JPH09509044A

JPH09509044A - 脳由来膜関連ｃｒｆ結合タンパク質

Info

Publication number: JPH09509044A
Application number: JP7513885A
Authority: JP
Inventors: ドミニクピーベーハン; ワイリーダブリュージュニアヴェイル; ヴォルフガンクハーフィッシャー; フィリップジェイローリー
Original assignee: University of Reading
Current assignee: University of Reading
Priority date: 1993-11-08
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 1997-09-16
Also published as: WO1995013372A1; US5587462A; AU1048895A; US5910428A; EP0728201A1; CA2175373A1; AU691216B2

Abstract

(57)【要約】単離された実質的に純粋な哺乳類脳由来膜関連CRF結合タンパク質及びその生物活性フラグメントが提供されるだけでなく、CRF結合タンパク質もしくはその生物活性フラグメントまたは別の哺乳類種の同族体をコードする単離され、精製されたＤＮＡフラグメントが提供される。受容体活性化を調節するのに有効な量のこのようなCRF結合タンパク質またはそのフラグメントを投与することにより、(a)脳及び神経系、(b)ACTH、βエンドルフィン及びコルチゾルの産生に特別な下垂体、(c)炎症の部位、(d)胎盤、(e)副腎、(f)生殖腺または(g)胃腸道に対するCRFの作用を調節することが可能である。そのタンパク質のＮ末端フラグメントの投与はCRFに対する結合部位密度を増大し、こうして生体内のその生物効果を調節する。

Description

【発明の詳細な説明】脳由来膜関連CRF結合タンパク質本発明は国立健康協会により授与された補助DK-26741及びHD-13527のもとに政府の支持によりなされた。政府は本発明に或る種の権利を有する。また、英国のリーディング大学及び医療研究カウンセルが財政面で本発明に貢献した。本発明は一般に哺乳類中のコルチコトロピン放出因子(CRF)の生物効果の調節に関するものであり、更に特別には脳中の細胞表面で発現され、かつCRFに対する高アフィニティーを有するCRF結合タンパク質(CRF-BP)に関する。発明の背景ストレスは実際の、または認知された脅迫または挑戦を受けた生物に課せられた要求である。生体恒常状態を維持するために、生物は一連のホルモン応答、自律応答及び挙動応答を増大し、これらの幾つかが最もストレスのある状況、例えば、下垂体の副腎軸及び交感神経系の活性化並びに挙動の覚醒に共通している。大部分のストレス応答は下垂体のACTHの分泌及び生合成を刺激して、増大された副腎グルココルチコイド産生をもたらす41残基の視床下部ペプチドであるコルチコトロピン放出因子(CRF)により調節される。このプロセスは負のフィードバックループにより調節され、それによりグルココルチコイドがCRF産生を抑制する。この視床下部下垂体副腎(HPA)軸中のその役割に基いて最初に単離され、特性決定されたが、CRFは中枢神経系内だけでなく、神経外組織、例えば、副腎及び睾丸中に広く分布されていることがわかり、そこでそれはまたパラクリン調節物質または神経伝達物質として作用し得る。更に、感情の障害、例えば、鬱病及び拒食症、並びに生殖及び免疫応答の調節におけるCRFの関与は、CRF発現の変化が重要な生理学的結果を有し得ることを示唆する。例えば、HPA軸を含む調節ループの乱れは循環しているグルココルチコイドの慢性的に上昇されたレベルをしばしば生じる。このような患者は、神経幹の肥満、筋肉消耗、及び低下された受胎率を含む、クッシング症候群の身体的特徴を示す。クッシング症候群の殆どの症例は下垂体またはそれ程頻繁ではないが非内分泌性組織のACTH産生腫瘍により引き起こされる。副腎腫瘍または異所性副腎組織はその障害の発生の10〜30％の原因であるが、下垂体依存性形態とは対照的に、血漿ACTHレベルは上昇されない。クッシング症候群の幾人かの患者は異所性CRF分泌腫瘍を有すると報告されており、CRFが下垂体ACTH産生を慢性的に誘導し、順に、グルココルチコイド放出を慢性的に誘導し得るという提案をもたらした。CRFの過剰の産生が下垂体肥厚を引起し、ミクロアデノーマ形成及び過度のACTH産生をもたらし得ることが示唆されていた。その下垂体肥厚は幾つかのCRF分泌腫瘍を伴い、この提案と合致する。こうして、CRFは人体中の種々のペプチドの合成及び分泌の非常に強力な刺激物質である。ラット及びヒトの種は同じCRF分子(r/h CRFまたはhCRF)を有し、これは米国特許第4,489,163号明細書に示される構造を有する41残基ペプチドである。ヒツジCRF(oCRF)が最初に特性決定され、その41残基構造が米国特許第4,415 ,558号明細書に示されている。ヒト末梢循環器系中のCRFレベルは通常低いが、母系循環器中ではしばしば上昇されたレベルのCRFがあり、そのレベルは妊娠中に次第に増加する。妊娠の症例、例えば、妊娠誘導高血圧及び早期陣痛における次第に増加する濃度のCRFは正常な妊娠中に見られる濃度よりも実質的にかなり上昇されることが知られていた(Campbellら，J.Clin.Endocr.＆Metab.，64:1054-1059，1987)。この母系血漿CRFは、おそらくそれがパラクリン役割を果たす胎盤に由来するものと考えられる。胎盤細胞はCRFに応答し、CRF及びそのｍＲＮＡを産生することが示された。妊娠後期の母系血漿中で測定されたCRF濃度はラット視床下部の門脈血液中の報告されたレベル（そのレベルはin vitro ACTH放出を刺激することができる）と同様であるとしても、妊娠中のACTHの過剰産生が通常あることは明らかではない。しかしながら、母系血漿ACTH濃度は妊娠の進行につれてわずかに増加する。幾人かの研究者らは放射性ヨウ素化CRFによる分子架橋を使用して脳細胞、下垂体細胞及びAtT-20細胞中の推定のヒツジCRF結合タンパク質及び受容体を同定し、これらは分子量が40〜70kDの範囲である。架橋CRFの分子量（約５kD）を引いた後に、下垂体中に見られる主タンパク質形態は70kDであることが報告された (Nishimuraら，J.Biol.Chem.，262，12893(1987))。約50kDの低分子量タンパク質が主要な脳形態であると報告された（Grigoriadisら，Endocrinology，125,30 68-3077(1989)）。これらのタンパク質のサイズの不均一性はおそらく異なるグリコシル化のためであると考えられた。何となれば、Ｎ−グリカナーゼ処理後に、約40〜46kDの唯一の架橋種が脳及び下垂体の両方中で観察されたからである。また、CRFを生物学的に不活化することができるヒト血漿中のタンパク質に関する報告があった。Linton,E.A.ら，Clin.Endo．28，315-324（1988）及びBehan ,D.P.ら，J.Endo．122，23-31（1989）を参照のこと。その後者の論文は約50％以下の純度であったことが今測定された単離物を生じた部分精製方法を開示している。その単離タンパク質の精製が最終的に達成され、そして純粋な化合物の配列決定がこのタンパク質をコードするＤＮＡをクローン化するのに充分なアミノ酸配列情報を与え、これが今ヒト血清hCRF結合タンパク質(hCRF-BP)［配列番号６］と称される（E.Potterら，Nature，349，423-426(1/31/91)）。このタンパク質物質の役割は妊娠中の不適当な下垂体−副腎の刺激の防止であることが提案されており、そして組換えラット及びヒト血清CRF-BPが今COS細胞中で発現された。それらは、CRFの作用を治療上調節できるように、高アフィニティーで41残基CRFに結合することがわかった。 CRF受容体を単離しようと試みて、幾つかの追加の予備研究が行われていた。G rigoriadis及びDeSouza，J.Biol.Chem.，263，10927-10931(1988)及びGrigo-ria disらの上記の文献は、脳CRF受容体の分子量がヒツジCRFのMWより小さく、約58k Dであると推測した。しかしながら、彼らの特性決定は、受容体と非常に多数のその他のタンパク質を含む粗抽出物中に存在する¹²⁵I-CRFとの間の化学架橋により生成された共有結合複合体のSDS-PAGE分析によるこのタンパク質の分子量の推定に制限されていた。彼らはCRF受容体に関する更に明確な情報を公表しておらず、こうして他人が受容体構造を決定し、または利用することを可能にしていなかった。哺乳類の脳中のシナプス膜CRF結合部位は、CRF-BP遺伝子発現の主要な部位を含む嗅球を含む幾つかの感知モダリティに主要なリレーに不可欠である。哺乳類の脳中の膜関連CRF受容体の存在は、とりわけ、コルチコトロピン産生及び中枢神経系の細胞間の連絡の調節のために存在するCRFペプチドの免疫検出をマスクする重要な細胞グループ中の結合タンパク質の存在により実証される。この分野における現在の研究は、膜関連脳CRF-BPの発現が如何にしてストレス及びコルチコステロイドの影響により調節されるのかを測定することを目的とする。 CRFに結合する脳由来膜関連タンパク質の構造及び生物学的特徴を研究し、そしてまたCRF刺激に対する種々の細胞集団の応答においてこれらの結合タンパク質により果たされる役割を研究するため、またはそれらを治療、アフィニティーカラム中の成分として、診断もしくはアッセイに有効に使用するために、結合タンパク質の均一な組成物が必要とされる。このような組成物は培養細胞により発現される可溶化タンパク質の精製により理論上利用可能である。しかしながら、検出可能なレベルのCRF受容体を発現することが知られている細胞系においてさえも、全細胞タンパク質の非常に微量の成分のようなものが存在する。それ故、このような膜関連CRF結合タンパク質の性質及び構造が確かめられ、その結果、これらのタンパク質がそれらを薬剤設計のための化合物のスクリーニング、組織結合部位に関する競合によるCRF受容体のトランスアクチベーションの調節による治療、アフィニティーカラム及びその他の適当な目的に利用されることを可能にするのに充分な量で提供されることが望ましい。発明の要約幾つかの膜関連CRF-BPタンパク質がヒツジの脳から今単離され、特性決定された。それらは固相マトリックスに固定されたhCRFに結合する能力を示す。約33kD 及び約35kDの分子量のタンパク質が得られた。夫々が¹²⁵I放射能標識ヒトCRF及びヒツジCRFに結合し、所望により、二官能性架橋剤、例えば、ジスクシンイミジルスベレートを使用してそれらに架橋し得る。33kD CRF-BP及び35kD CRF-BPは互いに複合体形成することがわかる。その複合体は、それらに対し産生される抗体を使用するアッセイにおいて同定されるように、35kDタンパク質のＮ末端部分を介するものである。35kDヒツジ脳由来膜関連CRF-BPの生物活性の天然産タンパク質分解産物がまた33kD CRF-BPとの複合体形成に活性であり、かつ上記の33 kD/35kDタンパク質複合体の生体内解離を生じるのに活性である35kDタンパク質のＮ末端フラグメントとして同定された。hCRF-BP(配列番号６)のＮ末端フラグメントが同様に生物活性であり、膜関連CRF-BPの複合体の解離を生じる。また、オルタナチブ遺伝子スプライシングの結果であると考えられる中間部アミノ酸配列の欠失を有する、35kDヒツジタンパク質及び33kDヒツジタンパク質の生物活性 CRF結合タンパク質カウンターパートが同定された。本発明は、特に、CRFと複合体形成し、それにより拮抗会合により哺乳類中のC RF作用を調節するのに使用でき、そしてまた更に有効な類縁体及び薬剤の設計に使用し得る、ヒト同族体を含む、哺乳類の脳由来膜関連CRF結合タンパク質を提供する。また、本発明のペプチドは、CRF受容体に対するそれらの相対的なアフィニティーを測定するための競合結合アッセイ等において化合物をスクリーニングするのに有益である。これらのペプチドはまた生物学的試料からのCRFの精製のためのアフィニティーカラムマトリックスへのカップリングに有益である。Ｎ末端フラグメントが同様にCRF-BPの精製及びアッセイに有益である。好ましい実施態様の詳細な説明 CRFは本明細書に記載された膜関連結合タンパク質と組み合わせて機能する原形質膜受容体タンパク質によるACTHの生合成及び分泌並びにβ−エンドルフィン様免疫活性(β-END-LI)を刺激する。本明細書に開示されたタンパク質として、ヒツジの脳から単離されたものが挙げられるが、これらに限定されない。生物活性類縁体は、そのアミノ酸が一旦知られると、当業者により容易につくられる。特にことわらない限り、本明細書に使用されるあらゆる技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に現れる種々のアミノ酸配列で生じるアミノ酸は、それらの公知の３文字略号または１文字略号に従って同定される。種々のＤＮＡフラグメント中で生じるヌクレオチドは、当業界で日常使用される通常の１文字表示で表示される。同族体という用語は、例えば、アミノ酸(AA)レベルまたはヌクレオチドレベルの配列中の員間の一致を示すその通常かつ公知の意味で使用される。この出願の目的のために、相同は少なくとも約70％の一致を有することを意味し、実質的に相同は少なくとも約80％の一致を有することを意味し、また高度に相同は少なくとも約90％または好ましくは約95％以上の一致を有することを意味する。ポリペプチド及びペプチドは隣接残基のα−アミノ基とα−カルボキシ基の間のペプチド結合により互いに連結されたアミノ酸残基の直線状の系列を表示する。ポリペプチドという用語はペプチドと若干互換可能に使用されるが、特に限定されない限り、一般に本明細書に記載されたタンパク質を含むのにまた使用される。 “類縁体”という用語は、一つ以上の残基が機能上同様の残基で保存的に置換され、かつ本明細書に記載されたようなCRF-BPを模擬する能力を示す本明細書に詳しく示された配列と実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するあらゆるポリペプチドを含む。保存的置換の例として、一つの非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、ロイシンまたはメチオニンのその他の残基への置換；一つの極性（親水性）残基のその他の残基への置換、例えば、アルギニンのリシンへの置換、グルタミンのアスパラギンへの置換、スレオニンのセリンへの置換；一つの塩基性残基、例えば、リシン、アルギニンまたはヒスチジンのその他の残基への置換；及び、一つの酸性残基、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸のその他の残基への置換が挙げられる。また、“保存的置換”は、このようなポリペプチドが必要な結合活性を示すことを条件として、非誘導体化残基に代えて化学誘導体化残基の使用を含む。 “化学誘導体”は官能性側鎖基の反応により化学誘導体化された一つ以上の残基を有する主題ポリペプチドを表す。このような誘導体体化された分子として、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を生成した分子が挙げられる。遊離カルボキシル基が誘導体化されて塩、メチルエステル基及びエチルエステル基もしくはその他の型のエステルまたはヒドラジドを生成してもよい。遊離ヒドロキシル基が誘導体化されてＯ− アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を生成してもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素が誘導体化されてＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを生成してもよい。また、化学誘導体として、20の標準アミノ酸の一種以上の天然産アミノ酸誘導体を含むペプチドが挙げられる。例えば、４−ヒドロキシプロリンがプロリンに代えて置換されてもよく、５−ヒドロキシリシンがリシンに代えて置換されてもよく、３−メチルヒスチジンがヒスチジンに代えて置換されてもよく、ホモセリンがセリンに代えて置換されてもよく、またオルニチンがリシンに代えて置換されてもよい。また、本発明のポリペプチドとして、必要な生物活性が維持される限り、配列が本明細書に示されるポリペプチドの配列に対して残基の一つ以上の付加及び／または欠失を有するあらゆるポリペプチドが挙げられる。本明細書に使用される“医薬上許される”、“生理学上寛容される”、及びこれらの文法上の変化は、それらが組成物、担体、希釈剤及び試薬を表す際に、互換可能に使用され、そしてこれらの物質が悪心、目眩、胃の不調等の如き望ましくない生理学的作用を生じないで哺乳類に投与することができることを表す。本明細書に使用される“同族体”という用語は、微々たる変化を発生したが、実質的に同じ方法で同じ生物学的機能を果たす異種哺乳類種からの類似のタンパク質、ペプチド及びＤＮＡを表す。本明細書に使用される“生物活性フラグメント”という用語は、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその両方；または相当するＤＮＡコード領域の5'末端もしくは 3'末端、またはその両方に関してトランケートされた開示されたタンパク質またはペプチドのフラグメントを表し、これらのフラグメントは実質的に同じ機能もしくは直接関係する機能を果たし、または前駆体と実質的に同じ機能もしくは直接関係する機能を果たすペプチドをコードする。本明細書に使用される“哺乳類中のCRF受容体のトランスアクチベーションの調節またはCRFの作用の調節”は、脳由来CRF-BPタンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは同族体を含む治療有効量の生理学上寛容される組成物を投与してCRFと複合体形成し、かつ／または前記CRF-BP/CRF-BP複合体そしておそらく35kDタンパク質間の複合体を解離し、それにより内在性CRFとの直接または誘導された拮抗（競合）会合により哺乳類中のCRF作用を調節し、こうしてCRFの周囲の生体内濃度を低下することを含む。ヒツジ及びラットの脳細胞の洗剤溶液から得られたCRF結合タンパク質がCRF結合活性を完全に保持して単離された。これらの結合タンパク質分子を得るために、哺乳類の脳が適当に均一にされ、処理され、抽出され、そして単離されたCR F-BPが特性決定された。実施例Ｉに以下に詳しく記載されるように、単離当たり３つのヒツジの脳のグループを処理することが都合がよい。 33kD及び35kDのヒツジのCRF-BPが実施例Ｉに記載されたようにしてヒツジから精製され、そして個々に試験された。実施例Ｉに示されたようにしてCRF-BPリガンドイムノラジオメトリックアッセイ(LIRMA)を使用して、CRF結合タンパク質様免疫反応性がこれらの２つのバンド中で検出された。CRFに対するそれらのアフィニティーを実証するために、単離された脳のヒツジCRF-BPタンパク質が、二官能性架橋剤としてジスクシンイミジルスベレートを使用して、oCRFまたはhCRFに夫々架橋される。夫々が¹²⁵I放射能標識hCRF及びoCRFに結合することがわかる。これらの単離されたタンパク質を更に特性決定するために、当業界で公知のような結合アッセイ実験がまた精製膜関連CRF-BPタンパク質を用いて行われて、それらがCRFに結合するアフィニティーを測定する。これらのアッセイの結果が解離定数Ｋ_Dに関して表され、これは存在するするCRF-BPの半分がCRFに結合され、即ち、CRFと複合体形成される平衡点における遊離CRFの濃度の逆数に等しい。換言すれば、結合タンパク質が高アフィニティーを有し、CRFに強く結合する場合、低CRF濃度は合計量の結合タンパク質分子の半分を飽和するであろう。一般に、約５以下の解離定数は強いアフィニティーの指標であると考えられ、また約６〜 14のＫ_Dは中間アフィニティーの指標である。33kD分子はＫ_D=0.25±0.2ナノモルを有する強いアフィニティーでhCRFを結合する。33kDタンパク質のＮ末端伸長変種である35kD膜関連タンパク質はＫ_D=7.5±2.5nMを有する。それ故、33kDタンパク質よりわずかに短い膜関連結合タンパク質はまた同様の強い結合アフィニティーを有するものと考えられる。更に、単離されたヒツジCRF-BPは約１μMの濃度で冷CRFと特異的に競合することがわかり、これらのタンパク質は実際に41残基C RF分子と選択的に複合体形成していることを示す。中間アフィニティー、例えば、約６〜約15ナノモルでCRFに結合する膜関連CRF -BPを含む、これらの膜関連CRF-BPは細胞標識受容体へのCRFの送出を促進するのに特に有益であり、この場合、その生物活性が達成される。これらの単離されたヒツジ脳結合タンパク質の両方がCRFに結合するので、それらの間でＮ末端中間体を有する結合タンパク質は一般に同様の結合アフィニティーを示すことが明らかである。更に、残基の一つまたは配列の脱離による33kDタンパク質のＮ末端から更に短くされた結合タンパク質はまた中間の結合アフィニティーを示すものと考えられる。以下に詳しく説明されるように、35kDタンパク質は一連の異なる実験操作後に配列番号１に示された295 AA配列を有することがわかった。Ｎ末端エドマン分解が、SDS-PAGE及びPUDF膜への電気移動後に単離されたタンパク質の夫々を気相配列分析に適用することにより二つの単離された脳ヒツジCR F-BPにつき個々に行われた。35kDバンドのＮ末端配列分析はＮ末端アミノ酸(AA) 配列：Glu-Ala-Val-Asp-His-Asp-Ser-Phe-Pro-His-Leu-Ala-Gly-Gly-Ala-Ser（配列番号１の残基1-16）を含むタンパク質を明らかにした。Ｎ末端配列分析は33 kDバンドがＮ末端アミノ酸(AA)配列： Glu-Leu-Glu-Gly-Glu-Pro-Leu-Tyr-Arg-Arg-Ala-Leu-Arg-Cys-Val-Asp-Met-Leu( 配列番号１の残基20-37)を含むタンパク質を含むことを明らかにした。これらの精製タンパク質のトリプシン消化、続いてトリプシンフラグメントの精製がまた行われた。33kDタンパク質の精製されたトリプシンフラグメントの全部に相当するフラグメントが35kDタンパク質のトリプシンフラグメントの中にあった。次いでこれらのトリプシンフラグメントのＮ末端配列分析が行われて、以下のＮ末端AA配列の同定をもたらした。 Cys残基の存在は、得られた実験情報の全体から演繹された。多数の品配列の同定による33kD及び35kD脳由来ヒツジCRF-BPの精製及び特性決定後に、別個の推定されたＤＮＡコード領域に関する合成5'センス及び3'アンチセンスオリゴヌクレオチドが使用されてヒツジｃＤＮＡ（ヒツジ脳ｍＲＮＡから誘導された）からのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりヒツジCRF-BP遺伝子フラグメントをクローン化した。552塩基対及び441塩基対(bp)の二つのヒツジCRF-BP cDNAコード領域クローンが夫々配列番号３及び配列番号４として本明細書に示されるように得られる。加えて、標識CRF-BP cDNAコード領域がその後分子ハイブリダイゼーションプローブとして使用されて、ヒツジ脳ｍＲＮＡからつくられたλZap(商標)(ストラタゲン、ラジョラ、CA)ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子セグメントを得た。そのプローブはヒツジ脳ｃＤＮＡライブラリー中で678 bpヒツジCRF-BP部分遺伝子ｃＤＮＡセグメント（配列番号５）を同定するのに成功した。エドマン分解Ｎ末端配列分析、PCRクローン化ｃＤＮＡコード領域、及び部分ｃＤＮＡコード領域からの相当するアミノ酸配列のその後の比較は35kDヒツジCR F-BP（配列番号１）及び33kDヒツジCRF-BP（配列番号１の残基20-295）の複合アミノ酸配列を生じる。二つのPCRクローン化セグメントの比較により、35kDヒツジCRF-BPに相当する37AA残基の欠失を有するタンパク質（配列番号２）そしてまた33kDヒツジCRF-BPに相当するタンパク質（配列番号２の残基20-258）があることが演繹される。また、35kDヒツジCRF-BPの生物活性Ｎ末端の18または19AA残基のタンパク質分解開裂産物（配列番号１の残基1-18または1-19）が演繹される。ヒトの脳中に約33kD及び約35kDのヒト膜関連CRF-BPタンパク質があり、これらはヒツジCRF-BPと相同性であり、またラットの脳中でも同様である。脳からの35kDヒツジタンパク質はＣ末端部分可溶性ヒト血清CRF-BP（配列番号６）と共通の或る配列を有し、これが今組換えにより発現された。その成熟ヒト血清CRF-BPは配列番号６中のcys³⁶とCys⁵⁷、Cys⁸⁰とCys¹¹⁷、Cys¹⁵⁹とCys¹⁸¹、c ys²¹³とcys²⁴⁰、及びcys²⁵³とcys²⁹⁴の間の夫々にその分子中に直線状に配置された５つのジスルフィドブリッジを含むことが測定された。同様の結合パターンがヒツジ精製タンパク質中に存在するものと考えられる。37AA欠失を有するヒツジ脳由来CRF-BPにおいて、少なくとも一つのシステイン−システイン潜在性ループが欠いており、これがこのようなCRF-BPの三次構造を単離された35kDヒツジ脳タンパク質の三次構造及びヒトCRF-BPの分泌血清形態と実質的に異ならせる。更に、可溶性血清CRF-BPタンパク質の構造からの脳由来CRF-BPのＮ末端の領域における非常にかなりの構造上の相違は、神経膜とのそれらの会合及び脳中のそれらの機能に寄与するものと考えられる。 cDNA PCRクローン（配列番号４）及び複合アミノ酸配列（配列番号２）により示されるヒツジCRF-BP mRNA内部欠失はオルタネートｍＲＮＡスプライシングの結果であると考えられる。これが二次構造中の第一ジスルフィドループの損失をもたらし、そして本明細書に開示されたようなCRF-BPの多様性を示す。 19アミノ酸Ｎ末端ドメインを欠いている33kD脳由来ヒツジCRF-BPは生体内のヒツジ脳由来膜関連CRF-BPの70％に相当し、そして上記されたように高アフィニティーでCRFを結合する。また、この33kD膜関連CRF-BPは35kD膜関連CRF-BPと物理的に複合体形成することが実証され、そしてこの複合体形成はそれに特異的である抗体を使用して行われたアッセイの結果として更に大きい生物分子の19残基Ｎ末端を介するものと考えられる。生体内のこのような33kD/35kD CRF-BP複合体または同様の35kD/35kD複合体の生物学的存在中に、両方の複合体形成されたCRF-B Pの高アフィニティーCRF結合部位が利用可能ではなく、またはかなり小さい結合アフィニティーのものである。これがシナプス部位を自由に結合する周囲CRF中の生体内の相対的な増加をもたらす。更に、35kD CRF-BPの19残基Ｎ末端タンパク質分解開裂産物は生物活性であり、33kD/35kD CRF-BP複合体を解離し、こうして高アフィニティーCRF結合部位を自由にし、その結果、シナプス受容体を結合するのに利用可能なCRFのレベルを低下する。それ故、このペプチドは脳中で利用可能なCRFのレベルを低下するその能力の点で治療上有益と考えられる。このペプチドの同族体変種はヒトを含むその他の哺乳類種中に存在し、この場合、配列番号６のＮ末端配列、例えば、残基1-21は同様の生物学的機能を与えるものと考えられる。また、35kDヒツジ脳由来膜関連CRF-BPの18残基Ｎ末端及び19残基Ｎ末端（配列番号１の残基1-18及び1-19）は化学誘導体、類縁体及び複雑な医薬化合物の設計に医療上有益である。化合物のこの記載されたファミリーはCRFの活性を特定の臓器の付近に誘導するのに使用し得るものと考えられる。ペプチド／化合物は、例えば、局所炎症の治療において貴重な治療薬を与えるものと医療上認められる。完全長ｃＤＮＡヒツジCRF-BP遺伝子セグメントがその後ヒツジ脳ｃＤＮＡライブラリーからクローン化され、それから、35kDタンパク質が29残基リーダー配列で転写されることが演繹される。天然産CRF-BPタンパク質は通常の哺乳類の膜の微量成分のみを構成し、また存在するその他の天然タンパク質に対し、非常に不純な形態でのみ存在する。関係する作用、生物学的試料の制限された利用可能性及び哺乳類の脳中の比較的低い濃度のために、CRF-BPを天然源から精製により調製することは非実用的であるであろう。それ故、脳由来膜CRF-BPは、勿論、本明細書に開示されたような天然タンパク質の完全なアミノ酸構造を知ることを伴うタンパク質及び／または類縁体の組換えＤＮＡ生産が可能にされない限り、臨床上の使用または類似の医薬化合物の包括的な設計に実際に利用できない。 CRF-BPポリペプチドフラグメントは、組換えＤＮＡ技術を含む、ポリペプチド分野の当業者に知られている技術のいずれかにより合成し得る。また、合成化学技術、例えば、固相メリフィールド型合成が、純度、抗原特異性、望ましくない副生物を含まないこと、生産の容易さ等の理由のためにポリペプチドフラグメントを生産するのに好ましい。例えば、組換えＤＮＡ技術は、天然CRF-BPが存在する比率に較べて、細胞物質及び／またはその分泌中に、全タンパク質に対してかなり高い比率で異種タンパク質を産生する生物または細胞系を生じるのに使用し得る。ヒツジCRF-BPだけでなく、その他の哺乳類CRF-BPをコードする合成遺伝子の構築、ひいてはこれらのタンパク質の組換え発現が本明細書に開示されたアミノ酸配列により実施可能にされる。このような合成の組換えCRF-BPタンパク質が単離される出発物質はタンパク質汚染物質を実質的に含まず、かつ実質的に大きな濃度の異種タンパク質を有する培地からのものであるので、利用可能な精製技術は更に高度に精製された CRF-BP製剤を比較的多量にかなり簡単に生産し得る。例えば、CHO細胞中のアミノ酸配列配列番号１に相当する合成ＤＮＡコード領域の発現は、通常の技術を使用して行われて295残基グリコシル化タンパク質を生産し得る。例示の組換え生産が実施例IVに記載される。その結果、治療の方法は組換えタンパク質及びそれらの有効な類縁体の投与により行い得る。有利に使用されるタンパク質及びペプチドの例として、35kDヒツジCRF-BP（配列番号１）、33kDヒツジCRF-BP（配列番号１の残基20-295）、37アミノ酸が欠失されたこれらの２種のタンパク質（配列番号２及び配列番号２の残基20-258）、成熟35kDタンパク質（配列番号１）のＮ末端フラグメント、例えば、残基1-18または1-19（Gluで開始し、LysまたはArg で終止する）、及び成熟ヒト血清タンパク質のＮ末端フラグメント（例えば、配列番号６の残基1-21）が挙げられる。医薬組成物は通常の医薬上許される担体と一緒にペプチドを通常含むであろう。治療のために、医薬組成物を生成するための医薬上許される担体と組み合わされた、実質的に純粋な単離されたCRF-BPもしくは合成CRF-BPまたはこれらの無毒性塩が、静脈内(iv)、皮下、筋肉内、経皮、例えば、鼻内、または大脳室内にヒトを含む哺乳類に非経口投与されることが好ましい。経口投与が適当な担体を用いて可能である。本発明のあらゆるポリペプチドは医薬上許される塩の形態で使用されてもよい。本発明のポリペプチドと塩を生成できる好適な酸として、無機酸及び有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素塩、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸等が挙げられる。本発明のペプチドと塩を生成できる好適な塩基として、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等、並びに有機塩基、例えば、モノ−、ジ−、及びトリ−アルキル及び−アリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン等）及び必要により置換されていてもよいエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、等）が挙げられる。本発明の治療組成物は、活性成分としてその中に溶解または分散された、本明細書に記載された脳由来CRF-BPタンパク質、ヒト同族体、ポリペプチドフラグメントまたは生物活性類縁体と一緒に生理学上寛容される担体を含むことが望ましいことがある。好ましい実施態様において、治療組成物は治療目的で哺乳類またはヒト患者に投与される時に免疫原性ではない。その中に溶解または分散された活性成分を含む医薬組成物の調製は当業界で良く理解されている。典型的には、このような組成物は液体溶液または懸濁液として注射液のように調製される。しかしながら、使用前の液体中の溶液、または懸濁液に適した固体形態がまた調製し得る。また、その製剤は乳化し得る。活性成分は、医薬上許され、かつ活性成分と適合性であり、かつ本明細書に記載された治療方法における使用に適した量の賦形剤と混合し得る。好適な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びこれらの組み合わせである。加えて、所望により、組成物は活性成分の有効性を増進する少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤等を含むことができる。本発明の治療組成物はその中に成分の医薬上許される塩を含むことができ、その塩が先に記載された。生理学上寛容される担体は当業界で公知である。液体担体の例示は、活性成分及び水の他に物質を含まず、または緩衝剤、例えば、生理pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水またはその両方、例えば、食塩加リン酸緩衝液を含む無菌水溶液である。更に、水性担体は一種より多い緩衝塩だけでなく、塩化ナトリウム及び塩化カリウムの如き塩、デキストロース、ポリエチレングリコール及びその他の溶質を含むことができる。また、液体組成物は水に加えて、また水を除いて液相を含むことができる。このような付加的な液相の例はグリセリン、植物油、例えば、綿実油、及び水−油エマルションである。これらのCRF-BPまたはその或る種のポリペプチドフラグメントの投与は、過剰のCRFにより生じた哺乳類中の高ACTHレベル（これが本明細書中“CRF誘発ACTH放出”と称される）を減少するのに有効である。このようにして、CRF-BPは高コルチゾール血症、クッション病、アルコール中毒、神経性食欲不振及び同様の疾患と関連する高コルチゾル（即ち、グルココルチコイド）レベルを治療するのに有効である。CRF-BPタンパク質及びそのフラグメントはまた妊娠の後期中に起こる異常を治療するのに有益である。例えば、それらは妊娠誘発合併症及び増大されたCRFレベルを軽減するのに使用でき、これはそうしないとACTHの過度の放出をもたらし得る。加えて、CRF-BPタンパク質またはそのフラグメントは投与されて患者中に存在するCRF/CRF-BPの比を減少し得る。また、CRF-BPのiv投与が或る場合に使用されてもよく、血圧を調節し、それにより低血圧を治療し得る。CRF- BPタンパク質は特に食欲、生殖、成長、不安、鬱病、発熱及び代謝の調節だけでなく、血圧、心拍数及び血流の調節に関して、脳に対するCRFの作用を調節するのに有効に使用し得る。先に示されたように、短いＮ末端フラグメントがまた脳中で有益であると予想される。こうして、本発明は、本発明のCRF-BPタンパク質またはポリペプチドフラグメントを含む生理学上寛容される組成物の治療有効量を投与することを特徴とする哺乳類中のCRFの作用の調節方法を提供する。治療有効量は、患者中で所望の効果、即ち、ACTHの量を減少し、またはCRF/CRF-BPの比を減少する効果を得るのに計算された量である。必要とされる投薬量は特別な治療及び所望の治療の期間に応じて変化するであろう。体重1Kg当たり約10μg〜約１mgの非常に一般的な毎日の投薬量が現在意図されているが、タンパク質またはポリペプチドのサイズに依存し、即ち、比較的少量が短いＮ末端フラグメントにつき使用し得る。加えて、 ACTHレベルの変化が治療レジメ中に監視されて、経時の投与されたCRF-BPタンパク質またはポリペプチドフラグメントの有効性を測定し得る。患者中に存在する ACTHのレベルがルーチンの臨床分析により容易に測定でき、そしてACTHのレベルを監視するアッセイが公知である。こうして、本発明の治療方法はまたヒト患者中のACTHレベルを減少する方法を提供する。精製され、単離された膜関連CRF-BPまたは組換えタンパク質の製剤は生体内の CRF誘発ACTH放出を抑制するのに有利に使用される。こうして、これらのCRF-BP は治療に投与されてCRFに結合し、CRFを不活化し、それにより過剰のCRFにより生じた哺乳類中の高ACTHレベルを減少し得る。更に、それらは下垂体ACTH分泌を減少し、それ故それらが異常に高い状態のもとに、例えば、慢性のストレス中または神経性食欲不振もしくはアルコール中毒で冒された患者中でコルチゾルレベルを減少するのに使用し得る。CRF-BPは静脈内(iv)投与される時にまたCRF誘発A CTH放出を防止するのに有効であることがわかった。更に、CRF-BPのiv投与は血圧を上昇し、このようにして低血圧を治療するのに使用し得るものと考えられる。また、これらの結合タンパク質はアッセイ系中で使用されてその結合アフィニティーに関するCRFへの化学修飾の効果を監視でき、またそれらは競合結合アッセイ及びCRF受容体に対するアフィニティーを測定するのに有益なアッセイにおいて化合物をスクリーニングするのに有益である。代表的なアッセイが共有の19 93年７月23日に出願された米国特許出願第08/097,828号に開示されており、その開示が参考として本明細書に含まれる。ヒトCRFに対するそれらの高い結合アフィニティーはこれらの結合タンパク質を体液、例えば、血清中、また組織中のCR Fレベルを測定するアッセイにおける使用に特に有益にする。 CRF-BP/CRF-BP複合体の生体内解離を生じる能力の治療上有益な性質、例えば、脳由来33kD/35kDまたはおそらく33kD/N末端開裂ペプチド複合体の解離を生じる性質に関する化合物のスクリーニング方法がここで可能にされる。例えば、等モル量のヒツジ脳由来33kD CRF-BP及び35kD CRF-BPと過剰の放射能標識CRFがほぼ生理イオン性の緩衝液中で混合される。次いで、生物学的平衡に達した後に、推定の治療化合物、即ち、小ペプチド、または非ペプチド、例えば、ステロイドがその溶液に導入されて、解離が起こって、それにより35kD CRF-BPを遊離し、それをCRFに結合させるか否かを試験する。生理溶液の動的平衡に続いて、35kD CRF-BPのＮ末端に対し誘導された精製抗体が添加される。生理条件下の再度の平衡後に、第一抗体が第二接合抗体またはスタフィロコッカスプロテインＡで沈殿される。上記のＮ末端ペプチドまたは有効な薬剤候補の場合、35kD CRF-BP／標識CRF複合体がそれにより沈殿される。定量分析が行われ、そしてシンチレーションカウンティングにより比較されて推定の治療化合物の相対的な有効性を測定する。これらのCRF結合タンパク質は、固体マトリックスに結合された時にCRFを生物学的試料または水溶液からアフィニティーの一部等として単離するのに使用し得る。これらのCRF-BPの結合能力はそれらをアフィニティークロマトグラフィーに使用されてhCRFまたはCRFの同族体を精製することを可能にする。これらのCRF結合タンパク質はセファロースまたはその他の適当なアフィニティークロマトグラフィー担体にカップリングされ、そして溶液及び生物学的試料からCRF及びCRF類縁体を精製するのに使用し得る。下記の実施例は、前記に種々に参考とされ、使用された或る種の実験操作を記載する。実施例Ｉ CRFに結合する精製タンパク質を得るために、３種のヒツジ脳を、50mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、25mMのEDTA、0.1容量％のアジ化ナトリウム(SPEA)を含み、10mMの塩化マグネシウム、２mMのフェニルメチル−スルホニルフルオリド(PMSF)、2.8μg/mlのロイペプチン及び７μg/mlのアプロチニンを含む標準結合緩衝液700ml中で均一にした。ホモジネートを500mlの遠心分離バケットに分け、遠心分離機中で3000rpmで10分間回転させて核と粒状物を分離した。上澄みをデカントし、ペレットを約0.2容量％の濃度のNP-40液体洗剤の水溶液の添加そして４℃で１時間の攪拌により可溶化した。NP-40（ノニデットP-40）はフェノール１モル当たり平均９モルのエチレンオキサイドを含むオクチルフェノール−エチレンオキサイド縮合物からなる洗剤である。それはフルカ・ケミカル・コーポレーション及びシグマ・ケミカル社を含む幾つかの供給業者から入手し得る。使用したNP-40はニューヨーク、ロンコンコマ、11779にあるフルカ・ケミカ−バイオケミカから得られた純度99％以上の物質であった。次いでその混合物を４℃で15分間にわたって5000xgで再度遠心分離し、上澄みをデカントした。得られたペレットを結合緩衝液400mlの添加により再度抽出し、その混合物をNP- 40を添加しないで上記のようにして再度遠心分離した。再抽出操作を４回繰り返した。全ての得られた上澄みを溜め、次いで結合緩衝液で４Ｌの最終容積に希釈した。顆粒のアフィゲルクロマトグラフィー媒体（バイオラド）１mlを４℃の蒸留水50mlで洗浄した。次いでCRF１mgをカップリング緩衝液（これは100mMのHep-es 、pH7.4である）７mlに溶解した。アフィゲル媒体をその混合物に添加し、その容器を４℃で一夜回転させ、CRFペプチドを全容積10mlの媒体にカップリングさせた。次いでその固相を重力下に沈降させ、上澄みをデカントした。次いで固相を1Mのエタノールアミン/HCL pH8.0に暴露し、適当な容器中で25℃で１時間にわたって回転させることによりアフィゲル媒体の未反応の基をブロックした。得られたCRF-固相接合体を焼結ガラスロートに移し、そして50mMの酢酸ナトリウム／ギ酸塩／20％のアセトニトリル緩衝液、pH3.0及び100mMのHepes pH7.4を含む夫々50mlの10のバッチで連続して洗浄した。次いでCRF-固相接合体を９mlの冷却した未活性化顆粒セファロース4Bと充分に混合することにより最後に希釈し、この希薄な混合物をアフィニティークロマトグラフィー分離の第一工程の媒体として使用した。冷却した未活性化セファロース4Bによる希釈を使用しなかった以外は上記のようにして第二工程分離の媒体を調製し、その結果、顆粒アフィゲル-CRF接合体単独１mlを使用して極めて小さい容積の物質を処理した。次いでこのクロマトグラフィー媒体を抽出液とともに４℃で一夜攪拌することにより抽出液４リットルを希釈されたCRF-固相接合体10mlに暴露した。暴露後、抽出液４Ｌを粗い焼結ガラスロート600mlで濾過することにより固相を回収した。次いで固相を0.9％のNaClで焼結ガラスから洗浄して除き、バイオラド・エコノカラム(20x2.5cm）に移し、そこでそれを0.9％のNaCl約200mlで更に洗浄した。次いで結合されたタンパク質を溶離緩衝液、即ち、0.1容量％のウシ血清アルブミン(BSA)を含む、80％の50mMの酢酸ナトリウム−ギ酸塩緩衝液／20％のアセトニトリル、pH3.0 50mLで脱着した。10の５mlのフラクションをこの溶離中に連続して回収した。フラクションの夫々を、全ヒト組換え成熟タンパク質hCRF-BP(1-298)に対して産生された抗体(Ab 5144)を使用するCRF-BPリガンドイムノラジオメトリックアッセイ(LIRMA)の助けによりCRF-BP様免疫反応性につき分析した。そのアッセイは1:1000初期希釈のCRF-BP抗体5144、及び高アフィニティー放射能標識¹²⁵I-hCR Fトレース［50,000c.p.m．］を使用した。放射性ヨウ素化CRFトレース50μl［50 ,000c.p.m．／アッセイ緩衝液50μlに希釈した］を、夫々のフラクションからのアリコートを含むケイ酸塩ガラス管に添加し、続いて室温で30分間インキュベートして結合を生じさせた。次いで、例えば、アッセイ緩衝液(0.25％のB.S.A.及び10mMのMgCl₂を含むSPEA)中1:1000に希釈された50μlのCRF-BP抗体5144を夫々のガラス管に添加し、室温で更に30分間インキュベートする。所望により競合結合曲線をこの型のアッセイの一部として得るために、結合を０から10 00nMの範囲の一連の冷CRF濃度の存在下で生じさせる。次いで結合された複合体を沈殿したヒツジ抗ウサギ［SAR］第二抗体［SARI:20、１％のNRS、４％のPEG、 50mMのリン酸ナトリウム、0.1％のアジ化ナトリウムを含む混合物］200μlの添加により沈殿させ、続いて室温で30分間インキュベートする。次いで抗体結合¹² ⁵ I-CRF沈殿を４℃で20分間にわたって遠心分離［3000xg］により分離し、得られたペレットをγカウンター中でカウントする。次いで活性フラクションを溜め、pHを1Mのトリス塩基で約7.5に調節し、溶離液約15mlを得た。次いでこの溶離液を、バイオラドエコノカラム(0.7x10cm)に装填された未希釈のCRF-固相接合体で４℃で５回パーコレートした。次いで固相接合体カラムを0.9％のNaCl 40ml及び80％の50mMの酢酸ナトリウム−ギ酸塩／20 ％のアセトニトリル緩衝液、pH6.8 15mlで連続して洗浄した。次いで結合されたタンパク質を、BSAを含まない以外は第一アフィニティークロマトグラフィー工程からタンパク質を溶離するのに使用したのと同じ溶離緩衝液を使用して５つの 0.5mlのフラクション中で最後に溶離した。この固相カラムから溶離し、LIRMAにより測定してAb 5144に結合した活性フラクションを溜め、次いで真空下でスピードーバク（商標）濃縮装置中で約100μl に濃縮した。次いでこれらの濃縮物をそれらの容積の約４倍の量の５％のメルカプトエタノールを含むSDS試料緩衝液の添加により還元し、そして試料緩衝液の色が黄色から淡青色に変化するまで、pHを5MのNaOHの滴下、添加によりほぼ中性に調節した。次いでその濃縮物を25℃で４時間にわたって10％のSDSポリアクリルアミドゲルによるSDS電気泳動にかけた。次いで分離したタンパク質を、移動緩衝液として10％のメタノールを含む100mMの３−［シクロヘキシルアミノ］− １−プロパンスルホン酸(CAPS)、pH11緩衝液を使用して、バイオラドトランスブロット装置中で水平電気泳動を25℃で45分間行うことによりイモビロン-Pブロッティング膜に移した。次いでイモビロン膜をアミドブラック染色液で室温で５分間染色することによりタンパク質バンドを視覚化した。 33kD及び35kDに相当する主要バンドを観察した。次いで染色されたタンパク質バンドをイモビロン膜（これはポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜である）から切断し、それらを蒸留水１mlを含むエッペンドルフ管中に使用前に貯蔵し、これを-7 0℃に凍結する。この実施例に記載された操作を、３種のヒツジ脳の夫々のもう二つのグループを使用して繰り返し、同様の染色パターンをイモビロン膜でその都度得る。夫々500のラット脳のグループを使用して、記載された操作を繰り返し、同様の染色パターンをイモビロン膜でその都度得る。ヒト脳組織を使用して、同様の結果を得る。実施例II 実施例Ｉからの２種の単離された35kD及び33kD脳由来膜関連ヒツジCRF-BPを、以下のようにしてアミノ酸配列データを測定することにより特性決定した。Ｎ末端エドマン分解を、単離されたタンパク質の夫々をSDS-PAGE及びPUDF膜へのエレクトロトランスファー後に気相配列分析に適用することにより単離された脳ヒツジCRF-BPにつき個々に行った。35kDヒツジCRF-BPのＮ末端配列分析はＮ末端アミノ酸(AA)配列：Glu-Ala-Val-Asp-His-Asp-Ser-Phe-Pro-His-Leu-Ala-Gly- Gly-Ala-Ser(配列番号１の残基1-16)を含むタンパク質を明らかにした。Ｎ末端配列分析は、単離された33kDヒツジCRF-BPがＮ末端アミノ酸(AA)配列：Glu-Leu- Glu-Gly-Glu-Pro-Leu-Tyr-Arg-Arg-Ala-Leu-Arg-Cys-Val-Asp-Met-Leu(配列番号１の残基20-37)を含むタンパク質を含むことを明らかにした。精製ヒツジCRF-BPタンパク質のトリプシン消化を行い、続いてトリプシンフラグメントを精製する。33kDフラクションからのトリプシンフラグメントは全て35 kDタンパク質のトリプシン消化パターン中にカウンターパートを有する。これらのフラクションのＮ末端配列決定後の５種の別個のトリプシンフラグメントの配列分析は下記のAA配列を生じた。そのCys残基は全体の実験データから演繹された。精製された33kD及び35kD脳由来ヒツジCRF-BP及びこれらのトリプシンフラグメントの配列分析からのＮ末端配列データを得た後、夫々約55％のＧ、Ｃ含量を有する21塩基の合成の5'センス及び3'アンチセンスオリゴヌクレオチドを得、これらは異なる哺乳類種の間に高度に保存されると思われるコード領域に誘導された。これらのオリゴヌクレオチドを使用してヒツジｃＤＮＡ（脳ｍＲＮＡから誘導された）からポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりヒツジCRF-BP遺伝子フラグメントをクローン化した。通常のPCR条件及び94℃の変性、45℃のアニーリング、72 ℃で10分間の一つの最後の伸長を伴う72℃の伸長の35サイクルを使用して、552 塩基対(bp)及び441塩基対(bp)のＤＮＡフラグメントを生産した。これらのヒツジCRF-BP cDNA部分クローンは夫々配列番号３及び配列番号４として本明細書に示される。ヒト血清CRF-BP cDNAコード領域の5'末端からの621塩基対pst1フラグメントを標識し、分子ハイブリダイゼーションプローブとして使用して上記のλZap(商標 )ヒツジ脳ｃＤＮＡラットをスクリーニングした。678bpヒツジCRF-BP cDNA部分クローン（配列番号５）を同定した。エドマン分解配列分析、PCRクローン化ｃＤＮＡフラグメント、及びｃＤＮＡ部分クローンからの相当するアミノ酸配列のその後の比較は、35kDヒツジCRF-BP （配列番号１）、33kDヒツジCRF-BP（配列番号１の残基20-295）、及び37アミノ酸欠失を有するこれらの２種のタンパク質（配列番号２及び配列番号２の残基20 -258）の複合アミノ酸配列を生じる。また、35kDヒツジCRF-BPからタンパク質分解開裂される生物活性Ｎ末端が配列番号１の残基1-18または1-19として同定される。実施例III ヒツジ脳由来膜関連CRF-BP結合分析及び解離分析配列番号６（ヒトCRF-BP）のＮ末端残基を含むペプチドに対し誘導された抗体はCRF/ヒトCRF-BP複合体を免疫沈殿させることができる。同抗体は完全長ヒツジ 33kDまたは35kDヒツジ脳由来膜関連CRF-BPに対し免疫アフィニティーを有しない。ヒトCRF-BP N末端に対するアフィニティーを有するこれらの抗体は、33kDヒツジ脳由来CRF-BPが溶液に添加される時に配列番号６の完全長ヒトCRF-BPを結合することができない。こうして、ヒトCRF-BPのＮ末端エピトープ領域はヒトCRF-BP /33kDヒツジ脳由来CRF-BP複合体中で抗体からマスクされることが結論される。配列番号６のヒト残基1-21からなる合成ペプチドはCRFを結合するヒツジCRF-BP の能力を抑制するが、それはCRFを結合する完全長ヒト血清CRF-BPの能力を抑制しないことが更に示される。これは脳由来ヒツジCRF-BPの70％が35kDヒツジCRF- BPのＮ末端トランケート変種(33kD)を含むためである。それ故、おそらく、配列番号６（ヒトCRF-BP）の残基1-21は33kD脳由来ヒツジCRF-BPと複合体形成するが、完全長35kDヒツジタンパク質とは複合体形成しない。それ故、ヒツジ35kD脳由来CRF-BPはヒト血清由来CRF-BPに類似する。一方、33kDトランケート変種及びＮ末端タンパク質分解開裂産物は異なる機能を有する脳由来哺乳類物体である。合成の21アミノ酸Ｎ末端ヒト血清CRF-BPペプチドはそれ自体ではCRFに対するアフィニティーを有しない。Ｎ末端ヒツジCRF-BPペプチド、即ち、配列番号１の残基1-18及び1-19は同様にCRFと複合体形成しない。しかしながら、33kDヒツジタンパク質は高アフィニティー(0.25のＫ_D)でCRFを結合する。更に、21残基の合成のＮ末端ヒト血清CRF-BPはCRF/33kDヒツジCRF-BP複合体の生成を抑制する。 35kDヒツジCRF-BPは、33kDタンパク質並びに18残基Ｎ末端タンパク質分解フラグメント及び19残基Ｎ末端タンパク質分解フラグメントが誘導される前駆体として一部利用できる。タンパク質分解開裂は配列番号１の残基19-20の間または残基18と19の間で起こることがあり、Arg残基が続いてトリミングされる。いずれにしても、それはCRFに対するそのＫ_Dを7.5から0.25ナノモルに減少するヒツジ脳由来CRF-BPの配座変化をもたらす。また、得られた33kD CRF-BPは35kDヒツジC RF-BPと複合体形成する傾向を有し、この複合体は35kDタンパク質のＮ末端により生じて35kD/33kDヒツジCRF-BP複合体をつくる。こうして、その無傷の露出されたＮ末端19残基領域を有する35kDヒツジCRF-BPは反応性であり、33kD変種と複合体形成する。しかしながら、Ｎ末端開裂された18AAペプチド及び19AAペプチドは35kDタンパク質と競合して、35kDヒツジCRF-BP及び33kDヒツジCRF-BPの複合体の解離を生じることができる。このＮ末端タンパク質分解産物及びそのヒト脳同族体は、それ故、CRF-BP CRF結合部位を遊離し、それにより生物組織中でCRF に対する結合部位密度を増大することができるであろうと予想される。これは生物組織中のCRFの濃度を有効に低下し、それ故、高レベルのCRFに関連する生理学的疾患の治療に有益であることが論理的に予想される。脳由来CRF-BPの33kD変種を生じるタンパク質分解イベントは33kD CRF-BP対35k D CRF-BPの脳中の比を支配するのに重要である。それ故、このタンパク質分解イベントは脳中の未結合CRFの平衡レベルを測定するのに重要である。このような脳プロテアーゼが参加する自然の調節機構は、脳中の33/35kD CRF-BP分子集団ひいては利用できるシナプスCRF結合部位の量を調節する微小の同調装置である。それ故、治療上有益なペプチド及びこのプロテアーゼの類縁アンタゴニストは自生タンパク質分解酵素により認識され、そしてまた自生開裂部位(即ち、配列番号１の残基18-19及び配列番号６の残基21-22)をスパンするのに充分な長さのCRF -BPフラグメント及び合成の化学誘導体または類縁体の形態で提供し得る。このようなペプチドは長さが少なくとも約５残基であり、好ましくは長さが約10AA残基よりも大きく、更に好ましくは約15残基以上である。実施例IV ヒツジCRF-BPをコードする機能性遺伝子の構築だけでなく、これらのタンパク質の組換え発現の方法が以下に示される。成熟35kDヒツジ脳由来膜関連CRF-BPのＤＮＡコード領域を、5'-3'の順序で、(1)配列番号１の残基1-7をコードする合成ＤＮＡ配列（当業者に公知のこれらの特別な残基の遺伝子コードの統計上保存されたヒトコドンを使用する）、(2)配列番号３の1-189 bpＤＮＡ配列、及び(3) 配列番号５のＤＮＡ配列の融合により構築する。この複合ＤＮＡセグメントの異種遺伝子発現は成熟35kDタンパク質（配列番号１）の完全コード領域を含み、そして市販の発現ベクター、例えば、ファーマシア（ピスカサウェイ、NJ）からの pMSG、pSVT7及びpMT2、または広く使用されるオカヤマ−ベルグベクターを使用してチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、CV-1細胞、HeLa S3、NIH-3T3細胞またはCOS7細胞中で有効に行われる。通常の技術の使用は295残基の活性な成熟グリコシル化タンパク質を生じる（また、E.Potterら，Nature，349，423-4 26(1/31/91);分子クローニング、実験マニュアル第２編、16章、培養哺乳類細胞中のクローン化遺伝子の発現、J.Sambrookら(1989)を参照のこと）。また、Summ ers,M.D.ら，Tex.Agric.Exp.Stn.Bull．1555号(1987)により記載されているように、バキュロウイルスベクターが培養昆虫細胞中のこれらの遺伝子の異種発現に使用されてもよい。この複合ＤＮＡセグメント遺伝子はまた天然細菌遺伝子に融合されて安定なキメラ原核生物生合成タンパク質を生じ得る。これらのキメラタンパク質はアフィニティークロマトグラフィーにより容易に単離され、次いでその活性タンパク質がその後の部位特異性タンパク質分解開裂により放出される。良く開発された市販の細菌発現ベクター及び宿主細胞が容易に利用できるだけでなく、これらの生合成ポリペプチドの生産のための単離／精製物質及びプロトコル（即ち、タンパク質融合及び精製系(PFP)、ニューイングランド・バイオラブズ）が容易に利用できる。ラットとヒトの間の41AA CRF生物学的メッセンジャーの分子構造に関する進化の逸脱の明らかな欠如は、このような多様な哺乳類種における類似受容体及びCR F脳由来結合タンパク質の相当するアミノ酸配列中の可能な保存領域のかなりの指標である。容易に引き出せる結論は、一つの哺乳類種の脳由来膜関連CRF-BP核酸配列、即ち、本明細書に開示されたヒツジ配列のかなりの部分を一旦有すると、同族体結合タンパク質をコードするその他の動物種の天然産の変異同族体配列を得ることが直接的な実施であることである（例えば、Potterら，Nature，349 ，423-426(1991)を参照のこと、そこにはヒト血清由来CRF-BPのｃＤＮＡコード領域が類似の血清由来ラットｃＤＮＡコード領域の同定を可能にするのに充分に相同性であることが示されていた）。例えば、当業者に公知の確立された方法（例えば、分子クローニング、実験マニュアル第２編、８章、ｃＤＮＡライブラリーの構築及び分析、J.Sambrookら(1989)を参照のこと）を使用して、配列番号３ −５またはその部分がヒト脳ｍＲＮＡからつくられた哺乳類ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてヒト脳由来膜関連CRF-BP DNA同族体コード領域及び／またはその他の哺乳類種のこれらのコード領域を同定し、単離し得る。実施例Ｖ CRF-BPは、CRFが試料中に存在するか否かを下記のプロトコルに従って測定するのに使用し得る。適当なアッセイが種々の方法で実施し得る。例えば、CRF-BP を96ウェルのミクロタイタプレートにカップリングでき、次いでCRFを含むと予想される試料のアリコートをビオチンがカップリングされた一定量の真正CRF の存在下で結合CRF-BPとともにインキュベートし得る。４〜６時間のインキュベーション後に、その溶液を除去し、プレートを洗浄して未結合のCRFを除去する。ホースラディッシュペルオキシド(HRP)にカップリングされたアビジンを添加し、インキュベートしてCRF-ビオチン接合体と複合体を生成する。再度、プレートを洗浄し、HRP基質を添加する。CRFを含まない試料を含む殆どのウェル中で色が生じる。試料をインキュベートし続けるにつれて、ビオチン-CRF接合体が次第に減少するレベルで結合する。それ故、発色が小さいであろう。これは、既知濃度の真正CRF(適当な場合)を使用して較正し得る投薬量依存性応答を生じるであろう。この種のアッセイは、いずれの欠点（即ち、放射能トレーサー、活性タンパク質に対する非特異性）もなく、受容体に結合することができる活性リガンドに対する特異性、並びにELISA抗体アッセイの感度及び簡素化を含む、放射性受容体アッセイの利点を有する。以上、特にことわらない限り、全ての％は容量％である。本発明が発明者らに不変に知られている最良の様式を構成するその好ましい実施態様に関して説明されたが、当業者に明らかであるような種々の変化及び改良が請求の範囲に示される本発明の範囲から逸脱しないでなし得ることが理解されるべきである。例えば、Ｃ末端もしくはＮ末端または両方の末端で短くされた、このようなタンパク質の生物活性フラグメントは完全タンパク質に代えて使用されて生物活性CRFを調節する同じ生物効果を有し得る。本発明の特別な特徴が下記の請求の範囲において強調される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＧ０１Ｎ 33/566 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/53 Ｚ // Ｇ０１Ｎ 33/53 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ベーハンドミニクピーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴアヴェニダナヴィダード 282‐7915 (72)発明者ヴェイルワイリーダブリュージュニアアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラジョラヴァルデーズ 1643 (72)発明者フィッシャーヴォルフガンクハーアメリカ合衆国カリフォルニア州 92024 エンシニタスレッドバーンロード 1733 (72)発明者ローリーフィリップジェイイギリスバークシャーアールジー６２エイチピーリーディングアーリーメイデンアーリードライヴ 19

Claims

【特許請求の範囲】１．CRFに対するアフィニティーを示す単離された実質的に純粋な哺乳類脳由来膜関連CRF結合タンパク質。２．CRFに対するアフィニティーを示し、かつ配列番号１の下記の配列：残基1-1 6、残基20-37、残基96-106、残基110-120、残基206-222、残基248-256及び残基2 67-272、または別の哺乳類種の天然産同族体からなる群から選ばれた少なくとも一つの配列を含む請求の範囲第１項に記載の単離された実質的に純粋な哺乳類膜関連CRF結合タンパク質。３．約35kDの分子量及び配列番号１の残基1-16のＮ末端を有する請求の範囲第１項に記載のCRF結合タンパク質。４．約33の分子量及び配列番号１の残基20-37のＮ末端を有する請求の範囲第１項に記載のCRF結合タンパク質。５．配列番号２のアミノ酸配列及びその生物活性フラグメントを含む請求の範囲第１項に記載のCRF結合タンパク質。６．実質的に配列番号２の残基20-258からなる請求の範囲第１項に記載のCRF結合タンパク質。７．複数の化合物をスクリーニングしてどの化合物がCRF受容体をトランスアクチベートするのかを測定する方法であって、その方法が競合結合アッセイにおいて請求の範囲第２項に記載のCRF結合タンパク質を使用することを特徴とする複数の化合物のスクリーニング方法。８．複数の化合物をスクリーニングしてどの化合物がCRF-BP複合体の解離を生じるのかを測定する方法であって、その方法が解離アッセイにおいて請求の範囲第２項に記載のCRF結合タンパク質を使用することを特徴とする複数の化合物のスクリーニング方法。９．配列番号１のアミノ酸配列またはその生物活性フラグメントを含むことを特徴とするCRF結合タンパク質。 10．実質的に配列番号１の残基20-295からなる請求の範囲第９項に記載の化合物。 11．実質的に配列番号１の残基1-18または残基1-19からなる請求の範囲第９項に記載の化合物。 12．CRF受容体のトランスアクチベーションを調節し、または哺乳類中のCRFのその作用を調節する方法であって、その方法が有効量の請求の範囲第９項に記載のCRF結合タンパク質を投与して受容体活性化を調節することを含み、前記の量が(a)脳及び神経系、(b)ACTH、 βエンドルフィン及びコルチゾルの産生に特別な下垂体、(c)炎症の部位、(d)胎盤、(f)副腎、(g)生殖腺または(h)胃腸道に対するCRFの作用を調節するのに有効であることを特徴とする方法。 13．配列番号１を有するCRF結合タンパク質もしくはその生物活性フラグメント、または同一もしくは別の哺乳類種の天然産同族体タンパク質をコードする単離され、精製されたＤＮＡフラグメント。 14．配列番号３または別の哺乳類種の天然産同族体配列を含む請求の範囲第13項に記載のＤＮＡフラグメント。 15．配列番号５または別の哺乳類種の天然産同族体配列を含む請求の範囲第13項に記載のＤＮＡフラグメント。 16．配列番号２を有するCRF結合タンパク質もしくはその生物活性フラグメント、または別の哺乳類種の天然産同族体タンパク質をコードする請求の範囲第13項に記載のＤＮＡフラグメント。 17．配列番号４または別の哺乳類種の天然産同族体配列を含む請求の範囲第16項に記載のＤＮＡフラグメント。 18．CRF結合タンパク質の生産方法であって、その方法が前記ＤＮＡを発現することができる請求の範囲第13項に記載のＤＮＡフラグメントを含む発現ベクターで形質転換された組換え宿主細胞を培養することを含み、前記培養が前記ＤＮＡの発現及びタンパク質の回収を可能にする条件下で行われることを特徴とするCRF結合タンパク質の生産方法。