JPH07501702A

JPH07501702A - 精製された可溶性ｂ型及びａ型ヒト血小板−誘導成長因子レセプタ断片の精製方法

Info

Publication number: JPH07501702A
Application number: JP5510347A
Authority: JP
Inventors: ウルフ，デビッド; トムリンソン，ジェームズ　イー．
Original assignee: コア　セラピューティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 1995-02-23
Also published as: CA2124957A1; RU94046397A; WO1993011223A1; AU675924B2; NO942032D0; NO942032L; PL171788B1; NZ246256A; EP0619836A4; AU3236493A; EP0619836A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】７、細胞外領域配列がＢ型又はＡ型ヒトＰＤＧＦ−Ｒ配ｌ１１である、請求項１に記載の細胞系。

８、断片がＢ型及びＡ型の両方のヒトＰＤＧＦ−Ｒ配列をもつ、請求項１に記載の細胞系。

９、細胞が以下の：ｄ）　ＰΔ１０Ｉ：ｅ）　ＰΔ１０２；及びｆ）　ＰΔ１０３から成る群から選ばれているプラスミドを含んで成る、請求項１（こ記載の細胞系。

１０、細胞系が以下の：ａ）　ＰΔｌ−５：ｂ＞　ｐΔαＲＦ；及びｃ）　ａ）又はｂ）の子孫から成る群から選ばれている、請求項１に記載の細胞系。

１１、細胞系が、断片を翻訳後に修飾する外因性酵素をさらに含んで成る、請求項１に記載の細胞系。

１２、酵素が解糖酵素である、請求項！■に記載の細胞系。

１３、請求項１に記載の細胞系から作られた蛋白を含んで成る組成物。

１４、以下の段階：ａ）　ＰΔｌ−５及びＰΔαＲＦの群から選ばれた細胞系を増殖させ：そして、ｂ）その細胞系からその細胞生成物を単離すること、を含んで成る、ヒト血小板 −誘導成長因子レセプタ結合活性を示す可溶性ポリペプチドの生産方法。

１５、細胞生成物が細胞培養基中に分泌される、請求項１４に記載の方法。

１６、細胞生成物が培地からアフィニティー・クロマトグラフィーにより単離される、請求項１４に記載の方法。

１７．アフィニティー・クロマトグラフィーがモノクロナール抗体免疫−アフィニティー試薬を含んで成る、請求項１４に記載の方法。

１８、モノクロナール抗体試薬が以下の：ａ）　ＩＣ７０５及びｂ）　ＩＨ２Ｈ８から成る群から選ばれている、請求項１５に記載の方法。

１９、可溶性ヒト血小板−誘導成長因子レセプタ・ペプチドの精製方法であって、以下の段階：ａ）ｉ）ＰΔｌ−５：及びｉｉ）　ＰΔαＲＦから成る群から選ばれた細胞系を増殖させ：ｂ）その細胞から細胞培養基を分離し：そして、ｃ）　ｉ）　ＩＣ７０５：及び ■）ＩＨ２Ｈ８から成る群から選ばれている抗体を使用して免疫アフィニティー・クロマニドグラフィーによりその培地からそのペプチドを単離すること、を含んで成るような方法。

２０、ペプチドが実質的に純粋な形態にある、請求項１９に記載の方法。

明細書精製された可溶性Ｂ型及びＡ型ヒト血小板−誘導成長因子レセプタ断片の精製方法発明の背景本発明は、一般的に、可溶性血小板−誘導成長因子レセプタ断片の製造方法に関する。さらに特に、それは、リガンド結合作用を示す精製された血小板−誘導成長因子レセプタ可溶性断片のさらに高く効率的な生産を可能にする、細胞系及びそれらの細胞系を使用する方法を、提供する。

ポリペプチド成長因子は、細胞原形質膜上に在るレセプタに特異的に結合することによりその細胞に対し作用する有糸分裂誘発物質である。この血小板−誘導成長因子（ＰＤＧＦ）は、生化学応答、例えば、イオン束の変更、各種キナーゼの活性化、細胞形状の変更、様々な遺伝子の転写、及びリン脂質代謝と関連する酵素活性の調節の、反ｒｃｈ　６５：１０７５−１０６５を参照のこと。この血小板−誘導成長因子は、膜結合レセプタ、すなわち、血小板−誘導成長因子レセプタ（ＰＤＧＦ−Ｒ）と、相互作用するポリペプチド因子である。このレセプタは、ＰＤＧＦリガンドに結合する結合部位をもつ。

特定の医学的症状が、異常なレセプターリガンドの相互作用から生じる。結合の特異性は、ある結合パートナ−の使用が、他の存在を定性的又は定量的に測定し、そして異常な相互作用を検出することを、可能にする。これらの診断試薬は、有用であろう。

血小板−誘導成長因子のためのレセプタは、様々な細胞において３−４１８；　Ｈａｉｄａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９９０）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５：１８７４１−１８７４４を参照のこと。

その他も、細胞内でＰＤＧＦレセプタ又はそれらの断片の発現を報告しているけれとも、リガンド結合断片は、すべて、そのレセプタの殆ど無傷の細胞外領域の内にあった。多くの場合に、より小さく且つ可溶性のリガンド結合セグメントが有用であろう。例えば、可溶性リガンド結合断片は、ＰＤＧＦリガンドの効果を調節するための拮抗物質として役立つことができる。元のレセプタよりも可溶性且つ小さな拮抗物質が、有用であろう。小さく可溶性の拮抗物質の生理学的な生物学的利用能は、天然の無傷のレセプタよりも良好であろう。

無傷のレセプタは、膜結合蛋白であり、そして典型的に、血液中で循環しないであろう。また、可溶性拮抗物質断片、例えば、生来のレセプタ結合部位よりも短いものは、典型的には、より低いコストで、より多量に、製造されるであろう。

その上、より小さな可溶性ペプチドは、さらに、遠くの且つ循環妥協の体の領域に達することができるようである。

このように、精製リガンド結合領域の製造のための、及びＰＤＧＦ結合活性をもつ可溶性分子のための。高効率の手段についての必要性が存在する。それぞれのレセプタの無傷の細胞外領域よりも小さな断片が、好ましい。ＰＤＧＦリガンド結合蛋白、例えば、必須の（ｃｒｉｔｉｃａｌ）リガンド結合領域を含む断片、の経済的且つ高効率の製造が、非常に好ましい。本発明は、これらの及び他の必要なものを提供する。

発明の要約本発明は、血小板−誘導成長因子（ＰＤＧＦ）に結合する可溶性ペプチドの高効率製造のための細胞系及び方法を提供する。ＰＤＧＦレセプタ（ＰＤＧＦ−Ｒ）の細胞外領域の断片を分泌する細胞系、又はＰＤＧＦリガンド結合の活性を示す関連ペプチドが、記載されている。これらの断片の多くは、リガンド結合アフィニティー又は特異性に貢献しない細胞外領域セグメントの欠失から生じる。また、例えば、ヒト・レセプタからの、ＰＤＧＦ−結合ペプチドを製造するためのこれらの細胞系の使用方法をも、提供する。

図面の簡単な説明図１は、可溶性ｈＰＤＧＦ−Ｒ細胞外ドメインのオリゴヌクレオチド特これらの構築物の多くが、可溶性ペプチドであろうし、又はそのように修飾されることができる。

使用する略語は：ＰＲ＝　ＰＤＧＦ−Ｒ：　無傷Ｐ　＝　ＰＤＧＦ−Ｒ：　細胞外領域ＴＭ＝）ランスメンプランＫ　＝　キナーゼＳ　＝　シグナル配列である。

図２は、様々な欠失ポリペプチドを発現させるために使用されたｐｃＤＬ−３α ２９６から得られたプラスミドの構造について説明している。

図３は、ｐｃＤＬα２９６から得られたプラスミドｐＢＪΔの構造につい４７２（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

１、　ｐｃＤＬ−３Ｒａ　２９６をＸｈｏｌｌ：：より切断する。

２、　ポリリンカー（Ｘｈｏ　Ｉ−Ｘｂａ　［−３ｆ　ｉ　ｌ−Ｎｏ　ｔ　Ｉ− ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ−Ｈｉｎｄ　Ｉ　ｒ　ｌ−Ｃ１ａｌ−Ｓａｌ　Ｉ）を上記Ｘｈｏ　Ｉ切断ベクター内に挿入する。

３、　Ｓａｌ［は、Ｘｈｏ１部位と互換性であり；そしてＳａｌ［とＸｈｏ　［部位との両方を生成する。

４、　ＳＶ４０１６ｓスプライス部位（ｓｐｌｉｃｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎ）は、もはや存在しない。

好ましい態様の説明本発明に従って、血小板−誘導成長因子（ＰＤＧＦ）に結合する可溶性ポリペプチドを作るための新たな細胞及びこのような断片を含んで成る組成物を提供する。対象の細胞は、所望のポリペプチド断片をエンコードしている核酸配列を含む。この細胞は、この核酸を発現し、これにより、大量の断片を生産するであろう。好ましい態様においては、この断片は、普通には、その培地中に分泌され、そして精製のために利用できる。この組成物は、アフィニティー及び特異性により血小板−誘導成長因子（ＰＤＧＰ）に特異的に結合することができる。

このポリペプチド断片は、診断及び治療的組成物としての用途があるであろう。

例えば、それらは、ＰＤＧＦリガンドの拮抗物質として、又はＰＤＧＦリガンドの定性的又は定量的検定のための試薬として、有用であろう。また、細胞は、例えば、精製工程のための出発物質の源として、大量の結合ポリペプチドの生産方法において使用されることもできる。

ＰＤＧＦ蛋白の同族体は、ＰＤＧＦリガンドといわれる。これらのリガンドは、典型的に、ＰＤＧＦ−Ｒの作用薬（ａｇｏｎｉｓｔｓ）である。ＰＤＧＰリガンドは、普通には、蛋白質であろうが、このレセプタとの相互作用において重要な構造的特徴を示す他の化合物であることができる。

１、　細胞系本発明の細胞は、典型的に、ＰＤＧＦリガンド結合ポリペプチドの安定的な培養生産が可能である。この細胞は、普通には、真核生物、例えば、容易に操作される細胞を提供する哺乳動物からのもの、であろう。げっ菌類細胞、例えば、ネズミ、ハムスター又はラット細胞が、好ましい態様である。ヒト蛋白に類似したやり方で可溶性蛋白を加工し又は修飾するするであろう細胞が、好まれるであろう。

グリコジル化及び他の蛋白修飾は、特に、重要である。

ある態様においては、細胞及びＤＮＡ構築物は、ヒト細胞系から得られる。特に好ましい細胞系は、ｐΔ１−５系であって、Ｂ型ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド断片を作るための発現ベクターを含むもの、並びにＰΔαＲＦ系であって、Ａ型ＰＤＧＦ−Ｒポリペプチド断片を作るための発現ベクターを含むもの、を含む。これらの細胞系のそれぞれは、適当なポリペプチド断片を効率良く発現する。

新規の細胞系であって血小板−誘導体成長因子レセプタの細胞外領域の断片を発現するためのものを、ここに、提供する。これらの断片は、部分的に、不測の性質を示す。なぜなら、ＰＤＧＦ−Ｒの細胞外領域の様々な部分の欠失がリガンド結合に影響を及ぼさないことが、発見されているからである。このレセプタの細胞外領域の特定のセグメントであってリガンド結合アフィニティー又は特異性に有意には貢献しないものが、同定されている。ＰＤＧＦ−Ｒ細胞外領域のこれらの無関係の（ｅｘｔｒａｎｅｏｕｓ）セグメントは、短縮されたポリペプチドの溶解性を増加させ、そしてその免疫原性を減少させる。その上、より高効率の生産及びより低コストは、かなりの商業的利点を提供す細胞生成物は、典型的には、ヒトＰＤＧＦレセプタ・ポリペプチドの可溶性断片であろう。Ｂ型又はＡ型レセプタ断片が、作られるであろう。それらのヒト起源のおかげで、ヒト患者に導入された断片は、より低い免疫原性を示し、そして有効な治療的試薬として作用しなければならない。天然のヒト蛋白へのそれらの相同性は、逆反応の見込み並びに治療的投与からの副作用を減少させるべきである。

リガンド結合領域（ＬＢＲｓ）は、ＰＤＧＦリガンドへの結合のアフィニティー又は特異性に対するそれらの効果により、部分的に、定められる。天然の、生来の完全長のＰＤＧＦ−Ｒは、約０．２ｍＭのＩＫｄをもつその天然リガンドと結合する。例えば、Ｄｕａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６６：４１３−４１８　（これを、引用により本明細書中に取り込む。

）を参照のこと。リガンド結合領域は、その存在がリガンド結合、例えば、絶対アフィニティー、及び特異性に有意に影響するポリペプチドのセグメントである。アフィニティーは、普通には、少なくとも約２の因子により、典型的には、少なくとも約４に因子により、さらに典型的には、少なくとも約８の因子により、そして好ましくは、少なくとも約１２以上の因子により、影響を受けるであろう。特異性についての測定は、定量化がより困難であるが、典型的には、類似の構造的特徴を示すリガンドに対する競合的アフィニティーを比較することにより、評価されるであろう。

本発明の哺乳類細胞の生産は、適当な発現ベクターにより多くの異なるタイプの哺乳類細胞を形質転換する標準的な方法により、行われることができる。例えば、Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７及び補遺用■ｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ／Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　（これを、引用によりここに本明細書中に取り込む。）を参照のこと。細胞の性質及び発現ベクターの性質の組み合わせの適当な選択は、所望の血小板− 誘導体成長因子レセプタ断片の改良された生産方法を導くことができる。

様々な方法が、高レベルにおける所定の蛋白を発現させるために利用されることができる。デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）を使用するものに類似の増幅方法を、利用できる。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：１７５０−１７５９を参照のこと。他のよく知られた高発現技術を、適用することもできるであろう。

これらの細胞は、特に、所望のレセプタ断片の高レベル発現について選択される。所望のペプチドをエンコードしているベクターによる形質転換から生じた細胞系が、提供される。形質転換細胞の異なる単離物は、分化した発現レベルをもたらす異なるコピー数及び組み込み部位をもつであろう。好ましい細胞株は、複数の位置及び数において組み込まれたＤＮＡをもち、特に高いレセプタ断片発現を提供するであろう。

この構築物に関して、ＰΔ１からＰΔ９まては、その発現ベクター内のクローニング部位中に挿入されたＢ型レセプタのＤＮＡ挿入をいう。ｐＢＪベクター内に挿入されたＰΔｌ構築物は、ｐＢＪＰΔと命名されている。このベクターは、特異的な細胞背景内に伝達され、そして様々なりローン形質転換細胞が、単離され、そして命名された、例えば、ｐΔ１−１　、　ｐΔ１−２等。それぞれのクローン単離物は、発現レベルにおいて得られたバラツキを伴って、配列コピー数及び組み込み部位により、他のものとは異なっている。このｐΔ１−５は、高レベルのＢ型リガンド結合領域を発現する特に有用な細胞系の態様である。

二のｐΔαＲＦ細胞系は、ヒトＡ型ＰＤＧＦレセプタの細胞外領域の全体を発現する。このエンコードＤＮＡ配列を、ｐＢＪ−１内に導入した。

ＣＨＯ細胞を、得られたＤＮＡ構築物により形質転換し、そしてｎｅｏプラスミドの発現、及びＡ型レセプタ断片の生産、の両方について選択した。

［１，方法本発明は、記載の断片の生産方法をも提供する。特に、細胞培養物を、記載の核酸を発現させるために利用することができる。普通には、断片が分泌され、それにより、そのレセプタ断片の精製をかなり単純化させる。この細胞は、破壊される必要がなく、そして細胞汚染は、最小化されている。したがって、細胞は、無傷の細胞の回収を可能にしながら、物理的技術により分泌生成物から分離されるてあろう。例えば、Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８７及び補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒ。

ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、特にセクション１０：Ｖｉｉを参照のこと。

普通には、可溶性蛋白は、分泌されるであろうし、そしてその培地から回収され易いであろう。様々な技術、例えば、濾過又は遠心分離が、その細胞からその培地中に可溶性蛋白を分離するために、使用されることができるてあろう。固体支持体に付着された細胞培養物は、濾過又は遠心分離によりその培地から容易に分離されるであろうし、一方、こわれやすい（ｆｒａｇｉ　Ｉｅ）細胞の懸濁培養物は、普通には、遠心分離に供されるであろう。

蛋白精製のための標準的な方法、例えば、クロマトグラフィー、遠心分離、沈降、電気泳動、免疫アフィニティー法、及び化学者及び酵素学者によく知られた他の技術が、使用されるであろう。例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；及びＡｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７及び補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒ。

ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇＹを参照のこと。

特に有用な精製試薬は、アフィニティー試薬、例えば、ＰＤＧＦ−リガンド・アフィニティー・カラム又は免疫アフィニティー・カラムのいずれかを含む。ＰＤＧＦ−リガンド・アフィニティー・カラムは、その蛋白生成物の単離及び固体支持体への付着のためのクローン化ＰＤＧＦ−リガンド配列又は同族体を使用して、容易に調製されることができる。免疫アフィニティー・カラムは、本発明の細胞、又は他の方法のいずれかにより作られたＰＤＧＦ−Ｒペプチドに対して作られた免疫グロブリンを付着させることにより、容易に調製されるであろう。

ＰＤＧＦ−レセプタ特異的モノクロナール抗体であって１０’　Ｍ−’、好ましくは１０’〜１ｏＩＯ１又はこれより強力な結合アフィニティーをもつものが、典型的に、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃ３ＨＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８８）：又はＧｏｄｉｎｇ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（２ｄ　ｅｄ、）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　（１９８６）　（これを、引用によりここに本明細書中に取り込む。）の中に記載されているような標準的な手順により、作られるであろう。

簡単に言えば、適当な動物が免疫化されるであろう。適当な期間の後、このような動物の牌臓細胞を切除し、そして個々の牌臓細胞を、典型的には、不朽化骨髄腫細胞と、融合させる。この融合生成物を、適当な選択条件に供し、そしてクローンに分離する。それぞれのクローンの上澄液を、抗原の所望の領域への結合に特異的な抗体についてテストする。

他の好適な技術は、抗原性ポリペプチドに対して、又はあるいは、ファージ又は類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択物に対して、リンパ球をインビトロにおいて晒すことを、含む。Ｈｕｓｅｅｔ　ａｔ、　（１９８９）”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｌａｒｇｅ　Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｌｉｂｒａｒｙ　。

６：１２７５−１２８１　：及びＷａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　”Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ａｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｒｎａｉｎｓ　５ｅｃｒｅｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、” 　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５４４−５４６；　（これらのそれぞれを、引用によりここに本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

本発明のポリペプチド及び抗体を、修飾を伴って又は伴わずに使用することができる。

適当なアフィニティー試薬、例えば、ＰＤＧＦ又は抗体は、普通には、固体支持体に付着されるであろう。典型的な支持体は、クロマトグラフィー・マトリックス、例えば、ＣＮＢｒ−セファロース、ガラス・ビーズ、及びプラスチックを含む。普通には、その付着は、共有結合であろうが、特定の条件下では、非共有結合による付着でも十分であることができる。

一旦、好適なアフィニティー試薬、又はアフィニティー試薬の組み合わせ物が調製されれば、可溶性断片を含む溶液は、特異的結合及び溶出のために、上記アフィニティー試薬を通過されるであろう。

これらの段階は、他の精製又は濃縮段階により散在されることができる。特に有用な断片の精製方法は、モノクロナール抗体を含んで成る免疫アフィニティー支持体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を取り込んでいる。レセプタ断片は、カラム内の固定化抗体に付着され、そして高いｐＨにおいて溶出される。また、例えば、アフィニティー除去技術による、同定された汚染成分の特異的除去のために取り込まれた追加の段階が在ることもできる。

単離された可溶性ペプチド断片を、様々な目的、例えば、診断試薬として又は治療的試薬のために、使用することができる。細胞は、動物、例えば、マウス中への伝達のために、又は適当な移植容器内での培養のために、有用であるであろうし、これらは、宿主生物への生成物の拡散を可能にするであろう。適当な細胞培養装置であって、治療的細胞生成物を分泌させるために患者に移植されることができるものは、例えば、米国特許第４．８０６．３５５号；第４．４０２．６９４号：及び第３．０９３．８３１号中に記載されている。

実施例一般的に、組換えＤＮＡ技術の標準的な技術は、様々な刊行物、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；　Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎλｔｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖａｔｓ、　１及び２並びに補遺：及びＷｕ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ　（ｅｄｓ、）（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、　５３　（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｐａｒｔ　Ｄ）；（これらのそれぞれを、引用により本明細書中に取り込む。）の中に記載されている。

１、　ヒト細胞外領域本ヒト・レセプタからの可溶性細胞外レセプタ断片の切り詰め又は欠失同族体の、構築、発現、及び生理学的効果の測定のための等価な技術を、核酸、ポリペプチド、及び本明細書中で提供する他の試薬を使用して、行うことができる。

Ａ、Ｂ型セグメントＢ型レセプタ・ポリペプチドの構築を、以下のように行った：ヒトＢ型ｈＰＤＧＦ−Ｒの３．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｆｌｌ　ｃＤＮＡ断片を、Ｍｎ２　ＭＰ１８のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ［［１部位にサブクローン化し、Ｍｐ１８ＰＲベクターを作った。技術については、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。サブクロ一二Ａ　７４：５４６３により記載されているように、制限酵素消化分析及びジデオキシ連鎖終止配列決定により行った。オリゴヌクレオチド特異的インビトロ突然変異誘発を、Ｋｕｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ６．１５４：３６７により記載された方法に従って行った。Ｍｐ１８ＰＲのオリゴヌクレオチド特異的インビトロ欠失突然変異誘発のための戦略を、図１中に概説する。

簡単に言えば、一連のオリゴヌクレオチドを、設計し、欠失突然変異誘発により可溶性Ｂ　繁ｈＰＤＧＦレセプタ細胞外領域のネスト・セット（ｎｅｓｔｅｄ　５ｅｔ）を作る。無傷のドメインを欠失させた。これらのドメインは、ドメイン１〜ドメイン５（ＤＩ−Ｄ５）と名付けられ、適当な真核生物発現系における発現に好適である。例示的な突然変異原性オリゴヌクレオチドを、表１中に列記する。これらのオリゴヌクレオチドは、様々に定められたＩｇＧ一様ドメインにわたるヒトＰＤＧＦレセプタの領域に相補的である。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４３：１５６４−１５７０　（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。

ヒｌ−Ｂ型ＰＤＧＦ−Ｒ突然変異誘発オリゴマー［これらは相補的であり＋３− ５゛について与えられていることに留意のこと。ＩＰΔ１コ曽−ＧＴＧ　ＴＧＡ　ＧＧＡ　ＡＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＣＣＣＣＧＡ−５’（配列番号ｌ）３　’−ＧＧＡ　ＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＧ　ＴＣＴ　ＡＧＴ　ＴＡＡ　ＴＣＧ　ＡＡＧ　ＧＡＣＡＴＣＣ（ＣＣＧＡ　Ｃ−５’（配列番号２）１’−ＴＡＧ　ＴＧＧ　ＣＡＣＣＡＡ　（ＴＣＴＣＧ　ＣＣＧ　ＡＴＣＧＭ　ＧＧＡ　ＣＡＴ　ＣＣＣＣＣＧ　ＡＣ−５’（配列番号３）（配列番号５）Ａ７３’−ＧＴＣＴＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＣＣＣＧ　ＧＡＣＣＡＧ　ＴＡＧ　ＴｒＧ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　ＣＡＣＴｒＧ　ＣＧＴ　ＣＡＣＧＴＣ−５f （配列番号７）Ｐ轟８３’−ＧＴＣＴＡＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣＣＣＧ　ＧｋＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＣＧＣＣＧＡＧ　（、ＡＣＣＣＴ　ＣＴＣＧＡＣ−５’（配列番号８）得られた構築物を、表２中に示すように標識する。アンチセンス・ストランドを、突然変異誘発の間じゆう使用した。ＰΔｉＰΔ２、ＰΔ３、ＰΔ４、及びＰΔ ５の突然変異誘発は、テンプレートとしてＭ１１１８ＰＲを使用し、そしてＰΔ ６、ＰΔ７、ＰΔ８、及びＰΔ９の突然変異誘発は、テンプレートとしてＭｐ１８　ＰΔ１を使用した。

ＰΔ１．４１塩基対オリゴマーは、Ｄ５のリジンａｓｓ　（Ｋ４１＠　）の後にＴＡＧ終止コドンを導入し、そしてトランスメンプラン（ＴＭ）並びに細胞間キナーゼ・ドメイン（に）の全体を除去し、Ｍｐ１８　ＰΔ１を作った（図１参照）。

表２ヒトＢ型ＰＤＧＦ−Ｒ発現構築物可溶性　膜結合ＢＪＰＲｐＢＪＰΔ１ｐＢＪＰΔ２ｐＢＪＰΔ３ｐＢＪＰΔ４ｐＢＪＰΔ５ｐＢＪＰΔ６ｐＢＪＰΔ７ｐＢＪＰΔ８ｐＢＪＰΔ９ヒトＰＤＧＦレセプタ構築物を、次に、Ｔａｋａｂｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８）　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８：４６６中に記載されているように、ｐＣＬ−ＳＲａ　２９６の誘導体を、ｐＢＪｌのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ［１１部位中にサブクローン化し、そして５ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、、　１：３２７により記載されているように、ｐｓＶ２ＮＥＯにより、チャイニーズ・ノλムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中に共同トランスフェクトした。図２及び図３を参照のこと。

精製され又は手積製された構築物の作用を、以下のように証明した：０．３３　ｎＭ　ＰＤＧＦ　ＢＢリガンドのサンプルを、以下の条件：１、　ヒトＰＤＧＦに対するポリクロナール抗体（この抗体は、ヒトＰＤＧＦ　ＡＡ　、　ＰＤＧＦ　ＢＢ及びＰＤＧＦ　ＡＢを認識する。）２、　１８ｎＭ（ＰＤＧＰ　ＢＢに対して６０倍のモル過剰）のヒトＢ型ＰＤＧＦレセプタ：３、　上記のレセプタ及び抗体がその中にあるリン酸塩バッファー生理食塩水；又は、４、　添加物無しで、リガンドそれ自体、の下で、４℃において１時間、前インキュベートする。

２連の実験において、０．３３０Ｍ　ＰＤＧＦ　ＡＡを、例えば、上記の２．３、及び４の上記の前インキュベーション条件の３つによりインキュベートする。

ヒトＢ型ＰＤＧ）ｌレセプタは、認めうるほとには、ＰＤＧＦＡＡを認識しないが、このリガンドは、Ｎｌ８３Ｔ３細胞からの細胞関連ヒトＡ型ＰＤＧＦレセプタを活性化し、そしてそれは、非特異的な一般的細胞効果、例えば、細胞毒性に対する、ヒトＢ型ＰＤＧＰレセプタの特異性及びＰＤＧＦ　ＢＢ−依存性活性化のための対照である。

前インキュベートされた材料は、０．５ｍｌの最終容量にあった。それらは、４ °Ｃまて冷やされた、血漿飢餓（静止（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ））Ｎｌ）１３Ｔ３細胞の集密層を含む６ｗｅ　ｌ　１組織培養皿の中のそれぞれの１つのｗｅｌｌ内に入れられた。この細胞及びインキュベーション混合物を、攪拌し、例えば、４°Ｃにおいて２時間、激しく揺すった。次に、それらを、４°Ｃのリン酸塩バッファー生理食塩水により２回洗浄した。４０μｌの、１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノ・メタン（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ６，８，２０（ｖ／ｖ）％　グリセロール、２（ｗ／ｖ）％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、２（ｖ／ｖ）％の２−メルカプトエタノール、及び０．００１％のブロモフェノール・ブルー（ＳＯＳサンプル・バッファーとして知られているもの）を、マイクロタイター・プレート毎に、添加し、その後、４０μｍの、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０，３０ｍＭピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、５ｍＭエチレンｂｉｓ（オキシエチレンニトリリオ）テトラ酢酸、１（ｗ／ｖ）％ＳＤＳ　、　１００ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、及び２００ＭＭナトリウム・ハナデートを、この細胞に添加した。この材料を、５分間沸騰させ、そして７．５％ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアミド・ゲルの単一ゲル・サンプルｗｅｌｌ上に供給した。細胞蛋白を、電気泳動により分離した。

分離された蛋白を、電気転移によりニトロセルロースに転移させ、そして得られた”ウェスタン・プロット”を、０．５（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、　ｐＨ７，５（ブロッキング・バッファーと命名）の３回の交換により、それぞれ室温において２０分間、インキュベートした。ブロッキング・バッファー中の１／１０００希釈のＰＹ２０（商業的に入手可能な、ホスホチロシン［ＩＣＮ］に対するモノクロナール抗体）を、４°Ｃにおいて一夜、このプロットと共にインキュベートした。このプロットを、ブロッキング・バッファー中でそれぞれ室温において２０分間、３回洗浄した。このプロットを、室温においてブロッキング・バッファー中で、４μＣｉ／４０ｍ１の１２５］−プロティンＡ　［Ａｍｅｒｓｈａｍ］と共にインキュベートし、そしてブロッキング・バッファー中でそれぞれ室温において２０分間、３回洗浄した。このプロットを、−７０’Ｃにおいて１つの増感スクリーンにより４８時間Ｘ−線フィルムに露出させ、そして標準的な試薬により顕色させた。

Ｂ、Ａ型配列同様の操作を、表３中に表す配列に基づく、突然変異原性オリゴスクレオチド又はＰＣＲプライマーを使用して行うことができる。適当なオリゴヌクレオチドを、使用して、表４中に列記するような。

Ａ型構築物を構築した。これらは、先に詳細に説明したＢ型検定において記載したような様々な構成により機能的にテストされることができる。

提案されたヒトＡ　ＷＰＤＧＦ−Ｒ突然変異誘発オリゴマー］これらは相補的であり、３−５°につぃて与えられていることに留意のこと。Ｊコ’−ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＧＡＣＧＣＡ　ＡＧＡ　ＣＴＴ　ＡＴｒ　ＧＡＣＣＧＣＣＴＡ　ＡＧＣＴＣＣＣＣ−５’（配列番号１０）コ’−ＴＡＡ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＧＴＡ　ＣＴＣＴＴｒ　ＣＣＡ　ＡＴＴ　ＧＡＣＣＧＣＣＴＡ　ＡＧＣＴＣＣＣＣ−５’（配列番号１２）（配列番号１４）ＰΔ１０６コ’−ＴＣＧ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＧＡＡ　ＣＴＡ　ＣＡＴ　ＣＧＧ　ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＣＣＴ−５f （配列番号１５）コ’−ＴＣＧ　ＧＡττＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＧＡＡ　ＣＴＣＧＡＣＣＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴｒ　ＴＡＣＣＴｒ　ＣＧＡ　ＧＡＡ−５f （配列番号１６）コ’　ＴＣＧ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＧＡＡ　ＡＡＧＴＡＡ　ＣＴＴ　ＴＡＧ　ＴｒＴ　ＧＧＧ　ＴＧＧ　ＡＡＧ−５’（配列番号１７）コ１−ＴＣＧ　ＧＡＴ　ＴＡＧ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＧＡＡ　ＡＧＴ　ＡＧＧ　ＴＡＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＣＣＡＧ−５’（配列番号１８）表４提案されたヒトＡ　ｆｆ１ＰＤＧＦ−Ｒ発現構築物タイプＡ可溶性　膜結合ＡＲ５ＲＣ，ＰＤＧＰプレート検定ポリスチレン・マイクロタイター・プレート（［ｍｍｕｌｏｎ、　ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、１００／Ｊ！ｌの２５ｍ＆Ｉ　Ｔｒｉｓ　、７５ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，７５中で１２〜１８時間、４°Ｃにおいてｗｅｌｌ当たり約１０−１００　ｎｇのこおの精製蛋白をインキュベートすることにより、（先に記載した）Ｂ型ヒトＰＤＧＦレセプタの細胞外領域により、被覆した。

この蛋白は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞内で発現され、そして０．２− １μｇ／ｍｌの濃度において、血清不含培地（Ｇｉｂｃｏ　ＭεＭα）中に、１５０−３００μｇ／ｍｌの全蛋白濃度を伴って、回収された。ヒトＢ型ＰＤＧＦレセプタ細胞外領域断片を濃縮し、そして１ｍＭ　ＰＭＳＦの存在中、４°Ｃにおいて（４８ｍｌ／ｈにおいて）小麦胚芽アグルチニシーセファロース上をその培地を通過させることにより、部分的に精製した。広く洗浄した後、蛋白を。０．３ＭＮ−アセチル−グルコサミン、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　＋００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、　ｐＨ７，４中に溶出させた。次に、この画分を、０．１５Ｍ２炭酸アンモニウムｐＨ７，９中で平衡化した５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００Ｈ５−２００ＨＲ（Ｐｈａｒに供給した。レセプタを含む両分（３− １０ｎｇ／μｍ）を、５ＯＳ−ＰＡＧＥにより並びにレセプタ外部領域からのドメイン１（ＤＩ）セグメントに対する、標準的な方法により作られたポリクロナール・ウサギ抗体によるウェスタン・プロッティングにより、検出した。これらの画分（３−１０ｎｇ／μｍ）を、先に記載したうようにマイクロタイターｗｅｌｌｓを被覆するために使用した。次に、このｗｅｌｌｓを、排液させ、２００ μｌのそれぞれの０，５％ゼラチン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ。

ＥＲＡグレード）、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　１００ｍＭ　ＮａＣｌ５ｐＨ７，４により１回濯ぎ、そして１５０μｌのこれと同一溶液と共に、２４°Ｃにおいて１−２時間インキュベートした。このｗｅｌｌを、排液させ、そして０．３％ゼラチン、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　１００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，４（それぞれ１５０μｌ）により濯いた。

９０μｌの０．３％ゼラチン溶液を、それぞれのｗｅｌｌ内に入れた（非特異的結合をテストするために使用したｗｅｌｌｓは、ちょうと８０μｌを、そして次いて、１０μｌの、０．３％ゼラチン溶液中のＯ，０１ｍｇ／ｍｌの非標識ＰＤＧＦを、受は取った。）　。ＰＤＧＦ　ＢＢ（Ａｍｇｅｎ）を、４°Ｃにおいて５２，０００　ＣＰＭ／ｎｇまで、ジーヨードＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により、ヨウ素化し、そして約４０．０００　ＣＰＭを、０．０２４％ＢＳＡ、０．４％ゼラチン、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、８０ｍＭ　ＮａＣｌ　、７０ｍＭ酢酸、ｐＨ７，４を含む１０μｌ中に、ｗｅｌｌ毎に添加した。このプレートを、２−３時間、２４°Ｃにおいてインキュベートし、その後、ｗｅｌｌｓを、それぞれ、０．３％ゼラチン、２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　１００ｍＭ　ＮａＣｌ、　ｐＨ７，４を含む１５０μｍにより、３回、洗浄した。

残りの結合放射能を、そのｗｅｌｌｓから２００μｌ１％ＳＤＳ、　０．５％ＢＳＡ中に可溶化し、そしてガンマ−カウンタ内で計数した。この非特異的結合は、１５０倍過剰の非標識ＰＤＧＰ　ＢＢ（Ａｍｇｅｎ）の存在中で測定され、そして全結合１２’　ｒ−ＰＤＧＦの約７％であった。

類似の検定が、Ａ型レセプタ断片を使用して可能であろう。しかしなから、Ａ型レセプタ断片は、Ｂ壓断片よりも他の蛋白の存在に対しより敏感であり、そしてゼラチンとは異なるｗｅｌｌ被覆試薬を必要とするよってある。ヘモグロビンが、１０００分の１においてそのバッファー中でゼラチンと置換される。

本検定は、５００ｎｇ／ｗｅｌ１未満のレセプタ可溶化形態を必要とし、これは、トランスフェクトＣＨＯ細胞内で発現され、そしてアフィニティー及びゲル・クロマトグラフィーにより、部分的に精製された。

ヨウ素化ＰＤＧＦ−ＢＢを使用して、１０ｐｇ未満のリガンドの特異的結合を、１００μｇ／ｗｅｌｌの検定容量中で検出することができる。４°Ｃにおいて、固定化レセプタへの”５Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢの結合は、飽和されることができ、そして高いアフィニティーを有する。５ｃａｔｃｈａｒｄ分析によるＫｄは、ｗｅｌｌ当たり１．８　Ｘ　１０１０部位を伴い約１ｎＭてあった。１００倍過剰の冷ＰＤＧＦ　ＢＢの存在中で測定された非特異的結合は、普通には、全結合の約５−１０％だけであった。また、この結合は、過剰の冷ＰＤＧＦ　ＡＡが”’ 　Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢ結合を阻害しない限り、そのリガンドの相同形態（ｉｓｏｆｏｒｍ）に特異的であった。さらに、溶液中のＢ型ＰＤＧＦレセプタの細胞外領域は、ヨウ素化ＰＤＧＦ　ＢＢの結合について、その固定化形態と、競合した（ＩＣ、。・５　ｎ　Ｍ）。４°Ｃにおいて４時間後に結合した１２’　Ｉ−ＰＤＧＦ　ＢＢ結合は、結合バッファー中で、はんのゆっくり解離することができるが（ｔ１７□＞　６ｈ）　、１５０倍過剰の非標識ＰＤＧＦ　ＢＢの添加により完全に置き替えられる（ｔ、７□〈１ｈ）。

Ｄ、　ｈＰＤＧＦ−Ｒ断片の精製Ｂ型ヒトＰＤＧＦ−Ｒ断片を、本明細書中に開示する細胞から調製した。

分泌された断片を、小麦胚芽アグルチニン・アフィニティー・クロマトグラフィーにより、そしてＳ−２００サイジング・クロマトグラフィーにより、精製した。純度を、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより評価し、そして約り０％純度であると推定した。

Ａ型ヒトＰＤＧＦ−Ｒ断片を、また、本明細書中に開示した細胞から調製した。

分泌断片を、イオン交換クロマトグラフィー、小麦胚芽アグルチニン・アフィニティー・クロマトグラフィー、及びＳ−２００サイジング・クロマトグラフィーにより、精製した。純度を、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより評価し、そして約り０％純度であると推定した。

Ｅ、　抗体の調製標準的な技術を使用して抗体を調製した。例えば、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　ＬＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、　（これらのそれぞれを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。ポリクロナール又はモノクロナール抗体のいずれかを、調製することができる。

２匹のＢａ１ｂ／Ｃマウスを、Ｂ型及びＡ型レセプタ断片のそれぞれに特異的なモノクロナール抗体の調製のために免疫化した。それぞれのマウスに、約１００ μｇの適当な精製レセプタ断片を、腹膜内に注射した。　それぞれのマウスを、約１００μｇのその蛋白によりブーストした。このマウスを殺し、そしてその牌臓を回収した。この牌臓を、破砕し、そして細胞を１、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）を使用して骨髄腫系Ｐ３Ｘと融合させた。細胞融合生成物を、限界希釈においてマイクロタイター・プレートに分配し、抗体産生ハイプリドーマをクローンとして単離した。抗体産生クローンを、酵素−結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）により、同定した。

選択された抗体産生クローンを、十分な数まで増殖させ、そしてマウス腹膜に導入し、腹水液を作った。典型的には、約１−１．５　ｘ　１０６細胞を、１ｍｌ中でマウスに注射した。腹水液からの抗体を、標準的な方法により精製した。

得られた抗体を、それらの結合特異性及び結合アフィニティーについて特徴付けした。クローンＩＣ７０５は、Ｂ型しセプタ断片結合特異性をもつ好ましいモノクロナール抗体であり；そしてクローンＩＨ−２Ｈ８は、Ａ型しセプタ断片結合特異性をもつ好ましいモノクロナール抗体である。

Ｆ、　細胞及び抗体を使用した断片の調製適当なレセプタ断片は、本明細書中に開示した細胞を使用して容易に調製されるであろう。例として、ＰΔＩ−５を、５リツター培養において中空ファイバー・バイオリアクター内で、増殖させた。

上澄培地を、遠心分離により取り出し、そして残存細胞を、濾過により除去した。この培地を、次に、限外濾過に供し、そして５０ｃｍモノクロナール抗体−Ｔｒｅｓｙｌアガロース免疫アフィニティー・カラム上を通過させた。二〇カラムを、洗浄し、そして結合レセプタ断片を、高ｐＨにより溶出させた。この精製可溶性レセプタ断片は、少なくとも約９７％の純度であり、細胞上澄液５リツターから約５０ｍｇの収量であった。

これらの研究は、他の成長因子による汚染を実質的に回避した成長因子調製物の利用により、並びに測定されたＰＤＧＦ応答のすへてかこの単一トランスフェクト・レセプタｃＤＮＡに起因することができるであろうところのレセプタ発現系の使用により、可能となった。

本明細書中の刊行物及び特許出願のすべてを、あたかも、個々の刊行物及び特許出願のそれぞれが引用により取り込まれることを示されるのと同じ程度まで、引用により取り込む。本発明をこれまで十分に記載してきたが、添付の請求の範囲又はその核心から外れることなくそれへの多くの変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らがであろう。

配列表（１）一般清報：（ｉ）出願人：　Ｗｏｌｆ、　ＤａｖｉｄＴｏｍｌｉｎｓｏｎ、　Ｊａｍｅｓ　Ｅ。

（１、発明の名称：精製された可溶性Ｂ型及びＡ型ヒト血小板−誘導体成長因子レセプタ断片の製造方法（ｉｉｉ）配列数：１８（ｉｖ）通信先：（Ａ）番地：　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ（Ｂ）　ストリート：　Ｏｎｅ　Ｍａｒｋｅｔ　Ｐｌａｚａ、５ｔｅｕａｒｔ　Ｔｏｗｅｒ、５ｕｉｔｅ（Ｃ）市：　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ。

（Ｄ）州：　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ（Ｅ）国：　ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号（Ｚ　［Ｐ）　：　９４１０５（ｖ）コンピューター読込媒体：（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢ乳ＩＰＣ互換性（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔ［ｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０．　ｖｅｒｓｉｏｎ　１１．２（ｖｉ）現出願データ：（Ａ）出願番号：　ＰＣＴ（Ｂ）出願臼：（Ｃ）分類：（ｖｉｉ）先行出願データ：（Ａ）出願番号＋　ＵＳ　０７／８０１，７９４（Ｂ）出願臼：　０２−ＤＥＣ −１９９１（ｖｉｉｉ）代理人／エージェント清報：（Ａ）氏名：　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｍ。

（Ｂ）登録番号：　３０，２２３（Ｃ）参照／事件整理番号：　１２４１８−１５（ｉｘ）遠距離通信情報：（Ａ）　を話番号：　４１５−３２６−２４００（Ｂ）ファックス番号：　４１５−３２６−２４２２（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　・４４塩基対（Ｂ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号５・ＧＡＧＣＣＣＣＣＴＡ　ＣｋＧＧＡＡＧＣＴｋ　ＧＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧ丁　ＡＧ入Ｇ　４４（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数＝１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号６゜ＡＴＧＡ’１ｌＴＡＧＧＧ　ＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡ　ＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧ　ＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧ　ＡＴＣＴＧ　４５（２）配列番号７についての情Ｗｉ：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　：４８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子種類・ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号７：ＣＴＧＣＡＣＴＧＣＧ　ＴｒＣＡＣＡＧＡＧＡ　ＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡ　ＧＡＧＡＴＣＴＧ　４Ｂ（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　、４５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号８：ＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＣＡ　ＣＧＴＡＧＡＣＣＡＧ　ＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧ　ＡＴＣＴＧ　４５（２）配列番号９についての情報：（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４２塩基対（Ｂ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｉｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号９゜ＡＣＴＴＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡ　ＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧ　４２（２）配列番号１０についての情報：（１）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ二旧塩基対（Ｂ）配列の型、核酸（Ｃ）鎖の数・１本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｊｌ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列、配列番号ｌ０１ＣＣＣＣＴＣＧＡ−”−Ｔ　ＣＣにＣＣＡＧＴＴＡ　ＴＴＣＡＧＡＡＣＧＣＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧ　Ｃ４１（２）配列番号１１についての情Ｎ：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　４１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）　Ｈの数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１１：（２）配列番号１２についての情報・（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４１塩基対（Ｂ）配列の壓：核酸（Ｃ）鎖の数＝１本鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１２：（２）配列番号Ｉ３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ、４１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（２）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（２）配列番号１４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　・４４塩基対（’Ｂ）配列の型コ核酸（Ｃ）鎖の数、１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号１４：（２）配列番号１５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４５塩基対（Ｂ）配列の型；核酸（Ｃ）　＠の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１５：（２）配列番号１６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４９塩基対ＣＢ＞配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数＝１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｊｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｉ）配列：配列番号１６：ＡＡＧＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡＴ　ＣＣＧＡＣＴＣＣＡＡ　ＧＣＴＧＧＣＡＧＡＧ　ＧＡＴＴＡＧＧＣＴ　４９（２）配列番号１７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ　、４５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉ　ｉ）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘｌ）配列：配列番号１７゜（２）配列番号Ｉ８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４２塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）分子種類：　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘＤ配列・配列番号１８・ＧＡＣＣＡＡＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧ　ＡＡＡＧＣＴＣＣＣＡ　ＧＡＧＧＡＴＴＡＧＧ　ＣＴ　４２♂ フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｒ１：９１）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ　、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。

Ｃ３，ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ。

、ＮＺ、ＰＬ、Ｒ○、　ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、　ＵＡ、　ＵＳＩ（Ｃ１２Ｎ　５１００　ＢＣｌ　２　Ｒ１：９１）（７２）発明者　トムリンソン、ジェームズ　イー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９４０１０゜バーリンガム、パルポア　ストリート

Claims

【特許請求の範囲】

１．血小板−誘導成長因子（ＰＤＧＦ）リガンドに結合する約８と４００との間のアミノ酸の可溶性ペプチド断片であって、血小板−誘導成長因子レセプタ（ＰＤＧＦ−Ｒ）細胞外領域配列の少なくとも約８の連続アミノ酸を含んで成るような断片を、発現する不朽化哺乳類細胞系。
２．断片が少なくとも約５０アミノ酸長である、請求項１に記載の細胞系。
３．連続アミノ酸が１ｇドメインを含んで成る、請求項１に記載の細胞系。
４．断片が少なくとも約０．５ｍＭのヒトＰＤＧＦに対する結合定数をもつ、請求項１に記載の細胞系。
５．ＰＤＧＦ及びＰＤＧＦ−Ｒがヒトである、請求項１に記載の細胞系。
６．系がチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系である、請求項１に記載の細胞系。
７．細胞外領域配列がＢ型又はＡ型ヒトＰＤＧＦ−Ｒ配列である、請求項１に記載の細胞系。
８．断片がＢ型及びＡ型の両方のヒトＰＤＧＦ−Ｒ配列をもつ、請求項１に記載の細胞系。
９．細胞が以下の：ａ）Ｐ△１；ｂ）Ｐ△２；ｃ）Ｐ△３；ｄ）Ｐ△１０１；ｅ）Ｐ△１０２；及びｆ）Ｐ△１０３から成る群から選ばれているプラスミドを含んで成る、請求項１に記載の細胞系。
１０．細胞系が以下の：ａ）Ｐ△１−５；ｂ）Ｐ△αＲＦ；及びｃ）ａ）又はｂ）の子孫から成る群から選ばれている、請求項１に記載の細胞系。
１１．細胞系が、断片を翻訳後に修飾する外因性酵素をさらに含んで成る、請求項１に記載の細胞系。
１２．酵素が解糖酵素である、請求項１１に記載の細胞系。
１３．請求項１に記載の細胞系から作られた蛋白を含んで成る組成物。
１４．以下の段階：ａ）Ｐ△１−５及びＰ△αＲＦの群から選ばれた細胞系を増殖させ；そして、ｂ）その細胞系からその細胞生成物を単離すること、を含んで成る、ヒト血小板 −誘導成長因子レセプタ結合活性を示す可溶性ポリペプチドの生産方法。
１５．細胞生成物が細胞培養基中に分泌される、請求項１４に記載の方法。
１６．細胞生成物が培地からアフィニティー・クロマトグラフィーにより単離される、請求項１４に記載の方法。
１７．アフィニティー・クロマトグラフィーがモノクロナール抗体免疫−アフィニティー試薬を含んで成る、請求項１４に記載の方法。
１８．モノクロナール抗体試薬が以下の：ａ）１Ｃ７０５及びｂ）１Ｈ２Ｈ８から成る群から選ばれている、請求項１５に記載の方法。
１９．可溶性ヒト血小板−誘導成長因子レセプタ・ペプチドの精製方法であって、以下の段階：ａ）ｊ）Ｐ△１−５；及びｉｉ）Ｐ△αＲＦから成る群から選ばれた細胞系を増殖させ；ｂ）その細胞から細胞培養基を分離し；そして、ｃ）ｉ）ｌＣ７０５；及びｉｉ）１Ｈ２Ｈ８から成る群から選ばれている抗体を使用して免疫アフィニティー・クロマトグラフィーによりその培地からそのペプチドを単離すること、を含んで成るような方法。
２０．ペプチドが実質的に純粋な形態にある、請求項１９に記載の方法。