JPH04218388A - ソマトトロピン結合蛋白質を特異的に認識する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【本発明の分野】本発明は抗体、特にソマトトロピン結
合蛋白質を特異的に認識する単クローン性抗体に関する
。この単クローン性抗体が結合する抗原の特異なペプチ
ド配列のために、これらの単クローン性抗体はソマトト
ロピン結合蛋白質に対し極めて特異的であるが、ソマト
トロピン・レセプターに対しては特異的でない。該単ク
ローン性抗体は動物のソマトトロピンのホルモン効果を
変更または増強するのに使用することができる。

【０００２】

【本発明の背景】ソマトトロピンは動物の下垂体前葉か
ら分泌されるポリペプチドであり、主として肝臓に存在
する特殊な細胞表面レセプターを通じて作用する（文献
１）。最近ソマトトロピンと高度の親和性をもって結合
する蛋白質が血清の中で発見された（２、３、４）。こ
の血清ソマトトロピン結合蛋白質は標的細胞の表面に存
在するソマトトロピン・レセプター分子と非常に似てお
り、多くの証拠によってソマトトロピン・レセプターの
細胞外領域とソマトトロピン結合蛋白質との間の類似性
および同一性が指摘されている（５、６、７、８、９、
１０、１１）。単クローン性抗体はソマトトロピン・レ
セプターと結合し、該レセプターはさらにソマトトロピ
ン結合蛋白質と反応する（１２）。またソマトトロピン
結合蛋白質はソマトトロピン・レセプターの加水分解生
成物であることが提案されている（９、１１、１３）。

【０００３】最近ラットのソマトトロピン関連ｍＲＮＡ
の２種が同定され、ｃＤＮＡでクローニングされた。こ
の１種のｍＲＮＡは膜に結合したソマトトロピン・レセ
プターの情報を伝え、他の１種は、細胞外領域と同一で
はあるがソマトトロピン・レセプターの膜間および細胞
内領域を欠いた分泌された可溶性蛋白質であるソマトト
ロピン結合蛋白質の情報を伝達する。この細胞外領域は
交互スプライス機構により１７個のアミノ酸から成る親
水性部分とその後に続く３個の独特な翻訳されない区域
で置き換えられる。従ってラットのソマトトロピン結合
蛋白質はソマトトロピン・レセプターには存在しない独
特なカルボキシル末端をもっている。マウスのソマトト
ロピン結合蛋白質にも同様な分子構造が報告されている
（１５）。

【０００４】

【本発明の要約】本発明は抗体、特にソマトトロピン結
合蛋白質と反応する単クローン性抗体に関する。ソマト
トロピン結合蛋白質と反応する他の単クローン性抗体と
は異なり、本発明の抗体はソマトトロピン・レセプター
とは反応しない。これは本発明の抗体がラットおよび他
の動物で見出だされる特殊な抗原に対してつくられたも
のではあるが、ソマトトロピン・レセプターに見出ださ
れる抗原に対して生じたものではないからである。本発
明の抗体はソマトトロピン結合蛋白質をソマトトロピン
・レセプターと識別し、血清の濃度または動物の血清ソ
マトトロピン結合蛋白質の他の品質を変性してその成長
特性を改善するのに使用される。

【０００５】

【本発明の詳細な記述】本発明は抗体、特にソマトトロ
ピン結合蛋白質の特殊な区域に対する単クローン性抗体
の調製法、該抗体を使用して動物の成長を増強する方法
、およびソマトトロピン結合蛋白質の濃度を決定する方
法に関する。第一段階としてこの特殊な区域に対応する
ペプチドは次の方法で合成される。

【０００６】ラットのソマトトロピン・レセプターおよ
びラットの血清ソマトトロピン結合蛋白質を表すｃＤＮ
Ａクローンの塩基配列を解析した結果、ソマトトロピン
結合蛋白質のｍＲＮＡは次のようなヌクレオチドの配列
により記述できるが、ソマトトロピン・レセプターはそ
うではないことが明らかになった。ＧＧＡＣＣＣＡＡＧ
　　ＴＴＣ　　ＡＡＴ　　ＴＣＣ　　ＣＡＧ　　ＣＡＣ
　　ＣＣＡ　　ＣＡＴ　　ＣＡＡＧＡＧ　　ＡＴＴ　　
ＧＡＣ　　ＡＡＣ　　ＣＡＣ　　ＣＴＧ　　ＴＡＡ。こ
のＤＮＡ配列はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓ
ｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ
−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕと
して翻訳でき、次いで停止コドンが来る。このことはこ
れがソマトトロピン結合蛋白質のカルボキシル末端をつ
くっていることを示している。 固相ペプチド合成法［フモック（Ｆｍｏｃ）ポリアミド
法］により、この特殊な区域は１の位置のＣｙｓ残基に
付加して合成され、ペプチドをカップリングする目的で
これを抗原担体蛋白質に含ませる。

【０００７】次いで高速液体クロマトグラフ法（ＨＰＬ
Ｃ）のような適当な方法で１８個のアミノ酸から成るペ
プチドを精製する。ペプチドの純度はアミノ酸組成分析
によって示される。

【０００８】マウスのソマトトロピン結合蛋白質＋Ｃｙ
ｓ残基の特殊なカルボキシル末端領域に対応する１８個
のアミノ酸から成るペプチドを同様な方法を用いてつく
ることができる。マウスの領域は次の塩基配列をもって
いる：Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ
−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（１５）。

【０００９】抗体の生成を増加させるためには、本発明
のペプチドをペプチドに対する担体としての機能をもっ
た高分子に結合させることが好ましい。　例えばペプチ
ドを例えばカギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）
のような蛋白質と複合させる。本発明のような範囲内に
入る他の担体としては、人および牛の血清アルブミン、
ミオグロビン、β−ガラクトシダーゼ、ペニシリナーゼ
およびバクテリア性のトキソイドのような当業界に公知
のものが含まれる。担体はまた合成分子、例えばマルチ
−ポリ−ＤＬ−アラニル−ポリ−Ｌ−リジンおよびポリ
−Ｌ−リジンであることができる。

【００１０】単クローン性抗体は本発明のペプチドで免
疫を賦与した動物により、単独または複合化した形で生
成させる。ペプチドは通常の経路、例えば皮下注射、筋
肉注射および静脈注射、並びに皮膚および口を介する投
与法により投与することができる。ペプチド（またはそ
の複合体）を例えばフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全
助剤のような助剤を含む担体と共に投与することが好ま
しい。　ペプチドを最初に投与した後規則的な間隔で同
じペプチドを用い追加免疫を行うことが特に好適である
。

【００１１】本発明はまた１８個のアミノ酸ペプチドに
対し抗原的に上記と同等なアミノ酸配列をもったペプチ
ドに対する単クローン性抗体に関する。このようなペプ
チドは、アミノ酸配列の相異が１８アミノ酸ペプチドの
僅かな部分を削除するか、或いはそのアミノ酸配列に対
し保存的な置換が行われた相異であり、ペプチドの三次
元配列が１８アミノ酸ペプチドと実質的に変わらずこれ
らのペプチドに対し抗体が生成する場合、独特なカルボ
キシル末端領域と同族列をなしたアミノ酸配列をもつペ
プチドと同等であると言われる。

【００１２】単クローン性抗体を調製する次の段階には
、ペプチドで免疫性を賦与した動物の脾臓を取り出して
リンパ球の懸濁液をつくり、これらのリンパ球をマウス
の骨髄腫に融合させ、細胞を培養して生き残ったハイブ
リドーマの上澄液を集め、固相における酵素結合免疫吸
着試験（ＥＬＩＳＡ）により抗体のスクリーニングを行
う工程が含まれる。所望の抗体を生産するこれらのハイ
ブリドーマをさらに継代クローニングを行い、マウスに
注射する。

【００１３】ＧＨＢＰ−４．３の記号を付けられたハイ
ブリドーマの試料はアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に保存され、ア
クセス番号はＡＴＣＣ　　ＨＢ　　１０３１０である。

【００１４】次に単クローン性抗体を次のようにして精
製する。マウスの腹腔から腹水を集め、硫酸アンモニウ
ム沈澱法によるかまたは高速蛋白質液体クロマトグラフ
（ＦＰＬＣ）システムによりプロテインＡアフィニティ
ー・カラム（ＰｒｏｔｅｉｎＡ　　ａｆｆｉｎｉｔｙ　
　ｃｏｌｕｍｎ）によりイムノグロブリン（Ｉｇ）を精
製する。このようにして精製されたＩｇの試料は所望の
単クローン性抗体を含み、これはＥＬＩＳＡ法を用いる
対抗原試験で同定することができる。

【００１５】このような単クローン性抗体がソマトトロ
ピン結合蛋白質に結合する能力は、ウエスターン・ブロ
ット試験（Ｗｅｓｔｅｒｎ　　ｂｌｏｔ　　ａｓｓａｙ
）のような方法で試験される。図１に示したように、単
クローン性抗体はソマトトロピン結合蛋白質を特異的に
認識する（レーン２）が、ソマトトロピン結合蛋白質の
配列が逆向きの配列をなす形質発現プラスミドを含む大
腸菌の蛋白質とは相互作用しない（このような株はソマ
トトロピン結合蛋白質を形質発現させることができない
）（レーン１）。

【００１６】本発明の他の態様においては、単クローン
性抗体を使用して血漿試料中のソマトトロピン結合蛋白
質の同定を行うことができる。血漿をポリアクリルアミ
ドのようなゲル上で電気泳動にかけ、分離した蛋白質を
電気的にブロッティングし、次いで本発明の単クローン
性抗体と共に保温する。ブロットをラベルした抗マウス
抗体に露出した後、発現させる。この試験は抗体がソマ
トトロピン結合蛋白質と反応することを示すのに用いる
ことができる。ラットに対する結果を図２に示す（レー
ン２）。

【００１７】さらに単クローン性抗体と種々の種類のソ
マトトロピン結合蛋白質との交叉反応性を、ＥＤＴＡで
処理した種々の動物の血漿をラットの血漿の場合に述べ
た方法を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥ法およびウエスターン・
ブロット法にかけることにより試験した。図２に示すよ
うに、この単クローン性抗体はラット、マウスおよび豚
のソマトトロピン結合蛋白質と反応するが、牛、羊、鶏
および人の蛋白質とは反応しない。この結果はラット、
マウスおよび豚のソマトトロピン結合蛋白質には同族的
なカルボキシル末端領域が存在することを示している。

【００１８】ソマトトロピン結合蛋白質に結合する単ク
ローン性抗体はソマトトロピン・レセプターとは反応し
ない。その理由は単クローン性抗体を生成させる結合蛋
白質の特殊なカルボキシル末端領域を含んでいないため
である。

【００１９】ＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体を使用
して血清中のソマトトロピン結合蛋白質の濃度を測定す
る方法には幾つかある。その一つの方法ではドデシル硫
酸ナトリウム／ポリアクリルアミド・ゲルを用いる電気
泳動法を使用する。変性剤としては２−メルカプトエタ
ノールを用いる。バクテリア由来の既知濃度のソマトト
ロピン結合蛋白質の試料を対照として使用する。試験試
料は容積既知の血清である。電気泳動を行ったゲルを先
ずＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体を用い、次いで二
次抗体として放射性をもった抗マウス・イミノグロブリ
ンを用いてウエスターン・ブロット試験を行う。血清か
ら得られる放射性信号の強度を既知量のバクテリア由来
ソマトトロピン結合蛋白質の信号強度と比較し、血清中
の結合蛋白質の濃度を推定する。

【００２０】他の方法では、放射性免疫試験／免疫沈澱
法を使用する。バクテリア由来のソマトトロピン結合蛋
白質に例えば１２５Ｉを使用して放射性のラベルを付け
る。この放射性のラベルを付けたソマトトロピン結合蛋
白質はＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体と免疫複合体
をつくることができる。追跡用のリガンドとしてはラベ
ルを付けた蛋白質を用いる。ラベルを付けたリガンドは
既知濃度のラベルを付けていないリガンドにより追い出
される。この追い出された量を監視し、放射線免疫検定
の標準曲線として使用する競合曲線をつくる。血清中の
ソマトトロピン結合蛋白質の濃度はラベルの付いていな
い競合物質として既知容積の血清を用い標準曲線の追い
出された量を参照してソマトトロピン結合蛋白質の量を
測定することにより確定される。

【００２１】本発明の他の態様においては、特異的にソ
マトトロピン結合蛋白質を認識する抗体を用い動物の成
長を促進させる。このような抗体を１種またはそれ以上
使用する。このような抗体の全部または一部が単クロー
ン性抗体であることができ、或いは全部が単クローン性
抗体でないこともできる。使用する抗体の選択は当業界
の専門家の知識の範囲内である。このような実験の結果
を図４に示す。本発明の単クローン性抗体で処理したマ
ウスは処理しなかったものに比べ迅速に成長した。

【００２２】本発明のさらに他の態様においては、本発
明の新規抗体をソマトトロピンと共に投与して動物にお
けるソマトトロピンの効果を強化する。この場合もこの
ような抗体を１種またはそれ以上使用し、またこのよう
な抗体の全部または一部が単クローン性抗体であること
ができ、或いは全部が単クローン性抗体でないこともで
きる。このような実験の結果を図５に示す。マウスのソ
マトトロピンと共に本発明の単クローン性抗体で処理し
たマウスは、ソマトトロピンだけで処理したマウスに比
べ体重の増加速度が速かった。

【００２３】本発明の理解をさらに良好にするために、
下記実施例により本発明を例示する。これらの実施例は
単に例示だけが目的であり、本発明を限定するものでは
ない。

【００２４】

【実施例】実施例　　１ ソマトトロピン結合蛋白質の特殊な領域を表す合成ペプ
チドの調製 １の位置にＣｙｓ残基を付加した（ペプチドを抗原担体
蛋白質に結合させる目的で）ソマトトロピン結合蛋白質
の特殊なカルボキシル末端領域に対応する下記の塩基配
列をもった１８アミノ酸ペプチドを、固相ペプチド合成
法（フモック・ポリアミド法）でつくる。

【００２５】Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ
−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕペプチド調製物の純度をヴァイダック（Ｖｙｄａｃ
）Ｃ１８（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）ＨＰＬＣカラム上に
おいて、３０分間に亙り０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ１
０〜５０％および０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ　　９０〜５
０％の直線勾配をつけ流速を１．５ｃｍ３／分にして測
定した。検出は２３０ｎｍの紫外線を用いた。アミノ酸
分析は酸で加水分解した後に薄層クロマトグラフにより
行った。結果を表１に示す。

【００２６】

【表１】 ＊システインは酸で加水分解すると分解してプロリンと
一緒に流出する生成物を生じる。

【００２７】高速原子衝撃質量分析法により分子量（陽
イオンスペクトルはｍ／ｚが２１００のところでＭ＋Ｈ
＋を与える）の決定と配列の確認を行った。

【００２８】実施例　　２ 合成ポリペプチドと高抗原性担体蛋白質との複合体実施
例１の合成ペプチドをペプチドの１の位置のシステイン
残基のチオール基を介してＫＬＨと複合体にする。 ヘテロ二官能性交叉結合剤としてｍ−マレイミド安息香
酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用い純粋な合成ペプ
チド１０ｍｇを８ｍｇのＫＬＨと結合させ、Ｎ−末端結
合ペプチド複合体をつくる。得られた複合体を透析し、
凍結乾燥し、使用するまで−２０℃で貯蔵する。

【００２９】実施例　　３ ソマトトロピン結合蛋白質に対する単クローン性抗体の
生成 生後６〜１０週間のＢａｌｂ／Ｃマウスを米国マサチュ
ーセッツ州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）の
チャールズ・リヴァー・ブリーディング・ラボラトリー
ズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　　Ｒｉｖｅｒ　　Ｂｒｅｅｄｉｎ
ｇ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入した。これ
らのマウスに、完全フロイント助剤で乳化した１００μ
ｇのＫＬＨ−ペプチドで免疫を付与した。その後３週間
毎に同じ抗原５０μｇを用いてマウスに追加免疫を行っ
た。最後の追加免疫後に脾臓を取り出し、リンパ球の単
細胞懸濁液を調製した。このリンパ球を５０％ポリエチ
レングリコールと共にヒポキサンチン・フォスフォリボ
シル・トランスファーゼ（ＨＰＲＴ）を欠いたＮＳ−１
マウスの骨髄腫細胞［米国メリーランド州ロックヴィル
（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・センター］と融合させ、２０％の牛の胎児の血清
（ＦＣＳ）［ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）］、０．１７５μｇ
／ｍｌのアミノプテリン、１３．６μｇ／ｍｌのヒポキ
サンチン、３．８８μｇ／ｍｌのチミジンおよび５０μ
ｇ／ｍｌのゲンタミシン（ＨＡＴ媒質）を含むデュルベ
ッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変性イーグル（Ｅａｇｌｅ
）媒質（Ｄ−ＭＥＭ）中に懸濁させ、最後に９６穴の培
養板に入れる。１０〜１４日間培養した後リンパ球のＨ
ＰＲＴ陽性の表現型のために生き残った数百種のハイブ
リドーマの上澄液を集め、固相ＥＬＩＳＡ法により抗体
のスクリーニングを行う。ＧＨＢＰ−１〜ＧＨＢＰ−１
４の記号を付けられた１４種のハイブリドーマが固相Ｅ
ＬＩＳＡ法およびウェスターン分析法により適当な抗原
であることが決定された。ここで大腸菌ＪＭ１０９（Ｄ
Ｅ３）／ｐＥＴ　　７−６株（この試料はアメリカン・
タイプ・カルチャー・センターに保存されており、アク
セス番号はＡＴＣＣ６８，２０５である）から得られる
細菌溶解物を各単クローン性抗体で検査し、限定希釈法
により継代クローニングを行った。

【００３０】大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）／ｐＥＴ　　
７−６ｍ株は次のようにして生成させる。Ｔ７ポリメラ
ーゼ形質発現システム中においてソマトトロピン結合蛋
白質のｃＤＮＡ塩基配列を用い、ラットのソマトトロピ
ン結合蛋白質を合成するのに大腸菌を使用する。プラス
ミドｐＲａｔ　　７−６（ＡＴＣＣ番号６７，８４９）
は１９８９年２月１７日付けの本出願人による同時出願
の米国特許願第３１０，７２５号に記載されており、次
のようにしてプラスミドｐＲａｔ　　７−６ｍを生成さ
せるのに用いた。ｐＲａｔ　　７−６を制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化させ、血清ソマトトロピン結合蛋白質を含む
０．９５ｋｂの断片を分離した。この断片をＥｃｏＲＩ
で消化させたベクターｐＧＥＭ　　３Ｚ（ｆ）＋［米国
ウイスコンシン州プロメガ・バイオテクノロジー（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ　　Ｂｉｏｔｅｃｈ．）］に連結する。この
断片の配置はソマトトロピン結合蛋白質の遺伝子の５’
末端がＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターと結
合しているような配置である（１６）。得られた構造体
ｐＲａｔ　　３＋　　７−６を結合部位指向突然変異を
行うのに使用した。

【００３１】大腸菌ＤＨ５α／ｐＲａｔ　　３Ｚ＋　　
７−６をヘルパー・ファージＲ４０８（米国ウイスコン
シン州プロメガ・バイオテクノロジー）で重感染させ、
単一鎖のＤＮＡを分離した。このＤＮＡは血清ソマトト
ロピン結合蛋白質のコーディング区域に関し負の鎖であ
る。 配列５’ＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＴＡＴＧＴＴＴＣＣＴ
３’をもつオリゴヌクレオチドを合成してアニーリング
し単一鎖のＤＮＡにする。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼの
クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片およびＴ４　　ＤＮＡリ
ガーゼを用い第２の鎖を完成させる。大腸菌ＤＨ５α株
［米国メリーランド州ゲイサーバーグ（ｇａｉｔｈｅｒ
ｂｕｒｇ）のベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｉｅｓ）］を形質転換し、この混合物をＬＢ−ＡＭ
Ｐ板上で培養する。このコロニーをニトロセルロースに
移す。

【００３２】コロニーのハイブリッド化は１Ｘ　　デン
ハルツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、５ＸＳＣＣおよび１５
０μｌ／ｍｌのｔＲＮＡの中で検体として末端を３２Ｐ
　　ＡＴＰでラベルしたオリゴヌクレオチドを使用して
３２℃で行った。フィルターを５６℃において３モルの
塩化テトラメチルアンモニウム、５０ミリモルのｐＨ８
のトリス、２ミリモルのＥＤＴＡおよび０．１％のドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の中で洗滌した。この条
件下においては変種の塩基配列をもつプラスミドを含む
コロニーだけがラベルされる。陽性のコロニーを拾いあ
げ、これから突然変異種および野生型の分子の両方を含
むプラスミドＤＮＡをつくる。形質転換、ハイブリッド
化および洗滌工程を繰り返し、再び陽性のコロニーを拾
いあげ、精製された変種のｐＲａｔ　　７−６ｍをつく
った。

【００３３】このプラスミドｐＲａｔ　　７−６ｍはラ
ットのソマトトロピン結合蛋白質の情報を取り込み、こ
こで１個のＮｄｅ　　Ｉ制限部位は通常の分子の１８の
位置におけるメチオニン残基の所で処理されたものであ
る。 制限エンドヌクレアーゼによって消化された０．９ｋｂ
断片をこの特殊なＮｄｅ　　Ｉ部位においてベクターｐ
ＥＴ３ｂに連結する（１７）。即ち位置１８におけるメ
チオニン残基はこのプラスミドの翻訳開始部位として作
用し、これはｐＥＴ　　７−６ｍと呼ばれている。得ら
れたソマトトロピン結合蛋白質分子はリュング（Ｌｅｕ
ｎｇ）らが予測したように（９）野生型の未処理の分子
の予想される信号配列をもっていない。

【００３４】この残基（メチオニン　　１８）は必ずし
もラットに見られる処理された血清ソマトトロピン結合
蛋白質の第１残基である必要はない［処理された野生型
の分子の最初の残基はマシューズ（Ｍａｔｈｅｗｓ）ら
（１８）により位置２５のスレオニン残基であると予測
されており、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１５）によりア
ミノ末端配列決定法によりマウスの対応するスレオニン
２５の残基であることが示されている］。しかし今問題
にしている分子は機能的に同等な種であり［残基１７の
後で人および兎の開裂部位を使うことにより証明される
（９）］、野生型の分子には存在しない位置に必要な開
始部位のメチオニン残基を付加しないでも、バクテリア
中でこのラットのソマトトロピン結合蛋白質の翻訳を行
うことができる。

【００３５】組み換えられたラットのソマトトロピン結
合蛋白質の転写は通常は大腸菌の中には見出されないフ
ァージＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼにより配列転写の信
号を送るファージＴ７遺伝子プロモーターにより誘起さ
れる。従ってλ−リソーゲン中におけるＴ７　　ＲＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の複製である大腸菌のＪＮ１０９（
ＤＥ　　３）（プロメガ社）株を使用して組み換えソマ
トトロピン結合蛋白質の形質発現を行う。このＴ７　　
ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は誘導プロモーター（ｌａｃ
ＵＶ５）の制御下にある。従って組み換えソマトトロピ
ン結合蛋白質の形質発現は０．４ミリモルのイソプロピ
ルチオガラクトシデ（ＩＰＴＧ）を培地に加えることに
より誘起される（１９）。クロランフェニコール耐性を
もつ遺伝子およびＴ７リゾチームを含んだ他のプラスミ
ドｐＬｙｅＳ（２０）を形質発現株に含ませることもで
きる。Ｔ７リゾチームが存在するとＴ７　　ＲＮＡポリ
メラーゼの作用が阻害されるから、これにより組み換え
ソマトトロピン結合蛋白質の早期に誘導された形質発現
を防止する作用を行うことができ、同時に誘導された細
菌の溶解を強化することができる。

【００３６】アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、１％
カサミノ酸および２０ｇ／ｌのグルコースを含むＭ９培
地の中でＪＭ１０９（ＤＥ３）／ｐＥＴ　　７−６ｍ株
を一晩成長させる。これを培養器に入れ、３７℃でＯＤ
６００が約１５になるまで成長させ、培地に０．４ミリ
モルのＩＰＴＧを加えて誘起させる。２．５時間後細胞
を取り出し凍結させる。細胞を再び水に懸濁させ、ポリ
トロンで或いは他の細胞／破砕法（ｐＬｙｓＳを使用し
ないとき）により均質化し、超音波をかけてゲノムＤＮ
Ａを破砕する。組み換え生成物は封入体の形でペレット
にし、洗滌し、高ｐＨにおいて可溶化し、中空の繊維フ
ィルター［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）］で超遠心分離し
、イオン交換型、疎水性相互作用型またはアフィニティ
型カラムを用いるクロマトグラフ法により精製する。

【００３７】ハイブリドーマＧＨＢＰ−４から得られる
クローンを選び、以下の研究の例としてこれにＧＨＢＰ
−４．３（ＡＴＣＣ　　ＨＢ　　１０３１０）の記号を
付ける。プリスタンで刺激したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹
腔似ＧＨＢＰ−４．３を注射し、抗体を含む腹水の製造
に用いた。

【００３８】実施例　　４ 抗体の精製 マウスの腹腔から腹水を集め、Ｉｇを硫酸アンモニウム
沈澱法により精製する。別法として試料を結合緩衝液（
３モルのＮａＣｌ、１．５モルのグリシン、ｐＨ８．９
）で５０％に希釈し、高速蛋白質液体クロマトグラフ（
ＦＰＬＣ）システム［米国ニュージャージー州ピスカタ
ウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のファーマシア（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）社］の分取用プロテインＡスーパーロ
ーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ａ　　Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）Ｈ
Ｒ　　１６／５カラムにかける。非Ｉｇ部分を結合緩衝
液と共にカラムから流出させ、次いでカラムをｐＨ３の
０．１モルのクエン酸で洗滌して結合したＩｇを補集す
る。 これを直ちにｐＨ８．２の２モルのトリス緩衝液でｐＨ
７〜８に中和する。両方法で調製された抗体をＰＢＳに
対し十分透析を行い、限外濾過［米国マサチューセッツ
州ダンヴァースーパーローズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）のアミ
コン社］により濃縮し、分別し、最後に使用時まで−２
０℃で貯蔵する。

【００３９】実施例　　５ 固相ＥＬＩＳＡ法 抗体をＰＢＳに溶解し、９６穴の平底ポリスチレン板の
それぞれの穴に１μｇ／１００μｌの量で加える。１時
間加温した後、自動板洗滌機［米国ヴァージニア州チャ
ンティリ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ）のダイナテック・ウォ
ッシ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　　Ｗａｓｈ）ＩＩ］を用い０
．０５％のトゥーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含むＰＢＳ
で３回板を洗滌する。各々の穴を２％ＰＳＡ［シグマ（
Ｓｉｇｍａ）］２００μｌで洗い出し、さらに１時間板
を加温する。穴に試験試料を加え、３０分間保温し、Ｐ
ＢＳで６回洗滌し、アルカリ性フォスファターゼが複合
化した山羊の抗マウスＩｇＧ　　Ｆ（ａｂ’）２［米国
カリフォルニア州サウス・サンフランシスコ（Ｓｏｕｔ
ｈ　　Ｓａｎ　　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）ザイメッド・ラ
ボラトリーズ（ｚｙｍｅｄ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）製］１００μｌを加える。３０分加温した後板を再
び洗滌し、ｐＨ１０．３のジエタノールアミン０．１モ
ル中にｐ−ニトロフェニルフォスフェート（１ｍｇ／ｍ
ｌ、シグマ社）１００μｌを含む液を発色基質として加
える。最後に波長４０５ｎｍにおいてＥＬＩＳＡ板読取
り機により発色応答を光学密度（ＯＤ）として記録する
。

【００４０】実施例　　６ ソマトトロピン結合蛋白質に対する単クローン性抗体の
特異的結合に関するウェスターン・ブロット試験実施例
３記載の大腸菌またはこれから精製したソマトトロピン
結合蛋白質使用してウェスターン・ブロット試験を行い
、単クローン性抗体とソマトトロピン結合蛋白質との特
異的相互作用を決定する。これらの菌から得られたラッ
トのソマトトロピン結合蛋白質は２６２個のアミノ酸を
含んでおり、見掛けの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ
れば３０Ｋｄである。ソマトトロピン結合蛋白質を含む
大腸菌溶解物を４０ミリモルのｐＨ７．４のトリス、５
ミリモルのＥＤＴＡ、３％のＳＤＳ、１μｌの２−メル
カプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中
で煮沸し、１５％ポリアクリルアミド上で電気泳動にか
ける。次いでこのゲルをイモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ）−Ｐ濾紙［ミリポア（ＭＩｌｌｉｐｏｒｅ）］上で
電気的にブロッティングする。ブロットを結合蛋白質の
カルボキシル末端の１７個のアミノ酸に対してつくられ
た単クローン性抗体ＧＨＢＰ−４．３で検出する。図１
に示したように、この単クローン性抗体は大腸菌抽出物
中のソマトトロピン結合蛋白質を特異的に認識する（レ
ーン２）。この単クローン性抗体はソマトトロピン結合
蛋白質の塩基配列の方向が反対の形質発現プラスミドを
含む大腸菌蛋白質とは相互作用しない（このような種は
ソマトトロピン結合蛋白質の形質発現を行うことはでき
ない）（レーン１）。

【００４１】実施例　　７ ＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体によるソマトトロピ
ン結合蛋白質の同定 ＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体を用いてラットの循
環系のソマトトロピン結合蛋白質を同定する。このため
にラットの血液５ｍｌを直接１ｍｌの０．５モルＥＤＴ
Ａ中に抜き出してラットの血漿を調製した。１μｌの血
漿を２０μｌの試料緩衝液（５０ミリモルのｐＨ７．４
のトリス、５ミリモルのＥＤＴＡ、３％のＳＤＳ、１μ
ｌの２−メルカプトエタノールを含む）中で変性し、３
分間加熱する（１００℃）。次いで血漿の試料を１５％
不連続ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動にかけ、
ゲル上で分離された蛋白質をイモビロン−Ｐ濾紙上で電
気的にブロッティングする。ブロットをＧＨＢＰ−４．
３単クローン性抗体（１０ミリモルのｐＨ７．４のトリ
ス、１５０ミリモルのＮａＣｌ、５％脱脂牛乳および０
．０５％ナトリウムアジド中に腹水５０μｌを含む）と
共に２時間室温で保温し、１０ミリモルのトリス、１５
０ミリモルのＮａＣｌ中で洗滌し、さらに２時間アルカ
リ性フォスファターゼでラベルした抗マウス抗体に露出
させる。再びブロットを洗滌し、１００ミリモルのＮａ
ＨＣＯ３および１ミリモルのＭｇＣｌ２２中に基質のニ
トロブルー塩化テトラゾイウム（ＮＢＴ）および５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェートｐ−
トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を含む液でアルカリ性フォス
ファターゼ反応に対して発色させる。図２に示すように
（レーン１）、この抗体は分子量４８Ｋｄの蛋白質と特
異的に反応する。この蛋白質の大きさは、その芯の蛋白
質（翻訳後変性物を含まない）の分子量の計算値が３０
Ｋｄであり、翻訳後変性物としての炭水化物鎖を含んで
いることを考えれば、ソマトトロピン結合蛋白質に期待
される範囲である。これに対しソマトトロピン・レセプ
ターの分子量は約１２０Ｋｄである（９）。

【００４２】種々の動物のＥＤＴＡで処理した血漿につ
いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験およびウェスターン・ブロッ
ト試験を行ってＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体と他
の動物のソマトトロピン結合蛋白質との交叉反応性を解
析した。ブロットを単クローン性抗体と共に加温した後
、上記のようにアルカリ性フォスファターゼでラベルし
た山羊の抗マウス抗体と共に保温する。この実験の結果
を図２に示す。この単クローン性抗体はラット、マウス
および豚のソマトトロピン結合蛋白質と反応するが、牛
、羊、鶏および人のソマトトロピン結合蛋白質とは反応
しない。この実験はまたマウスのソマトトロピン結合蛋
白質の見掛けの分子量が４８Ｋｄであり、豚のソマトト
ロピン結合蛋白質の見掛けの分子量が６０Ｋｄであるこ
とを示している。

【００４３】ＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体がソマ
トトロピン・レセプターと結合しないことを示すために
、クローン９の細胞、即ちソマトトロピン・レセプター
を含まないことが示されているラットの肝癌細胞の細胞
溶解物（米国メリーランド州ロックヴィル、アメリカン
・タイプ・カルチャー・センター）に対しＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ試験およびウェスターン・ブロット試験を行った。 この単クローン性抗体はソマトトロピン・レセプターと
交叉反応を行わない。

【００４４】実施例　　８ ソマトトロピン結合蛋白質とＧＨＢＰ−４．３単クロー
ン性抗体との免疫沈澱 ５０μｌのＥＤＴＡで処理したラットの血漿を、１５０
ミリモルのＮａＣｌ、５ミリモルのＥＤＴＡ、０．５％
のＮＰ−４０（洗剤）、３％のＢＳＡおよび０．３μＣ
ｉの１２５Ｉでラベルした牛のソマトトロピン（５ｎｇ
）を含むｐＨ７．５の２５ミリモルのトリス緩衝液１ｍ
ｌと共に一晩４℃に保つ。ＧＨＢＰ−４．３抗体を加え
、室温でさらに１時間に亙りこの複合物全体をフォルマ
リンで固定したスタフ（Ｓｔａｐｈ）Ａバクテリアで沈
澱させる。複合体を０．５％のＮＰ−４０、ｐＨ７．５
のトリス２５ミリモル、１５０ミリモルのＮａＣｌおよ
び５ミリモルのＥＤＴＡ中で３回洗滌し、２Ｘ　　ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で３分間解離させる。この試
料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動にかけ、ゲル
を固定し、乾燥し、最後にオートラジオグラフィーのＸ
線フィルムに露出させる。

【００４５】図３に示すように、放射性の複合体をＧＨ
ＢＰ−４．３単クローン性抗体で免疫沈澱させた後、１
２５Ｉでラベルしたソマトトロピンに対応する２０Ｋｄ
の蛋白質バンドが観測され、このことは１２５Ｉ−ソマ
トトロピンと結合するソマトトロピン結合蛋白質を特異
的に認識することを示している（レーン３）。ＳＰ２／
０親ラインおよび通常のマウスから誘導された抗体を対
照として使用した場合、蛋白質バンドは観測されないか
または非常に弱い。ラベルしないソマトトロピンを過剰
に加えると、放射性のソマトトロピンが消失し、このこ
とはソマトトロピンの免疫沈澱がソマトトロピン結合蛋
白質の存在に依存していることを示している。従ってＧ
ＨＢＰ−４．３単クローン性抗体はソマトトロピンと複
合体を形成した後もソマトトロピン結合蛋白質と特異的
に結合する。放射性のソマトトロピンと同時に単クロー
ン性抗体を加えてもこの免疫沈澱のパターンは変わらず
、この抗体が結合蛋白質に対するソマトトロピンの結合
部位で妨害されないことを示唆している。

【００４６】実施例　　９ 成長に対するＧＨＢＰ−４．３の効果 生体中で単クローン性抗体ＧＨＢＰ−４．３の効果を研
究するために、受動免疫法を用いた。抗体を直接若いマ
ウスに注射し、体重の増加を測定して成長度を追跡した
。１群を１０匹のマウスとし、三つの群に次のような処
理を行った。

【００４７】１．マウス１匹当たりＧＨＢＰ−４．３単
クローン性抗体を１ｍｇ含む腹水２００μｌを注射。

【００４８】２．マウス１匹当たり多クローン性抗体を
１ｍｇ含む腹水２００μｌを注射（対照）。

【００４９】３．未処理の対照。

【００５０】各群毎の平均体重増加に関するデータを表
２に示す。

【００５１】

【表２】 これらのデータは１４日の終わりにおいてＧＨＢＰ−４
．３単クローン性抗体で処理したマウスは通常のマウス
の抗体で処理したマウスまたは未処理のマウスに比べへ
平均体重増加が大きいことを示している。ＧＨＢＰ−４
．３単クローン性抗体で処理したマウスと未処理のマウ
スとの比較を図４に示す。

【００５２】図５に示した同様な実験においては、ＧＨ
ＢＰ−４．３単クローン性抗体とソマトトロピンとを組
み合わせて使用し、体重増加率に対する抗体の効果を研
究した。それぞれ４匹のマウスから成る群を、マウス１
匹当たり１００μｇのＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗
体と１０μｇのマウス・ソマトトロピン、１０μｇのマ
ウス・ソマトトロピンだけ、または１００μｇの対照マ
ウスＩｇＧで処理した。図５に示すように、１００μｇ
のＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体と１０μｇのマウ
ス・ソマトトロピンとで処理したマウスは対照マウスま
たはソマトトロピンだけで処理したマウスに比べ体重増
加の割合が速かった。

【００５３】実施例８および９の実験はソマトトロピン
結合蛋白質を投与すると体重増加率に著しい影響がある
ことを強く示唆している。

【００５４】［文献］１．ジェー・ピー・ハフス（Ｊ．
Ｐ．Ｈｕｇｈｅｓ）およびエイチ・ジー・フリーセン（
Ｈ．Ｇ．Ｆｒｅｉｅｓｅｎ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．、４７巻４６９〜４８２頁（１９８５年）。

【００５５】２．エス・アイ・イマー（Ｓ．Ｉ．Ｙｍｅ
ｒ）およびエー・シー・ヘリントン（Ａ．Ｃ．Ｈｅｒｉ
ｎｇｔｏｎ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．、４１巻１５３〜１６１頁（１９８５年）。

【００５６】３．ジー・バウマン（Ｇ．Ｂａｕｍａｎｎ
）その他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．、６
２巻１３１〜１４１頁（１９８６年）。

【００５７】４．エー・シー・ヘリントン、その他、Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７７巻１８１７〜１８２
３頁（１９８６年）。

【００５８】５．アール・エシェット（Ｒ．Ｅｓｈｅｔ
）その他、ＩｓｒａｅｌＪ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、２０巻
８〜１３頁（１９８５年）。

【００５９】６．アール・バーナード（Ｒ．Ｂａｒｎａ
ｒｄ）およびエム・ジェー・ウォーターズ（Ｍ．Ｊ．Ｗ
ａｔｅｒｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２３７巻８８５
〜８９２頁（１９８６年）。

【００６０】７．ジー・バウマン、その他、Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｅｎｄｏ．Ｍｅｔａｂ．、６５巻８１４〜８１６頁
（１９８７年）。

【００６１】８．ダヴリュー・エイチ・ダハデイ（Ｗ．
Ｈ．Ｄａｕｇｈａｄａｙ）およびビー・トリヴェディ（
Ｂ．Ｔｒｉｖｅｄｉ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．、８４巻４６３６〜４６４０頁（１９８７年
）。

【００６２】９．ディー・ダヴリュー・リュング（ｄ．
Ｗ．Ｌｅｕｎｇ）その他、Ｎａｔｕｒｅ、３３０巻５３
７〜５４３頁（１９８７年）。

【００６３】１０．ジー・バウマンおよびエム・エー・
ショウ（Ｍ．Ａ．Ｓｈａｗ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５２巻５３７〜
５７８頁（１９８８年）。

【００６４】１１．エス・エー・スペンサー（Ｓ．Ａ．
Ｓｐｅｎｃｅｒ）その他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
２６３巻７８６２〜７８６７頁（１９８８年）。

【００６５】１２．　　米国特許第４，８５７，６３７
号。

【００６６】１３．ビー・トリヴェディおよびダヴリュ
ー・エイチ・ダハデイ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、
１２３巻２２０１〜２２０６頁（１９８８年）。

【００６７】１４．ダヴリュー・アール・バウムバッハ
（Ｗ．Ｒ．Ｂａｕｍｂａｃｈ）、Ｇｅｎｅｓ　　＆　　
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、３巻１１９５〜１２０５頁（
１９８９年）。

【００６８】１５．ダヴリュー・シー・スミス（Ｗ．Ｃ
．Ｓｍｉｔｈ）その他、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．、３巻９８
４〜９９０頁（１９８９年）。

【００６９】１６．ジェー・ジェー・ダン（Ｊ．Ｊ．Ｄ
ｕｎｎ）およびエフ・ダヴリュー・スタディア（Ｆ．Ｗ
．Ｓｔｕｄｉｅｒ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６
巻４７７〜５３５頁（１９８３年）。

【００７０】１７．エー・エイチ・ローゼンバーグ（Ａ
．Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）その他、Ｇｅｎｅ、５６巻
１２５〜１３５頁（１９８７年）。

【００７１】１８．エル・エス・マシューズ（Ｌ．Ｓ．
Ｍａｔｈｅｗｓ）その他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
２６４巻９９０５〜９９１０頁（１９８９年）。

【００７２】１９．エフ・ダヴリュー・スタディアおよ
びビー・エー・モファット（Ｂ．Ａ．Ｍｏｆｆａｔｔ）
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８９巻１１３〜１３０頁
（１９８６ｎｅｎ）。

【００７３】２０．ビー・エー・モファットおよびエフ
・ダヴリュー・スタディア、Ｃｅｌｌ、４９巻２２１〜
２２７頁（１９８７年）本発明の主な特徴及び態様は次
の通りである。 １．或る動物種のソマトトロピン結合蛋白質に結合する
が、該種のソマトトロピン・レセプターには結合しない
抗体。

【００７４】２．該抗体が単クローン性抗体である上記
第１項記載の抗体。

【００７５】３．ラットのソマトトロピン結合蛋白質の
カルボキシル末端から成り、該カルボキシル末端はＧｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−
Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−
Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａ
ｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、或いはそれと抗原的に同等な塩
基配列をもつペプチドに対する抗体。

【００７６】４．該抗体が単クローン性抗体である上記
第３項記載の抗体。

【００７７】５．ＧＨＢＰ−４．３の記号をもつ単クロ
ーン性抗体。

【００７８】６．或る動物種のソマトトロピン結合蛋白
質に結合するが、該種のソマトトロピン・レセプターに
は結合しない抗体を生産するハイブリドーマ。

【００７９】７．ＧＨＢＰ−１、ＧＨＢＰ−２、ＧＨＢ
Ｐ−３、ＧＨＢＰ−４、ＧＨＢＰ−４．３、ＧＨＢＰ−
５、ＧＨＢＰ−６、ＧＨＢＰ−７、ＧＨＢＰ−８、ＧＨ
ＢＰ−９、ＧＨＢＰ−１０、ＧＨＢＰ−１１、ＧＨＢＰ
−１２、ＧＨＢＰ−１３およびＧＨＢＰ−１４から成る
群から選ばれる上記第６項記載のハイブリドーマ。 ８．（ａ）ウェスターン・ブロット法または（ｂ）免疫
沈澱法を用いる放射線免疫検定法のいずれかから成り、
或る動物種のソマトトロピン結合蛋白質に結合するが、
該種のソマトトロピン・レセプターには結合しない抗体
を使用する該動物種のソマトトロピン結合蛋白質の濃度
を決定する方法。

【００８０】９．成長を促進するのに効果的な量の或る
動物種のソマトトロピン結合蛋白質に結合するが、該種
のソマトトロピン・レセプターには結合しない抗体、お
よび薬物的に許容される担体を含有して成る薬物組成物
。

【００８１】１０．該抗体が単クローン性抗体である上
記第９項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＧＨＢＰ−４．３抗体とソマトトロピン
結合蛋白質との特異的な相互作用を示す。形質発現プラ
スミドｐＥＴ−７．６ｍによるラットのソマトトロピン
結合蛋白質の合成用の大腸菌の細胞抽出物を１５％ポリ
アクリルアミド・ゲル上で電気泳動にかけ、これを濾紙
に移し、ＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体で検出した
後、１２５ＩでラベルしたプロテインＡ（ＩｇＧと結合
するスタフＡバクテリア蛋白質）で検出してオートラジ
オグラフィーにかける。レーン２はラットのソマトトロ
ピン結合蛋白質の形質発現をする大腸菌細胞からの蛋白
質を含んでいる。レーン１は反対の向きをもったラット
のソマトトロピン結合蛋白質塩基配列をもつ形質発現プ
ラスミドによる大腸菌抽出物を含んでいる。図に示すよ
うに、正しい向きのラットのソマトトロピン結合蛋白質
塩基配列をもつバクテリアはＧＨＢＰ−４．３単クロー
ン性抗体で認識される蛋白質の形質発現を行うことがで
き、これは３０Ｋｄの所に移動する。右側に分子量のマ
ーカーが示されている（４３Ｋｄ−卵アルブミン；２９
Ｋｄ−カルボン酸アンヒドラーゼ；１８Ｋｄ−β−ラク
トグロブリン）。

【図２】図２には血液中におけるＧＨＢＰ−４．３単ク
ローン性抗体とソマトトロピン結合蛋白質との特異的な
相互作用が示されている。各動物から得た血漿１μｌを
１５％ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動にかけ、
これをイモビロン−Ｐ濾紙（ミリポア）上でブロッティ
ングする。ブロットをＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗
体で、次いでアルカリ性フォスフォターゼでラベルした
抗マウス二次抗体で検出した。次にウェスターン・ブロ
ット法によりアルカリ性フォスフォターゼ活性を試験し
た。図示のようにＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体は
ラット（レーン１）、豚（レーン４）およびマウス（レ
ーン６）の血漿中でソマトトロピン結合蛋白質を認識す
る。血漿中にマウスのイムノグロブリンが存在すると、
５５Ｋｄのところに余分のバンドが現れ、イムノグロブ
リンの二次抗体との相互作用を示す。右側に分子量のマ
ーカーを示した（８４Ｋｄ−フルクトース−６−フォス
フォターゼ；５８Ｋｄ−ピルヴェート・キナーゼ；４８
Ｋｄ−フマラーゼ）。

【図３】図３はソマトトロピン結合蛋白質／ソマトトロ
ピン複合体に対するＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体
の特異的な結合を示している。ラットのソマトトロピン
結合蛋白質と１２５Ｉ−ソマトトロピンとの複合体をＧ
ＨＢＰ−４．３単クローン性抗体およびフォルマリンで
固定したスタフＡで免疫沈澱させた。この複合体を試料
緩衝液中で解離させ、１５％ポリアクリルアミド・ゲル
上で電気泳動にかけた。次いでゲルを固定し、乾燥し、
オートラジオグラフィーにかけた。オートラジオグラム
は沈澱した放射性のソマトトロピンを示す。この図はＳ
Ｐ２／０抗体（レーン１）、ＳＰ２／０抗体と過剰のラ
ベルしないソマトトロピン（レーン２）、ＧＨＢＰ−４
．３単クローン性抗体（レーン３）、およびＧＨＢＰ−
４．３単クローン性抗体と過剰のラベルしないソマトト
ロピン（レーン４）によるソマトトロピン結合蛋白質／
ソマトトロピン複合体の免疫沈澱を示す。この図におい
てソマトトロピンは“ＧＨ”で示されている。

【図４】図４では二つの別々の実験におけるＢａｌｂ／
Ｃマウスの成長に対するＧＨＢＰ−４．３単クローン性
抗体の効果が示されている。生後３週間のＢａｌｂ／Ｃ
マウスに、１ｍｇのＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体
を注射するか（△−△）、また未処理の対照として保持
し（●−●）、２週間に亙りその体重増加を監視した。 各点は１０匹のマウスの平均体重増加を示す。対照のマ
ウスＩｇＧのデータは図４には含まれていないが、実施
例９に示されている。

【図５】図５では二つの別々の実験におけるＢａｌｂ／
Ｃマウスの成長に対するＧＨＢＰ−４．３単クローン性
抗体の効果が示されている。生後３週間のマウスを１０
０μｇのＧＨＢＰ−４．３単クローン性抗体＋１０μｇ
のソマトトロピン（●−●）、または１００μｇの対照
マウスＩｇＧ（△−△）、或いは１０μｇのソマトトロ
ピンのみ（○−○）で処理しその体重増加を３５日間監
視した。各点は４匹のマウスに対する平均体重増加を示
す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　或る動物種のソマトトロピン結合蛋白
   質に結合するが、該種のソマトトロピン・レセプターに
   は結合しないことを特徴とする抗体。
2. 【請求項２】　　ラットのソマトトロピン結合蛋白質の
   カルボキシル末端から成り、該カルボキシル末端はＧｌ
   ｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ
   −Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−
   Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−ＬｅｕまたはＧｌｙ−Ｔｈｒ
   −Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−
   Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ａ
   ｓｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、或いはそれと抗原的に同等な塩
   基配列をもつことを特徴とするペプチドに対する抗体。
3. 【請求項３】　　ＧＨＢＰ−４．３の記号をもつことを
   特徴とする単クローン性抗体。
4. 【請求項４】　　或る動物種のソマトトロピン結合蛋白
   質に結合するが、該種のソマトトロピン・レセプターに
   は結合しない抗体を生産することを特徴とするハイブリ
   ドーマ。
5. 【請求項５】　　（ａ）ウェスターン・ブロット法また
   は（ｂ）免疫沈澱法を用いる放射線免疫検定法のいずれ
   かから成り、或る動物種のソマトトロピン結合蛋白質に
   結合するが、該種のソマトトロピン・レセプターには結
   合しない抗体を使用することを特徴とする該動物種のソ
   マトトロピン結合蛋白質の濃度を決定する方法。
6. 【請求項６】　　成長を促進するのに効果的な量の或る
   動物種のソマトトロピン結合蛋白質に結合するが、該種
   のソマトトロピン・レセプターには結合しない抗体、お
   よび薬物的に許容される担体を含有して成ることを特徴
   とする薬物組成物。