リン酸（ｄ
ＧＴｐ）、チミジン三リン酸（’ＴＴＰ）。

２５０マイクロキユ一リー／ｍεの　Ｐ−ｄｃ、ＴＰＣ
ｇＯθキューリー／ミリモル；　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ
ｄＮｕｃｌｅａｒ、　ＢＯ８ｔＯｎ、　Ｍａｓｓａｃｈ
ｕｓｅｔｔｓ　）　、　２　！　ａ　９／σのオリゴｄ
Ｔ、ＩＯθμｍ１／ｒｒｔｅのｐｏｌｙ（Ａ）”ｍＲＮ
Ａ、及びｉ、ｏ　ｏ　ｏ単位／Ｖの逆トランスクリゾタ
ーゼ。

この方法の二つの方法を用いた：調製物ｌのために、ｍ
ＲＮＡは２．３ｍＭのＣＨ３ＨｇＯＨで室温でＳ分間予
備処理され、そしてアクチノマイシンＤ（３θμｇ／　
ｍｅ：　）が反応系に加えられた：（２）　調製物コの
ために、ｍＲＮＡは予備処理されず、ビロリン酸ナトリ
ウム（４’ｍＭ）が反応媒体に加えられた。

逆転写後に％調製物／は１ずフェノール／クロロホルム
で５次にエーテルで抽出された。二つのｃＤＮＡ調製物
は、その反応媒体の水性相から０．３Ｍ酢酸ナトリウム
及びエタノールによｐ数度沈澱され、乾燥され、そして
水に再懸濁された。サンプルは７００℃に３分間加熱さ
れ、そして氷上で迅速に冷やされて、ｍＲＮＡ−ｃＤＮ
Ａハイブリッドを分離する。

第二ストランド合成は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳＣ’ｌ−
（２−ヒドロキシエチル）−／−ピーｅラジンエタンス
ルホン酸）　ｂ　ｐｌ＋　’７−−２　ｂ　７０　ｍ　
Ｍのにｃｔ、／θｍｖのＭｇＣｌ２．１ｏｒｒｖのジチ
オスレイトール、各々θ、５ｍＭのｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ
。

ｄＧＴＰ、ＴＴＰ及び２００単位のＤＮＡポリメラーゼ
■、にＩｅｎｏｗ　フラグメント［：　Ｊａｃｋｓｏｎ
ら、Ｅｕｒ。

Ｊ、　ＢＩｏｃｈｅｍ、＋　’Ｉｓ　％　６２３〜４．
２’７　（／ｑ１’））（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ。

Ｒｏｃｋｕｌｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）を含む２
０θａｔの反応体積中で７５℃で３時間行った。反応は
、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を／θｍＭｌｌ
ｉｔで添加して停止された。二重らせんｃＤＮＡ　（ｄ
ａｃＤＮＡ　）はエタノールによυ沈澱された。

Ｓ　ヌクレアーゼ消化は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（
ｐＨ４’、５）−０，３ＭのＮａ（、ｔｈ　／ｍＭのＺ
　ｎ　ＳＯａ、及び１００単位のＳ、ヌクレアーゼ（Ｐ
Ｌ　Ｂｌｏｃｈｅｍｌｃａｌｓ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ
、　Ｗｌｓｃｏｎｓｌｎ　）を含むコθＯμｔの体積で
３７℃で３分間行われた。

Ｓ　ヌクレアーゼ消化後に、ｄｓｃＤＮＡ　調製物をフ
ェノール／クロロホルムで、次にエーテルで抽出し、そ
の後０．３Ｍの酢酸ナトリウム及びエタノールで水性相
から沈澱した。

この段階で、ｄｓｃＤＮＡ調製物は、０．１５ＭのＮａ
Ｃ４及び２ｍＭのＥＤＴＡをｐｎｇ、ｏで含む溶液で、
Ｇｏｕｔｈら（前出）記述のように、ＢｌｏｇｅｌＡ−
１００ｍアガロース除外クロマトグラフィビーズ（Ｂｌ
ｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｌｃｈｍｏ
ｎｄ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）　上で比較的大きな物質につ
いて富化される：調製物ｌは分画／Ａ（約１００θ〜約
ｉｇθ０の塩基対（ｂｐ））及び分画１日（約ＳＯＯ〜
約１０００のｂｐ）に分割されたニ一つの分画２ＡＣ約
ＳθθＩ）ｐ　より犬）が調製物コから導かれた。Ｒｏ
ｙｃｈｏｕｄａｒ　ｙら、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　
Ｒｅｓ、、３、ｇｂｓ〜ｇ７’７　（／９７Ａ）記載の
ように、オリゴデオキシシチジン尾部（ｔａｌｌ　）（
ｇ〜／Ｓのヌクレオチド）を各ｄｓｃＤＮＡ調製物に、
末端デオキシヌクレオチドトランスフエラー４”　（ｐ
ＬＢｌｏｃｈｅｍｌｃａｌｓ　）　の１０００単位／ｒ
！Ｌｅと共に加え。

２ＳｔｉＭのｄＧＴＰ、１００ｍＭのカコジル酸ナトリ
ウム（ｐ）１４．９　）　、ＪｍＭのＣｏ（、ｔ２、／
ｍＭのＥＤＴＡ中で３７℃で５分間保った。尾部をつけ
た（　ｔａｌｌｓｄ　）　ｄｓｃＤＮＡ調製物はフェノ
ール／りロロホルムで、次にエーテルで抽出され、エタ
ノールによシ水性相から沈澱された。

上の調製物の各りの一部（／θμＩｉ／ｍｔ）を、１０
０ｍＭのＮａＣ１，／　ＯｍＭのＴｒ　ｌ　５−ＨＯ２
ｐＨｇ１θ、５ｍＭのＥＤＴＡ中の、オリボデオキシダ
アノシン尾部結合したエンドヌクレアーゼＰｓｔＩ切断
シラスミド１）ＢＲ３２２（／θμｇ／ｍ）でアニーリ
ングした。混合物を、６７℃で１０分間。

５０℃で３０分間加熱し、そ、して−夜室温に放冷した
。

各々ｇ〜１５のヌクレオチドのデオキシグアノシン尾部
が、デオキシシチジン尾部について述べたと同様に切断
されたプラスミドに加えられた。

Ｅ、　ｃｏｌｌ　ＣＡ　Ｏθ細胞を組換えグラミドで性
質転換し、形質転換体をテトラサイクリン（ｌθμｇ／
Ｖ）プレート上で選別した。個々のコロニーが、二重の
（ｄｕｐＨｃａｔｅ　）アンピシリン（ａｍｐｌｃｌ　
Ｉ　ｌ　１ｎｅ）（３３μｇ／ｌ）及びテトラサイクリ
ンのプレートに移された。アンピシリンに敏感でテトラ
サイクリン耐性（Ａｍｐ’Ｔｓｔ’　）　のコロニーが
その後、の研究のために選ばれた。

コロニーを数え、各ケースで用いたｄｓｃＤＮＡインサ
ートの起源に対して、すなわちｄ　ｓ　ｃＤＮＡインサ
ート調製物／Ａ、／Ｂ、２Ａから固定された。′ｐＯ＃
　と同定されたクローンは％ＷｌｃｋｅｎＳら（前出）
の方法を用いた先導的クローンニング研究から生じる。

Ａｍｐ”Ｔｅｔ’クローンは、２ＹＴ　（水中の／、４
チＢａｃｔｏ　）リデト艮、ｌ係５ａｃｔｏイースト抽
出物及びθ、　！ｒ　４　ＮａＣｔ：　Ｄｌｆｃｏ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｄｅｔｒｏｌｔ、　Ｍｌｃｈｉｇａｎ　）媒体中でｌ酎
−夜培焚物として生長され、シラスミドＤＮＡはＢｌｒ
ｎｂｏｌｍら、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、
？　、／　５　／　３　（／９７９）記載の方法によシ
抽出された。各培養物の四分のｌをＰｓｔ　ｌ　（Ｎ、
Ｅ、　Ｂｌｏｌａｂｓ、　Ｂｅｕｓｒｌｙ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）で消化し、ＤＮＡサイ
ズスタンダードと並行して５θｍＭのＴｒｌｓ−硼酸塩
＆ｐ）Ｉｇ　、３．／ｍＭＥ、ＤＴＡを用いテ／　’Ａ
　７　！　ｏ−スｙル上で分画した。５００　ｂｐ　以
上の敏感なインサート／ｆンドを与えるクローンが、そ
の後の研究のために選ばれた。

Ｇ、Ｎｏｔｈｅｒｎプロット分析 プロ０ｌｙ（Ａ）”ｍＲＮＡサンプル（通常、２Ｊ１ｇ
）をＲａｖｅら、　ＮＵＣＩｅＩＯＡｃ１ｄｓ　ＲｅＳ
、１　６　ｈ　３　５　Ｓ　９　−３！ｒ乙７Ｃ／９７
９）記載のように／Ｍのホルムアルデヒドの存在下でｉ
、５ｔＩ）アガロースゲル上で電気泳動によ９分画し、
　Ｔｈｏｍａｓ　Ｐ、Ｓ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ［。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ、　７７ｂ　５．２０１
−３２Ｏ３（ｉｑｇθ）記載のようにニトロセルロース
ｌｃ移した。

プロットは、Ｓｃ係のホルムアミド、０．７３ＭのＮａ
Ｃ４，，２５ｍＭのＰＩＰＥＳ（：／、　ｌＩ−ビ硬う
ジンービス−（，２−エタンスルホン酸）〕、ｐｌＡ、
ｇ％０．２係のナトリウムドデシル硫酸塩（ＳＯＳ）、
２！ｒｍＭのＥＤＴＡ、１０θａｌｌ／ｌｎｔのサケ血
清ＤＮＡ％　１０θｐｇ／ａｔのイーストｍＲＮＡ　及
びＤｅｎｈａｒｄｔ、Ｄ、、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｌ
ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｒｒｍ。

２３、乙、ダンー乙ダＡ　Ｃ／９６１．）記載のような
３　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　溶液中で弘コ℃でｌ夜予備
混成された。

プロットは次に、同じ媒体（しがしｌ×Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ　溶液を用いる）中でグコ℃で１２ｐラベルしたグロ
ーブを用い混成された。

各粗製原形質抽出物の四分のｌ又はへ分の／又は（引き
続くスクリーニングのためにン精製した５ｕｐｅｒ　−
ｃｏｉｌｅｄ　プラスミドの１００ナノグラムをＲｌｇ
ｂｙ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、、
／　／　３．２３７−２３／（／９７７）記載のようＫ
ｍｌｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｌｏｎ　Ｋよ５１＋２ｐで
、２〜ＩＸ／θ　カウント７分・μ？の特定の活動度ま
で２ベルした。

プロットを、コｘｓｓｃ標準クエン酸ナトリウム溶液（
３０ｍＭ　クエン酸三ナトリウム及び。、３Ｍ塩化ナト
リウム、ｐＨ７、０）、０．２％ｓｏｓ中で二厚液を換
えて、各々グ２ｃで６゜分１＆Ｉ」そしてθ、／×％Ｓ
ＳＣ，（／　、ｊｍＭ　クエン酸三ナトリウム及び／、
ｔｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７，０’）、０．２％ＳＤ
Ｓで／夏６７℃でｉｓ分間洗った。

洗ったツｏｙトを次に、Ｃｒｏｎｅｓ　Ｌｉｇｈｔｅｎ
ｉｎｇＰｌｕｓ　補力スクリーンを用いてｌ又Ｆｉ／＆
日間、−ｓｏ’ｃｃにｏｄａｋＸＲＰ−５又はＸＡＲ−
／　Ｘ　線フイルムに露出した。サイズ推定値は、５ｕ
ｔｃｌｌｆｆｅ、　Ｊ、Ｇ、。

（７９７ざ）に記載のように、プラスミドｐＢＲ３２２
標準との比較に基づく。

ＤＮＡは、プロディナーゼに及びＳＤＳでの処理後にラ
ット肝臓核から抽出され、Ｈｉｎｄｌｌ　又はＥｃｏ　
Ｒ）　制限エンドヌクレアーゼで消化され、・７−して
０．６％アガロースダル上で分画された。

ＤＮＡ　は、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、、　Ｊ、Ｍｏ１
．　Ｂｌｏｌ、、　ラーグ、ＳＯ２−！；／７（／９７
３ン記載のようにニトロセルロース上移され、Ｎｏｒｔ
ｈｅｒｎ　プロットについて述べたように５２ｐラベル
されたプローブを用いて混成された。

７６、弘３３０−ψ３５弘（１９７γ）記載の一般的方
法に従った。ラット脳ホモグ不一トを　“２０．０ＯＯ
Ｇで２０分間遠心分離してペレット化して、粗製ミトコ
ンドリアーシナグトンームペレットを作った。遠心分離
後の上澄み中には、全免疫反応性の約１０％未満が残っ
た。

被レット化した物質を次に、ｇ％ポリアクリルアミド−
３ＤＳグル上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロース
上でエレクトロ１日ツデイングを行った。プロットした
分画は次に、適轟な抗合成ポリペプチド抗体たとえば抗
Ｐ５．抗Ｐ６又は抗Ｐ７血清を混合された。

結合した抗体の可視化は、指示群としてのＨＲＰに接合
したヤギ抗ラビットＩｇＧを用い、前述したようにジア
ミノベンジジン及び過酸化水素を用いて達成された。

ｌｌのクローンからの組換えプラスミドＤＮＡは、Ｔａ
ｎａｋａ　ら（前出）記載の方法によｐクロラムフェニ
コール処理したバクテリア培養物から作り、各々のクロ
ーンからの精製したＤＮＡ／θμタ　は、Ｍｅｌｌｉ　
ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｌｏｌ、＋　９３．２３〜３ｇ
Ｃ／９７６）記載のように変性され、そして二重ニトロ
セルロースフィルター上に固足される。脳細胞原質ｐｏ
ｌｙ（Ａ）　ｍＲＮＡ（ψμＦ）　は、７９ｍＭのＴｒ
ｉｓ　、’　ｐ＋＋　９　、　Ｓ％／　ｍＭのスペルミ
ジン、０．／ｍＭのＥＤＴＡの５Ｏｔｔ４中で９０℃で
／左分間培養することによジアルカリで破壊し、０．３
ＭのＴｒｌＳ（ｐＨヲ、５）、０　、　／　Ｍｇｃｚ２
、！；ＯｍＭのジテオトレイトール、５０％グリセロー
ルの６μｔこれは０．５マイクロキユーリーの５２Ｐ−
ＡＴＰＣ２０００＊ニーＵ−／ミ’）−Ｅ：／ｋ）及び
Ｔ＆ポリヌクレオチドキナーゼ（９単位）を含む）中刃
３７℃で６分間培養して末端ラベルして、約７００のヌ
クレオチドの生成！ｌ／ｌｍＲＮＡ＆ｌＫ群を得た。

ｓ２Ｐ−ｍＲＮＡはグラスミドＤＮＡに混成され、ニト
ロセルロースフィルターが洗ワレ、ソシテＤｅｒｍａｎ
　ら、Ｃｅｌｌ、　、二１３　、　７３７　〜３７９（
／９ｇ／）記載と同じ条件下でヒｖｉｍＲＮＡａｓｅ及
びプロディナーゼＫによ多処理された。フィルターをカ
ウントし、各クローンに対して混成する定常状態ｐｏｌ
ｙ（Ａ）　ｍＲＮＡ　のノや一セントを、下記の式を用
いて計算した： ｍＲＮＡサイズの数平均　（混成−背景）ｃｐｍｘ／、
５Ｘ／θ０ｃＤＮＡインサートのサイズ　全ｃｐｍ数平
均サイズ（１７１，０のヌクレオチド）は、重量パーセ
ントではなくて数に基づくパーセントを得るために用い
られた。係数７．５は、Ｐｏ１ｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ　８
Ｍ製物が約３０％のリデソームｍＲＮＡで汚染されてい
ると判断されたので、ここで用いられた。

計算された豊富さは丸められて、豊為さのクラス：３．
θ、コ、θ、／、０．０．５．０．２、θ、／、０．θ
Ｓ、０．０２．０．０／％の一つに入れられる。他のク
ローンの豊富さは、プローブ特異的な活動、オートラジ
オグラフ露出倍率及びバンド強度を推定の基礎として用
いて、これら／／の基準との比較によシ推定された〇に
、高圧液体クロマトグラフィ 高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析は、
一般にＲｉｖｌｅｒ、　Ｊ、　ＣＦｌｏｍａｔＯｇｒ−
＋　２０２．２／／−２２２（／９ｇθ）の技法に従っ
てＰＡＣｌ−／２！カラム（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ
ｉａｔｅｓ、　Ｂｏｓｔｏｎ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　）を含むＷａｔｅｒｓ　
ＡｓｓｏｃｌａｔｅｓＭｏｄｅｌコ０ｔＡ液体クロマト
グラフを用いて行われた。溶離は、０−２３Ｍのトリエ
チルアミンリン酸塩（ｐＨ，２゜２５）及び３θチのア
セトニトリルを含む水性緩衝液中で行われた。

ＨＰＬＣに適用されたサンプ／ｌ／は、ラット脳の／Ｉ
ｌｉ’ｌ酢酸抽出物（９つの脳／−）の１００μｔを含
んだ。得た分画け　＋２５１　ラベルした血清を用いて
、抗Ｐ、Ｓ−１抗Ｐ乙及び抗Ｐり活動による免疫反応の
形成について分析されえ。

このように行った検定法は、プロティノイド誘導体２０
〜！ｒθピコグラムの感度を持った。予備的研究は、抗
Ｐｇ活動の多くが約／Ｓ〜約１１０のアミノ酸残基を含
む小さなポリペプチドの保持時間でもってカラムから溶
離すること金示した。

得た溶離パターンは、抗ＰＳ反応性を持ついくつかの比
較的低分子量のプロテメイド誘導体が存在することを示
し、それによυ、合成ポリペプチドＰＳのアミノ酸残基
配列にほとんど対応するアミノ酸残基配列が抗Ｐ５血清
と免疫反応を形成しえたこれら溶離した分画中に存在す
ることを示している。

従ってこの結果は、合成ポリペプチドＰｓのアミノ酸残
基配列にほとんど対応するアミノ酸残基配列の存在が溶
離された複数の分画中にあることを示している。

し、腔内投与 ラットは、合成ポリペプチドの腔内投与のために側脳室
（１ａｔｅｒａｌ　ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ　）上をねらっ
て脳内脳室カニュールを備えられた。Ｋｏｏｂら、（７
９ｇ／）の一般的手順に従った。

この外科的処理のために、ラットはクロロベント麻酔剤
（Ｆｏｒｔ　Ｄｏｄｇｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　Ｉｎｃ　）で麻酔され、Ｋｏｐｆ　５ｔｅｒｅｏ　ｔ
ａｘｌｃ器具に固定された。

コ３ダージステンレススチール管から成ｐ７鵡長のガイ
ドカニユーレを脳室の／閣以内に下ろし、二つのステン
レススクリューと歯科用セメントで頭がいに固定した。

調整は、ｔｏｏｔｈ　ｂａｒによシ、耳中間ゼロの上！
ｆ閣、前項の後−０，ｂｍ、コ、０■横、挿入点で頭が
いの下−３、，２ｍｍとされた。

注入のために、ダミーのスタイレットを除去し、ポリエ
チレンｌＯ管の３０−を付けられた３０ゲージステンレ
ススチールカニユーレｋ、カイ）”ｋ通してガイドテッ
グｔ−／　ｔｏｎ越えて挿入した。管をラットの頭よｐ
上に上げて、ＳμＶのポリペプチドを含む／μｔの溶液
が流下するまで３０秒かけて重力によシこれを注入した
。体積は、予めＳμｔのＨａｍｌ　Ｉ　ｔｏｎ　シリン
ジで較正されたポリエチレン１０管上の印によシ測定さ
れた。

この技法でそのカニユーレが容易に流れたラットのみが
研究で用いられた。総ての実験は、ｉ横手Ｈを用いて行
われ、そこではラットをゲストする人は、ラットの処理
を知らなかった。

■発明の特別の実施態様 Ａ０合合成ポリ４ｆチ ド発明の一つの実施態様は、合成ポリペプチドである。

この合成ポリペプチドは、アミノ酸残基配列において、
自然に生じるプロティノイドの配列の少くとも一部に対
応し、該プロディノイドの分子量と同じ又はそれよ多少
ない分子量を持つ。

プロテイド自体は、主に脳細胞中にのみ存在するメツセ
ンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から翻訳される。

合成ポリペプチドは、担体に接合体として結合され、そ
して動物に導入されたとき、自然に生じるプロティノイ
ド又はその誘導体に対して免疫反応で結合する抗体の生
産を誘発する。

そのような合成ポリペプチドの例は、前述した合成ポリ
ペプチドＰ　／　、Ｐ−２及びＰ５〜Ｐ１０である。前
述の説明は、合成ポリ４ｆチドの配列が、クローンＰ／
Ａ７３又はり四−ンｐ／Ｂ−２３Ａと混成するｍ　ＲＮ
　Ａから細胞により翻訳されたプロティノイドの配列の
一部にほぼ対応すること、及び合成ポリペプチドの分子
量がプロティノイド分子量よシ笑質上小さいことを例示
した。このことは、ポリペプチドのクローンｐ／Ｂ２．
？乙読出しフレームの３／ｇのアミノ酸残基配列及び合
成ポリペプチドＰ５及びＰ乙の各々３　（１−ｍａｒ及
び２／−ｍａｒポリペプチドから容易に判る。

細胞的に１０テイノイドに翻訳されるｍＲＮＡの存在は
、種々の組織からのｍＲＮＡ刺激−用いてインビトロの
ｍＲＮＡ刺激された。ゾロティノイド合成によシ例示さ
れた。主に脳細胞中にのみ存在し、自然に生じるゾロテ
ィノイドに翻訳されるｍＲＮＡは好ましくはポリアデニ
ル化されており、核又はミトコンドリアと比べると細胞
形質中に存在する。

自然に生じるゾロティノイドに翻訳されるメツセンジャ
ーＲＮＡは好ましくは、脳細胞形質メツセンジャーｍＲ
ＮＡの約２重量％未満のｍ度で存在する。よシ好ましく
は、ゾロティノイドに翻訳されるｒｎ　ＲＮ　Ａ　Ｆｉ
、脳の細胞形質ｍＲＮＡの約０．２重量−未満、最も好
ましくは０．０／重量−未満で存在する。

いくつかの合成ポリペプチドが、にＬＨ−エドスチン及
びテログロブリンのような担体に結合されて接合体を形
成し、形成された接合体は動物における抗体の生産を誘
発するために用いられた。

そのように用いられた合成ポリペプチドは好ましくは、
少くとも約６のアミノ酸基の長さであシ、最大ではプロ
ティノイドのそれよシ短い長さであシうる。しかし、合
成ポリペプチドは、約７０〜約ＳＯのア（）酸基の＊名
であることが好ましい。

また、合成ポリペプチドは単独で用いる仁とができ、な
かんずく抗体を生じるため及び治療のためにそうであシ
、しかし抗体が作られるべき場合には接合体を用いるこ
とが好ましい。

そのようにして生じた抗体の結合は、前述した細胞免疫
化学的夾雑及びＨＰＬＣ分画したゾロティノイド誘導体
決定により例示された。そのように調製された抗体に結
合したゾロティノイド又はその誘導体は好ましくは、自
体神経活性なプロカッイドであシ又はよＪｌｌ？４’ｌ
ｌ性なプロカッイド誘導体の−又は二以上へと（合成ポ
リペプチドＰｓ及びＰ６に対する抗体忙よＣＭ合される
物質のようＫ）ｍｌ胞中で処理される。また合成ポリペ
プチドは、合成ポリペプチドＰ５のように、自体神経活
性でおシ、又は合成ポリペプチドＰｇのように神経活動
に調門作用を持つことが好ましい。

８　受容体分子 生物学的に活性な受容体分子は、本発明のもう一つの態
様である。これら分子は、本発明の合成ポリペプチド又
はそれと担体との接合体に対して誘発された又は生じた
抗体又は抗体の遺伝型含有ポリアミド部分である。好ま
しい態様において、受容体は本発明の好ましい合成ポリ
ペプチドに対して生ぜられる。

受容体は、少くとも生理的ｐＨ値及びイオン強度で水性
溶液中で抗原的合成ポリペプチドと混合されると、それ
と結合するにおいて生物的に活性である。

好ましくは受容体はまた、自然に生じるゾロティノイド
又はその誘導体と、該プロティフィト又は誘導体が脳細
胞組織内に又はそのような組織の表面にある時と同じ条
件下で又は脳細胞組織が水性媒体中に懸濁又は溶解され
たときにこのゾロティノイド又はその誘導体と給仕する
。

受容体が、約５〜約ヂのρＢ範囲内でかつ蒸留水から約
１モル濃度の塩化ナトリウムまでの範囲のイオン強度に
おいて少くとも抗原的合成ポリペプチドと結合すること
がより好ましい。

抗体の遺伝型含有ポリアミドは、抗原に結合する抗体の
一部である。

そのような部分としては、周知の酵素的切断技法により
抗体から作られたＦａｂ％　Ｆｅｂ’　及びＦ　（ａ　
ｂ’　）　２フラグメントが挙げられる。抗体は従来「
生じられる」又は「誘発される」と言われるので、抗体
の遺伝型含有／　ＩＪアミドもまた本明細書で「生じら
れる」又は「誘発される」と言われるが、抗体からその
ような物質を作るためには次に切断段階が通常必要であ
ることを理解しなければならない。

受容体分子は、前述した抗体の場合のようにポリクロナ
ールであることができ、又は受容体はモノクロナールで
あることができる。

モノクロナール抗体を作る技法は周知であシ、本発明の
モノクロナール受容体は、Ａｒｎｈｅｌｔｅｒら、Ｎａ
ｔｕｒｅ、、１．９’ｌ、２７ｇ−２ｇＯ（７９ｇｌ）
が行ったように免疫原として本発明の曾成ポリペプチド
（好ましくは抗体に結合された）を用いることにより作
ることができる。

モノクロナール抗体は典型的には、ハイプリドーマ組織
培養物から、又はハイグリドーマ組織が導入された動物
から得た腹水から、得られる。にも拘らずモノクロナー
ル抗体は、本発明の合成ポリペプチド又はそれと担体と
の接合体により「生じられる」又は「誘発される」と記
述される。

受容体は、ときにはラベルとも言われる「指示群（指示
基）」と共に用いられる。指示基又はラベルは、免疫反
応が起ったかどうかを決めるため及びある場合にはその
ような反応の程闇を測定するための手段として受容体と
一緒に用いられる。

指示基は、放射性元素の場合のように単一〇原子、たと
えばヨウ素１２Ｓ又は１３／、水素３又は硫黄３５、又
はＮＭＲ活性元素たとえばフッ素１９又は窒素ｌＳであ
ることができる。指示基はまた、フルオレセインのよう
な螢光染料又は西洋ワサヒノヤーオキシダーゼ（ＨＲＰ
）のような酵素などの分子であることができる。

指示基は、抗体が１２５１　でラベルされる場合のよう
に、受容体に結合されていてもよい。指示基はまた、抗
体受容体がラビット中で生じられた場合のＨＲＰ結合ヤ
・ギ抗ラビット抗体のような受容体分子と反応するとこ
ろの、又は１２５１　のようなロチインＡに結合された
場合のような独立した分子の一部又は全部又は原子であ
ってもよい。

主指示基がＨＲＰのような酵素である場合、免疫反応が
超った事実を可ネＲ化するために追加的反応剤が必要と
きれる。ＨＲＰのためのそのような追加的反応剤として
は、ここで用いた過酸化水素、ジアミノベンジジンのよ
うな酸化染料先駆体が挙げられる。

「指示基（指示群）」又は「ラベル」という言葉は、受
容体に結合される又は別々に用いられる単−原子及び分
子を包含するべく用いられ、とれら原子又は分子が単独
で用いられるか追加的反応剤と共に用いられるかにはか
かわらない。そのような指示基又はラベルは自体免疫化
学で周知であり、それらが他の点では新規な受容体、方
法及び／又は系と共に用いられる限りにおいて本発明の
一部を成す。

本発明の別の実施態様は一１脳細胞プロティノイドの自
然に生じるアミノ酸残基配列の存在のための検証法に関
する。

ここで上述の受容体が生ぜられ、そして収穫される。受
容体（抗体又はそれの遺伝子型含有ポリペプチド）は次
に、脳組織及び指示基と混＠はれる。自然に生じるアミ
ノ酸残基配列の存在は、指示基によりシグナルされる免
疫反応の形成により確認される。

この方法は、合成Ｈ？ＩＪ　４デチドＰ／及びＰ２に対
して生じた抗体を用いて前述の脳細胞組織切片のような
固体相系に通用できる。

この方法はとくに、ラビットへの合成ポリペプチドＰ５
及びＰ乙の導入により誘発された抗体により示されたよ
うに、そのｍＲＮＡが比戟的少量で存在する神経活性プ
ロティノイド又はその誘導体の存在を検出するために有
用である。

それはまた、ＨＰＬｃ分画したプロティノイド誘導体に
ついて示されたように、液体媒体たとえば均質化した又
は他の脳細胞ｍ織調製物において有紬である。

本発明の受容体が有用である特別の液体媒体の一つは、
脳Ｖ髄液（Ｃ３Ｆ）である。Ｃ３Ｆは、水性液体媒体と
して単独で、又は水又は緩衝溶液希釈Ｗ＋Ｊと混合され
て用いることができる。

本発明の別の実施態様において、脳損傷の疑いのある動
物からの脳を髄液が用意される。脳損傷が起きたとき、
そのよりなＣ９Ｆは典型的に、脳とを髄の間の接続の故
に損傷した脳細胞組織から放出されたゾロディノイド又
はゾロティノイド誘導体を含む。

用意され九〇ＳＦの少量に、生物学的に活性な受容体と
指示基又は種々の受容体と適当な指示基の複数の群の有
効量を混合する。混合物は、免疫反応が起るのに十分な
時間公知のように典型的に培養される。培養した混合物
は次に、指示基により示される免疫反応の存在を評価す
る。それによりデロテイノイ「又はその誘導体の存在が
示され、脳ｍ職の損傷の証拠を与える。

検証されるゾロティノイド又はプロティノイド誘導体が
Ｃ３Ｆの通常の成分である場合、この方法は存在量の増
加を測定するために用いられる。

この態様において、プロティノイド又はその誘導体の量
の増加は、脳組織の損傷又は上記増加ｔもたらす脳組織
の異常を示す。

主に脳細胞組織中にのみ又は脳中の既知の部位にある組
織の細胞中に存在するｍＲＮＡから翻訳されたゾロティ
ノイド又はゾロティノイド誘導体の配列にほぼ対応する
アミノ酸残基を持つ合成ポリペプチドに対して生じた受
容体が、この実施曹様の一局面において用いられる。そ
のような受容体の使−用は、外科的手段に頼らずに、損
傷した組織のタイプを同定すること又は脳に対する損傷
の部位を決めることを可能にする。

たとえば、前述したラビットへの合成Ｉリペプチドの導
入により誘発された抗体のような受容体は、脳のどこか
ヤのノイロン及び樹枝状突起に対する損傷を検出するた
めに用いることができる。

これら受容体の既知量に、クローンＰｔＡ７Ａ；’のＤ
ＮＡによりエンコードされたゾロティノイドを含むと考
えられるＣ３Ｆの少量を混合する。そしてｍ＠物は好捷
しくは培養されて免疫反応を起すことができるよりに寧
れる。

微量滴定プレートのくほみに合成ポリペプチドＰｔの既
知量を塗る。次に混合物をくほみに加え、培尊し、そし
てすすぐ。次にヤギ抗うビツ）　ＨＲＰ結合抗体の既知
量を、必要量の過酸化水素とジアミノベンジジンと共に
微量滴定プレートに加える。

起った反応の種間が、適当な基準を用いてＣ３Ｆ中のゾ
ロティノイドの存在及び量の評価として及びそれにより
抗Ｐ／反応性のノイロン及び樹枝状突起が損傷している
かどうかを決めるための検証法として用いられる。同じ
やシ方が、解剖学的に局在するゾロティノイド又はその
誘導体に対して、脳部位特異的な損傷評価のための方法
として用いることができることは容易に判る。

本方法の適用は広くてもよく、広く脳に対する損傷の検
証を可能にし、あるいは適用は狭められて損傷の部位を
より詳しく位置決めすることもできる。

広い適用が望まれる場合、合成ポリペプチドＰ／又はＰ
２に対して牛じた受答体の場合のように、そのアミノ酸
残基配列が広く分布しているプロティノイド又はプロテ
ィノイド誘導体の配列に対応しているところの合成ポリ
ペプチドに対して生じ先受容体が用いられる。組織タイ
プ損傷に関する適用は、合成ポリペプチドｐ３％Ｐ６又
はＰ７に対して生じた受容体のような受容体を用いて得
られる。

診断系（好ましくはキットの形の）は、本発明の別の態
様である。

この系は、免疫反応によシ、脳細胞におけるゾロティノ
イド又はその誘導体の自然に生じるアミノ酸残基配列の
存在を検出するために肩出である。

この系は、本発明の生物的に活性な受答体を含むパッケ
ージの少くとも一つを包含する。

指示基又はラベルは好ましくは受容体と共に供給され、
それと−緒にパッケージされ又は別々に７４ツケージさ
れることができる。

過酸化水素及びジアミノベンジジンのような追加的反応
剤はまた、ＨＲＰのような指示基が用いられる場合、系
に含められることができる。そのような物質は、多くの
指示基と同様に市販で容易に入手でき、診断系と一緒に
供給される必要はない。

また、過酸化水素のようなある反応剤は自然に分解し又
はある放射性元素のように短寿命であり、従って最終使
用者により入手されるのがより良い。

各診断系は、種々のアミノ酸残基配列の存在を検証する
べく設計されつる。

すなわち、神経活性プロティノイド又はその神経活性誘
導体の存在の検証のために用いられる系は、抗合成ポリ
ペゾチドＰ５、抗合成ポリペプチドＰ６又は抗合成ポリ
ペプチドＰ７受容体を含むことができる。同様に、錐状
細胞のような大きな突出ノイロンの存在の検証のための
系は、抗合成ポリペプチドＰ／又は抗合成ポリペプチド
Ｐ２受容体を含むことができる。

Ｏ６医薬組成物 本発明の合成ポＩＪ　ｉデチドのいくつかは神経活性で
ある；合成ポリペプチドは、脳細胞に投与されたとき、
それらの周辺に周まれる脳細胞の活動を変える。

合成ポリペプチドＰ５及びｐｇが、各々神経トランスミ
ツタ一様の活動（Ｐ５）及び神経調整活動＜ｐｇ＞を持
つことを先に示した。

すなわち合成ポリペプチドｐ５は、イオン泳動的に投与
されると海鳥のＣＡ３領域の細胞のｆｌｒｌｎｇ　ｒａ
ｔｅを増加し、脳内投与きれるとラットの日中運動活動
を増加させることが判った。結局、合成ポリペプチドＰ
ｊ及びＰｇの両者は、神経生理学的に及び／又は行動的
に測定しつる脳における生物的神経活動を持つ。

また合成ポリペプチドは、グルタミン酸塩の存在下で神
経活動を調整することが示された。

本発明の医薬組成物は、本発明の合成プリ″Ｊ！ゾチド
を生理学的に許容できる希釈剤たとえば蒸留水又は脱イ
オン水、標単塩水、Ｋｒｅｂｓ重炭酸塩溶液などと共に
含む。

本発明の合成ポリペプチドは、直接動にたとえば脳内的
に投与でき、又は注射によりＣ３Ｆ中に投与できる。典
型的な有効投与量は、約０．／μ２／体重に９〜約１０
０μ？／体重Ｋｇである。

「ブローポリペプチド」のような合成ポリペプチドを含
む医薬組成物はまた、静脈内（１，ｕ、）又は皮下（Ｓ
、Ｃ，）に投与できる。ここで「ブローポリペプチド」
という言葉は、動物への投与後に動物の体内で変化され
て治療部位とくに脳で合成ポリペプチド又は合成ポリペ
プチドの生物的に活性な誘導体を放出するところの本発
明の合成ポリペプチドの誘導体形を云う。

ブローポリペプチドは、好ましくは合成ポリペプチドの
親油性誘導体である。

合成の親油性ポリペプチド誘導体は、血−脳パリヤーを
通る血流から脳細胞組織中に通過することができ、１．
ｕ、及び／又はｌｉ、ｅ、投与を容易にする。

ブローポリペプチドは、さもなくば通常合成ポリペプチ
ド上に存在するイオン電荷を減少する又は除去する既知
の反応剤を用いて作ることができる。たとえば、合成ポ
リペプチドＮ−末端アミノ基及びリシンε−アミノ基は
、還元Ｎ−メチルニコチン酸などと反応させられて、生
理的ｐＨ値においてこれらアミン上に通常存在する正の
イオン電荷を電荷的に中性のアミド基に変換することが
できる。またニコチン酸部分は、アミド形成反応が完了
した後に還元されることもできる。

Ｎ−置換ニコチン酸部分の還元形は、上述のアミノ基よ
り親油性であり、第一アミノ基含有医薬モデルを誘導体
化して血−脳パリヤーを誘導体化モデルが通過できるよ
うにするのに有用であることがＢａｄｏｒ　、　５ｃｌ
ｅｎｃｅ　、　２　／　Ｑ　＊　／　％？　７θ〜１３
７．２（／９ｇ／）によシ示されている。

荷電した物質種への酸化は脳細胞内で起り、得られた荷
電した医薬モデル誘導体は脳内に留まり、そこでそれは
誘導体化されていない医薬モデルへと加工されうる。同
じ反応経路が、本発明の還元ニコチンアミド誘導体化合
成ポリペプチドについても起ると考えられる。

アミノ基は捷た、／〜約ｌθ個の炭素原子を含む反応性
の酸によるアミド化反応によってより親油性とされるこ
とができる。

そのような酸の例は、ギ酸、酢酸、ピバリン酸、安息香
酸なとである。酸は、周知のようＫその酸塩化物又は無
水物の使用、ｌ−エチル−３−（３−ジメチルアミノ）
−プロピルカルがジイミドのよらなカルボジイミドカッ
プリング剤の使用などによって「反応性」とすることが
できる。

アミノ基上の正のイオン電荷はまた、これらアミンをカ
ルバメート結合に変える反応により除去することができ
る。すなわちアミノ基はエチルクロロホルメートと反応
されて、エチルカルパメー）（Ｎ−カルブエトキシ）誘
導体を形成することができる。

カルボキシ基の負のイオン電荷は、アミド又はエステル
結合の形成により中和されることができて、合成ポリペ
プチド自体よりも比較的親油性のグローポリペプチドを
与える。

前述したように、脳及び体のどこか他で見い出されるい
くつかの神経活性プリ被グチドは、カルがキーシ末端ア
ミド基を含む。そのような非置換カルボキシ末端アミド
基（−ＣＯＮＨ２）は、本発明のブローポリペプチドの
カルがキシ末端部分を与えるために本発明で好ましい。

−及び二置換カルボキシ末端アミドは捷た、アミド窒素
原子がｌ〜約ダ個の炭素原子を含む低級アルキル基、ヒ
ドロキシ置換低級アルキル基で置換されている場合、父
はアミド窒素原子が５又はる員環（これは−以上のへテ
ロ原子たとえば酸素、硫黄又は窒素原子を含んでもよい
）を形成する場合、有用である。

種々述べたように、ブローポリペプチドのカル♂キシ末
端アミノ酸残基のカルブキシル官能基は、式−ＣＯＮＲ
’Ｒ２のアミド誘導体であることができる。

ここで　Ｒ１及びＲ２は互に独立に水素、Ｃ−Ｃ４ アルキル、Ｃ〜Ｃヒドロキシアルキルであり、４ 父はＲ１と８２はアミド窒素と一緒になって５又はる員
環（これは酸素、硫黄及び窒素原子から成る群から選ば
れた一以上のへテロ原子を含むことができる）を形成す
る。

０１〜Ｃ４アルキル残基の例としては、メチル、エチル
、インプロピル、第ニブチルなどである。

０１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル残基の例としては、λ−
ヒドロキシエチル、コーヒドロキゾプロビル、３−ヒド
ロキシプロピルなどである。アミド窒素原子を含むＳ又
は６員環残基の例としては、ピラジニル、ピラゾリジル
、ピラジル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリ
ゾニル、トリアゾリル、トリアジニルなどである。

ゲルコール又はリビースのような糖分子は、カル？末端
アミノ酸残基又は何らかの他のカルボキシ基含有アミノ
酸残基のエステル誘導体のアルコール部分として用いる
ことができる。ｌ〜約ＩＱ個の炭素原子を含む一官能性
アルコール、たとえばメタノール、エタノール、ベンジ
ルアルコールなどはま−た、エステル含有ブローポリペ
プチドを形成するにおいて有用である。またピパロイル
オキシメチルエステルなどは、カル？ン酸カリウム塩と
クロルメチルピバレート又は他の類似のクロルメチルエ
ステルたトエばクロルメチルアセテートとの反応により
作ることができる。

上述の反応及び誘導化剤は、用いることができるものの
例示を意図している。反応又は反応剤が本発明の合成ポ
リペプチド自体よりも親油性のグローポリペプチドを与
えるために用いられ、かくして作られたグローポリペプ
チドはｓ、ｃ、又は１、ｖ、投与後に血−脳パリヤーを
通る血流から脳内に合成ポリペプチドよシも容易に通過
する場合を除き、他の特定の反応又は誘導体化剤の使用
は本発明の一部ではない。

上述したところは本発明の例示であって、本発明を限定
するものではない。数字の変化及び変更は、本発明の正
しい精神及び新規な概念の範囲から離れることなく可能
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローンＰ／Ａ７３のＰ／Ａ７ｊ相補的ＤＮ
Ａの特徴を示す図である。 第一図は、クローンＰ／Ａ７！；の翻訳生成物に対応す
る蛋白質の特徴を示す図である。 第３図は、Ｐ／Ａ７３抗ペゾチド抗血清によるラット脳
抗原の免疫細胞技術的検出を示す図である。 第９図は、クローンＰ　／　Ｂ　、、）、　３乙の特徴
を示す図である。 第Ｓ図は、Ｐ／Ｆ３２３６オープン読出しフレームを示
す図である。 第６図は、Ｐ／Ｂ２３乙抗ペプチド抗体によるラット脳
抗原の免疫細胞化学的検出を示す。 第７図は、クローン／Ｆ３．２０ｇの特徴を示す。 ＠ｇ図は、クローンｐｏ−ｑｏの特徴を示す。 ＦＩＧＵＲε］ ｑ′γ金偶８９ン８勿偵ス廠グ々Ｖ紹Ｍ４μゑ一；＊−
中グ枯９々肋λ久８１εＪα純Ｃ９雫　１音　１− ＦＩＧＵＲＬ２ １１ＧｔＪＲＥ　、３ ＦＩＧＵＲＥ４ ＦｉＱＬＩＲε６ ＦＩＧＵＲＥ　？ ＾５ＩＬＮ　ＧＮＦ　Ｂ＠＠１；蒼１１ＦＩＧＵＲＥ　
８ Ａ　ＢＬ　に ４３６２＞　ｑ　２９０　４９０　６９０　ｓ？０１（
Ｆ　１２Ｐ０５ ２　・　・　・　−１−−ｍ−・ゲ・　０・・Ａ＾Ｃ１
（＋ｎＴｒＴＧＡＧ＾＋Ａ＾＾丁口ｏ＾ＧＴＣ，、？Ｇ
ＩＪＧ手続補正帯（方式）６０．４．−３ １．事件の表示　昭和５９年特許願第１５１１４６号り
合 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　自然に生じるゾロティノイドの配列の少くとも一
   部にアミノ酸残基配列において＃１とんど対応し、該グ
   ロテイノイドの分子量と同じ又ｔまそれより小さ込分子
   量を持つ合成ポリ被プチドであって、該グロテイノイド
   は主に脳細胞中にのみ存在するメツセンジャーＲＮＡか
   ら翻訳されたアミノ酸残基配列を含み、合成ポリｄデチ
   ドは担体に接合体として結合されて該接合体として動物
   に導入されたとき上記の自然に生じるグロテイノイド又
   はその誘導体に結合する抗体の製造を誘発するものであ
   るところの合成ぼりぜゾチド。 ２、　自然に生じるゾロティノイドへと翻訳されるメツ
   センジャＲＮＡが、脳の細胞形質メツセンシャーＲＮＡ
   の約２重ｆｒｙ未満の濃度で存在する特許請求の範囲第
   １項記載の合成ポリイデチド。 ３、　自然に生じるゾロティノイドに翻訳されるメツセ
   ンジャーＲＮＡが、脳細胞形質メツセンジャーＲＮＡの
   約０．０１重量係未満の濃度で存在する特許請求の範囲
   第１項記載の合成ｇ　ＩＪ　−２グチド。 ４、合成ｚすｄｆチドが、左から右へかつアミノ末端か
   らカルボキシ末端の方向に下記式により示されるアミノ
   酸残基配列を持ち、ここで該配列は （ａ）　ＣＩＰＥＧＬＥＳＹＹＴＥＱ （ｂ）　Ｒ８ＶＳＰＷＭＳＶＬＳＥε （ｃ）　ＮＶＴＥＳＰＳＦＳＡＧＤＮＰＨＶＬＹＳＰＥ
   ＦＲＩＳＧＡＰＤＫＹＥＳＥ：（ｄ）　ＬＬＧＬＲＧＥ
   ＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ５ＤＬＧ：（ｅ）　ＰＴＫＤＳＹ
   ＴＬＴＥＥＬＡＥＹＡＥＩＲＶに：（ｆ）　ＬＧＳＥＲ
   ＲＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ８ＤＬＧ：（ｇ
   ）　ＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ３ＤＬ−ＮＨ
   ２：及び（ｈ）　ＬＧＳＥＲＲＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬ
   ＤＬＳＹＳＨ８ＤＬ−ＮＨ２より成る群から選ばれる特
   許請求の範囲第１項記載の合成ポリペプチド。 ５、脳細胞組織と免疫学的に反応する生理活性な受容体
   において、自然に生じるゾロティノイドの配列の少くと
   も一部にアミノ酸残基配列においてほとんど対応し、該
   プロティノイドの分子−量と同じ又はそれより小感い分
   子量を持つ合成ポリペプチドであって、該ゾロティノイ
   ドは主に脳細胞中にのみ存在するメツセンジャーＲＮＡ
   から翻訳されたアミノ酸残基配列を含み、合成ポリペプ
   チドは担体に接合体として結合きれて該接合体として動
   物に導入されたとき上記の自然に生じるプロティノイド
   又はその誘導体妃結合する抗体の製造を誘発するもので
   あるところの合成ポリペプチド又は担体に結合された該
   合成ポリペプチドの接合体に対して生じた抗体又は抗体
   の遺伝型含有ポリアミド部分を含み、上記自然に生じる
   プロティノイド又はその誘導体を含む脳細胞組織と混合
   されると免疫反応を形成するところの受容体。 ６、　プロティノイド又はプロティノイド誘導体は特定
   の脳組織細胞の表面に存在するものである特許請求の範
   囲第５項記載の受容体。 Ｚ　脳細胞組成の試料中における脳細胞デロティノイＰ
   の自然に生じるアミノ酸残基配列の存在を検出する方法
   において、 （ａ）　脳細胞組織と免疫学的に反応する生理活性な受
   容体であって、自然に生じるゾロティノイドの配列の少
   くとも一部にアミノ酸残基配列においてほとんど対応し
   、該ゾロティノイドの分子量と同じ又はそれより小さい
   分子量を持つ合成ポリペプチドであって、該プロティノ
   イドは主に脳細胞中にのみ存在するメツセンツヤ−ＲＮ
   Ａから翻訳されたアミノ酸残基配列を含み１合成ポリペ
   プチドは担体に接合体として結合されて該接合体として
   動物に導入されたとき上記の自然に生じるゾロティノイ
   ド又はその誘導体に結合する抗体の製造を誘発するもの
   であるところの合成ポリペプチド又は担体に結合濱れた
   該合成ポリペプチドの接合体に対して生じた抗体又は抗
   体の遺伝型含有ポリアミド部分を含み、上記自然に生じ
   るプロティノイド又はその誘導体を含む脳細胞組織と混
   合されると免疫反応を形成するところの受容体を作るこ
   と：及び （ｂ）　該生理活性受容体を免疫反応の形成を指示する
   群の存在下で脳組織試料からの一部と混合することによ
   り、自然に生じるプロティノイドアミノ酸残基配列の存
   在を検出することの段階を包含する方法。 ８、脳細胞に存在するプロティノイドの少くとも一部に
   存在する自然に生じるアミノ酸残基配列の存在を免疫反
   応の形成により検出する診断系に赴いて、脳細胞組織と
   免疫学的に反応する生理活性な受容体であって、自然に
   生じるゾロティノイドの配列の少くとも一部にアミノ酸
   残基配列においてほとんど対応し、該′ゾロディノイド
   の分子量と同じ又はそれより小石い分子ｔｅ持つ合成Ｉ
   リペプチドであって、該ゾロティノイドは主に脳細胞中
   にのみ存在するメツセンジャーＲＮＡから翻訳でれたア
   ミノ酸残基配列を含み、合成ポリ−１！グチドは担体に
   接合体として結合きれて該接合体として動物に導入きれ
   たとき上記の自然に生じるゾロティノイド又はその誘導
   体に結合する抗体の製造を誘発するものであるところの
   合成Ｉす４デチド又は担体に結合はれた該合成ポリペプ
   チドの接合体に対して生じた抗体又は抗体の遺伝型含有
   ポリアミド部分を含み、上記自然に生じるグロティノイ
   げ又はその誘導体を含む脳細胞組織と混合きれると免疫
   反応を形成するところの受容体を含む少くとも一つのパ
   ッケージを包含し、上記受容体は脳組織と混合されると
   上記自然に生じるアミノ酸残基配列を含むプロティノイ
   ド又はその誘導体と免疫反応を形成するところの診断系
   。 ９、　免疫反応形成を指示する群をさらに含む特許請求
   の範囲第８項記載の診断系。 １０　指示群が受容体とは別に包装されている特許請求
   の範囲第９項記載の診断系・ １１、自然に生じるデロテイノイｒの配列の少くとも一
   部にアミノ酸残基配列においてほとんど対応し、該ゾロ
   ティノイドの分子量と同じ又はそれより小さい分子量を
   持つ合成ポリペプチドであって、該プロティノイドは主
   に１層細胞中にのみ存在するメツセンジャーＲＮ、Ａか
   ら翻訳されたアミノ酸残基配列を含み１合成、ｌ？　リ
   −４’　７’チドは担体に接合体として結合されて該接
   合体として動物に導入されたとき上記の自然に生じるゾ
   ロティノイド又はその誘導体に結合する抗体の製造を誘
   発する本のであるところの合成ポリぜグチドの有効量を
   活性成分として含み、また医薬的に許容できる希釈剤を
   含む医薬組成物。 １２、合成ポリペプチドが、自流から血−脳パリヤーを
   通って脳細胞組織に通過できる親油性のグローポリ−！
   ！グチド誘導体として存在する特許請求の範囲第１１項
   記載の医薬組成物。 １３、合成ポＩＪ　ｄゾチドが、左から右へかつアミノ
   末端からカルボキシ末端の方向に下記式により示される
   アミノ酸残基配列を持ち、ここで該配列は （ａ）　ＮＶＴＥＳＰＳＦＳＡＧＤＮＰＨＶＬＹＳＰＥ
   ＦＲＩＳＧＡＰＤにＹＥＳＥ：：（ｂ）　ＬＩＧＬＲＧ
   ＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ３ＤＬＧ：（ｃ）　ＬＧＳＥＲ
   ＲＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ３ＤＬＧ：（ｄ
   ）　ＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬＤＬＳＹＳＨ８ＤＬ−ＮＨ
   ２：及び（ｅ）　ＬＧＳＥＲＲＬＬＧＬＲＧＥＰＰＥＬ
   ＤＬ−８ＹＳＨ３ＤＬ−ＮＨ２より成る群から選ばれる
   特許請求の範囲第１１項記載の医薬組成物。 １４、免疫反応の形成によって、動物の脳細胞組織が損
   傷されたかどうかを決定する方法において。 （ａ）脳組織損傷を持つと疑われる動物から脳を髄液を
   採ること、但し該脳を髄液は脳組織に損傷が起きた時に
   損傷した脳組織から放出されたゾロティノイド又はその
   誘導体を含むものであること （ｂ）　該脳を髄液の一部に有効量の （１）脳細胞組織と免疫学的に反応する生理活性な受容
   体であって、自然に生じるゾロティノイドの配列の少く
   とも一部にアミノ酸残基、配列においてほとんど対応し
   、該プロティノイドの分子量と同じ又はそれより小さい
   分子量を持つ合成ポリペプチドであって、該ゾロティノ
   イドは主に脳細胞中にのみ存在するメツセンジャーＲＮ
   Ａから翻訳されたアミノ酸残基配列を含み１合成ポリペ
   プチドは担体に接合体として結合式れて該接合体として
   動物に導入されたとき上記の自然に生じるグロテイノイ
   「又はその誘導体に結合する抗体の製造を誘発するもの
   であるところの合成ぼりペプチド又は担体に結合された
   該合成ぼりペプチドの接合体に対して生じた抗体又は抗
   体の遺伝型含有ポリアミド部分を含み、上記自然に生じ
   るプロティノイド又はその誘導体を含む脳細胞組織と混
   合されると免疫反応を形成するところの受容体、及び （ｉｌ）指示群を混合すること；及び （Ｃ）　脳を髄液中のグロテイノイド又にそσ）誘導体
   と受容体の開の免疫反応の存在を上記混合物において検
   出すること、但し免疫反応の存在は指示群により指示さ
   れ、もって免液反応は脳組織の損傷を示すものであるこ
   と の各段階を包含する方法。 １５、ゾロティ、４イド又はその誘導体が脳のノイロン
   又は樹枝状突起に存在する特許請求の範囲第１４項記載
   の方法。