JP2980334B2 - ラットの顎下腺から導出したペプチド及びポリペプチド、対応するポリクローナル及びモノクローナル抗体、対応するハイブリドーマ並びに診断、検出及び治療目的でのこれらの生成物の使用 - Google Patents
ラットの顎下腺から導出したペプチド及びポリペプチド、対応するポリクローナル及びモノクローナル抗体、対応するハイブリドーマ並びに診断、検出及び治療目的でのこれらの生成物の使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ラットの顎下腺により分泌されるポリペプ
チドの成熟生成物である新規なペプチド、及びこれらの
ペプチドの類似物に関する。
チドの成熟生成物である新規なペプチド、及びこれらの
ペプチドの類似物に関する。
一定の生化学的特性を有する多くのポリペプチドが、
齧歯類動物の顎下腺（SMG）、特にマウスのSMGで多量に
合成される。これらのタンパク質は、神経成長因子（NG
F）、上皮成長因子（EGF）及びレニンを含み、所定の共
通する特性を有している。これらはすべて同じタイプの
細胞、即ち曲細管GCT（顆粒状曲細管）の細胞におい
て、種々のホルモン性刺激、特にアンドロゲンに応答し
て合成される。またこれらの分泌タンパク質がマウスの
唾液中に存在することを観察することも可能であり、そ
れらは前駆体の形で合成されて、カリクレイン型のプロ
テアーゼが関与する成熟過程を経た後に活性となる。こ
のカリクレイン型のプロテアーゼの幾つかのものもま
た、アンドロゲンの制御の下にSMGにおいて合成され
る。
齧歯類動物の顎下腺（SMG）、特にマウスのSMGで多量に
合成される。これらのタンパク質は、神経成長因子（NG
F）、上皮成長因子（EGF）及びレニンを含み、所定の共
通する特性を有している。これらはすべて同じタイプの
細胞、即ち曲細管GCT（顆粒状曲細管）の細胞におい
て、種々のホルモン性刺激、特にアンドロゲンに応答し
て合成される。またこれらの分泌タンパク質がマウスの
唾液中に存在することを観察することも可能であり、そ
れらは前駆体の形で合成されて、カリクレイン型のプロ
テアーゼが関与する成熟過程を経た後に活性となる。こ
のカリクレイン型のプロテアーゼの幾つかのものもま
た、アンドロゲンの制御の下にSMGにおいて合成され
る。
ラットのSMGにおいてアンドロゲンにより制御される
遺伝子の特性指摘を行う試みにおいて、本発明者らはこ
の組織のmRNAの試験管内翻訳生成物の電気泳動の輪郭の
分析を行った。
遺伝子の特性指摘を行う試みにおいて、本発明者らはこ
の組織のmRNAの試験管内翻訳生成物の電気泳動の輪郭の
分析を行った。
雄のラットの顎下腺に特異なmRNAが分離された。この
mRNAは、SMR1と称するポリペプチドに対応している。こ
のポリペプチドは、生理活性を有する成熟生成物を与え
る。本発明は主としてこれらのペプチドと、その他の同
様の特性を有するペプチドに関するものである。
mRNAは、SMR1と称するポリペプチドに対応している。こ
のポリペプチドは、生理活性を有する成熟生成物を与え
る。本発明は主としてこれらのペプチドと、その他の同
様の特性を有するペプチドに関するものである。
しかして本発明の主題は次式： Ｘ−His−Asn−Pro−Ｙ Ｉ のペプチドであり、式中Ｘはグルタミン酸（Gln）又は
ピログルタミン酸（pyro−Glu）残基を示し、Ｙは水酸
基又は塩基性アミノ酸残基を示す。
ピログルタミン酸（pyro−Glu）残基を示し、Ｙは水酸
基又は塩基性アミノ酸残基を示す。
塩基性アミノ酸は、リシン又はアルギニンでありう
る。
る。
より詳しく言えば、本発明の主題は次式： Gln−His−Asn−Pro II pyro−Glu−His−Asn−Pro III Gln−His−Asn−Pro−Arg IV pyro−Glu−His−Asn−Pro−Arg Ｖ Gln−His−Asn−Pro−Lys VI pyro−Glu−His−Asn−Pro−Lys VII のペプチドである。
本発明の別の主題は、式II、III、IV及びＶの成熟生
成物を与えるポリペプチドSMR1である。このポリペプチ
ドは、次式： に対応している。
成物を与えるポリペプチドSMR1である。このポリペプチ
ドは、次式： に対応している。
本発明の別の主題は、本発明によるペプチド及びポリ
ペプチドに対して指向されるモノクローナル及びポリク
ローナル抗体である。
ペプチドに対して指向されるモノクローナル及びポリク
ローナル抗体である。
本発明の別の主題は、ペプチドＩからVII及び本発明
によるポリペプチドに対して指向されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマである。
によるポリペプチドに対して指向されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマである。
本発明の別の主題は、本発明によるモノクローナル及
びポリクローナル抗体を用いることを含む、組織及び生
物学的溶液中における本発明によるペプチド及びポリペ
プチドの分析及び検出方法である。
びポリクローナル抗体を用いることを含む、組織及び生
物学的溶液中における本発明によるペプチド及びポリペ
プチドの分析及び検出方法である。
この目的のためにはとくに、放射性同位体によって標
識されたペプチドと、このペプチドと分析すべきペプチ
ドとの間の競合を用いるRIAタイプの方法を使用するこ
とが可能である（ニズヴェンダー（Niswender G.D.）
ら;Proc.Soc.Exp.Biol.128,807,1968）。また、例えば
支持体に結合されたペプチドと、このペプチドと分析す
べきペプチドとの間において、このペプチドに対して調
製された抗体についての競合を用いるELISAタイプの方
法を使用することも可能である。支持体に結合されたペ
プチドによって結合された抗体は、これに対する抗体に
よって検出され、酵素にリンクされる（アブロミアス
（Avromeas J.）及びグイルバート（Guilbert B）によ
って導出された方法、C.R.Acad.Sci.Paris 1971,273,23
05）。
識されたペプチドと、このペプチドと分析すべきペプチ
ドとの間の競合を用いるRIAタイプの方法を使用するこ
とが可能である（ニズヴェンダー（Niswender G.D.）
ら;Proc.Soc.Exp.Biol.128,807,1968）。また、例えば
支持体に結合されたペプチドと、このペプチドと分析す
べきペプチドとの間において、このペプチドに対して調
製された抗体についての競合を用いるELISAタイプの方
法を使用することも可能である。支持体に結合されたペ
プチドによって結合された抗体は、これに対する抗体に
よって検出され、酵素にリンクされる（アブロミアス
（Avromeas J.）及びグイルバート（Guilbert B）によ
って導出された方法、C.R.Acad.Sci.Paris 1971,273,23
05）。
本発明によるペプチドは、包含すべき異なるアミノ酸
残基を連続的にカップリングすることによって（液相で
はＮ末端からＣ末端に向けて、また固相ではＣ末端から
Ｎ末端に向けて）液相又は固相におけるペプチド合成に
より標準的な手法で調製でき、そのＮ末端及び反応性の
側鎖は標準的なグルーピングによって予めブロックされ
る。
残基を連続的にカップリングすることによって（液相で
はＮ末端からＣ末端に向けて、また固相ではＣ末端から
Ｎ末端に向けて）液相又は固相におけるペプチド合成に
より標準的な手法で調製でき、そのＮ末端及び反応性の
側鎖は標準的なグルーピングによって予めブロックされ
る。
固相でのこの合成については特に、メリフィールド
（Merrifield）による「固相ペプチド合成」（J.Am.Che
m.Soc.,85,2149−2154）と題する論文に記載の技術を用
いることが可能である。
（Merrifield）による「固相ペプチド合成」（J.Am.Che
m.Soc.,85,2149−2154）と題する論文に記載の技術を用
いることが可能である。
メリフィールド法に従ってペプチド鎖を生成するため
には、ペプチド鎖の最初のＣ末端アミノ酸が結合する非
常に多孔質の重合体樹脂を使用することが必須である。
このアミノ酸はそのカルボニル基を媒介として樹脂に結
合し、そのアミン官能基は例えばｔ−ブトキシカルボニ
ル基によって保護される。
には、ペプチド鎖の最初のＣ末端アミノ酸が結合する非
常に多孔質の重合体樹脂を使用することが必須である。
このアミノ酸はそのカルボニル基を媒介として樹脂に結
合し、そのアミン官能基は例えばｔ−ブトキシカルボニ
ル基によって保護される。
この最初のＣ末端アミノ酸がかくして樹脂に結合され
たならば、この樹脂を酸で洗うことによってアミン官能
基から保護基が外される。アミン官能基の保護基がｔ−
ブトキシカルボニル基である場合には、それは樹脂をト
リフルオロ酢酸を用いて処理することによって外され
る。
たならば、この樹脂を酸で洗うことによってアミン官能
基から保護基が外される。アミン官能基の保護基がｔ−
ブトキシカルボニル基である場合には、それは樹脂をト
リフルオロ酢酸を用いて処理することによって外され
る。
次いで所望とする配列の二つめの残基を提供する第二
のアミノ酸が、樹脂に結合された最初のＣ末端アミノ酸
の脱保護されたアミン官能基にカップリングされる。好
ましくは、この第二のアミノ酸のカルボニル官能基は例
えばジシクロヘキシルカルボジイミドによって活性化さ
れ、アミン官能基は例えばｔ−ブトキシカルボニル基に
よって保護される。
のアミノ酸が、樹脂に結合された最初のＣ末端アミノ酸
の脱保護されたアミン官能基にカップリングされる。好
ましくは、この第二のアミノ酸のカルボニル官能基は例
えばジシクロヘキシルカルボジイミドによって活性化さ
れ、アミン官能基は例えばｔ−ブトキシカルボニル基に
よって保護される。
このようにして、所望とするペプチド鎖の最初の部分
が得られるが、これは二つのアミノ酸と、保護されてい
る末端アミン官能基を含むものである。前と同じように
してアミン官能基は脱保護され、そして次いで、第二の
Ｃ末端アミノ酸の付加についてと同様の条件の下に第三
の残基を付けるよう処理することが可能である。
が得られるが、これは二つのアミノ酸と、保護されてい
る末端アミン官能基を含むものである。前と同じように
してアミン官能基は脱保護され、そして次いで、第二の
Ｃ末端アミノ酸の付加についてと同様の条件の下に第三
の残基を付けるよう処理することが可能である。
このようにして、ペプチド鎖を構成するアミノ酸は、
樹脂に担持され既に形成されたペプチド鎖の一部の、そ
れぞれの時点で予め脱保護されたアミン官能基に次から
次へと付けられる。
樹脂に担持され既に形成されたペプチド鎖の一部の、そ
れぞれの時点で予め脱保護されたアミン官能基に次から
次へと付けられる。
所望とするペプチド鎖の全体が形成されたならば、ペ
プチド鎖を構成している各種のアミノ酸から保護基が外
され、このペプチドは例えばフッ化水素によって樹脂か
ら切り離される。
プチド鎖を構成している各種のアミノ酸から保護基が外
され、このペプチドは例えばフッ化水素によって樹脂か
ら切り離される。
かくして得られたペプチドは、例べばカラムクロマト
グラフィーによって精製されうる。
グラフィーによって精製されうる。
SMR1ペプチド又はこのペプチドの誘導体はまた、遺伝
子工学の技術を借りて得ることもできる。またそれら
は、例えば脳下垂体から産生されるヒトの成長ホルモン
の精製について使用されるのに類似のクロマトグラフィ
ー又は沈降技術によって、生物学的材料からの精製によ
って得ることも可能である。
子工学の技術を借りて得ることもできる。またそれら
は、例えば脳下垂体から産生されるヒトの成長ホルモン
の精製について使用されるのに類似のクロマトグラフィ
ー又は沈降技術によって、生物学的材料からの精製によ
って得ることも可能である。
モノクローナル及びポリクローナル血清は、標準的な
技術によって調製することができる。この目的で、テト
ラペプチド又はペンタペプチド、或いはこれらのペプチ
ドの多重結合誘導体をKLH（キーホールリンペットヘモ
シアニン）、オボアルブミン、牛血清アルブミンその他
の如き免疫原に、グルタルアルデヒドの如きカップリン
グ剤によって結合することができる。SMR1タンパク質及
びこのタンパク質の誘導体（このタンパク質から誘導さ
れたペプチド、或いはプロテインＡの如き別のタンパク
質にリンクされたSMR1の一部又は全部を含むハイブリッ
ドタンパク質）はまた、直接に注射することも可能であ
る。
技術によって調製することができる。この目的で、テト
ラペプチド又はペンタペプチド、或いはこれらのペプチ
ドの多重結合誘導体をKLH（キーホールリンペットヘモ
シアニン）、オボアルブミン、牛血清アルブミンその他
の如き免疫原に、グルタルアルデヒドの如きカップリン
グ剤によって結合することができる。SMR1タンパク質及
びこのタンパク質の誘導体（このタンパク質から誘導さ
れたペプチド、或いはプロテインＡの如き別のタンパク
質にリンクされたSMR1の一部又は全部を含むハイブリッ
ドタンパク質）はまた、直接に注射することも可能であ
る。
免疫化は標準的な手法で行うことができる。例えばウ
サギ及びマウスでは、３週間の間隔を置いて３回から４
回、フロイントのアジュバントの存在下にカップリング
生成物をこれらの動物にたとえば100マイクログラム注
射することによって行われる。かくしてウサギでポリク
ローナル血清を得ることが可能となる。
サギ及びマウスでは、３週間の間隔を置いて３回から４
回、フロイントのアジュバントの存在下にカップリング
生成物をこれらの動物にたとえば100マイクログラム注
射することによって行われる。かくしてウサギでポリク
ローナル血清を得ることが可能となる。
ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体は、標準的な
手順によって得ることができる。
手順によって得ることができる。
SMR1ポリペプチドに対応するmRNAの分離、並びにポリ
ペプチドの特性及び成熟生成物については、以下により
詳しく説明する。
ペプチドの特性及び成熟生成物については、以下により
詳しく説明する。
１）材料及び方法 動物及びホルモン処理 10週齢の雄と雌のウィスター（Wistar）ラットをIffa
−Credoから入手した。去勢によってアンドロゲンを除
去し、10日後に35mgのテストステロン（プロピオン酸テ
ストステロンリタード、Roussel）をここに示したケー
スについて腹腔内経由で注射した。ここに示したケース
について、同量のテストステロンを雌のラットに投与し
た。８週齢のDBA/2及び「スイス」マウスをパスツール
研究所から入手した。
−Credoから入手した。去勢によってアンドロゲンを除
去し、10日後に35mgのテストステロン（プロピオン酸テ
ストステロンリタード、Roussel）をここに示したケー
スについて腹腔内経由で注射した。ここに示したケース
について、同量のテストステロンを雌のラットに投与し
た。８週齢のDBA/2及び「スイス」マウスをパスツール
研究所から入手した。
RNAの抽出及び試験管内翻訳 RNAはラット及びマウスの組織から、文献（トロニッ
ク（Tronik D.）ら、1987,EMBO J.6,983−987）記載の
ようにして調製した。RNAの試験管内翻訳は、mRNA依存
性網状赤血球の存在下で、mRNA依存性翻訳システムを溶
解質として用いて行った（ペルハム（Pelham H.RB）
ら、1976,Eur.J.Biochem.67,247−256）。生成物は、ポ
リアクリルアミド−ドデシル硫酸ナトリウムの変性ゲル
を用いて電気泳動により分析した。
ク（Tronik D.）ら、1987,EMBO J.6,983−987）記載の
ようにして調製した。RNAの試験管内翻訳は、mRNA依存
性網状赤血球の存在下で、mRNA依存性翻訳システムを溶
解質として用いて行った（ペルハム（Pelham H.RB）
ら、1976,Eur.J.Biochem.67,247−256）。生成物は、ポ
リアクリルアミド−ドデシル硫酸ナトリウムの変性ゲル
を用いて電気泳動により分析した。
SMR1についてのcDNAコードのクローニング及び特性指摘 雄のウィスターラットのSMGから得たポリ（Ａ）RNAを
リバーストランスクリプターゼの基質として用い、アマ
ーシャム（Amersham）のDNA合成システムにより、この
製造業者により供給されるプロトコルを用いて二重鎖cD
NAを得た。次いでこの二重鎖cDNAを、オリゴ−ｄ（Ｃ）
末端法（マニアティス（Maniatis,T.）ら「分子クロー
ニング」（1982）、研究所マニュアル（ニューヨーク州
コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハー
バー研究所）pp.241−242）によってpUC9のPst I位置に
挿入した。宿主細菌（DH1から誘導した細菌株DH 5−１
であり高い効率で形質転換を生ずる。HanatianのDNAク
ローニングvol.1,p.111参照）を形質転換し、そのコロ
ニーを後に記載するプローブを用いてハイブリッド形成
により分離した。要約して言うと、雄及び雌のSMGから
導出したmRNAを５−20％のショ糖密度勾配で分離した。
低分子量のmRNAの富む分画（試験管内翻訳によって、SM
R1に対するmRNAコードを含むことが示される）をエタノ
ールで沈降し、32Pで放射性標識されたdGTP及びdCTPの
存在下で、それらをリバーストランスクリプターゼの基
質として用いた。約3000の組み換え体が、雄及び雌のラ
ットのSMGから得られた放射性標識されたcDNAを備え
て、重複標本でもってフィルタ上に分離された。選択さ
れたクローンは、雄のcDNAプローブと強いハイブリッド
形成を示したが、雌のプローブとは非常に弱いハイブリ
ッド形成を示していた。組み換えクローンは、無細胞系
におけるDNA−mRNAハイブリッド形成によるmRNAの翻訳
阻害実験により同定された（ペイターソン（Paterson）
ら（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,4370−4374）。
リバーストランスクリプターゼの基質として用い、アマ
ーシャム（Amersham）のDNA合成システムにより、この
製造業者により供給されるプロトコルを用いて二重鎖cD
NAを得た。次いでこの二重鎖cDNAを、オリゴ−ｄ（Ｃ）
末端法（マニアティス（Maniatis,T.）ら「分子クロー
ニング」（1982）、研究所マニュアル（ニューヨーク州
コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハー
バー研究所）pp.241−242）によってpUC9のPst I位置に
挿入した。宿主細菌（DH1から誘導した細菌株DH 5−１
であり高い効率で形質転換を生ずる。HanatianのDNAク
ローニングvol.1,p.111参照）を形質転換し、そのコロ
ニーを後に記載するプローブを用いてハイブリッド形成
により分離した。要約して言うと、雄及び雌のSMGから
導出したmRNAを５−20％のショ糖密度勾配で分離した。
低分子量のmRNAの富む分画（試験管内翻訳によって、SM
R1に対するmRNAコードを含むことが示される）をエタノ
ールで沈降し、32Pで放射性標識されたdGTP及びdCTPの
存在下で、それらをリバーストランスクリプターゼの基
質として用いた。約3000の組み換え体が、雄及び雌のラ
ットのSMGから得られた放射性標識されたcDNAを備え
て、重複標本でもってフィルタ上に分離された。選択さ
れたクローンは、雄のcDNAプローブと強いハイブリッド
形成を示したが、雌のプローブとは非常に弱いハイブリ
ッド形成を示していた。組み換えクローンは、無細胞系
におけるDNA−mRNAハイブリッド形成によるmRNAの翻訳
阻害実験により同定された（ペイターソン（Paterson）
ら（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,4370−4374）。
SMR1についてのcDNAコードの配列決定 種々の制限酵素の助けを借りて、SMR1についてのcDNA
コードを切断し、得られた断片をM13 mp9ベクターでサ
ブクローン化した。このDNAの配列決定は、ジデオキシ
リボヌクレオシドを用いるターミネーター法（サンガー
（Sanger,F.）ら、（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
4,5463−5467）によって行った。
コードを切断し、得られた断片をM13 mp9ベクターでサ
ブクローン化した。このDNAの配列決定は、ジデオキシ
リボヌクレオシドを用いるターミネーター法（サンガー
（Sanger,F.）ら、（1977）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7
4,5463−5467）によって行った。
２）結果 ラット及びマウスのSMGから調製されたmRNAの試験管内
翻訳の分析 雄及び雌のマウス又は雄又は雌のラットのSMGから得
た全部のRNAのうち５μｇを、35S−メチオニンの存在下
で網状赤血球の無細胞系において翻訳した。試験管内翻
訳の生成物を12.5％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィ
ーで分析した。
翻訳の分析 雄及び雌のマウス又は雄又は雌のラットのSMGから得
た全部のRNAのうち５μｇを、35S−メチオニンの存在下
で網状赤血球の無細胞系において翻訳した。試験管内翻
訳の生成物を12.5％のドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動し、オートラジオグラフィ
ーで分析した。
雄及び雌のラットのSMGから調製したRNAの試験管内翻
訳生成物を比較すると、幾つかのポリペプチド（見掛け
上の分子量が18,000、19,000、35,000及び46,000）が雌
のラットよりも雄のラットの方に多量に存在することが
示された。これらのデータは、ラットのSMGに性的な二
形性があることを示している。
訳生成物を比較すると、幾つかのポリペプチド（見掛け
上の分子量が18,000、19,000、35,000及び46,000）が雌
のラットよりも雄のラットの方に多量に存在することが
示された。これらのデータは、ラットのSMGに性的な二
形性があることを示している。
さらに、これらの翻訳生成物をマウスのSMGから導出
されたRNAから得られたものと比較すると、これらの二
つの種においては殆どの主要なポリペプチドが異なって
いることが示された。特に、マウスにおいても伴性的な
相違が観察されうるが、これらのものはラットにおける
ように同じポリペプチドに関連してはいなかった。逆
に、ラットにおいて観察された雄に特異な翻訳生成物
は、マウスでは存在しないようである。
されたRNAから得られたものと比較すると、これらの二
つの種においては殆どの主要なポリペプチドが異なって
いることが示された。特に、マウスにおいても伴性的な
相違が観察されうるが、これらのものはラットにおける
ように同じポリペプチドに関連してはいなかった。逆
に、ラットにおいて観察された雄に特異な翻訳生成物
は、マウスでは存在しないようである。
雄のラットに特異なmRNAに対する相補的なcDNAの分離及
び配列 ラットのSMGから雄に特異なmRNAを分離するために、
ラットの組織から調製したcDNAのバンクをpUC9において
構成した。本明細書の「材料及び方法」の節に記載した
如き分離スクリーニング方法を用いることにより、組み
換えクローンを分離した。陽性クローンは、無細胞系に
おけるDNA−mRNAハイブリッド形成によるmRNAの翻訳阻
害実験により特徴付けした。組み換えcDNAの一つの種類
は、19,000ドルトンの見掛け上の分子量を有するポリペ
プチドの試験管内合成を抑制した。このポリペプチドが
SMR1として示されるものであり、雄のラットからのRNA
の試験管内翻訳生成物中には存在するが、雌からのもの
には存在していない。これに対応するcDNAを、ニトロセ
ルロース膜への転写によるRNAハイブリッド形成実験に
おけるプローブとして使用した。このハイブリッド形成
については、 0.5Mのリン酸ナトリウム、pH7.2 ７％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS） 1mMのエチレンジアミン四酢酸 １％のウシ血清アルブミン 音波処理したサケの精子DNA:100mg/ml を含有する溶液が用いられた。
び配列 ラットのSMGから雄に特異なmRNAを分離するために、
ラットの組織から調製したcDNAのバンクをpUC9において
構成した。本明細書の「材料及び方法」の節に記載した
如き分離スクリーニング方法を用いることにより、組み
換えクローンを分離した。陽性クローンは、無細胞系に
おけるDNA−mRNAハイブリッド形成によるmRNAの翻訳阻
害実験により特徴付けした。組み換えcDNAの一つの種類
は、19,000ドルトンの見掛け上の分子量を有するポリペ
プチドの試験管内合成を抑制した。このポリペプチドが
SMR1として示されるものであり、雄のラットからのRNA
の試験管内翻訳生成物中には存在するが、雌からのもの
には存在していない。これに対応するcDNAを、ニトロセ
ルロース膜への転写によるRNAハイブリッド形成実験に
おけるプローブとして使用した。このハイブリッド形成
については、 0.5Mのリン酸ナトリウム、pH7.2 ７％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS） 1mMのエチレンジアミン四酢酸 １％のウシ血清アルブミン 音波処理したサケの精子DNA:100mg/ml を含有する溶液が用いられた。
40mMのリン酸ナトリウム、pH7.2 １％のSDS 1mMのエチレンジアミン四酢酸 を含有する溶液で、65℃で１回につき10分間の洗浄を４
回行った。
回行った。
このcDNAは、雄のラットのSMG中に大量に存在する700
ヌクレオシドの長さを有するmRNAとハイブリッド形成さ
れた。この挿入されたcDNAエレメントはより詳しく特徴
付けされている。
ヌクレオシドの長さを有するmRNAとハイブリッド形成さ
れた。この挿入されたcDNAエレメントはより詳しく特徴
付けされている。
SMR1についてのcDNAコードの配列、及び導出されるタ
ンパク質の配列は以下に示される。
ンパク質の配列は以下に示される。
挿入されたcDNAは、ポリ（Ａ）断片を除くと652ヌク
レオシドの長さを有する。この配列は、510ヌクレオシ
ドの読み取り枠を含んでいる。開始コドンとして機能す
ることのできる唯一のATGは、cDNAのクローンの５′末
端から73ヌクレオシド下流に位置している。３′末端の
未翻訳領域（142ヌクレオシドの長さ）は、ポリ（Ａ）
尾部から23ヌクレオシド上流にあるポリアデニル化の一
致（consensus）信号（AATAAA）を含んでいる（ヌクレ
オシド625−630）。翻訳の終結コドンは別のAATAAA配列
（512−517）において見出されるが、これは明らかにポ
リアデニル化信号として認識されるものではない。
レオシドの長さを有する。この配列は、510ヌクレオシ
ドの読み取り枠を含んでいる。開始コドンとして機能す
ることのできる唯一のATGは、cDNAのクローンの５′末
端から73ヌクレオシド下流に位置している。３′末端の
未翻訳領域（142ヌクレオシドの長さ）は、ポリ（Ａ）
尾部から23ヌクレオシド上流にあるポリアデニル化の一
致（consensus）信号（AATAAA）を含んでいる（ヌクレ
オシド625−630）。翻訳の終結コドンは別のAATAAA配列
（512−517）において見出されるが、これは明らかにポ
リアデニル化信号として認識されるものではない。
これに対応するタンパク質は146アミノ酸の長さを有
し、これは約16,000ドルトンの分子量に相当する。この
分子量は、電気泳動移動度から求められる試験管内翻訳
生成物の分子量（19,000ドルトン）よりも僅かに少な
い。配列の分析から計算される分子量と、電気泳動移動
度から求められる分子量の間のこのような相違は、既に
ラット又はマウスのSMGの他のタンパク質について記載
されている。
し、これは約16,000ドルトンの分子量に相当する。この
分子量は、電気泳動移動度から求められる試験管内翻訳
生成物の分子量（19,000ドルトン）よりも僅かに少な
い。配列の分析から計算される分子量と、電気泳動移動
度から求められる分子量の間のこのような相違は、既に
ラット又はマウスのSMGの他のタンパク質について記載
されている。
SMR1は比較的大きなグルタミン及びプロリン残基含量
を有しているが、しかし繰り返し領域は含んでいない。
従ってこれは、SMGの必須タンパク質である「プロリン
に富む」又は「グルタミンに富む」ポリペプチドの種類
には属していない。さらに、mRNAの配列はその５′末端
に、この種類に特徴的な80ヌクレオシドの配列を含んで
いない。しかしながら、これらのタンパク質と同様に、
SMR1は（そのシグナルペプチドにあるものを除いて）シ
スティン又はメチオニン残基を含んでいない。
を有しているが、しかし繰り返し領域は含んでいない。
従ってこれは、SMGの必須タンパク質である「プロリン
に富む」又は「グルタミンに富む」ポリペプチドの種類
には属していない。さらに、mRNAの配列はその５′末端
に、この種類に特徴的な80ヌクレオシドの配列を含んで
いない。しかしながら、これらのタンパク質と同様に、
SMR1は（そのシグナルペプチドにあるものを除いて）シ
スティン又はメチオニン残基を含んでいない。
SMR1のアミノ末端部分は非常に疎水性であり、これは
殆どの分泌タンパク質のシグナルペプチドに特徴的なこ
とである。成熟タンパク質のアミノ末端配列は直接には
決定されていないが、フォン・ヘイン（G.Von Heijne）
によって行われた統計的分析（Nucleic Acids Res.14,4
683−4690,1986）（「−3,−１」則）によれば、シグナ
ルペプチドの切断個所は18と19の残基の間に位置してい
ることが想定できる。
殆どの分泌タンパク質のシグナルペプチドに特徴的なこ
とである。成熟タンパク質のアミノ末端配列は直接には
決定されていないが、フォン・ヘイン（G.Von Heijne）
によって行われた統計的分析（Nucleic Acids Res.14,4
683−4690,1986）（「−3,−１」則）によれば、シグナ
ルペプチドの切断個所は18と19の残基の間に位置してい
ることが想定できる。
タンパク質SMR1はまた、糖タンパク質に特有のある種
の特徴を示す。Ｎにリンクされた二つの潜在的なグリコ
シル化部位の存在が、139と136の位置に観察される。こ
のタンパク質は、プロリン（12％）、トレオニン（12
％）及びグルタミン（9.5％）に比較的富んでいる。か
くしてＯにリンクされた幾つかのグリコシル化部位が、
SMR1のカルボキシ末端断片に存在しうるが、これはプロ
リン及びトレオニン残基に富んだ領域が一般に、ムコタ
ンパク質やシアロ糖タンパク質の如く非常に０−グリコ
シル化されたタンパク質中に存在するからである。
の特徴を示す。Ｎにリンクされた二つの潜在的なグリコ
シル化部位の存在が、139と136の位置に観察される。こ
のタンパク質は、プロリン（12％）、トレオニン（12
％）及びグルタミン（9.5％）に比較的富んでいる。か
くしてＯにリンクされた幾つかのグリコシル化部位が、
SMR1のカルボキシ末端断片に存在しうるが、これはプロ
リン及びトレオニン残基に富んだ領域が一般に、ムコタ
ンパク質やシアロ糖タンパク質の如く非常に０−グリコ
シル化されたタンパク質中に存在するからである。
興味を引く特徴は、27−28及び33−34の位置における
一対の塩基性アミノ酸Arg−Argの存在である。このよう
なジペプチドは、成熟酵素による切断の潜在的な部位を
示している（ラジュア（Lazure,C.）ら、（1983）Can.
J.Biochem.,Cell Biol.61,501−515及びドチャティ（Do
cherty,K.）ら、（1982）Ann.Rev.Physiol.44,625−63
8）。これらはテトラペプチドGln−His−Asn−Proの側
面に位置している。このテトラペプチド及びこれに隣接
する配列は親水性環境に位置しており、この領域を何ら
かの成熟酵素によりアクセス可能なものとしている。
一対の塩基性アミノ酸Arg−Argの存在である。このよう
なジペプチドは、成熟酵素による切断の潜在的な部位を
示している（ラジュア（Lazure,C.）ら、（1983）Can.
J.Biochem.,Cell Biol.61,501−515及びドチャティ（Do
cherty,K.）ら、（1982）Ann.Rev.Physiol.44,625−63
8）。これらはテトラペプチドGln−His−Asn−Proの側
面に位置している。このテトラペプチド及びこれに隣接
する配列は親水性環境に位置しており、この領域を何ら
かの成熟酵素によりアクセス可能なものとしている。
成熟酵素によるArg−Arg連鎖の切断に続いて、塩基性
残基の除去をカルボキシペプチダーゼＥにより（フリッ
カー（Fricker,L.D）ら、（1983）J.Biol.Chem.258,109
50−10955）また恐らくはアミノペプチダーゼにより
（ロー（Loh,Y.P.）ら、（1984）Ann.Rev.Neurosci.7,1
89−222）行うことによって、テトラペプチド（Gln−Hi
s−Asn−Pro）とペンタペプチド（Gln−His−Asn−Pro
−Arg）の混合物が生成されるが、これは「Pro−Arg」
がカルボキシペプチダーゼＥにとって良い基質ではない
からである。翻訳後の他の修飾にはまた、これらの生成
物のピログルタミン酸誘導体の形成を含みうるものであ
り、その場合pyroGlu−His−Asn−Pro−ArgとpyroGlu−
His−Asn−Proの混合物が生成される。これらの構造
は、チロリベリン（TRH）の構造を思い起こさせる。
残基の除去をカルボキシペプチダーゼＥにより（フリッ
カー（Fricker,L.D）ら、（1983）J.Biol.Chem.258,109
50−10955）また恐らくはアミノペプチダーゼにより
（ロー（Loh,Y.P.）ら、（1984）Ann.Rev.Neurosci.7,1
89−222）行うことによって、テトラペプチド（Gln−Hi
s−Asn−Pro）とペンタペプチド（Gln−His−Asn−Pro
−Arg）の混合物が生成されるが、これは「Pro−Arg」
がカルボキシペプチダーゼＥにとって良い基質ではない
からである。翻訳後の他の修飾にはまた、これらの生成
物のピログルタミン酸誘導体の形成を含みうるものであ
り、その場合pyroGlu−His−Asn−Pro−ArgとpyroGlu−
His−Asn−Proの混合物が生成される。これらの構造
は、チロリベリン（TRH）の構造を思い起こさせる。
ラットのSMG中のSMR1についてのmRNAコードのアンドロ
ゲンによる蓄積の調節 ラットのSMG中のSMR1についてのmRNAコードのアンド
ロゲンによる蓄積の調節を調べるために、ポリ（Ａ）配
列を含むmRNAを、成体の雄、20日前に去勢した雄、アン
ドロゲン処理を受けた去勢した雄、雌、及びアンドロゲ
ンで処理した雌のSMGから調製した。雄のラット、テス
トステロンで処理した雌のラット、去勢した雄のラッ
ト、テストステロンで処理した去勢した雄のラット、及
び雌のラットから得た合計で１μｇのRNAを1.4％のアガ
ロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動させ、これら
のRNAをナイロン膜に転写してSMR1についてのcDNAプロ
ーブコードとハイブリッド形成した。オートラジオグラ
フィーでの露光時間は２時間であった。これらのmRNAを
固体支持体へと転写することにより得られた、32Pで標
識されたSMR1プローブを用いてのRNA分析の結果を図面
（Ａの部分）に示す。SMR1についてのmRNAコードの蓄積
におけるかなりの相違が、雄のラットのSMG及び雌のそ
れについて観察される。
ゲンによる蓄積の調節 ラットのSMG中のSMR1についてのmRNAコードのアンド
ロゲンによる蓄積の調節を調べるために、ポリ（Ａ）配
列を含むmRNAを、成体の雄、20日前に去勢した雄、アン
ドロゲン処理を受けた去勢した雄、雌、及びアンドロゲ
ンで処理した雌のSMGから調製した。雄のラット、テス
トステロンで処理した雌のラット、去勢した雄のラッ
ト、テストステロンで処理した去勢した雄のラット、及
び雌のラットから得た合計で１μｇのRNAを1.4％のアガ
ロース−ホルムアルデヒドゲルで電気泳動させ、これら
のRNAをナイロン膜に転写してSMR1についてのcDNAプロ
ーブコードとハイブリッド形成した。オートラジオグラ
フィーでの露光時間は２時間であった。これらのmRNAを
固体支持体へと転写することにより得られた、32Pで標
識されたSMR1プローブを用いてのRNA分析の結果を図面
（Ａの部分）に示す。SMR1についてのmRNAコードの蓄積
におけるかなりの相違が、雄のラットのSMG及び雌のそ
れについて観察される。
さらに、雄のラットと雌のラットのSMGから得た種々
の量（図面に示す）のRNAを２％のアガロース−ホルム
アルデヒドゲルで電気泳動し、それらをフィルターに転
写して、SMR1についてのcDNAプローブコードとハイブリ
ッド形成した。このフィルムは30時間露光した。Ｂの部
分で明らかなように、SMR1についてのmRNAコードは雄の
ウィスターラットのSMGにおいて非常に大量に蓄積して
いる。なぜならRNAの合計が最低でも1.5ngの量であれ
ば、ハイブリッド形成信号をもたらすのに十分だからで
ある。逆に、雌のウィスターラットのSMGにおけるSMR1
についてのmRNAコードの蓄積レベルは、雄のそれよりも
約1000から3000倍も少なかった。
の量（図面に示す）のRNAを２％のアガロース−ホルム
アルデヒドゲルで電気泳動し、それらをフィルターに転
写して、SMR1についてのcDNAプローブコードとハイブリ
ッド形成した。このフィルムは30時間露光した。Ｂの部
分で明らかなように、SMR1についてのmRNAコードは雄の
ウィスターラットのSMGにおいて非常に大量に蓄積して
いる。なぜならRNAの合計が最低でも1.5ngの量であれ
ば、ハイブリッド形成信号をもたらすのに十分だからで
ある。逆に、雌のウィスターラットのSMGにおけるSMR1
についてのmRNAコードの蓄積レベルは、雄のそれよりも
約1000から3000倍も少なかった。
去勢した雄では、SMR1についてのmRNAコードの量は10
から20倍も減少した。これらの雄にテストステロンを投
与すると、SMR1についてのmRNAコードの量は去勢してい
ない雄について観察されるものと同じ値に回復した。さ
らにまた、成体の雄のラットにテストステロンを投与す
ると、SMR1についてのmRNAコードの蓄積は雄について観
察されるものと同程度の量で生じた。
から20倍も減少した。これらの雄にテストステロンを投
与すると、SMR1についてのmRNAコードの量は去勢してい
ない雄について観察されるものと同じ値に回復した。さ
らにまた、成体の雄のラットにテストステロンを投与す
ると、SMR1についてのmRNAコードの蓄積は雄について観
察されるものと同程度の量で生じた。
SMR1についてのmRNAコードの顕著な性質は、アンドロ
ゲンでの処理に応じてラットのSMG中に高度に蓄積する
ことである。このことは、SMR1がSMGのGCT細胞において
合成されることを強く示唆している（ちょうどEGF、NGF
及びレニン、並びにマウスのSMG中のアンドロゲンの制
御下にある他のタンパク質と同様に）。さらにまた、雄
と雌におけるSMR1についてのmRNAコードの蓄積レベルの
相違は、標的器官（腎臓、肝臓、SMG）中で抗原によっ
て制御される他の遺伝子について通常観察されるものに
比較して、非常に大きい（1000倍以上も大きい）。
ゲンでの処理に応じてラットのSMG中に高度に蓄積する
ことである。このことは、SMR1がSMGのGCT細胞において
合成されることを強く示唆している（ちょうどEGF、NGF
及びレニン、並びにマウスのSMG中のアンドロゲンの制
御下にある他のタンパク質と同様に）。さらにまた、雄
と雌におけるSMR1についてのmRNAコードの蓄積レベルの
相違は、標的器官（腎臓、肝臓、SMG）中で抗原によっ
て制御される他の遺伝子について通常観察されるものに
比較して、非常に大きい（1000倍以上も大きい）。
以上の結果、また特にアンドロゲンによるSMR1遺伝子
の高度な誘導は、SMR1がラットの雄について特異な重要
な機能を満足するであろうことを示唆している。SMR1
は、雄のラットにおける行動特性を制御している分子
（前述のテトラ又はペンタペプチド、或いはSMR1のＣ末
端部分）の前駆体であろう。
の高度な誘導は、SMR1がラットの雄について特異な重要
な機能を満足するであろうことを示唆している。SMR1
は、雄のラットにおける行動特性を制御している分子
（前述のテトラ又はペンタペプチド、或いはSMR1のＣ末
端部分）の前駆体であろう。
本発明において記述された生成物は、治療目的で、又
は研究用試薬として使用することができる。
は研究用試薬として使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 39/395 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 Ｃ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 セイダ，ナビル カナダ国ケベック・エイチ・３イー・１ ケー７，モントリオール・コロット・ラ イル‐デ‐セール・277 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 5/10 C07K 7/06 C07K 14/47 C07K 16/18 C12P 21/00 - 21/08 C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/00 - 5/28 G01N 33/53 G01N 33/577 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (13)
- 【請求項１】式:X−His−Asn−Pro−Ｙ Ｉ で表され、式中Ｘはグルタミン酸又はピログルタミン酸
残基を示し、Ｙは水酸基又は塩基性アミノ酸残基を示す
ペプチド。 - 【請求項２】Ｙがリシン又はアルギニン残基である、請
求項１のペプチド。 - 【請求項３】式:Gln−His−Asn−Pro II のペプチド。
- 【請求項４】式:pyro−Glu−His−Asn−Pro III のペプチド。
- 【請求項５】式:Gln−His−Asn−Pro−Arg IV のペプチド。
- 【請求項６】式:pyro−Glu−His−Asn−Pro−Arg Ｖ のペプチド。
- 【請求項７】式:Gln−His−Asn−Pro−Lys VI のペプチド。
- 【請求項８】式:pyro−Glu−His−Asn−Pro−Lys VII のペプチド。
- 【請求項９】式VIII: のポリペプチド。
- 【請求項１０】請求項１から９の何れか一つのペプチド
又はポリペプチドに対して向けられるモノクローナル及
びポリクローナル抗体。 - 【請求項１１】請求項10によるモノクローナル抗体を産
生することを特徴とするハイブリドーマ。 - 【請求項１２】請求項１から９の何れか一つによるペプ
チドに対して向けられる抗体を使用することからなる、
前記ペプチドの分析又は検出方法。 - 【請求項１３】抗体がモノクローナル抗体である請求項
12による分析又は検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8813353A FR2637600B1 (fr) | 1988-10-11 | 1988-10-11 | Peptides et polypeptides provenant de la glande sous maxillaire du rat, anticorps monoclonaux et polyclonaux correspondants, hybridomes correspondants et applications de ces produits au diagnostic, a la detection ou a des fins therapeutiques |
| FR88/13353 | 1988-10-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03501738A JPH03501738A (ja) | 1991-04-18 |
| JP2980334B2 true JP2980334B2 (ja) | 1999-11-22 |
Family
ID=9370902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1511369A Expired - Lifetime JP2980334B2 (ja) | 1988-10-11 | 1989-10-11 | ラットの顎下腺から導出したペプチド及びポリペプチド、対応するポリクローナル及びモノクローナル抗体、対応するハイブリドーマ並びに診断、検出及び治療目的でのこれらの生成物の使用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5859189A (ja) |
| EP (1) | EP0394424B1 (ja) |
| JP (1) | JP2980334B2 (ja) |
| AT (1) | ATE131829T1 (ja) |
| DE (1) | DE68925199T2 (ja) |
| FR (1) | FR2637600B1 (ja) |
| WO (1) | WO1990003981A1 (ja) |
Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| US6589750B2 (en) * | 1997-02-20 | 2003-07-08 | Institut Pasteur | Therapeutic use of the SMR1 protein, the SMR1 maturation products, specifically the QHNPR pentapeptide as well as its biologically active derivatives |
| DK1185294T3 (da) * | 1999-06-23 | 2005-08-01 | Centre Nat Rech Scient | Peptider til behandling af svækkede interpersonelle og adfærdsmæssige lidelser |
| ES2390075T3 (es) | 2004-03-19 | 2012-11-06 | Institut Pasteur | Péptidos derivados de la proteína BPLP humana, polinucleótidos que codifican dichos péptidos y anticuerpos dirigidos contra dichos péptidos |
| US7190757B2 (en) * | 2004-05-21 | 2007-03-13 | Analogic Corporation | Method of and system for computing effective atomic number images in multi-energy computed tomography |
| US7136450B2 (en) * | 2004-05-26 | 2006-11-14 | Analogic Corporation | Method of and system for adaptive scatter correction in multi-energy computed tomography |
| US7415147B2 (en) * | 2004-06-04 | 2008-08-19 | Analogic Corporation | Method of and system for destreaking the photoelectric image in multi-energy computed tomography |
| US7327853B2 (en) * | 2004-06-09 | 2008-02-05 | Analogic Corporation | Method of and system for extracting 3D bag images from continuously reconstructed 2D image slices in computed tomography |
| US7302083B2 (en) * | 2004-07-01 | 2007-11-27 | Analogic Corporation | Method of and system for sharp object detection using computed tomography images |
| US7224763B2 (en) * | 2004-07-27 | 2007-05-29 | Analogic Corporation | Method of and system for X-ray spectral correction in multi-energy computed tomography |
| US7388983B2 (en) * | 2004-08-18 | 2008-06-17 | Analogic Corporation | Method of and system for detecting anomalies in projection images generated by computed tomography scanners |
| US7136451B2 (en) * | 2004-10-05 | 2006-11-14 | Analogic Corporation | Method of and system for stabilizing high voltage power supply voltages in multi-energy computed tomography |
| US8009883B2 (en) * | 2007-02-09 | 2011-08-30 | Analogic Corporation | Method of and system for automatic object display of volumetric computed tomography images for fast on-screen threat resolution |
| US7724866B2 (en) * | 2007-06-27 | 2010-05-25 | Analogic Corporation | Method of and system for variable pitch computed tomography scanning for baggage screening |
| EP2265937A1 (en) | 2008-03-27 | 2010-12-29 | Analogic Corporation | Method of and system for three-dimensional workstation for security and medical applications |
| JP5788788B2 (ja) * | 2008-04-07 | 2015-10-07 | アンスティテュ パストゥールＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ | エンケファリンを分解するエクトペプチダーゼを強力に阻害するオピオルフィンペプチド誘導体 |
| FR2931362B1 (fr) | 2008-05-26 | 2017-08-18 | Pasteur Institut | L'opiorphine pour une utilisation en tant que psychostimulant. |
| CA2645452A1 (en) * | 2008-11-28 | 2010-05-28 | Institut Pasteur | Use of basic prolin-rich lacrimal gene products, such as opiorphin, as a biomarker |
Family Cites Families (9)
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